CN102143682A - 植物调节序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多种调节序列。特别地，本发明涉及一种调节核苷酸序列，该核苷酸序列的至少一部分具有一种将一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的表达导向非花粉组织中、但不导向或基本上不导向花粉中的转录起始功能。本发明进一步涉及包括所述调节序列的嵌合基因和表达盒并且涉及包括所述嵌合基因和表达盒的转基因植物。

Description

植物调节序列

本发明属于植物生物技术领域并且涉及多种调节序列。特别地说，本发明涉及一种调节核苷酸序列，该调节核苷酸序列的至少一部分具有指导将感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达到基本上所有植物组织上、但基本上排除了表达于该植物的繁殖性结构的组织中、特别地花粉和/或雄花穗的组织中的转录起始功能，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。本发明进一步涉及包括与一种感兴趣的编码可表达的蛋白的多核苷酸连接的所述调节序列的多种嵌合基因以及表达盒并且分别地涉及包括所述嵌合基因和表达盒的转基因植物，这些嵌合基因和表达盒将感兴趣的编码蛋白的多核苷酸表达于基本上所有植物组织中，但基本上排除表达于该植物的繁殖性结构的组织中、特别地花粉和/或雄花穗的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

发明背景

在许多农作物例如玉米中，破坏性害虫倾向于以营养性组织例如叶、茎和根为食并且还以繁殖性组织例如穗为食。用于保护植物免受害虫的一种技术是使用化合物。一种替代的技术涉及基因重组，其中一个或多个基因被引入该植物中以表达蛋白产物，这些蛋白产物直接或间接地涉及这些害虫生物的防治。目前通过基因重组所生产的蛋白产品是组成型表达的，即贯穿该植物一生在所有时间并且在大多数组织和器官中表达。这类蛋白产品或者应答于特定的刺激物或者局限于特定的细胞或组织亦被特异性地表达。相比之下，本发明包括将感兴趣的蛋白或多核苷酸表达于基本上所有植物组织中，但基本上排除表达于该植物的繁殖性结构的组织、特别地该花粉和/或雄花穗的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

几种昆虫控制性状基因靶向发育的幼虫阶段。在某些情况下，这些蛋白还影响非预期的昆虫，这些昆虫不是玉米害虫，但偶尔以玉米花粉为食。这些昆虫可以被在花粉组织中表达的杀虫蛋白伤害。在早期BT-玉米事件中这被看做问题，BT-玉米事件在花粉中具有高杀虫性的蛋白表达。通过开发替代的转基因表达系统，这个问题在后来的BT-玉米事件中得以解决。这些最近的事件仍然有效地对抗目标害虫并且在花粉中积累较少的杀虫蛋白，但由于在花粉中存在杀虫蛋白，这些最新的事件仍然被视为对非目标害虫具有潜在的危害。

在一些情况中，有用的昆虫防治性状基因还可以连累该植物的繁殖性结构的发育，像例如雄花穗。

因此，提供排除了该转基因表达于该植物的繁殖性结构的组织(例如花粉和/或雄花穗的组织)中的植物、特别地玉米植物，是令人希望的。这可以通过以下步骤在本发明的范围内实现，即提供一种调节核苷酸序列，该调节核苷酸序列的至少一部分具有指导将感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于基本上所有植物组织上、但基本上排除表达于该植物的雄性繁殖性结构的组织中、特别地该花粉和/或雄花穗的组织中的转录起始功能，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于在所述组织中。然后可以使用这种调节核苷酸序列来开发表达系统，该表达系统能够有效地将感兴趣的多肽或蛋白(像例如一种杀虫蛋白)累积于目标害虫正常地以之为食的组织中，并且消除或减少将该杀虫蛋白累积于非目标组织或器官中和/或可能被感兴趣的多肽或蛋白损害的那些组织中。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物，该转基因植物包括被稳定地整合入其基因组中的嵌合多核苷酸构建体、特别地嵌合构建体，该嵌合构建体包括感兴趣的多核苷酸、特别地感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸与调节核苷酸序列连接和/或处于其控制之下，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能，该转录起始功能指导所述感兴趣的编码蛋白的多核苷酸表达于所述植物的基本上所有组织、特别地目标昆虫正常地以之为食的组织中，但基本上排除该繁殖性植物结构的组织、特别地花粉和/或雄花穗的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，感兴趣的多核苷酸、特别地感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，没有以任何显著的程度被转录于该繁殖性植物结构的组织、特别地根据本发明的转基因植物的花粉和/或雄花穗组织中。因此，该感兴趣的多核苷酸、特别地感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸的表达基本上没有出现在该雄性繁殖植物结构的组织、特别地该花粉和/或雄花穗的组织中，并且仅有残留量的表达产物(如果有)可以在所述组织中被检测到，该残留量对于该表达产物是不足以在所述组织中(特别地，在该花粉和/或雄花穗的组织中)实现它的想见的生物学功能的，并且因此也不能展示对以所述组织为食的昆虫或对这些植物繁殖结构的任何毒性影响。

在本发明的一个实施方案中，如在此所述提供了转基因植物，其中嵌合多核苷酸构建体、特别地嵌合DNA构建体，包括一种感兴趣的多核苷酸、特别地一种感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸可操作地与一种调节核苷酸序列连接和/或处于其可操作的控制之下，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能并且可以从编码肌动蛋白解聚因子3(ABP3)的基因中得到，该多肽或蛋白被高度表达于该植物的大多数组织中但基本上排除花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，所述肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因能够从玉米中得到。

在本发明的一个实施方案中，如在此所述提供了转基因植物，其中一种嵌合的多核苷酸构建体、特别地一种嵌合的DNA构建体，包括一种感兴趣的多核苷酸、特别地一种感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸可操作地与一种调节核苷酸序列进行连接和/或处于其可操作的控制之下，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能并且可以从由DNA探针(特别地如SEQ ID NO：47至56中所述的DNA序列的DNA探针)所表示的基因得到，该DNA探针在这些组织样品中显示一种信号模式，该信号模式表明所述基因表达于所有组织中并且不或基本上不表达于花粉中。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或多核苷酸构建体、特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种转录起始功能并且介导了将一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于该植物的大多数组织中但基本上排除花粉的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，该调节序列可以在PCR反应中使用以下各项从玉蜀黍基因组DNA模板得到：

i)第一引物，该引物与如SEQ ID NO：1中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：1的第一引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

ii)第二引物，该引物与如SEQ ID NO：2中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：2的第二引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

iii)第一引物作为正向引物，该正向引物与如SEQ ID NO：1中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；并且第二引物作为反向引物，该反向引物与如SEQ ID NO：2中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，特别地SEQ ID NO：1的正向引物以及SEQ ID NO：2的反向引物。

在一个实施方案中，本发明涉及如在此所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：13中所述的一种核苷酸序列至少80％至85％之间的序列同一性(其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中)，特别地与SEQ ID NO：13中所述的一种核苷酸序列至少85％至90％之间的序列同一性(其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中)，特别地与SEQ ID NO：13中所述的一种核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或其片段，并且其中所述调节核苷酸序列或其片段介导了一种可操作地连接的多核苷酸分子的转录、特别地一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于大多数该植物的组织中但基本上排除该花粉的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及如在此所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：13中所述的一种核苷酸序列进行杂交，特别地在中等程度杂交条件下，更特别地在严格杂交条件下，并且其中所述调节核苷酸序列介导了一种可操作地连接的多核苷酸分子的转录，特别地一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于大多数该植物的组织中但是基本上排除转录于花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及如在此所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列是SEQ ID NO：13中所述的序列或其片段，该片段作为转录起始序列仍然展示全部的功能性。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种可以从对一种肌动蛋白解聚因子3(ABP3)进行编码的基因(特别地从玉米肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到的转录终止功能，该嵌合多核苷酸构建体的调节序列介导可操作地连接的多核苷酸分子的转录，特别地感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸分子的转录，从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于除花粉组织之外的该植物的大多数组织中但基本上排除在该花粉的组织之外，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，其中

i)所述调节核苷酸序列包括转录终止序列，该转录终止序列与SEQID NO：14中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或其片段，该片段仍然展示终止序列的功能性；或

ii)所述调节核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：14中所述的一种核苷酸序列进行杂交，特别地在中等程度的杂交条件下，更特别地在中等严格的杂交条件下，特别地在严格的杂交条件下，并且介导了终止一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录；或

iii)所述调节核苷酸序列具有如SEQ ID NO：14中所述的序列，包括其互补序列。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有分别地(respectively)一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从对一种肌动蛋白解聚因子3(ABP3)进行编码的基因(特别地从玉米肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到，该对一种肌动蛋白解聚因子3(ABP3)进行编码的基因被表达于大多数植物的组织中但基本上排除该花粉的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列包括分别地转录起始序列和转录终止序列，这些序列与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中所述核苷酸序列分别地具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或其片段，该片段分别地作为转录起始序列和终止序列仍然展示全部的功能性。

在本发明的一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分分别地具有一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从对一种肌动蛋白解聚因子3(ABP3)进行编码的基因(特别地从玉米肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到，该嵌合的多核苷酸构建体被表达于该植物的大多数组织中但基本上排除该花粉的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，并且该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列包括如SEQ ID NO：13中所述的转录起始序列和如SEQ ID NO：14中所述的转录终止序列。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包括所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分分别地具有一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从由DNA探针所表示的基因、特别地如SEQ ID NO：47至56中所述的DNA序列的DNA探针得到，该DNA探针显示在这些组织样品中的信号模式，该信号模式表明所述基因表达于所有组织中但不或基本上不表达于花粉中。

在本发明的一个实施方案中，如在此所述提供了转基因植物，其中该嵌合多核苷酸构建体，特别地该嵌合DNA构建体，包括一种感兴趣的多核苷酸，特别地一种感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸可操作地与一种调节核苷酸序列连接和/或处于其可操作的控制之下，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能并且可以从植物基因组DNA、特别地从玉米基因组DNA得到，该多肽或蛋白被表达于该植物的大多数组织中但基本上排除雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在本发明的一个实施方案中，如在此所述提供了转基因植物，其中该嵌合多核苷酸构建体，特别地该嵌合DNA构建体，包括一种感兴趣的多核苷酸，特别地一种感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸可操作地与一种调节核苷酸序列连接和/或处于其可操作的控制之下，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能并且可以从一个由一个DNA探针(特别地如SEQ ID NO：57至79中所述的一种DNA序列的DNA探针)所表示的基因得到，该DNA探针在这些组织样品中显示一种信号模式，该信号模式表明所述基因表达于所有组织中并且不或基本上不表达于雄花穗的组织中。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该调节序列可以在PCR反应中使用以下各项从玉蜀黍基因组DNA模板得到：

i)第一引物，该引物与如SEQ ID NO：19中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：19的引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

ii)第二引物，该引物与如SEQ ID NO：20中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：20的反向引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

iii)第一引物作为正向引物，该正向引物与如SEQ ID NO：19中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；并且第二引物作为反向引物，该反向引物与如SEQ ID NO：20中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；特别地SEQ ID NO：19的正向引物以及SEQ ID NO：20的反向引物。

在一个实施方案中，本发明涉及如在此所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：35中所述的一种核苷酸序列至少80％至85％之间的序列同一性(其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中)，特别地与SEQ ID NO：35中所述的一种核苷酸序列至少85％至90％之间的序列同一性(其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中)，特别地与SEQ ID NO：35中所述的一种核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或其片段，并且其中所述调节核苷酸序列或其片段介导了一种可操作地连接的多核苷酸分子的转录，特别地一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但基本上排除该雄花穗的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及如在此所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：35中所述的一种核苷酸序列进行杂交，特别地在中等程度杂交条件下，更特别地在严格杂交条件下，并且其中所述调节核苷酸序列介导了一种可操作地连接的多核苷酸分子的转录，特别地一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但是基本上排除转录于雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及如在此所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列是SEQ ID NO：35中所述的序列或其片段，该片段作为转录起始序列仍然展示全部的功能性。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种可以从植物基因组DNA得到(特别地玉米基因组DNA)的转录终止功能，并且介导可操作地连接的多核苷酸分子的转录，特别地感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但基本上排除在该雄花穗的组织之外，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，其中

i)所述调节核苷酸序列包括转录终止序列，该转录终止序列与SEQID NO：36中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或其片段，该片段作为转录起始序列仍然展示全部的功能性；或

ii)所述调节核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：36中所述的一种核苷酸序列进行杂交，特别地在中等程度的杂交条件下，特别地在中等严格的杂交条件下，特别地在严格的杂交条件下，并且介导了终止一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录；或

iii)所述调节序列具有如SEQ ID NO：36中所述的序列，或其片段，其中该片段作为转录起始序列仍然展示全部的功能性，包括其互补序列。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有分别地(respectively)一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从植物基因组DNA(特别地从玉米基因组DNA)得到，并且被表达于该植物的大多数组织中但基本上排除该雄花穗的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列包括分别地转录起始序列和转录终止序列，这些序列与SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：36中所述核苷酸序列分别地具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，包括其片段，该片段分别地作为转录起始序列和终止序列仍然展示全部的功能性。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明并且如在此所述的转基因植物，该转基因植物包括调节核苷酸序列或包括所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该嵌合的多核苷酸构建体的调节序列的至少一部分分别地具有一种转录起始功能和一种终止功能，该调节核苷酸序列可以从植物基因组DNA、特别地玉米基因组DNA得到，并且被表达于该植物的大多数组织中但基本上排除在该雄花穗的组织之外，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列分别地包括如SEQ ID NO：35中所述的转录起始序列和如SEQ ID NO：36中所述的转录终止序列，包括它们的片段，该片段分别地作为转录起始序列和终止序列仍然展示全部的功能性。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸编码展示一种杀虫活性的多肽产物，特别地一种苏云金芽孢杆菌的内毒素。

在一个实施方案中，由这些植物繁殖结构的组织中、特别地花粉和/或雄花穗的组织中感兴趣的编码蛋白的多核苷酸表达的该多肽产物的浓度是这样的即在标准的昆虫摄食测定法中不能检测到杀虫的活性。特别地，在雄花穗中该表达产物的浓度低于不超过10ng/mg可溶性蛋白的基本水平，特别地不超过5ng/mg可溶性蛋白、更特别地不超过3ng/mg可溶性蛋白，但特别地不超过2ng/mg可溶性蛋白或以下。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中感兴趣的编码该多肽或蛋白的多核苷酸编码苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有与SEQ ID NO：15中所述的一种核苷酸序列至少80％至85％之间的序列同一性(其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中)，特别地至少85％至90％之间的序列同一性(其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中)，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中感兴趣的编码该多肽或蛋白的多核苷酸编码了一种苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有如SEQ ID NO：15中所述的核苷酸序列。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸编码了多肽产物，该多肽产物对增强干旱耐受性有影响，特别地H⁺-焦磷酸酶的去调节形式，其中所述多肽或蛋白处于根据本发明的调节序列的控制之下，该调节序列的至少一部分具有一种转录起始功能，该转录起始功能介导了一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于大多数植物组织中但基本上排除表达于花粉组织中和/或雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，根据本发明并且如在此所述的转基因植物是一种玉蜀黍植物。

在一个实施方案中，本发明涉及调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种转录起始功能，该转录起始功能介导了一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于大多数植物组织中但基本上排除表达于这些雄性繁殖结构的组织(特别地花粉和/或雄花穗的组织)中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在本发明的一个实施方案中，该调节核苷酸序列可以从由DNA探针所表示的基因(特别地如SEQ ID NO：47至56中所述的DNA序列的DNA探针)得到，该DNA探针显示在这些组织样品中的一种信号模式，该信号模式表示所述基因表达于所有组织中但不或基本上不表达于花粉中。

在本发明的一个实施方案中，该调节核苷酸序列可以从对一种肌动蛋白解聚因子3进行编码的基因(特别地一种来自玉米的肌动蛋白解聚因子3基因)得到，该肌动蛋白解聚因子3被表达于该植物的大多数组织中但基本上排除该花粉的组织之外从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在本发明的一个实施方案中，该调节核苷酸序列可以从由DNA探针所表示的基因(特别地如SEQ ID NO：57至79中所述的DNA序列的DNA探针)得到，该DNA探针显示在这些组织样品中的一种信号模式，该信号模式表示所述基因表达于所有组织中但不或基本上不表达于雄花穗的组织中。

在一个实施方案中，本发明提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该调节序列可以使用以下各项从玉蜀黍基因组DNA模板得到：

i)第一引物，该引物与如SEQ ID NO：1中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：1的第一引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

ii)第二引物，该引物与如SEQ ID NO：2中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：2的第二引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

iii)第一引物作为正向引物，该正向引物与如SEQ ID NO：1中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；并且第二引物作为反向引物，该反向引物与如SEQ ID NO：2中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；特别地SEQ ID NO：1的正向引物以及SEQ ID NO：2的反向引物。

在一个实施方案中，使用选自下组寡核苷酸的一个或多个寡核苷酸对根据本发明并且如在此所述的调节核苷酸序列进行修饰，该组寡核苷酸描述如下：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8。

在一个实施方案中，本发明涉及一种调节核苷酸序列或一种包含所述调节核苷酸序列的表达盒或一种多核苷酸构建体，特别地一种嵌合多核苷酸构建体，所述该嵌合多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该调节核苷酸序列提供了一种转录起始功能，其中提供所述功能的核苷酸序列与SEQID NO：13中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数被包括在其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且其中所述调节核苷酸序列介导了一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸转录于该植物的大多数组织中但基本上排除该花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及一种调节核苷酸序列或一种包含所述调节核苷酸序列的表达盒或一种多核苷酸构建体，特别地一种嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该嵌合多核苷酸构建体的调节核苷酸序列提供了一种转录起始功能，其中提供所述功能的核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：13中描述的核苷酸序列杂交，特别地在中等程度的杂交条件下，更特别地在中等程度严格的杂交条件下并且其中所述调节核苷酸序列介导了将一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸转录于该植物的大多数组织中但基本上排除该花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。特别地，所述杂交在严格杂交条件下发生。

在本发明的一个实施方案中，提供该转录起始功能的核苷酸序列是SEQID NO：13中所述的序列，或其片段，该片段作为转录起始序列仍然展示全部的功能性，及其互补序列。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的调节核苷酸序列或包括所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列包括约1kb的位于ZmABP3基因的ZmABP3转录起始位点的上游处的核苷酸序列，特别地如SEQ ID NO：17中所述位于ZmABP3基因的ZmABP3转录起始位点的上游。

在本发明的一个实施方案中，所述调节核苷酸序列另外包括该ZmABP35′-非翻译性序列、该ZmABP3第一外显子、该ZmABP3第一内含子和该ZmABP3第二外显子的一部分，特别地在该翻译起始密码子处终止的ZmABP3第二外显子的一部分，特别地该ZmABP3第二外显子的一部分，该部分包括该第二外显子的约10至约20个之间的核苷酸、特别地约12至约16个之间的核苷酸、特别地约14个核苷酸。

在一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种转录终止功能，该调节序列可以在PCR扩增反应中从gDNA模板(特别地玉米gDNA模板)使用正向引物(P3(5′-tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3′)(该正向引物与如SEQ ID NO：9中所述的核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)和反向引物(P4(5′-atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3′)(该反向引物具有与如SEQ ID NO：10中所述的核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)而得到。特别地，所述调节核苷酸序列包括转录终止子和多腺苷酸化信号。特别地，使用正向引物(P3(5′-tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3′))(该正向引物具有如SEQ ID NO：9中所述的核苷酸序列)和反向引物(P4(5′-atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3′)(该反向引物具有如SEQID NO：10中所述的核苷酸序列)。

在本发明的一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包括所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列包括可以从对一种肌动蛋白解聚因子3(ABP3)(特别地从玉米肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因)进行编码的基因得到的转录终止序列，该嵌合多核苷酸构建体的调节序列介导了一种可操作地连接的多核苷酸分子的转录，特别地一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸分子的转录，从而所述感兴趣的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不或基本上不转录于花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，其中

i)所述调节核苷酸序列包括转录终止序列，该调节序列与SEQ IDNO：14中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

ii)所述调节核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：14中所述的一种核苷酸序列进行杂交，特别地在中等程度的杂交条件下，更特别地在中等严格的杂交条件下，特别地在严格的杂交条件下，并且介导了终止一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录；或

iii)所述调节核苷酸序列具有如SEQ ID NO：14中所述的序列，或其片段，其中该片段作为终止序列仍然展示全部的功能性，包括其互补序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分分别地具有一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从对一种肌动蛋白解聚因子3(ABP3)进行编码的基因(特别地从玉米肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到，该嵌合的多核苷酸构建体被表达于该植物的大多数组织中但不或基本上不被表达于该花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，并且该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列包括如SEQ ID NO：13中所述的转录起始序列和如SEQ ID NO：14中所述的转录终止序列。

在本发明的一个实施方案中，该调节核苷酸序列可以从玉米基因组DNA、特别地从在该玉米基因组上推测的基因得到，该调节核苷酸序列被高度表达于该植物的大多数组织中但不或基本上不表示于雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的一种调节核苷酸序列或一种包含所述调节核苷酸序列的表达盒或一种多核苷酸构建体，特别地一种嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列包括约2.6kb的5′-序列，该5′-序列包括约2kb的5′-非转录性序列、5′-UTR、和外显子1和外显子2的一部分以及内含子1，特别地约0.6kb表示外显子1、内含子1和外显子2的约16bp。

在一个实施方案中，本发明提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种如在此所述的转录起始功能，该调节序列可以使用以下各项从玉蜀黍基因组DNA模板得到：

i)第一引物，该引物与如SEQ ID NO：19中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：19的引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

ii)第二引物，该引物与如SEQ ID NO：20中所述的一种核苷酸序列(特别地SEQ ID NO：20的反向引物)具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

iii)第一引物作为正向引物，该正向引物与如SEQ ID NO：19中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；并且第二引物作为反向引物，该反向引物与如SEQ ID NO：20中所述的一种核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；特别地SEQ ID NO：19的正向引物以及SEQ ID NO：20的反向引物。

在一个实施方案中，使用选自下组寡聚核苷酸的一个或多个寡核苷酸对根据本发明并且如在此所述的调节核苷酸序列进行修饰，该组描述如下：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26。

在一个实施方案中，本发明涉及一种调节核苷酸序列或一种包含所述调节核苷酸序列的表达盒或一种多核苷酸构建体，特别地一种嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该调节核苷酸序列提供了一种转录起始功能，其中提供所述功能的核苷酸序列与SEQ ID NO：35中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数被包括在其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且其中所述调节核苷酸序列介导了一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸转录于该植物的大多数组织中但基本上排除该雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及一种调节核苷酸序列或一种包含所述调节核苷酸序列的表达盒或一种多核苷酸构建体，特别地一种嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括如在此所述的调节序列，该嵌合多核苷酸构建体的调节核苷酸序列提供了一种转录起始功能，其中提供所述功能的核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：35中描述的核苷酸序列杂交，特别地在中等程度的杂交条件下，更特别地在中等程度严格的杂交条件下并且其中所述调节核苷酸序列介导了将一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸转录于该植物的大多数组织中但基本上排除该花粉的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。特别地，所述杂交在严格杂交条件下发生。

在本发明的一个实施方案中，提供该转录起始功能的核苷酸序列是SEQID NO：35中所述的序列，或其片段，该片段作为转录起始序列仍然展示全部的功能性，及其互补序列。

在一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分具有一种转录终止功能，该调节序列可以在PCR扩增反应中从gDNA模板(特别地玉米gDNA模板)使用正向引物(该正向引物与如SEQ ID NO：29中所述的核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)和反向引物(该反向引物具有与如SEQ ID NO：30中所述的核苷酸序列具有至少90％，特别地至少91％，特别地至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)而得到。特别地，所述调节核苷酸序列包括转录终止子和多腺苷酸化信号。特别地，使用正向引物(该正向引物具有如SEQ ID NO：29中所述的核苷酸序列)和反向引物(该反向引物具有如SEQ ID NO：30中所述的核苷酸序列)。

在本发明的一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，其中：

i)所述调节核苷酸序列包括转录终止序列，该转录终止序列与SEQID NO：36中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括在其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或

ii)所述调节核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：36中所述的一种核苷酸序列进行杂交，特别地在中等程度的杂交条件下，特别地在中等严格的杂交条件下，特别地在严格的杂交条件下，并且介导了终止一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录；或

iii)所述调节序列具有如SEQ ID NO：36中所述的序列，或其片段，其中该片段作为终止序列仍然展示全部的功能性，包括其互补序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分分别地具有一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从玉米基因组DNA得到，该嵌合多核苷酸构建体被表达于该植物的大多数组织中但不或基本上不表达于该雄花穗的组织中，并且该嵌合多核苷酸构建体的调节核苷酸序列包括分别地转录起始序列和转录终止序列，该转录起始序列和转录终止序列分别地与SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中所述的一种核苷酸序列具有至少80％至85％之间的序列同一性其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中，特别地至少85％至90％之间的序列同一性，其中落在这个范围内的所有整数也被包括其中，特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在本发明的一个实施方案中，提供了调节核苷酸序列或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合的多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括所述调节序列，该调节序列的至少一部分分别地具有一种转录起始功能和一种终止功能，该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列可以从玉米基因组DNA中得到，该嵌合的多核苷酸构建体被表达于该植物的大多数组织中但不或基本上不被表达于该雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，并且该嵌合的多核苷酸构建体的调节核苷酸序列包括如SEQ ID NO：35中所述的转录起始序列和如SEQ ID NO：36中所述的转录终止序列。

对于本领域的普通技术人员应当清楚的是基于在SEQ ID NO：13、SEQID NO 14、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中所示的核苷酸序列，可以从所述序列中得到不同长度的片段，例如通过使用感兴趣的任何引物组合来生成仍然展示根据本发明的特定调节功能的多个片段，该调节功能驱动一种感兴趣的可操作地连接的多核苷酸分别地表达于大多数植物组织中而不表达于花粉和雄花穗的组织中。因此，根据本发明并且如在此所述本发明包括从全长转录本启动子和全长终止子中得到的片段，它们根据本发明分别地发挥作用，即能够提供将可操作地连接的核苷酸序列表达和终止于大多数植物组织中但基本上排除该花粉和/或雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

一旦得到将该启动子和终止子片段，通过将它们融合到选择性或筛选性标记基因上并且测定融合构建体保留的特定的启动子活性可以容易地测试该启动子和终止子片段的功能。这类测定是在本领域的普通技术人员的普通技能之内的。

在一个实施方案中，本发明涉及多个核苷酸片段，特别地涉及能够从肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因的调节序列中得到的核苷酸片段，该肌动蛋白解聚因子3基因的核苷酸片段具有长度至少约50个碱基，优选地约400个碱基至约650个碱基之间，更优选地约200个碱基至约400个碱基之间，并且最优选地约350个碱基，并且仍然展示根据本发明的特定的调节功能，该调节功能驱动将一种感兴趣的可操作地连接的多核苷酸表达于大多数植物组织中但基本上排除该花粉和/或雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及核苷酸片段，该核苷酸片段包括分别地描述于SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：35中的一种核苷酸序列，该核苷酸序列包括至少50nt的连续的一段序列，特别地约400nt至约650nt之间，特别地约200nt至约400nt之间，特别地约350nt长度的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列仍然展示根据本发明的特定的调节功能，该调节功能驱动将一种感兴趣的可操作地连接的多核苷酸表达于大多数植物组织中但基本上排除该花粉和/或雄花穗的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

对于本领域的普通技术人员还应当清楚的是通过引入突变(即使用本领域中已知的方法将一个或多个核苷酸分别地插入、缺失和/或取代入SEQ IDNO：13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的DNA序列中)在不影响根据本发明的调节序列的特定性质下可以得到变体序列。此外，通过将本发明的序列改组可以进一步改变本发明的未修饰的或已修饰的核苷酸序列。为了测试根据本发明的变体DNA序列的功能，将感兴趣的序列可操作地连接到选择性或筛选性标记基因上并且在具有原生质体的瞬时表达测定中或在整个植物组织中或在稳定转化的植物中对该标记基因的表达进行测试。本领域的普通技术人员应当理解的是能够驱动表达一种可操作地连接的核苷酸序列的DNA序列是以一种模块的方式建造的。因此，来自较短DNA片段的表达水平与来自最长的片段的表达水平相比可以是不同的，并且彼此之间可以是不同的。例如，缺失下调上游元件将导致该连接的核苷酸序列的表达水平的增加，而缺失上调元件将减少该相关核苷酸序列的表达水平。

在一个实施方案中，本发明涉及一种包括调节核苷酸序列的表达盒或包含所述调节核苷酸序列的表达盒或多核苷酸构建体，特别地嵌合多核苷酸构建体，该嵌合的多核苷酸构建体包括根据本发明并且如在此所述的调节序列。

在一个实施方案中，根据本发明的表达盒包括约2.3kb的ZmABP3的5′序列，该ZmABP3的5′序列的组成为约1.1kb的5′-非转录性序列、约0.25kb的5′-UTR、以及约0.98kb表示ZmABP3-内含子1，在刚好越过该ABP3翻译终止密码子处开始的约1.013kb的3′-序列，该3′-序列包括约0.3kb的3′-UTR和约0.7kb的非转录性序列，该0.7kb的非转录性序列作为转录终止子和多腺苷酸化信号起作用。

在一个实施方案中，提供了根据本发明的表达盒，其中将该天然翻译起始密码子沉默并且移动到该第二外显子中，特别地移动到ZmABP3外显子2的5′-端的15个核苷酸中。

在一个实施方案中，提供根据本发明的表达盒，其中将该Kozak序列5′-...CCACC...-3′置于该起始密码子之前。

在一个实施方案中，根据本发明的表达盒包含调节核苷酸序列，该核苷酸序列包括约2.6kb的5′-序列，该5′-序列的组成为约2kb的5′-非转录性序列、和约12bp的5′-UTR、约0.6kb表示外显子1、内含子1和约16bp的外显子2；以及约1kb的3′-序列，该3′-序列在刚好越过该翻译终止密码子处开始并且包括约0.6kb的3′-UTR和约0.4kb的非转录性序列，并且作为转录终止子和多腺苷酸化信号起作用。

在一个实施方案中，提供根据本发明的一种表达盒，其中该天然翻译起始密码子被沉默并被移到该第二外显子处。

在一个实施方案中，提供了一种编码多肽或蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列编码苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有与SEQ ID NO：15中所述的一种核苷酸序列至少80％序列同一性，特别地至少85％序列同一性、特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在一个实施方案中，提供了编码多肽或蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列编码苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有如SEQ ID NO：15中所述的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物，该转基因植物包括根据本发明并且如在此所述的表达盒。

在一个实施方案中，本发明提供了转基因植物，特别地一种转基因玉米植物，该转基因玉米植物包括根据本发明并且如在此所述的调节序列。

在一个实施方案中，本发明提供了转基因植物，特别地一种转基因玉米植物，该转基因玉米植物包括根据本发明并且如在此所述的一种调节序列，该调节序列与一种感兴趣的多核苷酸、特别地一种感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸相连接。

在一个实施方案中，本发明提供了转基因植物，特别地一种转基因玉米植物，该转基因玉米植物包括根据本发明并且如在此所述的表达盒。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中编码该多肽或蛋白的核苷酸序列编码了一种苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有与SEQ ID NO：15中所述的一种核苷酸序列至少80％序列同一性，特别地至少85％序列同一性、特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且处于在所述植物中可操作的一种调节序列的控制之下。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中该编码多肽或蛋白的核苷酸序列编码了一种苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有如SEQ ID NO：15中所述的核苷酸序列，并且处于在所述植物中可操作的一种调节序列的控制之下。

本发明还提供了用于制备包括根据本发明的调节序列的表达盒的方法，该方法包括用根据本发明并且如在此所述的调节序列与感兴趣的对一种多肽或一种蛋白进行编码的可表达的多核苷酸进行连接以得到一种表达构建体，其中该感兴趣的多核苷酸被可操作地与该调节序列进行连接或连接从而该多肽或一种感兴趣的蛋白的表达被根据本发明的调节序列所介导并且导致所述多肽或一种感兴趣的蛋白表达于基本上所有植物组织中，但基本上排除表达于该植物的繁殖结构的组织中、特别地该花粉和/或雄花穗的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及一种生产转基因植物的方法，该转基因植物将一种感兴趣的DNA序列表达于非花粉组织中但不或基本上不表达于在该花粉和/或雄花穗的组织中，该方法包括：

a.将一种根据本发明并且如在此所述的表达盒转化入一种植物细胞中，该表达盒包括一种调节核苷酸序列，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能，该转录起始功能介导将一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于大多数植物组织中但基本上排除了花粉和/或雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中；并且

b.将步骤a)中转化的植物细胞再生成为植物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种防治目标昆虫-以营养植物组织例如叶、茎和根为食和/或以繁殖组织例如穗为食的害虫、但是保护以花粉为食的非目标害虫的方法，该方法包括：

a.在区域内生长一种根据本发明并且如在此所述的植物，用目标害虫侵染该区域；

b.在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下表达一种多肽或蛋白，该多肽或蛋白能够防治所述目标害虫。

在一个实施方案中，本发明涉及一种通过在所述组织中表达感兴趣的一种多肽或蛋白，从而保护一种植物的繁殖组织、特别地该花粉和/或雄花穗的组织免受损害的方法，该方法包括：

a.生长一种根据本发明或如在此所述的植物；

b.在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下在所述植物中表达一种感兴趣的多肽或蛋白。

在一个实施方案中，本发明涉及通过在所述组织中表达一种感兴趣的多肽或蛋白(包括在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下在所述植物中表达所述感兴趣的多肽或蛋白)从而使用根据本发明并且如在此所披露的一种调节序列来保护植物的繁殖组织、特别地花粉和/或雄花穗组织免受损伤。

序列的简要说明

SEQ ID NO：1描述了正向引物P1的核苷酸序列

SEQ ID NO：2描述了反向引物P2的核苷酸序列

SEQ ID NO：3描述了寡核苷酸Patg的核苷酸序列

SEQ ID NO：4描述了寡核苷酸Pnco的核苷酸序列

SEQ ID NO：5描述了寡核苷酸ADPc-1的核苷酸序列

SEQ ID NO：6描述了寡核苷酸ADPc-2的核苷酸序列

SEQ ID NO：7描述了寡核苷酸ADPc-4的核苷酸序列

SEQ ID NO：8描述了寡核苷酸adp3-a的核苷酸序列

SEQ ID NO：9描述了正向引物P3的核苷酸序列

SEQ ID NO：10描述了反向引物P4的核苷酸序列

SEQ ID NO：11描述了正向引物Tnco的核苷酸序列

SEQ ID NO：12描述了正向引物T2的核苷酸序列

SEQ ID NO：13描述了包括转录起始序列的修饰的ZmABP3调节序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：14描述了ZmABP3末端序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：15描述了Cry1AbG6的核苷酸序列

SEQ ID NO：16描述了玉米优化的AtAVP1D编码序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：17描述了ZmABP3基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：18描述了pNOV1321质粒的核苷酸序列

SEQ ID NO：19描述了正向引物ABT P1 forw的核苷酸序列

SEQ ID NO：20描述了反向引物ABT P2 rev的核苷酸序列

SEQ ID NO：21描述了寡核苷酸pABT mut1的核苷酸序列

SEQ ID NO：22描述了寡核苷酸pABT mut2的核苷酸序列

SEQ ID NO：23描述了寡核苷酸pABT mut3的核苷酸序列

SEQ ID NO：24描述了寡核苷酸pABT mut4的核苷酸序列

SEQ ID NO：25描述了寡核苷酸pABT mut5的核苷酸序列

SEQ ID NO：26描述了寡核苷酸pABT mut6的核苷酸序列

SEQ ID NO：27描述了正向引物pABT amp1的核苷酸序列

SEQ ID NO：28描述了反向引物pABT amp2的核苷酸序列

SEQ ID NO：29描述了正向引物ABT P4的核苷酸序列

SEQ ID NO：30描述了反向引物ABT P5的核苷酸序列

SEQ ID NO：31描述了寡核苷酸ABTt m1的核苷酸序列

SEQ ID NO：32描述了寡核苷酸ABTt m2的核苷酸序列

SEQ ID NO：33描述了ZmABT1 cDNA的核苷酸序列

SEQ ID NO：34描述了ZmABT2 cDNA的核苷酸序列

SEQ ID NO：35描述了ZmABT启动子的核苷酸序列

SEQ ID NO：36描述了ZmABT末端序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37描述了ZmABP3-Cry1AbG6组装构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：38描述了ZmABP3-Cry1AbG6二元构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：39描述了增强的ZmABP3-Cry1AbG6二元构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：40描述了ZmABP3-AmCyan组装构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：41描述了ZmABP3-AmCyan二元构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：42描述了ZmABP3-AtAVP1D组装构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：43描述了ZmABP3-AtAVP1二元构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：44描述了质粒15772(ZmABT组装体)的核苷酸序列

SEQ ID NO：45描述了质粒15773的核苷酸序列

SEQ ID NO：46描述了ZmABT gDNA的核苷酸序列

SEQ ID NO：47描述了Ctrl_ZMU45855-3_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：48描述了AF032370_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：49描述了Zm001747_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：50描述了Zm005803_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：51描述了Zm007728_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：52描述了Zm009722_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：53描述了Zm015335_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：54描述了Zm021004_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：55描述了Zm058948_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：56描述了Zm061393_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：57描述了Zm016864_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：58描述了Zm018791_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：59描述了ZMMETALL_x_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：60描述了Zm000019_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：61描述了Zm002987_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：62描述了Zm002990_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：63描述了Zm002990_x_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：64描述了Zm004433_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：65描述了Zm005761_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：66描述了Zm006285_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：67描述了Zm006481_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：68描述了Zm010323_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：69描述了Zm011554_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：70描述了Zm011554_x_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：71描述了Zm021403_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：72描述了Zm028405_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：73描述了Zm032921_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：74描述了Zm033444_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：75描述了Zm035082_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：76描述了Zm040564_x_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：77描述了Zm054116_s_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：78描述了Zm066342_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：79描述了Zm051284_at的核苷酸序列

SEQ ID NO：80描述了载体15289的核苷酸序列

SEQ ID NO：81描述了ZmABP-948-binary的核苷酸序列

SEQ ID NO：82描述了ZmABT-990-binary的核苷酸序列

SEQ ID NO：83描述了5’Bfr1引物的核苷酸序列

SEQ ID NO：84描述了3’Xba1引物的核苷酸序列

SEQ ID NO：85描述了5’Gfix引物的核苷酸序列

SEQ ID NO：86描述了3’Gfix引物的核苷酸序列

SEQ ID NO：87描述了5’1Ab5XbaI引物的核苷酸序列

SEQ ID NO：88描述了3’1Ab3d6引物的核苷酸序列

SEQ ID NO：89描述了cy2’的核苷酸序列

SEQ ID NO：90描述了cy1的核苷酸序列

SEQ ID NO：91描述了cy2的核苷酸序列。

发明详细说明

定义

在本申请的范围内所使用的技术术语和表述，如果在此以下没有另外说明，总体上将被给定通常地在植物分子生物学的相关领域中应用于它们之上的意义。

如在本说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”(a，an)、“一种”和“该”(所述，及类似翻译)包括复数指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，涉及“一种植物”包括一种或多种植物，并且涉及“一种细胞”包括多种细胞、组织等的混合物。

如在本说明书和所附的权利要求所使用的，复数形式“多个组织”也包括单数形式，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，涉及“该雄花穗的多个组织”包括该雄花穗中存在的一个或多个组织。

如在本说明书和所附的权利要求中所使用的，短语“该植物的大多数组织”或“该植物的基本上所有组织”是可交换地使用的并且指除了这些繁殖结构的组织、特别地花粉和雄花穗的组织之外相对于该植物中存在组织的多数。特别地，“大多数组织”指植物的那些组织，其中目标昆虫除了这些雄性繁殖结构组织以外主要以之为食的组织，例如茎、根、叶、穗、穗鞘、穗丝以及发育的核的组织。

术语“多核苷酸”在此应当理解为指高分子量的聚合物分子，该聚合物分子可以是由含有一种糖、磷酸盐和一种碱基的单体(核苷酸)组成的单链的或双链的，该碱基是或者一种嘌呤或者一种嘧啶。“多核苷酸片段”是一种给定的多核苷酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)涉及将DNA中包含的信息传递到蛋白中。“基因组”是在一种生物的每个细胞中所包含的遗传物质的整体，包括线粒体和质粒的基因组。因此术语“多核苷酸”指DNA或RNA的聚合物，该DNA或RNA可以是单链的或双链的，该聚合物任选地包含能够结合入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另外表明，本发明的一种特定的核酸序列还暗示性地涵盖它的保守地修饰的变体(例如，简并密码子取代)以及互补序列、以及连同明确地指明的序列。确切地，简并密码子取代可通过产生以下序列来实现，在这些序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被经混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer，et al.，NucleicAcid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka，et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini，et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语多核苷酸与核酸、核苷酸序列可交换地使用并且可以包括基因、cDNA、以及被基因编码的mRNA、等。

“其至少一部分具有一种转录起始功能的调节核苷酸序列”在此应当理解为是指一种核苷酸序列，该核苷酸序列通过提供对于RNA聚合酶以及用于适当转录所要求的其他因子的识别来控制一种可操作地连接的编码序列的表达，并且通常地位于它的编码序列的上游(5’)处。“调节核苷酸序列”包括位于近端的5’调节序列以及该连接的编码区的上游的更远端的元件，这些调节序列和元件影响转录、RNA加工或稳定性、或该连接的编码序列的翻译。“调节核苷酸序列”可以进一步包括3’序列，该3’序列包括3’非翻译的序列和/或3’非转录的序列，这些3’非翻译的序列和/或3’非转录的序列位于该连接的编码区域的下游处，并且该调节核苷酸序列可以包括一种转录终止位点。“调节核苷酸序列”可以包括增强子、启动子、非翻译的前导序列、内含子、以及聚腺苷酸化信号序列。它们包括自然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的多个序列。“增强子”是DNA序列，它可以促进启动子的活性并且可以是该启动子或一种插入的异源元件的固有元件以增强一种启动子的水平或组织特异性。它能够在两个方向(正常或翻转)上进行操作，并且甚至当移动到该启动子的上游或下游时还能够发挥作用。术语“调节核苷酸序列”的含义包括“转录起始”或”启动子”序列以及“启动子调节序列”。这些术语在以下被可交换地使用。

出于本发明的目的，术语“3’-非转录的序列”的定义包括对从目标基因得到的3’-非转录序列的核苷酸序列进行修饰，只要该修饰过的3’-非转录序列没有显著地降低它的连接的3’调节序列的活性。该3’-非转录序列向该转录终止位点的下游延伸约0.5kb到1.5kb。

本发明的多核苷酸应当理解为是以一种分离的形式提供的。术语“分离的”指在此披露和要求的多核苷酸，如果它确实具有天然发生的对应物，该多核苷酸不是以其天然背景的方式出现的多核苷酸。因此，以下进一步描述的本发明的其他化合物应当理解为是分离的。如果要求本发明的多核苷酸在植物基因组的背景中，通过亦即将修饰引入该天然发生的对应物序列和/或该基因组的插入侧以及位于该插入侧处的侧翼序列，将本发明的多核苷酸与天然发生的对应物区别开。

“可操作地关联”和“可操作地连接”被可交换地使用，并且指将核酸序列结合到单个的核酸片段上从而的功能被另影响。例如，当启动子能够影响编码序列或者功能RNA的表达时(即，该编码序列或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，该启动子与编码序列或者功能RNA是可操作地连接的或可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码序列能够与调节序列进行可操作地连接。

术语“以任何显著的程度存在”，如在本发明的上下文中所使用的，指以下事实，即仅有可以忽略的表达发生在花粉中，导致在花粉组织中仅有少量的表达产物处于可以通过高分辨率检测方法例如HPLC、基于ELISA的测定法、蛋白质印迹分析、昆虫摄食测定法、酶活性测定法、等可检出的浓度下，但停留在影响该表达产物的预想的生物功能所将需要的某一阈值水平以下。例如，在苏云金芽孢杆菌的Cry1AbG6内毒素的情况下，该阈值水平是在5ng/mg可溶蛋白与60ng/mg可溶蛋白之间的范围内，特别地在20ng/mg可溶蛋白与50ng/mg可溶蛋白之间的范围内。

术语“嵌合基因”指包含以下各项的任何基因1)包括调节序列和编码序列的DNA序列，在自然界中这些调节序列和编码序列没有以这种特定的组合的形式被一起发现，或2)对没有天然邻接的蛋白的部分进行编码的序列，或3)没有天然邻接的启动子的部分。因此，嵌合基因可以包括从不同来源得到的调节序列和编码序列，或包括从相同来源得到的、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行安排的调节序列和编码序列。

如在此使用的，术语“异源性DNA序列”、“外源性DNA区段”、或“异源性核酸”，各自是指序列，该序列起始于对该特定的宿主细胞而言外来的来源、或若来自相同的来源则是从其原始形式进行修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞是内源性的但是已经通过例如使用DNA改组或突变而修饰的一种基因。这些术语还包括一种天然发生的DNA序列的非天然发生的多种拷贝。因此，这些术语是指一种DNA区段，它是外来的或与该细胞异源的或与该细胞同源的但是处于其中通常找不到该元件的该宿主细胞基因组内的位置中。表达了外源DNA区段以产生外源性多肽。“同源”DNA序列是DNA序列，该DNA序列是与将该DNA序列引入其中的宿主细胞天然地连接的。

“转基因”是指基因，该基因已经通过转化被引入该基因组中并且被稳定地保持。转基因可以包括例如对于有待转化的特定植物的基因而言或者是异源的或者是同源的基因。此外，转基因可以包括被插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。术语“内源基因”是指在生物体的基因组中在它的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指不是正常地发现于宿主生物中但通过基因转移被引入的基因。

如在此所使用的，“表达盒”意思指DNA序列，该DNA序列能够指导一种特定的核苷酸序列在适当的宿主细胞中的表达，该DNA序列包括可操作地连接至感兴趣的编码蛋白的多核苷酸上的启动子，该感兴趣的编码该蛋白的多核苷酸被可操作地连接至终止子上。它还典型地包括用于核苷酸序列的适当翻译所要求的序列。该编码区通常对一种感兴趣的蛋白进行编码，但是还可能对一种感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在正义或反义方向上的反义RNA或一种非翻译性RNA。包括感兴趣的编码蛋白的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的。

“内含子”指几乎唯一地在真核基因中发生的DNA的内插区段，但这个内插区段在该基因产物中没有被翻译成氨基酸序列。通过称为剪接的过程从未成熟的mRNA中去除这些内含子，该剪接使外显子未被触及，从而形成mRNA。出于本发明的目的，术语“内含子”的定义包括对从目标基因得到的内含子的核苷酸序列进行修饰，只要该修饰过的内含子没有显著地降低它的连接的5’调节序列的活性。

“外显子”是指携带对蛋白或其一部分进行编码的序列的DNA的区段。外显子被内插的、非编码序列(内含子)分离。出于本发明的目的，术语“外显子”的定义包括对从目标基因得到的外显子的核苷酸序列进行修饰，只要该修饰过的外显子没有显著地降低它的连接的5’调节序列的活性。

术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在此被可交换地使用。

如在此所使用的“探针”是指可变长度的定义的核酸(DNA或RNA)片段，该片段可以用于在含有DNA或RNA的样品中检测与由探针分子所表示的序列互补的核苷酸序列。

这些探针分子可以被用于微阵列装置中，其中这些探针分子被共价地附连到惰性表面(例如包被的载玻片或基于硅的基因芯片)上的化学基质上。探针分子与样品中目标核酸的杂交通常发生在高严格条件下。通常通过基于荧光检测荧光团标记的目标对探针-目标杂交进行检测和定量以确定在该目标中核酸序列的相对转录本丰度。可以将DNA微阵列用于表达谱试验以对组织样品中(例如花粉和/或雄花穗的组织)目标分子的转录本丰度进行定量，基于对应样品中所检测到的信号的强度进行计算。

如在此所使用的术语“杂交”是在常规的杂交条件，优选地是指以下杂交条件，即：使用5xSSPE、1％SDS、1xDenhardts溶液作为溶液和/或杂交温度在35℃至70℃之间，优选地65℃。杂交后，优选地首先用2xSSC、1％SDS并且随后用0.2xSSC在35℃至75℃之间的温度下、特别地在45℃至65℃之间、但特别地在59℃下进行洗涤(关于上述引文中的SSPE、SSC和Denhardts溶液的定义参见Sambrook等人)。高严格杂交条件，如例如以上Sambrook等人中所述，是特别优选的。特别地，优选的严格杂交条件是例如如果如上表明在65℃下进行杂交并且洗涤时所存在的条件。非严格杂交条件，例如在45℃下进行的杂交并且洗涤，是较少优选的并且在35℃下是更少优选的。

“序列同源性或序列同一性”在此被可互换地使用。在两个或更多个核酸或蛋白序列的背景下，术语“一致性”(同一性)或百分比“一致性”是指当使用以下序列比较算法之一或通过目测测量时，当比较和比对最大一致性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。如果有待彼此比较的两个序列长度不同，序列同一性优选地涉及较短序列的核苷酸残基的百分比，该较短序列的核苷酸残基与该较长的核苷酸残基是完全相同的。常规地通过使用计算机程序例如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive Madison，WI 53711)可以确定序列同一性。Bestfit使用Smith和Waterman(Advances in AppliedMathematics 2(1981)，482-489)的局部同源性算法以便找到两个序列之间具有最大序列同一性的区段。当使用Bestfit或其他序列比对程序来确定是否特定的序列与本发明的参照序列具有例如95％一致性时，优选地对这些参数进行这样的调整从而在参照序列的整个长度上对一致性的百分比进行计算并且允许该参照序列中核苷酸的总数高达5％的同源性缺口。当使用Bestfit时，优选将所谓的任选参数保留在它们预设(“默认”)值。在给定的序列和上述本发明的序列之间的比较中出现的偏差可能是由例如加成、缺失、取代、插入或重组引起的。优选地还可以使用程序“fasta20u66”(version 2.0u66，1998年九月，由William R.Pearson和佛吉尼亚大学编写，也参见W.R.Pearson(1990)，Methods in Enzymology 183，63-98，所附的实施例以及http://workbench.sdsc.edu/)进行这样一种序列比较。对于这个目的，可以使用“缺省”参数。

两核酸序列实质上是相同的另一种指标是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指当该序列存在于一种复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，一种分子在严格条件下仅可与一种特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交。“基本上结合”是指在探针核酸与目标核酸之间的互补性杂交，并且包含少量的错配，这些错配可通过降低该杂交介质的严格性而适应，以实现该目标核酸序列的所希望的检测。

在核酸杂交实验的背景下(例如，DNA及RNA杂交)“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下进行特异性地杂交。对核酸杂交的一种广泛指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier，New York。总体上，所选择的高严格杂交和洗涤条件将是比在限定的离子强度和pH下该特定序列的热解链点(T_m)低大约5℃。典型地，在“严格条件”下，一种探针将会与它的目标子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。

T_m是50％的目标序列与一种完全匹配的探针进行杂交所处的温度(在限定离子强度及pH下)。极度严格条件选择为等于对于一种特定探针的T_m。对于互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实施例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将该杂交进行过夜。高严格洗涤条件的实施例是在72℃下，0.15MNaCl，持续大约15分钟。严格洗涤条件的实施例是在65℃下，0.2xSSC洗涤持续15分钟(参见Sambrook，以下，对于SSC缓冲剂的说明)。通常，一种高严格洗涤之前会先进行一种低严格洗涤，以便去除背景探针信号。对于一种例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的实施例是在45℃下0.1xSSC，持续15分钟。对于一种例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实施例是在40℃下4-6xSSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10-50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na⁺离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下，大约0.01至1.0M的Na⁺离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30℃。通过加入去稳定试剂例如甲酰胺也可以实现严格条件。一般而言，比在特定的杂交测定中观察到的对于不相关的探针高2倍(或更高)的信噪比，表明检测到特异的杂交。如果它们所编码的蛋白是基本上完全相同的，这些在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上完全相同的。这是(例如)在使用由该遗传密码所允许的最大密码子简并产生一种核酸的拷贝时发生的。

“植物”是处于发育的任何阶段的任何一种植物，特别是一种种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理的单位，包括原生质体和细胞壁。该植物细胞可以是处于一种分离的单细胞或一种培养的细胞的形式、或作为高等组织化的单位(例如像，一种植物组织、一种植物器官、或整株植物)的一部分。

“植物细胞的培养物”是指植物单位的培养物，像例如原生质体、细胞培养物的细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及处于不同的发育阶段的胚。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

“植物器官”是植物的独特的、并且具有可见结构的、并且已分化的部分，如根、茎、叶、花芽、或胚。

如在此所使用的“植物组织”是指被组织成为一种结构和功能单位的多个植物细胞的组。包括了在植物中或在培养物中植物的任何组织。本术语包括但不局限于：整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织成结构和/或功能单元的植物细胞的任何组。“植物组织”包括已分化的和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、嫩枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织、以及细胞和培养物的多种形式例如，单一的细胞、原生质体、胚、和愈伤组织。该植物组织可以在植物中或在器官、组织或细胞培养物中。

本术语与如以上所列的任何特异类型的植物组织一起(或在其缺失时)的使用、或通过由这项定义所涵盖含的其他方式的使用并非旨在排除任何其他类型的植物组织。

术语“玉米”、“苞米”以及“玉蜀黍”在此被可交换地使用并且指属于玉蜀黍属的植物包括例如玉蜀黍种的商用的或非商用的不同品系、种属或品种。

本发明涉及转基因植物，该植物包括稳定地整合于其基因组中的嵌合的多核苷酸构建体，特别地一种嵌合的DNA构建体，该构建体包括一种感兴趣的编码蛋白的多核苷酸，特别地一种感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸，该多核苷酸处于调节核苷酸序列的控制之下，该调节核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能指导所述感兴趣的编码蛋白的多核苷酸表达于该植物的基本上所有组织中，除了这些雄性繁殖结构的组织、特别地花粉和/或雄花穗的组织之外，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在用于筛选探针的表达谱实验中可以得到其至少一部分具有一种转录起始功能的根据本发明的调节核苷酸序列，该转录起始功能介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于大多数组织中，除了这些雄性繁殖结构的组织、特别地花粉和/或雄花穗的组织之外，该探针在所有样品中给出强信号但在花粉和/或雄花穗样品中仅有微弱的或没有信号，这表明在大多数植物组织中表达了由所述探针表示的这些对应的多核苷酸但是在花粉和/或雄花穗的组织中不或基本上不表达。特别地，可以筛选玉米植物组织和这些繁殖结构的组织、特别地该花粉和/或雄花穗的组织以鉴别和得到根据本发明的调节序列。

特别地，可以将所有植物组织的样品，特别地玉米植物的绿色组织和根的样品，直接地与来自该雄性繁殖结构的组织样品、特别地花粉和/或雄花穗的组织样品进行比较。将表示不符合该目标表达谱的多核苷酸的探针消除。仅对在所有的非花粉/非雄花穗组织中具有最强信号并且在花粉和/或雄花穗中具有弱或没有信号的那些探针进行选择用于进一步分析，表示多核苷酸的探针是在所有组织样品中高度表达但在花粉和/或雄花穗中显示基本上没有表达的那些探针。然后可以将所述探针与植物cDNA装配数据库进行比对以检测bona fide植物基因，特别地玉米基因或推测的玉米基因。

按照实施例中所描述的这些步骤，被鉴定为在所有组织样品中高度表达但在花粉中基本上不表达的表示基因的玉米芯片上的DNA序列表示探针，特别地由如SEQ ID NO：47至56中所给出的DNA序列所表示的探针以及在所有组织样品中被高度表达的并且在雄花穗样品中具有基本上没有或减少表达的那些表示基因，特别地由如SEQ ID NO：57-79中所给出的DNA序列所表示的探针，可以容易地被延伸到所设计的表达盒中。

可以将来自表达谱分析各表达种类所得到的探针候选序列进行选择并且前进到最终的二元载体中，其中所设计的表达盒连接到感兴趣的基因(像例如报告基因，即GUS报告基因)上。

在第一步骤中，将一个或多个适合的限制性内切酶位点(像例如SanDI/RsrII位点)置于各表达盒的侧翼并且克隆到该载体分子中。包括该转录起始功能的调节区典型地位于该转录起始位点的上游处约1000-1500bp的片段中并且延伸到该第二外显子中，或到该天然翻译起始密码子中(如果它不在该第一外显子上)。典型地，使用玉米优化的Kozak序列′gtaaaccatgg′将它终止。然后将该设计的翻译起始密码子植入适合的限制性酶切位点中，例如NcoI限制性内切酶位点′ccatgg′。将位于该设计的限制性酶切位点的上游处的理论的转录本中所有的翻译起始密码子进行消除。至少一个终止密码子应当存在与位于该设计的限制性酶切位点的上游处的各阅读框中。对包括该转录起始功能的调节区进行设计以将适合的限制性酶切位点置于侧翼，像，例如，位于5′端的XhoI/SanDI位点和位于3′端的NcoI位点。

在在此给出的作为NcoI/SacI片段的实施例中，提供了感兴趣的基因(GOI)例如GUS报告基因作为适合的限制性酶切片段。该末端从刚好越过该翻译终止密码子向下游延伸约1kb。对该末端进行设计以便将适合的限制性酶切位点置于侧翼，像，例如在5′端的SacI以及在3′端的RsrII/XmaI。

对该完全表达盒进行设计以便作为适合的限制性酶切片段(例如SanDI/RsrII片段)进行移动，可以将该SanDI/RsrII片段连接入位于农杆菌二元载体(例如在SEQ ID NO：80中给出的载体)上的相应位点中。

通过单碱基取代对在以上所鉴定的克隆步骤中所使用的所有内部的限制性酶切位点进行突变以便将它们沉默。

通过使用这些基本的步骤，植物表达盒可以被设计以应答于对应的探针分子，特别地被鉴别为表示基因的玉米芯片上的探针分子(这些基因被高度表达于所有组织样品中但基本上不表达于花粉中)，特别地由如SEQ ID NO：47至56中所给出的DNA序列所表示的探针以及被鉴定为在所有组织样品中被高度表达并且在雄花穗样品中基本上不或减少表达的表示基因的那些探针，特别地由在SEQ ID NOs：57至79中所给出的DNA序列所表示的探针。前者是能够在所有玉米组织中被转录并且在花粉中不被转录的一种表达盒。后者是能够在所有玉米组织中被转录并且在雄花穗中不被或仅被适当地转录的一种表达盒。这个设计策略可以被用于表达谱实验中所鉴定的所有探针。

在本发明的一个具体的实施方案中，使用上述指标导致鉴定了展示所希望的表达谱的那些基因。特别地，对编码肌动蛋白结合蛋白3(ABP3)，特别地玉米的肌动蛋白结合蛋白3(ZmABP3)的基因进行鉴定，该基因是小基因家族中的成员，该小基因家族以前已经被表征(Lopez et al.，1996)。该基因产物还被称为肌动蛋白解聚因子3。

通过DNA印迹分析显示在玉米基因组中存在两个ABP3基因(Lopez etal.，1996)，分别地在此指定为ZmABP3-A和ZmABP3-B。ZmABP3-A和ZmABP3-B cDNA编码一个除了一个以外，在所有残基上完全相同的139个氨基酸的蛋白。表达谱数据表明ZmABP3-B被高度表达于该植物的大多数组织中，但基本上排除表达于该花粉的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，而ZmABP3-A没有被像这样被高度表达。

ZmABP3-B基因的结构分析显示ZmABP3-B蛋白编码区被编码于3个外显子上，这3个外显子被侧翼是所期望的GT...AG边缘核苷酸的两个内插序列(内含子)中断。

该调节序列被置于该编码序列的紧邻上游的ABP3基因的5′-区中。该调节区的尺寸是在约2kb至3kb之间的范围内，特别地在约2.3kb至2.5kb之间，并且包含5′-非转录性序列，特别地约0.9kb至1.3kb之间的5′-非转录性序列，但特别地约1.1kb，以及5′-UTR，特别地约0.1kb至0.3kb之间，但特别地0.25kb的5′-UTR，以及表示ZmABP3-内含子1的核苷酸序列的全部或部分，特别地，约0.7kb至1.2kb之间的核苷酸序列，但特别地约0.98kb。

根据本发明该调节序列进一步包括刚好越过该ABP3翻译终止密码子开始的3′序列的一部分，包括被转录但不被翻译的序列(UTR)和作为转录终止子和多腺苷酸化信号起作用的不被转录的序列。特别地，该3′-序列是在约0.8kb至约1.2kb之间的范围内，特别地约0.9kb至约1.1kb，但特别地约1.013kb。该3′-UTR的尺寸是在约0.2kb至约0.4kb之间的范围内，但特别地约0.3kb，并且该非转录性序列的尺寸在约0.5kb至约0.8kb之间的范围内，但特别地约0.7kb。

在本发明的一个具体的实施方案中，对该调节序列进行修饰从而将该天然翻译终止密码子沉默以将它移动到该第二外显子中。

在本发明的另一个实施方案中，可以在DNA芯片或基因阵列上对候选探针进行鉴定，特别地玉米DNA芯片或基因阵列，例如，如使用上述指标的玉米Affymetrix^TM芯片，该芯片能够被用于在展示所希望的表达谱的玉米基因组上鉴定基因或推测的基因。将两个候选探针进行鉴定，这两个探针证实了在雄花穗中几乎没有信号但是在其他组织中具有高的信号。这表明由所述候选探针所表示的基因在雄花穗中没有表达并且在遍及该植物的其余部分中被高度地表达。在候选探针Zm033444_S_AT中观察到最大的表达差异，在非雄花穗组织中高60倍。另一个候选探针(Zm040564_X_AT)显示根据该被探测植物物质的发育情况进行信号改变，即当该植物变老时，在年幼的雄花穗中的低信号逐渐地增加到高或强信号。雄花穗和非雄花穗样品之间的信号强度差别达低于10倍，但与另一个候选探针相比非雄花穗样品中的信号强度几乎比它高10倍。这些序列数据表明这两种探针都不相应于一种特征标记的基因。两种探针都鉴别了用于开发启动子的良好的候选基因，该启动子在非雄花穗组织中提供了高表达并且在雄花穗中提供了很少的或没有表达。给定雄花穗与非雄花穗样品之间的高信号差异，开发出基于探针Zm033444_S_AT的一种表达盒。

可以使用候选探针Zm033444_S_AT序列通过BLASTN查询公共的和专有数据库以得到用于转录本和相应于Zm033444_S_AT的gDNA的DNA序列证据。与该查询序列精确匹配的的cDNA命中落在两个相似的重叠群中。ZmABT1相应于玉米1482.c47和玉米1908.c31，并且ZmABT2相应于玉米1482.c32、玉米1482.c28、玉米1482.c53、玉米1908.c17、玉米1908.c20、玉米1908.c37和AI947567。

然后使用Zm033444_S_AT、ZmABT1和ZmABT2序列来查询玉米基因组DNA序列数据库来鉴定该一个或多个调节序列，该一个或多个调节序列在非雄花穗组织中给出高表达并且在雄花穗中给出很少的或没有表达。这些查询鉴定了三个条目，AZM4_12、ZmGSStuc11-12-04.4740.1、以及MAGI_88845，这三个条目组装成单个的重叠群。该ZmABT gDNA序列示于SEQ ID NO：46中。它编码ZmABT1和ZmABT2这两个转录本，它表明这两个转录本是相同的转录本的可替代的剪接的变体。

ZmABT1被编码在5个外显子上，并且ZmABT2被编码在6个外显子上。额外的外显子位于ZmABT1的外显子1和外显子2之间。可以使用ZmABT1和ZmABT2上的最大开放阅读框来定义它们的翻译起始和终止密码子并且进一步来定义各翻译起始和终止密码子的位置。通过这个分析，这两个cDNA都使用相同的翻译起始和终止密码子。

在本发明的一个重要的方面中，根据本发明该调节序列可以被用于开发强表达盒，这些表达盒在该植物的大多数组织中表达重组基因，但在雄性繁殖结构的组织中特别地在花粉和/或雄花穗的组织中不或基本上不表达从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在本发明的一个具体实施方案中，可以将可从ABP3基因得到的调节序列、更特别地可从玉蜀黍ABP3基因得到的调节序列用于开发强表达盒，该表达盒在该植物的大多数组织中但基本上排除花粉的组织表达重组基因从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

根据本发明该调节序列的转录起始区，特别地从ABP3基因中可得到的调节序列的转录起始区，更特别地从玉蜀黍ABP3基因中可得到的调节序列的转录起始区可以通过从gDNA模板，特别地玉米gDNA模板进行扩增，在PCR反应中得到，该PCR反应包括引物对，该引物对包括正向引物P1(5′-atatatgcatgcggcgcgccgaaagtagcaaacaacaggttcatgtgcac-3′)(如SEQ ID NO：1中所述)和反向引物P2(5′-tatataccatggtgggtttgcctgcgaccacaagttca-3′)(如SEQ IDNO：2中所述)。在本发明的具体的实施方案中，使用热循环程序，该程序包括在以下条件下进行扩增：在约95℃下持续约15分钟，随后在约94℃下持续约1分钟约45个循环，在约64℃下持续约1分钟并且在约72℃下持续约5分钟。在约72℃下持续约15分钟完成最终的延伸步骤。将反应产物，特别地约2.3kb的反应产物，进行纯化并且使用本领域中已知的DNA提取方法提取DNA。将该DNA沉淀、回收、并且最终克隆入适合的载体中。

可以使用选自下组寡核苷酸的寡核苷酸中的至少一项将根据本发明的转录起始区，特别地从ABP3基因中可得到的转录起始区，更特别地从ZmABP3中可得到的转录起始区在一系列反应中进行修饰，该组寡核苷酸描述如下：

-SEQ ID NO：3(Patg(5′-cagctcgcccgagttggtaaggccccct-3′))，

-SEQ ID NO：4(Pnco(5′-acagattagtccatcgcccacggt-3′))，

-SEQ ID NO：5(ADPc-1(5′-agccctgtccatgacggcccaagcaac-3′))，

-SEQ ID NO：6(ADPc-2(5′-agtagcaattcggtaggcacaggcac-3′))，

-SEQ ID NO：7(ADPc-4(5′-tctatggtctgcgaggtgcggtggc-3′))，以及

-SEQ ID NO：8(adp3-a(5′-gtccccttcttcgccgcgccagctcgc-3′))。

可以在使用正向引物(P3(5′-tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3′))(如SEQ ID NO：9中所述)和反向引物(P4(5′-atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3′))(如SEQ ID NO：10中所述)的DNA聚合酶反应中从gDNA模板、特别地玉米gDNA模板将根据本发明的调节序列的末端、特别地从ABP3基因中可得到的末端序列、更特别地从ZmABP3中可得到的末端序列进行扩增。可以使用热循环程序，该程序包括约95℃持续约5分钟的第一循环，随后约94℃持续约30秒约45个循环，约50℃持续约1分钟并且约72℃持续约4分钟。在约72℃下持续约15分钟可以完成最终的延伸步骤。然后将该约1kb反应产物进行纯化并且使用标准提取方法提取DNA。将该DNA沉淀、回收并且克隆入适合的载体中。

可以在DNA聚合酶反应中，使用适合的引物对、特别地引物对Tnco(5′-Pgtaaaaaaaggtcccttggctcccagaaga-3′)/T2(5′-Pcaatgtgttagactgacgtg-3′)(如分别地在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中所述)将根据本发明的调节序列的末端、特别地从ABP3基因中可得到的末端序列、更特别地从ZmABP3中可得到的末端序列进行修饰以去除内部限制性酶切位点，特别地NcoI限制性酶切位点。所使用的热循环程序可以包括在约95℃下持续约5分钟的第一循环，随后约95℃持续约1分钟约30个循环，约50℃持续约1分钟并且约65℃持续约15分钟。然后可以将该产物进行处理并测序。

本发明还针对结合感兴趣的一种目标基因的这些调节机制的表达盒，该目标基因显示所希望的表达谱，该目标基因在大多数植物组织中是高度表达的但在花粉组织中不表达，特别地ABP目标基因，更特别地ZmABP3目标基因，本发明针对在植物中以模拟该原始目标基因的表达谱的方式控制感兴趣的核酸分子的产物的表达。

本发明进一步包括多个表达盒，这些表达盒结合从该目标基因的5’区、特别地ABP目标基因的5’区、更特别地ZmABP3目标基因的5’区中可得到的调节序列，以在植物组织中表达感兴趣的核酸分子的产物但在花粉组织中不或基本上不表达。本发明还针对结合从该目标基因的5’区和3’区、特别地ABP3目标基因的5’区和3’区、更特别地ZmABP3目标基因的的5’区和3’区中可得到的两个调节序列的表达盒。

在本发明的另一个具体的实施方案中，可以将从玉米基因组DNA中可得到的调节序列用于开发强表达盒，该表达盒在该植物的大多数组织中但基本上排除雄花穗的组织中转录多核苷酸从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

可以使用一种包括在内的、基于基因结构的设计策略来构建这样表达盒。为了将在如上述方法中鉴定的该推测的玉米基因的已知的可替代的剪接结合入该表达盒中，该设计策略可以基于ZmABT1转录本(示于SEQ ID NO：33中)的结构。

可以在DNA聚合酶反应中，从玉米gDNA模板将根据本发明的调节序列的转录起始区、特别地该ZmABT启动子区的转录起始区进行扩增，该DNA聚合酶反应包含gDNA和引物对，该引物对包括正向引物ABT P1 forw(5′-CGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3′)(如SEQ ID NO：19中所述)和ABT P2rev(5′-ACCCCAGGGCGTACGACAAGGCC-3′)(如SEQ ID NO：20中所述)。在本发明的一个具体的实施方案中，使用热循环程序，该程序包括在以下条件下进行扩增：在约95℃下持续约5分钟，随后94℃持续约30分钟约40个循环，约67℃持续约30秒并且约72℃持续约2.5分钟。在约72℃下持续约10分钟完成最终的延伸步骤。

这个扩增反应导致约2.6kb的扩增产物，可以将该扩增产物纯化并且使用一种标准的DNA提取方法提取DNA。然后可以将该DNA克隆入适合的载体中，例如，如该pCR-BluntII-TOPO载体。

可以在一系列的诱变反应中对该ZmABT启动子进行修饰以沉默该内源性的翻译起始密码子，沉默SanDI限制性酶切位点并且校正在扩增期间产生的点突变。可以使用选自下组寡核苷酸的寡核苷酸中的至少一项在一系列的反应中完成这项工作，该组寡核苷酸包括：

-SEQ ID NO：21pABT mut1

(5′-GATGGCCGGATTGGGCTCCCGGGGTGGAG-3′)

-SEQ ID NO：22pABT mut2

(5′-CTGGGAGGCGCGCAAGGGGCAGTTCCTCG-3′)

-SEQ ID NO：23pABT                     mut3

(5′-CCCACCGCCGGAGCACCGAAAGGCCCCGCG-3′)

-SEQ ID NO：24pABT mut4

(5′-GTCACCCGGGAGCACTTCCCGGCGCCG-3′)

-SEQ ID NO：25pABT mut5

(5′-CATTGGGCCGAGCACGGCTTCTTCCGC-3′)

-SEQ ID NO：26pABT mut6

(5′-GGGGTACGGTGTTCTTGAGTCGTGAAGCGAC-3′)

可以在另一个PCR反应中使用引物pABT amp1(5′-GCGTCTAGAGGGACCCCGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3′)(如SEQID NO：27中所述)和pABT amp2(5′-ACCCCAGGG-CGTACGACAAGGCCCCACCATGGGCGC-3′)(如SEQ ID NO：28中所述)将该修饰过的ZmABT启动子进行扩增。然后可以将该PCR产物进行纯化并且使用一种标准的DNA提取方法提取DNA。可以将该DNA克隆入一个适合的载体中(例如，如该pCR-BluntII-TOPO载体)，转化并且测序。然后可以将该ZmABT启动子切除(特别地作为XbaI/NcoI片段)并且连接到适合的表达载体上(例如，如pNOV6901)。

在本发明的一个实施方案中，提供了表达盒，该表达盒包括终止序列，该终止序列可以从已被鉴定的并且在以上描述的ZmABT基因中得到。可以在DNA聚合酶反应中，从玉米gDNA模板将该ZmABT末端进行扩增，该DNA聚合酶反应包含gDNA和引物对，该引物对包括正向引物ABT P4(5′-TATATAGAGCTCGAATCGAAGAAGCCACACTGTAAATCTGCCGGG-3′)(如SEQ ID NO：29中所述)和反向引物ABT  P5(5′-AGCAAGGCATATGCAGCAGCTGCTGGTCGGACCGGGCCCTATATA-3′)(如SEQ ID NO：30中所述)，生成约1kb的扩增产物。可以将该反应产物进行纯化并且使用一种标准的DNA提取方法提取DNA。然后可以将该纯化的DNA克隆入适合的载体中，例如，如该pCR4-TOPO-Blunt载体。

在本发明的一个实施方案中，对该ZmABP3末端进行修饰以去除内部的NcoI和XhoI限制性酶切位点。可以使用选自下组寡核苷酸的寡核苷酸中的至少一项在一系列的反应中完成这项工作，该组寡核苷酸包括：

-SEQ ID NO：31ABTt m1(5′-GTCATGCATGGGCATGTGAAGGAGGAGCC-3′)

-SEQ ID NO：32ABTt m2(5′-GTTGCATGCATGCTGCATGGCGTCGAGAT-3′)

然后可以将该扩增产物进行处理并且测序以生产如SEQ ID NO：36中所示的终止子序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了表达盒，该表达盒在该植物的大多数组织中但基本上排除在雄花穗的组织中表达重组基因从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，该表达盒包括其至少一部分具有一种转录起始功能的调节序列和其至少一部分具有一种终止功能的调节序列两者，这些调节序列可以从已鉴定的并且以上描述的ZmABT基因中得到。

在本发明的一个实施方案中，通过切除该被切除的ZmABT末端并且将它连接到适合的载体上可以得到这样一种表达盒，该适合的载体已经包括了其至少一部分具有一种转录起始功能的调节序列，特别地该ZmABT启动子的序列例如，如上述的pNOV6901-prABT载体。

在一个实施方案中，根据本发明的表达盒包含调节核苷酸序列，该核苷酸序列包括约2.6kb的5′-序列，该5′-序列的组成为约2kb的5′-非转录性序列、和约12bp的5′-UTR、约0.6kb表示外显子1、内含子1、和约16bp的外显子2；以及约1kb的3′-序列，该3′-序列在刚好越过该翻译终止密码子处开始并且包括约0.6kb的3′-UTR和约0.4kb的非转录性序列，并且作为转录终止子和多腺苷酸化信号起作用。

在一个实施方案中，提供一种根据本发明的表达盒，其中该天然翻译终止密码子被沉默并被移到该第二外显子中。

然后可以将该完全的表达盒移入适合的载体中用于植物转化和表达，例如，如农杆菌二元载体，特别地农杆菌二元载体15289。

该感兴趣的核酸片段可以例如编码核糖体RNA、一种反义RNA或不被翻译成蛋白的任何其他类型的RNA。在本发明的另一个优选的实施方案中，感兴趣的核酸片段被翻译成一种蛋白产物。指导转录的核苷酸序列和/或核酸片段相对于有待转化的植物可以是同源来源的或异源来源的。对于引入植物细胞中有用的重组DNA分子包括从任何来源得到或分离的那种分子，随后可以对这种分子进行结构尺寸和/或功能的表征、进行化学改变、并且稍后引入植物中。因此，一种有用的核苷酸序列、区段或感兴趣的片段包括完全合成的DNA、半合成的DNA、从生物来源中分离的DNA、等。一般地，该引入的DNA不是最初驻留在该植物基因型中的，该植物基因型是该DNA的受体，但从一个给定的植物基因型中分离基因，并且随后将该基因的多个拷贝引入该相同的基因型中(例如，提高一种给定的基因产物(例如一种储藏蛋白)或涉及碳水化合物代谢的一种蛋白或感兴趣的任何其他基因(如序列表的SEQ ID NO中所提供的)的生产)是在本发明的范围内。

被引入的重组DNA分子包括但不限于来自植物基因、以及非植物基因(例如来自细菌、酵母、动物或病毒的那些)的DNA。被引入的DNA可以包括修饰的基因、基因的部分、或嵌合基因，包括来自相同或不同基因型的基因。术语“嵌合基因”或“嵌合DNA”被定义为包括来自多个物种的至少两个DNA序列或片段的一个基因或DNA序列或片段，在自然条件下这些物种不结合DNA，或该DNA序列或片段以未转化的植物的天然基因组中正常不会发生的方式被定位或连接。

用于在此转化的被引入的重组DNA分子可以是环形的或线性的、双链的或单链的。一般地，DNA处于嵌合DNA的形式，例如质粒DNA。

在一个实施方案中，可以将这些调节序列与感兴趣的可表达的多核苷酸进行可操作地连接。该可表达的多核苷酸可以编码感兴趣的多肽或蛋白。

这样一种感兴趣的多肽或蛋白可以是一种展示某一生物活性的多肽或蛋白(例如，如一种杀虫、除草或杀真菌活性)或可以以改善产量、品质、倒伏、生物的和非生物的胁迫耐受性、开花控制等形式有助于农学上感兴趣的一种作物植物的改善的性能。

在一个实施方案中，从这些繁殖结构的组织中、特别地花粉和/或雄花穗的组织中感兴趣的编码蛋白的多核苷酸中表达的该多肽产物的浓度是这样的即在标准的昆虫摄食测定法中不能检测到杀虫的活性。特别地，这些雄性繁殖结构的组织中、特别地花粉和/或雄花穗的组织中表达产物的浓度是低于约10ng/mg可溶蛋白的基本水平，特别地约5ng/mg可溶蛋白，更特别地约3ng/mg可溶蛋白，但特别地约2ng/mg可溶蛋白或以下。

在本发明的一个具体的实施方案中，该感兴趣的多肽或蛋白是一种杀虫活性蛋白或多肽，特别地一种能从苏云金芽孢杆菌中得到的杀虫活性的蛋白或多肽，更特别地一种苏云金芽孢杆菌内毒素，例如，如cryIA(b)内毒素。已知在苏云金芽孢杆菌中存在的其他内毒素可以同样被用于与根据本发明的调节序列结合以得到毒素表达于除了花粉和/或雄花穗以外的大多数植物组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中感兴趣的编码该多肽或蛋白的多核苷酸编码苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有与SEQ ID NO：15中所述的一种核苷酸序列至少80％序列同一性，特别地至少85％序列同一性、特别地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在一个实施方案中，提供了根据本发明并且如在此所述的转基因植物，其中该感兴趣的编码多肽或蛋白的多核苷酸编码了一种苏云金芽孢杆菌的内毒素，具有如SEQ ID NO：15中所述的核苷酸序列。

一旦完成，可以将该表达盒移入适合的载体中用于植物转化，例如，如然后可以通过土壤杆菌介导的转化将一种二元载体移入玉米中。

可以通过许多种已建立的技术生成结合本发明的多核苷酸和/或表达感兴趣的多肽(例如，如一种苏云金芽孢杆菌的的毒素蛋白)的转基因植物(或植物细胞、或植物外植体、或植物组织)。根据本发明并且如在此所述构建表达盒以及结合该调节多核苷酸序列的载体之后，可以使用标准技术来将该多核苷酸引入感兴趣的一种植物、一种植物细胞、一种植物外植体或一种植物组织中。任选地，可以将该植物细胞、外植体或组织进行再生以生成转基因植物。该植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。适合的实验方案对于豆科(苜蓿、大豆、三叶草、等)、伞形科(胡萝卜、芹菜、欧洲防风草(parship))、十字花科(甘蓝、萝卜、油菜籽、青花椰菜、等)、葫芦科(甜瓜和黄瓜)、禾本科(小麦、玉米、稻、大麦、粟、等)、茄科(马铃薯、番茄、烟草、胡椒、等)以及多种其他作物是可获得的。参见Ammiratoet al.，eds.，(1984)Handbook of Plant Cell Culture--Crop Species，MacmillanPubl.Co.，New York，N.Y.；Shimamoto et al.(1989)Nature 338：274276；Frommet al.(1990)Bio/Technol.8：833839；以及Vasil et al.(1990)Bio/Technol.8：429434中所述实验方案。单子叶植物细胞和双子叶植物细胞的转化和再生现在是常规性的，并且选择最适当的转化技术将由实际工作者进行确定。方法的选择将随着有待转化的植物的类型而改变；本领域的普通技术人员应当理解对于给定的植物类型特定方法的适合性。适合的方法可以包括但不限于：植物原生质体的电穿孔、脂质体介导的转化、聚乙二醇(PEG)介导的转化、使用病毒进行转化、植物细胞的微注射、植物细胞的微弹轰击、真空渗透、以及根癌农杆菌介导的转化。

用单一DNA分子或多种DNA分子(即，共转化)可以进行植物的转化，并且这两种技术都适合使用本发明的表达盒。可获得多种转化载体用于植物转化，并且可以将本发明的表达盒用于与任何这类载体进行连接。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标物种。

本领域技术人员了解并可使用多种技术来将构建物引入植物细胞宿主中。总体上，这些技术包括使用一种根癌农杆菌(A.tumefaciens)或毛根农杆菌(A.rhizogenes)作为转化试剂用DNA进行转化、脂质体、PEG沉淀、电穿孔、DNA注射、直接DNA摄入、微弹轰击、颗粒加速、等(参见，例如，EP 295959和EP 138341)(参见以下)。然而，可以用本发明的表达盒转化除了植物细胞以外的细胞。植物表达载体和报告基因、以及农杆菌和农杆菌介导的基因转移的一般性描述可以在Gruber等人(1993)中找到。

可以将包含根据本发明的调节多核苷酸序列的表达载体引入原生质体中或引入完整的组织或分离的细胞中。优选地，将表达载体引入完整的组织中。例如，由Maki等人(1993)并且由Phillips等人(1988)提供了培养植物组织的一般性的方法。优选地，使用一种直接基因转移方法(例如微弹介导的递送、DNA注射、电穿孔等)将表达载体引入玉米或其他植物组织中。更优选地，使用基因枪装置使用微弹介导的递送将表达载体引入植物组织中。参见例如Tomes等人(1995)。本发明的载体不但能够被用于表达结构基因而且可以被用于外显子捕获克隆或启动子捕获步骤中以检测多种组织中差异的基因表达(Lindsey et al.，1993；Auch & Reth et al.)。

使用农杆菌属的Ti和Ri质粒的二元类型的载体是特别优选的。Ti衍生的载体转化了多种多样的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如大豆、棉花、油菜、烟草、以及稻(Pacciotti et al.，1985：Byrne et al.，1987；Sukhapinda et al.，1987；Lorz et al.，1985；Potrykus，1985；Park et al.，1985：Hieiet al.，1994)。使用T-DNA来转化植物细胞已经进行了广泛的研究并且被详细描述(EP 120516；Hoekema，1985；Knauf，et al.，1983；以及An et al.，1985)。为了引入植物中，可以如在实施例中所述将本发明的嵌合基因插入二元载体中。

本领域的普通技术人员应当理解，方法的选择应当取决于用于转化所靶向的植物的类型(即单子叶植物或双子叶植物)。转化植物细胞的适合的方法包括但不限于，微注射(Crossway等人，1986)、电穿孔(Riggs等人，1986)、土壤杆菌介导的转化(Hinchee等人，1988)、直接基因转移(Paszkowski等人，1984)、以及使用可从Agracetus公司(威斯康辛州麦迪逊)和BioRad(加利福尼亚州赫格拉斯)可获得的装置进行弹道颗粒加速(参见，例如，Sanford等人，美国专利号4,945,050；和McCabe等人，1988)。还参见，Weissinger等人，1988；Sanford等人，1987(葱头)；Christou等人，1988(大豆)；McCabe等人，1988(大豆)；Datta等人，1990(稻)；Klein等人，1988(玉米)；Klein等人，1988(玉米)；Klein等人，1988(玉米)；Fromm等人，1990(玉米)；以及Gordon-Kamm等人，1990(玉米)；Svab等人，1990(烟草叶绿体)；Koziel等人，1993(玉米)；Shimamoto等人，1989(稻)；Christou等人，1991(稻)；欧洲专利申请EP 0332581(鸭茅和其他早熟禾亚科)；Vasil等人，1993(小麦)；Weeks等人，1993(小麦)。在一个实施方案中，使用用于玉米的原生质体转化方法(欧洲专利申请EP 0292435、美国专利号5,350,689)。

在另一个实施方案中，本发明的一种核苷酸序列被直接转化进入质体基因组中。质体转化技术在美国专利号5,451,513、5,545,817、和5,545,818中、在PCT申请号WO 95/16783、并且在McBride等人，1994中进行了广泛地说明。转化后，优选地使用一种被结合入该转化载体中的显性选择性标记对植物进行选择。典型地，这样一种标记将在这些转化的植物上提供抗生素或除草剂抗性，并且通过将这些植物暴露于适当浓度的抗生素或除草剂下可以实现转化体的选择。

将转化的植物细胞或植物进行选择并且生长至成熟之后，对显示感兴趣的性状的那些植物进行鉴定。该性状可以是上述那些性状中的任何一项。此外，为了证实感兴趣的性状是由于在根据本发明的调节核苷酸的控制下感兴趣的被引入的多核苷酸的表达，使用RNA印迹、RT-PCR或微阵列通过分析mRNA表达或使用免疫印迹或蛋白质印迹或酶活性测定通过分析蛋白表达可以确定感兴趣的多肽或多核苷酸的表达水平或活性。

因此本发明涉及植物细胞和组织，涉及分别地从这类细胞和组织得到的植物，涉及植物材料，涉及子代并且涉及从这类植物中得到种子、并且涉及多种农产品，这些农产品包括通过例如以下描述的多种转化方法中的任何一项能够得到的具有改善的特性的处理过的植物产品。

一旦已经将与一种感兴趣的多核苷酸连接的包括根据本发明的一种调节序列的根据本发明并且如在此所述的一种表达盒转化入特定的植物物种中时，可以使用传统的培育技术将它在该物种中进行繁殖或将它移入相同物种的其他品种中，特别地包括商用品种。本发明的优选的植物包括裸子植物、单子叶植物、和双子叶植物，特别地农艺学上重要的作物植物，例如稻、小麦、大麦、黑麦、油菜、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、青花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、葱头、蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、西葫芦、黄瓜、苹果、梨、榅桲(quince)、甜瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑刺莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱以及甘蔗。

设计进入上述转基因植物中的遗传特性通过有性繁殖或营养生长被传递，并且可以因此被维持并在子代植物中繁殖。一般而言，所述维持和繁殖使用了已知的为满足特定的目的(如耕种、播种或收割)而开发的农业方法。也可以使用专门的方法例如水培或温室技术。根据本发明在植物育种中可以进一步使用这些转基因植物的有利的遗传性质，该育种是针对开发具有改善的特性(例如对害虫、杀虫剂或胁迫耐受)、改善的营养值、增加的产量或改善的结构(导致从倒伏或落粒的损失更少)的植物。通过已明确定义的人类介入(例如选择有待杂交的品系、直接授粉亲本品系或选择适当的子代植物)对多种育种步骤进行表征。取决于所希望的特性，可以采取不同的育种措施。这些相关技术在本领域中是熟知的并且包括但不限于杂交、近交、回交育种、多品系育种、品种混合、种间杂交、非整倍体技术、等。杂交技术还包括通过机械的、化学的或生物化学的方法将植物绝育以生成雄性或雌性不育植物。用不同品系的花粉将雄性不育植物杂交授粉确保该雄性不育植物而不是雌性不育植物的基因组将均一地得到这两个亲本品系两者的特性。因此，根据本发明的转基因植物可以用于改进的植物株系的育种，这些株系(例如)提高了常规方法如除草剂或杀虫剂处理的效率、或这因为它们的经过修饰的遗传特性而允许人们免除所述方法。可替代地，由于它们优化的遗传“设备”可以得到具有改进的胁迫耐受性的新作物，从而生产比不能耐受可比较的不利发育条件的产物更好品质的收获的产物。

在本发明的一个实施方案中，已经用一种编码多肽或蛋白的核苷酸序列转化该植物并且该植物表达该编码多肽或蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列在该植物的大多数组织中但基本上排除花粉和/或雄花穗的组织中编码展示一种杀虫活性的多肽产物、特别地一种苏云金芽孢杆菌的内毒素从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中，其中该核苷酸序列没有以任何显著的程度被转录。因此，基本上没有表达发生在花粉和/或雄花穗组织中并且仅有残留量的表达产物(即便有)可以在所述组织中被检测到，该量不足以用于表达产物以在所述组织中实现它的想见的生物学功能或者展示或者对以这些组织为食的昆虫或者对植物自身的任何毒性作用。

特别地，从这些花粉和/或雄花穗的组织中的感兴趣的编码蛋白的多核苷酸中表达的该多肽产物的浓度是这样的即在标准的昆虫摄食测定法中不能检测到杀虫的活性。在本发明的一个实施方案中，在花粉中表达产物的浓度是低于约10ng/mg可溶蛋白的基本水平的，特别地约5ng/mg可溶蛋白、更特别地约3ng/mg可溶蛋白，但特别地约2ng/mg可溶蛋白或以下。

本发明还提供了用于制备包括根据本发明的调节序列的表达盒的方法，该方法包括用根据本发明并且如在此所述的调节序列与对一种多肽或一种感兴趣的蛋白进行编码的可表达的多核苷酸进行连接以得到一种表达构建体，其中该感兴趣的多核苷酸被可操作地与该调节序列进行连接或连接从而该多肽或一种感兴趣的蛋白的表达被根据本发明的调节序列所介导并且导致所述多肽或感兴趣的一种蛋白在基本上所有植物组织中进行表达，但基本上排除在该植物的繁殖结构的组织中、特别地在该花粉和/或雄花穗的组织中进行表达，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

在一个实施方案中，本发明涉及一种生产转基因植物的方法，该转基因植物在非花粉组织中表达一种感兴趣的DNA序列但在该花粉和/或雄花穗的组织中不或基本上不表达该序列，该方法包括：

a)将根据本发明并且如在此所述的一种表达盒转化入一种植物细胞中，该表达盒包括一种调节核苷酸序列，该核苷酸序列的至少一部分具有一种转录起始功能，该转录起始功能介导将一种感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸表达于大多数植物组织中但基本上排除了花粉和/或雄花穗的组织从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中；并且

b)将步骤a)中转化的植物细胞再生成为植物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种防治目标昆虫-以营养植物组织例如叶、茎和根为食和/或以繁殖组织例如穗为食的害虫、但是保护以花粉为食的非目标害虫的方法，该方法包括：

a)在区域内生长一种根据本发明并且如在此所述的植物，用目标害虫侵染该区域；

b)在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下表达一种多肽或蛋白，该多肽或蛋白能够防治所述目标害虫。

在一个实施方案中，本发明涉及一种通过在所述组织中表达感兴趣的一种多肽或蛋白，从而保护一种植物的繁殖组织、特别地该花粉和/或雄花穗的组织免受损害的方法，该方法包括：

a)生长一种根据本发明或如在此所述的植物；

b)在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下表达一种感兴趣的多肽或蛋白。

在一个实施方案中，本发明涉及使用根据本发明并且如在此所披露的一种调节序列来防治目标昆虫-以营养植物组织例如叶、茎和根为食和/或以繁殖组织例如穗为食的害虫、但是保护以花粉为食的非目标害虫的方法，该方法包括：

a)在区域内生长一种根据本发明并且如在此所述的植物，用目标害虫侵染该区域；

b)在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下表达一种多肽或蛋白，该多肽或蛋白能够防治所述目标害虫。

在一个实施方案中，本发明涉及通过在所述组织中表达一种感兴趣的多肽或蛋白(包括在根据本发明并且如在此所述的一种调节序列的控制下表达所述多肽或感兴趣的蛋白)从而使用根据本发明并且如在此所披露的一种调节序列来保护植物的繁殖组织、特别地花粉和/或雄花穗组织免受损伤。

实施例

以下实施例提供多个说明性实施方案。根据本披露以及本领域中一般水平的技能，普通技术人员应当理解以下实施例仅仅旨在是示例性的并且在不离开本要求的主题的范围下可以使用许多改变、变换和更改。

用于构建和繁殖本发明中所述的菌株所需要的所有操作和技术对于本领域的普通技术人员是已知的。技术细节被描述于例如Ausubel et al 1995、Sambrook，J，2001和Miller，J.H.1992之中，并且描述于本发明中所引用的相关出版物中。

实施例1：非花粉表达

实施例1.1  ZmABP3的鉴定

在表达谱试验中，在玉蜀黍(Zm80K)Affymetrix芯片上查询玉米发育系列，寻找在所有样品中给出强信号、但在花粉样品中不或基本上不给出强信号的探针。将所有这些绿色组织和根样品直接地与花粉进行比较，并且将表示不符合该目标表达谱的多核苷酸的探针消除。该分析生成两组结果。第一组包含36个探针，这些探针表示在所有组织样品中被高度表达但在花粉中被非常低的表达的多核苷酸。第二组包含10个探针，这些探针表示在所有组织样品中被高度表达但在花粉中没有给出信号的多核苷酸。与玉米cDNA集合数据库进行探针序列的比对显示所有46个探针表示了bona fide玉米基因。前面10个探针是那些探针，它们在所有非花粉组织中具有最强的信号并且在花粉中没有信号(参见表A)。

使用另外的指标包括确定基因组DNA(gDNA)和cDNA序列有效性，因为每个序列导致生成的Zm07728_s_at成为满足所有启动子开发要求的最前面的候选者。文献分析显示这种探针表示对肌动蛋白结合蛋白3(ZmABP3)进行编码的基因，该肌动蛋白结合蛋白3是小基因家族中的成员，该小基因家族以前已经被表征(Lopez et al.，1996)。该基因产物也被称为肌动蛋白解聚因子3。在图3中Lopez等人(1996)证实了除了花粉样品外，ZmABP3被高度表达于被检测植物的大多数组织中。

Lopez等人(1996)还通过DNA印迹分析显示在玉米基因组中存在两个ABP3基因。他们报告的ZmABP3cDNA是GenBank登录号X97726，并且它对应于TIGR登录号TC248585。这个基因被指定为ZmABP3-A。这两个ZmABP3基因都在该玉米(Zm80K)Affymetrix芯片上进行表示：ZmABP3-A对应于探针Zm007595_at并且ZmABP3-B对应于Zm07728_s_at。使用′Zm07728_s_at′序列来在TIGR数据库中鉴定TC248588，并且在玉米cDNA集合数据库中鉴定MAIZE.974.CB1。还鉴定了MAGI_93606、MAGI_93607、AZM4_39177、ZmGSStuc11-12-04.2725.1、ZmGSStuc11-12-04.2725.2和CC463190gDNA序列。ZmABP3-A和ZmABP3-B cDNA编码除了一个以外，在所有残基上完全相同的蛋白。表达谱数据表明ZmABP3-B被高度表达于该植物的大多数组织中，但基本上排除表达于该花粉的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。ZmABP3-A没有被同样地高度表达。

SEQ ID NO：16显示ZmABP3-B mRNA被编码在3个外显子上。通过这些预期的GT...AG边缘核苷酸将两个间插序列(内含子)括起来。

更确切地说，SEQ ID NO：16披露了ZmABP3表达盒的设计。有待包括入该构建体中的ZmABP3调节元件是2.3kb的5′-序列(prZmABP3-01)，该5′-序列包括1.1kb的5′-非转录的序列、0.25kb的5′-UTR和0.98kb表示ZmABP3-B-内含子1；以及1.013kb的3′-序列(tZmZBP3-01)，该3′-序列正好在越过该ABP3-B翻译终止密码子处开始。这包括约0.3kb的3′-UTR以及0.7kb的非转录的序列。

表A显示前面10个候选探针的汇总，这些探针表示在所有玉米组织中具有高表达水平并且在花粉中没有表达信号的多核苷酸。

实施例1.2  Cry1AbG6的构建

Cry1AbG6(2814bp)是全长Cry1Ab(pNOV1321，3546bp)基因的修饰的版本。将Geiser序列(pNOV1321中从4398至4478的81bp)和3′端(pNOV1321中从4908至5558的651bp)删除。

如下由pNOV1321(用于该Cry1Ab全长基因的源载体)构建该Cry1AbG6序列：用BamHI/SacI切割pNOV1321质粒DNA。将该Cry1Ab全长基因(3546bp，命名为Michigan)进行凝胶纯化并且连接到pTrcHisB表达载体上(Invitrogen life technologies，Cat#V36020)，用BamHI/SacI将其进行切割。这个构建体被命名为Michigan-pTrcHisB。使用下面的引物通过重叠PCR将该Geiser序列(81bp)从Michigan-pTrcHisB中删除：

5’Bfr1(5′-cctggtggagtgcttaagcgacgagttctgcctgg-3′)，(SEQ ID NO：83)

3’Xba1(5′-gggcttctcctccaggaactctagattgcccaggcg-3′)，(SEQ ID NO：84)

5’Gfix(5′-catcggcaagtgccaccacagccaccacttcagcctg-3′)(SEQ ID NO：85)以及

3’Gfix(5′-gctgtggtggcacttgccgatggggctggg-3′)(SEQ ID NO：86)。

使用高保真PCR使用Michigan-pTrcHisB(作为模板)，以及5’Bfr1和3’Gfix引物生成PCR产物A。使用高保真PCR使用Michigan-pTrcHisB(作为模板)，以及5’Gfix和3’Xba1引物生成PCR产物B。最终PCR使用产物A和B(作为模板)，以及5’Bfr1和3’Xba1引物。用AflII/XbaI消化最终PCR条带并且进行凝胶纯化。将这个片段连接到也已经用XbaI/AflII消化过的Michigan-pTrcHisB上。通过AflII/XbaI酶解分析鉴定了正确的重组DNA产物。这个构建体被命名为Cry1Ab-G。

通过高保真PCR使用pNOV1321(作为模板)，SEQ ID NO：87中描述的5’1Ab5XbaI(5′-gcccgcctgggcaatctagagttcctggaggag-3′)引物，和SEQ ID NO：88中描述的3’1Ab3d6(5′-gcgagctcctagatgcggccctcgagttcctcgaaga-3′)引物，生成第二PCR产物。用XbaI/SacI将该PCR产物消化然后连接到也用XbaI/SacI消化的Cry1Ab-G上。使用BamHI/SacI限制性酶切分析鉴定了正确的重组DNA产物。这个构建体被命名为Cry1AbG6。

将Cry1AbG6序列进行QuikChange诱变以去除内部NcoI位点。该25μL反应包含

1μL Cry1AbG6模板，

2.5μL 10X QuikChange缓冲剂，

1μL QuikChange dNTP混合物，

1μL 20μM cy2’(5′-Pccctgtacggcacgatgggcaacgctgca-3′；SEQ ID NO：89)，

0.75μL Quik溶液以及

1μL QuikChange DNA聚合酶。

热循环程序是95℃持续5分钟，随后95℃持续1分钟30个循环，55℃持续1分钟并且65℃持续20分钟。按照生产厂家(Stratagene)的描述对该产物进行处理并且进行完全测序。

用以上的诱变的质粒模板在包含以下各项的50μL Pfu turbo(Stratagene)DNA聚合酶反应中将Cry1AbG6编码序列进行扩增：

5μL模板，

5μL 10x Pfu缓冲剂，

1μL 10mM dNTP混合物，

1μL 20μM cy1(5′-atatatccaccatggacaacaaccccaaca-3′；SEQ ID NO：90)，

1μL 20μM cy2(5′-tatatagagctcctagatgcggccctcgagt-3′；SEQ ID NO：91)以及

1μL Pfu turbo DNA聚合酶，

热循环程序是95℃持续2分钟，随后95℃持续1分钟40个循环，50℃持续1分钟并且72℃持续7分钟。最终的延伸步骤是72℃持续15分钟。在1％TAE琼脂糖上将该2.8kb反应产物进行凝胶纯化，并且使用QiaprepDNA提取方法对该DNA进行提取。用NcoI/SacI对回收的DNA进行消化，然后连接到也用NcoI/SacI消化过的pNOV6901载体上。这个操作用Cry1AbG6替换了pNOV6901中的GUS编码序列。在SEQ ID NO：15中给出该Cry1AbG6序列。

实施例1.3  ZmABP3表达盒的构建

使用包括在内的设计策略来开发该ZmABP3表达盒。该盒包含2.3kb的5′-序列，该5′-序列的组成为1.1kb的5′-非转录序列、0.25kb的5′-UTR和0.98kb表示ZmABP3-内含子1。将该天然的翻译起始密码子沉默以将它移动到该第二外显子。该表达盒还包含1.013kb的3′-序列，该3′-序列刚好在越过该ABP3翻译终止密码子处开始。这包括约0.3kb的3′-UTR以及0.7kb的非转录序列，并且作为转录终止子和多腺苷酸化信号起作用。

在含有以下各项的50μL Proofstart(Qiagen)DNA聚合酶反应中用玉米gDNA模板扩增该ZmABP3末端：

10μg gDNA，

5uL 10X Proofstart缓冲剂，

1.5μL 10mM dNTP混合物，

2.5μL 20μM P3(5′-tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3′；SEQ ID NO：9)，

2.5μL 20μM P4(5′-atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3′；SEQID NO：10)，

10μL Q溶液以及

2μL Proofstart DNA聚合酶。

热循环程序是95℃持续5分钟，随后94℃持续30秒45个循环，50℃持续1分钟并且72℃持续4分钟。最终的延伸步骤是72℃持续15分钟。在1％TAE琼脂糖上将该1kb反应产物进行凝胶纯化，并且使用QiaprepDNA提取方法对该DNA进行提取。将该DNA进行乙醇沉淀并且回收到4μLddH₂O中，然后克隆到该pCR4-TOPO-Blunt载体中。

使用Stratagene QuikChange多位点诱变试剂盒对该ZmABP3末端进行修饰以去除内部的NcoI限制性内切酶位点。该25μL反应包含

1μL pCR4-TOPO-ZmABP3-末端，

2.5μL 10xQuikChange缓冲剂，

1μL QuikChange dNTP混合物，

1μL 20μM Tnco(5′-Pgtaaaaaaaggtcccttggctcccagaaga-3′；SEQ ID NO：11)，

1μL 20μM T2(5′-Pcaatgtgttagactgacgtg-3′；SEQ ID NO：12)，

0.75μL Quik溶液以及

1μL QuikChange DNA聚合酶。

热循环程序是95℃持续5分钟，随后95℃持续1分钟30个循环，50℃持续1分钟并且65℃持续15分钟。按照生产厂家(Stratagene)的描述对该产物进行处理并且进行全测序。该ZmABP3-末端序列示于SEQ ID NO：14中。

在含有以下各项的50μL Hotstart(Qiagen)DNA聚合酶反应中由玉米gDNA模板扩增该ZmABP3启动子：

10μg gDNA，

25μL 2xHotstart Master混合物，

1.25μL 20μM P1

(5′-atatatgcatgcggcgcgccgaaagtagcaaacaacaggttcatgtgcac-3′；SEQ ID NO：1)，

1.25μL 20μM P2(5′-tatataccatggtgggtttgcctgcgaccacaagttca-3′；SEQ IDNO：2)，

10.5μL Q溶液以及

2μL 25mM MgCl₂。

热循环程序是95℃持续15分钟，随后94℃持续1分钟45个循环，64℃持续1分钟并且72℃持续5分钟。最终的延伸步骤是72℃持续15分钟。在1％TAE琼脂糖上将该2.3kb反应产物进行凝胶纯化，并且使用Qiaprep DNA提取方法对该DNA进行提取。将该DNA进行乙醇沉淀并且回收到4μL ddH₂O中，然后克隆到该pCR4-TOPO载体中。

如上所述使用以下寡核苷酸在一系列QuikChange反应中对该ZmABP3启动子进行修饰：

Patg(5′-cagctcgcccgagttggtaaggccccct-3′；SEQ ID NO：3)，

Pnco(5′-acagattagtccatcgcccacggt-3′；SEQ ID NO：4)，

ADPc-1(5′-agccctgtccatgacggcccaagcaac-3′；SEQ ID NO：5)，

ADPc-2(5′-agtagcaattcggtaggcacaggcac-3′；SEQ ID NO：6)，

ADPc-4(5′-tctatggtctgcgaggtgcggtggc-3′；SEQ ID NO：7)，以及

adp3-a(5′-gtccccttcttcgccgcgccagctcgc-3′；SEQ ID NO：8)。

该ZmABP3启动子序列示于SEQ ID NO：13中。

将该ZmABP3末端作为SacI/SpeI片段连接到该pNOV6901-Cry1AbG6载体(来自实施例2)上。随后将该ZmABP3启动子作为SphI/NcoI片段连接到该载体上。这个生成的ZmABP3-Cry1AbG6-组件示于SEQ ID NO：37中。将该完整的ZmABP3-Cry1AbG6表达盒作为AscI片段移动入二元载体中(pNOV6900)。这些构建体，ZmABP3-Cry1AbG6-6900和增强的ZmABP3-Cry1AbG6-二元，分别地示于SEQ ID NOS：38和39中。这些载体之间的唯一的差别是在该增强的ZmABP3-Cry1AbG6-二元中存在CaMV-FMV二元增强子。通过土壤杆菌介导的转化将这两者移动到玉米中。

实施例1.4  ZmABP3-AmCyan的构建

从ZmABP3-Cry1AbG6-组件中切除该Cry1AbG6编码序列，作为NcoI/SacI片段。用AmCyan报告基因编码序列替换它，从质粒13718中切除该AmCyan报告基因编码序列，作为NcoI/SacI片段。这个生成的ZmABP3-AmCyan-组件构建体示于SEQ ID NO：40中。将该ZmABP3-AmCyan表达盒作为AscI片段移动入二元载体中(pNOV6900)。这个构建体，ZmABP3-AmCyan-二元，示于SEQ ID NO：41中。通过土壤杆菌介导的转化将它移动到玉米中。

实施例1.5  由转基因玉米中ZmABP3-AmCyan表达

生成包含该ZmABP3-AmCyan表达盒的几个转基因玉米事件。对包含单拷贝的转基因和非预期的载体序列的那些进行分析。所有转基因事件在叶组织中积累AmCyan转录本(数据未示出)。对来自代表性事件的几个组织进行AmCyan转录本积累的检测。使用植物RNAeasy总RNA分离系统(Qiagen)来制备总RNA。使用由Shirzadegan等人(1991)描述的方法来制备花粉总RNA。使用紫外分光光度计法对制品的品质进行评估，并且在1％甲醛凝胶上对每个样品10μg总RNA进行分辨然后按照推荐的实验方案(Schleicher &Schuell)转到Nytran SuPerCharge膜上。使用高严格条件将该印迹杂交到随机引物³²P-标记的AmCyan DNA探针上。结果清楚地显示ZmABP3促进了在雄花穗、叶、穗丝、穗和根组织中的转录，但没有促进在花粉中的转录。

实施例1.6  由转基因玉米中ZmABP3-Cry1AbG6表达

生成包含该ZmABP3-Cry1AbG6表达盒的几个转基因玉米事件。对包含单拷贝的转基因和非预期的载体序列的那些进行分析。在发育过程期间对T0事件测试两次，检测抗玉米螟蛉的杀虫活性。该第一样品在V2-V4处取得，并且该第二样品在V7-V9处取得。将来自下部叶尖的叶盘切除并且置于47x10mm培养皿中的被水湿润的Whatman纸上。将十到二十个L1玉米螟蛉(corn earworm)或欧洲玉米螟幼虫加入各培养皿中，并且在28℃下将它们孵化48小时。然后对叶盘进行计分，检测昆虫损伤。具有不可见的叶损伤以及绝对致命性的样品被计分为正，并且具有可见损伤的那些是负。得到的数据显示具有抗这两种昆虫的活性的几个转基因事件已被鉴定。

使用带有完全截短的Cry1Ab标准品的酶联免疫吸附测定(ELISA)还测量了T0植物中Cry1AbG6蛋白的积累。在幼苗叶组织上进行该第一测定，对转到土壤中1-2周的样品取样。在来自成熟的植物的叶组织上进行该第二测定，对刚好转变为繁殖发育之前进行取样。表B中的数据显示在具有杀虫活性的植物中积累的Cry1AbG6蛋白的范围。这些数据表明植物需要差不多50ng(或更多)Cry1AbG6蛋白/mg可提取的蛋白以具有杀虫活性。

表B显示温室生长的植物的昆虫防治特性。

使用截短的Cry1Ab蛋白作为标准品通过ELISA对来自T0植物的叶组织进行Cry1AbG6蛋白的测定、检测玉米螟蛉活性和欧洲玉米螟(ECB)活性。当取样时该植物发育阶段被表示在各列的顶部。对较老的(下部的)叶组织进行取样。对于昆虫测定，(+)表明没有可视的叶损伤以及完全的和绝对的昆虫致命性。可视的叶损伤生成(-)分数。

实施例1.7  在大田中ZmABP3-Cry1AbG6事件的欧洲玉米螟功效

在2006年的生长季节期间在明尼苏达州的斯坦顿(SMN)和伊利诺斯州的(IL)布卢明顿(BIL)进行了ECB(欧洲玉米螟)田间功效的研究。对近等基因系杂交体(包括列于表C中的ABP3-Cry1AbG6事件)、Btll、以及一种非转基因对照杂交体进行测试。在每个位置用三次重复进行随机完全区组实验设计。由包含25个植物的5.31m长的行(其中行间距0.76m)构成曲线图。

表C显示了在大田研究中ZmABP3-Cry1AbG6玉米的性能。

在2006年在伊利诺斯州的布卢明顿(BIL)和明尼苏达州的斯坦顿(SMN)进行了两项研究。将几个ZmABP3-Cry1AG6事件与分别地由Btll和负校验所表示的正和负基准进行比较。

按照Guthrie(1989)中描述的步骤在衣阿华州的(IA)斯莱特的SyngentaSeeds公司昆虫学实验室从实验室群体生成I龄期ECB。在约28℃下并且在约80％相对湿度下将卵进行孵化，并且在孵化后约6小时从孵化容器中收集新生的幼虫。如通过运动来表明的，当置于植物上时幼虫是健康的并且有活力的。

执行两个ECB应用类型。ECB1，在大约V6-V8叶子阶段进行使用并且ECB2，在花粉脱落时进行使用。使用BioServe Davis接种器每个应用使用1ml玉米穗轴粗碾物进行这些应用。对于ECB1(一代ECB侵染)，将总计约150个幼虫置于玉米穗轴粗碾物中各植物的轮中。进行了二至四个应用，各应用之间一到六天。该行中第一个植物没有被处理，并且然后高达10个顺序的植物被侵染。

对于ECB2(二代ECB侵染)，每个植物使用总计约200个幼虫，将这些幼虫置于玉米穗轴粗碾物中穗叶腋中以及直接位于该穗的上方或下方的叶腋中。进行了四个应用，各应用之间一到六天。在ECB1处理的行的相对端上高达10个顺序的植物被侵染。该行的最后一个植物没有被处理。

对以下观察进行记录。对于ECB1，在第一侵染后至少14天对在该行中高达8个顺序的被侵染的植物进行评估检测叶的ECB损伤(表C中的ECBLR)。使用Guthrie分值1-9(Guthrie et al.(1960)并且对于每个曲线图对等级、被评估植物的平均数进行记录。对于ECB2，在这些植物被侵染后约45天，将来自ECB1评估的行的相对端上的高达8个顺序地被侵染的植物切开以便通过测量摄食通道的长度(cm)对穗柄、穗粒、以及茎的摄食进行评估。

将ECB2数据进行适合用于随机完全区段设计的方差分析。重复被认为是随机的而所有其他影响被认为是固定的。但是只要对于多个条目的F-测试在常规的5％显著性水平下是显著的，使用最小显著性差异(LSD)方法进行均值分离。因为在这些ECB1数据中这些事件直接没有差异性，对于这个性状没有作方差分析。在表D中汇总了这些数据和分析。一般而言，与在Btll物质中所观察到的类似，这些数据显示ZmABP3-Cry1ABG6提供了抗ECB的保护。

表D显示了在转基因玉米组织中Cry1AbG6蛋白的数量。对于每个植物在5个发育阶段(V5-V6、V8、V10、R1、R3-R4)使用ELISA对最年幼的发育的叶进行Cry1AbG6的测试。还测量花粉中的Cry1AbG6。事件5、12、15和16表达ABP3-Cry1AbG6构建体，并且事件A-D表达增强的ABP3-Cry1Ab构建体。显示的数据是平均值±SD(n＝8-10)。

实施例1.8  使用ZmABP3表达盒来增强玉米中的耐旱性

已经显示了一种拟南芥H⁺-焦磷酸酶(AtAVP1D)的一种去调节形式以便当在几种植物中过表达时提高耐旱性(Gaxiola et al.，2001；Park et al.，2005)。通过遍及整个植物的高表达使这种提高的性能成为可能。为了证实AtAVP1D的应用增强了玉米中的耐旱性，合成了一种玉米优化的编码序列。AtAVP1D合成基因的序列示于SEQ ID NO：16中。它作为NcoI/SacI片段被连接到ZmABP3表达盒上。示于SEQ ID：42中的载体图展示了该ZmABP3-AtAVP1D表达盒。从该Assembly载体中将该完全的ZmABP3-AVP1D表达盒作为SanDI/RsrII片段进行切除并且连接到农杆菌二元载体(15289)的RsrII位点上。该构建体的图示于SEQ ID NO：43中。

实施例1.9  玉米组织中Cry1AbG6的测量

在伊利诺斯州的布卢明顿的Syngenta大田站点生产了对于几个ZmABP3-Cry1ABG6事件的的杂交体T1种子(在ID5829/AX5707背景中)。在2英寸花盆中使几个种子发芽。对幼苗进行转基因配型测试，并且只保留半合子。将每个事件最小量8个植物移植到3加仑花盆中并且在控温的温室中进行生长。对来自各植物的叶组织进行取样并且在发育的5个阶段，V5-V6、V8、V10、R1、和R3-R4(Ritchie et al.，1997)，进行Cry1AbG6蛋白的测定。还收集花粉并且进行Cry1AbG6蛋白的测定。

在各阶段，从最新展开的叶中对叶组织(减去颈、中脉和鞘)进行取样。在96孔模块中对一式两份样品进行粉碎。将粉末悬浮在500μL至1mL提取缓冲剂中(0.1M硼酸钠、0.5％Tween 20、0.2％聚乙烯吡咯酮、0.05％叠氮化钠、以及1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂(Roche))。通过离心将混合物澄清并且使用BCA测定法对可溶蛋白进行定量。将新鲜的花粉收集到1.5mLEppendorf管中。将三个3mm玻璃珠加入各管中并且在-80℃下这些样品冷冻。然后在600rpm下在水平振荡器中将这些样品粉碎。通过加入500μL至1mL提取缓冲剂并且在4℃下孵化30分钟对蛋白进行提取。然后通过在4℃下离心将这些样品澄清，并且通过BCA测定法对各样品中的可溶蛋白进行定量。

将这些样品对于蛋白含量进行归一化，并且使用完全截短的Cry1Ab作为标准品通过ELISA对Cry1AbG6进行定量。每个数据点是两次测量的平均值，在总蛋白的不同稀释下进行该两次测量。各事件的数据以对于所有同一测试的平均值±SD的形式进行报告。

表D中的结果显示ZmABP3-Cry1AbG6盒贯穿整个发育过程在叶组织中生产稳定的Cry1AbG6蛋白。因为营养组织开始衰老(R3-R4)，CryAbG6蛋白的一些减少是明显的同样明显的是在也具有CaMV-FMV双增强子复合体的事件中Cry1AbG6积累的3至5倍增强。最终，这些数据显示在花粉中几乎没有可检出的Cry1AbG6蛋白。在所有的事件中，平均起来CryAbG6积累到少于1.5ng/mg总可溶蛋白。此外，该双增强子复合体没有影响花粉中Cry1AbG6积聚，它在所有事件之间是完全相同的。这与我们的数据一致，我们的数据显示ZmABP3没有被转录于花粉中(实施例5)。我们总结如下即在花粉中可检出的Cry1AbG6可能产自小胞子母细胞或它们的祖细胞中，并且通过细胞分裂被带到花粉中。

实施例2非雄花穗表达

实施例2.1  ZmABT的鉴别

2.1.1  表达谱实验：在Zm80K Affymetrix芯片上的玉米发育系列进行查询，寻找在所有样品中给出强信号并且在雄花穗样品中给出低的信号或没有信号的探针。鉴别出二十三(23)个探针，这些探针表示符合表达指标的多核苷酸。为了更好地代表雄花穗样品与其他组织样品之间不同的表达信号，对各探针计算了其他样品与雄花穗的平均信号的比率。这表明了雄花穗与其他样品之间的表达差异。低于50的任何信号处于实验噪音中，这意味着该基因可能不能被转录或以非常低的水平被转录。为了理解通过候选探针表示的各基因的表达水平，对第二表达谱研究进行查询。在这个实验中，将来自两个玉米基因型的组织杂交到该Zm80K Affymetrix芯片上。一般而言，超过1000的信号表示高表达而超过10,000的信号表示非常高表达。

2.1.2  候选探针的鉴别：对两个最前面的候选探针进行鉴别。探针Zm033444_S_AT证实了在雄花穗中几乎没有信号并且在其他组织中有高信号。这表明由Zm033444_S_AT表示的基因在雄花穗中没有表达并且在遍及该植物的其余部分中被高度表达。它也证实了最大表达差异，在非雄花穗组织中高60倍。探针Zm040564_X_AT在年幼的雄花穗中具有低的信号，该信号逐渐地增加到高或强信号。雄花穗与非雄花穗样品之间的信号强度差别为10倍以下。然而，非雄花穗样品中信号强度比Zm033444_S_AT高几乎10倍。这些序列数据表明这两种探针都不相应于一种特征标记(characterized)的基因。两种探针都鉴别了用于开发启动子的良好的候选基因，该启动子在非雄花穗中提供了高表达并且在雄花穗中提供了很少的或没有表达。给定(given)雄花穗与非雄花穗样品之间的高信号差异，开发出基于探针Zm033444_S_AT的一种表达盒。

表E：显示最前面的候选探针的汇总，这些探针表示在所有玉米组织中具有高表达水平并且在雄花穗中具有低表达信号的多核苷酸。

实施例2.2  开发一种表达盒

收集用于鉴别相应于Zm033444_S_AT的cDNA的DNA序列证据。使用Zm033444_S_AT序列通过BLASTN对公共的和专用的数据库进行查询。与该查询序列精确匹配的cDNA命中落在两个相似的重叠群中。ZmABT1相应于玉米1482.c47和玉米1908.c31，并且ZmABT2相应于玉米1482.c32、玉米1482.c28、玉米1482.c53、玉米1908.c17、玉米1908.c20、玉米1908.c37和AI947567。使用Zm033444_S_AT、ZmABT1和ZmABT2序列查询玉米基因组DNA序列数据库来鉴定一个或多个调节序列，该一个或多个调节序列在非雄花穗组织中给出高表达并且在雄花穗中给出很少的或没有表达。这些查询鉴定了三个条目，AZM4_12、ZmGSStuc11-12-04.4740.1以及MAGI_88845，这三个条目组装成单个的重叠群。该ZmABT gDNA序列示于SEQ ID NO：46中。它编码ZmABT1和ZmABT2两者(分别地SEQ ID NO：33和34)。可替代地它们是相同转录本的剪接的变异体。

ZmABT1被编码在5个外显子上，并且ZmABT2被编码在6个外显子上。额外的外显子位于ZmABT1的外显子1和外显子2之间。使用ZmABT1和ZmABT2上的最大开放阅读框来定义它们的翻译起始和终止密码子。这两个cDNA都使用相同的翻译起始和终止密码子。这个信息能够设计基于ZmABT的表达盒。

实施例3：ZmABT-GUS表达盒的构建

使用一种包括在内的，基于基因结构的设计策略来构建ZmABT表达盒。为了将该基因的已知的可替代的剪接结合到该表达盒中，该设计策略是基于ZmABT1的结构的。该盒包含2.615kb的5′-序列，该5′-序列的组成为2.020kb的5′-非转录序列、12bp的5′-UTR和0.58kb表示外显子1，内含子1和16bp的外显子2。将该天然的翻译起始密码子沉默以将它移动到该第二外显子上。该表达盒还包含1.039kb的3′-序列，该3′-序列刚好在越过该翻译终止密码子处开始。这包括0.603kb的3′-UTR以及0.436kb的非转录序列，并且作为转录终止子和多腺苷酸化信号起作用。

在50μL Proofstart(Qiagen)DNA聚合酶反应中从玉米gDNA模板扩增该ZmABT启动子，该反应包含：10μg gDNA、5μL 10X Proofstart Buffer、1.0μL 10mM dNTP混合物、1.0μL的20μM ABT P1 forw(5′-CGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3′；SEQ ID NO：19)、1.0μL的20μMABT P2rev(5′-ACCCCAGGGCGTACGACAAGGCC-3′；SEQ ID NO：20)、以及10.0μL 5X Q溶液。该热循环程序是95℃持续5分钟，随后94℃持续30秒40个循环，67℃持续30秒并且72℃持续2.5分钟。最终的延伸步骤是72℃持续10分钟。在1％TBE琼脂糖上将该2.6kb反应产物进行凝胶纯化，并且使用Qiaprep DNA提取方法对该DNA进行提取。将该DNA克隆入该pCR-BluntII-TOPO载体中。

在一系列的诱变反应中对该ZmABT启动子进行修饰以沉默该内源性的START密码子，沉默SanDI限制性酶切位点并且修正在扩增期间产生的点突变。使用Stratagene QuikChange多位点诱变试剂盒完成这项工作。该25μL反应包含1μL pCR4-TOPO-ZmABT-启动子、2.5μL 10X QuikChange缓冲剂、1μL QuikChange dNTP混合物、0.75μL Quik溶液、1μL QuikChangeDNA聚合酶以及1μL 20μM以下寡核苷酸中至少一项：

pABT mut1(5′-GATGGCCGGATTGGGCTCCCGGGGTGGAG-3′)(SEQID NO：21)

pABT mut2(5′-CTGGGAGGCGCGCAAGGGGCAGTTCCTCG-3′)(SEQID NO：22)

pABT mut3(5′-CCCACCGCCGGAGCACCGAAAGGCCCCGCG-3′)(SEQ ID NO：23)

pABT mut4(5′-GTCACCCGGGAGCACTTCCCGGCGCCG-3′)(SEQ IDNO：24)

pABT mut5(5′-CATTGGGCCGAGCACGGCTTCTTCCGC-3′)(SEQ IDNO：25)

pABT mut6(5′-GGGGTACGGTGTTCTTGAGTCGTGAAGCGAC-3′)(SEQ ID NO：26)

该热循环程序是95℃持续1分钟，随后95℃持续1分钟35个循环，50℃持续1分钟并且65℃持续12分钟。按照生产厂家(Stratagene)的描述对该产物进行处理并且进行全测序。该ZmABT启动子序列示于SEQ ID NO：35中。

如上述使用引物pABT amp1(5′-GCGTCTAGAGGGACCCCGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3′)(描述于SEQ ID NO：27中)、和pABT amp2(5′-ACCCCAGGGCGTACGACAA-GGCCCCACCATGGGCGC-3′)(描述于SEQ ID NO：28中)在50μL Proofstart(Qiagen)DNA聚合酶反应中从该TOPO载体PCR扩增该校正的ZmABT启动子。在1％TBE琼脂糖上将该PCR产物进行凝胶纯化，并且使用QiaprepDNA提取方法对该DNA进行提取。将该DNA克隆入该pCR-BluntII-TOPO载体中，转化并且测序。将该ZmABT启动子作为XbaI/NcoI片段进行切割并且连接到pNOV6901上。

在50μL Extensor(ABgene)DNA聚合酶反应中从玉米gDNA模板扩增该ZmABT末端，该反应包含：10μg gDNA、5μL 10X Extensor缓冲剂#1、2.0μL 10mM dNTP混合物、2.0μL 的20μM ABT P4(5′-TATATAGAGCTCGAATCGAAGAAGCCACACTGTAAATCTGCCGGG-3′；SEQ ID NO：29)、2.0μL 的20μM ABT P5(5′-AGCAAGGCATATGCAGCAGCTGCTGGTCGGACCGGGCCCTATATA-3′；SEQ ID NO：30)、10μL 5xQ溶液、0.5μL Extensor DNA聚合酶以及0.5μLAmplitaq DNA聚合酶。将矿物油覆盖在这些反应上并且该热循环程序是95℃持续2分钟随后98℃持续2秒钟40个循环、63℃持续1分钟并且68℃持续4分钟。最终的延伸步骤是68℃持续7分钟。在1％TAE琼脂糖上将该1kb反应产物进行凝胶纯化，并且使用Qiaprep DNA提取方法对该DNA进行提取。将该DNA进行乙醇沉淀并且回收到4μL ddH₂O中，然后克隆到该pCR4-TOPO-Blunt载体中。

如上述使用Stratagene QuikChange多位点诱变试剂盒对该ZmABT末端进行修饰以去除内部的NcoI和XhoI限制性酶切位点。该25μL反应包含1μL pCR4-TOPO-ZmABT-启动子、2.5μL 10X QuikChange缓冲剂、1μLQuikChange dNTP混合物、0.75μL Quik溶液、1μL QuikChange DNA聚合酶以及1μL 20μM以下寡核苷酸中至少一项：

ABTtm1(5′-GTCATGCATGGGCATGTGAAGGAGGAGCC-3′)(SEQ IDNO：31)

ABTt m2(5′-GTTGCATGCATGCTGCATGGCGTCGAGAT-3′)(SEQ IDNO：32)

该热循环程序是95℃持续1分钟，随后95℃持续1分钟35个循环，50℃持续1分钟并且65℃持续13分钟。按照生产厂家(Stratagene)的描述对该产物进行处理并且进行全测序。该ZmABT终止子序列示于SEQ ID NO：36中。

将该ZmABT末端作为一种SacI/ApaI片段进行切割并且连接到pNOV6901-prABT载体上(上述)。这生成了质粒15772(ZmABT组装体)，并且将质粒图谱示于SEQ ID NO：44中。将该完全的ZmABT表达盒作为SanDI/RsrII片段移动入该农杆菌二元载体15289的RsrII位点中。该构建体(15773)的质粒图谱示于SEQ ID NO：45中。

实施例4：将DNA探针序列延伸至设计的表达盒

按照以上描述的步骤，可以容易地将在玉米芯片上表示探针的DNA序列延伸到设计的表达盒中。用于被鉴定为被高度表达于所有组织样品中但不被表达于花粉中(表A)的表示基因以及被高度表达于所有组织样品中但在雄花穗样品中具有减少表达的那些(表E)的探针的DNA序列被报告为SEQ IDNOs：47-79。

对来自表达谱分析各表达种类的另外的候选探针进行选择以证实从该DNA序列前进到最终的二元载体中，其中设计的表达盒连接到该GUS报告基因上。所使用的方法与用于ZmABP3和ZmABT的方法完全相同。总之，有待使用的过程步骤如下：

1.将SanDI/RsrII位点置于各表达盒侧翼并且报告为克隆入15289(SEQ ID NO：80)的RsrII位点中。

2.启动子的组成为该转录起始位点的上游处1000-1500bp的序列并且延伸10个碱基进入该第二外显子，或延伸至该天然的翻译起始密码子处(如果该天然的翻译起始密码子不在该第一外显子上)。使用玉米优化的Kozak序列′gtaaaccatgg′将它终止。现在将设计的翻译起始密码子植入该NcoI限制性内切酶位点′ccatgg′中。将位于该设计的NcoI位点的上游处的理论的转录本中所有的翻译起始密码子进行突变。确保至少一个终止密码子位于该设计的NcoI位点的上游处的各阅读框中。对该启动子进行设计以便在5′端将XhoI/SanDI置于侧翼并且在3′端将NcoI置于侧翼。

3.该感兴趣的基因(GOI)作为NcoI/SacI片段通过GUS报告基因进行表示。

4.该末端从刚好越过该翻译终止密码子向下游延伸1kb。对该末端进行设计以便在5′端将SacI置于侧翼并且在3′端将RsrII/XmaI置于侧翼。

5.对该完全表达盒进行设计以便作为SanDI/RsrII片段进行移动，可以将该SanDI/RsrII片段连接入位于农杆菌二元载体例如15289(SEQ IDNO：80)上的RsrII位点中。

6.通过单碱基取代将所有内部的SanDI、RsrII、NcoI、SacI、XhoI和XmaI位点进行突变以将它们沉默。

通过使用这些基本的步骤，可以设计一种植物表达盒(SEQ ID NO：81)(该表达盒相应于探针Zm058948_s_at(SEQ ID NO：55))和一种植物表达盒(SEQ ID NO：82)(该表达盒相应于探针Zm002990_s_at(SEQ ID NO：62))。前者是能够在所有玉米组织中被转录并且在花粉中不被转录的一种表达盒。后者是能够在所有玉米组织中被转录并且在雄花穗中具有减少的转录的一种表达盒。这个设计策略用于在表A和E中被鉴定的所有探针中。

如何制备这样的表达盒的进一步的细节被描述于US2005235311中，通过引用将它以其全部内容结合在此。

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U.S.Pat No.5,545,817

U.S.Pat No.5,545,818

U.S.Pat.No.5,350,689

U.S.Pat No.5,451,513

U.S.Pat.No.4,945,050

WO 95/16783

Claims (65)

1.转基因植物，包括稳定地整合在其基因组中的嵌合多核苷酸构建体，该构建体包括至少一种感兴趣的编码蛋白的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与调节核苷酸序列连接(associate)和/或处于其可操作的控制之下，该核苷酸序列的至少一部分具有将所述感兴趣的多核苷酸的表达导向大多数植物组织中、但基本上排除导向这些繁殖性植物结构的组织中的转录起始功能。

2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述感兴趣的多核苷酸的表达被导向至目标昆虫正常地以之为食的组织中。

3.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述繁殖性植物结构的组织是花粉和/或雄花穗的组织。

4.根据权利要求1所述的转基因植物，其中感兴趣的编码蛋白的多核苷酸不被或基本上不被转录于花粉和/或雄花穗的组织中，从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

5.根据权利要求1所述的转基因植物，其中该嵌合DNA构建体包括感兴趣的编码蛋白的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与调节核苷酸序列连接和/或处于其可操作的控制之下，该核苷酸序列的至少一部分具有可从玉米基因组中存在的基因中得到的转录起始功能。

6.根据权利要求1所述的转基因植物，其中该嵌合DNA构建体包括感兴趣的编码蛋白的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与调节核苷酸序列连接和/或处于其可操作的控制之下，该核苷酸序列的至少一部分具有可从基因得到的转录起始功能，该基因被表达于所有组织样品中但不或基本上不表达于花粉和/或雄花穗的组织中，该基因通过探针分子、特别是显示如SEQ IDNO：47至79中所述的DNA序列的DNA探针分子来表示。

7.根据权利要求6所述的转基因植物，其中该嵌合DNA构建体包括感兴趣的编码蛋白的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与调节核苷酸序列连接和/或处于其可操作的控制之下，该核苷酸序列的至少一部分具有可从编码肌动蛋白解聚因子3(ABP3)的基因得到的转录起始功能，该肌动蛋白解聚因子3被表达于该植物的大多数组织中，但不被或基本上不被表达于花粉组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

8.根据权利要求7所述的转基因植物，其中所述肌动蛋白解聚因子3(ABP3)基因是来自玉米的。

9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列与SEQ ID NO：13中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于花粉的组织中从而没有或基本上没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

10.根据权利要求8所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：13中所述的核苷酸序列杂交并且其中所述调节序列控制感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于花粉的组织中。

11.根据权利要求8所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列是SEQ ID NO：13中所述的序列。

12.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述感兴趣的多核苷酸进一步提供了转录终止功能，其中提供所述功能的序列与SEQ ID NO：14中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性。

13.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述调节核苷酸序列进一步提供转录终止功能并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：14中所述的核苷酸序列杂交。

14.根据权利要求12所述的转基因植物，其中提供该转录终止功能的核苷酸序列是SEQ ID NO：14中所述的序列。

15.根据权利要求1所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列与SEQ ID NO：35中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

16.根据权利要求1所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：35中所述的核苷酸序列杂交，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但是基本上排除转录于雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

17.根据权利要求15所述的转基因植物，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列是SEQ ID NO：35中所述的序列。

18.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述感兴趣的多核苷酸进一步提供了转录终止功能，其中提供所述功能的序列与SEQ ID NO：36中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性。

19.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述调节核苷酸序列进一步提供转录终止功能并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：36中所述的核苷酸序列杂交。

20.根据权利要求18所述的转基因植物，其中提供该转录终止功能的调节核苷酸序列是SEQ ID NO：36中所述的序列。

21.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述感兴趣的编码蛋白的多核苷酸是编码多肽或蛋白的核苷酸序列。

22.根据权利要求21所述的转基因植物，其中感兴趣的多核苷酸编码显示杀虫活性的多肽产物。

23.根据权利要求22所述的转基因植物，其中该感兴趣的基因编码苏云金芽孢杆菌的内毒素。

24.根据权利要求22所述的转基因植物，其中由该感兴趣的编码蛋白的多核苷酸在植物繁殖结构、特别是在花粉和/或雄花穗的组织中表达的多肽产物的浓度使得在标准昆虫摄食测定中不能检测到杀虫活性并且也不能对该植物繁殖结构、特别是对花粉和/或雄花穗的组织无毒性作用。

25.根据权利要求24所述的转基因植物，其中该植物繁殖结构的组织中、特别是花粉和/或雄花穗的组织中的多肽浓度低于10ng/mg可溶性蛋白的基本水平。

26.根据权利要求1所述的转基因植物，其中该感兴趣的基因编码多肽产物，该多肽产物有助于提高耐旱性。

27.根据权利要求26所述的转基因植物，其中该感兴趣的基因编码H⁺-焦磷酸酶的去调节形式。

28.根据以上权利要求中任何一项所述的转基因植物，其中植物是玉蜀黍植物。

29.调节核苷酸序列，该核苷酸序列的至少一部分具有转录起始功能，该转录起始功能介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的核苷酸在大多数植物组织中、但基本上排除在该雄性繁殖性植物结构的组织中的表达。

30.根据权利要求29所述的调节核苷酸序列，其中该雄性繁殖性植物结构的组织是花粉和/或雄花穗的组织。

31.根据权利要求29所述的调节核苷酸序列，其中在花粉和/或雄花穗的组织中的表达使得没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

32.根据权利要求29所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列能够从该玉米基因组中存在的基因中得到。

33.根据权利要求32所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列能够从基因中得到，该基因被表达于所有组织样品中但不或基本上不被表达于花粉和/或雄花穗的组织中，该基因通过探针分子，特别是显示如SEQ ID NOs：47至79中所述的DNA序列的DNA探针分子来表示。

34.根据权利要求33所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列能够从编码肌动蛋白解聚因子3的基因中得到，该肌动蛋白解聚因子3被表达于该植物的大多数组织中，但基本上排除该花粉组织，从而没有或基本上没有表达发生于该花粉组织中并且没有或基本上没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

35.根据权利要求34所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列可以由基因组玉蜀黍DNA模板使用正向引物SEQ ID NO：1和反向引物SEQ ID NO：2在PCR反应中得到。

36.根据权利要求35所述的调节核苷酸序列，使用选自如下所示的寡核苷酸组的一个或多个寡核苷酸对该核苷酸序列进行修饰：在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8。

37.根据权利要求34所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列与SEQ ID NO：13中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于该花粉的组织中从而没有或基本上没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

38.根据权利要求34所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：13中所述的核苷酸序列杂交，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于该花粉的组织中从而没有或基本上没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

39.根据权利要求38所述的调节核苷酸序列，其中杂交发生在严格杂交条件下。

40.根据权利要求37所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列是在SEQ ID NO：13中描述的核苷酸序列。

41.根据权利要求34所述的调节核苷酸序列，其中所述调节核苷酸序列进一步提供了转录终止功能，并且其中提供所述功能的序列与SEQ IDNO：14中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性。

42.根据权利要求34所述的调节核苷酸序列，其中所述调节核苷酸序列进一步提供了转录终止功能，并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：14中所述的核苷酸序列杂交。

43.根据权利要求41所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录终止功能的核苷酸序列是在SEQ ID NO：14中描述的序列。

44.根据权利要求43所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列包括转录终止子和多聚腺苷酸化信号。

45.根据权利要求29所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列的至少一部分具有转录起始功能，该转录起始功能介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸在大多数植物组织中但基本上排除在雄花穗的组织中表达从而没有或基本上没有表达发生在该雄花穗的组织中并且没有或基本上没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

46.根据权利要求32所述的调节核苷酸序列，该核苷酸序列可以由基因组玉蜀黍DNA模板使用正向引物SEQ ID NO：19和反向引物SEQ IDNO：20在PCR反应中得到。

47.根据权利要求46所述的调节核苷酸序列，使用选自如下所示的寡核苷酸组的一个或多个寡核苷酸对该核苷酸序列进行修饰：在SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQID NO：26。

48.根据权利要求45所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列与SEQ ID NO：35中所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于该雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

49.根据权利要求45所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列的互补链与SEQ ID NO：35中所述的核苷酸序列杂交，并且其中所述调节序列介导了感兴趣的可操作地连接的编码蛋白的多核苷酸的转录，从而所述连接的多核苷酸被转录于该植物的大多数组织中但不被或基本上不被转录于该雄花穗的组织中从而没有表达产物以任何显著的程度存在于所述组织中。

50.根据权利要求49所述的调节核苷酸序列，其中杂交发生在严格杂交条件下。

51.根据权利要求48所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录起始功能的核苷酸序列是在SEQ ID NO：35中描述的序列。

52.根据权利要求45所述的调节核苷酸序列，其中所述调节核苷酸序列进一步提供了转录终止功能，并且其中提供所述功能的序列与SEQ IDNO：36中所述的核苷酸序列具有至少80％序列同一性。

53.根据权利要求45所述的调节核苷酸序列，其中所述调节核苷酸序列进一步提供了转录终止功能，并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互补链能够与SEQ ID NO：36中所述的核苷酸序列杂交。

54.根据权利要求52所述的调节核苷酸序列，其中提供该转录终止功能的核苷酸序列是在SEQ ID NO：36中描述的序列。

55.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述感兴趣的多核苷酸与根据权利要求29至40以及45至51中任何一项所述的调节核苷酸序列可操作地连接，该调节核苷酸序列包括提供转录起始功能的核苷酸序列。

56.根据权利要求55所述的转基因植物，其中所述感兴趣的多核苷酸与根据权利要求41至44以及52至54中所述的调节核苷酸序列可操作地连接，该调节核苷酸序列进一步包括提供转录终止功能的核苷酸序列。

57.表达盒，包括根据权利要求29至40以及45至51中任何一项所述的调节核苷酸序列，该调节核苷酸序列包括提供转录起始功能的核苷酸序列。

58.根据权利要求57所述的表达盒，包括根据权利要求41至44以及52至54中任何一项所述的调节核苷酸序列，该调节核苷酸序列进一步包括提供转录终止功能的核苷酸序列。

59.载体分子，包括根据权利要求57所述的表达盒。

60.转基因植物，包括如权利要求57所述的表达盒。

61.转基因植物，包括如权利要求59所述的载体分子。

62.生成转基因植物的方法，该植物在非花粉组织中但不在或基本上不在花粉中表达感兴趣的DNA序列，该方法包括：

a)将根据权利要求57的表达盒或将根据权利要求59的载体分子转化入植物细胞或植物组织中；并且

b)将步骤a)中转化的植物细胞再生成为植物。

63.根据权利要求62所述的方法，其中表达盒被转化入整个植物中。

64.防治目标昆虫-以营养植物组织例如叶、茎和根为食和/或以繁殖性组织例如穗为食的害虫，但是保护以花粉为食的非目标害虫的方法，该方法包括：

a)在用目标害虫侵染区域内培养根据以上权利要求中任何一项所述的植物；

b)表达多肽或蛋白，该多肽或蛋白能够在根据以上权利要求中任何一项所述的调节序列的控制下防治所述目标害虫。

65.由于在所述组织中表达感兴趣的多肽或蛋白而使得保护植物的繁殖组织、特别地该花粉和/或雄花穗的组织免受损害的方法，该方法包括：

a)培养根据以上权利要求中任何一项所述的植物；并且

b)在根据以上权利要求中任何一项所述的调节序列的控制下，在所述植物中表达感兴趣的多肽或蛋白。