MX2010014495A - Lipopeptidos ciclicos para uso como moduladores del sabor. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de uno o más lipopéptidos cíclicos, tales como las surfactinas A, B1 y C, y derivados y mezclas de los mismos, como un modulador del sabor y/o intensificador de dulzura para composiciones comestibles que contienen por lo menos un edulcorante natural o artificial; las composiciones comestibles incluyen alimento, bebidas, productos medicinales y cosméticos, y contienen de preferencia monosacáridos, disacáridos u oligosacáridos como edulcorantes; la invención se refiere además a dichas composiciones comestibles que contienen un lipopéptido cíclico como modulador del sabor.

Description

LIPOPÉPTIDOS CÍCLICOS PARA USO COMO MODULADORES DEL SABOR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de moléculas que pertenecen al grupo de lipopéptidos cíclicos como moduladores del sabor, de preferencia para composiciones comestibles que contienen por lo menos un edulcorante. En una modalidad preferida, se usan surfactinas para el propósito de la invención. Además, esta invención se refiere a un método para la modulación del sabor y/o dejo de dichas composiciones comestibles, asi como a dichas composiciones que contienen por lo menos un lipopéptido cíclico como modulador del sabor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las surfactinas son lipopéptidos cíclicos de origen microbiano que actúan como bioagentes tensoactivos debido a sus propiedades anfifílicas. Para una clasificación química, pueden designarse como lipodepsipéptidos cíclicos que son una forma especial de depsipéptidos. Los depsipéptidos son con frecuencia sintetizados en una forma cíclica (ciclodepsipéptidos) por hongos, por ejemplo, Metarhizium sp. o Cladobotryum sp., y bacterias, por ejemplo, Pseudomonas syringae (véase el documento US 5,830,855) o Bacillus subtilis (véase el documento EP 0761682 B1), y exhiben propiedades antibióticas y fitopatógenas. En los depsipéptidos, los aminoácidos e hidroxiácidos son enlazados por la formación de enlaces peptídicos, así como por la formación de enlaces de éster. Los depsipéptidos pertenecen por lo tanto a los heterodetpéptidos, caracterizados porque los enlaces peptídicos, así como los enlaces no peptídicos, están implicados en la coherencia de la molécula. El documento EP 0761682 B1 describe la preparación de depsipéptidos cíclicos de Bacillus subtilis, y propone un uso terapéutico en hiperlipemia. Las surfactinas y otros lipopéptidos cíclicos están disponibles comercialmente.

Las surfactinas consisten de un bucle peptídico de siete aminoácidos y una cadena de ácido graso hidrofóbica, que permiten que la molécula penetre las membranas celulares. Tienen una conformación característica de "silla de montar", con su cola de lípidos permitiendo la penetración de la membrana. Muchas moléculas variantes se conocen hasta la fecha: las surfactinas A-i, A2, A3, Bi, B2) C1 , C2 y D, respectivamente. Las formas variantes difieren en la longitud y; el factor de ramificación de la cola de lípidos, mientras que el péptido cíclico se mantiene esencialmente sin cambios, comprendiendo ácido L-glutámico, L-leucina, D-leucina, L-valina, L-asparagina, D-leucina y L-leucina (surfáctina A). Sólo para la última posición de aminoácido (L-leu), se han descrito algunas variaciones: L-val (surfáctina B) o L-lle (surfáctina C) (Stein, T., Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions, Mol. Microbiol. (2005) 56(4): 845-857).

Bacillus subtilis produce las surfactinas A, B y C, siendo la surfactina C la variante más intensamente estudiada. Las surfactinas son conocidas por tener actividades antimicrobianas contra bacterias, hongos y virus, y exhiben también actividades antitumorales y antitrombóticas (fibrinolíticas y anticoagulantes). Para una revisión de las aplicaciones terapéuticas potenciales de las surfactinas, véase: Seydlová, G. y Svobodová, J., Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications, Cent Eur. J. Med. (2008) 3(2): 123-133. Sus propiedades antiinflamatorias se deben a su efecto inhibidor sobre la transducción de señales inducida por LPS (Takahashi et al., Inhibition of lipopolysáccharide activity by a bacterial cyclic lipopeptide surfactin, J. Antibiot. (2006) 59(1): 35-43). La surfactina sódica se usa en la industria de cosméticos debido a su estabilidad (Yoneda et al., Surfactin sodium salt: an excellent bio-surfactant for cosmetics, Cosmet. Sci. (2001) 52(2): 153-4).

Puede obtenerse surfactina de Bacillus subtilis de acuerdo con métodos descritos, por ejemplo, en los documentos US 7,011 ,969 o US 5,227,294.

La toxicidad de las surfactinas debido a su efecto hemolítico se estudió más intensivamente para la surfactina C. La actividad hemolítica se vio sólo a altas concentraciones de 40 a 60 µ? (Dehghan-Noudeh, G. et al., Isolation, characterisation and investigaron of surface and haemolytic activities of a lipopeptide biosurfactant produced by Bacillus subtilis ATCC 6633, J. Microbiol. (2005) 43: 272-276). Se observó sólo toxicidad (LD5o) a altas concentraciones de más de 100 mg/kg i.v. por día en ratones. La absorción oral de hasta 10 mg de surfactina no mostró toxicidad aparente alguna (Hwang et al., Lipopolysaccharide-binding and neutralizing activities of surfactin C in experimental models of septic shock, Eur. J. Pharmacol. (2007) 556: 166-171).

No se ha descrito o propuesto hasta la fecha un uso de las surfactinas como componente en composiciones comestibles y especialmente como modulador del sabor o gusto.

Ha habido un progreso reciente significativo en la identificación de derivados útiles de agentes saborizantes naturales tales como, por ejemplo, edulcorantes que son derivados de edulcorantes de sacáridos naturales tales como, por ejemplo, eritritol, isomalta, lactitol, manitol, sorbitol y xilitol. Ha habido también un progreso reciente en la identificación de terpenoides, flavonoides o proteínas naturales como edulcorantes potenciales. Véase, por ejemplo, un artículo intitulado "Noncarcinogenic Intense Natural Sweeteners" por Kinghorn er a/. (Med. Res Rev (1998) 18(5): 347-360), el cual discutió materiales naturales recientemente descubiertos que son mucho más intensamente dulces que los edulcorantes naturales comunes tales como la sacarosa, fructosa, glucosa, y similares. Asimismo, ha habido un progreso reciente en la identificación y comercialización de nuevos edulcorantes artificiales, tales como aspartame, sacarina, acesulfame potásico, ciclamato, sucralosa y alitame, etc.; para una revisión, véase un artículo por Ager et al., Commercial, Synthetic Nonnutritive Sweeteners (Angew. Chem. Int. Ed. (1998) 37(12): 1802-1817).

En años recientes, se ha logrado un progreso sustancial en la biotecnología en general y en un mejor entendimiento de los fenómenos bioquímicos y biológicos subyacentes de la percepción del sabor. Por ejemplo, se han identificado recientemente proteínas receptoras del sabor en mamíferos, que están implicadas en la percepción del sabor. En particular, se han identificado dos diferentes familias de receptores acoplados a proteína G que se cree están implicadas en la percepción del sabor, T2Rs y T1Rs. (Véase, por ejemplo, Nelson et al., Cell (2001) 106(3): 381-390; Adler et al., Cell (2000) 100(6): 693-702; Chandrashekar et al., Cell (2000) 100: 703-711 ; Matsunami et al., Nature (2000) 404: 552-553; Li er al., Proc Nati Acad Sci USA (2002) 99: 4962-4966; Montmayeur et al., Nature Neuroscience (2001) 4(S): 492-498; patente de E.U.A. 6,462,148; y publicaciones del PCT WO 02/06254, WO 00/63166, WO 02/064631 y WO 03/001876, y publicación de patente de E.U.A. US 2003-0232407 A1 ): Mientras que la familia T2R incluye más de 25 genes que están implicados en la percepción del sabor amargo, la familia T1 R responsable de la percepción del sabor dulce incluye sólo tres miembros, T1 R1 , T1R2 y T1 R3 (véase Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2002) 99, 4962-4966). Recientemente, se descubrió en los documentos WO 02/064631 y WO 03/001876 que ciertos miembros de la familia T1 R, cuando son co-expresados en líneas de células de mamífero adecuadas, se ensamblan para formar receptores del sabor funcionales. Se encontró que la co-expresión de T1 R2 y T1R3 en una célula hospedera adecuada, resulta en un receptor del sabor "dulce" T1R2/T1 R3 funcional que responde a diferentes estímulos del sabor, incluyendo edulcorantes artificiales y de ocurrencia natural (véase Li et al., citado anteriormente). La expresión de los receptores de edulcorantes T1 R2 y T1 R3 como homooligómeros o heterooligómeros en células enteroendocrinas humanas, se propone como un sistema de prueba modelo para la identificación de moduladores de la sensación del sabor (véase el documento WO 08/014450 A2).

Alimento, bebidas, productos agradables, dulces, alimentos para mascotas, productos medicinales o cosméticos, tienen con frecuencia un alto contenido de edulcorantes, lo cual se considera generalmente como no deseable en términos del desarrollo de enfermedades relacionadas con edulcorantes. Aquí, especialmente enfermedades tales como la obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares y otras, se deben principalmente a edulcorantes de alto contenido calórico. Existe buena evidencia de que la absorción incrementada de edulcorantes" de alto contenido calórico, por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos, especialmente la sacarosa, están vinculados a mayores niveles de triglicéridos en plasma, lo cual es un factor de riesgo aceptado para enfermedad cardiovascular. Asimismo, la absorción incrementada de azúcar puede estar vinculada a un estado físico que promueve la diabetes, la obesidad u otras enfermedades. En la industria de alimentos y bebidas, es el estado de la técnica reemplazar aquellos azúcares problemáticos tales cómo la glucosa, sacarosa, trehalosa y otros, con fructosa.

El mercado de edulcorantes global está actualmente en una escala de 170 millones de toneladas por año de equivalentes de azúcar (unidades de medición que comparan las cantidades de diferentes edulcorantes, tomando en cuenta su diferente potencia de dulzura) en 2005. Este mercado comprende edulcorantes calóricos, edulcorantes de alta intensidad y polioles. El edulcorante calórico más importante es la azúcar refinada o sacarosa; otros edulcorantes calóricos son el jarabe de maíz de alto contenido de fructosa, la glucosa y la dextrosa. Los edulcorantes de alta intensidad son productos que proveen la misma dulzura que el azúcar, con menos material y por lo tanto menos calorías. Proveen de 35 a 10,000 veces la dulzura del azúcar. Se conocen también como edulcorantes dietéticos o de bajo contenido calórico o, si no incluyen caloría alguna, edulcorantes no calóricos. Aparte del acesulfame potásico, otros edulcorantes de alta intensidad importantes son la sacarina, el aspartame, el ciclamato, la esteviosida y la sucralosa. Por último, los polioles son alcoholes de azúcar que proveen el volumen y la textura del azúcar, pero pueden ser etiquetados que tienen menos calorías que el azúcar.

Por ejemplo, el uso de jarabe de maíz de alto contenido de fructosa (HFCS) como edulcorante en géneros horneados (HFCS 90), bebidas suaves (HFCS 55), bebidas deportivas (HFCS 42) o en panes, cereales, condimentos, etc., está comúnmente aceptado. El HFCS se refiere a un grupo de jarabes de maíz que son enzimáticamente procesados para incrementar su contenido de fructosa, y se mezclan entonces con jarabe de maíz puro (100% de glucosa) hasta alcanzar su forma final. Los tipos más comunes de HFCS son HFCS 90 (aproximadamente 90% de fructosa y 10% de glucosa); HFCS 55 (aproximadamente 55% de fructosa y 45% de glucosa); y HFCS 42 (aproximadamente 42% de fructosa y 58% de glucosa).

Sin embargo, pueden sacarse conclusiones de estudios recientes, de que los efectos de la fructosa en comparación con la sacarosa sobre los niveles de grelina, leptina, insulina y glucosa en sangre, no exhiben diferencias significativas. Considerados en conjunto, existe poca o ninguna evidencia para la hipótesis de que el HFCS es diferente de la sacarosa en sus efectos sobre el apetito o sobre los procesos metabólicos implicados en el almacenamiento de grasa.

Otra estrategia para reducir los edulcorantes calóricos en, por ejemplo, alimento empacado, es el uso de edulcorantes artificiales no calóricos o de bajo contenido calórico tales como acesulfame potásico, sacarina, ciclamato, aspartame, taumatina o neohesperidina DC, sucralosa, neotame o glucósidos de esteriol. Aquí, dos aspectos son de impacto mayor. Primero, estos compuestos en comparación con los sacáridos tienen un dejo distinto, y en segundo lugar, existe una discusión permanente sobre si o no estos edulcorantes son carcinógenos.

Por lo tanto, es deseable y un objetivo de la presente invención, encontrar compuestos con propiedades que modulen el sabor dulce, o que aumenten el sabor dulce evocado por un edulcorante conocido en la técnica siendo propiamente dulce, o siendo propiamente un edulcorante moderado a débil con el aumento de atributos para uno o más edulcorantes conocidos en la técnica, o más preferiblemente, siendo propiamente un intensificador sin atributos dulcificantes, pero con la capacidad para mejorar uno o más edulcorantes conocidos en la técnica que se usan en composiciones comestibles.

En la técnica, se han hecho varias propuestas con respecto a compuestos que muestran actividad modüladora del sabor. El documento WO 2006/138512 describe amidas bis-aromáticas y sus usos como modificadores del sabor dulce, degustantes e intensificadores del sabor. El documento US 7,175,872 se refiere a compuestos de piridinio-betaína para su uso como moduladores del sabor. El documento WO 2007/014879 propone la hesperetina para intensificar el sabor dulce.

No obstante, continúa habiendo en la técnica la necesidad de moduladores del sabor nuevos y mejorados como agentes saborizantes, y especialmente compuestos que no tengan potencial edulcorante o sólo muy poco potencial edulcorante, por las razones esbozadas anteriormente. La presente invención tiene el propósito de resolver estos problemas, proveyendo compuestos con propiedades moduladores del sabor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a surfactinas y lipopéptidos cíclicos relacionados, de preferencia de origen microbiano, lo cual se encontró sorprendentemente tiene propiedades moduladoras del sabor. Un aspecto de la invención es el uso de uno o más de los lipopéptidos anteriores, de preferencia el uso de surfactina C o de una mezcla de diferentes surfactinas, como un modulador del sabor en composiciones comestibles que contienen uno o más edulcorantes naturales o artificiales, ejemplos de los cuales se describieron anteriormente. Otro aspecto de la presente invención es un método para la modulación del sabor (incluyendo el dejo) de las composiciones comestibles mencionadas anteriormente, que comprende combinar dichas composiciones con una cantidad moduladora del sabor de uno o más de los lipopéptidos anteriores, de preferencia de surfactina C o de una mezcla de surfactinas. Y aún otro aspecto de la invención se refiere a una composición comestible que contiene uno o más edulcorantes naturales y/o artificiales y uno o más de dichos lipopéptidos, de preferencia surfactina C o una mezcla de surfactinas.

En esta especificación, se citan muchos documentos, y la descripción entera de estas referencias (incluyendo entre otras cosas artículos científicos, patentes y solicitudes de patente) se incorpora de esta manera en la presente como referencia con el propósito de describir por lo menos en parte el conocimiento de los expertos en la técnica, y con el propósito de describir, por ejemplo, compuestos, estructuras (tales como proteínas receptoras del sabor T2Rs y T1 Rs de mamífero), y métodos para, por ejemplo, expresar esos receptores en líneas de células, y el uso de las líneas de células resultantes para identificar compuestos con respecto a su actividad moduladora del sabor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra el vector de expresión eucariótico multicistrónico pTrix-Eb-R2R3. La expresión de los genes del receptor del sabor T1R2, T1 R3 en humanos y el gen de blasticidina S desaminasa (bsd), está bajo el control del promotor del factor de alargamiento alfa 1 humano (P-efla). Para conferir expresión multicistrónica en el nivel de traducción, se han insertado dos sitios internos de entrada ribosomal (citar I y citar II). La unidad multicistrónica es terminada por un sitio de poliadenilación del virus 40 simiano (poliA) y descrita como "cistrón" con una flecha negra continua. El origen de replicación procariótico (ori) y el gen de resistencia a kanamicina (kan) sirven para la propagación, amplificación y selección del vector de plásmido en E. coli.

La figura 2 muestra la actividad de la surfactina sobre los receptores del sabor dulce (actividad como edulcorante así como intensificador del sabor dulce) en la prueba basada en células descrita, en ausencia o en presencia de fructosa 30 mM. La respuesta del receptor se describe como incremento primario de fluorescencia (eje y) sobre el tiempo (segundos/eje x). La respuesta del receptor a la surfactina, es la concentración dependiente y aumentada en presencia de fructosa.

La figura 3 ilustra la actividad de la surfactina sobre los receptores del sabor dulce como intensificador del sabor dulce en la prueba basada en células descrita, en ausencia o en presencia de fructosa 30 mM. Los resultados revelan que a la escala de concentración relevante de surfactina hasta 2 µ? y en ausencia de fructosa, no se observa potencial de realce, mientras que en presencia de fructosa, se obtiene una señal en células positivas al receptor. No se observó señal alguna en células negativas al receptor en dicha escala de concentración. En conclusión, los resultados muestran que la surfactina no tiene propiamente efecto dulcificante, sólo un efecto modulador en presencia de un edulcorante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para el propósito de la presente invención, los siguientes términos tendrán los significados descritos a continuación: El término "composición comestible" se entenderá en su sentido más amplio incluyendo, pero no limitado a, alimento, bebidas, bebidas suaves, productos agradables, dulces, sustancias dulcificantes, cosméticos tales como, por ejemplo, enjuague bucal, alimento para animales tales como alimento para mascotas, y productos farmacéuticos o medicinales.

El término "modulador del sabor" o "modulación del sabor", se refiere a un compuesto/una actividad que modula el sabor (incluyendo el dejo) de una composición comestible que contiene uno o más edulcorantes naturales y/o artificiales. Un modulador del sabor puede modular, aumentar, potenciar, crear o inducir la impresión de sabor en un animal o un humano, y de preferencia en el sentido del sabor dulce mejorado.

El término "edulcorantes naturales" y "edulcorantes artificiales", se refiere a aquellos agentes dulcificantes conocidos y/o usados en la técnica con respecto a composiciones comestibles, ejemplos de los cuales se dan en los párrafos anteriores.

Una "cantidad moduladora del sabor", se refiere a una cantidad de un compuesto o compuestos capaces de modular el sabor de composiciones comestibles que contienen edulcorante. La concentración de un modulador del sabor necesaria para modular o mejorar el sabor de la composición comestible dependerá, de hecho, de muchas variables que incluyen el tipo específico de composición comestible y sus varios otros ingredientes, especialmente la presencia de otros edulcorantes naturales y/o artificiales y las concentraciones de los mismos, la variabilidad genética natural y preferencias y condiciones de salud individuales de varios seres humanos que saborean las composiciones, y el efecto subjetivo del compuesto particular sobre el sabor de dichos compuestos dulces.

De esta manera, no es posible especificar una "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, una cantidad efectiva apropiada puede ser determinada por los expertos en la técnica usando sólo experimentación de rutina (véase, por ejemplo, el ejemplo 9 del documento US 7,175,872, y el ejemplo 53 del documento WO 2006/138512 A2).

Los lipopéptidos cíclicos que pueden usarse en la presente invención, son aquellos de la fórmula general (I): R-CHCH¿CO-Glu-Leu-D-Leu-Vaf-Asp-D-Leu-Leu (0 1 2 3 4 5 6 7 en donde: Leu en la posición 7 puede ser reemplazada por Val o He, R denota un grupo alquilo lineal o ramificado, y 1 a 7 denota la posición de aminoácido dentro de la molécula cíclica.

R es de preferencia un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende 10, 11 , 12 ó 13 átomos de carbono, referidos también en lo sucesivo como alquilo de Cío, alquilo de Cu, alquilo de C12 o alquilo de C13. Grupos R particularmente preferidos incluyen: (CH2)7-CH(CH3)2, (CH2)6-CH(CH3)-CH2-CH3, (CH2)9-CH3, (CH2)8-CH(CH3)2, (CH2)10 -CH3, (CH2)g-CH(CH3)2, (CH2)8-CH(CH3)-CH2-CH3 y (CH2)10-CH(CH3)2.

Los lipopéptidos cíclicos preferidos de fórmula (I) para su uso de conformidad con la presente invención, son aquellos en donde los aminoácidos comprenden D- y L-aminoácidos. Especialmente preferidos son los lipopéptidos cíclicos (I) que comprenden D- y L-aminoácidos en la secuencia LLDLLDL (dada en la secuencia Pos. 1?¦ Pos. 7). Los lipopéptidos cíclicos de conformidad con la invención, incluyen también derivados naturales y diseñados. De esta manera, las moléculas variantes de ocurrencia natural con diferentes aminoácidos en la posición 7 (por ejemplo Val, He), están dentro del alcance de la invención. Otros derivados son aquellos en los cuales uno o más aminoácidos en la posición 1 a 6 en la fórmula I son reemplazados por aminoácidos con propiedades similares (carácter hidrofóbico, carga).

En otra modalidad preferida en el lipopéptido cíclico preferido (I) de conformidad con la invención, los residuos de aminoácido hidrofóbicos se localizan en una o más de las posiciones 2, 3, 4, 6 y 7, y los residuos de aminoácido cargados negativamente se localizan en una o más de las posiciones 1 y 5. Ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos preferidos, son Gly, Ala, Val, Leu, lie, Met, Phe, Trp y Pro, y para aminoácidos cargados negativamente, Asp y Glu.

Las surfactinas A (secuencia de aminoácidos 1? 7: L-Glu, L-Leu, D-Leu, L-Val, L-Asp, D-Leu, L-Leu; R = alquilo de Cío), B (L-Val en la posición 7 en lugar de L-Leu; R = alquilo de Cu), C (L-lle en la posición 7; R = alquilo de C12) y D (R = alquilo de 013), y mezclas respectivas de las mismas, son especialmente preferidas de conformidad con la invención. Más preferida es la surfactina C y/o mezclas de surfactina C con lipopéptidos cíclicos (I).

Las composiciones comestibles a las cuales los lipopéptidos cíclicos moduladores del sabor de conformidad con la presente invención se añaden, son de preferencia composiciones que contienen uno o más monosacáridos, disacáridos u oligosacáridos como edulcorantes, y más preferidas son las composiciones que contienen jarabe de maíz de alto contenido de fructosa o mezclas de jarabe de alto contenido de fructosa como edulcorantes. Entre las confituras, cereales, helado, bebidas, yogurts, postres, mermeladas y productos de panificación, nutricosméticos y composiciones medicinales, de preferencia bebidas alcohólicas y no alcohólicas carbohidratadas tales como a) bebidas suaves carbonatadas y no carbonatadas, b) bebidas suaves de contenido calórico completo, c) bebidas energéticas y deportivas, d) bebidas de jugo, e) tés listos para beber y otras bebidas suaves instantáneas, son composiciones comestibles de especial interés para el propósito de la presente invención. Más preferiblemente, son aquellos numerosos alimentos en los cuales el edulcorante líquido HFCS, el cual constituye también una fuente principal de la fructosa dietética, se ha vuelto un sustituto favorito de la sacarosa, por ejemplo, en bebidas suaves y muchas otras bebidas dulcificadas, así como en bebidas carbonatadas, géneros horneados, frutas enlatadas, mermeladas y jaleas y productos lácteos.

Las composiciones comestibles que contienen monosacáridos, disacáridos u oligosacáridos como edulcorantes y un lipopéptido cíclico de conformidad con la presente invención, exhiben una calidad de sabor idéntica o por lo menos cercana al sabor de dichos sacáridos mismos, y especialmente una dulzura significativamente mejorada.

Los lipopéptidos cíclicos de conformidad con la invención, y especialmente aquellos del tipo surfactina, multiplican o intensifican significativamente la dulzura de los edulcorantes naturales y/o artificiales conocidos, aún cuando se usan a bajas concentraciones, de modo que menos de los edulcorantes calóricos conocidos se requieren en una composición comestible, mientras que se mantiene o se amplifica el sabor percibido de los edulcorantes naturales. Esto es de muy alta utilidad y valor en vista de la incidencia rápidamente creciente del aumento de peso no deseable en humanos, y/o enfermedades asociadas tales como la diabetes, la aterosclerosis, etc.

La cantidad de modulador del sabor en las composiciones comestibles inventivas depende de la concentración de los edulcorantes naturales o artificiales contenidos en las mismas, así como de la presencia de otras sustancias auxiliares tales como dióxido de carbono, sabores (por ejemplo, especias, extractos naturales o aceites), colores, acidulantes (por ejemplo, ácido fosfórico y ácido cítrico), conservadores, potasio y sodio, por mencionar algunos de los auxiliares. La cantidad deseada puede estar generalmente entre 0.01 mg y 1 g de lipopépticos cíclicos/kg de la composición comestible acabada entera. La cantidad está en particular entre 0.01 mg y 500 mg de lipopéptido(s)/kg, de preferencia entre 0.1 mg y 100 mg de lipopéptido(s)/kg, y especialmente entre 0.1 mg y 50 mg de lipopéptido(s) cíclico(s)/kg de la composición comestible acabada (= ppm en peso).

Los lipopéptidos cíclicos de la invención tienen de preferencia solubilidad suficiente en agua y/o sustancias orgánicas polares, y mezclas de las mismas, para formulación a las escalas de concentración deseadas, disolviéndolas simplemente en los líquidos adecuados. Composiciones concentradas que comprenden sustancias solubles acuosas pero sólidas tales como azúcares o polisacáridos, y los lipopéptidos cíclicos descritos en la presente, pueden prepararse disolviendo o dispersando el lipopéptido cíclico y un vehículo soluble en agua o solventes polares, y secando entonces el líquido resultante por medio de procedimientos bien conocidos, tales como secado por aspersión.

La solubilidad de los lipopéptidos cíclicos de la invención puede ser limitada, sin embargo, en vehículos líquidos menos polares o apolares, tales como aceites o grasas. En dichas modalidades, puede ser deseable preparar una dispersión muy fina o emulsión del lipopéptido cíclico sólido en el vehículo triturando, moliendo u homogenizando una mezcla física del lipopéptido cíclico y el vehículo líquido. Los lipopéptidos cíclicos pueden formularse por lo tanto en algunos casos, como composiciones concentradas edulcorantes que comprenden dispersiones de micropartículas sólidas del lipopéptido cíclico en las sustancias precursoras. Por ejemplo, algunos de los lipopéptidos cíclicos de la invención pueden tener solubilidad limitada en sustancias no polares tales como grasas o aceites comestibles, y pueden formularse por lo tanto como composiciones concentradas edulcorantes moliendo o triturando el lipopéptido cíclico sólido hasta el tamaño de micropartículas y mezclado con la grasa o aceite comestible, u homogenizando una dispersión del lipopéptido cíclico sólido y la grasa o aceite comestible, o un análogo comestiblemente aceptable del mismo, tales como los aceites basados en éster de triglicérido Neobee™ vendidos por Stephan Corporation de Northfield Illinois, U.S.A.

También es posible preparar sólidos recubiertos, congelados o glaseados con los compuestos bien dispersos de la invención, disolviendo los lipopéptidos cíclicos en agua o un solvente polar y rociando entonces la composición o el vehículo sólido sobre el substrato o vehículo comestible sólido.

Por medio de los métodos descritos anteriormente, pueden reformularse muchas composiciones comestibles bien conocidas y valiosas que contienen comúnmente azúcar y/o edulcorantes de sacárido equivalentes, que comprenden uno o más de los lipopéptidos cíclicos descritos en la presente, con una capacidad concomitante para reducir significativamente la concentración del azúcar y/o los edulcorantes de sacárido equivalentes, por ejemplo, en aproximadamente 10% hasta tanto como 30 a 50% o más, con una disminución correspondiente en el contenido calórico de las composiciones comestibles.

Las composiciones concéntradas descritas anteriormente se usan entonces en métodos bien conocidos, para preparar las composiciones comestibles deseadas de la invención.

De esta manera, la presente invención abarca diferentes aspectos que pertenecen todos al mismo concepto inventivo: a) el uso de los lipopéptidos cíclicos de la invención como moduladores del sabor para composiciones comestibles que contienen por lo menos un edulcorante natural o artificial conocido, b) un método para la modulación del sabor (incluyendo el dejo) de dichas composiciones comestibles, añadiendo uno o más lipopéptidos cíclicos de la invención a dichas composiciones, c) un método para reducir la concentración de edulcorantes calóricos en dichas composiciones comestibles, añadiendo uno o más lipopéptidos cíclicos de la invención a dichas composiciones, y d) composiciones comestibles que contienen por lo menos un edulcorante natural o artificial conocido y por lo menos un lipopéptido cíclico de conformidad con la invención.

EJEMPLOS Otras características de la invención resultan de los siguientes ejemplos. En este contexto, pueden realizarse características individuales de esta invención solas o en combinación. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar modalidades preferidas, y se pretende que sean ilustrativas y no limitativas del alcance de la invención.

Materiales y métodos experimentales Cultivo de células Transfección transitoria/selección de células HEK293 estables -Pueden realizarse transfecciones transitorias y estables con complejos de lípidos tales como con precipitación con fosfato de calcio, reactivo de Lipofectamine/PLUS (Invitrogen), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) o MIRUS TranslT293 (Mirus Bio Corporation), de acuerdo con los manuales. La electroporación puede ser también un método de elección para la transfección estable de células eucarióticas.

Las células se siembran en placas de 6 cavidades a una densidad de 4x105 células/cavidad. Células HEK293 son transfectadas con plásmidos linealizados para la expresión estable de los genes de interés. Después de 24 horas, comienza la selección con reactivos de selección tales como zeocina, higromicina, neomicina o blasticidina. Aproximadamente 50 µ? a 300 µ? de células transfectadas tripsinizadas de una placa de 6 cavidades se siembran en una placa de 100 mm, y se añade el antibiótico necesario en una concentración adecuada. Las células se cultivan hasta que sean visibles clones en la placa de cultivo de células de 100 mm. Estos clones se seleccionan para más cultivo y formación de imágenes con calcio. Transcurren aproximadamente 4 a 8 semanas para seleccionar clones de células que expresan establemente los genes de interés.

Formación de imágenes con calcio Prueba de fluo-4 AM con células HEK293 estables - Células estables se mantienen en medio DMEM de alto contenido de glucosa (Invitrogen) complementado con suero de bovino fetal a 10% (Biochrom) y L-glutamina 4 mM (Invitrogen). Las células para la formación de imágenes con calcio se mantienen en medio DMEM de bajo contenido de glucosa complementado con FBS a 10% y 1x Glutamax-1 (Invitrogen) por 48 horas antes de la siembra. Estas células estables son tripsinizadas después de 48 horas (ya sea con tripsina-EDTA, Accutase o TrypLE), y se siembran en placas de prueba de 96 cavidades recubiertas de poli-D-lisina (Corning) a una densidad de 45,000 células/cavidad en medio DMEM de bajo contenido de glucosa complementado con FBS a 10% y 1x Glutamax-1.

Después de 24 horas, las células se cargan en 100 µ? de medio con otros 100 µ? de Fluo-4 4 µ? (colorante de detección de calcio, concentración final de 2 µ?; Molecular Probes) en regulador de pH de Krebs-HEPES (KH) por 1 hora. El reactivo de carga se reemplaza entonces con 200 µ? de regulador de pH KH por cavidad. El regulador de pH de Krebs-HEPES (regulador de pH KH), es una solución salina fisiológica que incluye CaCl2 1.2 mM, NaHC03 4.2 mM y HEPES 10 mM.

Las células estables cargadas de colorante en las placas se pusieron en un lector de placa de microtítulo de fluorescencia, para monitorear el cambio de fluorescencia (excitación a 488 nm, emisión a 520 nm) después de la adición de 50 µ? de regulador de pH KH complementado con 5x degustantes. Para cada traza, se añadió degustante 16 segundos después del inicio de la exploración, y se mezclaron dos veces con el regulador de pH, se continuó la exploración por otros 90 segundos, y se colectaron los datos cada segundo.

Análisis de los datos/registro de los datos Se cuantificó la movilización de calcio como el cambio de fluorescencia pico (AF) sobre el nivel del punto de referencia (Fo). Los datos se expresaron como el error estándar de la media del valor (AF/F0) de muestras independientes replicadas. El análisis se hizo con el software del lector de placa de microtitulo.

Surfactina La surfactina de Bacillus subtilis usada para las pruebas de la presente invención, se adquirió de Sigma (No. de catálogo S3523). Es una mezcla de diferentes surfactinas de ocurrencia natural, siendo la surfactina C el componente principal. La fórmula molecular se da como C53H93N7O13, y el peso molecular como 1036.34 (CAS No: 24730-31-2). No es peligrosa de acuerdo con Directive 67/548/EEC. Una solución de repuesto es soluble en etanol (10 mg/ml), y pueden diluirse concentraciones menores en reguladores de pH acuosos.

Sustancias de control Como sustancias de control, se usaron los edulcorantes conocidos acesulfame potásico (adquirido de Fluka) y ciclamato sódico (adquirido de Applichem) en concentraciones de 40 mM cada uno.

EJEMPLO 1 Detección de la actividad del ¡ntensifícador de sabor dulce surfactina en una prueba basada en células dependiente de T1R2/T1R3 dependiente del receptor del sabor en humanos En las células gustativas de tipo silvestre - por ejemplo, en el corpúsculo del gusto humano -, la transducción de señales es transducida presumiblemente por la proteína G gustducina y/o por las proteínas G del tipo G alfa-i. Mediante el encuentro de ligandos del sabor dulce, el receptor heterodimérico del sabor en humanos T1R2 T1R3 reacciona con la inducción de moléculas del segundo mensajero; ya sea inducción del nivel de AMPc en respuesta a la mayor parte de los azúcares o inducción del nivel de calcio en respuesta a la mayoría de los edulcorantes artificiales (véase Margolskee, J. Biol Chem. (2002) 277, 1-4).

Para analizar la función y actividad de la surfactina, el receptor heterodimérico del sabor dulce T1 R2/T1R3 se ha utilizado en una prueba basada en células dependiente de calcio. Receptores del sabor tipo T1 R han sido transfectados con el vector de plásmido multicistrónico pTrix-Eb-R2R3 en una línea de células HEK293 que expresa establemente la protema G promiscua G-alfa-15 de ratón.

Para la generación de líneas de células estables, se ha utilizado una unidad de expresión multicistrónica que usa secuencias del receptor del sabor en humanos. Como se muestra en la figura 1 , la unidad de expresión tricistrónica del vector de expresión pTrix-Eb-R2R3 está bajo el control del promotor del factor de alargamiento alfa 1 humano. Mediante el uso de técnicas de clonación estándar, se ha clonado el ADNc para los receptores ht1 R2 y ht1 R3 y el ADNc para el gen de blasticidina S desaminasa. Para permitir el inicio de la traducción de cada gen de esta unidad tricistrónica, se han insertado dos sitios internos de entrada ribosomal (IRES - denominados también intensificador de traducción independiente de Cap (CITE)) (Jackson et al., Trends Biochem Sci (1990) 15, 477-83; Jang et al., J Virol (1988) 62, 2636-43).

La unidad de expresión tricistrónica es terminada por una secuencia de señal de poliadenilación del virus 40 simiano. Esta composición permite la expresión simultánea de los tres genes bajo el control de sólo un promotor. En contraste con las unidades de transcripción monocistrónicas, las cuales se integran independientemente entre sí en diferentes sitios cromosómicos durante el proceso de desarrollo de líneas de células estables, la unidad de transcripción tricistrónica integra todos los genes contenidos en uno y el mismo locus cromosómico. Debido a la alineación de los genes, el gen de blasticidina S desaminasa es transcrito sólo en caso de que ocurra una transcripción de longitud completa. Además, la polaridad de las unidades de transcripción multicistrónicas (Moser, S. et al., Biotechnol Prog (2000) 16, 724-35) lleva probablemente a estequiometría balanceada de los genes receptores y sus velocidades de expresión en la escala de 1 :07 hasta 1 :1 para las dos primeras posiciones, mientras que el gen de blasticidina S desaminasa comparado con los genes receptores en la tercera posición es expresado a un menor grado. Asumiendo que para el receptor heterodimérico funcional ht1 R2/ht R3 es necesaria una estequiometría 1 :1 , los menores efectos de polaridad para los genes receptores promueven la estequiometría deseada, mientras que la expresión reducida de la desaminasa promueve un locus de integración con actividad de transcripción aumentada. Se ha realizado la generación de células estables que expresan T1 R2 T1 R3, cultivando las células transfectadas en presencia de blasticidina.

Para la medición de la actividad dependiente del receptor del sabor T1 R2/T1 R3 humano, células HEK293 que expresan establemente G-alfa-15, T1 R2 de humano y T1 R3 de humano, se sembraron 4x104 células en placas de 96 cavidades y se marcaron con el colorante de fluorescencia sensible a calcio Fluo4-AM (2 µ?) en medio de cultivo DMEM por 1 hora a 37°C. Para la medición en un lector de placa de fluorescencia, el medio se intercambió por regulador de pH KH, y se incubó por otros 20 minutos a 37°C. La medición de la fluorescencia de las células marcadas se llevó a cabo en un lector de placa de fluorescencia Flex Station II (Molecular Devices, Sunnyvale, California). La respuesta a diferentes concentraciones de surfactina en presencia de fructosa 30 mM se registró como el incremento de la fluorescencia de Fluo4-AM iniciada a través del incremento dependiente de T1 R2/T1 R3 del segundo mensajero calcio. La concentración de fructosa aplicada se seleccionó de los resultados de exámenes previos que muestran que la fructosa 30 mM (5.4 g/l) es una concentración que está escasamente activando a los receptores del sabor dulce dentro de esta prueba basada en células (véase la figura 2). De esta manera, una propiedad de aumento de la dulzura de un compuesto de prueba es detectable en presencia del edulcorante fructosa. Después de que se obtienen señales de calcio para cada muestra, la movilización del calcio en respuesta a degustantes se cuantificó como el cambio relativo (fluorescencia pico F1 - nivel F0 de fluorescencia en el punto de partida, denotado como AF) de su propio nivel de fluorescencia en el punto de partida (denotado como F0). Sin embargo, reí. RFU es AF/F0. La intensidad de fluorescencia pico ocurrió aproximadamente 20 a 30 segundos después de la adición de degustantes. Los datos mostrados se obtuvieron de por lo menos dos experimentos independientes, y se hicieron por triplicado. La capacidad de la surfactina para aumentar la fructosa se describe en la figura 2 como curvas de incremento primario de la fluorescencia, y el realce de la fructosa se da en g/l de incremento de la fructosa facilitado por las concentraciones de surfactina aplicadas.

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de uno o más lipopéptidos cíclicos de conformidad la fórmula (I): R-CHCHsCO-Glu-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Leu 1 2 3 4 5 6 7 en donde: R denota un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende de 10 a 13 átomos de carbono, y 1 a 7 denota la posición de aminoácido dentro de la molécula cíclica, como un intensificador de dulzura.

2. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde en la fórmula (I) los aminoácidos son D- y L-aminoácidos, especialmente en la secuencia LLDLLDL (de la posición 1 a 7).

3. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde por lo menos se usa otro lipopéptido cíclico que es diferente del lipopéptido de conformidad con la fórmula (I).

4.- El uso como el que se reclama en una o más de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la fórmula (I) el aminoácido en la posición 7 es reemplazado por Val o lie.

5.- El uso como el que se reclama en una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en donde en la fórmula (I) uno o más de los aminoácidos en las posiciones 2, 3, 4, 6 y 7 son reemplazados con aminoácidos hidrofóbicos del grupo que incluye Gly, Ala, Val, Leu, He, Met, Phe, Trp y Pro, y/o uno o más de los aminoácidos en las posiciones 1 y 5 son reemplazados con aminoácidos cargados negativamente del grupo que incluye Asp y Glu.

6 - El uso como el que se reclama en una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en una composición comestible.

7 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde la composición comestible contiene por lo menos un edulcorante natural o artificial.

8. - El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el lipopéptido cíclico o los lipopéptidos cíclicos se usa(n) en una cantidad entre 0.01 mg y 10 g de lipopéptidos cíclicos/kg de la composición comestible.

9. - El uso como el que se reclama en una o más de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la composición comestible comprende además monosacáridos, disacáridos u oligosacáridos como edulcorantes.

10. - El uso como el que se reclama en una o más de las reivindicaciones 6 a 9, en donde la composición comestible contiene jarabe de maíz de alto contenido de fructosa (HFCS) como edulcorante.

11. - El uso como el que se reclama en una o más de las reivindicaciones 6 a 10, en donde la composición comestible se selecciona del grupo que consiste de helado, bebidas, yogurts, postres, mermeladas y composiciones medicinales, de preferencia bebidas alcohólicas y no alcohólicas carbohidratadas.

12. - Un método para la modulación del sabor, que comprende el paso de añadir un lipopéptido cíclico de la reivindicación 1 a una composición comestible.

13. - Un método para reducir la concentración de edulcorantes calóricos, que comprende el paso de añadir un lipopéptido cíclico de la reivindicación 1 a una composición comestible.

14.- Una composición comestible que comprende un lipopéptido cíclico de la reivindicación 1.