KR20110036051A - 맛 조절제로서 사용하기 위한 사이클릭 리포펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 천연 또는 인공 감미제를 함유하는 식료품 조성물용 맛 조절제 및/또는 감미 증진제로서, 하나 이상의 사이클릭 리포펩타이드, 예를 들면, 서팩틴 A, B1 및 C, 및 이들의 유도체 및 혼합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 식료품 조성물은 식품, 음료, 의약 제품 및 화장품을 포함하며 바람직하게는 감미제로서 모노-, 디- 또는 올리고사카라이드를 함유한다. 본 발명은 또한 맛 조절제로서 사이클릭 리포펩타이드를 함유하는 상기 식료품 조성물에 관한 것이다.

Description

맛 조절제로서 사용하기 위한 사이클릭 리포펩타이드{Cyclic lipopeptides for use as taste modulators}
본 발명은 맛 조절제, 바람직하게는, 적어도 하나의 감미제를 함유하는 식료품 조성물용 맛 조절제로서의 사이클릭 리포펩타이드의 그룹에 속하는 분자의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 서팩틴(surfactin)이 본 발명의 목적을 위해 사용된다. 또한, 본 발명은 맛 조절제로서 적어도 하나의 사이클릭 리포펩타이드를 함유하는 상기 식료품 조성물뿐만 아니라 상기 식료품 조성물의 맛 및/또는 뒷맛을 조절하는 방법에 관한 것이다.
서팩틴은 자체의 양친매성 특징으로 인하여 생계면활성제로서 작용하는 미생물 기원의 사이클릭 리포펩타이드이다. 화학적 분류를 위해, 이들은 뎁시펩타이드(depsipeptide)의 특정 형태인 사이클릭 리포뎁시펩타이드로서 지정될 수 있다. 뎁시펩타이드는 흔히 진균, 예를 들면, 메타르히지움 아종(Metarhizium sp.) 또는 클라도보트리움 아종(Cladobotryum sp.), 및 세균, 예를 들면, 슈도모나스 쉬린가에(Pseudomonas syringae)(US 5,830,855) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(EP 0761682 B1)에 의해 사이클릭 형태(사이클로뎁시펩타이드)로 합성되며, 항생제 및 식물병원성(phytophathogenic) 특성을 나타낸다. 뎁시펩타이드에서 아미노- 및 하이드록시산은 펩타이드-결합 및 에스테르-결합에 의해 연결되어 있다. 따라서, 뎁시펩타이드는, 펩타이드 결합 및 비-펩타이드 결합이 분자의 결집에 관여함을 특징으로 하는 헤테로데트 펩타이드에 속한다. EP 제0761682 B1호는 바실러스 서브틸리스로부터 사이클릭 뎁시펩타이드의 제조를 기술하고 있으며 고지질혈증용의 치료학적 용도를 제안하고 있다. 서팩틴 및 기타 사이클릭 리포펩타이드는 시판되고 있다.
서팩틴은 7개의 아미노산 및 소수성 지방산 쇄의 펩타이드 루프로 이루어져 있으며, 당해 루프는 분자가 세포막을 침투하도록 한다. 이는 자체의 지질 꼬리가 막 침투를 허용하는 특징적인 "호스 새들(horse saddle)" 입체형태를 갖는다. 다수의 변이체 분자가 지금까지 알려져 있다: 서팩틴 A1, A2, A3, B1, B2, C1, C2 및 D 각각. 변이체 형태는 지질 꼬리의 길이 및 분지 인자(branching factor)에 있어 상이하지만, L-글루탐산, L-류신, D-류신, L-발린, L-아스파라긴, D-류신 및 L-류신(서팩틴 A)를 포함하는 사이클릭 펩타이드는 본질적으로 변화하지 않는다. 단지 후자의 아미노산 위치(L-leu)의 경우에만 일부 변화가 기술되어 있다: L-val(서팩틴 B) 또는 L-Ile(서팩틴 C)(참조: Stein, T., Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions, Mol. Microbiol. (2005) 56(4): 845-857). 바실러스 서브틸리스는 서팩틴 A, B 및 C를 생산하며, 서팩틴 C는 가장 집중적으로 연구된 변이체이다. 서팩틴은 세균, 진균 및 바이러스에 대해 항미생물 활성을 갖는 것으로 공지되어 있으며 또한 항종양 및 항-혈전(섬유소용해제 및 항응고제) 활성을 나타낸다. 서팩틴의 강력한 치료학적 적용의 고찰을 위해 다음 문헌을 참조한다: Seydlova, G. and Svobodova, J., Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications, Cent Eur. J. Med. (2008) 3(2): 123-133. 이의 소염 특성은 LPS-유도된 신호 전달에 있어서의 이의 억제 효과에 기인한다[참조: Takahashi et al, Inhibition of lipopolysaccharide activity by a bacterial cyclic lipopeptide surfactin, J. Antibiot. (2006) 59(1): 35-43]. 서팩틴 나트륨은 이의 안정성으로 인하여 화장품 산업에서 사용된다[참조: Yoneda et al. surfactin sodium salt: an excellent bio-surfactant for cosmetics, Cosmet. Sci. (2001) 52(2): 153-4].
서팩틴은 예를 들면 US 7,011,969 또는 US 5,227,294에 기술된 방법에 따라 바실러스 서브틸리스로부터 수득될 수 있다.
자체의 용혈 효과로 인한 서팩틴의 독성은 서팩틴 C에 대해 가장 집중적으로 연구되어 왔다. 용혈 활성은 40 내지 60μM의 고 농도에서만 관측되었다[참조: Dehghan-Noudeh, G. et al., Isolation, characterisation and investigation of surface and haemolytic activities of a lipopeptide biosurfactant produced by Bacillus subtilis ATCC 6633, J. Microbiol. (2005) 43: 272-276]. 독성(LD50)은 단지 마우스에서 1일에 100 mg/kg 이상의 고 농도의 정맥내 투여에서 관측되었다. 10 mg이하의 서팩틴의 경구 흡수는 어떠한 명백한 독성도 나타내지 않았다[참조: Hwang et al., Lipopolysaccharide-binding and neutralizing activities of surfactin C in experimental models of septic shock, Eur. J. Pharmacol. (2007) 556: 166-171].
식료품 조성물내 성분 및 특히 향 또는 맛 조절제로서 서팩틴의 용도는 지금까지 기술되거나 제안되어 있지 않다.
최근에 예를 들면, 에리트리톨, 이소말트, 락티톨, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨과 같은 천연 당류 감미제의 유도체인 감미제와 같은, 천연 풍미제의 유용한 유도체를 확인하는데 있어 큰 진전이 있어왔다. 또한 최근에 강력한 감미제로서 천연 테르페노이드, 플라보노이드 또는 단백질을 확인하는데 있어 진전이 있어왔다. 예를 들면, 슈크로즈, 프럭토즈, 글루코즈 등과 같은 일반적인 천연 감미제보다 훨씬 더 강력하게 단 최근 발견된 천연 물질을 논의하고 있는 킹호른(Kinghorn) 등에 의한 "Noncarcinogenic Intense Natural Sweeteners"라는 제목의 논문[Med. Res Rev (1998) 18(5):347-360]을 참조한다. 유사하게, 최근에 아스파탐, 사카린, 아세설팜-K, 사이클라메이트, 슈크랄로즈 및 알리탐 등과 같은 새로운 인공 감미제를 확인하여 상업화하는데 있어 진전이 있어왔다[참조: 아거(Ager) 등의 논문 'Commercial, Synthetic Nonnutritive Sweeteners (Angew. Chem. Int. Ed. (1998) 37(12): 1802-1817'].
최근 몇 년 동안, 일반적으로 생명공학 및 맛 인지의 잠재하는 생물학적 및 생화학적 현상을 보다 잘 이해하는데 있어 실질적인 진전이 있어왔다. 예를 들어, 맛 수용체 단백질이 최근에 맛 인지에 포함되는 포유동물에서 확인되었다. 특히, G 단백질 결합된 수용체의 2개의 상이한 계열이 맛 인지에 관여하는 것으로 여겨지며, T2R 및 T1R이 확인되었다[참조: 예를 들면, Nelson et al., Cell (2001) 106(3):381-390; Adler et al., Cell (2000) 100(6):693-702; Chandrashekar et al., Cell (2000) 100:703-711 ; Matsunami et al., Nature (2000) 404:552-553; Li et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:4962-4966; Montmayeur et al., Nature Neuroscience (2001) 4(S):492-498; 미국 특허 제6,462,148호; 및 PCT 공개공보 제WO 02/06254호, 제WO 00/63166호, 제WO 02/064631호, 및 제WO 03/001876호, 및 미국 특허 공개공보 제US 2003-0232407 A1호].
반면에, T2R 계열은 쓴맛 인지에 관여하는 25개에 걸친 유전자를 포함하며, 단맛의 인지를 담당하는 T1R 계열은 단지 3개의 구성원, T1R1, T1R2 및 T1R3를 포함한다[참조: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99, 4962-4966]. 최근에, 제WO 02/064631호 및 제WO 03/001876호에, 특정의 T1R 구성원이 적합한 포유동물 세포주에서 공동-발현되는 경우, 조립되어 작용적 맛 수용체를 형성하는 것을 기술하였다. 적합한 숙주 세포내에서 T1R2 및 T1R3의 공동-발현은 천연적으로 존재하는 감미제 및 인공 감미제를 포함하는 상이한 맛 자극에 대해 반응하는 작용적 T1R2/T1R3 "단" 맛 수용체를 생성한다(참조: Li 등의 상기 인용된 문헌). 사람 장내분비 세포에서 동종- 및 이종올리고머로서 감미제 수용체 T1R2 및 T1R3의 발현은 맛 감각의 조절제의 확인을 위한 모델 시험 시스템으로 제안되고 있다(참조: 제WO 08/014450 A2호).
식품, 음료, 기호 제품(pleasing products), 감미제, 애완동물 식품, 의약 제품 또는 화장품은 흔히 고 함량의 감미제를 가지며, 이는 일반적으로 감미제 관련 질병 발현의 측면에서 바람직하지 않은 것으로 고려되고 있다. 여기서, 특히 비만, 당뇨병, 심혈관병 및 기타 질병과 같은 질병은 주로 고칼로리 감미제에 기인한다. 고칼로리 감미제, 예를 들면, 모노-, 디- 및 올리고사카라이드, 특히 슈크로즈의 증가된 흡수는 심혈관병에 대한 인정된 위험 인자인 높은 수준의 혈장 트리글리세라이드에 연결되어 있다. 마찬가지로, 증가된 당 섭취는 당뇨병, 비만 또는 기타 질병을 촉진하는 신체적 상태와 연관될 수 있다. 식품 및 음료 산업에서, 글루코즈, 사카로즈, 트레할로즈 및 기타와 같이 문제가 되는 당을 프럭토즈로 교체하는 것이 당해 분야의 상태이다.
전세계 감미제 시장은 현재 2005년에 연간 1억 7천만 톤의 설탕-당량(sugar-equivalent)(이들의 상이한 단맛 효능(sweetness potency)을 고려하여, 상이한 감미제의 양과 비교하기 위한 측정 단위)의 규모이다. 당해 시장은 칼로리 감미제, 고-강도 감미제 및 폴리올을 포함한다. 가장 중요한 칼로리 감미제는 정제당 또는 슈크로즈이며; 다른 칼로리 감미제는 고 프럭토즈 옥수수 시럽, 글루코즈 및 덱스트로즈이다. 고-강도 감미제는 적은 물질로 설탕과 동일한 닷맛을 제공하므로 보다 적은 칼로리를 제공하는 제품이다. 이들은 설탕의 단맛의 35 내지 10,000배를 제공한다. 이들은 또한 저칼로리 또는 식이 감미제로 알려져 있거나, 또는 이들이 어떠한 칼로리도 포함하지 않는 경우, 무칼로리 감미제로 알려져 있다. 아세설팜-K와는 별도로, 다른 중요한 고-강도 감미제는 사카린, 아스파르탐, 사이클라메이트, 스테비오사이드 및 슈크랄로즈이다. 마지막으로, 폴리올은 당의 부피 및 질감을 제공하지만 당보다 적은 칼로리를 가진 것으로 표지될 수 있는 당 알코올이다.
예를 들어, 제과 제품(HFCS 90), 무알콜성 음료(soft drink: HFCS 55), 스포츠 음료(HFCS 42) 또는 빵, 시리얼, 조미료 등에서 감미제로서 고 프럭토즈 옥수수 시럽(HFCS)의 사용이 일반적으로 허용되고 있다. HFCS는 이들의 프럭토즈 함량을 증가시키기 위하여 효소적으로 가공된 후 이들의 최종 형태에 도달하기 위하여 순수한 옥수수 시럽(100% 글루코즈)과 혼합된 옥수수 시럽의 그룹을 말한다. HFCS의 가장 일반적인 유형은 HFCS 90(대략 90% 프럭토즈 및 10% 글루코즈); HFCS 55(대략 55% 프럭토즈 및 45% 글루코즈); 및 HFCS 42(대략 42% 프럭토즈 및 58% 글루코즈)이다.
그러나, 최근 연구로부터, 혈중 글루코즈, 인슐린, 렙틴 및 그렐린 수준에 있어서 슈크로즈와 비교하여 프럭토즈의 효과가 현저한 차이가 없다는 결론이 도출될 수 있다. 이와 함께, HFCS가 식욕, 또는 지방 저장과 관련된 대사 과정에서 이의 효과에 있어 슈크로즈와 상이하다는 가설에 대한 증거가 거의 또는 전혀 없다.
예를 들면, 포장 식품에서 칼로리 감미제를 감소시키기 위한 다른 전략은 아세설팜-K, 사카린, 사이클라메이트, 아스파르탐, 타우마틴 또는 네오헤스페리딘 DC, 슈크랄로즈, 네오탐 또는 스테리올 글리코사이드와 같은 무칼로리 또는 저칼로리의 인공 감미제의 사용이다. 여기에 2개의 측면이 주요 영향을 미친다. 우선, 사카라이드와 비교하여 이들 화합물은 독특한 뒷맛을 가지며 둘째로 이들 감미제가 발암성인지에 대한 영구적인 논의가 있다는 것이다.
따라서, 자체로 단맛이 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 하나 이상의 감미제에 대한 증진 속성으로 인해 자체로 약한 감미제에 대해 중간이 되거나, 또는 가장 바람직하게는 자체에는 단맛의 속성이 없으나 식료품 조성물에 사용된 당해 분야에 공지된 하나 이상의 감미제를 증진시키는 능력이 있어서, 단맛을 조절하거나, 또는 당해 분야에 공지된 감미제에 의해 유발된 단맛을 증진시키는 화합물을 발견하는 것이 요구되며, 본 발명의 목적이다.
당해 분야에서, 미각 조절 활성을 나타내는 화합물과 관련하여 몇가지 제안이 이루어졌다. 제WO 2006/138512호는 비스-방향족 아미드 및 단맛 증진제, 미각촉진제 및 미각 증진제로서 이의 용도를 기술하고 있다. 제US 7,175,872호는 맛 조절제로서 사용하기 위한 피리디늄-베타인 화합물에 관한 것이다. 제WO 2007/014879호는 단맛을 증진시키기 위한 헤스퍼레틴을 제안하고 있다.
그럼에도 불구하고, 당해 분야에서는 풍미제로서 신규하고 개선된 맛 조절제 및 특히 상기 요약한 이유로 인해 감미제 가능성이 전혀 없거나 단지 약간 있는 화합물에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 맛 조절 특성을 가진 화합물을 제공함으로써 이들 문제점들을 해결하려는 것이다.
본 발명은, 놀랍게도 맛 조절 특성을 가진 것으로 밝혀진, 바람직하게는 미생물 기원의 서팩틴 및 관련된 사이클릭 리포펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 측면은 상기 리포펩타이드중 하나 이상의 용도, 바람직하게는 이의 예가 위에서 기술되어 있는, 하나 이상의 천연 또는 인공 감미제를 함유하는 식료품 조성물에서 맛 조절제로서 서팩틴 C 또는 상이한 서팩틴들의 혼합물의 용도이다. 본 발명의 다른 측면은 상기 리포펩타이드중 하나 이상, 바람직하게는 서팩틴 C 또는 서팩틴들의 혼합물의 맛 조절 양을 상기 조성물과 조합시킴을 포함하는, 상기 언급한 식료품 조성물의 맛(뒷맛 포함)을 조절하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 천연 및/또는 인공 감미제 및 하나 이상의 상기 리포펩타이드, 바람직하게는 서팩틴 C 또는 서팩틴들의 혼합물을 함유하는 식료품 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서, 다수의 문헌이 인용되어 있으며, 이들 참조 문헌의 전체 내용(특히 과학 논문, 특허 및 특허원 포함)은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자의 지식의 적어도 일부를 기술하고 예를 들면, 화합물, 구조(T2R 및 T1R 포유동물 맛 수용체 단백질) 및 예를 들면, 세포주에서 이들 수용체를 발현하고 이들의 맛 조절 활성과 관련하여 화합물을 스크리닝하기 위해 수득되는 세포주를 사용하는 방법을 기술하기 위한 목적으로 본원에 인용된다.
본 발명의 목적을 위해, 다음 용어들은 하기 기술된 의미를 갖는다:
"식료품 조성물"은 식품, 음료, 무알콜성 음료, 기호 제품, 감미, 감미료, 예를 들면, 구강세척제와 같은 화장품, 애완동물 먹이와 같은 동물 식품, 및 약제 또는 의약 제품을 포함하나, 이에 한정되지 않는 광범위한 의미에서 이해되어야 한다.
"맛 조절제" 또는 "맛 조절"은 하나 이상의 천연 및/또는 인공 감미제를 함유하는 식료품 조성물의 맛(뒷맛 포함)을 조절하는 화합물/활성을 말한다. 맛 조절제는 동물 또는 사람 및 바람직하게는 증진된 단맛의 의미에서 맛 느낌을 조절하거나, 증진시키거나, 강화하거나, 생성하거나 또는 유도할 수 있다.
"천연" 및 "인공 감미제"는 이의 예가 앞서의 단락에서 제공된, 식료품 조성물과 관련하여 당해 분야에 공지되고/되거나 사용된 감미제이다.
"맛 조절량"은 식료품 조성물을 함유하는 감미제의 맛을 조절할 수 있는 화합물 또는 화합물들의 양을 말한다. 식료품 조성물의 맛을 조절하거나 개선시키는데 요구되는 맛 조절제의 농도는 물론, 특히 기타 천연 및/또는 인공 감미제 및 이의 농도의 존재하에서, 식료품 조성물의 특정 유형 및 이의 각종의 다른 성분들, 천연의 유전적 변수, 개개의 선호도 및 조성물을 음미하는 다양한 사람들의 건강 상태, 및 이러한 감미 화합물의 맛에 있어서 특정 화합물의 주관적인 효과를 포함하는 많은 변수에 물론 의존할 것이다.
따라서, 정확한 "유효량"을 규정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적절한 유효량은 단지 통상의 실험을 사용하여 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다(참조: 예를 들면, 제US 7,175,872호의 실시예 9 및 제WO 2006/138512 A2호의 실시예 53).
본 발명에서 사용될 수 있는 사이클릭 리포펩타이드는 화학식 I의 사이클릭 리포펩타이드이다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
7번 위치의 Leu은 Val 또는 Ile으로 치환될 수 있고,
R은 직쇄 또는 측쇄 알킬 그룹을 나타내며,
1번 내지 7번은 상기 사이클릭 분자내의 상기 아미노산 위치를 나타낸다.
R은 바람직하게는 10개, 11개, 12개, 또는 13개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 측쇄 알킬 그룹이며, 이후에 또한 C10 알킬, C11 알킬, C12 알킬, 또는 C13 알킬로 언급된다. 특히 바람직한 그룹 R은 (CH2)7-CH(CH3)2, (CH2)6-CH(CH3)-CH2-CH3, (CH2)9-CH3, (CH2)8-CH(CH3)2, (CH2)10-CH3, (CH2)9-CH(CH3)2, (CH2)8-CH(CH3)-CH2-CH3, 및 (CH2)10- CH(CH3)2를 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 화학식 I의 바람직한 사이클릭 리포펩타이드는, 아미노산이 D- 및 L-아미노산을 포함하는 것들이다. LLDLLDL(1번 위치로부터 7번 위치까지의 순서로 제공됨)의 순서로 D- 및 L-아미노산을 포함하는 사이클릭 리포펩타이드 (I)이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 사이클릭 리포펩타이드는 또한 천연 및 가공된 유도체를 포함한다. 따라서, 7번 위치에서 상이한 아미노산(예를 들면, Val, Ile)을 갖는 천연적으로 존재하는 변이체 분자는 본 발명의 영역내에 있다. 추가의 유도체는, 화학식 I의 1번 내지 6번 위치에서 하나 이상의 아미노산이 유사한 특성(소수성, 하전)을 갖는 아미노산으로 치환된 것들이다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 바람직한 사이클릭 리포펩타이드(I)에서 소수성 아미노산 잔기는 2번, 3번, 4번, 6번 및 7번 중 하나 이상에 위치하며 음하전된 아미노산 잔기는 1번 및 5번 위치 중 하나 이상에 위치한다. 바람직한 소수성 아미노산의 예는 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro이며 음하전된 아미노산은 Asp, Glu이다.
서팩틴 A(아미노산 서열 1 → 7: L - Glu, L-Leu, D-Leu, L-Val, L-Asp, D-Leu, L-Leu; R = C10알킬), B (7번 위치에서 L-Leu 대신 L-Val; R = C11 알킬), C (7번 위치에서 L-Ile; R = C12 알킬) 및 D (R = C13 알킬) 및 이들의 각각의 혼합물이 본 발명에 따라 특히 바람직하다. 서팩틴 C 및/또는 서팩틴 C와 사이클릭 리포펩타이드(I)의 혼합물이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 맛 조절 사이클릭 리포펩타이드가 가해진 식료품 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 모노-, 디- 또는 올리고사카라이드를 감미제로서 함유하는 조성물이며, 고 프럭토즈 옥수수 시럽 또는 고 프럭토즈 시럽 블렌드를 감미제로서 함유하는 조성물이 가장 바람직하다. 사탕과자, 시리얼, 아이스크림, 음료, 요구르트, 디저트, 스프레드 및 제과 제품 중에서, 영양식용 제품 및 의약 조성물, 바람직하게는 탄수화물처리된(carbohydrated) 및 탄수화물 처리되지 않은 a) 무 알코올성 음료, b) 완전한 칼로리 무-알코올성 음료, c) 스포츠 및 에너지 음료, d) 주스 음료, e) 바로 마실 수 있는(ready-to-drink) 차 및 기타 인스턴트 무-알코올성 음료와 같은, 알코올 및 비-알코올성 음료가 본 발명의 목적을 위한 특히 관심있는 식료품 조성물이다. 또한 식이 프럭토즈의 주요 공급원을 구성하는 액체 감미제 HFCS가, 예를 들면, 무-알코올성 음료 및 많은 다른 감미 음료 및 또한 카보네이트 음료, 제과 제품, 과일 통조림, 잼 및 젤리, 및 식이 제품에서 슈크로즈에 대해 선호하는 대체물이 되는 다수의 식품이 가장 바람직하다. 감미제로서 모노-, 디- 또는 올리고사카라이드 및 본 발명에 따른 사이클릭 리포펩타이드를 함유하는 식료품 조성물은 상기 사카라이드 자체의 맛과 동일하거나 이 맛에 적어도 근접하며, 특히 현저히 증진된 단맛의 맛 품질을 나타낸다.
본 발명에 따른 사이클릭 리포펩타이드 및 서팩틴 유형의 것들은 심지어 저 농도에서 사용되는 경우에도 공지된 천연 및/또는 인공 감미제의 단맛을 현저히 배가시키거나 증진시켜, 공지된 칼로리 감미제가 식료품 조성물에 요구되지 않으면서, 천연 감미제의 인식된 맛을 유지시키거나 증폭시킨다. 이는 바람직하지 않은 사람 체중 증가 및/또는 당뇨병, 죽상경화증 등과 같은 관련 질병의 발생을 현저히 증가시키는 측면에서 매우 높은 유용성 및 가치가 있다.
본 발명의 식료품 조성물중 맛 조절제의 양은 이에 함유된 천연 또는 인공 감미제의 농도 및 또한 보조제중 일부로 언급되는 이산화탄소, 풍미제(예를 들면, 스파이스, 천연 추출물 또는 오일), 착색제, 산미료(예를 들면, 인산 및 시트르산), 방부제, 칼륨, 나트륨과 같은 추가의 보조 물질의 존재에 의존한다. 바람직한 양은 일반적으로 전체 가공된 식료품 조성물 kg당 0.01mg 내지 1g의 사이클릭 리포펩타이드일 수 있다. 당해 양은 특히 가공된 식료품 조성물의 kg당 0.01mg 내지 500mg의 리포펩타이드, 바람직하게는 0.1mg 내지 100mg의 리포펩타이드, 및 특히 0.1mg 내지 50mg의 사이클릭 리포펩타이드(= 중량 ppm)이다.
본 발명의 사이클릭 리포펩타이드는 바람직하게는 적절한 액체속에 이들을 단순 용해시킴으로써 바람직한 농도 범위에서 제형을 위한 물 및/또는 극성 유기 물질, 및 이들의 혼합물 속에서 충분한 가용성을 갖는다. 설탕 또는 다당류와 같이 고체이지만 수용성인 물질, 및 본원에 기술된 사이클릭 리포펩타이드를 포함하는 농축 조성물은 사이클릭 리포펩타이드 및 가용성 담체를 물 또는 극성 용매 속에 용해시키거나 분산시킨 후, 수득되는 액체를 분무 건조와 같은 익히 공지된 방법을 통해 건조시킴으로써 제조할 수 있다.
그러나, 본 발명의 사이클릭 리포펩타이드의 가용성은 오일 또는 지방과 같은 극성이 거의 없거나 비극성인 액체 담체로 한정될 수 있다. 이러한 양태에서, 사이클릭 리포펩타이드 및 액체 담체의 물리적 혼합물을 분쇄하거나, 제분시키거나 또는 균질화시킴으로써 담체속에 고체 사이클릭 리포펩타이드의 매우 미세한 분산액 또는 유화액을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 사이클릭 리포펩타이드는 일부 경우에 전구체 물질 속에 사이클릭 리포펩타이드의 고체 미세입자의 분산액을 포함하는 감미제 농축 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 사이클릭 리포펩타이드 중 일부는 식용성 지방 또는 오일과 같은 비-극성 물질 속에서 제한된 가용성을 가질 수 있으므로 고체 사이클릭 리포펩타이드를 미세입자 크기로 제분하거나 분쇄하여 식용성 지방 또는 오일과 혼합하거나, 또는 고체 사이클릭 리포펩타이드와 식용성 지방 또는 오일의 분산액, 또는 NeobeeTM 트리글리세라이드 에스테르계 오일 고체[미국 일리노이즈주 노쓰필드에 소재하는 스테판 코포레이션(Stephan Corporation)에서 시판]와 같은 이의 식용가능하게 허용되는 유사체의 분산액을 균질화함으로써 감미제 농축 조성물로 제형화할 수 있다.
사이클릭 리포펩타이드를 물 또는 극성 용매 속에 용해한 후 고체 담체 또는 조성물을 고체 식용 담체 또는 기재위에 분무함으로써 잘 분산된 본 발명의 화합물로 피복되거나, 덮히거나 또는 윤을 낸 고체를 제조하는 것이 가능하다.
상기 기술된 방법을 이용하여, 현재 설탕 및/또는 동등물 사카라이드 감미제를 함유하는 많은 익히 공지되고 가치있는 식료품 조성물을 재제형화하여, 식료품 조성물의 칼로리 함량에 있어서 상응하는 분량으로 설탕 및/또는 동등물 사카라이드 감미제의 농도를, 예를 들면, 약 10% 내지 30 내지 50% 이상까지 감소시키는 부수적인 능력을 지닌 본원에 기술된 하나 이상의 사이클릭 리포펩타이드를 포함하도록 할 수 있다.
이어서, 위에서 기술된 농축 조성물을 익히 공지된 방법으로 사용하여 본 발명의 목적한 식료품 조성물을 제조한다.
따라서, 본 발명은
a) 적어도 하나의 (공지된) 천연 또는 인공 감미제를 함유하는 식료품 조성물용 맛 조절제로서 본 발명의 사이클릭 리포펩타이드의 용도,
b) 본 발명의 하나 이상의 사이클릭 리포펩타이드를 상기 식료품 조성물에 가함으로써 상기 식료품 조성물의 맛(뒷맛 포함)을 조절하는 방법,
c) 본 발명의 하나 이상의 사이클릭 리포펩타이드를 상기 식료품 조성물에 가함으로써 상기 식료품 조성물에서 칼로리 감미제의 농도를 감소시키는 방법, 및
d) 적어도 하나의 공지된 천연 또는 인공 감미제 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 사이클릭 리포펩타이드를 함유하는 식료품 조성물의 동일한 발명 개념에 모두 속하는 상이한 측면들을 포함한다.
실시예
본 발명의 추가의 특징은 하기 실시예로부터 생성된다. 당해 내용에서, 본 발명의 단일 특성 단독 또는 조합이 인지될 수 있다. 하기 실시예는 바람직한 양태를 설명하기 위해 제공되며 본 발명의 영역을 설명하기 위해 의도되며 본 발명의 영역을 제한하는 것은 아니다.
실험 재료 및 방법
세포 배양
안정한 HEK293 세포의 일시적인 형질감염/선택 - 일시적이고 안정한 형질감염은 인산칼슘 침전, 리포펙타민/PLUS 시약[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)], 리포펙타민 2000(제조원: 인비트로겐) 또는 MIRUS TransIT293[제조원: 미루스 바이오 코포레이션(Mirus Bio Corporation)]과 같은 지질 복합체를 매뉴얼에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 전기천공(electroporation)은 또한 진핵 세포의 안정한 형질감염을 위한 선택 방법일 수 있다.
세포를 6-웰 플레이트에서 4x105 세포/웰(cell/well)의 밀도로 접종시킨다. HEK293 세포를 목적 유전자의 안정한 발현을 위해 선형화된 플라스미드로 형질감염시킨다. 24시간 후, 제오신, 하이그로마이신, 네오마이신 또는 블라스티시딘과 같은 시약을 선택하여 선택을 개시한다. 6-웰로부터 약 50μl 내지 300μl의 트립신처리된 형질감염된 세포를 100 mm 디쉬에 접종시키고 필요한 항생제를 적절한 농도로 가한다. 세포를 클론이 100mm의 세포 배양 플레이트상에서 가시적으로 될 때까지 배양한다. 이들 클론을 추가의 배양 및 칼슘 영상화를 위해 선택한다. 목적 유전자를 안정하게 발현하는 세포 클론을 선택하는데 약 4 내지 8주가 소요된다.
칼슘 영상화
안정한 HEK293 세포를 사용한 Fluo-4 AM 검정 - 안정한 세포를 10% 태아 소 혈청[제조원: 바이오크롬(Biochrom)] 및 4mM L-글루타민(제조원: 인비트로겐)이 보충된 DMEM 고-글루코즈 배지(제조원: 인비트로겐) 속에 유지시킨다. 칼슘 영상을 위한 세포를 10% FBS 및 1x 글루타맥스-1(Glutamax-1)(제조원: 인비트로겐)가 보충된 DMEM 저-글루코즈 배지 속에 48시간 동안 유지시킨 후 접종한다. 이들 안정한 세포를 48시간 후 트립신 처리하고(트립신-EDTA, 아큐타제(Accutase) 또는 TrypLE 사용) 폴리-D-라이신 피복된 96-웰 검정 플레이트[제조원: 코닝(Corning)]상에 45,000 세포/웰의 밀도에서 10% FBS 및 1x 글루맥스-1이 보충된 DMEM 저-글루코즈 배지 속에 접종시킨다.
24시간 후, 세포를 추가로 크렙스(Krebs)-HEPES(KH)-완충액 중 4μM Fluo-4[칼슘 반응 염료, 2μM의 최종 농도; 제조원: 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes)]가 들어있는 100μl의 배지속에 1시간 동안 로딩(loading)한다. 이후에, 로딩 시약을 웰당 200μl KH-완충액으로 교체한다. 크렙스-HEPES-완충액(KH-완충액)은 1.2 mM CaCl2, 4.2 mM NaHCO3 및 10 mM HEPES를 포함하는 생리학적 염수 용액이다.
플레이트내의 염료-로딩된 안정한 세포를 형광 미세역가 플레이트 판독기내로 두고 5x 미각촉진제가 보충된 50μl KH-완충액을 첨가한 후 형광(여기 488nm, 방출 520nm) 변화를 모니터링하였다. 각각의 추적을 위해, 미각촉진제를 스캔 시작 후 16초째에 가하고 완충액으로 2회 혼합하고, 추가로 90초 동안 계속 스캐닝하고, 데이터를 매초마다 수집하였다.
데이터 분석/데이터 기록
칼슘 이동을 기준선 수준(F0)에 대하여 최대 형광의 변화(△F)로서 정량하였다. 데이터는 반복된 독립 시료의 (△F/F0) 값의 평균 S.E.로 나타내었다. 분석은 미세역가 플레이트 판독기의 소프트웨어로 수행하였다.
서팩틴
본 발명의 검정에 사용된 바실러스 서브틸리스로부터의 서팩틴은 시그마(Sigma)(제품 번호 S3523)으로부터 구입하였다. 이는 상이한 천연적으로 존재하는 서팩틴과 주요 성분인 서팩틴 C와의 혼합물이다. 분자식은 C53H93N7O13로 제공되며 분자량은 1036.34(CAS 번호: 24730-31-2)이다. 이는 지침서 67/548/EEC에 따르면 유해하지 않다. 스톡 용액(stock solution)은 에탄올(10 mg/ml) 속에서 가용성이며 수성 완충액 속에서 보다 낮은 농도로 희석시킬 수 있다.
대조군 물질
대조군 물질로서는 공지된 감미제 아세설팜 K[플루카(Fluka)로부터 구입함] 및 나트륨 사이클라메이트[아플리켐(Applichem)으로부터 구입함]을 각각 40 mM의 농도에서 사용하였다.
실시예 1
재조합체 사람 맛 수용체 의존성 T1R2/T1R3 의존성 세포계 검정에서 서팩틴 감미 증진제 활성의 검출
야생형 미각 세포 - 예를 들면 사람 맛 봉우리(taste bud)에서 - 신호 전달은 아마도 G-단백질 구스트듀신(gustducin), 및/또는 Galpha-i 형의 G-단백질에 의해 유도된다. 감미 리간드와 접촉시 이종이량체 사람 맛 수용체 T1R2/T1R3는 제2의 전령 분자의 유도와 반응하여; 대부분의 당에 대한 반응시 cAMP 수준을 유도하거나 대부분의 인공 감미제에 대한 반응시 칼슘 수준을 유도한다[참조: Margolskee J. Biol Chem. (2002) 277, 1-4].
서팩틴의 작용 및 활성을 분석하기 위해, 이종이량체 T1R2/T1R3 단맛 수용체를 칼슘 의존성 세포계 검정에 이용하여 왔다. T1R 유형 맛 수용체는 무차별 마우스 G-알파-15G-단백질을 안정하게 발현하는 HEK293 세포주에서 멀티시스트론성(multicistronic) 플라스미드 벡터 pTrix-Eb-R2R3로 형질감염시켰다.
안정한 세포주를 생성하기 위해, 사람 맛 수용체 서열을 사용하는 멀티시스트론성 발현 단위를 사용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 발현 벡터 pTrix-Eb-R2R3의 트리시스트론성 발현 단위는 사람 연장 인자 1 알파 프로모터의 조절하에 있다. 표준 클로닝 기술을 사용하여 수용체 ht1R2 및 ht1R3에 대한 cDNA 및 블라스티시딘 S 데아미나제 유전자에 대한 cDNA를 클로닝하였다. 당해 트리시스트론성 단위의 각각의 유전자의 해독 개시를 가능하도록 하기 위해, 2개의 EMC-바이러스 기원한 내부 리보솜 진입 부위[IRES - 또한 Cap-독립적인 해독 증진인자(Cap-independent translation enhancer: CITE)]를 삽입하였다[참조: Jackson et al., Trends Biochem Sci (1990) 15, 477-83; Jang et al., J Virol (1988) 62, 2636-43].
트리시스트론성 발현 단위는 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 시그날 서열로 종결된다. 당해 조성물은 단지 하나의 프로모터의 조절하에서 모든 3개의 유전자의 동시 발현을 허용한다. 안정한 세포주의 발달 과정 동안 각각 서로로부터 상이한 염색체 위치로 독립적으로 통합되는 모노시스트론성 전사 단위와는 대조적으로, 트리시스트론성 전사 단위는 한쪽 및 동일한 염색체 위치의 유전자를 함유하는 모두를 통합한다. 유전자의 정렬로 인하여, 블라스티시딘 S 데아미나제 유전자가, 완전한 길이의 전사가 일어나는 경우에 단지 전사된다. 또한, 멀티시스트론성 전사 단위의 극성[참조: Moser, S. et al., Biotechnol Prog (2000) 16, 724-35]은 아마도 첫번째 2개의 위치에 대해 1:0.7 내지 1:1의 범위에서 수용체 유전자 및 이들의 발현율의 균형된 입체화학을 초래하는 반면, 3번째 위치에서 수용체 유전자와 비교하여 블라스티시딘 S 데아미나제 유전자는 훨씬 적은 정도로 발현된다. 작용성 이종이량체 수용체 ht1R2/ht1R3의 경우 1:1 화학량론이 요구된다는 것을 가정할 때 수용체 유전자에 대한 보다 적은 극성 효과는 바람직한 화학량론을 촉진하는 반면, 데아미나제의 감소된 발현은 증진된 전사 활성으로 통합 위치를 촉진한다. 안정한 T1R2/T1R3 발현 세포의 생성은 블라스티시딘의 존재하에서 형질감염된 세포를 배양함으로써 수행된다.
사람 T1R2/T1R3 맛 수용체 의존적 활성을 측정하기 위해, G-알파-15, 사람 T1R2 및 사람 T1R3를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 96-웰 플레이트에 4x104으로 접종하고 DMEM 배양 배지 속에서 칼슘 민감성 형광 염료 Fluo4-AM(2μM)을 사용하여 1시간 동안 37℃에서 표지화한다. 형광 플레이트 판독기 속에서 측정하기 위해, 배지를 KH-완충액으로 교환하고 다른 20분 동안 37℃에서 배양한다. 표지화된 세포의 형광 측정은 Flex Station II 형광 플레이트 판독기[제조원: 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재]내에서 수행하였다. 30mM 프럭토즈의 존재하에서 서팩틴의 상이한 농도에 대한 반응을 제2 전령 칼슘의 T1R2/T1R3 의존적인 증가를 통해 개시된 Fluo4-AM 형광 증가로서 기록하였다. 적용된 프럭토즈 농도를 앞서의 실험의 결과로부터 선택하였으며 당해 실험에서는, 30mM 프럭토즈(5.4g/l)가 당해 세포계 검정내에서 단맛 수용체를 간신히 활성화시키는 농도이다(참조: 도 2). 따라서, 시험 화합물의 감미 증진 특성은 감미제 프럭토즈의 존재하에서 검출가능하다. 각각의 시료에 대해 칼슘 시그날을 수득한 후, 미각촉진제에 대한 반응시 칼슘 이동을 이의 자체 기준선 형광 수준(F0로서 나타냄)으로부터 상대적 변화(최대 형광 F1 - 기준선 형광 F0 수준, △F로 나타냄)로서 정량화하였다. 상대적 RFU는 △F/F0이다. 최대 형광 강도는 미각촉진제의 첨가후 약 20 내지 30초 째에 발생하였다. 나타낸 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 수득하였고 3회 수행하였다. 서팩틴의 프럭토즈 증진 능력은 도 2에서 주요 형광 증가 곡선으로 나타내었고 프럭토즈 증진은 적용된 서팩틴 농도에 의해 촉진된 g/l 프럭토즈 증가로 제공한다.
범례
도 1은 멀티시스트론성 진핵세포 발현 벡터 pTrix-Eb-R2R3를 나타낸다. 사람 맛 수용체 유전자 T1R2, T1R3 및 블라스티시딘 S 데아미나제(bsd) 유전자의 발현은 사람 연장 인자 1 알파 프로모터(P-ef1α)의 조절하에 있다. 해독 수준에서 멀티시스트론성 발현을 부여하기 위하여, 2개의 내부 리보솜 진입 부위(부위-I 및 부위-II)를 삽입하였다. 멀티시스트론성 단위는 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 부위(polyA)에 의해 종결되며 진한 검은색 화살표로 "시스트론"으로서 표시한다. 원핵세포성 복제 오리진(ori) 및 가나마이신 내성 유전자(kan)는 이. 콜라이(E. coli)내에서 플라스미드 벡터의 증식, 증폭 및 선택을 위해 제공된다.
도 2는 기술된 세포계 검정에서 30mM 프럭토즈의 부재 또는 존재하에서 단맛 수용체에 있어서의 서팩틴 활성(감미제 및 감미 증진제로서의 활성)을 나타낸다. 수용체 반응은 시간에 따른(초/x-축) 주요 형광 증가(y-축)로 나타낸다. 서팩틴에 대한 수용체-반응은 농도 의존적이며 프럭토즈의 존재하에서 증진된다.
도 3은 기술된 세포계 검정에서 30mM 프럭토즈의 부재 또는 존재하에서 감미 증진제로서 단맛 수용체에 대한 서팩틴 활성을 나타낸다. 당해 결과는, 2μM 이하의 서팩틴의 관련 농도 범위에서 및 프럭토즈의 부재하에서 증진 효능이 관측되지 않는 반면, 프럭토즈의 존재하에서 수용체 양성 세포에 시그날이 수득됨을 나타낸다. 상기 농도 범위에서 수용체 음성 세포에서는 시그날이 관측되지 않았다. 결론적으로, 당해 결과는, 서팩틴이 이의 자체로는 감미 효과를 가지지 않으며, 단지 감미제의 존재하에서 조절 효과만을 가짐을 나타낸다.

Claims (14)

  1. 화학식 I에 따른 하나 이상의 사이클릭 리포펩타이드의 감미 증진제로서의 용도.
    [화학식 I]
    Figure pct00002

    상기 화학식 I에서,
    R은 탄소수 10 내지 13의 직쇄 또는 측쇄 알킬 그룹을 나타내고,
    1번 내지 7번은 상기 사이클릭 분자내의 상기 아미노산 위치를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I에서 상기 아미노산들이 D- 및 L-아미노산이고, 특히 LLDLLDL(1번 위치로부터 7번 위치까지)의 순서인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I에 따른 상기 리포펩타이드와는 상이한 적어도 하나의 추가의 사이클릭 리포펩타이드가 사용되는 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에서 7번 위치의 상기 아미노산이 Val 또는 Ile으로 치환되는 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에서 2, 3, 4, 6 및 7번 위치의 상기 아미노산들 중 하나 이상이 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp 및 Pro을 포함하는 그룹으로부터의 소수성 아미노산으로 치환되고/되거나 1번 및 5번 위치의 상기 아미노산들 중 하나 이상이 Asp 및 Glu를 포함하는 그룹으로부터의 음하전된 아미노산으로 치환되는 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식료품 조성물에 있어서의 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식료품 조성물이 적어도 하나의 천연 또는 인공 감미제를 함유하는 용도.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 사이클릭 리포펩타이드 또는 상기 사이클릭 리포펩타이드들이 식료품 조성물 kg당 0.01mg 내지 10g의 사이클릭 리포펩타이드(들)의 양으로 사용되는 용도.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식료품 조성물이 감미제로서 모노-, 디- 또는 올리고사카라이드를 추가로 포함하는 용도.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식료품 조성물이 감미제로서 고 프럭토즈 옥수수 시럽(HFCS)을 함유하는 용도.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식료품 조성물이 아이스크림, 음료, 요구르트, 디저트, 스프레드(spread) 및 의약 조성물, 바람직하게는 탄수화물처리된 알코올성 및 비-알코올성 음료로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  12. 제1항에 따른 사이클릭 리포펩타이드를 식료품 조성물에 가하는 단계를 포함하여, 맛을 조절하는 방법.
  13. 제1항에 따른 사이클릭 리포펩타이드를 식료품 조성물에 가하는 단계를 포함하여, 칼로리 감미제의 농도를 감소시키는 방법.
  14. 제1항에 따른 사이클릭 리포펩타이드를 포함하는 식료품 조성물.
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