MX2010011959A - Metodos para monitorear la modulacion de la actividad de cinasa del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y uso de dichos metodos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona de forma general con métodos de diagnóstico in vitro, en particular el uso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23), fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo inorgánico y calcio total (P x tCa), osteopontina (OPN) y hormona paratiroidea (PTH) como biomarcador. Dichos biomarcadores se pueden utilizar para monitorear la modulación de la actividad de cinasa del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), en particular, su inhibición y/o la aparición de efectos secundarios de la inhibición del FGFR. La invención también proporciona métodos y kits relacionados con estos usos.

Description

M ÉTODOS PARA MON ITOREAR LA MODU LAC IÓN DE LA ACTIVI DAD DE CINASA DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE FI BROBLASTOS Y USO DE DIC HOS M ÉTODOS Campo de la I nvención La presente invención se relaciona de forma general con los métodos de diagnóstico in vitro, en particular el uso de un compuesto seleccionado del g rupo que consiste de factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FG F23) , fósforo inorgánico (P) , el producto de fósforo inorgán ico y calcio total (P x tCa) , osteopontina (OPN) y hormona paratiroidea (PTH) como biomarcador. Dichos biomarcadores se pueden uti lizar para monitorear la modulación de la actividad de cinasa de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFRs) , en particular, su inhibición y/o la aparición de efectos secundarios de la inh ibición del FG FR.

Antecedentes de la Invención La fam ilia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y sus receptores de señalización están asociados con múltiples actividades biológicas (proliferación , supervivencia, apoptosis, diferenciación , motilidad) que rigen procesos fundamentales (desarrollo, angiogénesis, metabolismo) para el crecimiento y el mantenimiento de organismos desde g usanos hasta humanos. Se han identificado 22 FG Fs distintos, todos compartiendo un dominio conservado de núcleo de 1 20 aminoácidos con 1 5 a 65% de identidad de secuencia . Los FGFs median sus respuestas celulares uniéndose a y activando una familia de cuatro RTKs FGFR1 a FGFR4, todos ellos existentes en varias isoformas (Lee PL eí al., Science 245: 57-60 (1989); Givol D et al., FASEB J. 6:3362-9 (1992); Jaye M er al., EMBO J. 7:963-9 (1988); Ornitz DM & Itoh N, Genome Biol. 2 (2001)). La unión del ligando induce eventos de dimerización del receptor y la activación de la cinasa que conduce a la fosforilación y/o selección de moléculas corriente abajo y la activación de vías de señalización intracelulares.

Las funciones biológicas de FGFs / FGFRs han sido investigados por análisis de sistemas específicos de desarrollo, métodos de estudio genético y patrones de expresión en modelos de ratón. Estos estudios han demostrado su participación en muchas funciones biológicas incluyendo angiogénesis y cicatrización de heridas, desarrollo y metabolismo. Una variedad de síndromes de craneosinostosis humanos y displasias esqueléticas han sido vinculados a la ganancia específica de mutaciones de la función en FGFR1, FGFR2 FGFR3 que conducen a un deterioro severo en el desarrollo craneal, digital y del esqueleto. Webster MK & Donoghue DJ, Trends Genet. 1997 13:178-82 (1997); Wilkie AO, Hum. Mol. Genet. 6:1647-56 (1997).

Estudios epidemiológicos han reportado alteraciones genéticas y/o expresión anormal de FGFs/FGFRs en cánceres humanos: el desplazamiento y la fusión de FGFR1 a otros genes que resultan en la activación constitutiva de la cinasa de FGFR1 son responsables de un trastorno mieloproliferativo 8p11 (MacDonald D & Cross NC, Pathobiology 74:81-8 (2007)). Los desplazamientos cromosómicos recurrentes de 14q32 hacia la región de cambio de cadena pesada de inmunoglobulina resultan en la sobre-expresión desregulada de FGFR3 en mieloma múltiple (Chesi M et al. , Nature Genetics 16:260-264 ( 1 997); Chesi M et al, Blood 97:729-736 (2001 )). La amplificación del gen y la sobre-expresión de proteínas han sido reportadas para FGFR1 , FGFR2 y FGFR4 en los tumores de mama (Adnane J et al. , Oncogene 6:659-63 ( 1991 ); Jaakkola S et al, Int. J. Cáncer 54: 378-82 ( 1 993); Penault-Llorca F et al., Int. J. Cáncer 61 : 170-6 ( 1995); Reis-Filho JS et al. , Clin. Cáncer Res. 12:6652-62 (2006)). Las mutaciones de activación somática de FGFR2 son conocidas en las secreciones gástricas (Jang JH et al. , Cáncer Res. 61 : 3541 -3 (2001 )) y en los cánceres de endometrio (Pollock PM et al. , Oncogene (21 de mayo de 2007)) y las mutaciones somáticas en dominios específicos de FGFR3 que conducen a la activación constitutiva independiente del ligando del receptor han sido identificadas en los carcinomas de vejiga urinaria (Cappellen D et al, Nature Genetics 23: 18-20 ( 1999); Billerey C et al. , Am. J. Pathol. 1 58(6): 1 955-9 (2001 )). Además, la sobreexpresión de FGFR3, ARNm y proteínas, ha sido encontrada en este tipo de cáncer (Gómez-Romana JJ et al., Clin. Cáncer Res. 1 1 (2 Pt 1 ) :459-65 (2005)).

Por lo tanto, un compuesto capaz de inhibir la actividad de cinasa de los FGFRs es un candidato probable para el tratamiento de los cánceres humanos con señalización del FGFR desregulada.

La utilidad de los inhibidores de pequeña masa molecular de la tirosina cinasa de FGFR ya ha sido validada (véase Brown, A. P et al. (2005), Toxicol. Pathol. 33, p. 449-455; Xin, X. ef al. (2006), Clin. Cáncer Res. , Vol 12( 16), p. 4908-491 5; Trudel, S. ef al. (2005), Blood, Vol. 105(7), p. 2941-2948).

Sin embargo, la determinación de la eficacia terapéutica de tales inhibidores en modelos de animal es bastante engorrosa ya que involucra por ejemplo la medición del crecimiento del tumor, la inhibición de la auto-fosforilación de los receptores de FGF y/o la fosforilación de las moléculas corriente abajo de la cascada de señalización, tales como Erk1/2. Si bien estos métodos son adecuados en un entorno pre-clinico, para estudios clínicos, es deseable un método no invasivo para determinar la eficacia terapéutica de una manera simple y directa.

Además, estudios no clínicos de toxicidad en ratas y perros con el inhibidor de la tirosina cinasa de FGFR, PD176067 produjeron la mineralización de los tejidos blandos. Debido a la aparición de este efecto no deseado, se concluye que serían necesarios más estudios para determinar si dicha agente tiene el potencial de ser utilizado para el tratamiento del cáncer (véase Brown, A.P. et al. (2005), Toxicol. Pathol. 33, p. 449-455).

La mineralización ectópica, depósito inadecuado de sales de fosfato de calcio en los tejidos blandos y el sistema vascular, puede conducir a la morbilidad y la mortalidad (Londres GM et al, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2005, 14:525-531).

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de biomarcadores, de métodos confiables y kits correspondientes que indiquen la eficacia terapéutica de los inhibidores FGFR. Por otra parte, un método para predecir los efectos secundarios no deseados después de la administración de inhibidores FGFR, en particular de mineralización ectópica, sería de gran utilidad.

Breve Descripción de la Invención Sorprendentemente, se ha encontrado que los compuestos seleccionados a partir del grupo formado por factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) , fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo inorgánico y calcio total (P x tCa), osteopontina (OPN) y hormona paratiroidea (PTH) son biomarcadores útiles que permiten el monitoreo de la actividad de inhibidores del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) y adicionalmente pueden ser útiles para predecir la aparición de efectos secundarios de la inhibición de FGFR, en particular de la mineralización ectópica.

En particular, la presente invención proporciona el uso de FGF23 como un biomarcador. Al inhibir los FGFRs, se encontró que la actividad anti-tumoral también se traduce en un incremento de FGF23. El grado del incremento de FGF23 se correlaciona con la dosis del inhibidor utilizado. En determinadas dosis, se detectan efectos secundarios, en particular, la mineralización vascular y de tejidos blandos. Debido a esta doble connotación FGF23 puede considerarse como un marcador farmacodinámico de los inhibidores de FGFR. La identificación y validación de biomarcadores farmacodinámicos que permitan monitorear la actividad biológica de un fármaco es útil para la selección de la dosis y la optimización de la terapia.

Por otra parte, un análisis global de biomarcadores potenciales para predecir y monitorear la mineralización ectópica después de la regulación del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos muestra que los compuestos seleccionados del grupo que consiste de FGF23, P, P x tCa, OPN y PTH son confirmados como marcadores predictivos de la mineralización ectópica.

Por lo tanto, la invención proporciona en un primer aspecto el uso de un compuesto seleccionado del grupo formado por FGF23, P, P x tCa OPN , y PTH como un biomarcador, en particular para la modulación de la actividad de la cinasa de FGFRs.

En una modalidad dicho compuesto es usado para monitorear la inhibición de la actividad de la cinasa del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos. Preferiblemente, el compuesto es FGF23.

La invención proporciona además el uso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23), fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo inorgánico y calcio total (P x tCa), osteopontina (OPN) y hormona paratiroidea (PTH) como un marcador de seguridad para evitar efectos secundarios, en particular mineralización ectópica. Preferiblemente, dicho compuesto es FGF23.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la modulación de la actividad de la cinasa de FGFR, en particular la inhibición de la actividad de la cinasa, que comprende los pasos de: a) administrar un inhibidor FGFR a un sujeto; b) proporcionar una muestra de dicho sujeto; c) determinar el nivel de FGF23 de dicha muestra; y d) comparar dicho nivel del FGF23 de dicha muestra con un nivel de referencia, en donde el nivel de referencia es el nivel de FGF23 en el sujeto antes del inicio del tratamiento con un inhibidor FGFR.

Además, se proporciona un método para determinar la eficacia terapéutica de un inhibidor FGFR, que comprende los pasos a) - d) del método anterior, en donde el nivel de referencia es el nivel de FGF23 en el sujeto antes del inicio del tratamiento con un inhibidor FGFR.

Por otra parte, se proporciona un método para determinar uno o más efectos secundarios de un inhibidor FGFR que comprende los pasos a) - d) del método anterior, en donde el nivel de referencia es el nivel de FGF23 en el sujeto antes del inicio del tratamiento con un inhibidor FGFR.

Los métodos aquí descritos pueden ser llevados a cabo de forma similar con cualquiera de los compuestos seleccionados del grupo que consiste de P, P x tCa, OPN, y PTH .

La invención es particularmente útil en un entorno clínico para la selección de dosis, la selección del horario, selección de pacientes y la optimización del tratamiento.

La presente invención será descrita con más detalle a continuación . Se entiende que diferentes modalidades, preferencias e intervalos pueden ser combinados a voluntad. Además, dependiendo de la modalidad específica, las definiciones seleccionadas, las modalidades o intervalos pueden no aplicar.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una gráfica que muestra el cambio del volumen del tumor en [mm3] durante el tratamiento con el compuesto A de ratones hembras desnudos atímicos que tienen tumores subcutáneos NIH3T3/FGFR3 S2 9C. Circuios blancos: COMPUESTO A 0 mg/kg una vez al día (qd), vía oral (p.o.); círculos negros: COMPUESTO A 10 mg/kg una vez al día, vía oral; círculos grises: COMPUESTO A 30 mg/kg una vez al día, vía oral; triángulos negros: COMPUESTO A 50 mg/kg, una vez al día, vía oral.

La figura 2 es una fotografía que muestra el análisis ex vivo de tumores. Los tumores fueron diseccionados 2 horas después de la última administración del compuesto. El tejido tumoral se lisó y el FGFR3 se inmunoprecipitó con un anticuerpo específico. Los inmunocomplejos fueron analizados por SDS-PAGE, blotted en membranas de PVDF y examinados con anticuerpos anti-pTyr para monitorear la fosforilación de tirosina del FGFR3. Las membranas se cortaron en tiras y se examinaron nuevamente con anticuerpos anti-FGFR3 para monitorear los niveles totales de proteína del FGFR3.

La figura 3 es una gráfica que muestra el cambio de volumen del tumor en [mm3] durante el tratamiento con el COMPUESTO A de ratones hembras desnudos atímicos que tienen xenoinjertos subcutáneos RT112/luciferasa1. Círculos blancos: Vehículo 10 mg/kg una vez al día (qd), vía oral (p.o.); cuadrados blancos: COMPUESTO A 50 mg/kg una vez al día, vía oral; triángulos negros: Compuesto A 75 mg/kg una vez al día, vía oral.

La figura 4 es una gráfica de barras que muestra los niveles de FGF23 en muestras de plasma recuperadas 2 horas después de la última administración del compuesto A o vehículo de control en las dosis indicadas y horario para 14 días (n = 6) para ratones hembras atímicos que tienen xenoinjertos subcutáneos RT112/luciferasa1. Los niveles de FGF23 fueron monitoreados usando el kit de ELISA de FGF23 de Kainos, número de catálogo CY-4000, y se expresan en pg/ml. Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (SD).

La figura 5 es un diagrama de dispersión de los niveles de fósforo inorgánico (P) [mg/dl], tal como se describe en el ejemplo 2.

La figura 6 es un diagrama de dispersión de los niveles séricos de calcio total (tCa) [mg/dl].

La figura 7 es un diagrama de dispersión de los niveles séricos del producto P x tCa [mg2/dl2].

La figura 8 es un diagrama de dispersión de los niveles séricos de FGF23 [pg/ml].

La figura 9 es una gráfica de barras que muestra los niveles de FGF23 en muestras de plasma de pacientes con melanoma en pre-tratamiento o tratados por vía oral con TKI258 a 200, 300, 400 ó 500 mg/día en una dosis continua de una vez diariamente en el ciclo 1 día 15 y en el ciclo 1 día 26. Los niveles de FGF23 fueron monitoreados usando el kit de ELISA de FGF23 de Kainos, número de catálogo CY-4000, y se expresan en pg/ml. Los datos se presentan como medias ± desviación estándar.

La figura 10 muestra una fotografía de una biopsia de tumor de un paciente con melanoma tratado con 400 mg de TKI258 en el ciclo 1 día 15, analizado por inmunohistoquímica con un anticuerpo que reconoce FGFR fosforilado y activado.

La figura 11 es una gráfica que muestra los niveles de FGF23 en 8 pacientes diferentes con carcinoma de células renales en la línea de base (CID1) y en tratamiento con 500 mg de TKI258 en C1D15 y en C1D26, expresado como número de veces o factor de inducción con respecto a la línea de base, siendo ésta indicada como 1.

La figura 12 es una fotografía que muestra el análisis ex vivo de xenoinjertos tumorales RT112. Los tumores fueron diseccionados 3 horas después de la administración del compuesto. El tejido tumoral se lisó y los niveles de fosforilación de FRS2 tirosina se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo de Señalización Celular (# 3864), que detecta FRS2 cuando es fosforilado en Tyr196. Como un control de carga, la membrana se examinó con un anticuerpo de Sigma (# T4026) que detecta b-tubulina.

La figura 13 es una gráfica de barras que muestra los niveles de FGF23 en muestras de suero de ratas tratadas con las dosis orales indicadas de TKI258 y obtenidas por sangrado sublingual 24 horas después del tratamiento con TKI258 o vehículo de control. Los niveles de FGF23 fueron monitoreados usando el kit de ELISA de FGF23 de Kainos, número de catálogo CY-4000, y se expresan en pg/ml. Los datos se presentan como medias de n = 4, ± SD. Los datos se compararon mediante ANOVA de una vía post-hoc de Dunnett versus vehículo.

La figura 14 es una gráfica de barras que muestra los niveles de FGF23 en muestras de suero de ratas tratadas con la dosis oral indicada de los compuestos indicados y obtenidas por sangrado sublingual 24 horas después de la administración del compuesto. Los niveles de FGF23 fueron monitoreados usando el kit de ELISA de FGF23 de Kainos, número de catálogo CY-4000, y se expresan en pg/ml. Los datos se presentan como medias de n = 6, ± SD.

Descripción Detallada de la Invención En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23), fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo inorgánico y calcio total (P x tCa), osteopontina (OPN) y hormona paratiroidea (PTH) como un biomarcador, en particular, como un biomarcador para la modulación, preferiblemente la inhibición de la actividad de la cinasa del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Dicho compuesto preferiblemente es FGF23.

El factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) es conocido. Se considera un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos con amplia actividad biológica. La secuencia de la proteína y/o la secuencia de codificación de la proteína pueden ser encontradas en bases de datos disponibles públicamente conocidas en la técnica. El FGF23 humano también es conocido en la técnica como ADHR; HYPF; HPDR2; PHPTC. Los métodos para la determinación son conocidos en el campo y están particularmente descritos más adelante.

El término "fósforo inorgánico" (P) es conocido en el campo y en particular se refiere al nivel de fósforo inorgánico en sangre y puede por ejemplo ser medido en suero por el método ultravioleta utilizando kits por ejemplo de Randox Laboratories Ltd, Reino Unido, y un analizador de química clínica, como el analizador Hitachi 717 (Roche Diagnostics).

El término "'calcio total" (tCa) es conocido en el campo y en particular, se refiere al nivel de calcio total en sangre y puede por ejemplo, medirse en el suero por el método ultravioleta utilizando kits por ejemplo de Randox Laboratories Ltd y un analizador de química clínica tal como el analizador Hitachi 717.

El término "producto de fósforo inorgánico y calcio total" (P x tCa) es conocido en el campo y, en particular, se obtiene multiplicando el valor de niveles de fósforo inorgánico (P) por el valor de niveles de calcio total (tCa) en mg/dl.

La osteopontina (OPN) también referida como fosfoproteína 1 secretada, sialoproteína I ósea o activación 1 temprana de linfocitos T es conocida. Se considera una proteína estructural extracelular. La osteopontina humana se conoce en la técnica como SPPI. La osteopontina puede e.g., ser medida usando un kit tal como el Kit de EIA de Osteopontina (rata) de Assay Designs, Inc., E.U.A., siguiendo las instrucciones del fabricante.

La hormona paratiroidea (PTH) o parathormona es conocida. Se considera una hormona implicada en la regulación del nivel de calcio en la sangre. La PTH puede e.g., ser determinada usando un radioinmunoanálisis en fase sólida, como el disponible en Immutopics, Inc., EUA. En particular, la inhibición de los FGFRs puede ser evaluada mediante la determinación de los niveles de uno o más de los compuestos mencionados anteriormente, preferiblemente de FGF23 en una muestra. De tal modo, la eficacia terapéutica de un inhibidor FGFR puede ser evaluada.

El término "inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos" o "inhibidor FGFR" como se usa aquí, se refiere a las moléculas que pueden bloquear la actividad de cinasa de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos. Estas pueden ser macromoléculas, tales como los anticuerpos, o compuestos de pequeña masa molecular.

En una modalidad preferida del uso y métodos aquí descritos, el inhibidor FGFR es un compuesto de pequeña masa molecular. Ejemplos de inhibidores FGFR de pequeña masa molecular incluyen, pero no se limitan a, PD176067, PD173074, COMPUESTO A, TKI258, o COMPUESTO B. PD76067 (véase Brown, CL et al., (2005), Toxicol. Pathol, Vol. 33, p. 449-455. PD173074 es un inhibidor FGF-R de Parke Davis (ver Mohammadi ef al., EMBO J. 17.: 5896-5904), del cual se confirmaron la especificidad y la potencia. Tiene la fórmula: TKI258 era conocido anteriormente como CHIR258 y está descrito en WO 02/22598 en el ejemplo 109, así como en Xin, X. ef al., (2006), Clin. Cáncer Res., vol. 12 (16), p. 4908-4915; Trudel, S. et al., (2005), Blood, vol. 105 (7), p. 2941 a 2948). El COMPUESTO A es un inhibidor pan-FGFR, e.g., descrito en WO 06/000420 en el ejemplo 145 como 3- (2,3-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-urea. El COMPUESTO B es un derivado de [4,5']bipirimidinil-6,4'-diamina. Su estructura está descrita en WO 08/008747 (compuesto número 4 en la tabla 1). Los compuestos pueden ser preparados como se describe en, o por analogía con los procedimientos descritos en estas referencias.

En una modalidad preferida de los métodos y el uso aquí descrito, el inhibidor FGFR es el compuesto A en forma de base libre o de una sal adecuada.

"Eficacia terapéutica" como se usa aquí, se refiere al tratamiento, prevención o retraso del avance de neoplasias humanas o condiciones, tales como enfermedades proliferativas y trastornos no cancerosos. En el caso de enfermedades proliferativas, la eficacia terapéutica se refiere e.g., a la capacidad de un compuesto para reducir el tamaño de un tumor o detener el crecimiento de un tumor.

La enfermedad puede ser, sin limitarse a, una enfermedad proliferativa benigna o maligna, e.g., un cáncer, e.g., tumores y/o metástasis (dondequiera que se encuentren). En una modalidad preferida, la enfermedad proliferativa de los métodos de la presente invención es un cáncer. Preferiblemente, dicho cáncer es causado o está relacionado con la señalización del FGFR desregulada.

Las enfermedades proliferativas incluyen, sin estar limitadas a, cánceres de la vejiga, cuello uterino, o carcinomas orales de células escamosas con FGFR3 mutado y/o expresión elevada de FGFR3 (Cappellen ef al., Nature Genetics 1999, 23; 19-20; van Rhijn ef al., Cáncer Research 2001, 61: 1265-1268; Billerey eí al., Am. J. Pathol. 2001158:1955-1959, Gómez-Roman er al., Clin. Can. Res. 2005, 11:459-465; Tomlinson eí al., J. Pathol. 2007 213:91-8; WO 2004/085676), mieloma múltiple con la translocación cromosómica t(4,14) (Chesi eí al., Nature Genetics 1997, 16: 260-264; Richelda eí al., Blood 1997, 90: 4061-4070; Sibley eí al., BJH 2002, 118: 514-520; Santra eí al., Blood 2003, 101: 2374 a 2476), cáncer de mama con amplificación de genes y/o sobreexpresión proteica de FGFR1, FGFR2 o FGFR4 (Elbauomi Elsheikh eí al., Breast Cáncer Research 2007, 9 (2); Penault-Llorca eí al., Int J Cáncer 1995; Theillet eí al., Genes Chrom. Cáncer 1993; Adnane eí al., Oncogene 1991; Jaakola eí al., Int J Cáncer 1993), cáncer de endometrio con mutaciones FGFR2 (Pollock, Oncogene 2007, 1-5), cáncer hepatocelular con expresión elevada de FGFR3 o FGFR4 o ligandos FGF (Tsou, Genomics 1998, 50:331-40; Hu eí al., Carcinogenesis 1996, 17:931-8; Qui. World J. Gastroenterol. 2005, 11 :5266-72; Hu eí al., Cáncer Letters 2007, 252:36-42), cualquier tipo de cáncer con una amplificación del amplicón 11Q13, que contiene los lugares FGF3, FGF4 y FGF19, por ejemplo cáncer de mama, cáncer hepatocelular (Berns EM eí al., 1995 Gene, 159:11-8, Hu eí al., Cáncer Letters 2007, 252:36-42), trastornos mieloproliferativos E S con proteínas de fusión de FGFR1 anormales (MacDonald, Cross Pathobiology 2007, 74:81-88), linfomas con proteínas de fusión de FGFR3 anormales (Yagasaki eí al., Cáncer Res. 2001, 61:8371-4), glioblastomas con expresión anormal de FGFRI o mutaciones (Yamaguchi eí al., PNAS 1994, 91 :484-488 ; Yamada eí al., Glia 1999, 28:66-76), carcinomas gástricos con mutaciones FGFR2 o sobreexpresión o mutaciones FGFR3 (Nakamura eí al., Gastroenterology 2006, 131: 1530-1541, Takeda eí al., Clin. Can. Res. 2007, 13:3051-7; Jang eí al., Cáncer Res. 2001, 61: 3541 - 3), carcinomas pancreáticos con expresión anormal de FGFR1 o FGFR4 (Kobrin et al., Cáncer Research 1993; Yamanaka et al., Cáncer Research 1993; Shah eí al., Oncogen 2002), carcinomas de próstata con expresión anormal de FGFR1, FGFR4, o ligandos FGF (Giri eí al., Clin. Cáncer Res. 1999; Dorkin eí al., Oncogen 1999, 18:2755-61; Valve eí al., Lab. Invest. 2001, 81 :815-26; Wang, Clin. Cáncer Res. 2004, 10:6169-78); tumores hipofisarios con FGFR4 anormal (Abbas eí al., J. Clin. Endocrino! Metab. 1997, 82:1160-6), y cualquier tipo de cáncer que requiera de angiogénesis ya qye FGFs/FGFRs también están implicados en la angiogénesis (véase, por ejemplo Presta eí al Cytokine & Growth Factors Reviews 16, 159-178 (2005).

Por otra parte, la enfermedad puede ser un trastorno no canceroso tal como, sin limitarse a, tumores de piel benignos con mutaciones activadoras de FGFR3 (Logie eí al., Hum. Mol Genet. 2005; Hafner eí al., The Journal oí Clin. Inv. 2006, 116:2201-2207), trastornos del esqueleto que resultan de mutaciones en FGFRs incluyendo acondroplasia, hipocondroplasia, acondroplasia graves con retraso en el desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN), displasia tanatofórica (TD) (Webster eí al., Trends Genetics 13 (5): 178-182 (1997); Tavormina eí al., Am. J. Hum. Genet. 1999, 64: 722-731), craneosinostosis coronal Muenke (Bellus eí al., Nature Genetics 1996, 14: 174-176); Muenke eí al., Am. J.¦ Hum. Genet. 1997, 60: 555-564), síndrome de Crouzon con acantosis nigricans (Meyers et al., Nature Genetics 1995, 11: 462-464), tanto formas esporádicos y familiares de síndrome de Pfeiffer (Galvin et al., PNAS USA 1996, 93: 7894-7899; Schell er a/., Hum. Mol. Gen. 1995, 4: 323-328); trastornos relacionados con alteraciones de homeostasis de fosfato como hipofosfatemia o hiperfosfatemia, por ejemplo ADHR (raquitismo hipofosfatémico dominante autosómico), relacionado con mutaciones sin sentido de FGF23 (Consorcio de ADHR, Nat. Genet. 2000 26 (3):345-8), XLH (raquitismo hipofosfatémico ligado-x), un trastorno dominante ligado-x relacionado con mutaciones inactivas en el gen PHEX (White et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 1996, 81: 4075-4080; Quarles, Am. J. Physiol. Endocrino!. Metab. 2003 285:E1-E9, 2003; doi: 10.1152/ajpendo.00016.2003 0193-1849/03), TIO (osteomalacia inducida por tumor), un trastorno adquirido por desgaste de fosfato aislado (Shimada et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 2001 mayo 22; 98 ( 1):6500-5), displasia fibrosa del hueso (FD) (X. Yu ef al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, 221-232 y X. Yu et al., Therapeutic Apheresis and Dialysis 2005, 9(4), 308-312), y calcinosis tumoral relacionada con la pérdida de la actividad del FGF23 (Larsson et al., Endocrinology 2005 Sep; 146 (9) :3883-91).

Se ha encontrado que la inhibición de la actividad de FGFR representa un medio para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes mediadas por las células T, como por ejemplo en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias o autoinmunes mediadas por las células T que incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide (AR) , artritis inducida por colágeno I I, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES) , psoriasis, diabetes juvenil, enfermedad de Sjogren, enfermedad de la tiroides, sarcoidosis, uveítis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), enfermedad celíaca y miastenia gravis (ver WO 2004/1 10487).

Los trastornos derivados de mutaciones de FGFR3 están descritas también en el documento WO 03/023004 y WO 02/102972.

En otra modalidad, una o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de FGF23, P, P x tCa, OPN y PTH, preferiblemente FGF23, se pueden utilizar como marcadores de seguridad con el fin de predecir uno o más efectos secundarios de un inhibidor de FGFR, en particular, mineralización ectópica. Preferiblemente, el FGF23 se utiliza como marcador de seguridad para predecir uno o más efectos secundarios.

El término "efecto secundario" como se usa aquí, se refiere a un efecto no deseado el cual puede ser perjudicial para el sujeto. Dicho efecto es secundario al efecto principal o terapéutico como se describió anteriormente. Puede ser el resultado de una dosificación incorrecta o inadecuada o procedimiento de moduladores FGFR, pero también puede estar relacionada con el mecanismo de acción de los inhibidores FGFR como en el caso de la mineralización ectópica.

La mineralización ectópica es una biomineralización inadecuada que ocurre en los tejidos blandos, tales como, sin estar limitados a , aorta, corazón, pulmón, estómago, intestino, riñon y músculo esquelético. En el caso de la calcificación , por lo general se depositan sales de fosfato de calcio, incluyendo la hidroxiapatita, pero también se encuentran oxalatos de calcio y fosfatos de octacalcio (Giachelli CM, (1999), Am. J. Pathol., vol. 154(3), p. 671-675 ). La mineralización ectópica se asocia frecuentemente con la muerte celular. Esto conduce a síntomas clínicos cuando se produce en los tejidos cardiovasculares; en las arterias, la calcificación se correlaciona con la cantidad de placa aterosclerótica y un mayor riesgo de infarto de miocardio, así como un mayor riesgo de disección después de la angioplastia.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la modulación, preferiblemente la inhibición de la actividad de cinasa de FGFR, que comprende los pasos de: a) administrar un inhibidor FGFR a un sujeto; b) proporcionar una muestra de dicho sujeto; c) determinar el nivel de FGF23 de dicha muestra; y d) comparar el nivel de FGF23 de dicha muestra con un nivel de referencia.

Dicho método es, e.g., adecuado para determinar ia eficacia terapéutica de un inhibidor FGFR y/o para determinar uno o más efectos secundarios de un inhibidor de FGFR.

El sujeto de los métodos aquí descritos es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor (tal como un ratón o una rata), un perro, un cerdo o un ser humano.

La invención proporciona además un método para determinar la eficacia terapéutica de un inhibidor FGFR que comprende los pasos a) - d) del método aquí descrito, en donde el sujeto es una rata y el nivel de referencia es de 745 pg/ml.

Además, la invención proporciona un método para determinar uno o más efectos secundarios de un inhibidor FGFR que comprende los pasos a) - d) del método aquí descrito en donde el sujeto es una rata y el nivel de referencia es de 1371 pg/ml.

El "nivel de referencia" referido en los métodos de la presente invención puede ser establecido por la determinación del nivel de FGF23 en el sujeto antes del inicio del tratamiento con un compuesto inhibidor del FGFR, es decir, determinando el nivel básico del sujeto. Así, en una modalidad alternativa, el método comprende además el paso de medir el nivel básico de FGF23 en un sujeto. Otra alternativa consiste en determinar el nivel de FGF23 en un individuo o un grupo de control sano, o en un individuo o grupo de control con la misma enfermedad proliferativa o similar la cual es tratada con un compuesto no-terapéutico. Además, el nivel de referencia puede también derivarse de la literatura.

La muestra del sujeto preferiblemente se deriva de la sangre, por ejemplo, plasma o suero, u orina. Sin embargo, el método también se puede ser practicado en otros tejidos del cuerpo o derivados de los mismos, tales como Usados celulares. Debe entenderse que los métodos de la presente invención son practicados ex vivo.

La presente invención proporciona un método ex vivo para determinar la modulación, preferiblemente la inhibición de la actividad de la cinasa del FGFR que comprende los pasos de: a) determinar el nivel de FGF23 en una muestra de un paciente antes del inicio de un tratamiento con un inhibidor FGFR (nivel de referencia individual); b) determinar el nivel de FGF23 en una muestra del mismo paciente después de recibir dicho tratamiento con un inhibidor FGFR, en donde el nivel de FGF23 incrementado del paso b) con respecto al nivel de referencia individual indica la modulación, preferiblemente la inhibición, de la actividad de la cinasa de FGFR ocurrida En una modalidad preferida, el paciente es un paciente de cáncer. En una modalidad preferida, el cáncer de tal paciente es causado o está relacionado con la señalización del FGFR desregulada. Más preferiblemente, el cáncer es un tumor sólido, preferiblemente incluye pero no se limita a cáncer de vejiga, melanoma y cáncer de riñon.

Aunque el grado del aumento del FGF23 varía dependiendo de la naturaleza de cada inhibidor FGFR individual, la dosis y el régimen de tratamiento, el uso de FGF23 como un biomarcador proporciona una forma confiable, conveniente y no invasiva para el seguimiento de la respuesta del paciente al tratamiento con el inhibidor FGFR. Por otra parte, el médico puede de acuerdo con el valor incrementado de FGF23 hacer un mejor pronóstico, ajustar la dosis, cambiar a otro tratamiento o monitoreo cercano y evitar los efectos secundarios debidos al tratamiento.

Preferentemente el nivel de FGF23 del paso b) se aumenta al menos 1.2 veces en comparación con el nivel de referencia individual, aún más preferiblemente al menos 1.4 veces, por lo menos 1.5 veces, por lo menos 1 .7 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 2.5 veces. Para inhibidores FGFR potentes, tales como el compuesto A, el nivel de FGF23 puede aumentar al menos 2.5 veces, al menos 3 veces, 4 veces o incluso más.

El aumento del nivel de FGF23 después del tratamiento con el inhibidor FGFR normalmente se observa después de la primera dosis estándar del inhibidor FGFR particular. La información relativa a la dosis estándar de un inhibidor FGFR particular se puede encontrar normalmente en la etiqueta del medicamento que contiene el inhibidor FGFR particular como API . Normalmente el nivel de FGF23 se mide una vez que la concentración del inhibidor FGFR alcanza su estado estacionario. Nuestra observación preliminar con pacientes con melanoma y pacientes con carcinoma de células renales metastásico tratados con 400 mg o 500 mg de TKI258 indicó que el pico de FGF23 es alrededor del día 1 5 en el primer ciclo de tratamiento. Así, en una modalidad preferida, el método de la presente invención comprende determinar el nivel de FGF23 en una muestra del mismo paciente después de recibir dicho tratamiento con inhibidor FGFR por lo menos 5 días, preferiblemente por lo menos 5 días pero no más de 30 días, preferiblemente por lo menos 1 0 días pero no más de 25 días, por lo menos 1 0 días pero no más de 20 días. En el caso de los pacientes tratados con 400 mg al día con TKI258, los niveles de FGF23 podría aumentar hasta 1 .96 veces y 2.1 veces.

En una modalidad preferida, el inhibidor FGFR es el compuesto A o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad preferida , el inhibidor FGFR es TKI258 o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del m ismo.

En un aspecto, la presente invención proporciona un uso de un inh ibidor FG F R para la elaboración de u n medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa , en donde preferiblemente dicha enfermedad prol iferativa es cáncer, más preferiblemente cáncer con desreg u lación de señalización del FGFR, en un paciente , en donde el paciente tiene un mayor nivel de FG F23 después de tomar dicho inhibidor del receptor FG FR. Alternativamente la presente invención proporciona un método de tratam iento de una enfermedad prol iferativa , en donde preferiblemente dicha enfermedad proliferativa es cáncer, más preferiblemente cáncer con desreg ulación de señal ización del FGFR, en un paciente, que com prende el paso de administrar un inhibidor FG FR a d icho paciente , en donde dicho paciente tiene el nivel incrementado del FG F23 después de tomar dicho inhibidor del receptor FGFR . El aumento del n ivel de FGF23 después del tratamiento con inhi bidor FGFR normalmente se observa después de la primera dosis estándar del inhibidor FGFR particular. Normalmente el nivel de FGF23 se mide una vez q ue la concentración del inhibidor FGFR alcanza su estado estacionario. Así, el uso de FGF23 como biomarcador permite la estratificación de los pacientes, particularmente pacientes con cáncer con desregulación de señalización de FG FR, dependiendo de sus respuestas a un inh ibidor FGFR.

La presente solicitud proporciona un método para seleccionar pacientes para determinar si un paciente se beneficiará de un tratamiento con inhibidor FGFR, dicho método comprende los pasos de (a) proporcionar a un paciente un tratamiento con inhibidor FGFR por un período de tiempo; (b) medir el nivel de FGF23 en la muestra de dicho paciente después de dicho tratamiento; (c) comparar el valor de FGF23 obtenido del paso (b) con el nivel de referencia individual (nivel de FGF23 en dicho paciente antes del inicio de dicho tratamiento con el inhibidor FGFR) y decidir si dicho paciente debe continuar dicho tratamiento con el inhibidor FGFR o no.

El término "período de tiempo" como se usa aquí, se refiere a un período de tiempo relativamente corto, normalmente no mayor de 30 días, más probablemente no mayor de 15 días, posiblemente no mayor de una semana. Durante este período de tiempo de "juicio", se le proporciona al paciente dicho tratamiento con inhibidor FGFR de acuerdo al régimen estándar o incluso a dosis elevadas o con mayor frecuencia de administración o ambas. El paciente tiene normalmente una condición que podría ser causada o estar relacionada con la señalización desregulada de FGFR, en la mayoría de los casos el paciente tiene un cáncer que podría ser causado o relacionado con la señalización desregulada de FGFR.

El aumento de FGF23 en comparación con el nivel de referencia individual es normalmente por lo menos 1.2 veces, preferiblemente por lo menos 1.3 veces o por lo menos 1.5 veces. Este es típicamente y preferiblemente el caso cuando el inhibidor FGFR es TKI258.

Para un inhibidor FGFR potente se podría esperar un mayor aumento de FGF23. En el caso del compuesto A, el aumento es por lo menos 1.3 veces, preferiblemente por lo menos 1.5 veces, más preferiblemente por lo menos 2 veces, más preferiblemente por lo menos 3 veces.

El inhibidor FGFR se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de PD176067, PD173074, compuesto A (3-(2,3-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4 -(4-etil-perpazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil urea), TKI258 y el compuesto B (un derivado de [4,5'] bipirimidinil-6,4'-diamina).

En una modalidad preferida, el inhibidor FGFR es el compuesto A o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad preferida, el inhibidor FGFR es TKI258 o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Para efectos de detección, la muestra puede ser tratada adicionalmente, e.gf., las proteínas se pueden aislar mediante técnicas que son bien conocidas por expertos en la técnica.

Por lo general, el nivel de FGF23 se determina midiendo la presencia del polipéptido FGF23 en dicha muestra de un sujeto con un agente adecuado para la detección. Un agente preferido para la detección de un polipéptido de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención, preferiblemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o preferiblemente, monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo, por ejemplo, Fab o F(ab')2.

En otra modalidad , la expresión de la secuencia q ue codifica para FGF23 puede ser detectada en la muestra, por ejem plo, determ inando el nivel del ARN correspondiente. Un agente de detección adecuado es u na sonda, u na secuencia de ácido nucleico corta complementaria de la secuencia del ácido nucleico objetivo . En una modalidad preferida de la invención , se detecta el polipéptido FGF23. El agente de detección puede ser directa o indirectamente detectable y preferiblemente está marcado. El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo , tiene el propósito de abarcar el marcado directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento , i. e. , uniendo físicamente, una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo , así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por la reactividad con otro agente que está directamente marcado. Ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y un extremo marcado de una sonda de ADN con bioti na de tal manera q ue pueda ser detectado con estreptavidi na marcada fluorescentemente. La marca puede ser una convencional , por ejemplo, biotina o una enzima tal como la fosfatasa alcal ina (AP) , peroxidasa de rábano picante (H RP) o peroxidasa (POD) o una molécula fluorescente, e. g. , un pigmento fluorescente, tal como e. g. isotiocianato de fluoresceína.

En una modalidad preferida de la invención , el medio de detección com prende un anticuerpo, incluyendo derivados de anticuerpos o fragmentos de los mismos, e. g. , un a nticuerpo que reconoce FGF23, e. g. , un anticuerpo q ue reconoce FG F23 q ue lleva marca . En otro aspecto, el nivel de FGF23 se determina en el uso de un anticuerpo específico FGF23.

El agente de detección, e.g., el anticuerpo que lleva la marca, puede ser detectado conforme a métodos convencionales, e.g., a través de métodos de medición de fluorescencia o de detección de enzimas, incluyendo los convencionales en el campo de los ensayos, por ejemplo, los inmunoensayos, tales como inmunoensayos enzimáticos (ELISAs); ensayos basados en fluorescencia, tales como inmunoensayos de lantánidos de mayor disociación (DELFIA) o ensayos radiométricos tales como radioinmunoensayo (RIA). Otros ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, análisis EIA y Western blot. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente métodos de detección de anticuerpos/ proteína conocidos para su uso en la determinación del nivel de FGF23.

Debe entenderse que los métodos aquí descritos pueden ser llevados a cabo de manera similar con un compuesto seleccionado del grupo que consiste de P, P x tCa, OPN y PTH.

En una modalidad preferida, dos o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de FGF23, P, P x tCa, OPN y PTH se utilizan en los métodos aquí descritos, más preferiblemente, FGF23 en combinación con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de P, P x tCa, OPN y PTH. Al usar múltiples biomarcadores, se aumenta la exactitud en la determinación de la eficacia terapéutica y/o uno o más efectos secundarios de un inhibidor FGFR.

Cuando uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de FGF23, P, P x tCa, OPN, PTH se utilizan como un biomarcador de seg uridad , el método descrito anteriormente para determinar uno o más efectos secu ndarios de un inhi bidor FG FR puede comprender además los pasos de e) correlacionar el n ivel de u no o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de FGF23, P , P x tCa, OPN , PTH con uno o más efectos secundarios ; y f) determ inar el nivel de dicho(s) compuesto (s) por encima del cual ocurrirá el secundario efecto , relativo al tratamiento empleado.

Preferiblemente, el nivel de FGF23, P, P x tCa, OPN aumenta cuando se compara con el nivel de referencia .

Preferiblemente, el nivel de PTH disminuye cuando se compara con el nivel de referencia.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene un trastorno relacionado con FG FR a un tratamiento terapéutico con un inh ibidor FG FR, que comprende el paso de determinar el nivel de uno o más com puestos seleccionados del grupo que consiste de FG F23, P, P x tCa, OPN , PTH , preferiblemente FGF23, en el plasma o en el suero del sujeto.

Como se usa aquí, "tratamiento terapéutico" se refiere al tratam iento , prevención o retraso del avance de un trastorno relacionado con FG FR , preferiblemente de una enfermedad proliferativa , más preferiblemente de un cáncer.

En aún otro aspecto, la invención proporciona u n kit de diagnóstico q ue incluye los elementos a) - d) como se indica a continuación. En particular, se refiere a un kit para determinar la eficacia de un inhibidor FGFR y/o los efectos secundarios de los inhibidores FGFR, preferiblemente en una muestra de un sujeto, que comprende a) una molécu la q ue reconoce uno o más com puestos seleccionados del grupo q ue consiste de FGF23, P, P x tCa, OPN y PTH o parte de los mismos, opcionalmente en una forma marcada ; b) opcionalmente, instrucciones de uso; c) opcionalmente medios de detección ; y d) opcionalmente una fase sólida .

Además, se proporciona el uso de dicho kit para determinar la eficacia de un inhibidor FGFR y/o los efectos secundarios de inhibidores FGFR , preferiblemente en una m uestra de un sujeto.

En una modalidad preferida , la presente invención proporciona un kit de diag nóstico que comprende a) una molécula que reconoce FGF23 o una parte del m ismo , opciona lmente en u na forma marcada ; b) por lo menos un reactivo susceptible de detectar un segundo biomarcador seleccionado del grupo que consiste de fósforo inorgánico (P) , el prod ucto de fósforo y calcio total (P x tCa), osteopontina (OPN) y la hormona paratiroidea (PTH) ; c) opcionalmente, instrucciones de uso; d) opcionalmente medios de detección ; y e) opcionalmente una fase sólida.

Además, la presente invención proporciona el uso del kit como se indicó anteriormente para determinar la eficacia de un inhibidor FGFR y/ o los efectos secundarios de los inhibidores FGFR en una muestra de un sujeto.

En una modalidad preferida, el kit comprende al menos un reactivo capaz de detectar un segundo biomarcador que es fósforo inorgánico (P)- Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más detalladamente las modalidades preferidas de la invención. Estos ejemplos no deben de ninguna manera interpretarse como limitación del alcance de la invención, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Inhibición dependiente de la dosis de homoinjertos de tumor por el COMPUESTO A; FGF23 como biomarcador para monitorear la inhibición de la actividad de cinasa del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1.1 Métodos Animales. Los experimentos se llevaron a cabo en hembras HsdNpa: ratones desnudos-nu atímicos obtenidos de Laboratory Animal Services de Novartis Pharma AG, Basilea, Suiza. Los animales se mantuvieron bajo condiciones OHC en jaulas Makrolon tipo III (con un máximo de 10 animales por jaula) con condiciones de 12 horas de oscuridad, 12 horas de luz (luces prendidas: 6 AM, luces apagadas: 6 PM). Los animales fueron alimentados con comida y agua ad libitum. Los experimentos se llevaron a cabo con la licencia número 1762 y licencia número 1763 aprobadas por The Basel Cantonal Veterinary Office. Todos los procedimientos invasivos se realizaron bajo anestesia Forene.

Establecimiento de modelo de homoinjerto del tumor NIH3T3/FGFR3S249C en ratones desnudos. El modelo NIH3T3/FGFR3S2 9C ha sido validado y caracterizado como un modelo de tumor murino subcutáneo para el perfilado in vivo de los inhibidores de FGFR. La línea celular NIH3T3 primaria fue derivada originalmente por inmortalización de fibroblastos embrionarios de ratón. Las células NIH3T3/FGFR3S2 9C fueron generadas por la infección de los fibroblastos NIH3T3 primarios con un vector retroviral que expresa FGFR3 con la mutación de activación S249C. Se establecieron y caracterizaron grupos de células NIH3T3 resistentes G418 para la expresión de FGFR3 y fosforilación de la tirosina. Para generar los homoinjertos, 5x105 células NIH3T3/FGFR3S2 9C resuspendidas en PBS se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos (0.2 ml/ratón).

Establecimiento del modelo de xenoinjerto de tumor RT112/luc1 en ratones desnudos. La línea celular del carcinoma de células transicionales de vejiga urinaria humana RT-112, la cual expresó altos niveles de FGFR3 tipo silvestre, se derivó inicialmente de una paciente hembra con carcinoma de vejiga urinaria primario sin tratamiento primario (grado histológico G2, etapa no registrada) en 1973 (Marshall et al., 1977, asters et al., 1986). El vial del stock original de células RT112 usadas en este estudio se obtuvo de DSMZ ACC # 418.

Las células se cultivaron en medio MEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 1% de piruvato de sodio y 1% de L-glutamina.

Los reactivos del cultivo celular se adquirieron de BioConcept (Allschwil, Suiza).

La línea celular RT1 12 primaria se infectó con el vector de expresión retroviral pLNCX2/luc1 y los grupos de células resistentes G418 se establecieron y se caracterizaron para la expresión de luciferasa. La expresión dirigida CMV de luciferasa permite la detección de tumores usando cámaras Xenogen I VI S R™ después de la inyección de D-luciferina.

Los tumores de xenoinjerto RT1 12/luc1 fueron establecidos por inyección subcutánea de 5xl06 células en 100 µ? de HBSS (Sigma # H8264) que contiene 50 % de Matrigel (BD # 356234) en el flanco derecho.

Evaluación de la actividad anti-tumoral. Para el modelo NI H3T3/FGFR3S2 9C, el tratamiento se inició cuando el volumen promedio del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm 3 El crecimiento del tumor y los pesos corporales fueron controlados a intervalos regulares. Los tamaños del tumor se midieron manualmente con pinzas. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula: (W x L x H x p/6), en donde el ancho (W), longitud (L) y altura (H) son los tres diámetros más grandes.

Para el modelo RT1 12/luc1 , los tratamientos se iniciaron cuando los volúmenes medios del tumor fueron aproximadamente 1 80 mm3 y los ratones fueron tratados diariamente durante 14 d ías. Los pesos corporales y el volumen del tumor se registraron dos veces por semana. Los volúmenes del tumor se midieron con pinzas y se determinaron de acuerdo con la fórmula de la longitud x diámetro2 x tt/6.

Análisis Estadístico. Cuando es aplicable, los resultados se presentan como media ± SEM. Los datos de tumor y peso corporal fueron analizados por ANOVA con prueba de Dunnett post hoc para la comparación del tratamiento versus grupo control. La prueba de Tukey post hoc se utilizó para la comparación entre grupos. El nivel de significancia del cambio de peso corporal dentro de un grupo entre el inicio y el final del experimento se determinó mediante una prueba t por pares. El análisis estadístico se realizó a través del prisma Graphpad 4.02 (GraphPad Software).

Como una medida de la eficacia anti-tumoral, el valor % T/C calcula en un cierto número de días después de comenzar el tratamiento en función de: (variación media del volumen del tumor de animales tratados / variación media del volumen del tumor de animales de control) x100. Cuando es aplicable, el % de regresiones se calculan de acuerdo con la fórmula (variación media del volumen del tumor / media del volumen del tumor inicial) x I00. L Formulación de compuestos y tratamiento de animales. El Compuesto A fue formulado como una suspensión en PEG300/D5W (2:1 v/v, D5W = glucosa al 5% en agua) y aplicado diariamente por sonda. El Vehículo consistió de PEG300/D5W. Los volúmenes de aplicación fueron de 10 mi / kg.

Procesamiento de tejidos para el análisis ex vivo. Al final de los experimentos, 2 horas después de la última administración del compuesto, se tomaron las muestras de tumor y sangre.

Las muestras del tumor se disecaron y se congelaron en N2 líquido. El material tumoral fue pulverizado con un molino de oscilación (RETSCH M200). Los recipientes y bolas de la molienda se enfriaron en hielo seco durante media hora antes de agregar las muestras de tumor congeladas. El molino de oscilación fue operado durante 20 segundos al 100% de intensidad. El polvo del tumor se transfirió a 14 mi de polipropileno (todos los pasos en hielo seco) y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Se pesaron alícuotas de 50 mg de polvo de tumor, se colocaron en hielo y se resuspendieron inmediatamente en una proporción de 1: 10 (p/ v) en tampón de lisis enfriado de hielo (Tris 50 mM pH 7.5, NaCI150 mM, EGTA 1 mM, EDTA5 mM, 1% de Tritón, Vanadato de sodio 2 mM, PMSF 1 mM e inhibidores de la proteasa Cóctel de Roche # 11873580001). Se dejó que la lisis continuara durante 30 min en hielo, los Usados fueron aclarados por centrifugación a 12000 x g durante 15 min y la concentración de proteínas se determinó usando reactivos del análisis de proteínas DC (Bio Rad # 500-0116) y un BSA estándar. Se tomó sangre de la vena cava con una aguja de calibre 23 en una jeringa de 1 mi que contiene 70 µ? de 1000 IU/ mi de solución de heparina. La sangre se almacenó después en hielo durante 30 minutos hasta la centrifugación (10,000 g, 5 minutos) y después se recogió el plasma.

Inmunoprecipitación y análisis Western blot. Cantidades iguales de lisados de proteínas se aclararon previamente con proteína A sefarosa seguido por incubación con 1 µg de anticuerpos a-FGFR3 (policlonal de conejo, Sigma # F3922) durante 2 h en hielo. Se obtuvieron Inmunocomplejos con proteína A sefarosa y se lavaron 3 veces con tampón de lisis. Las proteínas unidas se liberaron mediante ebullición en tampón de muestra (20% de SDS, 20% de glicerol, Tris 160 mM pH 6.8, 4% de ß-mercaptoetanol, 0.04 % bromo- azul de fenol).

Las muestras fueron sometidas a SDS-PAGE y las proteínas blotted en membranas de PVDF. Los filtros se bloquearon con 20 % de suero de caballo, 0.02% de Tween 20 en PBS/O durante 1 hora y el anticuerpo 4G10 anti-pTirosina (Upstate) se agregó en dilución 1: 10000 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron con anticuerpo anti-ratón acoplado con peroxidasa (Amersham # NA931V) utilizando el sistema de detección de sustrato de duración prolongada SuperSeñal® West Dura (Pierce # 34075). Además, las membranas se cortaron en tiras en Tris-HCI 62.5 mM pH 6.8; 2 % SDS; 1/125 ß-mercaptoetanol durante 30 minutos a 60 °C, evaluadas nuevamente con anticuerpos a-FGFR3 (policlonal de conejo, Sigma # F3922), seguido por anticuerpos anti-conejo acoplado con peroxidasa (Amersham # NA934V). Las proteínas se visualizaron como se describió anteriormente.

Ensayo de Elisa FGF23. Para monitorear los niveles de FGF23 en muestras de suero o plasma se usó el ensayo ELISA FGF23 de KAINOS Laboratories, Inc., Japón (catálogo # CY-4000). En pocas palabras, se usaron dos anticuerpos monoclonales específicos de murino que se unen a FGF-23 de longitud completa: el primer anticuerpo se inmovilizó en el pozo de la placa de microtitulación para captura y el segundo anticuerpo se conjugó con HRP (peroxidasa de rábano picante) para detección. En una primera reacción, las muestras de plasma o suero se agregaron en pozos de microtítulación recubiertos con anticuerpo anti-FGF23 que permite la unión. Los pozos se lavaron para eliminar el FGF23 no unido y otros componentes. En una segunda reacción, el FGF23 inmovilizado se incubó con el anticuerpo marcado con HRP para formar un complejo "emparedado".

Este ensayo de ELISA ha sido validado para el control de FGF23 en suero y plasma de ratón, rata y perro. 1.2 Resultados y discusión La actividad del compuesto A en el modelo NIH3T3/FGFR3S2 9C. El efecto anti-tumoral del compuesto A se evaluó en el modelo NIH3T3/FGFR3 S2 9C subcutáneo. Se evaluaron los niveles de dosis de 10, 30 y 50 mg/kg. El tratamiento se inicia cuando el tamaño promedio del tumor estimado alcanzó los 100 mm3 (día 0) y los animales fueron tratados durante 8 días. Los tamaños del tumor y los pesos corporales se evaluaron en el día 8 del tratamiento por ANOVA de una vía. El efecto antitumoral estadísticamente significativo se observó en todos los niveles de dosis cuando se comparó con los animales tratados con vehículo (ANOVA post hoc de Dunnett), con valores T/C de 34 y 4% en 10 y 30 mg/kg, respectivamente, y 40% de regresión del tumor en 50 mg/kg (Tabla 1, Figura 1). Los dos niveles de dosis más altos ganaron menos peso corporal estadísticamente significativo durante el período de tratamiento. Sin embargo, la ganancia de peso corporal adicional observada en el vehículo tratado y el grupo tratado con 10 mg/ kg es, al menos en parte, correspondiente a la masa tumoral.

Tabla 1 Respuesta de Tumor Respuesta de huésped Compuesto Dosis, T/C Regr. ? Volumen del ? peso corporal ? peso corporal ruta, (%) (%) Tumor (media (media g ± (%± SEM) horario mm3 ± SEM SEM) Vehículo 10 ml/kg, 100 ND 3853 ± 473 4.1 ± 0.5 16.9 ± 2 oral, una diaria Compuesto 10 mg/kg, 34 ND 1320 ± 245* 4.2 ± 0.7 18.0 ± 3.2 A oral, una diaria Compuesto 30 mg/kg, 4 ND 156 ± 56* 1.6 ± 0.7 7.0 ± 3.1* A oral, una diaria Compuesto 50 mg/kg, ND 40 -43 ± 2.8* 1.1 ± 0.5 4.6 ± 2.2* A oral, una diaria Farmacodinamica de la fosforilación de tirosina del FGFR3 en el tratamiento con el COMPUES TO A . Los tumores N I H3T3/FGFR3S249C de animales tratados con 1 0, 30 ó 50 mg/kg una vez al día, o con vehículo fueron disecados 2 horas después de la última dosificación , la cual se encuentra dentro del intervalo de tmax establecido en estudios farmacocinéticos previos. E l análisis ex vivo de tumores im plantados N I H3T3/FGFR3 S249c demostró una inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de ti rosina del FGFR3 mientras que los niveles totales del receptor permanecieron constantes (Fig ura 2) . Este efecto farmacodinámico se correlacionó con el efecto anti-tumoral (Figura 1 ) .

Actividad del compuesto A en el modelo RT1 12/luc 1. La actividad anti-tumoral del compuesto A se evaluó en dos niveles de dosis diferentes, 50 y 75 mg/kg por día administrado oralmente a ratones desnudos. Las dos dosis produjeron una regresión tumoral estadísticamente importante (p <0,01; ANOVA post hoc de Dunnett). Los valores de regresión fueron 67 y 74% para el compuesto A en 50 y 75 mg/kg, respectivamente (Tabla 2, Figura 3). Los tratamientos fueron bien tolerados, según es mostrado por el aumento estadísticamente importante en el peso corporal en el vehículo y el compuesto A en grupos de 50 mg / kg / día en el transcurso del experimento. El grupo tratado con 75 mg/kg del COMPUESTO A mostró una ligera pérdida de peso corporal, aunque no significativa estadísticamente. Los aumentos en el peso corporal se encontraron significativamente diferentes en el grupo tratado con 75 mg/kg del COMPUESTO A en comparación con los controles del vehículo (p<0.0l, ANOVA, post hoc de Dunnett). Además, el grupo tratado con 75 mg/kg del COMPUESTO A mostró una diferencia estadísticamente importante en el cambio de peso corporal en comparación con todos los demás grupos (p <0.05, ANOVA, post hoc de Tukey).

Tabla 2 Respuesta de Tumor Respuesta de huésped Compuesto Dosis, T/C Regr. ? Volumen del ? peso corporal ? peso corporal ruta, (%) (%) Tumor (media (media g ± (%± SEM) horario mm3 ± SEM SEM) Vehículo 10 ml/kg, 100 ND 500 ± 54 3.3 ± 0.6* 13.5 ± 2.7 oral, una diaria Compuesto 50 mg/kg, ND 67 -120+ 12* 2.6 ± 1.0* 10.8 ± 4.1 A oral, una diaria Compuesto 75 mg/kg, ND 74 -133 ± 13* -1.1 ± 1.1 -4.0 ± 4.5 A oral, una diaria Niveles de FGF23 en muestras de plasma de ratones desnudos. Como parte del estudio descrito en la sección 1.1, se determinaron los niveles de FGF23 en muestras de plasma de ratones tratados con 50 ó 75 mg/kg una vez al día del compuesto A o vehículo, dos horas después de la última administración. Los ratones que fueron tratados con el compuesto A mostraron niveles plasmáticos de FGF23 incrementados en comparación con el grupo tratado con vehículo (Figura 4), el cual se correlacionó con el efecto de eficacia anti-tumoral observado con ambas dosis del compuesto (Figura 3), Conclusión. Los datos experimentales presentados demuestran que las dosis del compuesto A que inhiben FGFR3 in vivo y producen efectos anti-tumorales estadísticamente importantes en dos modelos de tumor de murino, también conllevan a mayores niveles de FGF23 en plasma en una forma dependiente de la dosis.

Ejemplo 2 Estudio Mecánico en Ratas 2.1 Métodos Animales. Los experimentos se realizaron en ratas machos Crl:WI (Han) (14-17 semanas de edad al inicio de la dosificación) obtenidas a partir de Charles River Laboratories Germany GmbH, Modelos de Investigación y Servicios, Sulzfeld, Alemania. Los animales se mantuvieron en condiciones óptimas de higiene (OHC) en jaulas Makrolon tipo IV con condiciones de 12 horas de oscuridad, 12 horas de luz. Se proporcionó dieta estándar en pellas y agua ad libitum. Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal de Suiza y bajo la Licencia No. 5.075 por "Kantonales Veterinaramt Baselland" (Oficina Cantonal de Veterinaria, Basilea).

Formulación del compuesto y tratamiento de los animales. El Compuesto A fue formulado como una solución en amortiguador de ácido acético-acetato (pH 4.6) / PEG300 (2:1 v / v) y aplicado diariamente por sonda. El vehículo consistió de amortiguador de ácido acético-acetato (pH 4.6) / PEG300 (2:1 v / v). Los volúmenes de aplicación fueron de 5 ml/kg.

Diseño del estudio. El Compuesto A se administró oralmente a grupos de 10 ratas machos en dosis de 10 mg/kg durante 1, 3, 7 y 15 días, o 20 mg/kg para 1, 3 y 6 días, una vez al día. Los animales tratados con 20 mg/kg tuvieron que ser terminados antes de tiempo después de la 6a administración debido a la pérdida severa de peso corporal. Los animales de control recibieron el vehículo para 1, 3, 7 y 15 días. Grupos adicionales (10 machos cada uno) que recibieron ya sea el Compuesto A (dosis: 10 mg/kg para el 3, 7 y 15 días; 20 mg/kg para 1 y 3 días) o el vehículo, se introdujeron para investigar más a fondo los efectos relacionados con el tratamiento y monitorear las variaciones en los parámetros químicos clínicos seleccionados después de 4, 7 ó 14 días de recuperación. 2.2 Resultados v discusión Hallazgos histopatológicos relacionados con la inhibición de FGFR. El engrosamiento de la placa de crecimiento se detectó después de tres días de tratamiento en los animales dosificados con 10 y 20 mg/kg/día. Esto es una consecuencia de la inhibición de FGFR3, muy probablemente en condrocitos. De hecho, el engrosamiento de la placa de crecimiento, debido al tamaño incrementado de la zona hipertrófica, había sido demostrado previamente que se produce también en ratones homocigotos para una interrupción selectiva de FGFR3, es decir, carecen de la expresión de FGFR3 (Colvin et al., Nature Genetics 1996, 12: 390-397). Esta observación demuestra que FGFR3 desempeña un papel en la regulación del ensanchamiento de la placa de crecimiento. Por lo tanto, los hallazgos relacionados con la placa de crecimiento son considerados una lectura farmacológica de los inhibidores FGFR y son una indicación de la eficacia, es decir, la inhibición de FGFR3, de un inhibidor FGFR. Los signos de eventos de remodelación ósea se observaron en los animales tratados con 10 mg/kg/ día después de 15 días de tratamiento y 4 días de período de recuperación y 20 mg/kg/ día después de 3 días de tratamiento y 4 días de período de recuperación (efectos retrasados), y en los animales tratados durante 6 días con 20 mg/ kg/día. Se detectaron tejidos blandos/ mineralización vascular en los animales tratados con 20 mg/kg/día durante 3 días después de 4 días de recuperación y después de 6 días de tratamiento en la dosis de 20 mg/kg/una vez al día del compuesto A. Tal hallazgo no se observó en los grupos administrados con 10 mg/kg/ una vez al día del compuesto A.

Parámetros químicos clínicos. El fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo inorgánico y calcio total (P x tCa), hormona paratiroidea (PTH), osteopontina (OPN) y FGF23 se midieron con el propósito de evaluar su utilidad como marcadores para predecir y monitorear los eventos farmacológico (engrosamiento de la placa de crecim iento) y patológico (remodelación ósea y mineral ización ectópica) . Las variaciones en el suero de los niveles de P , tCa, sus productos y FG F23 se muestran como diagramas de dispersión en la Fig ura 5, 6, 7 y 8, respectivamente. Cada d iagrama (cuadrado con escala de grises representa un solo animal) se reporta como una función de la concentración periférica del marcador (eje Y) y de la dosis del Compuesto A (eje X) . Diferentes tonos grises se asocian a períodos de tratam iento específico. Se utilizó Spotfire 8.2 para la visualización de los datos.

Método para la validación de los biomarcadores. Se llevó a cabo una evaluación cuantitativa de la eficiencia de los marcadores seleccionados medidos en el estud io exploratorio de ratas mediante un análisis de las características operativas del receptor (ROC), un método com únmente uti lizado para evaluar las pruebas médicas que permite determ inar la capacidad de diag nóstico de un análisis dado mediante la medición del área bajo la curva (AUC) de ROC. Swets JA, Science. 240 : 1 285-93 ( 1 988) ; Swets JA et al. , Scientific American 283: 82-7 (2000) .

Evaluación de las eficiencias de los biomarcadores seleccionados. La clasificación de la eficiencia de los marcadores (AUC) , obtenida por aplicación del análisis de ROC a los datos obtenidos de la fase de tratam iento, está reportada en la Tabla 3.

Tabla 3 Farmacología Patología Marcador AUC SE Valor p Marcador AUC SE Valor p FGF23 0.92 0.03 0.0E + 00 FGF23 1.00 0.00 0.0E + 00 P tCa 0.90 0.03 0.0E + 00 OPN 1.00 0.00 0.0E + 00 PTH 0.90 0.03 0.0E + 00 P 0.90 0.03 O.OE + 00 P 0.89 0.03 0.0E + 00 P x tCa 0.87 0.04 0.0E + 00 OPN 0.84 0.07 8.4E - 07 PTH 0.75 0.07 3.1 E - 04 SE = error estándar del AUC.

Valor p. = probabilidad de obtener el valor correspondiente del AUC por casualidad.

El análisis de ROC se utilizó para conducir una evaluación adicional de la eficiencia de FGF23, teniendo en cuenta los efectos patológicos retrasados. Este análisis permitió la determ inación de los umbrales de la farmacolog ía y seguridad para este marcador (Tabla 4) . El va lor umbral de farmacolog ía es de 745 pg/ml , lo que representa el nivel de FG F23 por encima del cual se puede observar el engrosam iento de la placa de crecim iento durante los tratamientos considerados en este análisis. El valor del umbral de seguridad es 1 371 pg/ml , lo q ue representa el nivel más alto de FGF23 permitido durante los tratam ientos considerados en este análisis que garantiza la ausencia de efectos retardados patológicos (remodelación ósea y m ineral ización ectópica) .

Tabla 4 FGF23 Evaluación AUC Umbral (pg/ml) Farmacología 1.00 745 Patología 0.99 1371 Conclusión. Entre los parámetros clínicos medidos en el contexto de este estudio en la rata, se encontraron varios a ser marcadores farmacodinám icos adecuados . Estos marcadores muestran buenos a muy altos niveles de eficiencias según se dem uestra por los correspondientes valores del AUC reportados en la Tabla 3. Además , como se muestra en el Tabla 4, este estudio dem uestra que FGF23 es un biomarcador predictivo para monitorear el in icio del engrosam iento de la placa de crecimiento (eficacia terapéutica/ farmacología) y para prevenir el inicio de la remodelación ósea y la mineral izacion ectópica (seguridad/ patolog ía) . La farmacolog ía y los umbrales de seguridad ha n sido establecidos para FGF23 en el contexto de este estudio específico y de los tratamientos considerados en el análisis.

Ejemplo 3 I nducción de FG F23 por el Compuesto A en perros 3. 1 Métodos Animales. Los experimentos fueron llevados a cabo en perros: Especie de animal y raza : Perro, Beagle.

N úmero de an imales en estud io: 8 Edad: 13 a 18 meses (al inicio de la dosificación).

Intervalo de peso corporal: 7 a 11 Kg (al inicio de la dosificación).

Proveedores de tratamientos terapia antiparasitaria y vacunación en veterinarios: contra de moquillo, hepatitis infecciosa canina, parainfluenza, leptospirosis, parvovirus, adenovirus, rabia.

Formulación del compuesto y tratamiento de animales. El Compuesto A fue formulado como una suspensión en 0.5% de HP C603 y se aplicó una vez al día mediante una sonda nasogástrica. El vehículo consistió de 0.5% de HP C603. Los volúmenes de aplicación fueron de 2 ml/kg.

Diseño del estudio: Los perros fueron tratados con el vehículo o el compuesto A como se indica: Tabla 1 Grupo Dosificación Animales por Macho Hembra Vol. de dosificación No. (mg/Kg/dia) sexo o No (ml/Kg/dia) 1 0* 1 451 452 2 2 3/100** 1 453 454 2 3 30* 1 455 456 2 4 300*** 1 457 458 2 * El Grupo 1 y Grupo 3 fueron tratados durante 15 días consecutivos.

** El Grupo 2 fue tratado durante 8 días con 3 mg/kg/día. Del día 9 al día 18 la dosis se aumentó a 100 mg/kg/día; a partir del día 19 al día 21 los animales descansaron de fármacos, y la dosificación se reanudó el día 22 y día 23 (100 mg/kg: 10 días, 3 días de descanso, 2 días).

*** El Grupo 3 recibió 300 mg/kg/día durante 8 días consecutivos.

Muestreo de sangre para el análisis ex vivo. Al final del periodo de dosificación , 1 hora después de la última administración del compuesto, se recolectó toda la sangre en tubos recubiertos con EDTA tomada de la vena yug ular o vena cefálica del antebrazo y se mantuvo en agua helada hasta su posterior procesam iento. La m uestra se centrifugó y el plasma se transfirió a un tubo Eppendorf y se colocó en hielo seco .

Ensayo ELI SA de FGF23. Para monitorear los niveles de FGF23 en m uestras de plasma se usó el ensayo ELI SA de FGF23 de KAI NOS Laboratories , I nc. , Japón (catálogo # CY-4000) . En pocas palabras, se usaron dos anticuerpos monoclonales específicos de murino que se u nen a FG F-23 de long itud com pleta: el primer anticuerpo se inmovilizó en el pozo de la placa de m icrotitulación para captura y el seg undo anticuerpo se conjugó con H RP (peroxidasa de rábano picante) para detección. En una primera reacción , las muestras de plasma o suero se agregaron en pozos de microtitulación recubiertos con anticuerpo anti-FG F23 que perm ite la unión . Los pozos se lavaron para eliminar el FG F23 no unido y otros componentes. En una segunda reacción , el FGF23 inmovilizado se incubó con el anticuerpo marcado con H RP para formar un complejo "emparedado". 3.2 Resultados y d iscusión Niveles de FGF23 en muestras de plasma de perros. Los perros que fueron tratados con el compuesto A mostraron un aumento de los niveles plasmáticos de FGF23 en comparación con los grupos tratados con el veh ículo (Tabla 2) , que fueron en general dependientes de la dosis. E l i ncremento inferior al proporcional de la dosis para el g rupo 2 se podría explicar por un mecanismo de adaptación durante el periodo de dosificación de 3 mg/kg/día. Alternativamente, los tres días de descanso después de 10 días de tratamiento podría resultar en una disminución de FGF23.

Tabla 2 Conclusión. Los datos experimentales presentados demuestran que el Compuesto A conduce a mayores niveles de FGF23 plasmático en perros.

Ejemplo 4 Mediciones de FGF23 en muestras de plasma de pacientes con cáncer de melanoma tratados con TKI258 4.1 Métodos Compuesto: TKI258 es un inhibidor multi-cinasa que inhibe entre otros, FGFR1, FGFR2 y FGFR3 con valores de IC50 en ensayos celulares de 166, 78 y 55 nM, respectivamente.

Pacientes y tratamiento: pacientes con melanoma metastásico fueron tratados diariamente con TKI258 administrado por vía oral en las dosis indicadas. El muestreo de sangre se llevó a cabo en el día y ciclo indicados. Los niveles de FGF23 se midieron en plasma. Los valores dados para CI DI son los valores de la l ínea de base.

Ensayo ELI SA de FGF23. Para mon itorear las muestras de plasma de FG F23 en los pacientes se usó el ensayo ELI SA de FGF23 de KAI NOS Laboratories, I nc. , Japón (catálogo # CY-4000) como se describió en el Ejem plo 3. 4.2 Resultados v discusión Los datos de FGF23 de tres pacientes diferentes se muestran en la Tabla 3 Tabla 3 Paciente Dosis (mg) Ciclo de tratamiento (C) / FGF23 Factor de Día de tratamiento (D) [pg/ml] Inducción C1 D1 36.4 1.00 C1 D15 39.8 1.09 A 200 C1 D26 24.4 0.67 C3D26 31.8 0.87 C6D26 21.1 0.58 C9D26 39.6 1.09 C1 D1 72.3 1.00 B 400 C1 D15 94.1 1.30 C3D26 88.5 1.22 C4D26 141.5 1.96 C1 D1 41.1 1.00 C 400 C1 D15 86.5 2.10 El paciente A tratado con 200 mg de TKI258 mostró n iveles similares de FGF23 a través de todo el tratamiento. En los pacientes B y C tratados con 400 mg de TKI258, los niveles de FGF23 aumentaron hasta 1 .96 veces y 2. 1 veces los niveles básales, respectivamente.

Ejemplo 5: Las mediciones de FG F23 en muestras de plasma de pacientes con cáncer de melanoma tratados con TKI258 5. 1 Métodos Métodos: Los pacientes fueron tratados oralmente con 200, 300, 400 ó 500 mg/día en un horario continuo de dosis una vez al d ía. La MTD se definió en 400 mg/d ía. Se tomaron muestras de plasma de 43 pacientes. La concentración plasmática de TKI258 se midió por LC/MS/ MS . El FG F23 en plasma se evaluó por ELI SA.

Ensayo ELISA de FGF23. Para monitorear FGF23 en muestras de plasma en los pacientes se usó el ensayo ELI SA de FG F23 de KAI N OS Laboratories, I nc. , Japón (catálogo #CY-4000) como se describió en los ejem plos anteriores. 5.2 Resultados y discusión Los datos de FGF23 de los pacientes tratados con 200 mg , 300 mg , 400 mg o 500 mg de dosis diaria de TKI258 se muestran en la Figura 9. Los datos se presentan como la media del número indicado de pacientes. Después de una dosificación diaria continua de 400 mg ó 500 mg , la exposición plasmática media (AU C24hr) fue de aproximadamente 3000 ng/ml*h y 4100 ng/ml*h , respectivamente. No se observó acum ulación en la exposición plasmática de T I258 en dosis de 400 mg o menos, mientras que se observó una acumulación de hasta 2.5 veces en el d ía 1 5 después de una dosis d iaria de 500 mg. Al final del primer ciclo de tratamiento, la med ia de los niveles de FG F23 plasmáticos aumentó con respecto al valor de la línea base en un 68% mientras que el aumento en el día 15 del primer ciclo de tratamiento es de 63%. Uno de los pacientes tratados con 400 mg de TKI258 mostró un incremento de FGF23 plasmático con respecto a la línea base del 98% (del nivel de línea base de 40pg/ml a aproximadamente 80pg/ml) en el Día 15 del Ciclo 1. La biopsia del tumor del mismo paciente en el Día 15 del ciclo 1 mostró una inhibición significativa del pFGFR analizada por técnicas inmunohistoquímicas (Figura 10). Este resultado sugiere que la inducción de FGF23 en plasma después del tratamiento con TKI258 se correlaciona con la inhibición objetivo de FGFR en los tejidos tumorales.

Conclusiones: La inducción del FGF23 en plasma sugiere que el FGFR puede ser inhibido en dosis de 400 mg/día y superiores.

Ejemplo 6: Las mediciones de FGF23 en muestras de plasma de pacientes con carcinoma de células renales metastásico (mRCC) tratados con TKI258 en fase I de un ensayo clínico. 6.1 Métodos Pacientes y Tratamiento: El objetivo principal de esta fase I fue determinar la dosis máxima tolerada (MTD) de TKI258, administrado por vía oral en un horario de 5 días / 2 días de descanso en ciclos repetidos de 28 días, en pacientes con mRCC refractario a terapias convencionales. Un modelo de regresión logística Bayesiana de dos parámetros y los datos de seguridad de al menos 21 pacientes serán usados para determinar la MTD.

Ensayo ELISA de FGF23. Para monitorear FGF23 de muestras de plasma en pacientes se usó el ensayo ELISA de FGF23 de KAINOS Laboratories, Inc. , Japón (catálogo #CY-4000) como se describió en los ejemplos anteriores. 6.2 Resultados v discusión Resultados: Un estudio de fase I está en curso. En diciembre de 2008, se inscribieron 1 1 pacientes (9 h, 2 m), edad mediana: 55 (29-66 años). Cuatro pacientes han sido tratados con 500 mg/d ía (dosis inicial): 2 están en curso en el ciclo (C)7, 1 paciente suspendió debido a PD y 1 debido a la bradicardia sinusal. Cinco pacientes recibieron 600 mg/día: 2 DLTs (G4 hipertensión y G3 fatiga - pacientes discontinuados) que conduce a la reducción de dosis de todos los pacientes a 500 mg/día, 2 pacientes en el C5 y C4, 1 paciente interrumpió para PD. Dos pacientes acaban de entrar en el grupo de extensión a 500 mg. Otras toxicidades > G2 incluyen fatiga, náuseas, vómitos, diarrea, neutropenia, foliculitis y mareos. Los datos de PK mostraron intervalo de Cmáximo ( 180 a 487 ng/ml, n = 8) y el intervalo del AUC (2200 a 8251 ng/ml* h). Los datos del biomarcador preliminares indicaron que los pacientes tuvieron niveles de VEGF (506 ± 203 pg/ml, n = 6) 6) y bFGF (220 ± 185 pg/ml, n = 6) de la línea base elevados, lo que puede reflejar el fracaso de los agentes anti-VEGF anteriores. Se observó inducción de los niveles de FGF23 plasmáticos, un biomarcador farmacodinámico de inhibición de FGFR, en pacientes del primer grupo de dosificación de 500 mg/día (los datos de FGF23 de pacientes con RCC individuales tratados con TKI258 se muestran en la Figura 1 1 ). La evidencia preliminar de la eficacia se observó con una respuesta menor (-1 7% en C4), 4 enfermedad estable y 1 dramática reducción/necrosis de algunas lesiones de objetivo (ganglios linfáticos y masa suprarrenal).

Conclusiones: 500 mg/día de TKI258 parece un programa factible en los pacientes con cáncer de células renales metastásico pre-tratados excesivamente con algunas indicaciones de beneficio clínico. Algunos de los pacientes tratados han aumentado claramente el nivel de FGF23, mientras que otros pacientes no tienen ese aumento. Para los pacientes que han aumentado FGF23, el pico del nivel de FGF23 parecía estar alrededor del día 15 del ciclo 1. El nivel de FGF23 ha aumentado en un intervalo de 1.35 a 1.75 en comparación con el nivel de la línea de base.

Ejemplo 7: La inducción de FGF23 por TKI258 en ratas se correlaciona con la inhibición de FGFR3 en xenoinjertos de tumores subcutáneos RT112 7.1 Métodos Animales. Los experimentos se llevaron a cabo en ratas hembras Rowett Hsd: RH-Fox 1rnu. Estas ratas desnudas atímicas se obtuvieron de Harían (Países Bajos) Formulación de compuestos y Tratamiento de animales. El TKI258 se formuló en amortiguador de ácido acético-acetato (pH 4.6) / PEG300 (2:1 v / v) y se aplicó diariamente por sonda. El vehículo consistió de amortiguador de ácido acético-acetato (pH 4.6) / PEG300 (2:1 v / v). Los volúmenes de aplicación fueron de 5 ml/kg.

Diseño del Estudio: Las ratas fueron implantadas subcutáneamente con xenoinjertos RT112 por inyección subcutánea en el flanco derecho de 1x106 células RT112 en 100 µ? de HBSS (Sigma # H8264) que contiene 50% de Matrigel (BD # 356234). Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 400 mm3, las ratas recibieron una única administración oral de TKI258 en 10 mg/kg, 25 mg/kg ó 50 mg/kg, o vehículo.

Muestreo de sangre y tejido para análisis ex vivo. Se tomaron muestras de sangre por vía sublingual a 3h, 7h y 24 horas después de la administración del compuesto. Se prepararon plasma y como suero a partir de cada muestra de sangre. En los mismos puntos de tiempo, los tumores se disecaron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Análisis ex vivo de xenoinjertos de tumor RT112: Células de cáncer de vejiga RT112 expresan altos niveles de FGFR3, la actividad del cual puede ser monitoreada en estas células midiendo los cambios en la fosforilación de tirosina de FRS2, un sustrato de los FGFRs. El material del tumor se pulverizó usando un molino de oscilación (RETSCH, ya sea MM2 o MM200). Las alícuotas del tumor en polvo (50 mg) fueron Usadas en amortiguador de lisis enfriado en hielo que contiene Tris 50 mM pH 7.5, NaCI 150 mM, EGTA1 mM, EDTA5 mM, 1% de Tritón, dos Na Vanadato 2 mM, PMSF 1 m y cóctel de inhibidores de proteasa Roche # 11873580001). Los lisados fueron aclarados por centrifugación a 12000 x g durante 15 min y la concentración de proteínas se determinó usando los reactivos del análisis de la proteína DC (Bio Rad # 500 a 0.116) y un BSA estándar. Los lisados celulares totales fueron sometidos a SDS-PAGE y las proteínas blotted en las membranas de PVDF. Los filtros fueron bloqueados en BSA al 5% y además incubados con los anticuerpos primarios p-FRS2 (Tyr196): Señalización Celular # 3864; ß-tubulina: Sigma # T4026) durante la noche a 4 °C. Las proteínas se visualizaron con anticuerpos de antiratón acoplados con peroxidasa o anticuerpos anti-conejo usando el sistema de detección de sustrato de duración prolongada SuperSignal® West Dura (Pierce # 34075).

Ensayo de Elisa FGF23. Para monitorear los niveles de FGF23 en muestras de suero se usó el ensayo ELISA de FGF23 de KAINOS Laboratories, Inc., Japón (catálogo # CY-4000) como se describió en los ejemplos anteriores. 7.2 Resultados v discusión Modulación de la fosforilación de tirosina de FRS2 en xenoinjertos RT112 en la administración de TKI258 a ratas. El FRS2 es un sustrato de los FGFRs que es fosforilado en residuos de tirosina mediante FGFRs activados y por lo tanto puede ser utilizado como una lectura de la actividad del FGFR. El análisis de tumores RT112 de los animales tratados con 10, 25 ó 50 mg/kg de TKI258 o vehículo, diseccionados a las 3 h post-tratamiento mostró que el TKI258 inhibió la fosforilación de tirosina de FRS2 en una manera dependiente de la dosis (Figura 12).

Niveles de FGF23 en muestras de suero de ratas Rowett. Los niveles de FGF23 fueron determinados en muestras de suero de ratas tratadas con TKI258 o vehículo, 24 horas después de la administración. Las ratas que fueron tratadas con TKI258 mostraron un aumento dependiente de la dosis en los niveles séricos de FGF23 en comparación con engrupo tratado con el vehículo (Figura 13), el cual fue estadísticamente importante. (P < 0.01, ANOVA post hoc de Dunnett).

Los datos se presentan como media ± SEM.

Conclusión. Los datos experimentales presentados demuestran que las dosis de TKI258 que inhiben FGFR3 in vivo, según lo determinado por la inhibición de la fosforilación de tirosina de FRS2, también conducen a mayores niveles de FGF23 en suero en una forma dependiente de la dosis.

Ejemplo 8: Inducción de FGF23 por PD173074 en ratas y comparación con el compuesto A y TKI258 8.1 Métodos Animales. Los experimentos se llevaron a cabo en ratas Wistar hembras Furth WF/lco Compuestos, formulación y tratamiento de animales.

PD173074, el compuesto A y TKI258 fueron formulados como soluciones en NMP (1-metil-2-pirrolidona) / PEG300 1: 9 (1 mi de NMP + 9ml de PEG300) y aplicados diariamente por sonda. Los volúmenes de aplicación fueron de 5 ml/kg.

Diseño del estudio: Las ratas fueron tratadas con una única administración oral de PD173074 (50 mg/kg), compuesto A (10 mg/kg) o TKI258 (50 mg/kg) o en vehículo.

Muestreo de sangre y tejido para el análisis ex vivo. Se tomaron muestras de sangre por vía sublingual a las 24h después de la administración del compuesto. El plasma, como las muestras de suero se preparó a partir de cada muestra de sangre.

Ensayo ELISA de FGF23. Para controlar los niveles de FGF23 en muestras de suero se usó el ensayo ELISA de FGF23 de KAINOS Laboratories, Inc., Japón (catálogo # CY-4000), como se indicó en los ejemplos anteriores. 8.2 Resultados v discusión Niveles de FGF23 en muestras de suero de ratas wister. Las ratas que fueron tratadas con PD173074, o el compuesto A o TKI258 mostraron un aumento estadísticamente significativo en los niveles séricos de FGF23 en comparación con el grupo tratado con vehículo (Figura 14). (P < 0.01, ANOVA post hoc de Dunnett). Los datos están presentados como media ± SEM.

Conclusión. Los datos experimentales presentados demuestran que los inhibidores FGFR: PD173074, COMPUESTO A o TKI258, causan un aumento en los niveles séricos de FGF23 en ratas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. El uso de FGF23 como un biomarcador para determinar la eficacia terapéutica y/o uno o más efectos secundarios de un inhibidor de FGFR.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 para determinar la eficacia terapéutica, en donde preferiblemente la eficacia terapéutica se selecciona del grupo que consiste en el tratamiento, prevención o retraso del avance de enfermedades proliferativas y/o trastornos no cancerosos.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 para determinar uno o más efectos secundarios de un inhibidor FGFR, en donde preferiblemente el efecto secundario es mineralización ectópica.

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor FGFR es una macromolécula o un compuesto de masa molecular pequeña, en particular, un inhibidor FGFR seleccionado del grupo que consiste de PD176067, PD173074, compuesto A (3-(2,3-dicloro -3,5-dimetoxi-fenil)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil urea), TKI258 y el compuesto B (un derivado de [4,5']bipirimidinil-6,4,-diamina).

5. Método para determinar la modulación de la actividad de cinasa del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), que comprende los pasos de: a) administrar un inhibidor FGFR a un sujeto; b) proporcionar una muestra de dicho sujeto; c) determinar el nivel del FGF23 de dicha muestra; y d) comparar el nivel del FGF23 de dicha muestra con un nivel de referencia.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el sujeto es un mamífero, en particular, un roedor tal como un ratón o una rata, un perro, un cerdo o un humano.

7. Un método para determinar uno o más efectos secundarios de un inhibidor FGFR que comprende los pasos a) - d) de la reivindicación 5, que comprende además los pasos de e) correlacionar el nivel del FGF23 con uno o más efectos secundarios; y f) determinar el nivel de FGF23 por encima del cual se producen efectos secundarios relativos al tratamiento empleado.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el inhibidor FGFR es una macromolécula o un compuesto de masa molecular pequeña, en particular, 3-(2,3-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil urea o TKI258.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el nivel de FGF23 es incrementado cuando se compara con el nivel de referencia.

10. Un kit de diagnóstico que comprende a) una molécula que reconoce FGF23 o una parte del mismo, opcionalmente en una forma marcada; b) por lo menos un reactivo que detecta un segundo biomarcador seleccionado de un grupo que consiste de fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo y calcio total (P x tCa), y osteopontina (OPN); c) opcionalmente instrucciones de uso; d) opcionalmente medios de detección; y e) opcionalmente una fase sólida.

1 1 . El uso de un kit que comprende a) una molécula que reconoce FGF23 o una parte del mismo, opcionalmente en una forma marcada; b) opcionalmente instrucciones de uso; c) opcionalmente medios de detección; y d) opcionalmente una fase sólida, para determinar la eficacia de un inhibidor FGFR y/o los efectos secundarios de los inhibidores FGFR en una muestra de un sujeto.

12. Un método ex vivo para determinar la modulación de la actividad de cinasa del FGFR que comprende los pasos de: a) determinar el nivel de FGF23 en una muestra de un paciente antes del inicio de un tratamiento con un inhibidor FGFR (nivel de referencia individual); b) determinar el nivel de FGF23 en una muestra del m ismo paciente después del tratamiento con el inhibidor FGFR, en donde el nivel FGF23 aumentado del paso b) con respecto al nivel de referencia individual indica la modulación, preferiblemente la inhibición , de la actividad de cinasa de FGFR ocurrida.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde el inhibidor FGFR seleccionado del grupo que consiste de PD176067, PD 1 73074, compuesto A (3-(2,3-dicloro-3, 5-dimetoxi-fenil)-1 -{6-[4-(4- etil-piperazin- 1 -il)-fenilamino]-pirim idin-4-il}- 1 -metil urea), TKI258 y compuesto B (un derivado de [4,5,]bipirimidinil-6,4'-diamina).

14. El método de conformidad con la reivindicación 12 o 13, en donde el inhibidor FGFR es el compuesto A.

15. Un kit de diagnóstico que comprende a) una molécula que reconoce FGF23 o una parte del mismo, opcionalmente en una forma marcada; b) por lo menos un reactivo capaz de detectar un segundo biomarcador seleccionado del grupo que consiste de fósforo inorgánico (P), el producto de fósforo y calcio total (P x tCa), osteopontina (OPN) y hormona paratiroidea (PTH); c) opcionalmente instrucciones de uso; d) opcionalmente medios de detección; y e) opcionalmente una fase sólida.

16. Un método para seleccionar pacientes para determinar si un paciente se beneficiará con un tratamiento con inhibidor FGFR, el método comprende los pasos de (a) proporcionar a un paciente un tratamiento con inhibidor FGFR durante un período de tiempo; (b) medir el nivel de FGF23 en la muestra de dicho paciente después de dicho tratamiento; (c) comparar el valor de FGF23 obtenido del paso (b) con el nivel de referencia individual (nivel de FGF23 en dicho paciente antes del inicio del tratamiento con el inhibidor FGFR) y decidir si el paciente debe continuar o no con el tratamiento del inhibidor FGFR.