MX2008012953A - Anticuerpos glucosilados. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un anticuerpo humano de tipo IgG1 o IgG3 que ha sido glucosilado con una cadena de azúcar en Ans297, el anticuerpo se caracteriza porque la cantidad de fucosa de la cadena de azúcar es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA es de 1% o inferior y/o la cantidad de alfa-1,3-galactosa N-terminal es de un 1% o inferior, y la utilización del mismo.

Description

ANTICUERPOS GLUCOSILADOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un anticuerpo recombinante que tiene una región Fe que se expresa y que está glucosilada, en la que el núcleo de la estructura del carbohidrato unido a la región Fe del anticuerpo se encuentra completamente fucosilada. La presente invención también se refiere a células CHO hospederas (células de ovario de hámster chino) , métodos para seleccionar las células CHO hospederas y a la utilización de los anticuerpos recombinantes . ANTECEDENTES DE LA INVENCION La forma nativa de las inmunoglobulinas o anticuerpos es usualmente una glucoproteina tetramérica compuesta de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Los anticuerpos constan de dominios constantes que sirven para clasificar los anticuerpos en diferentes clases: IgA, IgD, IgE, IgM e IgG; y en varias subclases: IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos humanos de las clases IgGl e IgG3 generalmente actúan en las respuestas de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés ) . También se conocen otras moléculas que son similares a los anticuerpos y contienen, por ejemplo, un dominio de unión de una proteina heteróloga como un receptor, Ref. 196702 un ligando o una enzima, y la región Fe de un anticuerpo. Las proteínas Fe de fusión están descritas, por ejemplo, en Stabila, P., y otros, Nature Biotech 16 (1998) 1357-1360 y en la patente US 5,610,297. Los anticuerpos monoclonales poseen cuatro funciones efectoras: ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y tasas de aclaramiento/ vida media. La ADCC y la fagocitosis se producen gracias a la interacción de anticuerpos unidos a la célula con el FcyR (receptores Fe gamma) ; la CDC gracias a la interacción de anticuerpos unidos a la célula junto con una serie de proteínas que forman el sistema del complemento. La CDC está relacionada con la unión de Clq, la activación de C3 o la unión del receptor Fe al dominio Fe. Si la unión de Clq, la activación de C3 o la unión del receptor Fe al dominio constante de un anticuerpo debe ser reducida, generalmente se utilizan anticuerpos IgG4 porque no activan el sistema del complemento, no se unen a Clq ni activan C3. Como alternativa, se utilizan dominios Fe que constan de una cadena pesada gamma-1 con una región con determinadas mutaciones como L234A y L235A o D265A y N297A (WO 99/51642) . Se conocen muy bien en el ámbito las técnicas de modificación de los dominios constantes de los anticuerpos para mejorar sus funciones efectoras. Por ejemplo, se describen los métodos en WO 99/54342.

En Routier, F.H. y otros, Glycocon ugate J. 14 (1997) 201-207 se describe el patrón de glucosilación de un anticuerpo IgGl humanizado expresado en una célula CHO-DUKX. Este anticuerpo muestra una relación molar de Fuc:Man de 0.8:3.0, que significa que la proporción de fucosilación es del 80%. En Niwa, R. y otros, J. Immunol . Methods 306 (2005) 151-160 se describen anticuerpos IgGl e IgG3 anti-CD20 producidos de forma recombinante en CHO DG44 con una fucosilación del 90 y 91%, respectivamente. En Mimura, Y y otros, J. Immunol. Methods 247 (2001) 205-216 se describe que el butirato aumenta la producción de IgG humanas quiméricas en las células CHO-K1 que conservan sus funciones y su patrón de glucosilación. Los perfiles de oligosacáridos muestran un contenido considerable de glucanos con estructuras no fucosiladas. En Raju, T.S., BioProcess International 1 (2003) 44-53 se describe la nomenclatura y el impacto sobre la actividad biológica de las inmunoglobulinas terapéuticas de las variaciones en la glucosilación mediante sistemas de expresión. En Ma, S., Anal. Chem. 71 (1999) 5185-5192 se describe el análisis de carbohidratos de rituximab. Rituximab muestra un porcentaje de fucosilación del 9-10% (Niwa, R. y otros, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160). En Fujii, S., J. Biol. Chem. 265 (1990) 6009-6018 se describe que un 11% de las IgG bovinas no están fucosiladas. En Mizouchi, T., J. Immunol. 129 (1982) 2016-2020 se describe que un 14% de las IgG humanas no están fucosiladas. En Bergwerff, A. A., Glycoconj ugate J. 12 (1995) 318-330 se describe que los anticuerpos producidos en ratón SP2/0 contienen oligosacáridos de ácido N-glucolilneuraminico (NGNA) en grandes cantidades. En Nahrgang, S. y otros, En: Animal Cell Technology: Products from Cells, Cells as Products, Bernard, A. y otros (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999, pp . 259-261, se describe que para la expresión de CHO de IgGl después de una transfección temporal se encuentra un bajo nivel de glucosilación general. En Lund, J. y otros, Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748 se describe la producción recombinante de un anticuerpo quimérico humano en células de transfectoma de ratón. Un 13% de los anticuerpos IgGl se encuentran sin fucosilar. En Patel, T.P. y otros, Biochem. J. 285 (1992) 839-845 se describe la glucosilación de anticuerpos obtenidos de células de hibridoma y de ascitos de ratón. En Niwa, R. y otros, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 se describe que para anticuerpos IgGl anti-CD20 la fucosilación es del 91% tras su producción recombinante en CHO DG44 y en Morí, K. y otros, Biotech. Bioeng. 88 (2004) 901-908, una fucosilación del 94%. Davies, J. , y otros, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 describen que la expresión de anticuerpos con un glicoformas alternadas da como resultado un incremento en la ADCC . Sheeley, D.M., y otros, Anal. Biochem. 247 (1997) 102-110 comparan la glucosilación de los anticuerpos en diferentes sistemas de expresión. Shields, R.L., y otros, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 describen que una falta de fucosa en la región Fe de las IgGl humanas mejora la unión a FCYRIII y la ADCC . En Zhu, L., y otros, Nature Biotechnol. 23 (2005) 1159-1169 se describe la producción de anticuerpos humanos en huevos de pollos. WO 2004/087756 y WO 2005/005635 describen anticuerpos mejorados frente a IGF-1R. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención consiste en un anticuerpo humano de tipo IgGl o IgG3 que ha sido glucosilado con una cadena de azúcar en Asn297, el anticuerpo caracterizado porque la cantidad de fucosa de la cadena de azúcar es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA es de un 1% o inferior y/o la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa en el extremo N-terminal es de un 1% o inferior. Según la invención "cantidad" significa la cantidad de la azúcar dentro de la cadena de azúcar en Asn297, relacionada con la suma de G0, Gl, G2 (sin mañosa [4 y 5]) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3. De acuerdo con la invención es posible proporcionar anticuerpos y/o células hospederas CHO con una fucosilación de incluso el 99.4% o más, el 99.5% o más o el 99.9% o más. Es preferible que la cantidad de NGNA sea del 0.5% o menos, más preferiblemente del 0.1% o menos e incluso indetectable por LCMS (cromatografía liquida/espectrometría de masas) . Es preferible que la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa N-terminal sea del 0.5% o menos, más preferiblemente del 0.1% o menos e incluso indetectable por cromatografía líquida/espectrometría de masas. La cadena de azúcar muestra preferiblemente las características de los N-glucanos unidos a Asn297 de un anticuerpo expresado por medios recombinantes en una célula CHO. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. La invención además consiste en una célula CHO capaz de expresar de forma recombinante un anticuerpo humano de tipo IgGl o IgG3 que ha sido glucosilado con una cadena de azúcar en Asn297 que se caracteriza porque la cantidad de fucosa de la cadena de azúcar es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA es de un 1% o inferior o la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa en el N-terminal es de un 1% o inferior . La línea celular, que es hu Ab<IGF-lR>Bl-4E10_9-16) , se encuentra en depósito por el Tratado de Budapest que supone el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los objetivos de un procedimiento patentado, con número de depósito DSM ACC 2795 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania, el 21 de junio de 2006. Las cantidades de azúcar preferidas se han mencionado anteriormente. Es preferible que la célula CHO sea una célula CHO que conste de una eliminación (por ejemplo, DG44) o una inactivación funcional de ambos alelos DHFR o una eliminación de un alelo DHFR y una inactivación funcional del segundo alelo DHFR (por ejemplo, DXB11) . La invención además comprende una composición de acuerdo con la invención para su uso en terapia médica en humanos . El anticuerpo de la composición de acuerdo con la invención es preferiblemente un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo no humano, un anticuerpo de cadena única que consta de la región constante de la cadena pesada de IgGl o IgG3, o la región constante de la cadena pesada de IgGl o IgG3. La invención además comprende la utilización de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento. Preferiblemente, el medicamento es útil para provocar inmunodepresión en el tratamiento de alteraciones mediadas por la célula T, trastornos autoinmunitarios , enfermedades infecciosas y enfermedades cancerígenas.

La invención además comprende una composición farmacéutica que consta de un anticuerpo de acuerdo con la invención . Es también objeto de la invención un método para seleccionar células CHO para la producción recombinante de un anticuerpo monoclonal de tipo IgGl o IgG3 humano glucosilado con una cadena de azúcar en Asn297, el anticuerpo se caracteriza porque la cantidad de fucosa de la cadena de azúcar es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA es de un 1% o inferior o la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa N-terminal es de un 1% o inferior, el método consiste en el cultivo de una célula CHO transfectada con un anticuerpo IgGl o IgG3 y un gen DHFR, bajo presión selectiva de DHFR y MTX, la selección de un clon individual que expande los clones y la selección de un clon que produce un anticuerpo con el patrón de glucosilación de acuerdo con la invención. Es preferible que el cultivo se lleve a cabo durante al menos dos semanas, preferiblemente, al menos tres semanas. Es también objeto de la invención la utilización de una célula CHO de acuerdo con la invención para la producción recombinante de un anticuerpo monoclonal. Es también objeto de la invención un método para producir anticuerpos monoclonales en una célula CHO por técnicas recombinantes de acuerdo con la invención. Las células CHO son células hospederas útiles para la expresión recombinante de polipéptidos heterólogos. BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURA La Figura 1 es una gráfica de barras que muestra la actividad ADCC o la falta de la misma en anticuerpos de la invención y en anticuerpos de control y comparativos. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los anticuerpos contienen estructuras de carbohidrato en posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada, con cada isotipo poseyendo un perfil diferente de estructuras de carbohidratos N-enlazados que afectan de forma distinta al ensamblaje proteico, la secreción o la actividad funcional (Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). La estructura de los Carbohidratos N-enlazados varia considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento y pueden incluir oligosacáridos ricos en mañosa, que presentan múltiples ramificaciones u oligosacáridos complejos birramificados (Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol .15 (1997) 26-32) . Los anticuerpos de tipo IgGl e IgG3 son glucoproteinas que poseen un lugar de N-glucosilación conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos complejos birramificados unidos a Asn297 se encuentran escondidos entre los dominios CH2 estableciendo muchos contactos con la estructura del polipéptido, y su presencia es esencial para que los anticuerpos realicen sus funciones efectoras como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely, M.R., y otros, Glycobiology 5 [1995] 813-822; Jefferis, R. , y otros, Immunol Rev. 163 [1998] 59-76; Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 [1997] 26-32). Tal como se usa aquí, el término "región Fe del tipo IgG humano" también incluye, preferiblemente, las variantes alélicas naturales de la región Fe de una inmunoglobulina (anticuerpo), asi como, las variantes que presentan alteraciones como sustituciones, adiciones o eliminaciones pero que no afectan a la glucosilación en Asn297. Por ejemplo, pueden ser eliminados uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de la región Fe de una inmunoglobulina sin una pérdida sustancial de la actividad biológica. Las variantes pueden seleccionarse según las reglas generales conocidas en el ámbito para producir los mínimos efectos sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie, J.U., y otros, Science 247 [1990] 1306-1310). El término "anticuerpo" comprende las diversas formas de anticuerpos incluyendo, pero sin suponer una limitación, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos modificados genéticamente siempre y cuando conserven las propiedades características de acuerdo con la invención. Por tanto, un anticuerpo de acuerdo con la invención contiene al menos una región Fe activa y funcional (se une a FcR) de IgGl o IgG3 que se encuentra glucosilada en Asn297. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se usa aquí, se refiere a una preparación que contiene anticuerpos con idéntica secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una especificidad de unión única y que poseen regiones constantes y variables derivadas de las secuencias de inmunoglobulinas de la linea germinal humana. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo monoclonal que consta de una región variable, es decir, de una región de unión, de un origen o especie y al menos una porción de una región constante de otro origen u otra especie que se prepara mediante técnicas de ADN recombinante . Se prefieren especialmente aquellos anticuerpos quiméricos que constan de una región variable murina y una región constante humana. Los anticuerpos quiméricos murino-humanos son el producto de genes de inmunoglobulinas expresados que constan de segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulinas murinas y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulinas humanas. Los métodos de producción de anticuerpos quiméricos implican la utilización de técnicas de ADN recombinante y de transfección génica convencionales que ya se conocen muy bien en el ámbito (véanse, por ejemplo, Morrison, S.L., y otros, Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; y las patentes estadounidenses núms . US 5,202,238 y US 5,204,244). El término "anticuerpo humanizado" hace referencia a anticuerpos en los que la región de estructura o las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR, en sus siglas en inglés) han sido modificadas para constituir una inmunoglobulina con una región CDR de especificidad distinta a la de la inmunoglobulina de la que deriva. En una modalidad preferida, se une un CDR murino a la región de estructura de un anticuerpo humano para preparar un "anticuerpo humanizado" (véanse, por ejemplo, Riechmann, L., y otros, Nature 332 [1988] 323-327; y Neuberger, M.S., y otros, Nature 314 (1985) 268-270). Se prefiere especialmente que los CDR se correspondan con aquellos que representan secuencias que reconocen los antigenos mencionados anteriormente para los anticuerpos quiméricos o bifuncionales . El término "anticuerpo humano", tal como se usa aquí, incluye anticuerpos que poseen regiones constantes y variables derivadas de las secuencias de inmunoglobulinas de la linea germinal humana. Las regiones están descritas en, por ejemplo, Johnson, G., y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 y las bases de datos a las que hace referencia resultan útiles siempre y cuando conserven las propiedades de acuerdo con la invención. Los anticuerpos humanos se conocen muy bien en el ámbito (van Dijk, M.A., y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras una inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia de la colección de genes de la linea germinal de las inmunoglobulinas humanas a la línea germinal del ratón transgénico tiene como resultado la producción de anticuerpos humanos después de su inmunización con el antígeno (véanse, por ejemplo, Jakobovits, A., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., y otros, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, . , y otros, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas en fagos (Hoogenboom, H.R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., y otros, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas descritas por Colé y otros y Boerner y otros también se pueden utilizar para preparar anticuerpos monoclonales humanos (Colé y otros, Monoclonal Antibodies y Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., y otros, J. Immunol. 147 (1991) 86-95). El anticuerpo humano comprende las diversas formas de anticuerpos, preferiblemente los anticuerpos monoclonales que incluyen, pero sin suponer una limitación, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos modificados genéticamente (variantes o mutados) siempre y cuando conserven las propiedades características de acuerdo con la invención. Se prefieren, especialmente, los anticuerpos humanos recombinantes . El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa aquí, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante técnicas recombinantes, como los anticuerpos aislados de una célula hospederas, de acuerdo con la invención, que ha sido transfectada con un vector de expresión recombinante. Los "dominios constantes" no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo a su antígeno, pero presentan otras funciones como, por ejemplo, funciones efectoras. Las regiones constantes de la cadena pesada de las IgGl se denominan cadenas ?? . Las regiones constantes de la cadena pesada de las IgG3 se denominan cadenas ?? . Las cadenas constantes ? de las cadenas pesadas están descritas con detalle en Kabat, E.A. y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), y en Brueggemann, M . , y otros, J. Exp . Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., y otros, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Los dominios constantes del tipo IgGl o IgG3 están glucosilados en Asn297. La expresión "Asn297" de acuerdo con la invención se refiere a que el aminoácido asparagina localizado aproximadamente en la posición 297 de la región Fe, según variaciones secundarias de la secuencia de los anticuerpos, Asn297 también puede localizarse algunos aminoácidos delante o detrás del que le corresponde (generalmente no más de tres aminoácidos) . Por ejemplo, en un anticuerpo de acuerdo con la invención "Asn297" se localiza en la posición 298. La glucosilacion de las IgGl o las IgG3 humanas se produce en Asn297 como una glucosilacion con un oligosacárido complejo birramificado fucosilado central que termina en hasta dos residuos Gal. Las estructuras se denominan residuos de glucano G0, Gl (al, 6 o al, 3) o G2, en función de la cantidad de residuos Gal terminales (Raju, T.S., BioProcess International 1 (2003) 44-53) . El tipo de glucosilacion que se produce en las regiones Fe de los anticuerpos en las células CHO está descrito en Routier, F. H., Glycoconj ugate J. 14 (1997) 201-207. El término "región variable" (región variable de la cadena ligera, VL; región variable de la cadena pesada, VP) , tal como se usa aquí, hace referencia a cada pareja de cadenas ligera y pesada que está implicada en la unión directa del anticuerpo con su antigeno. Según la invención, se puede seleccionar un anticuerpo producido en una célula hospedera CHO que sea capaz de proporcionar a través de la expresión recombinante una composición de anticuerpos monoclonales que muestran un patrón de glucosilación de acuerdo con la invención. La célula hospedera CHO contiene uno o más vectores de expresión para conseguir la expresión recombinante del anticuerpo. Es preferible que la transfección de la célula hospedera con el vector sea estable y que los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo se integren en el genoma de la célula hospedera CHO. El término "célula CHO" comprende las diversas formas de las células de ovario de hámster chino (CHO) que presentan la eliminación de los alelos dhfr (deficientes en la dihidrofolato reductasa [dhfr"]). Las células dhfr" y los métodos para su obtención están descritos en, por ejemplo, Urlaub, G. y otros, Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G. y otros, Som. Cell Molec. Genet. 12 (1986) 555-566; Kolkekar y otros, Biochemistry 36 (1997) 10901-10909. Preferiblemente, se utilizarán células de la linea DG44. Las células CHO dhfr- se pueden obtener mediante radiación gamma para eliminar completamente el sitio dhfr. En las células de tipo salvaje sin mutaciones, la dhfr es una enzima esencial para la síntesis de novo de glicina, purinas y desoxitimidina . Este hecho permite utilizar el gen dhfr codificado en plásmidos como marcador de selección dominante y un gen amplificador para la expresión de proteínas en líneas celulares dhfr-. La mutación dhfr- en las células DG44 es estable e irreversible. Las células CHO que han sido co-transfectadas con éxito con un vector (es) de expresión para un anticuerpo del tipo IgGl o IgG3 humano y el gen DHFR, poseerán el fenotipo dhfr+ y pueden ser seleccionadas fácilmente cultivando colonias en medio sin timidina ni hipoxantina y que contenga opcionalmente metotrexato (MTX) para la amplificación. Las células DG44 son muy conocidas en el ámbito y se encuentran disponibles comercialmente en forma de linea celular en, por ejemplo, Invitrogen Corp. (EE. UU . ) . Las células DG44 pueden crecer adheridas a un sustrato, en suspensión o en medio sin suero. Tal como se utiliza aquí, los términos "célula", "linea celular" y "cultivo celular" pueden utilizarse indistintamente y todas las designaciones de las lineas celulares CHO dhfr- (eliminación de los dos alelos dhfr) incluyen a su progenie. Por tanto, los términos "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula transformada inicialmente y los cultivos derivados de la célula sin tener en cuenta el número de transferencias. No toda la progenie ha de ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que posee las mismas características de glucosilación de acuerdo con la invención que se seleccionaron en la célula transformada inicialmente.

Es preferible que la linea celular CHO dhfr- se coamplifique con al menos DHFR como uno de los genes de selección. Por ejemplo, un vector de expresión de mamífero que contiene el marcador de selección y el gen del anticuerpo se co-transfectan en una célula CHO receptora. Las colonias resultantes pueden ser seleccionadas y aquellas que muestren el fenotipo esperado serán capaces de expresar el anticuerpo. Otros marcadores de selección adicionales son, aunque no necesariamente, de naturaleza dominante. Como ejemplos de marcadores de selección adicionales para su utilización en la co-transfección se encuentran la adenosina desaminasa (Kaufman, R.J., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83 (1986) 3136-3140), la asparagina sintetasa (Cartier, M., y otros, Mol. Cell Biol. 7 (1987) 1623-1628), los genes trpB de E. coli e hisD de Salmonella (Hartman, S.C., y Mulligan, R.C., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8047-8051), M2 ribonucleótido reductasa murina (Thelander, M., y Thelander, L., EMBO J. 8 (1989) 2475-2479), el gen humano de resistencia a múltiples fármacos (Kane, S.E., y otros, Gene 84 (1989) 439-446), la glutamina sintetasa (Bebbington, C.R. y otros, ADN Cloning, Vol . III, D.M. Glover (ed.), IRL Press, pp. 163-188, 1987), la xantina guanina fosforribosil transferasa (gpt) (Mulligan, R.C., y Berg, P., Science 209 (1980) 1422-1427), la higromicina B (Santerre, R.F., y otros, Gene 30 (1984) 147-156) y el gen de la neomicina (Southern, P.J., y Berg, P., J. Mol. Appl . Genet. 1 (1982) 327-341). Los marcadores de selección también proporcionan la base para que los genes que codifican el anticuerpo puedan ser amplificados. En la co-transfección de una linea celular CHO, el vector de ADN habitualmente se integra en el cromosoma de la célula en el mismo lugar. Asi, la utilización de solo uno de los marcadores de selección como base para la amplificación habitualmente da como resultado un incremento en el número de copias de ambos genes. Uno de los marcadores de selección que puede utilizarse de esta manera es dhfr que permite obtener la amplificación deseada mediante la utilización de concentraciones crecientes de MTX. Un segundo marcador de selección que se prefiere es GS que permite la amplificación mediante la adición de metionina sulfoximina (MSX) . Naturalmente, los marcadores de selección se colocan bajo el control de elementos reguladores del ADN que permitan su expresión. En el caso de la utilización de dhfr como marcador de selección, los elementos reguladores son preferiblemente de origen vírico, como el ADN procedente de oncovirus. Se prefiere especialmente la utilización del promotor tardío mayor de SV40 o adenovirus. Es particularmente ventajoso en ese sentido eliminar el elemento estimulador del promotor inutilizándolo de forma efectiva. Esta modificación produce un aumento en los niveles de amplificación del gen en cada una de las concentraciones de selección de metotrexato que, de lo contrario ocurriría si se utilizara un promotor más potente. En el caso de la utilización de neomicina como marcador de selección, un ejemplo de promotor apropiado es el promotor de la metalotioneína murina. El término "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", tal como se usa aquí, incluye moléculas de ADN y de ARN . Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero se prefiere un ADN bicatenario . Un ácido nucleico se encuentra "unido de forma activa" cuando presenta una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o una secuencia líder de secreción se encuentra unido de forma activa al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o estimulador se encuentra unido de forma activa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión a ribosomas se encuentra unido de forma activa a una secuencia codificante si se coloca de manera que facilita la traducción. Generalmente, el término "unido de forma activa" significa que las secuencias de ADN a las que se unen se encuentran en cis y, en el caso de una secuencia líder de secreción, se sitúa contigua y dentro del mismo marco de lectura. No obstante, no es necesario que los estimuladores se sitúen contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en las objetivos de restricción apropiadas. Si esos objetivos no existen, se utilizan los oligonucleótidos adaptadores o enlazadores sintéticos según los métodos tradicionales . Los anticuerpos de acuerdo con la invención se obtienen preferentemente mediante métodos recombinantes . Los métodos son muy conocidos en el ámbito y consisten en la expresión de la proteina en células procariotas o eucariotas con el posterior aislamiento del polipéptido del anticuerpo y, generalmente, se realiza una purificación hasta alcanzar niveles de pureza farmacéuticamente aceptables. Para la expresión de proteínas, los ácido nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas o fragmentos de los mismos se insertan en vectores de expresión mediante técnicas convencionales. La expresión se realiza en células hospederas CHO y el anticuerpo se recupera de las células o, preferiblemente, de los sobrenadantes tras la lisis. Las técnicas de producción de anticuerpos recombinantes se conocen muy bien en el ámbito y están descritas en, por ejemplo, las revisiones de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., y otros, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol.

Biotechnol. 16 (2000) 151-161; o Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Los anticuerpos pueden aparecer en las células intactas, en los sobrenadantes, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se lleva a cabo para eliminar otros componentes celulares o contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares u otras proteínas, mediante técnicas convencionales como el tratamiento álcali/SDS, el bandeo con CsCl, la cromatografía en columna, o la electroforesis en gel de agarosa, entre otras muy conocidas en el ámbito (véase, Ausubel, F., y otros, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience , New York (1987) ) . Entre las secuencias de control apropiadas para procariotas se encuentran, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, estimuladores y señales de poliadenilación . Los anticuerpos monoclonales se pueden separar de manera adecuada del medio de cultivo de hibridomas mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, la cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN o ARN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente a partir del hibridoma y se obtiene su secuencia mediante métodos convencionales. Las células de hibridoma pueden utilizarse como fuente de los ADN y ARN . Una vez identificado y aislado, el ADN debe insertarse en vectores de expresión que se utilizan entonces para transfectar células CHO que, de otro modo, no producirían la inmunoglobulina , de esa manera, se consigue que las células hospederas sinteticen los anticuerpos monoclonales. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que consiste en una composición de la presente invención formulada junto con un transportador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, se utiliza una composición farmacéutica de acuerdo con la patente WO 98/22136. La composición contiene, por ejemplo, en un 1 mi de solución: 2.0 mg de anticuerpo, tampón fosfato 15 mM pH 6.5, cloruro sódico 30 mM, 25 mg de manita, 10 mg de arginina y 0.1 mg de Tween®20. Tal como se usa aquí, "un transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, los medios de dispersión, los recubrimientos, los agentes antibióticos y antimicóticos , los agentes retardantes de la absorción isotónicos y otros compuestos similares que sean fisiológicamente compatibles. Es preferible que el transportador sea apropiado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión) . El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del anticuerpo y que no provoca ningún efecto tóxico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., y otros, J. Pharm.

Sci . 66 (1977) 1-19) . Las sales están incluidas en la invención. Entre los ejemplos de las sales se encuentran las sales de adición ácida y básica. Entre las sales de adición ácida se incluyen aquellas que derivan de ácidos inorgánicos inocuos como los clorhidratos. Una composición de la presente invención se puede administrar mediante varios métodos conocidos en el ámbito.

Como el experto en la técnica podrá apreciar, la vía y el modo de administración variará en función del resultado que se desee. Para administrar el compuesto de la invención a través de ciertas vías de administración, puede ser necesario recubrir o co-administrar el compuesto con un material que prevenga su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un individuo con un transportador adecuado como, por ejemplo, liposomas, o con un diluyente. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen soluciones como reguladores de pH acuosos o salinos. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables apropiados se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de los medios y agentes como sustancias farmacéuticamente activas se conoce en el ámbito. Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se usa aquí, se refiere a modos de administración distintos a la administración tópica y entérica, generalmente por inyección e incluyen, entre otras, la inyección y la infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular , intraorbital , intracardiaca , intradérmica , intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular , intraarticular , subcapsular, subaracnoidea , intraespinal , epidural e intraesternal . Estas composiciones también pueden contener adyuvantes como conservadores, agentes humectantes, emulsionantes y dispersantes. Se puede prevenir la aparición de microorganismos tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la introducción de diversos agentes antibióticos y antimicóticos , por ejemplo, parabén, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. También es deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos, como azúcares, cloruro sódico y similares. Asimismo, la absorción prolongada de las composiciones farmacéuticas inyectables puede conseguirse mediante la adición de agentes retardantes de la absorción como el monoestearato de aluminio y la gelatina. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada apropiada, o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en dosis farmacéuticamente aceptables a través de métodos convencionales que el experto en la técnica ya conoce. Los niveles actuales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición o un modo de administración en particular, que no sea tóxica para el paciente. Los niveles de dosificación seleccionados dependerán de una serie de factores farmacocinéticos como: la actividad de las composiciones particulares de la presente invención que se utilicen, o el éster, la sal o la amida derivados de las mismas; la vía de administración; el patrón de administración; la tasa de excreción del compuesto concreto que se esté utilizando; la duración del tratamiento; otros fármacos, compuestos o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones concretas utilizadas; la edad; el sexo; el peso; el estado general de salud y los antecedentes médicos del paciente antes de ser tratado; y otros factores similares que se conocen muy bien en la práctica médica. La composición debe ser estéril y lo suficientemente fluida para que pueda ser administrada con una jeringa. Además del agua, el transportador puede ser una solución salina regulada en pH isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido y similares) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, como la lecitina y por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión por la utilización de tensioactivos . En muchos casos, es preferible incluir en la composición, agentes isotónicos como, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como el manitol y el sorbitol, y cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante la adición de agentes retardantes de la absorción como, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Se presentan los siguientes ejemplos y la figura 1 para ayudar a la comprensión de la presente invención cuyo auténtico ámbito de aplicación se expone en las reivindicaciones anexas. Cabe resaltar que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos expuestos sin alejarse del espíritu de la invención. Ejemplos Lineas celulares La línea celular parental utilizada para la obtención de una línea celular que exprese de forma recombinante IgG es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) , CHO-DG44 (Flintoff, W.F. y otros, Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261; Flintoff, W.F. y otros, Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285; Urlaub, G. y otros, Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub. G. y otros, Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566) . Las células CHO-DG44 han perdido ambos lugares endógenos de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) . Las células CHO-DG44 se cultivaron en medio mínimo alfa MEM (Gibco núm. 22561), FCS dializado al 10% (Gibco núm. 26400-044) y l-glutamina 2 mmoles/1, hipoxantina 100 µ?, timidina 16 µ? (suplemento HT) . Plásmidos Se utilizó el sistema de expresión que consta del promotor CMV y que se describe en la Tabla 1. Como anticuerpo se utilizó el anticuerpo frente a IGF-1R (WO2005005635, AK18 o AK22) .

Tabla 1 Pb Elemento del vector / Segmento de ADN 1-26 Sitios de restricción únicos: SgrAI, Sse83871 27-614 Promotor del citomegalovirus humano (HCMV) (CMV- Prom) incluyendo el promotor CMV IE humano incluyendo 5'-UTR sintéticos 615-641 Enlazador 642-780 Secuencia líder de la cadena pesada de las Ig murinas (Ll, intrón de secuencia señal, L2) 642-686 Ll 687-768 Intrón señal (intrón SS) 769-780 L2 781-1105 Dominio variable de la cadena ligera ? del anticuerpo frente a IGF-1R (AK18) 1106- Enlazador 1140 1141- Intrón 2 de la cadena ligera ? híbrida humano-ratón 3134 2433- ?-fragmento estimulador 2913 3135- Enlazador 3475 3476- K-dominio constante de la cadena ligera (C-kappa) Pb Elemento del vector / Segmento de ADN 3795 3796- Secuencia de poliadenilación de la cadena ligera-K 4098 de las Ig humanas (C-kappa pA) 4099- Enlazador 4137 4138- Resistencia a higromicina 5800 4138- Promotor SV40 (SV40 Prom) incluye repeticiones de 4485 72 pb, TATA y origen SV40 4486- Enlazador 4502 5403- Higromicina-B-fosfotransferasa (Hyg) 5528 5529- Enlazador 5535 5536- Señal de poliadenilación de SV40 (SV40 pA) 5795 5796- Enlazador 5800 5801- Dihidrofolato reductasa murina (DHFR) 6944 5801- Promotor SV40 (SV40 Prom) incluye repeticiones de 6088 72 pb acortadas y origen SV40 Pb Elemento del vector / Segmento de ADN 6089- Enlazador 6105 6106- Gen DHFR murino (DHFR murino) 6672 6673- Enlazador 6679 6680- Señal de poliadenilación de SV40 (SV40 pA) 6944 6945- Enlazador 7181 7182- Origen de replicación bacteriano y marcadores de 8941 selección derivados del plásmido pUC18 7182- Origen de replicación ("origen pUC") 7792 7793- Enlazador 7939 7940- Gen de la ß-lactamasa (Ap(r)) 8847 8848- Enlazador 8941 8942-9529 Promotor del citomegalovirus humano (CMV-Prom) incluyendo el promotor CMV IE humano Pb Elemento del vector / Segmento de ADN incluyendo 5'-UTR sintéticos 9530-9556 Enlazador 9557-9696 Secuencia líder de la cadena pesada de las Ig murinas (Ll, señal de secuencia intrónica, L2) 9557-9602 Ll 9603-9685 Intrón señal (intrón SS) 9686-9696 L2 9697- Dominio variable de la cadena pesada de las IgGl 10051 del anticuerpo frente a IGF-1R (AK18) 10052- Enlazador 10085 10086- Intrón 2 de la cadena pesada híbrida humano-ratón 11682 incluyendo la región de la cadena pesada de las Ig murinas correspondiente al segmento J incluyendo el elemento estimulador de la cadena pesada de las Ig (regiones JH3 y JH4) Elemento estimulador de la cadena pesada de las Ig murinas 11683- Enlazador 11909 11910- Dominio constante de la cadena pesada de las IgGl 13504 humanas (CHi-región bisagra-CH2-CH3) 11910- CH1 12203 Pb Elemento del vector / Segmento de ADN 12594- Región bisagra 12638 12757- CH2 13086 13184- CH3 (el sitio de corte y empalme alternativo están 13504 eliminados ) 13505- Secuencia de poliadenilación de la cadena pesada de 13967 las IgGl humanas (IgGl pA) 13968- Enlazador SgrAl 13970 Ejemplo 1 Transfección y selección La transfección del plásmido de expresión se realizó con Fugene (Roche Diagnostics GmbH) . Un día después de la transfección, las células DG44 se sometieron a selección con medio mínimo alfa MEM, FCS dializado al 10% y 1-glutamina " 2 mmoles/1 y metotrexato (MTX) 20 nM. Después de tres semanas sometidas a selección, se seleccionaron clones aislados de la placa y se resembraron. Se recogieron los sobrenadantes y se analizó la presencia del anticuerpo con un ELISA específico para IgG humanas. Los subclones se volvieron a resembrar y se analizó la producción de anticuerpos específicos.

Los clones fueron adaptados al crecimiento en suspensión y en medio sin suero, HyQ SFM4 CHO-Utility (HyClone núm. SH30516) que contiene MTX 20 nM. Paralelamente se determinó el patrón de glucosilación. Se seleccionaron los subclones que presentaban una desfucosilación del 2.0% o menos (en función de la cantidad molar total de oligosacáridos ) . Ejemplo 2 Cultivo y purificación Las células se cultivaron en frascos en agitación (Corning) con 30 mi de medio a 37°C, CO2 al 5%, 100 rpm. La densidad celular se valoró con un dispositivo CASY Counter y se recogieron los sobrenadantes para determinar la concentración de anticuerpos por cromatografía de afinidad con proteína A. Se purificaron unos 20 mi de cada sobrenadante para una caracterización bioquímica posterior mediante cromatografía con proteína A (equilibrada con PBS, lavado con tampón de citrato sódico 25 mM pH 5.2, elución con tampón de citrato sódico 100 mM pH 2.8, CIP con NaOH 10 mM) . Ejemplo 3 Análisis de la glucoestructura del anticuerpo El anticuerpo purificado se analizó mediante análisis del mapa peptídico por cromatografía líquida/espectrometría de masas. Las muestras se redujeron (Tris/HCl 0.4 M, guanidina/HCl 8 M pH 8.5, DTT 3 mg/ml), se carboximetilaron (ácido yodoacético) y se digirieron con tripsina. La mezcla de péptidos-glucopéptidos se separó por HPLC en fase inversa y se analizaron por medio de espectrometría de masas por electroaspersión en línea. Se integraron los espectros m/ z de los péptidos que presentaban la estructura glucídica y los resultados se muestran en la Tabla 2. Tabla 2 Cantidad relativa de variantes glucosiladas Man: Estructuras altas en mañosa que llevan cuatro y cinco residuos de mañosa respectivamente. G0, Gl, G2 : cadenas pesadas reducidas con carbohidrato de tipo complejo birramificado fucosilado con 1, 2 o 3 residuos de galactosa terminales. noFuc: cadena pesada reducida con carbohidrato de tipo complejo birramificado sin fucosa El clon 5 de la línea celular CHO (hu MAb<IGF-1R>B1-4E10_9-16) se depositó bajo las normas del Tratado de Budapest para el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los objetivos de un procedimiento patentado, con número de depósito DSM ACC 2795 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania, 21 de junio de 2006. El medio utilizado fue suministrado por Hyclone (HyQ SFM4 CHO-Utility para los clones 4-6) o Sigma (C-8862 para los clones 1-3 y 7) . noFuc: cantidad de cadenas glucidicas sin fucosilar en Asn297 El análisis del mapa peptidico por cromatografía líquida/espectrometría de masas se llevó a cabo mediante la integración de los cromatogramas iónicos específicos de todos los glucopéptidos y en todos sus estados iónicos. La bisección de GlcNac, NGNA altos en mañosa se determinó en la misma forma. La bisección de GlcNac, NGNA no fue detectable. La bisección de GlcNac y NGNA no es detectable, de esta forma la cantidad adicional de NGNA es 0.5% o inferior, y también es de 0.1% o inferior. La cantidad de la bisección de GlcNac también es de 0.5% o inferior, y 0.1% o inferior. En la Tabla 3 se muestra un ejemplo del cálculo de glucosilación ilustrativo (clon 3) (Tabla 3a: clon 3, Tabla 3B: clon 5; péptido que comprende asn298, denominado H27) Tabla 3a cantidad Area z=2 Area z=3 Area z=4 Suma rel.% H27 GO 616 198 0 814 28.7 H27_G1 734 425 0 1158 40.9 H27_G2 103 135 0 238 8.4 H27_G3 0 0 0 0 0.0 H27_G4 0 0 0 0 0.0 H27_G1_1NGNA 0 0 0 0 0.0 H27_G2_1NGNA 0 0 0 0 0.0 H27 G2 2NGNA 0 0 0 0 0.0 H27 G3_1NGNA 0 0 0 0 0.0 H27_G3_2NGNA 0 0 0 0 0.0 GO sin GlcNAc y sin Man 0 57 0 57 2.0 GO sin GlcNAc 330 0 0 330 11.7 Gl sin GlcNAc 208 0 0 208 7.4 Man5 22 0 0 22 0.8 GO sin Fue 5 0 0 5 0.2 Gl sin Fue 0 0 0 0 0.0 Man4 0 0 0 0 0.0 Total 2833.15 100.00 Cantidad reí . de glucoproteínas con NGNA 0 0 Cantidad reí . de glucoproteínas con galactosas (G3 y G 0 0 Cantidad reí . de estructura rica en mañosa 0 8 Cantidad reí . de GO sin Fue y Gl sin Fue 0 2 Suma GO 42.4 Suma Gl 48.2 Suma G2 8.4 Suma total 99.0 En relación con el 100% que es G0-1- 2 GO 42.8 Gl 48.7 G2 8.5 Suma sin Man 99.2 Suma de G0/1 sin Fue 0.2 Cantidad relativa sin Fue 0.2 Area: área del pico H27_ G0 - H27_G4: Glucopéptido H27 (conteniendo sn 298) con carbohidrato de tipo complejo birramificado fucosilado con galactosa x-terminal (por ejemplo, G4 con unidades de galactosa) Cantidad relativa sin Fue: porcentaje de Fue en relación con GO, Gl, G2 sin glucoestructura con mañosa (4 y 5) (rica en mañosa) . H27_G1_1NGNA - H27_G3_2NGNA : Glucopéptido H27 conteniendo Asn 298) con carbohidrato de tipo complejo birramificado fucosilado con galactosa x-terminal (por ejemplo, G2 con 2 unidades) llevando uno o dos ácidos N-glicolil-neuraminico . glucoestructura de tipo complejo birramificadas fucosiladas con galactosa x-terminal (0, 1, 2, 3, y 4 respectivamente ) 2) glucoestructura de tipo complejo birramificadas fucosiladas con galactosa x-terminal (0, 1, 2, 3, y 4 respectivamente) con residuos de ácido n-glicolil neuraminico adicionales . 3) glucoestructura de tipo complejo birramificadas fucosiladas (principalmente artefactos del método) 4) estructuras ricas en mañosa que llevan cuatro o cinco residuos de mañosa respectivamente 51 glucoestructuras no fucosiladas. Ejemplo 4 Valoración de las funciones efectoras de los anticuerpos mediante anti-IGF-IR HuMAc Para determinar la capacidad de los anticuerpos HuMAb generados para desencadenar mecanismos inmunitarios efectores, se llevaron a cabo estudios de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) . Para determinar la capacidad de los anticuerpos HuMAb generados para desencadenar mecanismos inmunitarios efectores, se llevaron a cabo estudios de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) . Para estudiar los efectos de los anticuerpos en ADCC, se marcaron células cancerígenas de próstata DU145 (HTB-81; 1 x 106 en 2-4 mi de RPMI-FM) que expresaban IGF-IR con 1 µ? de solución de bis ( acetoximetil ) 2 , 2 ' : 6' , 2 ' ' -terpiridin-6, 6' ' -dicarboxilato (BATDA) durante 25 minutos a 37°C en un incubador de células. Se lavaron las células cuatro veces con 10 mi de RPMI-FM y se centrifugaron durante 10 minutos a 200 x g con freno. A continuación, se ajustó la concentración de células a 1 x 105 células por mi. Se sembraron 5 000 células por cavidad en una placa de fondo redondeado hasta un volumen de 50 µ?. Se añadieron anticuerpos HuMAb hasta una concentración de 25-0.1 ng/ml en 50 µ? de medio de cultivo. Posteriormente, se añadieron 50 µ? de células efectoras PBMC recién aisladas de sangre o células efectoras purificadas de la capa de leucocitos con una relación aproximada entre células efectoras y células objetivo de 25:1. Las placas se centrifugaron inmediatamente durante 1 minuto a 200 x g con freno y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Tras la incubación, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 200 x g y se añadieron 20 µ? del sobrenadante a una microplaca Optiplate 96-F. Se añadieron 200 µ? de solución Europim a temperatura ambiente y la mezcla se incubó durante 15 minutos en un agitador. La fluorescencia resultante se midió en un fluorómetro de resolución temporal utilizando un protocolo EU-TDA de Perkin Elmer . La magnitud de la lisis celular causada por ADCC se expresó como el porcentaje de máxima liberación de 2, 2' : 6' , 2' ' -terpiridin-6, 6' ' -dicarboxilato (TDA) de las células objetivo lisadas con un detergente y corregido con la liberación espontánea de TDA de las células objetivo respectivas. Como estándar de referencia de un anticuerpo que "no desencadena una respuesta de ADCC" se utiliza un anticuerpo frente a KLH (hemocianina de lapa californiana ) o una mezcla de IgG aisladas de unos 35 000 donantes ( "Redimune" ) . Se utilizaron anticuerpos libres de fucosa en un 75% frente a IGF-IR como control positivo. Un anticuerpo de acuerdo con la invención mostró una liberación de TDA que se encontraba dentro de 3 x SD de la liberación de TDA respecto al anticuerpo estándar (Fig.l). Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. - Un anticuerpo humano de tipo IgGl o IgG3 que ha sido glucosilado con una cadena de azúcar en Asn297, caracterizado porque la cantidad de fucosa de la cadena de azúcar relacionada con la suma de GO, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3, es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de GO, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de 1% o inferior y/o la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa N-terminal dentro de la cadena de azúcar relacionada como la suma de G0, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de 1% o inferior.
2. 2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de NGNA es de 0.5% o menos.
3. 3.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa N-terminal es de 0.5% o menos.
4. 4.- El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.
5. 5.- Una célula CHO capaz de expresar de forma recombinante un anticuerpo humano de tipo IgGl o IgG3 que ha sido glucosilado con una cadena de azúcar en Asn297, caracterizada porque el anticuerpo dentro de la cadena de azúcar la cantidad de fucosa dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de GO, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de GO, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de 1% o inferior y/o la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa N-terminal dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de G0, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de un 1% o inferior.
6. 6. - La célula CHO de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende la eliminación de dos alelos DHFR.
7. 7.- La linea celular, caracterizada porque es CHO DSM ACC 2795.
8. 8. - El uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5 en terapia médica humana.
9. 9.- El uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a 5 para la fabricación de un medicamento .
10. 10.- El uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para la inmunodepresión, para el tratamiento de alteraciones mediadas por la célula T, trastornos autoinmunitarios , enfermedades infecciosas y enfermedades cancerígenas
11. 11. - La composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a 5.
12. 12. - Un método para seleccionar una célula CHO para la producción recombinante de un anticuerpo monoclonal de tipo IgGl o IgG3 humano que está glucosilado con una cadena de azúcar en Asn297, el anticuerpo caracterizado porque la cantidad de fucosa dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de G0, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de al menos el 99% y, además, la cantidad de NGNA dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de G0, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de 1% o inferior y/o la cantidad de alfa-1 , 3-galactosa N-terminal dentro de la cadena de azúcar relacionada con la suma de G0, Gl, G2 (sin mañosa (4 y 5) como el 100% y como se calcula en el ejemplo 3 es de un 1% o inferior, el método comprende cultivar una célula CHO transfectada con un anticuerpo IgGl o IgG3, bajo presión selectiva de DHFR, la selección de clones individuales que expanden los clones y seleccionar un clon que produce un anticuerpo con el patrón de glucosilación de conformidad con la invención.
13. 13. - El uso de una célula CHO de conformidad con las reivindicaciones de la 5 a 7 para producir de forma recombinante un anticuerpo monoclonal.
14. 14. - Un método, caracterizado porque es para la producción recombinante de un anticuerpo monoclonal en una célula CHO de conformidad con las reivindicaciones 5 a 7.