MX2008011731A - Tratamiento de condiciones del snc. - Google Patents

Abstract

Métodos y composiciones para el tratamiento condiciones patológicas del sistema nervioso central (SNC) por medio de administración intranasal de una composición que modula, por medio de interferencia de ARN, la expresión y/o la actividad de genes involucrados en las condiciones antes mencionadas.

Description

TRATAMIENTO DE CONDICIONES DEL SNC Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de condiciones patológicas del sistema nervioso central (SNC) por medio de administración intranasal de una composición que modula, por medio de interferencia de ARN, la expresión y/o actividad de genes involucrados en las condiciones antes mencionadas. Las composiciones de la invención contienen moléculas de ácido nucleico pequeño interferente (ANsi) y compuestos relacionados incluyendo, sin limitarse a ellos, ARN pequeño interferente (ARNsi). En modalidades preferidas, las moléculas de ANsi administradas intranasalmente que apuntan a tau, huntingtina, acetilcolinesterasa, así como también alelos mutados de estos u otros genes del SNC, son útiles en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades del SNC tales como demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, así como también enfermedades congénitas asociadas con mutaciones de genes del SNC entre otros. Antecedentes de la invención iARN como herramienta para modular la expresión genética La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento genético post-transcripcional específico para la secuencia mediado por ARN bicatenario (ARNds). Después del descubrimiento del fenómeno en las plantas a principios de los 90, Andy Fire y Craig Mello demostraron que el ARNds inhibía específica y selectivamente la expresión genética en una forma extremadamente eficiente en Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998). La secuencia de la primera cadena (ARN directo) coincidió con la de la región correspondiente del ARN mensajero objetivo (ARNm). La segunda cadena (ARN inverso) fue complementaria al ARNm. El ARNds resultante pasó a ser varios órdenes de magnitud más eficiente que las moléculas de ARN monocatenario correspondientes (en particular, ARN inverso). El proceso de iARN comienza cuando la enzima DICER encuentra ARNds y la corta en pedazos denominados ARN pequeño interferente o ARNsi. Esta proteína pertenece a la familia de nucleasa RNasa III. Un complejo de proteínas recoge estos ARN remanentes y usa su código como una guía para encontrar y destruir cualesquiera ARN que estén en la célula sin una secuencia coincidente, tal como ARNm objetivo (ver Bosher y Labouesse, 2000; y Akashi et al., 2001 ). Al intentar aplicar el iARN para la inactivación genética (" knockdown"), se reconoció que las células de mamífero han desarrollado diversos mecanismos protectores contra infecciones virales que podrían impedir el uso de este enfoque. Sin duda, la presencia de niveles extremadamente bajos de ARNds viral, dispara una respuesta de interferón, lo que produce una supresión global no específica de traducción, lo que a su vez activa la apoptosis (Williams, 1997, Gil y Esteban, 2000). En 2000, se reportó que el ARNds inhibe específicamente tres genes en el oocito de ratón y en el embrión. No se observó paro traduccional, y por ello una respuesta de PKR, a medida que los embriones continuaban su desarrollo (Wianny y Zernicka-Goetz, 2000). La investigación en Ribopharma AG (Kulmbach, Alemania) demostró la funcionalidad del i ARN en células de mamífero, usando ARNds cortos (20-24 pares de base) para desconectar genes en células humanas sin iniciar la respuesta en fase aguda. Experimentos similares llevados a cabo por otros grupos de investigación confirmaron estos resultados (Elbashir et al., 2001; Caplen et al., 2001). Sometidos a prueba en una variedad de líneas celulares normales y cancerosas humanas y de ratón, se determinó que los ARN de horquilla corta (ARNsh) pueden silenciar los genes tan eficientemente como su contraparte ARNsi (Paddison et al., 2002). Recientemente, se demostró que otro grupo de ARN pequeños (21-25 pares de base) media la regulación hacia abajo de la expresión genética. Estos ARN pequeños, ARN pequeños regulados temporalmente (ARNst), regulan la programación de la expresión genética durante el desarrollo en Caenorhabditis elegans (para una revisión, ver Banerjee y Slack, 2002 y Grosshans y Slack, 2002).

Los científicos han utilizado iARN en varios sistemas, incluyendo Caenorhabditis elegans, Drosophila, tripanosomas, y otros invertebrados. Varios grupos han presentado recientemente la supresión específica de biosíntesis de proteína en diferentes líneas celulares de mamíferos (específicamente en células HeLa) demostrando que el ¡ARN es un método de extensa aplicación para la silenciación genética in vitro. Con base en estos resultados, el iARN se ha convertido rápidamente en una herramienta bien reconocida para validar (identificar y asignar) funciones genéticas. El iARN que emplea oligonucleótidos de ARNds cortos, producirá un entendimiento de la función de los genes que solamente están secuenciados parcialmente. Recientemente, Krutzfeldt y colaboradores han demostrado que una clase de compuestos diseñados especialmente denominados 'antagomirs' pueden silenciar efectivamente la acción de microARN (miARN), trozos no codificadores de ARN que regulan la expresión genética (Krutzfeldt et al., 2005). Administración intranasal de productos de ANsi El suministro en aerosol de ácidos nucleicos a los pulmones usando vectores virales, polímeros, agentes tensoactivos, o excipientes, ha sido descrito para el tratamiento de pulmón enfermedades. Se ha sugerido que los ácidos nucleicos apropiados para administración intranasal incluyen ADNds, ARNds, ADNss, ARNss, ARN interferente corto, micro- ARN , y ARN inverso (ver US2005/0265927, y WO2005/115358).

Los agentes de administración preferidos para agentes inductores de iARN en el pulmón incluyen polímeros catiónicos, polímeros catiónicos modificados, lípidos, y agentes tensoactivos apropiados para introducción (ver US20050008617). Administración en el SNC Solamente se ha logrado la administración intranasal para el tratamiento de SNC enfermedades con inhibidores de acetilcolinesterasa tales como galantamina y diversas sales y derivados de galantamina (ver por ejemplo US2006003989, WO2004/002402, WO2005/102275), mientas que el tratamiento de trastornos neurodegenerativos por medio de descarga de ARN interferente pequeño en el SNC ha sido obtenido previamente por implantación quirúrgica de un catéter (ver por ejemplo WO2005/116212). WO02/086105 describe métodos para suministro de oligonucleótidos al SNC por medio de rutas neurales que se originan en la cavidad nasal. El uso de oligonucleótidos en sentido inverso se describe, pero no se hace ninguna referencia a la interferencia de ARN. Adicionalmente, no hay descripción en esta publicación de actividad fisiológica de los oligonucleótidos suministrados. Adicionalmente, se ha demostrado que el ANsi administrado por vía intravenosa atraviesa la barrera sangre-retina y modula la expresión de genes en el ojo (WO03/087367, US2005/0222061 ).

La modulación de la expresión de algunos genes involucrados en la enfermedad de Alzheimer, tales como beta-secretasa (BACE), proteína precursora amiloide (APP), PIN-I, presenilina 1 (PS-I) y/o presenilina 2 (PS-2), así como también la de genes involucrados en la enfermedad de Huntington, tales como huntingtina o taxina-1, ya se ha logrado con ANsi en cultivos de células, así como también in vivo por medio de estrategias que incluyen administración intratecal e intracerebroventricular, implantación de catéteres y bombas, mediante apertura química u osmótica de la barrera sangre-cerebro, o mediante inyección directa o perfusión en el sistema arterial cerebral (es decir: en el estriado, córtex) - ver por ejemplo WO2005/003350, US2005/042646, y GB2415961). Dirección hacia Tau por medio de ¡ARN Tau tiene un papel central en formas heredadas y adquiridas de demencia relacionada con la edad, incluyendo enfermedad de Alzheimer (AD) (Hardy y Selkoe, 2002; Lee et al., 2001 ; Mullan et al., 1992; Poorkaj et al., 1998; Hutton et al., 1998). La AD se caracteriza por dos sellos distintivos patológicos principales: placas seniles, que contienen beta-amiloide (AP) derivado de división de proteína precursora amiloide (APP); y marañas neurofibrilares, que contienen proteína Tau filamentosa. Formas raras de AD hereditarias han revelado un papel esencial para la producción de AP en la patogénesis de todas las formas de AD, tanto esporádicas como heredadas (Hardy y Selkoe, 2002). Las mutaciones en los tres genes que se sabe que producen la AD familiar - los genes que codifican APP, presenilina 1 y presenilina 2 - actúan dominantemente para ampliar la producción del neurotóxico beta-amiloide (Hardy y Selkoe, 2002). Tau, el componente principal de las marañas neurofibrilares, igualmente juega un papel significativo en la patogénesis de AD (Lee et al., 2001). Las mutaciones en tau producen una enfermedad neurodegenerativa similar dominantemente hereditaria, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP- 17). En el FTDP-17, las mutaciones de tau alteran la secuencia de la proteína tau o conducen a corte y empalme aberrante (Lee et al., 2001; Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2003). Las anormalidades en la expresión de tau también contribuyen a otros varios trastornos neurodegenerativos importantes, incluyendo parálisis supranuclear progresiva y degeneración gangliónica cortical-basal (Houlden et al., 2001 ). Por ello, se puede probar que los esfuerzos para reducir la expresión de tau, ya sea en general o de forma específica para el alelo, son útiles terapéuticamente en enfermedades relacionadas con FTDP-17, AD u otras enfermedades relacionadas con tau. La silenciación específica para el alelo de las mutaciones de tau y/o polimorfismos de un solo nucleótido asociados (SNP) por medio de iARN ya se ha logrado en cultivos de células (Miller et al. 2003, 2004), Adicionalmente, los ARNsi de interés fueron administrados exitosamente en un modelo de ratón por medio de inyección en la vena caudal (US2004/0241854). La anterior es una discusión de técnica relevante referente al iARN así como también de enfoques de suministro en el SNC. La discusión se proporciona solamente para la comprensión de la invención que sigue, y no es una admisión de que cualquiera de los trabajos descritos es técnica anterior con respecto a la invención reclamada. Hay una necesidad no cubierta por la técnica de métodos convenientes mediante los cuales se pueda suministrar moléculas de ANsi al SNC, y mediante los cuales este suministro dé como resultado la actividad de interferencia de ARN. Hemos desarrollado técnicas para modular la expresión genética in vivo para tratar enfermedades del SNC por medio de dirigir moléculas de ARNsi hacia el SNC mediante administración intranasal. Breve descripción de la invención La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de patologías del sistema nervioso central (SNC) por medio de administración intranasal de compuestos que producen interferencia de ARN, Las composiciones de la invención contienen moléculas de ácido nucleico pequeño interferente (ANsi) y compuestos relacionados incluyendo, sin limitarse a ellos, ARN interferente pequeño (ARNsi), ARN bicatenario (ARNds), ARN de horquilla corta (ARNsh), micro-ARN (mi ARN ), antagomirs, y moléculas capaces de mediar la interferencia de ARN. Los métodos de la invención incluyen la administración a un paciente que necesita de ello, de una cantidad efectiva de uno o más ANsi de la invención para el tratamiento de una condición patológica del SNC. En modalidades preferidas, los métodos de la invención incluyen administración intranasal del ANsi terapéutico. En particular, las composiciones de la invención se pueden usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de patologías del SNC incluyendo demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, así como también enfermedades congénitas asociadas con mutaciones de genes del SNC entre otros. Las patologías y enfermedades que se pueden tratar de acuerdo con los métodos de la invención preferiblemente incluyen las que afectan el hipocampo, el córtex, y/o el estriado. En una modalidad, la presente invención se refiere a ANsi o entidades similares sintetizadas químicamente, que están dirigidas a interferir con la expresión del ARNm de los genes de tau, huntingtina o acetilcolinesterasa, así como también de alelos mutados de estos u otros genes del SNC que finalmente modulan la cantidad de proteína producida. En modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención se administran intranasalmente para apuntar específicamente a la versión anormal del gen de interés en el SNC.

Breve descripción de las figuras La invención será descrita, a manera de ejemplo solamente, con referencia a las siguientes figuras. Figura 1: Niveles de expresión de GPF después de la administración intranasal a ratones de NaCI al 0.9 % (Control), 1 nmol/ul de ARNsi-GFP (Ratón 1), 2 nmol/ul de ARNsi-GFP (Ratón 2), y 2 nmol/ul de ARNsi-GFP + TransIT-TKO (Ratón 3). Se llevaron a cabo análisis de córtex, hipocampo, estriado y bulbo del SNC. Figura 2. El ARNsi reduce los niveles de proteína GFP. Se administró intranasalmente el ARNsi designado contra GFP a ratones transgénicos con GFP. Los animales se sacrificaron en diferentes momentos y los tejidos recolectados se analizaron mediante inmunodetección Western. Se administró salina de control a los ratones Cl, CU y Clll como control. Los valores muestran los niveles de expresión de proteína GPF normalizada con respecto a la proteína GFP de los ratones de control. Figura 3. El ARNsi reduce los niveles de ARNm de GFP. Se administró intranasalmente el ARNsi designado contra GFP a ratones transgénicos con GFP. Los animales se sacrificaron en diferentes momentos y se recolectó el ARNm de diferentes tejidos. En esta figura se analizó la expresión del ARNm de GFP del Estriado y el Córtex mediante PCR cuantitativa. Figura 4. El ARNsi reduce los niveles de transcripto del gen MAPT con diferentes mutaciones. Se analizaron los ARNsi diseñados para diferentes mutaciones: Seq ID 159 (mutación P301L) y Seq ID 160 (mutación R406W). Se preparó ARN a partir de células tratadas con los ARNsi específicos durante 48 h. Las muestras se analizaron mediante PCR cuantitativa usando cebadores específicos para MAPT (descritos en el texto). Los valores muestran los niveles de expresión media de diferentes transcriptos normalizados para 18S con relación a células con transfección simulada como control. Figura 5. El ARNsi reduce los niveles de transcripto del gen MAPT. Se preparó ARN a partir de células M DA-MB-435 tratadas con diferentes ARNsi durante 24, 48 h y 72h. Las muestras se analizaron mediante PCR en tiempo real usando cebadores específicos, descritos en el texto. Los valores muestran los niveles de expresión media de diferentes transcriptos normalizados para 18S con relación a control con transfección simulada. Figura 6. El ARNsi Seq ID 160 diseñado para mutación R406W reduce los niveles de proteína MAPT in vivo. El ARNsi Seq ID 160 se administró intranasalmente en ratones transgénicos con MAPT. Los animales se sacrificaron a los siete días al ocurrir la administración del ARNsi y se analizó el tejido del hipocampo mediante inmunodetección Western. Figura 7. Lista de mutaciones MAPT y números de acceso de secuencia genética. Figura 8. Lista de secuencias de regiones de MAPT apuntadas por el ANsi de la invención, y de dúplex de ANsi que apuntan a estas regiones. Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de patologías del SNC por medio de administración intranasal de compuestos que producen iARN. Las composiciones de la invención contienen moléculas de ácido nucleico pequeño interferente (ANsi) que modulan la expresión de genes objetivo asociados con condiciones anormales del SNC. Los métodos de la invención incluyen la administración a un paciente que necesita de ello de una cantidad efectiva de uno o más ANsi de la invención. Diseño de ARNsi Un gen es "apuntado" por ANsi de acuerdo con la invención cuando, por ejemplo, el ANsi disminuye o inhibe selectivamente la expresión del gen o de un alelo del gen involucrado en una condición patológica. Alternativamente, el ANsi apunta a un gen cuando el ANsi se híbrida bajo condiciones restrictivas con el transcripto geiaético. Los ANsi se pueden someter a prueba ya sea in vitro o in vivo para determinar su capacidad de apuntar a un gen. En 1999, Tuschl et al. descifraron el efecto silenciador de los ARNsi mostrando que su eficiencia es una función de la longitud del dúplex, la longitud de las proyecciones en el extremo 3', y la secuencia en estas proyecciones. La selección de la región homologa correcta dentro del gen objetivo es de gran relevancia para el silenciamiento apropiado. Un fragmento corto de la secuencia del gen objetivo (por ejemplo, 19-40 nucleótidos de longitud) se escoge como la secuencia del ANsi de la invención. Alternativamente, la región variable del alelo de interés se selecciona como diana de los compuestos de ANsi. En una modalidad, el ANsi es ARNsi. En tales modalidades, el fragmento corto de la secuencia genética objetivo es un fragmento del gen objetivo ARNm. En modalidades preferidas, los criterios para escoger un fragmento de secuencia del gen objetivo ARNm para que sea una molécula de ARNsi candidata incluyen: 1) una secuencia del gen objetivo ARNm que es de al menos 50-100 nucleótidos desde el extremo 5' o 3' de la molécula de ARNm originaria; 2) una secuencia del gen objetivo ARNm que tiene un contenido de G/C de entre 30% y 70%, mucho más preferiblemente alrededor de 50%; 3) una secuencia del gen objetivo ARNm que no contiene secuencias repetitivas (por ejemplo, AAA, CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT); 4) una secuencia del gen objetivo ARNm que es accesible en el ARNm; y 5) una secuencia del gen objetivo ARNm que es única para el gen objetivo. El fragmento de secuencia del gen objetivo ARNm puede cumplir con uno o más de los criterios identificados mencionados anteriormente. En modalidades preferidas, el ARNsi tiene un contenido de G/C por debajo de 60% y/o carece de secuencias repetitivas. Prácticamente, el gen de interés se introduce como una secuencia de nucleótidos en un programa de predicción que toma en cuenta todas las variables descritas anteriormente para el diseño de oligonucleótidos óptimos. Este programa explora cualquier secuencia de nucleótidos de ARNm para identificar regiones susceptibles de ser apuntadas por ARNsi. El resultado de este análisis es una puntuación de posibles oligonucleótidos de ARNsi. Las puntuaciones más altas se usan para diseñar oligonucleótidos de ARN bicatenario (comúnmente de 21 bp de longitud, si bien también son posibles otras longitudes) que comúnmente se realizan mediante síntesis química. Varias modificaciones químicas que se conocen bien en la técnica, dirigidas a aumentar la estabilidad o disponibilidad de los oligonucleótidos de ARNds, también se pueden hacer. Los oligonucleótidos candidatos se pueden filtrar adicionalmente para la conservación de la secuencia entre especies con el fin de facilitar la transición de estudios clínicos en animales a humanos. Además del ANsi que es perfectamente complementario a la región diana, se puede usar secuencias de ANsi degeneradas para apuntar a las regiones homologas diana. WO2005/045037 describe el diseño de moléculas de ANsi para apuntar a estas secuencias homologas, por ejemplo incorporando pares de base no canónicos, por ejemplo pares de base no coincidentes y/o con bamboleo, que pueden proporcionar secuencias diana adicionales. En los casos en los que están identificadas las fallas en coincidencia, se puede usar pares de base no canónicos (por ejemplo, bases no coincidentes y/o con bamboleo) para generar moléculas de ANsi que apunten a más de una secuencia genética. En un ejemplo no limitante, se usan pares de base no canónicos tales como UU y CC pares de base para generar moléculas de ANsi que son capaces de dirigir secuencias a diferentes dianas que comparten homología de secuencia. Como tal, una ventaja del uso de ANsi de la invención es que un solo ANsi puede ser diseñado para que incluya una secuencia de ácido nucleico que es complementaria para la secuencia de nucleótidos que se conserva entre genes homólogos. En este enfoque, se puede usar un solo ANsi para inhibir la expresión de más de un gen en lugar de usar más de una molécula de ANsi para apuntar a diferentes genes. La identidad de secuencia se puede calcular mediante comparación de secuencia y algoritmos de alineación conocidos en la técnica (ver Gribskov y Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, y referencias citadas allí) y calcular la diferencia en porcentaje entre la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, mediante el algoritmo Smith-Waterman implementado en el programa de software BESTFIT usando los parámetros por defecto (por ejemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Se prefiere una identidad de secuencia de más de 90%, 95%, o 99% entre el ANsi y la parte del gen objetivo. Alternativamente, la complementariedad entre el ANsi y molécula de ARN originario se puede definir funcionalmente por hibridación, así como también funcionalmente por su capacidad para disminuir o inhibir la expresión de un gen objetivo. La capacidad de un ANsi para afectar la expresión genética se puede determinar empíricamente, ya sea in vivo o ¡n vitro. Las moléculas de ANsi preferidas de la invención son bicatenarias. En una modalidad, moléculas de ANsi bicatenario contienen extremos romos. En otra modalidad, moléculas de ANsi bicatenario contienen proyecciones de nucleótidos (por ejemplo, proyecciones de 1-5 nucleótidos, preferiblemente proyecciones de 2 nucleótidos). En una modalidad específica, las proyecciones de nucleótidos son proyecciones 3'. En otra modalidad específica, las proyecciones de nucleótidos son proyecciones 5'. Cualquier tipo de nucleótido puede ser una parte de la proyección. En una modalidad, el nucleótido o nucleótidos que se proyectan son ácidos ribonucleicos. En otra modalidad, el nucleótido o nucleótidos que se proyectan son ácidos desoxirribonucleicos. En una modalidad preferida, el nucleótido o nucleótidos que se proyectan son nucleótidos de timidina. En otra modalidad, el nucleótido o nucleótidos que se proyectan son nucleótidos modificados o no clásicos. El nucleótido o nucleótidos que se proyectan pueden tener uniones no clásicas entre nucleótidos (por ejemplo, distintas de enlace fosfodiéster). Síntesis de dúplex de ANsi El ANsi se puede sintetizar por cualquier método conocido en la técnica. Los ARN preferiblemente se sintetizan químicamente usando fosforamiditas ribonucleósidas protegidas apropiadamente y un sintetizador convencional de ADN/ARN. Adicionalmente, el ARNsi se puede obtener de proveedores comerciales de oligosíntesis de ARN incluyendo, sin limitarse a ellos, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA), y Cmachem (Glasgow, UK), Qiagen (Alemania) Ambion (USA) e Invitrogen (Escocia). Alternativamente, las moléculas de ANsi de la invención se pueden expresar en células transfectando las células con vectores que contienen la secuencia de ANsi del complemento inverso bajo el control de un promotor. Una vez expresado, el ANsi puede ser aislado de la célula usando técnicas bien conocidas en la materia. Un paso de hibridación es necesario cuando se trabaja con moléculas de ARN monocatenario. Para hibridar los ARN, se va a combinar 30 µ? de cada ARN oligo 50 µ? solución en 100 mM acetato de potasio, 30 m HEPES-KOH pH 7.4, 2 mM acetato de magnesio. Luego se incuba la solución durante 1 minuto a 90 °C, centrifugado durante 15 segundos, y se incuba durante 1 hora a 37°C. En modalidades en donde el ARNsi es un ARN de horquilla corta (ARNsh), las dos cadenas de la molécula de ARNsi pueden estar conectadas por una región enlazante (por ejemplo, un enlazante nucleótido o un enlazante no nucleótido). Modificación química de ANsi. Los ANsi de la invención pueden contener uno o más nucleótidos modificados y/o enlaces no fosfodiéster. Las modificaciones químicas bien conocidas en la técnica son capaces de aumentar la estabilidad, disponibilidad, y/o captación de células del ANsi. La persona entrenada se dará cuenta de otros tipos de modificaciones que se pueden incorporar en las moléculas de ARN (ver Publicaciones Internacionales WO03/070744 y WO2005/045037 para una visión general de tipos de modificaciones). En una modalidad, es posible usar modificaciones para proporcionar resistencia mejorada a la degradación o captación mejorada. Ejemplos de estas modificaciones incluyen enlaces fosforotioato entre nucleótidos, 2'-0-metil ribonucleótidos (especialmente en la cadena en sentido directo de un ARNsi bicatenario), 2'-desoxi-fluoro ribonucleótidos, 2'-desoxi ribonucleótidos, nucleótidos de "base universal", nucleótidos de 5-C-metilo, e incorporación de residuo disoxibásico invertido (ver de manera general GB2406568). En otra modalidad, es posible usar modificaciones para mejorar la estabilidad del ARNsi o para aumentar la eficiencia de apuntamiento. Las modificaciones incluyen enlace químico cruzado entre las dos cadenas complementarias de un ARNsi, modificación química de un término 3' o 5' de una cadena de un ARNsi, modificaciones de azúcar, modificaciones de núcleo base y/o modificaciones de estructura principal, ribonucleótidos 2'-fluoro modificados y 2'-desoxi ribonucleótidos (ver de manera general la Publicación Internacional WO2004/029212). En otra modalidad, es posible usar modificaciones para aumentar o disminuir la afinidad por los nucleótidos complementarios en el ARNm objetivo y/o en la cadena de ANsi complementaria (ver de manera general la Publicación Internacional WO2005/044976). Por ejemplo, un nucleótido de pirimidina no modificado puede ser sustituido por a 2-tio, 5-alquinil, 5-metil, o 5-propinil pirimidina. Adicionalmente, una purina no modificada se puede sustituir con una 7-deza, 7-alquil, o 7-alquenil purina. En otra modalidad, cuando el ANsi es un ARNsi bicatenario, los nucleótidos de las proyecciones de nucleótidos del terminal 3' se reemplazan por desoxiribonucleótidos (ver de manera general Elbashir et al., 2001). En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) monocatenario que regula hacia abajo la expresión de un gen objetivo, preferiblemente un gen expresado en el SNC, más preferiblemente un gen MAPT, en donde la molécula de ANsi es ensamblada a partir de dos fragmentos de oligonucleótidos separados en donde un fragmento incluye la región en sentido directo y el segundo fragmento incluye la región en sentido inverso de la molécula de ANsi. En otra modalidad aproximadamente 19 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANsi están apareados en la base con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANsi y en donde al menos dos nucleótidos del terminal 3' de cada fragmento de la molécula de ANsi no son pares de base para los nucleótidos del otro fragmento de la molécula de ANsi (es decir, la molécula de ANsi incluye proyecciones de al menos 2 nucleótidos en cada cadena). En una modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del terminal 3' de cada fragmento de la molécula de ANsi es un nucleótido de 2'-desoxi-pirimidina, tal como una 2'-desoxi-timidina. En otra modalidad, todos los 21 nucleótidos de cada fragmento de la molécula de ANsi están apareados en la base con los nucleótidos complementarios del otro fragmento de la molécula de ANsi. En otra modalidad, aproximadamente 19 nucleótidos de la región en sentido inverso están apareados en la base con la secuencia de nucleótidos o una parte de ella del ARN codificado por el gen objetivo. En otra modalidad, aproximadamente 21 nucleótidos de la región en sentido inverso están apareados en la base con la secuencia de nucleótidos o una parte de ella del ARN codificado por el gen objetivo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el extremo 5' del fragmento que comprende dicha región en sentido inverso puede incluir opcionalmente un grupo fosfato. En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ANsi, en donde cualquiera o ambas de las cadena en sentido directo o en sentido inverso incluye uno o más, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, preferiblemente desde 1 hasta 5, enlaces fosforotioato entre nucleótidos, y/o uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), preferiblemente desde 1 hasta 5, 2'-desoxi, 2'-0-metil, 2'-desoxi-2'-fluoro , y/o aproximadamente uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), preferiblemente desde 1 hasta 5, nucleótidos modificados de base universal, y opcionalmente una molécula de capuchón terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos de los extremos 3' y 5' de cualquiera o de ambos de la cadena en sentido directo o en sentido inverso. En otra modalidad, uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, preferiblemente desde 1 hasta 5, nucleótidos de pirimidina de la cadena de ANsi en sentido directo y/o en sentido inverso están modificados químicamente con 2'-desoxi, 2'-0-metil y/o nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro, opcionalmente con uno o más, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más, preferiblemente desde 1 hasta 5, enlaces fosforotioato entre nucleótidos y/o una molécula de capuchón terminal en el extremo 3', el extremo 5', o ambos de los extremos 3' y 5', que están presentes en la misma cadena o en cadenas diferentes. En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) modificada químicamente que tiene aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 o más (específicamente alrededor de 1, 2, 3, 4, 5 o más) enlaces fosforotioato entre nucleótidos en cada cadena de la molécula de ANsi. En otra modalidad, la invención incorpora una molécula de ANsi que comprende enlaces 2'-5' entre nucleótidos. El enlace o los enlaces entre nucleótidos 2'-5' pueden ser en el extremo 3', el extremo 5', o ambos de los extremos 3' y 5' de una o ambas cadenas de la secuencia de ANsi. Además, el enlace o los enlaces entre nucleótidos 2'-5' pueden estar presentes en otras diversas posiciones dentro de una o ambas cadenas de secuencia de ANsi, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más incluyendo cada enlace entre nucleótidos de un nucleotido de pirimidina en una o en ambas cadenas de la molécula de ANsi pueden contener un enlace entre nucleótidos 2'-5', o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más incluyendo cada enlace entre nucleótidos de un nucleotido de purina en una o en ambas cadenas de la molécula de ANsi pueden contener un enlace entre nucleótidos 2'-5'. En una modalidad, una molécula de ANsi de la invención incluye uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), por ejemplo, en el extremo 5', el extremo 3', en ambos extremos 5' y 3', o cualquier combinación de ellos, de la molécula de ANsi. En otra modalidad, una molécula de' ANsi de la invención incluye uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos acíclicos, por ejemplo, en el extremo 5', el extremo 3', en ambos extremos 5' y 3', o cualquier combinación de ellos, de la molécula de ANsi, En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) modificada químicamente de la invención, en donde cualquiera (por ejemplo, uno o más o todos) de los nucleótidos de pirimidina presentes en cualquiera o en ambas de las regiones en sentido directo o en sentido inverso son Nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro de pirimidina, y en donde cualquiera (por ejemplo, uno o más o todos) de los nucleótidos de purina presentes en cualquiera o en ambas de las regiones en sentido directo o en sentido inverso son T-desoxi nucleótidos de purina. Opcionalmente, cualquiera de los nucleótidos que incluye una proyección de nucleótido en el terminal 3' que están presentes en dicha región en sentido directo o en sentido inverso son 2'-desoxi nucleótidos. En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) modificada químicamente de la invención, en donde cualquiera (por ejemplo, uno o más o todos) los nucleótidos de pirimidina presentes en cualquiera o en ambas de las regiones en sentido directo o en sentido inverso son Nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro de pirimidina, y en donde cualquiera (por ejemplo, uno o más o todos) nucleótidos de purina presentes en cualquiera o en ambas de las regiones en sentido directo o en sentido inverso son nucleótidos 2'-0-metilo de purina. Opcionalmente, cualquiera de los nucleótidos que incluye una proyección de nucleótido en el terminal 3' que están presentes en dicha región en sentido directo o en sentido inverso son nucleótidos 2'-desoxi. En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ARN bicatenaria sintetizada químicamente que dirige la división de un ARN objetivo, preferiblemente un ARN expresado en el SNC, más preferiblemente un ARN de MAPT, mediante interferencia de ARN, en donde cada cadena de dicha molécula de ARN es de aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud; una cadena de la molécula de ARN incluye secuencia de nucleótido que tiene suficiente complementariedad con respecto al ARN objetivo para la molécula de ARN para dirigir la división del ARN objetivo por medio de interferencia de ARN; y en donde al menos una cadena de la molécula de ARN incluye uno o más nucleótidos modificados químicamente descritos aquí, tales como desoxinucleótidos, T-O-metil nucleótidos, nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-0-metlioxietil nucleótidos etc. En una modalidad, la invención incorpora un medicamento que contiene una molécula de ANsi de la invención. En una modalidad, la invención incorpora un ingrediente activo que contiene una molécula de ANsi de la invención. En una modalidad, la invención incorpora el uso de una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) monocatenario para regular hacia abajo la expresión de un gen objetivo, preferiblemente un gen expresado en el SNC, más preferiblemente un gen MAPT, en donde la molécula de ANsi incluye una o más modificaciones químicas y cada cadena del ANsi bicatenario es de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 28 o más (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 o más) nucleótidos de longitud . En una modalidad, la invención incorpora una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) monocatenario que inhibe la expresión de un gen objetivo, preferiblemente un gen expresado en el SNC, más preferiblemente un gen MAPT, en donde una de las cadenas de la molécula de ANsi bicatenaria es una cadena en sentido inverso que incluye secuencia de nucleótido que es complementaria para secuencia de nucleótido of target ARN o una parte de ella, la otra cadena es una cadena en sentido directo que incluye secuencia de nucleótido que es complementaria para una secuencia de nucieótidos de la cadena en sentido inverso y en donde una mayoría de los nucieótidos de pirimidina presentes en la molécula de ANsi bicatenaria incluye una modificación de azúcar. Preferiblemente el ARN objetivo o parte de él codifica una proteína o parte de él. Opcionalmente, el extremo 5' de la cadena en sentido inverso incluye un grupo fosfato. La secuencia de nucieótidos o una parte de ella de la cadena en sentido inverso puede ser complementaria para una secuencia de nucieótidos de la región no traducida o una parte de ella del ARN objetivo. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANsi incluye aproximadamente 18 hasta aproximadamente 29 o más (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29 o más) nucieótidos, en donde cada cadena incluye al menos aproximadamente 18 nucieótidos que son complementarios para los nucieótidos de la otra cadena. En una modalidad, la molécula de ANsi se ensambla a partir de dos fragmentos de oligonucleótidos, en donde un fragmento incluye la secuencia de nucieótidos de la cadena en sentido inverso de la molécula de ANsi y un segundo fragmento incluye la secuencia de nucleótido de la región en sentido directo de la molécula de ANsi. En una modalidad, la cadena en sentido directo está conectada a la cadena en sentido inverso por medio de una molécula enlazante, tal como un enlazante polinucleótido o un enlazante no nucleótido. En una modalidad adicional, los nucleotidos de pirimidina presentes en la cadena en sentido directo son nucleotidos 2'-desoxi-2'fluoro de pirimidina y los nucleotidos de purina presentes en la región en sentido directo son nucleotidos 2'-desoxi de purina. En otra modalidad, los nucleotidos de pirimidina presentes en la cadena en sentido directo son nucleotidos 2'-desoxi-2'fluoro de pirimidina y los nucleotidos de purina presentes en la región en sentido directo son nucleotidos 2'-0-metilo de purina. En todavía otra modalidad, los nucleotidos de pirimidina presentes en la cadena en sentido inverso son Nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro de pirimidina y cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la cadena en sentido inverso son nucleótidos 2 -desoxi de purina. En otra modalidad, la cadena en sentido inverso incluye uno o más nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro de pirimidina y uno o más nucleótidos 2'-0-metilo de purina. En otra modalidad, los nucleótidos de pirimidina presentes en la cadena en sentido inverso are nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro de pirimidina y cualesquiera nucleótidos de purina presentes en la cadena en sentido inverso son nucleótidos 2'-0-metilo de purina. En una modalidad adicional la cadena en sentido directo incluye un extremo 3' y un extremo 5', en donde una fracción de capuchón terminal (por ejemplo, una fracción abásica desoxi invertida o una fracción de nucleótido desoxi invertida tal como timidina invertida) está presente en el extremo 5", el extremo 3', o ambos de los extremos 3' y 5' de la cadena en sentido directo. En otra modalidad, la cadena en sentido inverso incluye un enlace fosforotioato entre nucleotidos en el extremo 3' de la cadena en sentido inverso. En otra modalidad, la cadena en sentido inverso incluye una modificación glicerilo en el extremo 3'. En otra modalidad, el extremo 5' de la cadena en sentido inverso opcionalmente incluye un grupo fosfato. En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente de una molécula de ácido nucleico interferente corto (ANsi) monocatenario que inhibe la expresión de un gen objetivo, preferiblemente un gen expresado en el SNC, más preferiblemente un gen MAPT, en donde una mayoría de los nucleotidos de pirimidina presentes en la molécula de ANsi bicatenaria incluye una modificación de azúcar, cada una de los dos cadenas de la molécula de ANsi puede contener aproximadamente 21 nucleotidos. En una modalidad, aproximadamente 21 nucleotidos de cada cadena de la molécula de ANsi están apareados en la base con los nucleotidos complementarios de la otra cadena de la molécula de ANsi. En otra modalidad, aproximadamente 19 nucleotidos de cada cadena de la molécula de ANsi están apareados en la base con los nucleotidos complementarios de la otra cadena de la molécula de ANsi, en donde al menos dos nucleotidos del terminal 3' de cada cadena de la molécula de ANsi no son pares de base para los nucleotidos de la otra cadena de la molécula de ANsi. En otra modalidad, cada uno de los dos nucleótidos del terminal 3' de cada fragmento de la molécula de ANsi es una 2'-desoxi-pirimidina, tal como 2'-desoxi-timidina. En una modalidad, cada cadena de la molécula de ANsi está apareada en la base a los nucleótidos complementarios de la otra cadena de la molécula de ANsi. En una modalidad, aproximadamente 19 nucleótidos de la cadena en sentido inverso están apareados en la base con la secuencia de nucleótidos del ARN objetivo o una parte de ella. En una modalidad, aproximadamente 21 nucleótidos de la cadena en sentido inverso están apareados en la base con la secuencia de nucleótidos del ARN objetivo o una parte de ella. En una modalidad, la invención incorpora una composición que contiene una molécula de ANsi de la invención en un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente. En un ejemplo no limitante, la introducción de nucleótidos modificados químicamente en moléculas de ácido nucleico proporciona una poderosa herramienta para superar las limitaciones potenciales de estabilidad y biodisponibilidad in vivo inherentes a las moléculas de ARN originarias que son suministradas exógenamente. Por ejemplo, el uso de moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente puede permitir una menor dosis de una molécula de ácido nucleico en particular para un efecto terapéutico dado, puesto que las moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente tienden a tener una duración más prolongada en suero. Adicionalmente, algunas modificaciones químicas pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas de ácido nucleico apuntando a células o tejidos en particular y/o mejorando la captación celular de la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, aún si la actividad de una molécula de ácido nucleico modificada químicamente es reducida en comparación con una molécula de ácido nucleico natural, por ejemplo, cuando se compara con una molécula de ácido nucleico de todos los ARN, la actividad global de la molécula de ácido nucleico modificada puede ser mayor que la de la molécula natural debido a la estabilidad y/o suministro mejorados de la molécula. A diferencia del ANsi natural no modificado, el ANsi modificado químicamente también puede reducir al mínimo la posibilidad de activación de la actividad del interferón en los seres humanos. En cualquiera de las modalidades de moléculas de ANsi descritas aquí, la región en sentido inverso de una molécula de ANsi de la invención pueden contener un enlace fosforotioato entre nucleótidos en el extremo 3' de dicha región en sentido inverso. En cualquiera de las modalidades de moléculas de ANsi descritas aquí, la región en sentido inverso puede contener desde aproximadamente uno hasta aproximadamente cinco enlaces fosforotioato entre nucleótidos en el extremo 5' de dicha región en sentido inverso. En cualquiera de las modalidades de moléculas de ANsi descritas aquí, las proyecciones de nucleótidos del terminal 3' de una molécula de ANsi de la invención pueden contener ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos que están modificados químicamente en un azúcar, base o estructura principal de ácido nucleico. En cualquiera de las modalidades de moléculas de ANsi descritas aquí, las proyecciones de nucleótido del terminal 3' pueden contener uno o más ribonucleótidos de base universal, En cualquiera de las modalidades de moléculas de ANsi descritas aquí, las proyecciones de nucleótido del terminal 3' pueden contener uno o más nucleótidos acíclicos. En otras modalidades moléculas de ANsi tienen extremos romos. En una modalidad, la invención abarca moléculas de ANsi que son de 40 nucleótidos o menos y contienen una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-160 de la Figura 8. En una modalidad específica, el ANsi tiene 21-20 nucleótidos de longitud e incluye cualquiera de las SEQ ID NOS:161-318 de la Figura 8. En una modalidad, la invención incorpora un método para modular la expresión de un gen objetivo, preferiblemente un gen expresado en el SNC, más preferiblemente un gen MAPT en un sujeto u organismo, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANsi de la invención, la cual puede estar modificada químicamente, en donde una de las cadenas de ANsi incluye una secuencia complementaria para el ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de ANsi en el sujeto u organismo bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en el sujeto u organismo. El nivel de proteína o ARN objetivo se puede determinar usando diversos métodos bien conocidos en la técnica. En otra modalidad, la invención incorpora un método para modular la expresión de más de un gen objetivo, preferiblemente genes expresados en el SNC, más preferiblemente incluyendo al menos un gen MAPT en un sujeto u organismo, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANsi de la invención, las cuales pueden estar modificadas químicamente, en donde una de las cadenas de ANsi incluye una secuencia complementaria para el ARN de los genes objetivo; y (b) introducir las moléculas de ANsi en el sujeto u organismo bajo condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes objetivo en el sujeto u organismo. El nivel de proteína o ARN objetivo pueden ser determinados como se conoce en la técnica. En una modalidad, la invención incorpora un método para modular la expresión de un gen objetivo, preferiblemente un gen expresado en el SNC, más preferiblemente un gen MAPT dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar una molécula de ANsi de la invención, la cual puede estar modificada químicamente, en donde el ANsi incluye una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad para ARN del gen objetivo; y (b) introducir la molécula de ANsi en una célula bajo condiciones adecuadas para modular la expresión del gen objetivo en la célula. En otra modalidad, la invención incorpora un método para modular la expresión de más de un gen objetivo, preferiblemente genes expresado en el SNC, más preferiblemente incluyendo al menos un gen MAPT dentro de una célula, que comprende: (a) sintetizar moléculas de ANsi de la invención, las cuales pueden estar modificadas químicamente, en donde el ANsi incluye una secuencia monocatenaria que tiene complementariedad para ARN del gen objetivo; y (b) poner en contacto la célula in vitro o in vivo con la molécula de ANsi bajo condiciones adecuadas para modular la expresión de los genes objetivo en la célula. Pruebas in vitro de los dúplex de ARNsi. Para verificar la especificidad de la interferencia de ARNsi, se puede llevar a cabo pruebas preliminares en cultivos de células que expresan los genes objetivo. Básicamente, las células se incuban con los correspondientes dúplex de ARNsi, seguido por un análisis de los niveles de expresión genética. Para ligar el ARNsi inactivado genéticamente a fenotipos específicos en células cultivadas, es necesario demostrar la disminución de la proteína apuntada o al menos demostrar la reducción del ARNm apuntado. Los niveles de ARNm del gen objetivo pueden ser cuantificados mediante PCR en tiempo real (RT-PCR). Adicionalmente, los niveles de proteína pueden ser determinados en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como análisis de inmunodetección Western con anticuerpos específicos para los diferentes objetivos que permiten la vigilancia directa de la reducción de la proteína apuntada. Los ARNsi se introducen en las células por medio de cualquier técnica de transfección bien conocida en la técnica. Se puede realizar una sola transfección del dúplex de ARNsi, por ejemplo, usando un lípido catiónico, tal como Reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen), seguido por un análisis de eficiencia de silenciamiento 24, 48 y 72 horas después de la transfección . La eficiencia de transfección puede depender del tipo de célula, pero también del número de pases y la confluencia de las células. El tiempo y la manera de formación de complejos de ARNsi-liposoma (por ejemplo inversión contra efecto de vórtice) también son críticos. Bajas eficiencias de transfección son la causa más frecuente de silenciamiento no exitoso. La buena transfección no es un aspecto trivial y se tiene que examinar cuidadosamente para cada nueva línea celular que se vaya a usar. La eficiencia de transfección se puede probar transfectando genes informadores por ejemplo un plásmido con expresión de EGFP dirigido por CMV (por ejemplo de Clontech) o un plásmido con expresión de B-Gal, y luego evaluarse por contraste de fase y/o microscopía de fluorescencia al día siguiente. Dependiendo de la abundancia y el tiempo de vida (o rotación) de la proteína apuntada, puede hacerse evidente un fenotipo inactivado genéticamente después de 1 a 3 días, o aún posteriormente. En los casos en donde no se observa ningún fenotipo, se puede observar el agotamiento de la proteína mediante inmunofluorescencia o inmunodetección Western. Formulaciones farmacéuticas v rutas de administración. La presente invención puede incluir la administración de una o más especies de moléculas de ANsi simultáneamente. Estas especies pueden seleccionarse para apuntar a uno o más genes objetivo. En una modalidad, se administra un solo tipo de ANsi en los métodos terapéuticos de la invención. En otra modalidad, un ANsi de la invención se administra en combinación con otro ANsi de la invención y/o con uno o más de otros agentes terapéuticos de ANsi útiles para el tratamiento, prevención o manejo de una condición de enfermedad del SNC. El término "en combinación con" no está limitado a la administración de agentes terapéuticos exactamente al mismo tiempo, sino que en lugar de ello significa que los ANsi de la invención y el otro agente se administran a un paciente en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que el beneficio de la combinación es mayor que el beneficio si fueran administrados de otra forma. Por ejemplo, cada agente terapéutico se puede administrar al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes puntos en el tiempo; sin embargo, si no se administraran al mismo tiempo, se deberían administrar suficientemente cerca en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Cada agente terapéutico se puede administrar por separado, en cualquier forma apropiada y mediante cualquier ruta apropiada. Los ANsi de la invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante cualquiera de las técnicas convencionales conocidas en la materia (ver por ejemplo, Alfonso, G. et al., 1995, en: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19a. ed.). Las formulaciones que contienen uno o más ANsi para uso en los métodos de la invención pueden estar en numerosas formas, y pueden depender de los diversos factores específicos para cada paciente (por ejemplo, el tipo y gravedad del trastorno, tipo de ANsi administrado, edad, peso corporal, respuesta, y la historia médica del paciente), la cantidad y tipo de ANsi en la formulación, la forma de la composición (por ejemplo, en forma líquida, semi-líquida o sólida) y/o el régimen terapéutico (por ejemplo si el agente terapéutico se administra en el tiempo como una infusión lenta, un solo bolo, una vez al día, varías veces al día o una vez cada pocos días). Las moléculas de ANsi de la invención y formulaciones o composiciones de ellas se pueden administrar directamente o tópicamente como es del conocimiento general en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ANsi puede contener un vehículo de suministro, incluyendo liposomas, para su administración a un sujeto. Los portadores y diluyentes y sus sales pueden estar presentes en formulaciones aceptables farmacéuticamente. Las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar a las células mediante una variedad de métodos conocidos por las personas hábiles en la técnica, incluyendo, sin estar restringidas a ellas, encapsulación en liposomas, iontoforesis, o incorporación en otros vehículos, tales como polímeros bíodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas, ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteináceos. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención también puede ser formuladas o formadas en complejos con polietilenimina y sus derivados, tales como polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o derivados de polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL). Una molécula de ANsi de la invención se puede formar como complejo con agente interruptores de membrana y/o un lípido catiónico o molécula lípida auxiliar.

Los sistemas de suministro que se pueden usar con la invención incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, ungüentos, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases y polvos de hidrocarburo, y pueden contener excipientes tales como ' solubilizantes, mejoradores de permeación, (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácido graso, alcoholes grasos y aminoácidos), y polímeros hidrofílicos (por ejemplo, policarbofil y polivinilpirrolidona). En una modalidad, el portador aceptable farmacéuticamente es un liposoma o un mejorador transdérmico. Una formulación farmacéutica de la invención está en una forma apropiada para su administración, por ejemplo, administración sistémica o local, en una célula o sujeto, incluyendo por ejemplo un humano. Las formas apropiadas, en parte, dependen del uso o de la ruta de entrada, por ejemplo oral, transdérmica , o por inyección. Otros factores son conocidos en la técnica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que evitan que la composición o formulación ejerza su efecto. La presente invención también incluye composiciones preparadas para almacenamiento o administración que incluyen una cantidad efectiva farmacéuticamente de los compuestos deseados en un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, se pueden proporcionar conservadores, estabilizantes, colorantes y agentes saborizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Adicionalmente, se puede usar antioxidantes y agentes suspensores. Una dosis efectiva farmacéuticamente es la dosis requerida para evitar, inhibir la aparición, o tratar (aliviar un síntoma en algún grado, preferiblemente todos los síntomas) de un estado de enfermedad. La dosis efectiva farmacéuticamente depende del tipo de enfermedad, de la composición utilizada, de la vía de administración, del tipo de mamífero que está siendo tratado, de las características físicas del mamífero específico bajo consideración, de la medicación concurrente, y de otros factores que las personas entrenadas en la técnica médica reconocerán. Las formulaciones de la invención pueden ser administradas en formulaciones de unidad de dosis que contiene portadores, adyuvantes o vehículos convencionales no tóxicos, aceptables farmacéuticamente. Las formulaciones para uso oral también pueden ser presentadas como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio aceitoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva. Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en una mezcla con excipientes apropiados para la fabricación de suspensiones acuosas. Estos excipientes son agentes suspensores, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropil-metilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido de origen natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetileneoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol anhídridos, por ejemplo monooleato de polietilen sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo etil, o n-propil p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes endulzantes, tales como sacarosa o sacarina. Las suspensiones aceitosas se pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Estas composiciones pueden ser conservadas mediante la adición de un anti-oxidante tal como ácido ascórbico. Los polvos y gránulos dispersables apropiados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente suspensor y uno o más conservadores. Los agentes dispersantes o agentes humectantes o agentes suspensores apropiados son ejemplificados por los ya mencionados anteriormente. Otros excipientes, por ejemplo agentes endulzantes, saborizantes y colorantes, también pueden estar presentes. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de ellos. Los agentes emulsificantes apropiados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo goma acacia o goma tragacanto, fosfátidos de origen natural, por ejemplo frijol de soya, lecitina, y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes endulzantes y saborizantes. Esa suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, usando aquellos agentes dispersantes o humectantes y agentes suspensores apropiados que han sido mencionados anteriormente. Una preparación estéril inyectable también puede ser una solución estéril inyectable o suspensión en un diluyente o solvente no tóxico aceptable parenteralmente, por ejemplo una solución en 1 ,3-butanodiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como solvente o como medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite blando fijo, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Adicionalmente, los ácidos grasos tales como ácido oleico, encuentran uso en la preparación de inyectables. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden administrar a un sujeto en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico total. El uso de compuestos múltiples para tratar un indicio puede aumentar los efectos beneficiosos al tiempo que reduce la presencia de efectos secundarios.

Alternativamente, algunas moléculas de ANsi de la invención pueden ser expresadas dentro de las células de promotores eucarióticos. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ANsi pueden ser suministrados y persistir en las células objetivo. Alternativamente, se puede usar vectores que proporcionan expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Estos vectores pueden ser administrados repetidamente según sea necesario. Una vez expresada, la molécula de ANsi ineractúa con el ARNm objetivo y genera una respuesta de 1ARN. El suministro de vectores que expresan molécula de ANsi puede ser sistémico, por ejemplo mediante administración intravenosa o intra-muscular, mediante administración a células objetivo explantadas de un sujeto seguida por reintroducción en el sujeto, o mediante cualquier otro medio que pudiera permitir la introducción en la célula objetivo deseada. Administración intranasal de ANsi. Se llevaron a cabo estudios de administración intranasal de ANsi en ratones C57BL/6-TG con GFP (ACTB-EGFP). Esta línea de ratón transgénico se adquirió en "The Jackson Laboratory". Se han estado usando ratones transgénicos porque los ratones homocigotos para este transgen mueren dentro del periodo de las primeras dos semanas después del nacimiento. La línea de ratón transgénico con un cADN de GFP (EGFP) "mejorado" bajo el control de un promotor beta-actina de pollo y citomegalovirus mejorador hace que todos los tejidos, con la excepción de eritrocitos y cabello, aparezcan verdes bajo la excitación luminosa. Esta variedad se generó en ratones C57BL/6. La variedad mejorada con cADN que codifica proteína verde fluorescente (EGFP) se unió al promotor beta actina de pollo y al mejorador citomegalovirus. También se incluyó una señal de poliadenilación de globina bovina en la construcción. Los sitios EcoRI incluidos en los sensibilizadores para PCR se usaron para introducir el cADN de EGFP amplificado en un vector de expresión de pCAGGS que contiene el promotor beta-actina de pollo y mejorador citomegalovirus, intrón beta-actina y señal de poli-adenilación de globina bovina. El inserto completo con el promotor y secuencia codificadora fue eliminado con Bam-HI y Salí y purificado con gel. El ARNsi utilizado para regular hacia abajo la expresión de ARNm de EGFP apuntó a la siguiente secuencia en ARNm de EGFP (SEQ ID 319): 5'-GGC UAC GUC CAG GAG CGC ACC-3*. La cadena en sentido directo del ARNsi dúplex fue 5'-P GGC UAC GUC CAG CGC ACC-3' y la cadena en sentido inverso fue 5'-P U GCG CUC CUG GAC GUA GCC UU-3" (SEQ ID 320). El dúplex de ARNsi usado en los experimentos descritos más adelante tenía 2 proyecciones de timidina en el nucleótído 3'. Protocolo experimental Para los experimentos de administración intranasal C57BL/6-TG (ACTB-EGFP) se usaron ratones machos (8 semanas de edad). Los ratones instilados intranasalmente con ARNsi diluido en NaCI 0.9% fueron comparados con ratones de control instilados con el vehículo (NaCI 0.9%). Los animales se anestesiaron con isoflurano y 20 µ? de cada solución se instiló en cada ventana nasal. Diferentes dosis de ARNsi contra ARNm de EGFP (-/+' lípido de transfección) se administraron intranasalmente en un volumen final de 20 µ?. Los animales de control se trataron con el vehículo solo. En todos los casos los animales se sacrificaron en un intervalo de días después de la administración del fármaco con el fin de encontrar el momento óptimo para interferencia. Para el análisis de tejidos los ratones fueron sacrificados con C02 y los cerebros fueron disecados rápidamente en una placa enfriada con hielo. La mitad se procesó por inmunodetección Western, mientras que la otra mitad se procesó por inmnohistoquímica. Los tejidos de muestra se recolectaron de diferentes áreas cerebrales y se analizaron mediante inmunodetección Western y PCR en tiempo real. La expresión de GPF en las diferentes condiciones de tratamiento se midió con la ayuda del programa Adobe Photoshop. Los niveles de inhibición se obtuvieron después de normalización con respecto al gen beta-actina, el cual es expresado constitutivamente en los diferentes tejidos. Las condiciones experimentales estuvieron distribuidas como se describe en la Tabla 1 (las condiciones se analizaron por duplicado o por triplicado). Los ratones tratados intranasalmente con una dosis de 530 ug (40 nanomoles) del ARNsi desnudo para GFP fueron nombrados ratones 1, 2 y 3 y se sacrificaron a los 3 y 5 días después de la inoculación de ARNsi. Otro grupo experimental (numerados 4, 5, 6, 7, 8 y 9) estuvo constituido por animales tratados con dos dosis de 265 ug (20 nanomoles) de ARNsi estabilizado y se sacrificaron a los 3, 5 y 8 días (Tabla 1). Los tejidos de muestra se recolectaron mediante dos métodos: uno en medio para lisis con amortiguador de proteína y el otro en RNAIater (Ambion). Luego de esto se incluyeron pedazos pequeños de tejido en OCT con el fin de analizar la señal de inmunofluorescencia de proteína GFP en el tejido. Todas las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el procesamiento de los datos. Tabla 1: Distribución esquemática de condiciones experimentales para suministro intranasal de ARNsi. Las dosis de ARNsi se indican en la tabla. Número de ratón Tratamiento terapéutico intranasal Cl, Cll, Clll Dosis de control de vehículo 1, 2, 3 Dosis única de 530 ug de ARNsi 4, 5 Dosis única de 265 ug de ARNsi sacrificados a los 3 días 6, 7 Dosis única de 265 ug de ARNsi sacrificados a los 5 días 8,9 Dosis única de 265 ug de ARNsi sacrificados a los 8 días Los extractos para análisis de inmunodetección Western se prepararon homogeneizando las áreas cerebrales en amortiguador para extracción enfriado en hielo constituido por HEPES 20 mM, pH 7.4, NaCI 100 mM, NaF 20 mM, Tritón X-100 al 1%, ortovanadato de sodio 1 mM, EDTA 5 mM, ácido ocadaico 1 µ? e inhibidores de proteasa (PMSF 2 mM, 10 pg/ml de aprotinina, 10 pg/ml de leupeptina, y 10 pg/ml de pepstatina). Las muestras fueron homogenizadas y centrifugadas a 15,000 X g durante 20 min a 4°C. La proteína contenida en el sobrenadante fue determinada por Bradford. Treinta microgramos de proteína total fueron separados por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio al 10%-poliacrilamida y transferidos a membranas de nitrocelulosa. El anticuerpo primario para detectar el transgen fue el anticuerpo EGFP (1/1000) (Sigma) y anti- -actina (1/2500) (Sigma). Las membranas se incubaron con los anticuerpos a 4°C de un día para otro en leche en polvo descremada al 5%. Un anticuerpo anti-ratón de cabra secundario (1/1000; Invitrogen, San Diego, CA) y Reactivos para detección ECL (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL) se usaron para la inmunodetección. Los niveles de proteína fueron cuantif icados mediante densitometría y los valores de las GFP fueron normalizados con respecto a la actina para corregir cualquier desviación en las cantidades de proteína cargadas.

Los cerebros para inmunohistoquímica se fijaron en paraformaldehido al 4% en amortiguador de Sorensen de un día para otro y fueron crioprotegidos en solución de sacarosa al 30%. Los cerebros se cortaron en treinta secciones sagitales micrométricas en un micrótomo con congelación (Leica, Nussloch, Alemania) y se recolectaron en una solución crioprotectora constituida por etilen glicol al 30%, glicerol al 26% y amortiguador fosfato, pH 7.2. Luego, las secciones de cerebro se analizaron mediante microscopía con fluorescencia. Los tejidos aislados en RNAIater se almacenaron a -80 °C. se eliminó el RNAIater antes de la extracción del ARN debido a su densidad. El ARN se aisla con el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, El tratamiento con ADNsa se realiza bajo la medición de la expresión de GPF mediante PCR cuantitativa. La aplicación de ARNsi se hace con el fin de determinar si tiene lugar el suministro de ARNsi al cerebro. Dado que el objetivo es determinar la regulación hacia abajo del transcripto del gen de GFP, se midieron los niveles de fluorescencia luego de la aplicación del ARNsi. No se observaron efectos secundarios en los animales a lo largo de los protocolos experimentales. Resultados Modelo de suministro al Sistema Nervioso Central in vivo Ejemplo 1.

La aplicación de ARNsi se realizó con el fin de determinar el suministro intranasal apropiado de ARNsi en el Sistema Nervioso Central (SNC). Los ratones tratados con 20 µ? de NaCI (0.9%) (control), o con 20 µ? de ARNsi en una concentración de 1 nmol/µ? (Ratón 1), 2 nmol/µ? (Ratón 2), o 2 nmol/µ? + Lípido de transfección TransIT-TKO (Ratón 3), fueron sacrificados 48 h después del tratamiento. No se observaron efectos secundarios en los animales durante los protocolos experimentales. Muestras de diferentes regiones del SNC (córtex, hipocampo, estriado o bulbo), así como también de diferentes tejidos (tráquea, pulmón, epitelio nasal, esófago) fueron extraídas, y analizadas adicionalmente por inmunodetección Western con anticuerpos que reconocen específicamente GFP e inmunofluorescencia como se describió anteriormente. Como control de carga, se usaron anticuerpos contra beta-actina. Los resultados de los niveles de inhibición en la expresión de GFP en diferentes regiones del SNC, después de normalización con respecto a beta-actina, se presentan en la Figura 1. Como puede observarse, el mayor efecto inhibidor se obtuvo con la dosis de 2 nmol/µ?, sin lípido de transfección. Adicionalmente, se observó inhibición en diversos tejidos del SNC, incluyendo el córtex, hipocampo, estriado, y bulbo. Este resultado también fue confirmado mediante PCR en tiempo real. Ejemplo 2 Diferentes concentraciones y programación de administración intranasal de ARNsi se utilizaron en modelos de ratón con GFP. Los ratones tratados con 20 µ? de NaCI (0.9%) (control), o con 20 µ? de ARNsi en una concentración de 40 nmol o 20 nmol, fueron sacrificados a los 3, 5, y 8 días después del tratamiento. No se observaron efectos secundarios en los animales durante los protocolos experimentales. Muestras de diferentes regiones del SNC (córtex, hipocampo, estriado, cerebelo, tallo cerebral o bulbo) fueron extraídas, y adicionalmente se analizaron por medio de inmunodetección Western e inmunofluorescencia con anticuerpos que reconocen específicamente GFP. Como control de carga, se usaron anticuerpos contra beta-actina. Los resultados de los niveles de inhibición en la expresión de GFP en diferentes regiones del SNC, después de la normalización con respecto a beta-actina, se presentan en la Figura 2. Como puede observarse, el efecto inhibidor dependió del área cerebral. El máximo silenciamiento de GFP se observó en el córtex, el hipocampo, el estriado y el bulbo. Los resultados de los experimentos de inmunodetección Western fueron confirmados mediante PCR cuantitativa (Figura 3). En la Figura 3 la regulación hacia abajo de los niveles de ARNm de GFP fueron analizados en córtex y estriado y se observó una clara reducción de estos niveles en las condiciones de ratón 8 y 9. Ejemplo 3. Pruebas de dúplex de ARNsi con MAPT in vitro.

Para verificar la especificidad de los ARNsi, se analizó la interferencia de MAPT (proteína tau asociada al micro túbulo) en cultivos de células que expresan MAPT. Las células utilizadas para estos experimentos fueron células MDA-MB-435. Los niveles de ARNm de MAPT se analizaron después de incubación con el correspondiente dúplex de ARNsi. Para ligar el ARNsi inactivado genéticamente a fenotipos específicos en células cultivadas, es necesario demostrar la disminución de la proteína apuntada o al menos demostrar la reducción del ARNm apuntado. Transfección de dúplex de ARNsi en cultivos de células Varios ejemplos de técnicas para transfección de ARNsi son bien conocidos en la técnica. La transfección de dúplex de ARNsi consiste en una sola transfección de ARNsi dúplex usando un lípido catiónico, tales como Reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y realizar una lectura para el silenciamiento 24, 48 y 72 horas después de la transfección. Un protocolo de transfección típico se puede realizar como sigue: Para un receptáculo de una placa de 6 receptáculos, transfectamos usando 100 nM para células MDA-MB-435 humanas como concentración final de ARNsi. Siguiendo el protocolo del reactivo Lipofectamina 2000, el día anterior a la transfección, sembramos 2-4 x 105 células por receptáculo en 3ml de un medio de crecimiento apropiado, que contenía DMEM, 10% de suero, antibióticos y glutamina, y se incubaron las células bajo condiciones de crecimiento normales (37°C y 5% C02). El día de la transfección, las células tenían que tener una confluencia de 30-50%. Diluimos 12.5 ul de ARNsi dúplex 20 uM (correspondiente a 100 nM de concentración final) o 25ul de ARNsi dúplex 20 uM (correspondiente a 200 nM de concentración final) en 250 ul de DMEM y mezclamos. También, 6ul de Lipofectamina 2000 se diluyeron en 250 ul de DMEM y se mezclaron. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, el oligómero diluido (ARNsi dúplex) y la lipofectamina diluida se combinan para permitir la formación de complejo durante 20 minutos de incubación a temperatura ambiente. Posteriormente, añadimos los complejos por goteo a las células con 2 mi de medio de crecimiento fresco bajo en antibióticos y mezclamos suavemente agitando la placa hacia adelante y hacia atrás, para asegurar la distribución uniforme de los complejos de transfección. Incubamos las células bajo sus condiciones de crecimiento normales y el día siguiente se retiran los complejos y se les añade medio de crecimiento fresco y completo. Para vigilar el silenciamiento genético, se recolectan las células a las 24, 48 y 72h después de la transfección. La eficiencia de transfección puede depender del tipo de célula, pero también del número de pases y la confluencia de las células. El tiempo y la manera de formación de complejos de ARNsi-liposoma (por ejemplo inversión contra efecto de vórtice) también son críticos. Las bajas eficiencias de transfección son la causa más frecuente de silenciamiento no exitoso. La buena transfección no es un aspecto trivial y se tiene que examinar cuidadosamente para cada nueva línea celular que se vaya a usar. La eficiencia de transfección se puede probar transfectando genes informadores, por ejemplo un plásmido con expresión de EGFP dirigido por CMV (por ejemplo de Clontech) o un plásmido con expresión de B-Gal, y luego evaluarse por contraste de fase y/o microscopía de fluorescencia al día siguiente. Dependiendo de la abundancia y el tiempo de vida (o rotación) de la proteína apuntada, puede hacerse evidente un fenotipo inactivado genéticamente después de 1 a 3 días, o aún posteriormente. En los casos en donde no se observa ningún fenotipo, se puede observar el agotamiento de la proteína mediante inmunofluorescencia o inmunodetección Western. Después de las transfecciones, las fracciones de ARN total extraídas de las células fueron tratadas previamente con DNasa I y utilizadas para transcripción inversa usando un cebador aleatorio. La PCR amplificada con un par cebador específico cubre al menos una unión exón-exón con el fin de controlar la amplificación de los pre-ARNm. La RT/PCR de un ARNm no apuntado también es necesaria como control. El agotamiento efectivo de la reducción todavía indetectable del ARNm de una proteína objetivo puede indicar que es posible que exista un depósito grande de proteína estable en la célula. Alternativamente, se puede usar amplificación por PCR en tiempo real para probar en una forma más precisa la disminución o desaparición del ARNm. La PCR cuantitativa vigila la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción de amplicón durante cada ciclo de PCR. Esta señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en una reacción. Registrando la cantidad de emisión de fluorescencia en cada ciclo, es posible vigilar la reacción de PCR durante la fase exponencial en donde el primer aumento significativo en la cantidad de producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial de plantilla objetivo. Para verificar el patrón de interferencia del gen MAPT expresado diferencialmente en los cultivos celulares, se realizó una qRT-PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). Las condiciones de la reacción fueron establecidas por Applied Biosystems 7300 y se realizó un paso de la reacción RT-PCR. El volumen de reacción de 25 ul consiste en 2X SyBr verde, 6.25 U de transcriptasa inversa MultiscribeTM , inhibidor de RNasa y 50 nM de cebadores directo e inverso mezclados con 100 ng del ARN plantilla. Se diseñaron cebadores específicos para MAPT y se analizó 18S como gen de mantenimiento. El sensibilizador directo tuvo la secuencia: AAGAGCCGCCTGCAGACA (SEQ ID NO 321) mientras que el sensibilizador inverso tuvo la secuencia GAGCCGATCTTGGACTTGACA (SEQ ID NO 322). La transcripción inversa se llevó a cabo con un paso inicial de 30' a 48 °C. Los parámetros de ciclado térmico fueron 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 15 seg y 60 °C durante 1 min. También se analizaron las curvas de disociación para determinar la especificidad de amplificación verificada. Los valores del ciclo umbral (Ct) de cada muestra se compararon con la muestra control de 24h para determinar el porcentaje de regulación hacia abajo de cada gen después de la transfección con ARNsi. Con el fin de evaluar la especificidad del producto de PCR amplificado se realizó un análisis de curva de fusión. Las curvas de fusión resultantes permiten la discriminación entre cebador-dímeros y el producto de PCR específico. Análisis in vitro para ARNsi de MAPT. Para determinar la inhibición de MAPT diana usando tecnología de ¡ARN, el primer paso fue realizar experimentos en cultivos de células MDA-MB-435. Estos análisis se realizaron en dos partes. Primero, los ARNsi diseñados contra las mutaciones MAPT descritas en la Figura 7 fueron transfectados. Posteriormente, se diseñaron ARNsi contra MAPT de tipo natural y se analizó la regulación hacia abajo de MAPT después de la transfección. La figura 4 muestra resultados representativos de los experimentos con PCR cuantitativa para algunas de las mutaciones de MAPT descritas previamente en la Figura 7. La Figura 8 muestra las secuencias objetivo en MAPT (SEQ ID NO 1-160) contra las cuales fueron diseñados los ANsi. Los dúplex de ANsi se proporcionan como SEQ ID NO 161-318. Los ARNsi diseñados contra las mutaciones de MAPT P301L (región objetivo dada como Seq ID 159) y MAPT R406W (región objetivo dada como Seq ID 160) para regular hacia abajo los niveles de ARNm de MAPT se analizaron. Los valores que se muestran en la Figura 4 representan la media del porcentaje de interferencia de ARNsi sobre la expresión genética una vez normalizada con las células de control y sus desviaciones estándar. En comparación con las células de control, el nivel del transcripto MAPT a las 48h se redujo en un 20% después del tratamiento con ARNsi Seq ID 159 (específico para MAPT P301L). Sin embargo, la reducción de MAPT con la transfección de ARNsi Seq ID 160 (específico para MAPT R406W) alcanzó hasta 40% sobre los niveles de control. En una segunda ronda de experimentos diferentes se diseñaron ARNsi dirigidos a MAPT wt. Debido a que la MAPT tiene diferentes isoformas, se llevó a cabo una alineación de secuencia y se diseñaron ARNsi para la región común. Los números de acceso de las Secuencias de Referencia de las isoformas MAPT están indicados como NM_005910, NM_016834, NM_016835 y NM_016841. Dos diferentes ARNsi para MAPT wt, correspondientes a la Seq ID 128 y a la Seq ID 139 fueron transfectados en células MDA-MB-435. La Figura 5 siguiente muestra resultados representativos de análisis cuantitativos de PCR. Los valores representan la media del porcentaje de interferencia de ARNsi sobre cada expresión genética una vez normalizados con las células de control y sus desviaciones estándar. En comparación con las células de control, el nivel de transcripto MAPT a las 24, 48 o 72h fue significativamente reducido después del tratamiento con ARNsi específico. El ARNsi correspondiente a la Seq ID 128, redujo el transcripto MAPT en un 70% siendo muy sostenida esta reducción a lo largo de 48h y 72 h. El ARNsi Seq ID 129 también alcanzó un nivel muy bueno de regulación hacia abajo de MAPT aproximadamente 60% en comparación con las células con transfección simulada. Ejemplo 4. Pruebas de ARNsi dúplex de MAPT in vivo. Con el fin de proporcionar una prueba de concepto de la administración intranasal en un modelo patológico, se reguló hacia abajo el MAPT involucrado en demencia fronto-temporal demencia en un modelo apropiado de ratón transgénico con MAPT. Descripción de la variedad de ratón Para la generación de ratones transgénicos con MAPT un plásmido pSGT42 (Montejo de Garcini et al., 1994) que codifica una isoforma tau humana de 4 repeticiones con dos exones en el terminal N se usó como una plantilla para introducir las mutaciones G272V y P301 L en FTDP-17 por separado con el procedimiento Quikchange (Stratagene). Luego se ensambló un cADN mutante tau triple mediante ligación de los fragmentos de restricción Sacll/Asel (que contienen la mutación G272V) y Asel/Hindlll (que contienen la mutación P301L) en el plásmido pSGTR406W (Pérez, M . , Lim, F., Arrásate, M . , y Avila, J. (2000). La mutación R406W ligada a FTDP-17 abóle la interacción entre tau fosforilada y los micro túbulos. J. Neurochem. 74: 2583-2589) previamente cortados con Sacl l/Hind¡TI para dar origen al plásmido pSGTVLW. El marco de lectura abierto de tau mutante fue eliminado de pSGTVLW como un fragmento BamHI/BglII y ligado en el sitio BamHI de PBKCMV (Stratagene) en la orientación directa con respecto al promotor CMV para producir pBKVLW. El fragmento Sall/Xhol de pB KVLW fue ligado entonces en el sitio Xhol de pTSC21k (Luthi et al., 1997) en la orientación directa con respecto al promotor thyl. Se confirmó que el plásmido resultante pTTVLW codifica los tres cambios de aminoácidos específicos G272V, P301L, y R406W mediante secuenciación de la región Sacll-Hindlll. Las secuencias de vector fueron eliminadas mediante digestión Notl y purificación en gel del fragmento grande, el cual fue introducido luego por inyección pronuclear en embriones CBA 3C57BL/6 con una sola célula. Los ratones fundadores fueron identificados por PCR y cruzados con ratones C57BL/6 de tipo natural. Todos los ratones transgénicos analizados fueron heterocigotos. Los ratones fueron alojados cuatro por jaula con alimento y agua disponibles ad Iibitum y se mantuvieron en un ambiente con temperatura controlada en un ciclo de luz del día-oscuridad de 12/12 h, con inicio de la luz a las 07:00 h. La exploración por PCR se realizó en ADN de cola usando los oligonucleótidos TT1, 5'- CTCTGCCCTCTGTTCTCTGG-3' (SEQ ID 323, en el exón 2 del gen thyl murino); TT2, 5'-CCTGTCCCCCAACCCGTACG-3' (SEQ ID 324; en el extremo 59 del cADN de tau humana); y THY, 5'-CGCTGATGGCTGGGTTCATG-3' (SEQ ID 325; en el intrón 2 del gen thyl murino). Utilizamos TT1 y TT2 para amplificar un producto de 470-bp específicamente del transgen y no del ADN endógeno murino, mientras que como control interno para el ADN, se usaron TT1 y THY para amplificar un producto de 450-bp específicamente de ADN genómico murino, pero no del transgen. Los transgenes fueron expresados predominantemente en el hipocampo y en el córtex fronto temporal. Protocolo experimental Diferentes concentraciones y programaciones de administración intranasal de ARNsi se usaron en modelos de ratón transgénico con MAPT. Los ratones se trataron con 20 µ? de NaCI (0.9%) (control), o con 20 µ? ARNsi en una concentración de 20 nmol. Las condiciones experimentales estuvieron distribuidas como se describe en la Tabla 2 (las condiciones fueron analizadas por triplicado). Los ratones fueron tratados intranasalmente con una o dos dosis del ARNsi para MAPT (Seq ID 160) y se sacrificaron en diferentes momentos después de las inoculaciones de ARNsi. Tabla 2. Distribución esquemática de condiciones experimentales para suministro intranasal de ARNsi. Las dosis de ARNsi se indican en la tabla.

Muestras de diferentes regiones del SNC (córtex, hipocampo, estriado, cerebelo, tallo cerebral o bulbo) fueron extraídas, y analizadas adicionalmente por inmunodetección Western, inmunofluorescencia y PCR cuantitativa. Se emplearon anticuerpos que reconocen específicamente la MAPT humana mutada. Como control de carga, se usaron anticuerpos contra beta-actina. La expresión de MAPT en las diferentes condiciones de tratamiento se midió con la ayuda del programa Adobe Photoshop. Los niveles de inhibición se obtuvieron después de normalización con respecto al gen beta-actina, el cual es expresado constitutivamente en los diferentes tejidos.

Los resultados de los niveles de expresión de la inhibición de MAPT en diferentes regiones del SNC, después de la normalización con respecto a beta-actina, se presentan en la Figura 6. Como puede observarse, el efecto inhibidor sobre la expresión de MAPT se observó en el hipocampo, en donde la proteína transgénica se expresó en altos niveles. Las condiciones de los animales en las cuales la regulación hacia abajo de la expresión genética fue más alta correspondieron a los animales sacrificados a los 7 días después de la instilación del ARNsi. Los resultados de los experimentos de inmunodetección Western fueron confirmados mediante PCR cuantitativa.

REFERENCIAS Akashi H, Miandagishi M, Taira K, Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2001, 11 (6):359-67. Banerjee D, Slack F. Control of developmental timing band small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioessaands, 2002, 24(2): 119-29. Bosher JM, Labouesse M. RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol, 2000, 2(2):E31-6. Caplen, NJ., Parrish, S., Imani, F., Fire, A. & Morgan, R.A. Specific inhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertébrate systems. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2001, 98:9742-9747. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22- nucleotide RNAs. Genes Dev, 2001, 15(2):188-200. Fire A, Xu S, Montgomerand MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391(6669):806-11. Gil J, Esteban M. Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action. Apoptosis, 2000, 5(2):107-14. Grosshans H, Slack FJ. Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol, 2002, 156(1 ):17-21. Hardand, J & Selkoe, D. J. The Amyloid Hypothesis of Alzheimer's Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics. Science, 2002; Vol. 297. no. 5580, pp. 353-356. Houlden, H . , Baker, ., Morris, H.R., et al. Corticobasal degeneration and progressive supranuclear palsy share a common tau haplotype. Neurology, 2001; 56:1702- 706. Hutton, M . , Lendon, C. L. , Rizzu P., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature, 1998; 393:702-705. Krutzfeldt J, Rajewskand N, Braich R, Rajeev KG, Tuschl T, Manoharan M, Stoffel M. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 2005, 438(7068):685-9. Lee VM, Goedert M, Trojanowski JQ. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci., 2001;24:1121-59. Lewis, J., Dickson, D. W., Lin, W., et al. Enhanced NeurofibrillaryDegeneration in Transgenic Mice Expressing Mutant Tau and APP. Science, 2001; 293. no. 5534, pp. 1487-1491. Miller VM, Gouvion CM, Davidson BL, Paulson HL.

Targeting Alzheimer's disease genes with RNA interference: an efficient strategy for silencing mutant alíeles. Nucleic Acids Res., 2004 Jan 30;32(2):661 -8. Miller VM, Xia H, Marrs GL, Gouvion CM, Lee G, Davidson BL, Paulson HL. Alíele- specific silencing of dominant disease genes. Proc Nati Acad Sci U S A, 2003 Jun 10.100(12):7195-200. Mullan M, Crawford F, Axelman K, Houlden H, Lilius L, Winblad B, Lannfelt L. A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the APP gene at the N- terminus of beta-amyloid. Nat Genet., 1992 Aug; 1 (5):345-7. Oddo S, Caccamo A, Shepherd JD, Murphand MP, Golde TE, Kaanded R, Metherate R, Mattson MP, Akbari Y, LaFerla FM. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron, 2003;39(3):409-2 . Paddison PJ, Caudand AA, Bernstein E, Hannon GJ, Conklin DS. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev, 2002, 16(8):948-58. Poorkaj P, Bird TD, Wijsman E, Nemens E, Garruto R , Anderson L, Andreadis A, Wiederholt WC, Raskind M, Schellenberg GD. Tau is a candidate gene for chromosome 17 frontotemporal dementia. Ann Neurol., 1998 Jun;43(6):815-25. Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R, Bartel DP, Sharp PA.

Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev., 1999; 13(24):3191 -7. Wiannand F, Zernicka-Goetz M. Specific interference with gene function by double- stranded RNA in early mouse development, Nat Cell Biol., 2000, 2(2):70-5.

Williams BR. Role of the double-stranded RNA-acti ated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans, 1997, 25(2):509-13.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de un compuesto que produce interferencia de ARN en la preparación de un medicamento para el tratamiento efectivo de un trastorno del sistema nervioso central (SNC), en donde el medicamento está formulado para administración intranasal. 2. El uso de la reivindicación 1, caracterizado además porque el compuesto produce interferencia de ARN en un gen expresado en el SNC. 3. El uso de la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el trastorno es demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, así como también enfermedades congénitas asociadas con mutaciones de genes del SNC. 4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo con niveles alterados y/o mutaciones en un paciente que necesita de tratamiento. 5. El uso de la reivindicación 4 caracterizado además porque el gen objetivo es seleccionado de tau, huntingtina, acetilcolinesterasa, o un alelo mutado de estos genes. 6. El uso de la reivindicación 5 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un alelo mutado del gen objetivo. 7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado además porque la expresión del gen objetivo es modulada en una célula. 8. El uso de la reivindicación 7 caracterizado además porque la expresión del gen objetivo es modulada en una célula del SNC. 9. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto es ANsi. 10. El uso de la reivindicación 9 caracterizado además porque el ANsi es ARNsi. 11. El uso de la reivindicación 9 caracterizado además porque el ANsi es ARNds. 12. El uso de la reivindicación 9 caracterizado además porque el ANsi es ARNsh. 13. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula los niveles de ARNmi. 14. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto incluye un oligonucleótido modificado. 15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 12 caracterizado además porque el ANsi tiene una longitud de 40 pares de base o menos. 16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 12 caracterizado además porque el ANsi tiene proyecciones 3'. 17. El uso de la reivindicación 16 caracterizado además porque las proyecciones 3' son dinucleótidos. 18. El uso de la reivindicación 17 caracterizado además porque las proyecciones de dinucleótido están elaboradas de nucleótidos de timidina. 19. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque se usa una pluralidad de especies de compuesto. 20. El uso de la reivindicación 19 caracterizado además porque dicha pluralidad de especies están dirigidas a la misma especie de ARNm. 21. El uso de la reivindicación 19 caracterizado además porque dicha pluralidad de especies están dirigidas a diferentes especies de ARNm. 22. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, o una enfermedad congénita asociadas con mutaciones de genes del SNC. 23. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en demencia. 24. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedad de Alzheimer. 25. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedad de Huntington. 26. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedad de Parkinson. 27. El uso de cualquier reivindicación precedente caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedades congénitas asociadas con mutaciones de genes del SNC. 28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 22 hasta 27 caracterizado además porque el gen objetivo es tau. 29. El uso de la reivindicación 28, caracterizado además porque el ANsi es dirigido contra una región de secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 1 hasta 160. 30. El uso de la reivindicación 28, caracterizado además porque el ANsi tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 161 hasta 318. 31. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 22 hasta 27 caracterizado además porque el gen objetivo es huntingtina. 32. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 22 hasta 27 caracterizado además porque el gen objetivo es acetilcolinesterasa. 33. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 22 hasta 27 caracterizado además porque el gen objetivo es un alelo mutado de un gen seleccionado de tau, huntingtina, o acetilcolinesterasa. 34. Uso de un compuesto que produce interferencia de ARN en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del SNC, caracterizado además porque el compuesto se administra intranasalmente a un paciente. 35. Uso de la reivindicación 34 caracterizado además porque el compuesto produce interferencia de ARN en un gen expresado en el SNC. 36. Uso de la reivindicación 34 caracterizado además porque el compuesto produce interferencia de ARN en un gen seleccionado de tau, huntingtina, o acetilcolinesterasa, o alelos mutados de estos genes. 37. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34 hasta 36 caracterizado además porque el trastorno del SNC es demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, o una enfermedad congénita asociadas con mutaciones de genes del SNC entre otros. 38. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34 hasta 37 caracterizado además porque el compuesto es ARNds, ARNsi o ARNsh . 39. Una composición farmacéutica comprende uno o una pluralidad de ANsi dirigido a un gen expresado en el SNC, formulada para administración intranasal. 40. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno del SNC que comprende un compuesto que produce interferencia de ARN en un gen expresado en el SNC, formulada para administración intranasal. 41. La composición de la reivindicación 39 o 40 caracterizado además porque el gen es expresado específicamente en el SNC. 42. Un método efectivo para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central (SNC), que comprende administrar un compuesto que produce interferencia de ARN intranasalmente a un paciente. 43. El método de la reivindicación 42, caracterizado además porque el compuesto produce interferencia de ARN en un gen expresado en el SNC. 44. El método de la reivindicación 42 o 43, caracterizado además porque el trastorno es demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, así como también enfermedades congénitas asociadas con mutaciones de genes del SNC. 45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 to 44 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo con niveles alterados y/o mutaciones en un paciente que necesita de tratamiento. 46. El método de la reivindicación 45 caracterizado además porque el gen objetivo es seleccionado de tau, huntingtina, acetilcolinesterasa, o un alelo mutado de estos genes. 47. El método de la reivindicación 46 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un alelo mutado del gen objetivo. 48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 to 47 caracterizado además porque la expresión del gen objetivo es modulada en una célula. 49. El método de la reivindicación 48 caracterizado además porque la expresión del gen objetivo es modulada en una célula del SNC. 50. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 to 49 caracterizado además porque el compuesto es ANsi. 51. El método de la reivindicación 50 caracterizado además porque el ANsi es ARNsi. 52. El método de la reivindicación 50 caracterizado además porque el ANsi es ARNds. 53. El método de la reivindicación 50 caracterizado además porque el ANsi es ARNsh. 54. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 53 caracterizado además porque el compuesto modula los niveles de ARNmi. 55. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 54 caracterizado además porque el compuesto incluye un oligonucleótido modificado. 56. El método de cualquiera de las reivindicaciones 50 hasta 53 caracterizado además porque el ANsi tiene una longitud de 40 pares de base o menos. 57. El método de cualquiera de las reivindicaciones 50 hasta 53 caracterizado además porque el ANsi tiene proyecciones 3'. 58. El método de la reivindicación 57 caracterizado además porque las proyecciones 3' son dinucleótidos. 59. El método de la reivindicación 58 caracterizado además porque las proyecciones de dinucleótido están elaboradas de nucleótidos de timidina. 60. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 59 caracterizado además porque se usa una pluralidad de especies de compuesto. 62. El método de la reivindicación 60 caracterizado además porque dicha pluralidad de especies están dirigidas a la misma especie de ARNm. 63. El método de la reivindicación 60 caracterizado además porque dicha pluralidad de especies están dirigidas a diferentes especies de ARNm. 64. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 62 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en demencia, Enfermedad de Alzheimer, de Huntington y/o de Parkinson, o una enfermedad congénita asociada con mutaciones de genes del SNC. 64. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 63 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en demencia. 65. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 64 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedad de Alzheimer. 66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 65 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedad de Huntington. 67. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 66 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedad de Parkinson. 68. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 67 caracterizado además porque el compuesto modula la expresión de un gen objetivo involucrado en enfermedades congénitas asociadas con mutaciones de genes del SNC. 69. El método de cualquiera de las reivindicaciones 63 to 68 caracterizado además porque el gen objetivo es tau. 70. El uso de la reivindicación 69, caracterizado además porque el ANsi es dirigido contra una región de secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 1 hasta 160. 71. El uso de la reivindicación 69, caracterizado además porque el ANsi tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 161 hasta 318. 72. El método de cualquiera de las reivindicaciones 63 to 68 caracterizado además porque el gen objetivo es huntingtina. 73. El método de cualquiera de las reivindicaciones 63 to 68 caracterizado además porque el gen objetivo es acetilcolinesterasa . 74. El método de cualquiera de las reivindicaciones 63 to 73 caracterizado además porque el gen objetivo es un alelo mutado de un gen seleccionado de tau, huntingtina, o acetilcolinesterasa. 75. Un método para reducir la expresión de un gen objetivo en el SNC de un mamífero no humano, comprende administrar por vía intranasal un compuesto que produce interferencia de ARN en dicho gen objetivo para dicho mamífero no humano. 76. El método de la reivindicación 75 caracterizado además porque el gen objetivo se expresa en niveles normales en el mamífero no humano, y el compuesto se administra para la investigación de la función de dicho gen.