BR112020018365A2 - Oligonucleotídeos modificados e métodos para uso em tauopatias - Google Patents

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Saúl Martinez Montero
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Abstract

oligonucleotídeos modificados e métodos para uso em tauopatias. a presente invenção refere-se a oligonucleotídeos que compreendem modificações na(s) posição(ões) 2' e/ou 3' juntamente com métodos para produção e uso contra a doença de alzheimer e outras tauopatias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "OLIGO-
NUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS E MÉTODOS PARA USO EM TAUOPATIAS". ANTECEDENTES
[001] As terapias de oligonucleotídeos antissenso têm sido con- sideradas para o tratamento ou prevenção de várias doenças e condi- ções, tais como doenças virais, doenças neurológicas, doenças neu- rodegenerativas, doenças fibróticas e doenças hiperproliferativas.
[002] As doenças neurodegenerativas associadas à agregação patológica da proteína tau em emaranhados neurofibrilares ou gliofibri- lares no cérebro humano são conhecidas como tauopatias. Os emara- nhados são compostos de proteína tau associada a microtúbulo hiper- fosforilado, agregada em uma forma insolúvel. Os emaranhados neu- rofibrilares (NFT) podem levar à morte neuronal e, portanto, ser um fator causal primário em tauopatias, incluindo a doença de Alzheimer.
[003] A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenera- tiva cerebral crônica e é responsável por 50 a 70% de todos os casos de demência. Aproximadamente 47 milhões de pessoas em todo o mundo vivem com demência e estima-se que o número aumente para 131 milhões em 2050. Apenas os tratamentos sintomáticos estão dis- poníveis e ilustram a necessidade de encontrar terapias modificadoras da doença que retardam ou mesmo interrompem a progressão da do- ença.
[004] Patologicamente, a DA é caracterizada pelo acúmulo anor- mal de placas β amiloide extracelulares e a formação intracelular de NFTs que consistem em proteínas tau hiperfosforiladas. Tau é uma proteína associada a microtúbulo (MAP) codificada pelo gene MAPT. A localização e a intensidade do acúmulo de NFT se correlacionam for- temente com o declínio cognitivo na DA, e as mutações no gene MAPT causam demência frontotemporal com Parkinsonismo (FTD).
Esses fatos apoiam o desenvolvimento de terapias à base de tau. Re- duzir a agregação, remover agregados intracelulares, interromper a disseminação, aumentar a depuração intracelular e alterar modifica- ções pós-tradução são algumas estratégias terapêuticas que visam reduzir a patologia tau.
[005] Os oligonucleotídeos antissenso (ASOs) são pequenas mo- léculas de ácido nucleico de filamento único que se ligam a seus alvos de RNA através de pares de bases Watson-Crick clássicos, resultando em um dúplex ASO:RNA. Dependendo das modificações químicas da estrutura principal fosfato-açúcar, o dúplex ASO:RNA formado pode recrutar RNase-H que irá clivar o filamento de RNA do dúplex deixan- do o ASO intacto. O RNA clivado é então degradado ainda, resultando em níveis de expressão de mRNA e de proteína reduzidos do gene alvo. As modificações químicas da estrutura principal de ASO também podem alterar a afinidade de ligação, a resistência à atividade da nu- clease e a capacidade de ligação às proteínas (séricas).
[006] Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de descobrir e desenvolver novas terapias com diferentes mecanismos de ação, potência aumentada, afinidade aumentada e/ou efeitos colate- rais diminuídos.
SUMÁRIO
[007] A presente invenção descriçãorefere-se a compostos e composições que contêm oligonucleotídeos e seu uso na prevenção ou tratamento de doenças e condições, por exemplo, tauopatias, tais como a doença de Alzheimer.
[008] Algumas modalidades incluem um oligonucleotídeo que compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleotídeos do oli- gonucleotídeo são nucleotídeos de Fórmula (I):
(I), em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nu- cleobase, R1 é –(CR'2)2OCR'3, e R' é independentemente em cada caso H ou F. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo do dito oli- gonucleotídeo é um nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modali- dades, o oligonucleotídeo compreende 2 a 40 nucleotídeos. Em algu- mas modalidades, o oligonucleotídeo compreende 2 a 26 nucleotídeos de Fórmula (I). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compre- ende 5 a 10 nucleotídeos de Fórmula (I). Em algumas modalidades, B é uma nucleobase não modificada em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, B é uma nucleobase modifica- da em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas moda- lidades, B é uma nucleobase não modificada em cada nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, B é uma nucleobase modifica- da em cada nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, ca- da R' é H em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, cada R' é H em cada nucleotídeo de Fórmula (I). Em al- gumas modalidades, R1 é –(CH2)2OCH3 em pelo menos um nucleotí- deo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, R1 é –(CH2)2OCH3 em cada nucleotídeo de Fórmula (I).
[009] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleotídeos de Fórmula (II): (II),
em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nucleobase, R2 é –CR'3, –CR'2OCR'3, –(CR'2)3OCR'3 ou – (CR'2)1-2CR'3, ou R2 é –(CR'2)2OCR'3 e Y é O, e R' é independentemen- te em cada caso H ou F. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é –CR'3. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é –(CR'2)1-2OCR'3. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é –(CR'2)1-2CR'3. Em algu- mas modalidades, B é uma nucleobase modificada em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II). Em algumas modalidades, Y é S em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II). Em algumas modalidades, Y é O em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II). Em algumas moda- lidades, Y é S em cada nucleotídeo de Fórmula (II). Em algumas mo- dalidades, Y é O em cada nucleotídeo de Fórmula (II).
[0010] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende ainda um ou mais nucleotídeos de Fórmula (IIIa) ou Fórmula (IIIb): (IIIa) (IIIb), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente e B é uma nucleobase.
[0011] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende ainda um ou mais nucleotídeos de Fórmula (V'): (V'),
em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, A é -(CR''R'')1-2– e R'' é independentemente em cada caso H, F ou Me.
[0012] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é disposto em um construto de Fórmula (VI): 5' X — Y — Z 3' (VI), em que cada um de X, Y e Z é um domínio que compreende 2 a 14 nucleotídeos, em que pelo menos um dos domínios X e Z compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I), e em que cada um dos nucleotídeos do domínio Y é um 2'-desoxinucleotídeo. Em algumas modalidades, o oli- gonucleotídeo compreende 18 a 22 nucleosídeos. Em algumas moda- lidades, os domínios X e Z compreendem cada um 5 a 10 nucleotí- deos. Em algumas modalidades, o domínio Y compreende 5 a 10 nu- cleotídeos. Em algumas modalidades, os domínios X e Z compreen- dem cada um 5 a 10 nucleotídeos e o domínio Y compreende 5 a 10 nucleotídeos. Em algumas modalidades, os domínios X e Z compre- endem, cada um, 5 nucleotídeos e o domínio Y compreende 10 nucle- otídeos. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo dos domínios X e Z é um nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo do domínio X e pelo menos um nucleotídeo do domínio Z são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste em um nucleotídeo de Fórmula (II), um nucleotídeo de Fórmula (IIIa) e um nucleotídeo de Fórmula (IIIb). Em algumas modali- dades, cada um dos pelo menos um nucleotídeo dos domínios X e Z é o mesmo nucleotídeo. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo do domínio Y é ligado por meio de ligações intersubunidades de tiofosfa- to. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é de filamento único. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso.
[0013] Em modalidades, o oligonucleotídeo é complementar a pelo menos uma porção do éxon 5 do gene MAPT humano.
[0014] Outras modalidades incluem um oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleotídeos do oligonucleotídeo são nucleotídeos de Fórmula (VI): 5' -X—Y—Z- 3' (VI), em que X—Y—Z é um oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência de 18 a 22 nucleosídeos e é opcionalmente conjugado na extremidade 5' e/ou 3' a um grupo alvo de ligante; X é um domínio que compreende uma sequência de nucleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; Z é um domínio que com- preende uma sequência de nucleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; e Y é um domínio que compreende uma sequência de 2 a 14 2'-desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato. Em algumas modalidades, o domínio Y tem 6 a 10 nucleosídeos de comprimento. Em algumas mo- dalidades, os domínios X e/ou Z compreendem uma sequência de nu- cleosídeos modificados ligados por meio de ligação intersubunidade de N3'→P5' fosforamidato ou N3'→P5' tiofosforamidato. Em algumas modalidades, o domínio Y compreende pelo menos uma ligação inter- subunidade de fosfodiéster. Em algumas modalidades, o domínio Y consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados através de ligações inter- subunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ou duas ligações in- tersubunidades de fosfodiéster. Em algumas modalidades, o domínio X compreende nucleosídeos modificados em que a modificação é se- lecionada independentemente, do grupo que consiste em 2'-F, 2'-F- N3'→P5', 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'-O- metoxietoxi-N3'→P5', nucleosídeos conformacionalmente restritos, 2'- OH-N3′→P5′ tiofosforamidato e 2'-OH-N3′→P5′ fosforamidato. Em al- gumas modalidades, o domínio funcional de Z compreende nucleosí-
deos modificados em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5', 2'-O- metoxietóxi, 2'-O-metoxietoxi-N3'→P5', nucleosídeos conformacional- mente restritos, 2'-OH-N3′→P5′ tiofosforamidato e 2'-OH-N3′→P5′ fos- foramidato.
Em algumas modalidades, os domínios X e/ou Z compre- endem um ou mais 2'-desoxinucleosídeos ligados através de uma liga- ção intersubunidade de N3'→P5' fosforamidato.
Em algumas modali- dades, os domínios X e Z compreendem um ou mais nucleosídeo mo- dificado 2'-arabino-F e/ou 2'-ribo-F, em que cada dito nucleosídeo é ligado independentemente através de pelo menos uma de uma ligação intersubunidade de N3′→P5′ fosforamidato ou N3′→P5 tiofosforamida- to.
Em algumas modalidades, os domínios X e Z compreendem um ou mais nucleosídeos modificados de 2'-OMe, em que cada dito nucleosí- deo é ligado independentemente através de pelo menos uma das liga- ções intersubunidades de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosfora- midato ou tiofosfato.
Em algumas modalidades, os nucleosídeos modi- ficados em cada um dos domínios X e Z são nucleosídeos modificados 2'-OMe ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato e em que os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 5- metilcitosina, mas opcionalmente não citosina.
Em algumas modalida- des, os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 2,6- diaminopurina, mas opcionalmente não adenina.
Em algumas modali- dades, os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 5- metiluracila, mas opcionalmente não uracila.
Em algumas modalida- des, os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 2,6- diaminopurina, mas não nucleobases adenina e 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila.
Em algumas modalidades, o domínio Y compreende 6-8 2'-desoxinucleosídeos.
Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados em cada um dos domínios X e Z compreen- dem nucleosídeos modificados 2'-OMe e nucleosídeos conformacio-
nalmente restritos opcionalmente ligados através de ligações intersu- bunidades de tiofosfato, e em que os nucleosídeos modificados 2'- OMe incluem nucleobases 5-metilcitosina, mas opcionalmente não ci- tosina. Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados em cada um dos domínios X e Z compreendem 2'-OMe e nucleosídeos conformacionalmente restritos. Em algumas modalidades, os nucleo- sídeos modificados em cada um dos domínios X e Z compreendem nucleosídeos conformacionalmente restritos e, em que pelo menos um nucleosídeo modificado inclui uma ligação intersubunidade de N3'→P5' fosforamidato ou N3′→P5' tiofosforamidato. Em algumas mo- dalidades, o domínio Y compreende 7-8 2'-desoxinucleosídeos. Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados 2'-OMe incluem nucleobases 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila. Em algu- mas modalidades, o domínio Y compreende 9-10 2'- desoxinucleosídeos.
[0015] Em algumas modalidades, os domínios X e Z compreen- dem nucleotídeos representados pela Fórmula (A1): (A1), em que A é independentemente em cada caso NH ou O; B é indepen- dentemente em cada caso uma nucleobase não modificada ou modifi- cada; W é independentemente em cada caso OR ou SR, em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente; R' e R'' são, cada um, independentemente em cada caso selecionados do grupo que consiste em H, F, Cl, OH, OMe, Me e O-metoxietóxi; R''' é H, ou R' e R''' juntos formam –O-CH2– ou –O-(CH2)2–, e a é um número inteiro de 3 a 9, em que quando R', R'' e R''' são, cada um, H, então A é NH, e opcional- mente quando A é O, então W é SR.
[0016] Em algumas modalidades, o grupo alvo de ligante é seleci- onado do grupo que consiste em tocoferóis, ácido palmítico e ácido lipoico e combinações dos mesmos.
[0017] Em algumas modalidades, o domínio X e/ou Z compreende um ou mais oligonucleotídeos em que a modificação é 2'-O- metoxietoxi-N3'→P5'. Em algumas modalidades, o domínio X compre- ende um ou mais oligonucleotídeos em que a modificação é 2'-O- metoxietoxi-N3'→P5'. Em algumas modalidades, o domínio Z compre- ende um ou mais oligonucleotídeos em que a modificação é 2'-O- metoxietoxi-N3'→P5'. Em algumas modalidades, o construto do dito oligonucleotídeo corresponde a um construto da Tabela B.
[0018] Outras modalidades incluem um oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleotídeos do oligonucleotídeo são nucleotídeos de Fórmula (VII): 5'-X'—Y'—Z'-3' (VII), em que X'-Y'-Z' é um oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência de 16 a 22 nucleosídeos e é opcionalmente conjugado na extremidade 5' e/ou 3'; X' é um domínio que compreende uma sequên- cia de nucleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; Z' é um domínio que compreende uma sequência de nucleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimen- to; e Y' é um domínio que compreende uma sequência de 2 a 4 2'- desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades, em que os domínios X' e/ou Z' compreendem uma sequência de nucleosí- deos modificados ligados através de ligações intersubunidades de
N3′→P5′ fosforamidato ou N3′→P5′ tiofosforamidato. Em algumas mo- dalidades, o domínio Y consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ligação intersubunidade de fosfodiéster. Em algumas modalida- des, o domínio X' tem 9 ou 10 nucleosídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, o domínio X' compreende nucleosídeos modifica- dos em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em 2'- F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'-O- metoxietoxi-N3'→P5' e nucleosídeos conformacionalmente restritos. Em algumas modalidades, o domínio Z' compreende nucleosídeos modificados em que a modificação é selecionada do grupo que consis- te em 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OH, 2'-OMe, 2'- OMe-N3'→P5', 2'-O- metoxietóxi, 2'-O-metoxietoxi-N3'→P5' e nucleosídeos conformacio- nalmente restritos. Em algumas modalidades, os domínios X' e/ou Z' compreendem um ou mais nucleosídeos modificados 2'-arabino-F e/ou 2'-ribo-F. Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados nos domínios X' e/ou Z' compreendem 2'-OMe e nucleosídeos conformaci- onalmente restritos. Em algumas modalidades, os nucleosídeos modi- ficados nos domínios X' e/ou Z' compreendem nucleosídeos confor- macionalmente restritos e uma modificação N3'→P5'. Em algumas modalidades, a sequência é selecionada dentre aquelas na Tabela B que têm um domínio Y de 2 a 4 nucleotídeos.
[0019] Outras modalidades incluem um oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT, em que a sequência de nucleo- base do oligonucleotídeo corresponde a uma sequência listada na Ta- bela D.
[0020] Outras modalidades incluem um oligonucleotídeo que com- preende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleotídeos do oligo-
nucleotídeo são nucleotídeos Fórmula (VIII) que se segue: (VIII), em que XA é NH ou O, Y é OR ou SR, em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, BA é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, RA' e RA'' são, cada um, independentemente em cada caso seleciona- dos de H, F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi, e RA''' é H ou RA' e RA''' jun- tos formam –O-CH2– ou –O-(CH2)2–. Em algumas modalidades, RA' e RA''' são H; e RA'' é F. Em algumas modalidades, RA' e RA'' são H; e RA''' é F, OH, H ou OMe. Em algumas modalidades, XA é NH; BA é uma nucleobase não modificada ou modificada; RA' e RA''' juntos formam um nucleosídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O-CH2– ou –O-(CH2) 2–); e RA'' é H. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre RA' e RA'' é H. Em algumas modalidades, quando BA é uma nu- cleobase purina pelo menos um dentre RA' e RA'' é OH ou F, e/ou quando BA é uma nucleobase pirimidina pelo menos um dentre RA' e RA'' é OMe, OH ou F. Em algumas modalidades, a nucleobase modifi- cada é selecionada de 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 5- metiluracila e uma g-clamp.
[0021] Outras modalidades incluem um oligonucleotídeo que com- preende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que dez ou mais nucleotídeos do oligo- nucleotídeo são nucleotídeos da Fórmula (IX) que se segue: (IX),
em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, BB é inde- pendentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modifi- cada ou uma nucleobase modificada, RB' e RB'' são cada um indepen- dentemente em cada caso selecionado de H, F, OMe, Me, O- metoxietóxi, e RB''' é H ou RB' e RB''' juntos formam –O-CH2– ou –O- (CH2) 2–. Em algumas modalidades, RB' e RB''' são H; e RB'' é F. Em algumas modalidades, RB' e RB'' são H; e RB''' é F, OH, H ou OMe. Em algumas modalidades, BB é uma nucleobase não modificada ou modi- ficada; RB' e RB''' juntos formam um nucleosídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O-CH2– ou –O-(CH2) 2–); e RB'' é H. Em algu- mas modalidades, pelo menos um dentre RB' e RB'' é H. Em algumas modalidades, quando BB é uma nucleobase purina pelo menos um dentre RB' e RB'' é OH ou F, e/ou quando BB é uma nucleobase pirimi- dina pelo menos um dentre RB' e RB'' é OMe, OH ou F. Em algumas modalidades, a nucleobase modificada é selecionada de 5- metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 5-metiluracila e uma g-clamp.
[0022] Em algumas modalidades, os nucleotídeos de Fórmula (B) incluem aqueles na Tabela A, em que XA é NH. Em algumas modali- dades, o nucleotídeo de Fórmula (B) é disposto e modificado de acor- do com os construtos listados na Tabela B. Em algumas modalidades, o construto de Fórmula (B) inclui uma sequência de 1, 2, 3, 4 ou 5 nu- cleobases diferentes de uma sequência selecionada dentre aquelas na Tabela D. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo é um nu- cleotídeo de Fórmula (B).
[0023] Em modalidades, a sequência de nucleobases do oligonu- cleotídeo corresponde a SEQ ID NO: 1. Em modalidades, a sequência de SEQ ID NO: 1 é modificada de acordo com pelo menos uma das modificações divulgadas. Em modalidades, pelo menos os dois primei- ros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo que têm uma sequência de nucleobase que corresponde a SEQ ID NO: 1 são modificados para incluir uma ligação fosforamidato e ainda modifica- dos para incluir uma modificação 2'-metoxietóxi (2'MOE). Em modali- dades, pelo menos os três primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo que têm uma sequência de nucleobase que corresponde a SEQ ID NO: 1 são ainda modificados para incluir uma modificação 2'MOE. Em modalidades, pelo menos os quatro primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo que têm uma sequência de nucleobase que corresponde a SEQ ID NO: 1 são ainda modificados para incluir uma modificação 2'MOE. Em modalida- des, pelo menos os cinco primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo que têm uma sequência de nucleobase que corresponde a SEQ ID NO: 1 são ainda modificados para incluir uma modificação 2'MOE. Em modalidades, pelo menos os seis primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo que têm uma sequência de nucleobase que corresponde a SEQ ID NO: 1 são ainda modificados para incluir uma modificação 2'MOE.
[0024] Outras modalidades incluem uma composição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo de qualquer uma das modalida- des anteriores e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em al- gumas modalidades, a composição é adequada para administração intratecal ou intracerebroventricular. Outras modalidades incluem um método de inibir a expressão do gene MAPT em uma célula do siste- ma nervoso central (SNC), tal como um neurônio, astrócito, oligoden- drócito e microglia, que compreende colocar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição de qualquer uma das modalidades anteriores. Outras modalidades incluem um método para inibir a trans- crição ou tradução de MAPT em uma célula do SNC, que compreende colocar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição de qualquer uma das modalidades anteriores. Outras modalidades in- cluem um método para tratar um indivíduo com tauopatia, tal como a doença de Alzheimer (DA) e/ou qualquer distúrbio relacionado à tauo- patia, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantida- de terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição de qualquer uma das modalidades anteriores.
Outras modalidades inclu- em um oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o dito oligonucleotídeo complexado com pelo menos uma por- ção da sequência do gene MAPT tem uma temperatura de fusão (Tm) de > 37 °C.
Outras modalidades incluem um método para tratar um indivíduo com tauopatia, tal como a doença de Alzheimer (DA) e/ou qualquer distúrbio relacionado à tauopatia, que compreende a adminis- tração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição de qualquer uma das modalidades anteriores.
Outras modalidades incluem um método para inibir a ex- pressão de um RNA alvo em uma célula do SNC que compreende co- locar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição que compreende o dito oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o oligonucleotídeo quimérico contém uma sequên- cia de nucleobase que é complementar ou hibridiza com uma porção do RNA alvo.
Outras modalidades incluem um método para inibir a transcrição ou tradução do gene MAPT em uma célula do SNC que compreende colocar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição que compreende o dito oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende o dito oligonucleotídeo conter uma sequência de nucleobase que é complementar ou hibridiza com pelo menos uma parte do gene MAPT.
Outras modalidades inclu- em um método para tratar um indivíduo com tauopatia, tal como a do- ença de Alzheimer (DA) e/ou qualquer distúrbio relacionado à tauopa- tia, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição que compreende o dito oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o oligonucleotídeo contém uma sequência de nu- cleobases que é complementar ou hibridiza com pelo menos uma por- ção do gene MAPT. Outras modalidades incluem um método para mo- dular a expressão de um alvo por contato de um ácido nucleico alvo com um composto antissenso que compreende um oligonucleotídeo ou composição que compreende o dito oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o oligonucleotídeo contém uma sequência de nucleobase que é complementar ou hibrida com uma porção do ácido nucleico alvo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0025] A presente descrição é direcionada a oligonucleotídeos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma por- ção da sequência do gene MAPT, em que um ou mais nucleotídeos do oligonucleotídeo são nucleotídeos modificados e dois ou mais nucleo- tídeos contêm ligações modificadas entre os nucleotídeos. A presente descrição também é direcionada a construtos dos oligonucleotídeos, que incluem domínios, regiões ou porções químicas dentro do oligonu- cleotídeo que têm características comuns e componentes adicionais conjugados ao oligonucleotídeo, tais como porções químicas alvo. A presente descrição é direcionada ainda a métodos de uso e prepara- ção dos oligonucleotídeos e seus construtos.
[0026] Como conhecido na técnica e como estabelecido na pre- sente descrição, um nucleotídeo modificado é qualquer nucleotídeo que não seja um desoxirribonucleotídeo. Por exemplo, o carbono 2' da desoxirribose pode ser substituído por um substituinte diferente do hi- dróxi (OH); o carbono 3' da desoxirribose pode ser substituído por um substituinte diferente do átomo de oxigênio (O). Como conhecido na técnica e como estabelecido na presente descrição, uma ligação modi- ficada entre dois nucleotídeos é qualquer ligação que não seja uma ligação fosfodiéster entre o carbono 3' da desoxirribose do primeiro nucleotídeo e o carbono 5' da desoxirribose do segundo nucleotídeo.
1. Nucleotídeos 2', 3' Modificados e Oligonucleotídeos Relaciona- dos
[0027] Os compostos da presente descrição incluem oligonucleotí- deos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleo- tídeos do oligonucleotídeo são nucleotídeos modificados com modifi- cações particulares de 2' e 3'. Em modalidades, os compostos da pre- sente descrição incluem a substituição do hidróxi, ou substituição, no carbono 2' do açúcar desoxirribose. Além disso, estes compostos da presente descrição incluem modificações da ligação entre dois nucleo- sídeos, que incluem a substituição do átomo de oxigênio, ou substitui- ção, por um átomo de nitrogênio (N) no carbono 3' do açúcar desoxir- ribose. As modificações da ligação incluem ainda a substituição de ou- tro átomo de oxigênio, ou substituição, na ligação fosfodiéster.
[0028] Estes nucleotídeos modificados podem ser usados, por exemplo, em oligonucleotídeos, tais como oligonucleotídeos quiméri- cos permitindo a clivagem enzimática do alvo genético por RNase H ou oligonucleotídeos antissenso modificados. Nucleotídeos 2', 3' Modificados
[0029] Por conseguinte, os compostos da presente descrição in- cluem oligonucleotídeos que compreendem uma sequência comple- mentar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleotídeos dos oligonucleotídeos são nucleotídeos de Fórmula (I): (I), em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é inde-
pendentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modifi- cada ou uma nucleobase modificada, R1 é -(CR'2)2OCR'3, e R' é inde- pendentemente em cada caso H ou F.
[0030] Nos nucleotídeos de Fórmula (I), R1 é –(CR'2)2OCR'3. Em algumas modalidades, R' é H em cada caso. Em outras modalidades, pelo menos um R' é F, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 R's são F. Em algumas modalidades, CR'3 contém 1, 2 ou 3 porções químicas F. Por exemplo, em modalidades, R1 é selecionado do grupo que consiste em –CH2CH2OCH3 (ou MOE), –CF2CH2OCH3, –CH2CF2OCH3, – CH2CH2OCF3, –CF2CF2OCH3, –CH2CF2OCF3, –CF2CH2OCF3, – CF2CF2OCF3, –CHFCH2OCH3, –CHFCHFOCH3, –CHFCH2OCFH2, – CHFCH2OCHF2 e –CH2CHFOCH3. Em modalidades, o nucleotídeo de Fórmula I é: .
[0031] Em modalidades, os compostos da presente descrição in- cluem oligonucleotídeos que compreendem uma sequência comple- mentar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleotídeos dos oligonucleotídeos são nucleotídeos de Fórmula (II): (II), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nucleobase, R2 é –CR'3, –CR'2OCR'3, –(CR'2)3OCR'3 ou – (CR'2)1-2CR'3, ou R2 é –(CR'2)2OCR'3 e Y é O e R' é independentemen- te em cada caso H ou F.
[0032] No nucleotídeo de Fórmula (II), R2 é –CR'3, –(CR'2)1-3OCR'3, ou –(CR'2)1-2CR'3. Em algumas modalidades, R2 é–CR'3 ou –CR'2CR'3. Em algumas modalidades, R' é H em cada caso. Em outras modalida- des, pelo menos um R' é F, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 R's são F. Em algumas modalidades, CR'3 contém 1, 2 ou 3 porções químicas F. Por exemplo, em modalidades, R2 é selecionado do grupo que consiste em –CH3 (ou Me), –CFH2, –CHF2, CF3, –CH2OCH3, –CFH2OCH3, – CHF2OCH3, –CF3OCH3, –CH2OCFH2, –CH2OCHF2, –CH2OCF3, – CFH2OCH3, –CFH2OCFH2, –CFH2OCHF2, –CFH2OCF3, –CHF2OCH3, –CHF2OCFH2, –CHF2OCHF2, –CHF2OCF3, –(CR'2)3OCR'3, –CH2CH3 (ou Et), –CFH2CH3, –CHF2CH3, –CF3CH3, –CH2CFH2, –CH2CHF2, – CH2CF3, –CFH2CH3, –CFH2CFH2, –CFH2CHF2, –CFH2CF3, –CHF2CH3, –CHF2CFH2, –CHF2CHF2, –CHF2CF3, –CH2CH2CH3, CF2CH2CH3, CH2CF2CH3, CH2CH2CF3, CF2CF2CH3, CH2CF2CF3, CF2CH2CF3, CF2CF2CF3, CHFCH2CH3, CHFCHFOCH3, CHFCH2CFH2, CHFCH2CHF2 e CH2CHFCH3. Em modalidades, R2 é –CH3 (ou Me) ou –CH2CH3 (ou Et).
[0033] Em modalidades, os nucleotídeos de Fórmula II são seleci- onados do grupo que consiste em , e .
[0034] Em compostos de Fórmulas (I) ou (II), Y pode ser O ou S. Em algumas modalidades, Y é S em pelo menos um caso (por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.). Em outras modalidades, Y é S em pelo menos um caso e O em pelo menos outro caso. Em outras modalidades, Y é S em cada caso. Em algumas modalidades, Y é O em pelo menos um caso (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.).
[0035] Os oligonucleotídeos descritos compreendem pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I). Em modalidades, os oligonucleotídeos descritos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos de Fórmula (I). Em mo- dalidades, os oligonucleotídeos descritos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleo- tídeos de Fórmula (II). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende de 2 a 40 nucleotídeos, por exemplo, 8 a 26 nucleotídeos ou números inteiros entre os mesmos.
[0036] Em modalidades em que mais de um nucleotídeo de Fór- mula (I) é incluído no oligonucleotídeo, o nucleotídeo pode ser o mes- mo ou diferente. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos de Fórmula (II) são incluídos e podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I) e pelo menos um nucleotí- deo de Fórmula (II). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I), em que pelo menos um R1 é MOE e pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é Me ou Et. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo com- preende pelo menos 2 nucleotídeos alternados de Fórmula (I) e Fór- mula (II). Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos com modificação 2' alterna- da (por exemplo, Me-MOE-Me-MOE... ou Et-MOE-Et-MOE-Et-MOE...).
[0037] Em algumas modalidades, o nucleotídeo de Fórmula (I) e/ou Fórmula (II) é representado pelo seguinte: (I') (II'),
[0038] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo que compre- ende o nucleotídeo de Fórmula (I) compreende ainda um 2'- fluoronucleotídeo de Fórmula (IIIa) e/ou (IIIb): (IIIa) (IIIb), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente e B é uma nucleobase.
[0039] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 4 nucleotídeos alternados de Fórmulas (I) e (IIIa). Por exemplo, o oligonucleotídeo compreende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos alternados.
[0040] Certas modalidades incluem um oligonucleotídeo que com- preende 4 a 40 nucleotídeos e que compreende a Fórmula (IV): (IV) em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nucleobase, R1 é –(CR'2)2OCR'3, R2 é selecionado de –OCR'3, –OCR'2OCR'3, –O(CR'2)3OCR'3 ou –O(CR'2)1-2CR'3 e F, R' é indepen- dentemente em cada caso H ou F, e a é um número inteiro de 1 a 10 e b é um número inteiro de 1 a 10, em que o até 20, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20.
[0041] Compostos da presente descrição incluem oligonucleotí- deos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleo- tídeos dos oligonucleotídeos são nucleotídeos de Fórmula (III'): (III'), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, e B é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada; e opcionalmente que compreende uma ou mais das fórmulas (I), (II) e/ou (IV).
[0042] As nucleobases, B, dos nucleotídeos de Fórmulas (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV) e (V) podem ser, cada uma, independentemente, uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada. Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados incluem nu- cleobases 2,6-diaminopurina, mas opcionalmente não adenina. Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados incluem nucleoba- ses 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila. Em algumas moda- lidades, os nucleotídeos modificados incluem nucleobases 2,6- diaminopurina, mas não nucleobases adenina e 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila.
[0043] Y em cada nucleotídeo de Fórmulas (II), (IIIa), (IIIb), (IV) e (V) pode ser independentemente O ou S. Em algumas modalidades, Y é S em pelo menos um caso (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.). Em outras modalidades, Y é S em pelo menos um caso e O em pelo menos outro caso. Em outras modalidades, Y é S em cada caso. Em algumas modalidades, Y é O em pelo menos um caso (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.).
[0044] Em modalidades em que mais de um nucleotídeo de cada uma das Fórmulas (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV) e (V) são incluídos, mais de um nucleotídeo de tais Fórmulas podem ser iguais ou diferente. Por exemplo, em algumas modalidades, o nucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), (III), (IV), (V) e/ou (V'), além de pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I). Em algumas modalidades, o nucleotídeo compreende pelo menos 2 nucleotídeos alternados de Fórmula (I) e/ou Fórmula (II) e/ou (III) e/ou (IV), (V) e/ou (V'). Por exemplo, os oligonucleotídeos descritos podem incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotí- deos com modificações 2' alternadas.
[0045] Em modalidades, os nucleotídeos do oligonucleotídeo são selecionados do grupo que consiste em:
O B
O HN OCH2CH3
O P
HO , , , , e , em que B pode ser qualquer base natural ou modifica- da.
[0046] Compostos da presente descrição incluem oligonucleotí- deos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleo- tídeos dos oligonucleotídeos são nucleotídeos de Fórmula (V'):
(V'), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, A é -(CR''R'')1-2– e R'' é independentemente em cada caso H, F ou Me, e que compreende op- cionalmente uma ou mais das Fórmulas (I), (II), (III), (IV) ou (V).
[0047] No composto que compreende a fórmula (V'), A é - (CR''R'')1-2–. Em algumas modalidades, A é -(CR''R'') - em outras mo- dalidades, A é -(CR''R'')2–. R'' é independentemente em cada caso H ou Me. Em algumas modalidades, um R'' é Me e os restantes são H. Em outras modalidades, todos os R'' são H.
[0048] Em algumas modalidades, quando A é CH2, então Y é S. Em outras modalidades, quando A é CH2CH2, então Y é O ou S. Em algumas modalidades, A é CH2CH(Me) ou CH(Me) e Y é O ou S.
[0049] Em o composto que compreende a Fórmula (V'), Y é O ou S. Em algumas modalidades, Y é S em pelo menos um caso (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.). Em outras modalidades, Y é S em pelo menos um caso e O em pelo menos outro caso. Em ou- tras modalidades, Y é S em cada caso. Em algumas modalidades, Y é O em pelo menos um caso (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.).
[0050] O composto de Fórmula (V') (e opcionalmente Fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) e/ou (V') pode ser parte de um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o composto que compreende a Fórmula (IV) (e opcionalmente Fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) e/ou (V')) é um oligonu- cleotídeo que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos de Fórmula (V') (e Fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) e/ou (V')). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende de 2 a 40 nucleotídeos, por exemplo, 8 a 26 nucleotídeos ou número inteiros entre os mesmos.
[0051] Em modalidades em que mais de um nucleotídeo de Fór- mula (V') estão incluídos, mais de um nucleotídeo de Fórmula (V') po- dem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos de Fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) e/ou (V') estão incluídos e podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, em some modalidades, o nucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (V') e pelo menos um nucleotídeo de Fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) e/ou (V'). Em algumas modalidades, o nucleotídeo compreende pelo menos 2 nucleotídeos alternados de Fórmula (V') e Fórmula (I) e/ou (II). Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos com modificação 2' alternada.
[0052] Em algumas modalidades, o nucleotídeo que compreende o nucleotídeo de Fórmula (V') (e opcionalmente Fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) e/ou (V')) compreende ainda um 2 -fluoronucleotídeo das se- guintes estruturas: ou , em que Y, R e B são os mesmos da Fórmula (I). Em algumas modalidades, o nucleotídeo compreende pelo menos 4 nucleotídeos alternados de Fórmula (V') e 2- fluoronucleotídeos.
[0053] Compostos da presente descrição incluem oligonucleotí- deos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT em que um ou mais nucleo- tídeos dos oligonucleotídeos são nucleotídeos de Fórmula (V):
O B
O HN OEt
O P
RY , em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, e B é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada; e opcionalmente que compreende uma ou mais das fórmulas (I), (II), (III), (IV) e/ou (V'). Oligonucleotídeos Quiméricos
[0054] A presente descrição é direcionada a construtos de oligo- nucleotídeos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT, que inclui domínios, regiões ou porções químicas dentro do oligonucleotídeo com caracte- rísticas comuns. Os oligonucleotídeos que têm estes domínios são de- nominados no presente documento como oligonucleotídeos quiméri- cos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos quiméricos são representados pela Fórmula (VI): 5'-X—Y—Z-3' (VI), em que o oligonucleotídeo quimérico compreende uma sequência de 14 a 22 nucleosídeos, em que X é um domínio que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados que tem 3 a 10 nucleotídeos de comprimento; Z é um domínio que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimen- to; e Y é um domínio que compreende uma sequência de 2 a 10 2'- desoxinucleotídeos ou nucleotídeos não modificados. Cada um dos nucleosídeos em cada um dos domínios é ligado através de ligações intersubunidades.
[0055] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos quiméricos que compreendem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT incluem um ou mais nucleotídeos de Fórmula (VI'): 5'-X—Y—Z-3' (VI'), em que o oligonucleotídeo quimérico compreende uma sequência de 14 a 22 nucleosídeos, em que X é um domínio que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados que tem 3 a 10 nucleotídeos de comprimento; Z é um domínio que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados que tem 2 a 10 nucleosídeos de comprimen- to; e Y é um domínio que compreende uma sequência de 6 a 14 2'- desoxinucleotídeos ou nucleotídeos não modificados. Cada um dos nucleosídeos em cada um dos domínios é ligado através de ligações intersubunidades.
[0056] Os nucleotídeos de fórmula (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV), (V) e/ou (V') podem estar presentes no domínio X e/ou Z. O oligonucleotí- deo quimérico pode ser conjugado na extremidade 5' e/ou 3' a um gru- po alvo de ligante.
[0057] Em algumas modalidades, o domínio Y contém 2'desoxinucleosídeos ligados por ligações intersubunidades de tiofos- fato. Em modalidades, o domínio Y contém 2'desoxinucleosídeos liga- dos por pelo menos uma ligação intersubunidade de fosfodiéster. Em modalidades, o domínio Y contém 2'desoxinucleosídeos ligados por duas ligações intersubunidades de fosfodiéster. Em modalidades, o domínio Y contém 2'desoxinucleosídeos ligados por ligações intersu- bunidades de tiofosfato e uma ou duas ligações intersubunidades de fosfodiéster. Em algumas modalidades, o domínio Y tem 6 a 10 nucle- otídeos de comprimento.
[0058] Em algumas modalidades, o domínio X compreende nucle- otídeos de fórmulas (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV), (V) e/ou (V'). Em algumas modalidades, o domínio X compreende nucleotídeos modificados em que a modificação é selecionada independentemente de 2'-OMe, 2' - OEt, 2'-O-metoxietóxi e nucleotídeos conformacionalmente restritos. Em algumas modalidades, o domínio X' tem 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento.
[0059] Em algumas modalidades, o domínio Z compreende nu- cleotídeos de fórmulas (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV), (V) e/ou (V'). Em algu- mas modalidades, o domínio Z compreende nucleotídeos modificados 2' em que a modificação é 2'-OMe, 2' -OEt ou 2'-MOE. Em algumas modalidades, o domínio Z tem 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento.
[0060] Em modalidades, o oligonucleotídeo quimérico compreende uma sequência de 14 a 22 nucleotídeos. Por exemplo, o oligonucleotí- deo pode incluir 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos.
[0061] Em modalidades, X é um domínio que consiste em uma se- quência que contêm um ou mais nucleotídeos modificados que têm 3 a 10 nucleotídeos de comprimento; Z é um domínio que consiste em uma sequência que contêm um ou mais nucleotídeos modificados que têm 3 a 10 nucleotídeos de comprimento; e Y é um domínio que con- siste em uma sequência de 2 a 10 2'-desoxinucleosídeos ligados atra- vés de ligações intersubunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ou duas ligações intersubunidades de fosfodiéster. Em algumas moda- lidades, X é 5 a 9, Y é 6 a 10 e Z é 5 a 9. Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos em cada um de X, Y e Z, respectivamente, é: 6/6/6, 6/6/7, 6/6/8, 6/7/6, 6/7/7, 6/7/8, 6/8/6, 6/8/7, 6/8/8, 3/10/3, 4/10/4, 5/10/5, 5/10/6, 2/12/2, 3/12/3, 2/14/2, 5/9/5, 5/9/6, 5/8/5, 5/8/6, 5/8/7, 7/5/7, 7/5/8, 7/5/9,7/6/6, 7/6/7, 7/6/8, 7/6/9, 7/7/6, 7/7/7, 7/7/8, 7/7/9, 7/5/7, 7/5/8, 7/5/9, 7/4/7, 7/4/8, 7/4/9, 8/4/7, 8/4/8, 8/4/9, 7/3/7, 7/3/8, 7/3/9, 8/3/7, 8/3/8, 8/3/9, 8/3/10, 9/3/7, 9/3/8, 9/3/9, 9/3/10, 8/2/7, 8/2/8, 8/2/9, 8/2/10 ,9/2/7, 9/2/8, 9/2/9, 9/2/10, 10/2/8, 10/2/9, 10/2/10. O do- mínio X e o domínio Z, cada um, compreendem, respectivamente, uma sequência de nucleotídeos modificados, em que o domínio tem 4 a 10 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, o domínio X e/ou o domí- nio Z pode compreender uma sequência de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nu- cleotídeos. Um ou mais desses nucleotídeos são modificados (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Por exemplo, em algumas mo- dalidades, todos os nucleotídeos em cada um do domínio X e/ou do- mínio Z são modificados.
[0062] Os nucleotídeos dos domínios X e Z podem ser modifica- dos de acordo com as Fórmulas (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV), (V) e/ou (V') em relação a um ou mais de suas nucleobases, as posições 2' e/ou 3' no açúcar ribose e suas ligações intersubunidades. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades também incluem que a po- sição 2' seja modificada com um OMe e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino), bem como Me ou OMe, e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um O-metoxietóxi e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades também incluem que a posição 2' seja modi- ficada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que as posições 2' e 4' sejam grupos de ponte modificados (como descrito em outro lugar no presente documento) para formar um nucleotídeo conformacionalmente restrito e a posição 3' seja O ou NH. Cada uma dessas modalidades pode incluir tiofosfato (ou tiofosforamidato dependendo da substituição 3') e ligações intersu- bunidades de fosforamidato.
[0063] As modalidades também incluem oligonucleotídeos em que a posição 2' de pelo menos um nucleotídeo é H e a posição 3' é NH. Cada uma dessas modalidades pode incluir ligações intersubunidades de tiofosforamidato e/ou fosforamidato.
[0064] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados do domínio X e do domínio Z, cada um, respectivamente, incluem uma modificação selecionada independentemente de pelo menos um den- tre 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'- O-metoxietoxi-N3'→P5', nucleotídeos conformacionalmente restritos.
[0065] Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado con- tém um nucleosídeo representado pela Fórmula (A) que se segue: (A), em que A é independentemente em cada caso NH ou O, B é indepen- dentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, e R' e R'' são, cada um, independen- temente em cada caso selecionados de H, F, OH, OMe, OEt, O- metoxietóxi, e R''' é H, ou R' e R''' juntos formam uma ponte de 2 a 4 átomos para formar um nucleosídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O-CH2–, –O-CH(Me)–, ou –O-(CH2) 2–).
[0066] Em algumas modalidades, R' é selecionado de F, OH, - OMe, -OEt, O-metoxietóxi; R'' é H e F; e R''' é H, Me ou -OMe. Em ou- tras modalidades, R'' e R''' são H; e R' é selecionado de F, OMe, OEt e O-metoxietóxi. Em algumas modalidades, A é NH em cada caso.
[0067] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleosídeos modificados representados pela Fórmula (A), em que A é NH; B é um g-clamp; R' é F ou OMe e R'' é H; ou R' é H e R'' é H ou F; e R''' é H.
[0068] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleosídeos modificados representados pela Fórmula (A), em que A é NH; B é uma nucleobase não modificada ou modificada; R' e R''' juntos formam um nucleosídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O-CH2–, –O- CH(Me)- ou –O-(CH2)2–); e R'' é H. Em algumas modalidades, B é uma nucleobase não modificada ou modificada selecionada do grupo que consiste em 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina e 5-metiluracila.
[0069] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleosídeos modificados representados pela Fórmula (A), em que A é NH; B é uma nucleobase não modificada ou modificada; R' é F ou OMe, R'' é H e R''' é H.
[0070] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleosídeos modificados representados pela Fórmula (A), em que A é NH; B é uma nucleobase não modificada ou modificada; R' é H, R'' é F e R''' é H.
[0071] Em algumas modalidades, os domínios X e Z são represen- tados pela Fórmula (A1): (A1), em que W é independentemente em cada caso OR ou SR, em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente; R', R'', R''', A e B são como descritos para a Fórmula (A). Em outras modalidades, A é O e R', R" são independentemente H ou OEt, em que pelo menos um den- tre R', R" é OEt.
[0072] Por exemplo, além de pelo menos um nucleotídeo em cada um dos domínios X e Z em que A é NH, W é S e R' é MOE, os nucleo- tídeos de X e/ou Z podem incluir um ou mais nucleotídeos de Fórmula A2 como descrito na Tabela A2 ou um ou mais nucleotídeos de Fór- mula A3 como descrito na Tabela A3.
(A2) Tabela A2 Nucleotí- R' R'' R''' A W deo no 1 F H H NH S 2 F H H NH O 3 F H H O S 4 F H H O O 5 H F H NH S 6 H F H NH O 7 H F H O S 8 H F H O O 9 OMe H H NH S 10 OMe H H NH O 11 OMe H H O S 12 OMe H H O O 13 H F H NH S 14 H F H NH O 15 H F H O S 16 H F H O O 17 O-metoxietóxi H H NH S 18 O-metoxietóxi H H NH O 19 O-metoxietóxi H H O S 20 O-metoxietóxi H H O O 21 H H H NH S 22 H H H NH O 23 OH H H NH S 24 OH H H NH O 25 OH H H O S
Nucleotí- R' R'' R''' A W deo no 26 H OH H NH O 27 H OH H NH S 28 H OEt H NH O 29 H OEt H NH S 30 H OEt H O O 31 H OEt H O S 32 OEt H H NH O 33 OEt H H NH S 34 OEt H H O O 35 OEt H H O S (A3) Tabela A3 Nucleotídeo no C A W 36 -O-CH2- NH S 37 -O-CH2- NH O 38 -O-CH2- O S 39 -O-CH2- O O 40 -O-(CH2)2- NH S 41 -O-(CH2)2- NH O 42 -O-(CH2)2- O S 43 -O-(CH2)2- O O 44 -O-CH(Me)- NH S 45 -O-CH(Me)- NH O 46 -O-CH(Me)- O S 47 -O-CH(Me)- O O
[0073] Em algumas modalidades, o domínio X e o domínio Z, cada um, independentemente, compreende dois, três ou mais nucleotídeos diferentes 1 a 47.
[0074] Os nucleosídeos do domínio X são ligados através de liga- ções intersubunidades, por exemplo, ligações intersubunidades de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato, tiofosfato, fosfodiés- ter ou combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o domí- nio X é ligado através de ligações intersubunidades selecionadas de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato e combinações das mesmas.
[0075] O domínio X do oligonucleotídeo quimérico pode incluir um certo arranjo de nucleotídeos modificados. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio X compreende um ou mais nucleotídeos con- formacionalmente restritos. Os nucleotídeos conformacionalmente res- tritos podem incluir BNA, tal como LNA e ENA. (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleotídeos conformacionalmente restritos). Em al- gumas modalidades, o domínio X compreende um ou mais nucleotí- deos modificados 2'-F e/ou 2'-OMe. Em algumas modalidades, o do- mínio X compreende nucleotídeos conformacionalmente restritos al- ternados, por exemplo, cada outro nucleotídeo é um nucleotídeo con- formacionalmente restrito. Em algumas modalidades, o domínio X compreende um ou mais nucleotídeos modificados 2'-F e/ou 2'-OMe (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleotídeos modificados 2'-F e/ou 2'-OMe). Em algumas modalidades, o domínio X compreende nu- cleotídeos modificados 2'-F e 2'-OMe alternados. Em modalidades, o domínio X compreende 2'-F ou 2'-OMe e nucleotídeos conformacio- nalmente restritos, por exemplo, em uma sequência alternada.
[0076] O domínio Y compreende uma sequência de 2 a 14 2'- desoxinucleotídeos. Por exemplo, o domínio Y pode compreender uma sequência de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 2'- desoxinucleotídeos. Um ou mais dos 2'-desoxinucleosídeos podem ser ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato (por exem-
plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ligações intersubunida- des de tiofosfato). Em algumas modalidades, cada um dos 2'- desoxinucleosídeos é ligado através de uma ligação intersubunidade de tiofosfato. Em algumas modalidades, o domínio Y compreende pelo menos uma ligação intersubunidade de fosfodiéster (por exemplo, 1, 2 ou 3 ligações intersubunidades de fosfodiéster). Em outras modalida- des, o domínio Y consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ou duas ligações intersubunidades de fosfodiéster.
[0077] Em modalidades, o domínio Y compreende nucleotídeos que induzem a clivagem de RNase H.
[0078] Em algumas modalidades, os nucleotídeos de Fórmula (A) incluem aqueles na Tabela A, em que XA é NH. Em algumas modali- dades, o nucleotídeo de Fórmula (A) é disposto e modificado de acor- do com os construtos listados na Tabela B. Em algumas modalidades, o construto de Fórmula (A) inclui uma sequência de 1, 2, 3, 4 ou 5 nu- cleobases diferentes de uma sequência selecionada dentre aquelas na Tabela D. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo em um oligo- nucleotídeo é um nucleotídeo de Fórmula (A).
[0079] Em algumas modalidades, o 2'-desoxinucleosídeo ligado através de uma ligação intersubunidade tiofosfato pode ser represen- tado pela Fórmula (B) que se segue: (B) em que B é independentemente em cada caso uma nucleobase não modificada ou modificada. Em algumas modalidades, B é uma nucleo- base não modificada ou modificada selecionada do grupo que consiste em 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina e 5-metiluracila.
[0080] Em outras modalidades, o 2'-desoxinucleosídeo ligado atra- vés de uma ligação intersubunidade de tiofosfato compreende um 2'- desoxinucleosídeo modificado, que pode ser modificado da mesma maneira que no domínio X e Z. Por exemplo, o 2'-desoxinucleosídeo modificado ligado através de uma ligação intersubunidade de tiofosfato pode ser representado pela Fórmula (C) que se segue: (C) em que B é independentemente, em cada caso, uma nucleobase não modificada ou modificada, e R'' e R''' são, cada um, independentemen- te, em cada caso, selecionados de H, F, Cl, OH, OMe, Me, O- metoxietóxi ou R' e R''' juntos formam uma ponte de 2 a 4 átomos para formar um nucleosídeo conformacionalmente restrito. Em algumas modalidades, B é uma nucleobase não modificada ou modificada sele- cionada do grupo que consiste em 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina e 5-metiluracila. [0081] O domínio Z compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que o domínio Z tem 4 a 10 nucleotí- deos de comprimento. Por exemplo, o domínio Z pode compreender uma sequência de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos. Um ou mais des- ses nucleotídeos são modificados (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22). Por exemplo, em algumas modalidades, todos os nucleotídeos no domínio Z são modifi- cados.
[0081] Os nucleotídeos modificados do domínio Z incluem, por exemplo, uma modificação selecionada independentemente de pelo menos um dentre 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5', 2'- OEt-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'-O-metoxietoxi-N3'→P5', nucleotí- deos conformacionalmente restritos, 2'-OH-N3′→P5′ tiofosforamidato e
2'-OH-N3′→P5′ fosforamidato.
[0082] Os nucleotídeos do domínio Z podem ser ligados através de ligações intersubunidades, tais como, por exemplo, ligações inter- subunidades de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato, tio- fosfato ou fosfodiéster. Em algumas modalidades, o domínio Z é ligado por ligações intersubunidades N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofos- foramidato e combinações das mesmas.
[0083] O domínio Z do oligonucleotídeo quimérico pode incluir um certo arranjo de nucleotídeos modificados. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio Z compreende um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais) nucleotídeos conformacionalmente restritos (por exemplo, BNA, tal como, LNA, ENA, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído). Em algumas modalidades, o do- mínio Z compreende nucleotídeos conformacionalmente restritos alter- nados, por exemplo, cada outro nucleotídeo é um nucleotídeo confor- macionalmente restrito (por exemplo, BNA, tal como, LNA, ENA, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído). Em algumas moda- lidades, o domínio Z compreende um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais) nucleotídeos modificados 2'-F e/ou 2'-OMe. Por exemplo, algumas modalidades incluem que o domínio Z compre- enda nucleotídeos modificados 2'-F e 2'-OMe alternados, ou o domínio Z compreenda 2'-F ou 2'-OMe alternados e nucleotídeos conformacio- nalmente restritos.
[0084] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados de Fórmula (VI) ou (VI') incluem nucleobases 5-metilcitosina, mas não ci- tosina. Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados de Fórmula (VI) ou (VI') incluem nucleobases 2,6-diaminopurina, mas não adenina. Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados de Fórmula (VI) ou (VI') incluem nucleobases 5-metiluracila, mas não ura- cila. Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados de Fór-
mula (VI) ou (VI') incluem 2'-OMe e nucleotídeos conformacionalmente restritos e são ligados através de ligações intersubunidades de tiofos- fato, e os nucleotídeos modificados incluem nucleobases 5- metilcitosina, mas não citosina. Em algumas modalidades, os nucleotí- deos modificados de Fórmula (VI) ou (VI') incluem os nucleotídeos modificados 2'-OMe com nucleobases 5-metiluracila, mas não uracila.
[0085] Em certas modalidades, os nucleotídeos de Fórmula (VI) ou (VI') no oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT são dispostos de acordo com pelo menos um dos construtos da Tabe- la B, em que pelo menos uma ligação intersubunidade nos domínios X e Z é uma ligação NPS. Tabela B Domínio X Domínio Y Domínio Z Número Ligações Substitui- Número Ligações Substitui- Número Ligações Substitui- de Nucs Intersu- ções de de Nucs Intersu- ções de de Nucs Intersu- ções de bunida- Nucleo- bunida- bunida- Nucleo- des bases des des bases 2, 3, 4, 5, np, nps, A, G, C, 2, 3, 4, 5, ps A, G, C, 2, 3, 4, 5, np, nps, A, G, C, 6, 7, 8, 9, ps, PO T, U, 6, 7, 8, 9, T, U 6, 7, 8, 9, ps, PO T, U, 10, 11 e DAP, 10, 11, 10, 11 e DAP, 12 5meC, 12, 13 e 12 5meC, 5meU, G 14 5meU, G clamp, clamp,
DAP DAP
[0086] Na Tabela B, os nucleotídeos em cada um dos domínios X e Z podem ser um ou mais dos nucleotídeos numerados nas Tabelas A2 e A3. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos quiméricos da Tabela B incluem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais dos nu- cleotídeos modificados na Tabela A. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos de X e/ou Z são nucleotídeos modificados. Em algu- mas modalidades, os nucleotídeos na Tabela B são selecionados de certos nucleotídeos modificados listados na Tabela A, tais como os nucleotídeos números 1 a 4 ou 5 a 8 ou 9 a 12 ou 13 a 16 ou 17 a 20 ou 21 a 24 ou 25 a 28 ou 29 a 30 ou 31 a 32 ou 33. Em algumas mo-
dalidades, os nucleotídeos na Tabela B são selecionados de certos nucleotídeos modificados listados na Tabela A, tais como os nucleotí- deos números 9 a 12 e 21 a 28, ou 9 a 12 e 21 a 24, ou 1 a 4 e 21 a 28, ou 1 a 4 e 21 a 24, ou 5 a 8 e 21 a 28, ou 5 a 8 e 21 a 24. Em al- gumas modalidades, os nucleotídeos na Tabela B são selecionados de um ou dois ou três nucleotídeos modificados listados na Tabela A, tais como os nucleotídeos de números 29 a 31 ou 31 a 32 ou 33. Em al- gumas modalidades, os nucleotídeos na Tabela B são selecionados de certos nucleotídeos modificados listados na Tabela A, tais como os nucleotídeos números 29 ou 31 ou 33. Os nucleotídeos no domínio Y da Tabela B podem incluir nucleotídeos de Fórmula B.
[0087] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da Tabela B é conjugado na extremidade 5' e/ou 3' a um grupo alvo de ligante e/ou porção química lipídica.
[0088] Em algumas modalidades, os compostos de oligonucleotí- deo da presente descrição incluem as seguintes sequências de nu- cleobases estabelecidas na Tabela C. Tabela C Sequências de nucleobases (5'-3') 5'- GCTTTTACTGACCATGCGAG -3' (SEQ ID NO: 1)
[0089] Em modalidades, o oligonucleotídeo inclui a sequência de SEQ ID NO: 1. Em modalidades, a sequência de SEQ ID NO: 1 é mo- dificada de acordo com pelo menos uma das modificações divulgadas. Em modalidades, o SEQ ID NO: 1 é modificado com uma ligação tio- fosforamidato e modificação 2'-metoxietóxi (2'MOE) pelo menos nos dois primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotí- deo. Em modalidades, o SEQ ID NO: 1 é modificado com uma modifi- cação 2'MOE em pelo menos os três primeiros nucleotídeos das ex- tremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo. Em modalidades, o SEQ ID NO: 1 é modificado com uma modificação 2'MOE em pelo menos os quatro primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleo-
tídeo. Em modalidades, o SEQ ID NO: 1 é modificado com uma modi- ficação 2'MOE em pelo menos os cinco primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotídeo. Em modalidades, o SEQ ID NO: 1 é modificado com uma modificação 2'MOE em pelo menos os seis primeiros nucleotídeos das extremidades 5' e 3' do oligonucleotí- deo.
[0090] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo que compre- ende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da se- quência do gene MAPT compreende uma sequência modificada de acordo com a sequência modificada da Tabela D em que X é indepen- dentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada. Em algumas modalidades, cada X é selecionado independentemente de A, C, G, U, T, 2,6-diaminopurina, uma pirimidina 5-Me (por exemplo, 5-metilcitosina, 5-metiluracila) e um g-clamp. Em modalidades, o SEQ ID NO: 1 é modificado de acordo com as sequências modificadas da Tabela D de modo que cada X na Tabela D corresponda a cada uma das nucleobases da SEQ ID NO: 1. Tabela D Sequência modificada (5'-3') 5'- moeXnpsmoeXnpsmoeXnpsmoeXnpsmoeXnpsXpsXpsXpsXpsXpsXps XpsXpsXpsXpsmoeXnpsmoeXnpsmoeXnpsmoeXnpsmoeXn-3' 5'- moeGnpsmoeCnps(5m)moeUnps(5m)moeUnps(5m)moeUnpsTpsAps CpsTpsGpsApsCpsCpsApsTpsmoeGnpsmoeCnpsmoeGnpsmoeAnps moeGn-3'—SEQ ID NO: 1 Modificado com NPS
[0091] Em modalidades, cada um dos nucleotídeos de um domínio é modificado. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos de um do- mínio tem as mesmas modificações. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos dos domínios X e Z é modificado. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos dos domínios X e Z tem as mesmas modifica- ções. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos de um domínio é modificado com 2' MOE. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos dos domínios X e Z é modificado com 2' MOE. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos de um domínio é modificado com 2' OMe. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos dos domínios X e Z é modifi- cado com 2' OMe. Em modalidades, cada um dos nucleotídeos de um domínio é modificado com 2' OEt. Em modalidades, cada um dos nu- cleotídeos dos domínios X e Z é modificado com 2' OEt. Em modalida- des, cada um dos nucleotídeos dos domínios X e Z é ligado por uma ligação NPS. Em modalidades, os domínios X e Z têm o mesmo núme- ro de nucleotídeos. Em modalidades, cada um dos domínios X e Z tem 4 a 8 nucleotídeos. Em modalidades, cada um dos domínios X e Z tem 5 a 6 nucleotídeos. Em modalidades, cada um dos domínios X e Z tem 5 nucleotídeos. Em modalidades, o domínio Y tem pelo menos duas vezes o número de nucleotídeos de cada um dos domínios X e Z. Em modalidades, o domínio Y tem 8 a 12 nucleotídeos. Em modalidades, o domínio Y tem 10 nucleotídeos. Em modalidades, cada um dos nu- cleotídeos do domínio Y é ligado por uma ligação PS. Em modalida- des, pelo menos uma nucleobase do oligonucleotídeo é modificada. Em modalidades, pelo menos uma nucleobase adjacente à extremida- de terminal 3' do oligonucleotídeo é modificada. Em modalidades, pelo menos uma nucleobase no domínio Z do oligonucleotídeo é modifica- da. Em modalidades, pelo menos uma nucleobase no domínio Y do oligonucleotídeo é modificada.
[0092] Os oligonucleotídeos da presente descrição também inclu- em um oligonucleotídeo que compreende uma sequência que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de nucleobase selecionada das sequências listadas na Tabela C, independentemente das modifica- ções das sequências listadas nas Tabelas B e D. Em algumas modali- dades, 1, 2, 3, 4, 5 nucleobases são diferentes das sequências lista- das na Tabela C, independentemente das modificações das sequên-
cias listadas nas Tabelas B e D.
[0093] Em modalidades, os oligonucleotídeos descritos exibem uma afinidade aumentada com uma sequência de ácido nucleico alvo em comparação com um oligonucleotídeo não modificado da mesma sequência. Por exemplo, em algumas sequências, o oligonucleotídeo divulgado tem uma sequência de nucleobase que é complementar ou hibridiza com uma sequência de ácido nucleico alvo com uma afinida- de superior a um oligonucleotídeo não modificado da mesma sequên- cia. Em modalidades, o oligonucleotídeo divulgado complexado com uma sequência de ácido nucleico alvo complementar tem uma tempe- ratura de fusão (Tm) de > 37 °C. O complexo pode ser formado sob condições fisiológicas ou condições quase fisiológicas, tal como em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em modalidades, a Tm do complexo é > 50 °C. Em modalidades, a Tm do complexo é de 50 a 100 °C. Em modalidades, a Tm de um oligonucleotídeo divulgado du- plexado com uma sequência de ácido nucleico alvo sob condições fisi- ológicas ou condições quase fisiológicas é > 50 °C.
[0094] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo pode ser selecionada de uma sequência de ácido nucleico de uma se- quência de DNA ou RNA conhecida, como o gene MAPT. O gene MAPT pode ser uma sequência de DNA ou RNA, tal como éxon 5, éxon 10 ou éxon 12.
[0095] Em modalidades, os oligonucleotídeos descritos exibem uma afinidade com pelo menos uma porção do gene MAPT ou seus equivalentes de RNA, tal como mRNA MAPT, e/ou exibem estabilida- de complexada a pelo menos uma porção do gene MAPT ou seus equivalentes de RNA. Em modalidades, o oligonucleotídeo complexa- do com uma sequência do gene MAPT complementar tem uma tempe- ratura de fusão (Tm) de > 37 °C. O gene MAPT pode incluir uma se- quência de RNA, tal como éxon 5, éxon 10 ou éxon 12. O complexo pode ser formado em condições fisiológicas ou condições quase fisio- lógicas, tal como em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em modalidades, a Tm do complexo é > 50 °C. Em modalidades, a Tm do complexo é de 50 a 100 °C. Em modalidades, a Tm de um oligonu- cleotídeo divulgado duplexado com o gene MAPT sob condições fisio- lógicas ou condições quase fisiológicas é > 50 °C.
[0096] Os compostos da presente descrição incluem um construto de oligonucleotídeo que tem uma sequência de nucleobase comple- mentar a pelo menos uma porção do gene MAPT, sendo que o cons- truto tem a Fórmula (VII) que se segue: 5'-X'—Y'—Z'-3' (VII) em que X'-Y'-Z' é um oligonucleotídeo quimérico que compreende uma sequência de 14 a 22 nucleosídeos e é opcionalmente conjugado na extremidade 5' e/ou 3' de um grupo alvo de ligante, X' é um domínio que compreende uma sequência de nucleosídeos modificados que tem 3 a 14 nucleosídeos de comprimento; Y' é um domínio que com- preende uma sequência de 2 a 4 2'-desoxinucleosídeos ligados atra- vés de ligações intersubunidades; e Z' é um domínio que compreende uma sequência de nucleosídeos modificados que tem 3 a 14 nucleosí- deos de comprimento, em que os domínios X' e/ou Y' compreendem um ou mais nucleosídeos modificados que são ligados através de uma ligação intersubunidade de N3′→P5′ fosforamidato ou N3′→P5′ tiofos- foramidato.
[0097] O oligonucleotídeo quimérico representado por X'-Y'-Z' de Fórmula (VII) compreende uma sequência de 14 a 22 nucleotídeos, por exemplo, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos. Em al- gumas modalidades, o número de nucleotídeos em cada um de X', Y' e Z', respectivamente, é: 8/2/10, 9/2/10, 10/2/10, 7/3/10, 8/3/10, 9/3/10, 8/4/8, 9/4/9, 6/4/8. Em algumas modalidades, X' é 6 a 10, Y' é 2 a 4 e Z' é 8 a 10.
[0098] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula (VII) consiste no oligonucleotídeo quimérico X'-Y'-Z' que consiste em uma sequência de 14 a 22 nucleotídeos e é opcionalmente conjugado na extremidade 5' e/ou 3'(por exemplo, extremidade 5', extremidade 3' ou ambas as extremidades 5' e 3') a um grupo alvo de ligante, em que X' é um domínio que consiste em uma sequência que contêm um ou mais nucleotídeos modificados que tem 3 a 10 nucleotídeos de com- primento; Z' é um domínio que consiste em uma sequência que con- têm um ou mais nucleotídeos modificados que tem 3 a 10 nucleotídeos de comprimento; e Y' é um domínio que consiste em uma sequência de 2 a 42'-desoxi-nucleotídeos ligados através de ligações intersubu- nidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ligação intersubunidade de fosfodiéster, em que os domínios X' e/ou Y' contêm um ou mais nu- cleotídeos modificados que são ligados através de uma ligação inter- subunidade N3′→P5′ fosforamidato ou N3′→P5′ tiofosforamidato.
[0099] O domínio X' compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que o domínio X' tem 4 a 10 nucleotídeos de compri- mento. Por exemplo, o domínio X' pode compreender uma sequência de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos. Um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22) desses nucleotídeos é modificado. Por exemplo, em algumas modali- dades, todos os nucleotídeos no domínio X' são modificados.
[00100] Os nucleotídeos modificados do domínio X' podem ser os mesmos que os descritos para X na Fórmula (VI) ou (VI'). Por exem- plo, os nucleotídeos do domínio X' podem ser modificados em relação a uma ou mais de suas nucleobases, as posições 2' e/ou 3' no açúcar ribose e suas ligações intersubunidades. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades também incluem que a posição 2' seja modificada com um OMe e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino), bem como Me ou OMe, e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um O-metoxietóxi e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades também incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalida- des incluem que as posições 2' e 4' sejam grupos de ponte modifica- dos (como descrito em outro lugar no presente documento) para for- mar um nucleotídeo conformacionalmente restrito e a posição 3' seja O ou NH. Cada uma dessas modalidades pode incluir tiofosfato (ou tio- fosforamidato dependendo da substituição 3') e ligações intersubuni- dades de fosforamidato.
[00101] As modalidades também incluem que a posição 2' seja OH e a posição 3' seja NH, ou que a posição 2' seja H e a posição 3' seja NH. Cada uma dessas modalidades pode incluir ligações intersubuni- dades de tiofosforamidato e/ou fosforamidato.
[00102] Os nucleotídeos do domínio X' são ligados através de liga- ções intersubunidades, por exemplo, ligações intersubunidades de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato, tiofosfato ou fosfo- diéster. Em algumas modalidades, o domínio X' é ligado através de ligações intersubunidades selecionadas de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o domínio X' compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de ligações intersubunidades de N3′→P5′ fosforamidato e/ou N3′→P5′ tiofosforamidato.
[00103] O domínio Y' compreende uma sequência de 2 a 4 2'- desoxinucleotídeos. Por exemplo, o domínio Y' pode compreender uma sequência de 2, 3 ou 4 2'-desoxinucleotídeos. Um ou mais dos 2'- desoxinucleotídeos podem ser ligados através de ligações intersubu-
nidades de tiofosfato ou fosfodiéster (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22). Em algumas modalidades, cada um dos 2'-desoxinucleotídeos é ligado através de uma ligação intersubunidade de tiofosfato. Em outras modalidades, cada um dos 2'-desoxinucleotídeos é ligado através de uma ligação intersubunidade de fosfodiéster. Em outras modalidades, o domínio Y' consiste em 2'-desoxinucleotídeos ligados através de ligações intersu- bunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ligação intersubunidade de fosfodiéster.
[00104] O domínio Z' compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que o domínio Z tem 4 a 10 nucleotídeos de compri- mento. Por exemplo, o domínio Z' pode compreender uma sequência de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos. Um ou mais desses nucleotídeos são modificados (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22). Por exemplo, em algumas moda- lidades, todos os nucleotídeos no domínio Z' são modificados.
[00105] Os nucleotídeos modificados do domínio Z' podem ser os mesmos que os descritos para Z na Fórmula (VI) ou (VI'). Por exem- plo, os nucleotídeos do domínio Z' podem ser modificados em relação a uma ou mais de suas nucleobases, as posições 2' e/ou 3' no açúcar ribose e suas ligações intersubunidades. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades também incluem que a posição 2' seja modificada com um OMe e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino), bem como Me ou OMe, e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades incluem que a posição 2' seja modificada com um O-metoxietóxi e a posição 3' seja O ou NH. As modalidades também incluem que a posição 2' seja modificada com um F (ribo ou arabino) e a posição 3' seja O ou NH. As modalida- des incluem que as posições 2' e 4' sejam grupos de ponte modifica- dos (como descrito em outro lugar no presente documento) para for- mar um nucleotídeo conformacionalmente restrito e a posição 3' seja O ou NH. Cada uma dessas modalidades pode incluir tiofosfato (ou tio- fosforamidato dependendo da substituição 3') e ligações intersubuni- dades de fosforamidato.
[00106] As modalidades também incluem oligonucleotídeos que compreendem nucleotídeos em que a posição 2' é OH e a posição 3' é NH, ou em que a posição 2' é H e a posição 3' é NH. Cada uma des- sas modalidades pode incluir ligações intersubunidades de tiofosfora- midato e/ou fosforamidato.
[00107] Os nucleotídeos do domínio Z' são ligados através de liga- ções intersubunidades, por exemplo, ligações intersubunidades de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato, tiofosfato ou fosfo- diéster. Em algumas modalidades, o domínio Z' é ligado através de ligações intersubunidades selecionadas de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o domínio Z' compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de ligações intersubunidades de N3′→P5′ fosforamidato e/ou N3′→P5′ tiofosforamidato.
[00108] Modalidades adicionais incluem um oligonucleotídeo que compreende:
[00109] (A) um ou mais nucleotídeos da fórmula que se segue: , em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nu- cleobase, R1 é –(CH2)2OCH3 ou –OCH3 e
[00110] (B) um domínio que compreende uma sequência de 2 a 10 2'-desoxi-nucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui um domínio que compreende uma sequência de 10 2'-desoxi- nucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfa- to. Oligonucleotídeos Antissenso Modificados
[00111] Outros compostos incluem oligonucleotídeos antissenso modificados. Em algumas modalidades, o ASO inclui o nucleotídeo de fórmula (I), (II), (IIIa), (IIIb), (IV), (V) e/ou (V').
[00112] Outros compostos da presente descrição incluem um oligo- nucleotídeo que tem uma sequência de nucleobase complementar a pelo menos uma porção do gene MAPT, sendo que o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo que tem a Fórmula (VIII) que se segue: (VIII), em que XA é NH ou O, Y é OR ou SR, em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, BA é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, RA' e RA'' são, cada um, independentemente em cada caso seleciona- dos de H, F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi, e RA''' é H ou RA' e RA''' jun- tos formam –O-CH2– ou –O-(CH2)2–.
[00113] Em algumas modalidades, RA' e RA''' são H; e RA'' é seleci- onado de F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi. Em outras modalidades, RA'' e RA''' são H; e RA' é selecionado de F, OMe, Me, O-metoxietóxi. Em algumas modalidades, XA é NH em cada caso.
[00114] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (VIII), em que XA é NH; BA é um G-clamp; RA' é F ou OMe e RA'' é H; ou RA' é H e RA'' é H ou F; e RA''' é H.
[00115] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (VIII), em que XA é NH; BA é uma nucleobase não modificada ou modificada; RA' e RA''' juntos for- mam um nucleotídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O- CH2– ou –O-(CH2)2–); e RA'' é H. Em algumas modalidades, BA é uma nucleobase não modificada ou modificada selecionada do grupo que consiste em 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina e 5-metiluracila.
[00116] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (VIII), em que XA é NH; B é uma nucleobase não modificada ou modificada; RA' é F ou OMe, RA'' é H e RA''' é H.
[00117] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (VIII), em que XA é NH; BA é uma nucleobase não modificada ou modificada; RA' é H, RA'' é F e RA''' é H.
[00118] Em algumas modalidades, XA é NH. Em outras modalida- des, Y é O- ou S- (com um contra-íon carregado positivamente). Em algumas modalidades, RA' ou RA'' é H e o outro é F, OH, OMe, Me, O- metoxietóxi (por exemplo, arabino-F ou ribo-F ou OMe).
[00119] Em algumas modalidades, BA é selecionado de A, C, G, U e T. Em modalidades adicionais, BA é selecionado de A, C, G, U, T, 2,6- diaminopurina, uma pirimidina 5-Me (por exemplo, 5-metilcitosina, 5- metiluracila). Em algumas modalidades, pelo menos um dentre RA' e RA'' é H. Por exemplo, em algumas modalidades, RA' é F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi e RA'' é H. Em outras modalidades, RA' é H e RA'' é F.
[00120] Em algumas modalidades, quando BA é uma nucleobase purina pelo menos um dentre RA' e RA'' é OH ou F, e/ou quando BA é uma nucleobase pirimidina pelo menos um dentre RA' e RA'' é OMe, OH ou F.
[00121] Em outras modalidades, os nucleotídeos incluem um ou mais dos nucleotídeos na Tabela E ou Tabela F. Tabela E Nucleotí- R' R'' R''' A W deo no 48 F H H NH S 49 F H H NH O 50 F H H O S 51 F H H O O 52 H F H NH S 53 H F H NH O 54 H F H O S 55 H F H O O 56 OMe H H NH S 57 OMe H H NH O 58 OMe H H O S 59 OMe H H O O 60 H F H NH S 61 H F H NH O 62 H F H O S 63 H F H O O 64 O-metoxietóxi H H NH S 65 O-metoxietóxi H H NH O 66 O-metoxietóxi H H O S
Nucleotí- R' R'' R''' A W deo no 67 O-metoxietóxi H H O O 68 H H H NH S 69 H H H NH O 70 OH H H NH S 71 OH H H NH O 72 OH H H O S 73 H OH H NH O 74 H OH H NH S 75 H OEt H NH O 76 H OEt H NH S 77 H OEt H O O 78 H OEt H O S 79 OEt H H NH O 80 OEt H H NH S 81 OEt H H O O 82 OEt H H O S Tabela F
Nucleotídeo no C A W 83 -O-CH2- NH S 84 -O-CH2- NH O 85 -O-CH2- O S
Nucleotídeo no C A W 86 -O-CH2- O O 87 -O-(CH2)2- NH S 88 -O-(CH2)2- NH O 89 -O-(CH2)2- O S 90 -O-(CH2)2- O O 91 -O-CH(Me)- NH S 92 -O-CH(Me)- NH O 93 -O-CH(Me)- O S 94 -O-CH(Me)- O O
[00122] Os compostos da presente descrição também incluem um oligonucleotídeo que tem uma sequência de nucleobase complemen- tar a pelo menos uma porção do gene MAPT, sendo que o oligonucle- otídeo compreende pelo menos dez nucleotídeos que têm a Fórmula (IX) que se segue: (IX), em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, BB é inde- pendentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modifi- cada ou uma nucleobase modificada, RB' e RB'' são cada um indepen- dentemente em cada caso selecionado de H, F, OMe, O-metoxietóxi, e RB''' é H ou RB' e RB''' juntos formam –O-CH2– ou –O-(CH2)2–.
[00123] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo é um nu- cleotídeo de Fórmula (IX).
[00124] Em algumas modalidades, RB' e RB''' são H e RB'' é selecio- nado de F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi. Em outras modalidades, RB'' e RB''' são H; e RB' é selecionado de F, OMe, Me, O-metoxietóxi.
[00125] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (IX), em que BA é um g- clamp; RB' é F ou OMe e RB'' é H; ou RB' é H e RB'' é H ou F; e RB''' é H.
[00126] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (IX), em que BA é uma nu- cleobase não modificada ou modificada; RB' e RB''' juntos formam um nucleotídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O-CH2– ou – O-(CH2)2–); e RB'' é H. Em algumas modalidades, BA é uma nucleoba- se não modificada ou modificada selecionada do grupo que consiste em 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina e 5-metiluracila.
[00127] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (IX), em que B é uma nu- cleobase não modificada ou modificada; RB' é F ou OMe, RB'' é H e RB''' é H.
[00128] Algumas modalidades incluem um ou mais nucleotídeos modificados representados pela Fórmula (IX), em que BA é uma nu- cleobase não modificada ou modificada; RB' é H, RB'' é F e RB''' é H.
[00129] Em outras modalidades, Y é S- (com um contra-íon carre- gado positivamente). Em algumas modalidades, RB' ou RB'' é H e o ou- tro é F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi (por exemplo, arabino-F ou ribo-F ou OMe).
[00130] Em algumas modalidades, BB é selecionado de A, C, G, U e T. Em modalidades adicionais, BB é selecionado de A, C, G, U, T, 2,6- diaminopurina, uma pirimidina 5-Me (por exemplo, 5-metilcitosina). Em algumas modalidades, pelo menos um dentre RB' e RB'' é H. Por exemplo, em algumas modalidades, RA' é F, OH, OMe, Me, O-
metoxietóxi e RB'' é H. Em outras modalidades, RB' é H e RB'' é F.
[00131] Em algumas modalidades, quando BB é uma nucleobase purina pelo menos um dentre RB' e RB'' é OH ou F, e/ou quando BB é uma nucleobase pirimidina pelo menos um dentre RB' e RB'' é OMe, OH ou F.
[00132] Em algumas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo de Fórmulas (VIII) ou (IX) compreende uma sequên- cia selecionada dentre aquelas na Tabela A. Em algumas modalida- des, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo de Fórmulas (VIII) ou (IX) compreende uma sequência de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleoba- ses diferentes de uma sequência selecionada dentre aquelas na Tabe- la D.
[00133] Em modalidades, os oligonucleotídeos descritos exibem uma afinidade com pelo menos uma porção do gene MAPT ou seus equivalentes de RNA e/ou exibem estabilidade complexada a pelo menos uma das seis sequências seguintes de pelo menos uma porção do gene MAPT ou seus equivalentes de RNA. Em modalidades, o oli- gonucleotídeo complexado com uma sequência do gene MAPT com- plementar tem uma temperatura de fusão (Tm) de > 37 °C. O gene MAPT pode ser uma sequência de RNA, tal como éxon 5, éxon 10 ou éxon 12. O complexo pode ser formado em condições fisiológicas ou condições quase fisiológicas, tal como em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em modalidades, a Tm do complexo é > 50 °C. Em modalidades, a Tm do complexo é de 50 a 100 °C. Em modalidades, a Tm de um oligonucleotídeo divulgado duplexado com pelo menos uma porção do gene MAPT sob condições fisiológicas ou condições quase fisiológicas é > 50 °C.
[00134] Em alguns aspectos da descrição, a sequência de nucleo- bases do oligonucleotídeo de Fórmula (VIII) ou (IX) compreende uma sequência de 12 a 22 nucleotídeos, por exemplo, 14 a 20 nucleotídeos ou 16 a 19 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo de Fórmula (VIII) ou (IX) tem 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento.
[00135] Em outro aspecto da descrição, os oligonucleotídeos des- critos no presente documento são conjugados ou modificados em uma ou mais extremidades do oligonucleotídeo.
[00136] Por exemplo, em algumas modalidades, uma extremidade terminal do oligonucleotídeo é protegida da clivagem hidrolítica por pe- lo menos um nucleotídeo modificado na dita extremidade terminal. Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado é um nucleotídeo mo- dificado que compreende uma modificação 3'-N e pode incluir uma li- gação de subunidade de tiofosforamidato. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de Fórmulas (VIII) e (IX) compreendem ainda pe- lo menos um nucleotídeo (por exemplo, 1 ou 2) na extremidade 3' e/ou 5' que contém uma ligação intersubunidade de tiofosfato e uma nu- cleobase de timina. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das Fórmulas (VIII) e (IX) compreendem ainda pelo menos um nucleo- tídeo (por exemplo, 1 ou 2) na extremidade 3' e/ou 5' que contém um nucleotídeo modificado 2'-OMe e uma nucleobase de timina. Em al- gumas modalidades, os oligonucleotídeos de Fórmulas (VIII) e (IX) compreendem ainda pelo menos um nucleotídeo modificado 2'-OMe na extremidade 3' e/ou 5' que contém uma ligação intersubunidade de tiofosfato e uma nucleobase de uracila. Em algumas modalidades, um dT invertido pode ser incorporado na extremidade 3' dos oligonucleotí- deos de Fórmulas (VIII) e (IX), levando a uma ligação 3'-3' que pode inibir a degradação por exonucleases 3' e/ou extensão por DNA poli- merases. Oligonucleotídeos Conjugados
[00137] A presente descrição também é direcionada a componentes adicionais conjugados ao oligonucleotídeo, tais como porções quími-
cas alvo e oligonucleotídeos modificados em uma ou mais extremida- des.
[00138] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos descritos no presente documento são conjugados a um ou mais grupos alvo de ligante, opcionalmente através de uma porção química de ligação, tal como um ligante HEG ou um ligante C6 ou C7 amino. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos descritos no presente documento compreendem ainda um grupo alvo de ligante conjugado na extremi- dade 5' e/ou 3' através de um ligante opcional. Em modalidades prefe- renciais, os oligonucleotídeos descritos no presente documento com- preendem ainda um grupo alvo de ligante conjugado na extremidade 5' e/ou 3' através de um ligante opcional. Em algumas modalidades, a conjugação é na extremidade 3' dos oligonucleotídeos descritos no presente documento.
[00139] Em algumas modalidades, o grupo alvo de ligante aumenta a atividade, distribuição celular ou absorção celular do oligonucleotí- deo por um tipo particular de célula, tal como células do SNC.
[00140] Em algumas modalidades, o grupo alvo de ligante pode ser uma porção química lipídica, tal como tocoferóis e ácidos graxos, co- mo ácidos hexadecanoicos (ácido palmítico) e ácidos octanoicos, tais como ácido ditio-octanoico (ácido lipoico), uma porção química palmi- toil.
[00141] Em algumas modalidades, uma extremidade terminal do oligonucleotídeo é protegida da clivagem hidrolítica por pelo menos um nucleotídeo modificado na extremidade terminal. Em algumas modali- dades, o nucleotídeo modificado é um nucleotídeo modificado que compreende uma modificação 3'-N e pode incluir uma ligação de su- bunidade de tiofosforamidato. Em algumas modalidades, o filamento de oligonucleotídeo compreende ainda pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, 1 ou 2) na extremidade 3' e/ou 5' que contém uma liga-
ção intersubunidade de tiofosfato e uma nucleobase de timina. Em al- gumas modalidades, o filamento de oligonucleotídeo compreende ain- da pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, 1 ou 2) na extremidade 3' e/ou 5' que contém um nucleotídeo modificado 2'-F, 2'-OMe, 2'-OEt ou 2'-MOE. Em algumas modalidades, o filamento de oligonucleotídeo compreende ainda pelo menos um nucleotídeo modificado 2'-OMe na extremidade 3' e/ou 5' que contém uma ligação intersubunidade tiofos- fato e uma nucleobase de uracila. Em modalidades, a extremidade 3' do ASO é anexada através de uma ligação np ou po a um ligante C6 amino ainda ligado a uma porção química alvo.
[00142] Em algumas modalidades, um dT invertido pode ser incor- porado na extremidade 3' do filamento de oligonucleotídeo, levando a uma ligação 3'-3' que pode inibir a degradação por exonucleases 3' e/ou extensão por DNA polimerases.
2. Composições
[00143] A presente descrição também abrange composições farma- cêuticas que compreendem oligonucleotídeos da presente descrição. Uma modalidade é uma composição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo de Fórmula (I), (II), (III), (IV), (V) ou (VI), ou outro oligonucleotídeo da presente descrição e um diluente ou veículo far- maceuticamente aceitável.
[00144] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que contêm o oligonucleotídeo da presente descrição é formulada para administração ao sistema nervoso central (SNC), tal como administra- ção intratecal ou intracerebroventricular. Em outras modalidades, a composição farmacêutica que contêm o oligonucleotídeo da presente descrição é formulada para administração sistêmica através de admi- nistração parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infu- são intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramus- cular; também, administração subdérmica, por exemplo, através de um dispositivo implantado. Em uma modalidade preferencial, a composi- ção farmacêutica que contêm o oligonucleotídeo da presente descri- ção é formulada para administração intratecal ou intracerebroventricu- lar. As formulações para administração do SNC podem incluir suspen- são aquosa estéril, que também pode conter tampões, diluentes e ou- tros aditivos farmaceuticamente aceitáveis como entendido pelo espe- cialista na técnica.
[00145] As composições farmacêuticas que contêm o oligonucleotí- deo da presente descrição são úteis para o tratamento de uma doença ou distúrbio, por exemplo, associado à expressão ou atividade de um gene DA.
3. Métodos de Uso
[00146] Um aspecto da presente tecnologia inclui métodos para tra- tar um indivíduo diagnosticado com, suspeito de ter, ou em risco de ter tauopatia, tal como a doença de Alzheimer (DA) e/ou qualquer outro distúrbio relacionado a tau. Em aplicações terapêuticas, as composi- ções que compreendem os oligonucleotídeos da presente descrição são administradas a um indivíduo suspeito ou que já sofre de tauopa- tia, tal como DA e/ou qualquer distúrbio relacionado à tauopatia em uma quantidade suficiente para curar, ou pelo menos parcialmente de- ter, os sintomas da doença, incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da tauopatia.
[00147] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presen- te descrição mostram afinidade com sequências de cDNA de tau, in- cluindo um éxon e/ou uma região intrônica. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente descrição mostram afinidade com alvos microgliais, tais como PLCG2, CD33, TREM2) ou alvos astrogli- ais, tais como ApoE, bem como outros alvos neuronais, tais como APP. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente descrição mostram afinidade com pelo menos uma das seguintes regi-
ões do gene MAPT na Tabela G. Tabela G: Regiã Sequências do gene Proteínas Tau Afetadas o MAPT alvo Todas as 8 isoformas: NP_058519.3, NP_005901.2, NP_058518.1, NP_058525.1, Éxon CTCGCATGGTCAGTA NP_001116539.1, 5 AAAGC NP_00116538.2, NP_001190180.1, NP_001190181.1 Todas as 8 isoformas: NP_058519.3, NP_005901.2, NP_058518.1, NP_058525.1, Exon GGAAGCGATGACAAA NP_001116539.1, 5 AAAGC NP_00116538.2, NP_001190180.1, NP_001190181.1 Todas as 8 isoformas: NP_058519.3, NP_005901.2, NP_058518.1, NP_058525.1, Exon GGCTCAAAGGATAATA NP_001116539.1, 10 TCAA NP_00116538.2, NP_001190180.1, NP_001190181.1 Todas as 8 isoformas: NP_058519.3, NP_005901.2, NP_058518.1, NP_058525.1, Éxon GGTCCCTGGACAATA NP_001116539.1, 12 TCACC NP_00116538.2, NP_001190180.1, NP_001190181.1
[00148] Em uma modalidade, os nucleotídeos da presente descri- ção mostram afinidade com o éxon 10 ou éxon 12 do mRNA de Tau.
[00149] Em outro aspecto geral, a presente descrição se refere a um método de tratamento ou redução de sintomas de uma doença,
distúrbio ou condição, tal como uma tauopatia, em um indivíduo em necessidade, que compreende a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da presente descrição.
[00150] Em outro aspecto geral, a presente descrição se refere a um método de redução da agregação de tau patológica ou dissemina- ção da tauopatia em um indivíduo em necessidade, que compreende a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da pre- sente descrição.
[00151] De acordo com modalidades da presente descrição, a com- posição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo da presente descrição. Como usado no presente documento com referência aos oligonucleotídeos da presente descrição, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade dos oligonucleotídeos da presente descrição que resulta no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição; que previne ou retarda a progressão da doença, distúrbio ou condição; ou reduz ou alivia completamente os sintomas associados à doença, distúrbio ou condição imunológica.
[00152] De acordo com modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é sufici- ente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou um sintoma associado à mesma; (ii) reduzir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associ- ado à mesma; (iii) prevenir a progressão da doença, distúrbio ou con- dição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (iv) causar regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sin- toma associado à mesma; (v) prevenir o desenvolvimento ou início da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (vi) prevenir a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (vii) reduzir a hospi- talização de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (viii) reduzir o tempo de hospitalização de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (ix) aumentar a so- brevivência de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (xi) inibir ou reduzir a do- ença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma em um indivíduo; e/ou (xii) aumentar ou melhorar o efeito (ou efeitos) profilático ou terapêutico de outra terapia.
[00153] De acordo com modalidades particulares, a doença, distúr- bio ou condição a ser tratada é uma tauopatia. De acordo com modali- dades mais particulares, a doença, distúrbio ou condição a ser tratada inclui, porém, sem limitação, doença de Alzheimer familial, doença de Alzheimer esporádica, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progres- siva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, demência senil do tipo emaranhados neurofibrilares, ema- ranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência de grãos argirofílicos, complexo parkinsonismo-demência de esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, doença corporal de Gerstmann- Sträussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpo de inclusão, doença de Creutzfeld-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral com pro- teína de príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotôni- ca, doença do neurônio motor não-Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefalopatia traumáti- ca crônica ou demência pugilística (doença do boxe).
[00154] Um fenótipo comportamental relacionado à tauopatia inclui, porém, sem limitação, deficiências cognitivas, mudança precoce de personalidade e desinibição, apatia, abulia, mutismo, apraxia, perseve- ração, movimentos/comportamentos estereotipados, hiperoralidade, desorganização, incapacidade de planejar ou organizar tarefas se- quenciais, egoísmo/insensibilidade, traços antissociais, falta de empa- tia, hesitação, discurso agramático com erros parafásicos frequentes, mas compreensão relativamente preservada, compreensão prejudica- da e déficits de busca de palavras, instabilidade de marcha lentamente progressiva, retropulsões, congelamento, quedas frequentes, rigidez axial não responsiva à levodopa, paralisia supranuclear do olhar, es- pasmos de onda quadrada, sacadas verticais lentas, paralisia pseudo- bulbar, apraxia de membros, distonia, perda sensorial cortical e tremor.
[00155] Pacientes passíveis de tratamento incluem, porém, sem limitação, indivíduos assintomáticos em risco de DA ou outra tauopa- tia, bem como pacientes que atualmente apresentam sintomas. Paci- entes passíveis de tratamento incluem indivíduos com risco genético conhecido de DA, tal como história familiar de DA ou presença de fato- res de risco genéticos no genoma. Fatores de risco exemplificativos são mutações na proteína precursora de amiloide (APP), especialmen- te na posição 717 e nas posições 670 e 671 (mutações Hardy e Sue- ca, respectivamente). Outros fatores de risco são mutações nos genes da presenilina PS1 e PS2 e na ApoE4, história familiar de hipercoleste- rolemia ou aterosclerose. Os indivíduos que atualmente sofrem de DA podem ser reconhecidos de demência característica pela presença dos fatores de risco descritos acima. Além disso, vários testes de di- agnóstico estão disponíveis para identificar os indivíduos que têm DA. Esses incluem a medição dos níveis de Tau e Abeta 42 no líquido ce- falorraquidiano. Níveis de tau elevado e de Abeta 42 diminuído signifi- cam a presença de DA. Os indivíduos que sofrem de DA também po- dem ser diagnosticados pelos critérios da Associação de DA e Distúr- bios Relacionados.
[00156] Os oligonucleotídeos da presente descrição são adequados como agentes tanto terapêuticos quanto profiláticos para tratar ou pre- venir doenças neurodegenerativas que envolvem agregação patológi- ca de tau, tais como DA ou outras tauopatias. Em pacientes assinto- máticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, por volta dos 10, 15, 20, 25, 30 anos). Normalmente, entretanto, não é necessário iniciar o tratamento até que o paciente atinja cerca de 40, 50, 60 ou 70 anos. O tratamento normalmente envolve múltiplas dosa- gens durante um período de tempo.
[00157] Em aplicações profiláticas, composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, DA em uma quantidade suficiente para elimi- nar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da do- ença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamen- tais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediá- rios apresentados durante o desenvolvimento da doença. Em aplica- ções terapêuticas, composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito ou que já sofre de tal doença em uma quanti- dade suficiente para reduzir, interromper ou atrasar qualquer um dos sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais). A administração de um medicamento pode reduzir ou eliminar o com- prometimento cognitivo leve em pacientes que ainda não desenvolve- ram a patologia de Alzheimer característica.
[00158] A quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com vários fatores, tais como a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, o meio de administração, o local alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é um ser humano ou um animal, outros medi- camentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são tituladas de forma ideal para otimizar a segurança e eficácia.
[00159] Os oligonucleotídeos da presente descrição podem ser preparados como composições farmacêuticas que contêm uma quan- tidade terapeuticamente eficaz dos oligonucleotídeos da presente des- crição como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo pode ser líquido, tal como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e se- melhantes. Por exemplo, podem ser usados 0,4% de solução salina e 0,3% de glicina. Essas soluções são estéreis e geralmente isentas de partículas. As mesmas podem ser esterilizadas por técnicas convenci- onais de esterilização bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, agentes de estabiliza- ção, espessamento, lubrificação e coloração, etc. A concentração dos oligonucleotídeos da presente descrição em tal formulação farmacêuti- ca pode variar amplamente, isto é, de menos de cerca de 0,5%, ge- ralmente em ou pelo menos cerca de 1% a até 15 ou 20% em peso e será selecionada principalmente com base na dose necessária, volu- mes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.
[00160] O modo de administração para uso terapêutico dos oligo- nucleotídeos da presente descrição pode ser qualquer via adequada que entregue o agente ao hospedeiro. Por exemplo, as composições descritas no presente documento podem ser formuladas para serem adequadas para administração parenteral, por exemplo, administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal ou intracraniana, ou podem ser administradas no fluido ce- rebrospinal do cérebro ou coluna vertebral.
[00161] Em algumas modalidades, a formulação injetável de acordo com a presente descrição pode ser administrada diretamente ao sis- tema nervoso central (SNC). Como definido no presente documento, o termo "sistema nervoso central" é definido como a parte do sistema nervoso que nos vertebrados consiste no cérebro e medula espinhal, para a qual os impulsos sensoriais são transmitidos e a partir da qual os impulsos motores passam, e que coordena a atividade de todo o sistema nervoso.
[00162] Exemplos de administração direta no SNC incluem adminis- tração intratecal (IT) e administração direta no cérebro, tais como as vias de administração intracerebral (IC), intraventricular, intracerebro- ventricular (ICV), intracraniana ou subdural. Essas vias de administra- ção podem ser particularmente benéficas para doenças que afetam o sistema nervoso central.
[00163] Assim, em certos aspectos e modalidades da presente des- crição, a administração não sistêmica é selecionada do grupo que consiste em administração intratecal, intracerebral, intraventricular, in- tracerebroventricular, intracraniana e subdural.
[00164] Em algumas modalidades, a administração não sistêmica, como definida no presente documento, é a administração intratecal. Como conhecido de um especialista na técnica, o termo "administra- ção intratecal" se refere à introdução de uma substância terapêutica por injeção no espaço subaracnoideo da medula espinal, enquanto contorna a barreira hematoencefica.
[00165] Em outras modalidades, a administração não sistêmica, como definida no presente documento, é a administração intracerebro- ventricular.
[00166] Como conhecido na técnica, o sistema ventricular é um conjunto de quatro cavidades interconectadas (ventrículos) no cérebro, em que o líquido cefalorraquidiano (LCR) é produzido. Dentro de cada ventrículo existe uma região do plexo coroide, uma rede de células ependimárias envolvidas na produção de LCR. O sistema ventricular é contínuo com o canal central da medula espinhal, permitindo a que o fluxo de LCR circule.
[00167] Apesar do papel protetor que a barreira hematoencefálica desempenha na proteção do cérebro, a mesma limita o acesso ao sis- tema nervoso central (SNC) de potenciais terapêuticos projetados para doenças neurodegenerativas. Doenças neurodegenerativas, tais co- mo, porém, sem limitação, doença de Alzheimer, podem se beneficiar muito com a introdução de agentes terapêuticos diretamente no SNC. Uma das vias diretas de administração no SNC é a injeção direta nos ventrículos laterais cerebrais, por administração intracerebroventricu- lar, que resulta na administração de materiais no SNC através do lí- quido cefalorraquidiano.
[00168] Portanto, como é conhecido na técnica e usado no presente documento, o termo "administração intracerebroventricular" se refere à injeção direta nos ventrículos laterais cerebrais.
[00169] O termo "injeção" ou "injetável" como usado no presente documento se refere a uma injeção em bolus (administração de uma quantidade distinta de um agente para aumentar sua concentração em um fluido corporal), injeção em bolus lenta ao longo de vários minutos ou infusão prolongada, ou várias injeções/infusões que são adminis- tradas em intervalos espaçados.
[00170] O tratamento pode ser dado em uma programação de dose única ou como uma programação de múltiplas doses em que um curso primário de tratamento pode ser com 1 a 10 doses separadas, seguido por outras doses administradas em intervalos de tempo subsequentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta, por exemplo, em 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose (ou do- ses) subsequente após vários meses. Exemplos de esquemas de tra-
tamento adequados incluem: (i) 0, 1 mês e 6 meses, (ii) 0, 7 dias e 1 mês, (iii) 0 e 1 mês, (iv) 0 e 6 meses, ou outras programações suficien- tes para obter as respostas desejadas com a expectativa de reduzir sintomas da doença ou reduzir a gravidade da doença.
[00171] De acordo com modalidades particulares, uma composição usada no tratamento de uma tauopatia pode ser usada em combina- ção com outros agentes que sejam eficazes para o tratamento de do- enças neurodegenerativas relacionadas. No caso de DA, os oligonu- cleotídeos da presente descrição podem ser administrados em combi- nação com agentes que reduzem ou evitam a deposição de beta- amiloide (Abeta). É possível que as patologias PHF-tau e Abeta sejam sinérgicas. Portanto, a terapia de combinação visando a eliminação tanto de PHF-tau e Abeta quanto de patologias relacionadas ao Abeta ao mesmo tempo pode ser mais eficaz do que direcionar cada uma individualmente. No caso da doença de Parkinson e doenças neuro- degenerativas relacionadas, a modulação imunológica para eliminar formas agregadas da proteína alfa-sinucleína também é uma terapia emergente. Uma terapia de combinação que visa a eliminação de pro- teínas tau e alfa-sinucleína simultaneamente pode ser mais eficaz do que direcionar qualquer uma das proteínas individualmente.
[00172] Em outro aspecto geral, a presente descrição se refere a um método para produzir uma composição farmacêutica que compre- ende um oligonucleotídeo da presente descrição, que compreende a combinação do oligonucleotídeo com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.
[00173] Em algumas modalidades, os indivíduos tratados com a composição de oligonucleotídeo da presente descrição mostrarão me- lhora ou eliminação de uma ou mais das seguintes condições ou sin- tomas: doença de Alzheimer familial, doença de Alzheimer esporádica, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo
17 (FTDP-17), paralisia supranuclear progressiva, degeneração corti- cobasal, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, demência se- nil do tipo emaranhados neurofibrilares, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência de grãos argirofílicos, complexo parkinsonismo-demência de esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, doença corporal de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpo de inclusão, doença de Creu- tzfeld-Jakob, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral com proteína de príon, panencefa- lite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não-Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinso- nismo pós-encefalítico, encefalopatia traumática crônica e demência pugilística (doença do boxe).
[00174] Em algumas modalidades, os indivíduos tratados com a composição de oligonucleotídeo da presente descrição mostrarão uma redução nos níveis de expressão de um ou mais biomarcadores sele- cionados entre a proteína tau e o mRNA MAPT, em comparação com indivíduos não tratados que sofrem de tauopatia, tal como DA e/ou qualquer outro distúrbio associado a tau.
[00175] A presente descrição fornece um método para tratar um indivíduo diagnosticado com ou suspeito de ter tauopatia, tal como DA e/ou qualquer outro distúrbio associado a tau, que compreende a ad- ministração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composi- ção de oligonucleotídeo da presente descrição.
[00176] Os oligonucleotídeos e composições da presente descrição podem ser usados em terapia antissenso. Por exemplo, o oligonucleo- tídeo pode conter uma sequência de nucleobase que é complementar ou hibridiza com uma sequência de ácido nucleico alvo de uma se- quência de DNA ou RNA conhecida implicada em DA, tal como pelo menos uma porção do gene MAPT.
[00177] Algumas modalidades incluem um método para modular a expressão de um alvo contatando-se um ácido nucleico alvo com um composto antissenso que compreende o oligonucleotídeo da presente descrição. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo está em uma célula, por exemplo, em um animal, tal como um ser humano.
[00178] Algumas modalidades incluem um método para inibir a ex- pressão de um gene MAPT em um animal, que compreende a admi- nistração ao animal de um composto antissenso que compreende o oligonucleotídeo da presente descrição. O oligonucleotídeo pode ser complementar ou hibridar com uma porção do gene MAPT.
[00179] Algumas modalidades incluem um método para reduzir a expressão de mRNA de tau ou níveis de proteína tau em um indivíduo com DA, que compreende a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou uma composição da presente descrição ao indivíduo em necessidade, reduzindo assim a expressão de mRNA de tau ou níveis de proteína tau no indivíduo. O oligonucleotídeo pode ser complementar ou hibridar com uma porção do RNA alvo envolvido na expressão de mRNA de tau, tal como o mRNA MAPT.
[00180] Os oligonucleotídeos e composições da presente descrição podem ser usados, por exemplo, para inibir ou reduzir expressão de tau ou do gene MAPT ou inibir a transcrição ou tradução de tau ou MAPT para o tratamento de um indivíduo com DA ou para reduzir os níveis de proteína tau ou MAPT em um indivíduo que tem ou diagnos- ticado com DA. Em modalidades, os oligonucleotídeos quiméricos descritos são usados para induzir a atividade de RNase H em um gene alvo, tal como o gene MAPT.
[00181] A presente descrição também é direcionada a métodos de estabilização de um oligonucleotídeo para administração a um indiví- duo. A estabilização de um oligonucleotídeo é caracterizada [quantifi-
cada] no presente documento como o aumento do ponto ou tempera- tura de fusão, Tm, de um oligonucleotídeo.
[00182] Os construtos de oligonucleotídeo descritos podem ser ad- ministrados sozinhos ou em combinação com um ou mais tratamentos adicionais para a enfermidade alvo. Os construtos de oligonucleotí- deos descritos podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais tratamentos adicionais para DA. Em terapias de com- binação, os construtos de oligonucleotídeo e um ou mais tratamentos adicionais para DA podem ser administrados simultaneamente nas mesmas composições ou em composições separadas, ou administra- dos separadamente, ao mesmo tempo ou sequencialmente.
[00183] Em algumas modalidades, os construtos de oligonucleotí- deo descritos são administrados em combinação com inibidores da transcrição ou tradução de tau ou MAPT ou em regimes que combi- nam agentes oligonucleotídeos anti-DA com inibidores da transcrição ou tradução de tau ou MAPT. Em modalidades, os construtos de oli- gonucleotídeo descritos são administrados em combinação com pa- drão de tratamento de cuidados para tauopatias, tais como DA. O pa- drão de tratamento de cuidados para tauopatias, tais como DA pode incluir inibidores da acetilcolina esterase, moduladores do receptor NMDA, inibidores BACE, inibidores da agregação de proteínas, anti- corpos anti-tau, anticorpos anti-Abeta, vacinação tau, vacinação Abeta e outros tratamentos conhecidos para tauopatias. Em modalidades, os construtos de oligonucleotídeos descritos são administrados em com- binação com um ou mais oligonucleotídeos após dosagem simultânea (coadministração) ou sequencial. Os oligonucleotídeos podem incluir oligonucleotídeos de siRNA, oligonucleotídeos antissenso, tais como TauASO-12 (Devos et al., Sci Transl Med. 2017, 25 de janeiro; 9 (374)), mimetizadores ou inibidores de miRNA, aptâmeros, bloqueado- res estéricos, saRNA, shRNA e/ou oligonucleotídeos imunomodulado-
res.
[00184] Algumas modalidades incluem a inibição da expressão do gene MAPT em uma célula ou indivíduo, que compreende colocar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição da presen- te descrição, ou a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição da presente descrição a um indivíduo em necessidade da mesma.
[00185] Algumas modalidades incluem o tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade do gene MAPT, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição da presente descrição a um indivíduo em necessidade da mesma.
[00186] Algumas modalidades incluem um método para reduzir a expressão de mRNA de tau ou níveis de proteína tau de uma tauopa- tia, tal como a doença de Alzheimer (DA) em um indivíduo com uma tauopatia, que compreende a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição da presen- te descrição ao indivíduo em necessidade da mesma, reduzindo assim a expressão de mRNA de tau ou níveis de proteína tau no indivíduo.
[00187] Algumas modalidades incluem um método para reduzir a expressão de mRNA MAPT ou níveis de proteína MAPT de uma tauo- patia, tal como a doença de Alzheimer (DA) em um indivíduo com uma tauopatia, que compreende a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou composição da presen- te descrição ao indivíduo em necessidade da mesma, reduzindo assim a expressão de mRNA MAPT ou os níveis de proteína MAPT no indi- víduo.
[00188] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo ou composição da presente descrição visando MAPT é administrado a um indivíduo com tauopatia, tal como doença de Alzheimer e/ou qualquer distúrbio relacionado à tauopatia, de modo que a expressão do gene MAPT e/ou nível de proteína tau, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue ou outro tecido ou fluido do indivíduo sejam reduzidos em pelo menos cerca de 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos cerca de 99% ou mais, ou valo- res entre dois desses números, após a administração ao indivíduo do oligonucleotídeo ou composição da presente descrição. Em algumas modalidades, os níveis de proteína tau são diminuídos pela quantidade citada anteriormente. Em algumas modalidades, a expressão de um ou mais genes, incluindo o gene MAPT, é diminuída pela quantidade citada anteriormente.
[00189] A administração do oligonucleotídeo ou composição da presente descrição de acordo com os métodos e usos da descrição pode resultar em uma redução da gravidade, sinais, sintomas e/ou marcadores de tais doenças ou distúrbios em um paciente com tauo- patia tal como doença de Alzheimer e/ou qualquer distúrbio relaciona- do à tauopatia. Por "redução", neste contexto, entende-se uma dimi- nuição estatisticamente significativa em tal nível. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou cerca de 100%, ou valores entre dois desses números.
[00190] A quantidade de um oligonucleotídeo ou composição da presente descrição pode ser determinada por um profissional médico. A dosagem diária dos produtos pode ser variada em uma ampla faixa de 0,001 a 1.000 mg por ser humano adulto por dia, ou qualquer faixa nela.
Para administração IT ou ICV, as composições são fornecidas preferencialmente na forma de suspensões contendo 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250 e 500 mili- gramas de princípio ativo para o ajuste sintomático da dosagem ao paciente a ser tratado.
Uma quantidade eficaz do fármaco é ordinaria- mente fornecida a um nível de dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cer- ca de 100 mg/kg de peso corporal por dia, ou qualquer faixa entre as mesmas.
De preferência, a faixa é de cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg/kg de peso corporal por dia, ou qualquer faixa nela.
Mais preferen- cialmente, de cerca de 0,01 a cerca de 10,0 mg/kg de peso corporal por dia, ou qualquer faixa entre as mesmas.
Mais preferencialmente, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 mg/kg de peso corporal por dia, ou qualquer faixa entre as mesmas.
Os oligonucleotídeos podem ser ad- ministrados em um regime de 1 a 4 vezes por dia.
Por exemplo, os oli- gonucleotídeos da presente descrição podem ser administrados em uma ou mais doses de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg.
Por exemplo, os oligonucleotídeos descritos podem ser administrados em uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou cerca de 100 mg/kg.
Valores e faixas intermediários aos valores enumerados também se destinam a fazer parte desta descrição.
Esses valores podem se apli-
car à administração intratecal ou intracerebroventricular. Outras formas de administração descritas no presente documento também podem ser administradas nessas doses. As dosagens podem ser variadas de- pendendo da necessidade dos pacientes, da gravidade da condição a ser tratada e dos oligonucleotídeos a serem empregados. O uso de administração diária ou dosagem pós-periódica pode ser usado.
[00191] Os oligonucleotídeos da presente descrição podem ser ad- ministrados por infusão intratecal ou intracerebroventricular durante um período de tempo, tal como ao longo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou cerca de um período de 25 minutos. A administração pode ser repetida, por exemplo, em uma ba- se regular, tal como semanalmente, quinzenalmente (ou seja, a cada duas semanas) por um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência. Por exemplo, após a adminis- tração semanal ou quinzenal durante três meses, a administração po- de ser repetida uma vez por mês, durante seis meses ou um ano ou mais.
[00192] A eficácia do tratamento ou prevenção da doença pode ser avaliada, por exemplo, medindo-se a progressão da doença, remissão da doença, gravidade dos sintomas, medidas cognitivas, redução da dor, qualidade de vida, dose de um medicamento necessário para sus- tentar um efeito de tratamento, nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma determina- da doença sendo tratada ou visada para prevenção. Está bem dentro da capacidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do tra- tamento ou prevenção medindo-se qualquer um desses parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de uma tauopatia, tal como DA, pode ser avaliada, por exemplo, por monitoramento periódico da expressão do gene MAPT e/ou dos níveis de proteína tau. A comparação das leituras posteriores com as leituras iniciais fornece uma indicação da efetividade do trata- mento.
4. Definições
[00193] Deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção. As definições que se seguem devem se aplicar, a menos que seja indica- do de outra forma.
[00194] Como usados no presente documento, os termos "comple- mentar" ou "complementaridade", como usados no presente documen- to com referência a polinucleotídeos (ou seja, uma sequência de nu- cleotídeos, como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) se referem às regras de emparelhamento de bases. O complemento de uma sequência de ácido nucleico, tal como usado no presente docu- mento, se refere a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico de modo que a extremidade 5' de uma sequência esteja emparelhada com a extremidade 3' da outra, está em "associação antiparalela". Por exemplo, a sequência "5'-AGT-3'" é complementar à sequência "3'-TCA-5". Certas bases não encontradas comumente em ácidos nucleicos de ocorrência natural podem ser in- cluídas nos ácidos nucleicos descritos no presente documento. Essas incluem, por exemplo, inosina, 7-deazaguanina, Ácidos Nucleicos Blo- queados (LNA) e Ácidos Nucleicos Peptídicos (PNA). A complementa- ridade não precisa ser perfeita; dúplexes estáveis podem conter pares de bases incompatíveis, bases degenerativas ou não combinadas. Os versados na técnica de tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade do dúplex empiricamente considerando diversas variá- veis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, com- posição de base e sequência do oligonucleotídeo, força iônica e inci-
dência de pares de bases incompatíveis. Uma sequência de comple- mento também pode ser uma sequência de RNA complementar à se- quência de DNA ou seu complemento e também pode ser um cDNA.
[00195] Como usado no presente documento, o termo "hibridizar" se refere a um processo em que dois filamentos de ácido nucleico substancialmente complementares (pelo menos cerca de 65% com- plementares ao longo de um trecho de pelo menos 14 a 25 nucleotí- deos, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 90% com- plementares) recozem-se entre si sob condições apropriadamente ri- gorosas para formar um dúplex ou heterodúplex através da formação de ligações de hidrogênio entre pares de bases complementares. As hibridações são típica e preferencialmente, conduzidas com moléculas de ácido nucleico de comprimento de sonda, preferencialmente 15 a 100 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente 18 a 50 nu- cleotídeos de comprimento. As técnicas de hibridização de ácido nu- cleico são bem conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Sam- brook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. A hibridização e a força da hibridização (ou seja, a força da associação entre os ácidos nucleicos) são influenciadas por fatores como o grau de complementa- ridade entre os ácidos nucleicos, rigor das condições envolvidas e o ponto de fusão térmico (Tm) do híbrido formado. Os versados na técni- ca entendem como estimar e ajustar o rigor das condições de hibridi- zação de modo que as sequências com pelo menos um nível desejado de complementaridade hibridem de forma estável, enquanto aquelas com complementaridade inferior não. Para exemplos de condições e parâmetros de hibridização, ver, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F. M. et al. 1994, Current Pro- tocols em Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. Em algumas modalidades, a hibridização específica ocorre sob condições de hibridização rigorosas. Um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo irá "hibridizar" com o ácido nucleico alvo sob condições adequadas.
[00196] Como usado no presente documento, o termo "condições de hibridização rigorosas" se refere a condições de hibridização pelo menos tão rigorosas como as seguintes: hibridização em 50% forma- mida, 5xSSC, NaH2PO4 50 mM, pH 6,8, SDS a 0,5%, DNA de esper- ma de salmão sonicado 0,1 mg/ml e solução de Denhart 5x a 42 oC durante a noite; lavagem com 2x SSC, SDS 0,1% a 45 oC; e lavagem com 0,2x SSC, SDS a 0,1% a 45 oC. Em outro exemplo, as condições de hibridização estringentes não devem permitir a hibridização de dois ácidos nucleicos, que diferem em um trecho de 20 nucleotídeos contí- guos por mais de duas bases.
[00197] Como usado no presente documento, o termo "substanci- almente complementar", como usado no presente documento, significa que duas sequências hibridizam sob condições de hibridização rigoro- sas. O especialista na técnica entenderá que sequências substancial- mente complementares não precisam hibridizar ao longo de todo o seu comprimento. Em particular, sequências substancialmente comple- mentares podem compreender uma sequência contígua de bases que não hibridizam com uma sequência alvo, posicionada 3' ou 5' para uma sequência contígua de bases que hibridizam em condições de hibridização estringentes com uma sequência alvo.
[00198] Como usado no presente documento, o termo "farmaceuti- camente aceitável" se refere a um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, ou seja, o material pode ser incorpora- do em uma composição farmacêutica administrada a um paciente sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de forma deletéria com qualquer um dos outros componentes da composição na qual o mesmo está contido. Quando o termo "farmaceuticamente acei- tável" é usado para se referir a um veículo ou excipiente farmacêutico, está implícito que o veículo ou excipiente atendeu aos padrões exigi- dos de testes toxicológicos e de fabricação ou que está incluído no Guia de Ingredientes Inativos preparado pela Food and Drug Adminis- tration dos EUA.
[00199] Como usado no presente documento, o termo "construto" ou "construtos" dos oligonucleotídeos pode se referir a um oligonucleo- tídeo da presente descrição e, por exemplo, (1) uma porção química conjugada, tal como aquelas descritas no presente documento (tais como porções químicas alvo) ou (2) domínios de nucleotídeos modifi- cados/não modificados, tais como em alguns oligonucleotídeos quimé- ricos.
[00200] Como usado no presente documento, o termo "oligonucleo- tídeo quimérico" se refere a um oligonucleotídeo que tem mais de um domínio, por exemplo, como exemplificado pelas Fórmulas (VI) e (VII). O oligonucleotídeo quimérico pode incluir componentes adicionais, por exemplo, um grupo alvo de ligante ou nucleotídeos adicionais, agluti- nante, etc.
[00201] Como usado no presente documento, o termo "nucleosídeo modificado" se refere a um nucleosídeo que têm, independentemente, uma porção química de açúcar modificada e/ou nucleobase modifica- da. Entende-se que os nucleosídeos podem ser ligados através de li- gações intersubunidades, tais como ligações intersubunidades de fos- fodiéster, ligações intersubunidades de tiofosfato, ligações intersubu- nidades de fosforamidato e ligações intersubunidades de tiofosforami- dato, o termo "Nucleotídeos modificados" pode se referir a um nucleo- sídeo e ligação intersubunidade juntos.
[00202] Como usado no presente documento, os termos nucleoba-
ses "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adeni- na (A) e guanina (G), e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). "Nucleobases modificadas" incluem outras nucleobases sintéticas e naturais, tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2- propila e outros deri- vados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinila (-C≡C-CH3) uracila e citosina e outros derivados de alcinila de bases de pirimidina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5- halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outros uracilas e citosinas 5-substituídos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2- F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7- deazaguanina e 7-deaza-adenina e 3-deazaguanina e 3-deaza- adenina. Nucleobases modificadas adicionais incluem pirimidinas tricí- clicas, tais como fenoxazina citidina (1H-pirimido[5,4- b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][ 1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), G-clamps tais como uma fenoxazina citidi- na substituída (por exemplo, 9-(2-am-oel-hoxi)-H-pirimido[5,4-b][1, 4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2- ona), piridoindol citidina (H-pirido[3,2, 5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Nucleobases modificadas também podem incluir aquelas em que a base purina ou pirimidina é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2- piridona.
[00203] Em algumas modalidades, a nucleobase modificada é sele- cionada do grupo que consiste em 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 5-metiluracila e um g-clamp. Em algumas modalidades, o g-clamp é
.
[00204] Como usado no presente documento, os termos "grupo alvo de ligante" ou "porção química alvo" se referem a uma porção química que promove a entrega do oligonucleotídeo às células implicadas em tauopatias, aumentando a absorção celular ou melhorando a farmaco- cinética, incluindo a biodisponibilidade do oligonucleotídeo para sua sequência alvo. Esses grupos incluem ligantes alvo de receptor que visam os receptores nas superfícies das células.
[00205] Como usado no presente documento, o termo "nucleosídeo conformacionalmente restrito" se refere a nucleosídeos com uma es- trutura de açúcar em ponte ou bicíclica em que a conformação do nu- cleosídeo pode ser fixada em uma configuração particular. Por exem- plo, nucleosídeos conformacionalmente restritos incluem aqueles com enrugamento fixo de açúcar C3'-endo. Modalidades exemplificativas incluem ácidos nucleicos em ponte (BNAs), por exemplo, 2', 4'-BNA nucleosídeos tal como α-L-Metilenóxi (4′-CH2-O-2′) LNA, β-D- Metilenóxi (4′-CH2-O-2′) LNA, Etilenóxi (4′-(CH2)2-O-2′) ENA, 2',4'- BNANC[NH], 2',4'-BNANC[NMe], 2',4'-BNANC[NBn], aminóxi (4′-CH2— O—N(R)-2′) BNA e oxiamino (4′-CH2—N(R)—O-2′) BNA. Outras estru- turas BNA exemplificativas incluem, porém, sem limitação, oligonu- cleotídeos que têm pelo menos uma ponte entre as posições 4' e 2' do açúcar em que cada uma das pontes compreende independentemente 1 ou de 2 a 4 grupos ligados independentemente selecionados de — [C(R1)(R2)]n—, —C(R1)═C(R2)—, —C(R1)═N—, —C(═NR1)—, — C(═O)—, —C(═S)—, —O—, —Si(R1)2—, —S(═O)x— e —N(R1)—; em que: x é 0, 1 ou 2; n é 1, 2, 3 ou 4; cada R1 e R2 é, independentemen- te, H, um grupo protetor, hidroxila, alquila C1-C12, alquila C1-C12, substi-
tuído, alquenila C2-C12, alquenila C2-C12 substituído, alquinila C2-C12, alquinila C2-C12 substituído, arila C5-C20, arila C5-C20 substituído, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, heteroarila, hete- roarila substituído, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 subs- tituído, halogênio, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acila (C(═O)—H), acila substituído, CN, sulfonil(S(═O)2-J1) ou sulfoxil (S (═O) -J1); e cada J1 e J2 é, independentemente, H, alquila C1-C12, alquila C1-C12 substituído, alquenila C2-C12, alquenila C2-C12 substituído, alquinila C2-C12, alquinila C2-C12 substituído, arila C5-C20, arila C5-C20 substituído, acila (C(═O)— H), acila substituído, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, aminoalquila C1-C12, aminoalquila C1-C12substituído ou um grupo protetor. Certos BNAs foram preparados e descritos na literatura de patentes, bem como na literatura científica (consultar, por exemplo: as Patentes emitidas nos U.S. 7.053.207; 6.268.490; 6.770.748;
6.794.499; 7.034.133; 6.525.191; 7.696.345; 7.569.575; 7.314.923;
7.217.805 e 7.084.125, incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência. "Nucleotídeo conformacionalmente restrito" se refere a nucleosídeos conformacionalmente restritos liga- dos através de uma ligação intersubunidade.
[00206] Em algumas modalidades, o nucleosídeo conformacional- mente restrito é selecionado de LNA opcionalmente substituído ou ENA opcionalmente substituído. O LNA ou ENA opcionalmente substi- tuído pode ser substituído por uma porção química alquila, por exem- plo, um metila ou etila em uma das porções químicas –CH2–.
[00207] Como usado no presente documento, o termo "expressão" se refere à biossíntese de um produto gênico. O termo abrange a transcrição de um gene em RNA. O termo também abrange a transcri- ção de RNA em um ou mais polipeptídeos e, ainda, abrange todas as modificações pós-transcricionais e pós-traducionais de ocorrência na- tural. Os oligonucleotídeos da presente descrição podem estar dentro do citoplasma de uma célula hospedeira, no ambiente extracelular, tal como o meio de crescimento de uma cultura de células ou ancorados à membrana celular.
[00208] Como usado no presente documento, o termo "inibir a ex- pressão" se refere a uma redução ou bloqueio da expressão ou ativi- dade e não indica necessariamente uma eliminação total da expressão ou atividade.
[00209] Como usado no presente documento, o termo "reduzir os níveis de proteína" se refere à redução ou bloqueio da transcrição do mRNA para formar uma proteína codificada pelo mRNA e não indica necessariamente uma eliminação total da transcrição do mRNA ou da proteína.
[00210] Como usado no presente documento, o termo "indivíduo" se refere a mamíferos e inclui mamíferos humanos e não humanos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano, tal como um ser humano adulto.
[00211] Como usado no presente documento, o termo "tau" ou "pro- teína tau" se refere a uma proteína do sistema nervoso central e peri- férico abundante com múltiplas isoformas. No sistema nervoso central (SNC) humano, existem seis isoformas de tau principais que variam em tamanho de 352 a 441 aminoácidos devido ao splicing alternativo (Hanger et al., Trends Mol Med. 15:112 a 9, 2009). As isoformas dife- rem umas das outras pela inclusão regulada de 0 a 2 inserções N- terminais e 3 ou 4 repetições de ligação de microtúbulos dispostas em tandem e são denominadas como 0N3R (SEQ ID NO: 64), 1N3R (SEQ ID NO: 65), 2N3R (SEQ ID NO: 66), 0N4R (SEQ ID NO: 67), 1N4R (SEQ ID NO: 68) e 2N4R (SEQ ID NO: 69). Como usado no presente documento, o termo "tau de controle" se refere à isoforma de tau de SEQ ID NO: 69 que é desprovida de fosforilação e outras modificações pós-tradução. Como usado no presente documento, o termo "tau" in-
clui proteínas que compreendem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, deleções e variantes de splice de tau de tipo selvagem de comprimento total. O termo "tau" também abrange modificações pós-tradução da sequência de aminoácidos tau. As mo- dificações pós-tradução incluem, porém, sem limitação, fosforilação. A tau liga microtúbulos e regula o transporte de carga através das célu- las, um processo que pode ser modulado pela fosforilação da tau. Na DA e distúrbios relacionados, a fosforilação anormal da tau é prevalen- te e acredita-se que precede e/ou desencadeia a agregação da tau em fibrilas, denominadas filamentos helicoidais emparelhados (PHF). O principal constituinte do PHF é a tau hiperfosforilada. Como usado no presente documento, o termo "filamento tau helicoidal emparelhado" ou "PHF-tau" se refere a agregados de tau em filamentos helicoidais emparelhados. Duas regiões principais na estrutura de PHF são evi- dentes na microscopia eletrônica, o revestimento difuso e o filamento central; sendo que o revestimento difuso é sensível à proteólise e loca- lizado fora dos filamentos, e o núcleo resistente à protease dos fila- mentos que forma o cerne dos PHFs (Wischik et al. Proc Natl Acad Sci USA. 85:4884 a 8, 1988).
[00212] Como usado no presente documento, uma "tauopatia" abrange qualquer doença neurodegenerativa que envolve a agregação patológica de tau dentro do cérebro. Além da DA familiar e esporádica, outras tauopatias exemplificativas são demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia su- pranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, demência senil do tipo emaranhados neurofibrilares, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência de grãos argirofílicos, complexo parkinsonismo-demência de esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, doença corporal de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, mio-
site de corpo de inclusão, doença de Creutzfeld-Jakob, atrofia de múl- tiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, angiopatia amiloide cerebral com proteína de príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia miotônica, doença do neurônio motor não-Guamaniana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo pós-encefalítico, encefa- lopatia traumática crônica e demência pugilística (doença do boxe) (Morris et al., Neuron, 70:410 a 26, 2011).
[00213] Como usado no presente documento, os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" se destinam todos a se referir a uma melhoria ou reversão de pelo menos um parâmetro físico mensurável relaciona- do a uma tauopatia que não é necessariamente discernível no indiví- duo, mas pode ser discernível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratan- do" e "tratamento" também podem se referir a causar regressão, pre- venir a progressão ou, pelo menos, retardar a progressão da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratan- do" e "tratamento" se referem a um alívio, prevenção do desenvolvi- mento ou início, ou redução na duração de um ou mais sintomas as- sociados à tauopatia. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratan- do" e "tratamento" se referem à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratan- do" e "tratamento" se referem a um aumento na sobrevivência de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalida- de particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem à eliminação da doença, distúrbio ou condição no indivíduo.
[00214] Como usado no presente documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um ingredien- te ou componente ativo que provoca a resposta biológica ou medicinal desejada em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em rela- ção ao propósito declarado. Por exemplo, os ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. A seleção de uma dose eficaz particular pode ser de- terminada (por exemplo, através de ensaios clínicos) por aqueles ver- sados na técnica com base na consideração de vários fatores, incluin- do a doença a ser tratada ou prevenida, os sintomas envolvidos, a massa corporal do paciente, o estado imunológico e outros fatores co- nhecidos pelo especialista na técnica. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravi- dade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes po- dem ser extrapoladas de curvas de resposta à dose derivadas de sis- temas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00215] Como usado no presente documento, o termo "sal farma- ceuticamente aceitável" significa sais fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente descrição, ou seja, sais que re- têm a atividade biológica desejada do oligonucleotídeo/composto pa- rental e não transmitem efeitos toxicológicos indesejados aos mesmos.
[00216] As abreviações que se seguem são usadas nesta descri- ção. Os nucleosídeos 2'-H (desoxirribose) são denominados por uma letra maiúscula que corresponde à nucleobase, por exemplo, A, C, G e T. Os nucleosídeos 2'-OH (ribose) são denominados por uma letra r minúscula e uma letra maiúscula que corresponde à nucleobase, por exemplo, rA, rC, rG e rU. Os nucleosídeos 2'-O-Me são denominados por um m minúsculo e uma letra maiúscula que corresponde à nucleo- base, por exemplo, mA, mC, mG e mU. Os nucleosídeos 2'-MOE são denominados por um "moe" minúsculo e uma letra maiúscula que cor- responde à nucleobase, por exemplo, moeA, moeC, moeG e moeU. Os nucleosídeos 2'-ribo-F são denominados por um "f" minúsculo e uma letra maiúscula que corresponde à nucleobase, por exemplo, fA, fC, fG e fU. Os nucleosídeos 2'-arabino-F são denominados por um
"af" minúsculo e uma letra maiúscula que corresponde à nucleobase, por exemplo, afA, afC, afG e afU. mA * é 3'-amino-2'-OMe-2,6- diaminopurina. A* é 3'-amino-2'-desoxi-2,6-Diaminopurina. fA* é 3'- amino-2'-F-2,6-Diaminopurina. Os nucleosídeos do LNA são denomi- nados por um "L" e uma letra maiúscula que corresponde à nucleoba- se, por exemplo, LA, LC, LG, LT.
[00217] Para o cerne ou ligações intersubunidades dos nucleotí- deos, as ligações intersubunidades de fosfodiéster são denominadas como "PO" ou geralmente não são incluídas nos detalhes da sequên- cia; as ligações intersubunidades de tiofosfato são abreviadas como "ps" minúsculo; as ligações intersubunidades de fosforamidato são abreviadas como "np" minúsculo e as ligações intersubunidades de tiofosforamidato são abreviadas como "nps" minúsculo.
[00218] N3'→P5' se refere a nucleotídeos modificados com ligações intersubunidades, em que a porção química 3' contém N (por exemplo, NH) e é ligada através de um P, por exemplo, a estrutura que se se- gue tem uma ligação N3'→P5': .
[00219] É observado que, como usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto determina clara- mente de outra forma. É observado ainda que as reivindicações po- dem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração se destina a servir como base antecedente para o uso de terminologia exclusiva tal como "somente", "apenas" e similares em conexão com a recitação de elementos de reivindicação ou uso de uma limitação "negativa".
[00220] O termo "cerca de" será compreendido por pessoas de ha- bilidade comum na técnica e irá variar até certo ponto, dependendo do contexto em que é usado. Se houver usos do termo que não sejam claros para as pessoas de habilidade comum na técnica, dado o con- texto em que é usado, "cerca de" significará até mais ou menos 10% do termo específico. Certas faixas são apresentadas no presente do- cumento com os valores numéricos sendo precedidos pelo termo "cer- ca de". O termo "cerca de" é usado no presente documento para for- necer suporte literal para o número exato que ele precede, bem como um número que é próximo ou se aproximada do número que o termo precede. Ao determinar se um número é próximo ou se aproxima de um número recitado especificamente, o número não recitado próximo ou que se aproxima pode ser um número, que, no contexto em que é apresentado, fornece o equivalente substancial do número recitado especificamente.
[00221] Também deve ser reconhecido que os vários modos de tra- tamento ou prevenção das doenças ou condições descritas no presen- te documento se destinam a significar "substancial", o que inclui trata- mento ou prevenção total, mas também inferior ao total, e em que al- gum resultado biológica ou clinicamente relevante é alcançado. O tra- tamento pode ser um tratamento prolongado contínuo para uma doen- ça crônica ou uma administração única ou de poucas vezes para o tra- tamento de uma condição aguda.
[00222] Quando uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto determine claramente de outra forma, entre o limite superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor declarado ou intermediário em essa faixa declarada, é abrangido pela invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser inde- pendentemente incluídos nas faixas menores e também são abrangi-
dos pela invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. Onde a faixa indicada inclui um ou ambos os limi- tes, as faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos também es- tão incluídas na invenção.
[00223] Esta descrição não é limitada a modalidades particulares descritas e como tal pode variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o objetivo de descre- ver modalidades particulares apenas, e não se destina ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pe- las reivindicações anexas.
[00224] Como será evidente para aqueles versados na técnica após a leitura desta descrição, cada uma das modalidades individuais des- critas e ilustradas no presente documento tem componentes e caracte- rísticas distintas que podem ser prontamente separadas ou combina- das com as características de qualquer uma das outras diversas mo- dalidades sem se afastar do escopo ou espírito da presente invenção. Qualquer método recitado pode ser realizado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível.
[00225] Todas as publicações e patentes citadas neste relatório descritivo são incorporadas no presente documento a título de referên- cia, como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência, e são incorporadas no presente documento por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as pu- blicações são citadas. A citação de qualquer publicação é para sua descrição antes da data de depósito e não deve ser interpretada como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de ante- ceder tal publicação em virtude de uma invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar ser confirmadas independente-
mente.
5. Exemplos
[00226] Os exemplos a seguir ilustram certas modalidades da pre- sente descrição para auxiliar o especialista na prática da descrição. Por conseguinte, os exemplos não são de forma alguma considerados como limites ao escopo da descrição. Métodos para produzir
[00227] Todos os monômeros foram secos em dessecador a vácuo com dessecantes (KOH e P2O5, TA 24h). Suportes sólidos de síntese (CPG) ligados ao primeiro resíduo 5' foram obtidos de fontes disponí- veis comercialmente. Todos os outros reagentes de síntese e solven- tes foram obtidos de fontes comercialmente disponíveis e usados co- mo tal. Os produtos químicos e solventes para o fluxo de trabalho pós- síntese foram adquiridos de fontes disponíveis comercialmente e usa- dos sem qualquer purificação ou tratamento. Solvente (acetonitrila) e soluções (amidita e ativador) foram armazenados em peneiras molecu- lares durante a síntese.
[00228] Os oligonucleotídeos antissenso foram sintetizados em um sintetizador ABI-394 com o uso do ciclo padrão de 93 etapas escrito pelo fabricante. O suporte sólido era de vidro de poro controlado e os monômeros continham grupos de proteção padrão. Cada oligonucleo- tídeo foi sintetizado individualmente com o uso de 5'-O-(4,4'- dimetoxitritil)-3'-O-(2-cianoetil-N, N-di-isopropil) DNA e/ou monômeros de 2'-O-Me fosforamidita de 6-N-benzoiladenosina (ABz), 4-N- acetilcitidina (CAc), 2-N-isobutirilguanosina (GiBu) e Timidina (T) dispo- níveis comercialmente, de acordo com protocolos de síntese de oligo- nucleotídeos em fase sólida padrão. Os fosforamiditos foram adquiri- dos de fontes disponíveis comercialmente. A 2'-O-Me- 2,6,diaminopurina fosforamidita foi adquirida de fontes disponíveis co- mercialmente. O DDTT ((dimetilamino-metilideno) amino)-3H-1,2,4-
ditiazaolina-3-tiona foi usado como agente de transferência de enxofre para a síntese de fosforotioatos de oligoribonucleotídeo. Os oligonu- cleotídeos modificados foram obtidos com o uso de um acoplamento estendido de solução de fosforamidita 0,1 M em CH3CN na presença de ativador 5-(etiltio)-1H-tetrazol a um oligonucleotídeo ligado a um sólido seguido por capeamento, oxidação e desproteção padrões. A eficiência de acoplamento passo a passo de todos os fosforamiditos modificados foi superior a 98%. Os suportes sólidos contendo oligonu- cleotídeo foram aquecidos com solução aquosa de amônia/etanol (3:1) a 55 °C durante 8 h para desproteger os grupos de proteção instáveis de base.
[00229] Os oligonucleotídeos conjugados com tocoferol podem ser obtidos iniciando-se a síntese em fase sólida em suporte de tocoferol ligado ao ligante TEG e acoplamento final da fosforamidita ao oligonu- cleotídeo ligado ao suporte. As sequências conjugadas com tocoferol podem ser purificadas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em uma coluna de fase reversa RPC-Source15 embalada in- ternamente. Os tampões podem ser NaOAc 20 mM em CH3CN a 10% (tampão A) e NaOAc 20 mM em CH3CN a 70% (tampão B). HPLC analítico e ES LC-MS estabelecem a integridade dos oligonucleotí- deos.
Síntese de Oligonucleotídeos Modificados Fosforamidato (NP) e Tio- fosforamidato (NPS)
[00230] Os oligonucleotídeos modificados NP e NPS foram sinteti- zados em um sintetizador ABI-394 com o uso do ciclo de 93 etapas escrito com modificações para etapas de desbloqueio, acoplamento e espera. O suporte sólido era 3'-NHTr-5'-LCAA-CPG. Cada oligonucleo- tídeo foi sintetizado individualmente com o uso de monômeros de fos- foramidito de 3'-NH-Tr-5'-O-(2-cianoetil-N, N-di-isopropil) DNA de 6-N- benzoiladenosina (ABz), 4-N-Benzilcitidina (CBz), 2-N- isobutirilguanosina (GiBu) e Timidina (T), de acordo com protocolos de química de fosforamidita de fase sólida padrão com o uso do procedi- mento descrito em Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 14 2661 a 2668.
Blocos de construção 3'-NHTr-DNA para síntese de oligômero
[00231] Os monômeros de 2'-F 3'-NH-MMTr-5'-O-(2-cianoetil-N,N- di-isopropil) Uridina (U) e 4-N-benzoilcitidina (CBz) fosforamidita foram sintetizados com o uso do procedimento descrito em Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 15, 2966 a 2973
[00232] 2'-F 3'-NH-MMTr-5'-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropil) 6-N- benzoladenosina (ABz), 2-N-isobutirilguanosina (GiBu), foram sintetiza- dos como o procedimento descrito abaixo
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Preparação de PH-1
[00233] A uma solução de (2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)- 5-(hidroximetil)oxolano-3,4-diol (300 g, 1,123 mol, 1,00 equiv) em N,N- dimetilformamida (7.500 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionada trifenilfosfina (735 g, 2,802 mol, 2,50 equiv). A solução resultante foi agitada durante 15 min a 0 oC. Isso foi seguido pela adi- ção da solução de dietil azodicarboxilato (449,4 g, 2,581 mol, 2,54 equiv.) em N, N-dimetilformamida (7500 ml) gota a gota com agitação a 0 oC durante 60 min. A solução resultante foi agitada, durante 2 h a 25 oC. A mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida. O produto foi precipitado pela adição de éter. Os sólidos foram coletados por filtração. O produto bruto foi purificado por recristalização de meta- nol. O sólido foi seco em um forno sob pressão reduzida. Isso resultou em 186 g (66%) de PH-1 como um sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): 8,34 – 8,07 (m, 2H), 7,44 – 7,26 (m, 2H), 6,30 – 6,21 (m, 1H), 5,07 – 4,95 (m, 1H), 4,33 – 4,20 (m, 1H), 4,15 – 4,03 (m, 2H), 3,71 – 3,50 (m, 2H). Preparação de PH-2
[00234] A uma solução de PH-1 (100g, 401,2 mmol, 1,00 equiv.) em piridina (1.000 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicio- nada cloreto de benzoílo (175 g, 1,245 mol, 3,10 equiv.) gota a gota com agitação a 0 oC durante 30 min. A solução resultante foi agitada durante 3 h a 25 oC. A solução resultante foi diluída com 400 ml de acetato de etila. A mistura resultante foi lavada com 3x300 ml de água e 2x300 ml de solução de bicarbonato de sódio saturada, respectiva- mente. A mistura resultante foi lavada com 1x300 ml de solução de cloreto de sódio saturada. A mistura foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com acetato de etila/éter de pe- tróleo (2/1). Isso resultou em 157 g (70%) de PH- 2 como um sólido branco. Preparação de PH-3
[00235] A uma solução de PH-2 (30 g, 53,42 mmol, 1,00 equiv) em N,N-dimetilformamida (300 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogê- nio, foi adicionado cloreto de amônio (5,7 g, 106,56 mmol, 2,00 equiv) e azida de sódio (34,8 g, 535,30 mmol, 10,00 equiv) em ordem. A so- lução resultante foi agitada durante 5 h a 50 oC. A solução resultante foi diluída com 2.000 ml de diclorometano. A mistura resultante foi la- vada com 3x2.000 ml de água, 1x2.000 ml de solução de bicarbonato de sódio saturada e 1x2.000 ml de solução de cloreto de sódio satura- da, respectivamente. A mistura foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. Isso resultou em 24 g (90%) de PH-3 e PH-3S (5:1) como um sólido branco. Preparação de PH-4
[00236] A uma solução de PH- 3 e PH-3S (5:1) (10 g, 19,98 mmol,
1,00 equiv) em tetra-hidrofurano (100 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionado 1, 8-Diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno (10,69 g, 70,22 mmol, 3,50 equiv). Isso foi seguido pela adição de fluoreto de perfluorobutilssulfonila (12,69 g, 2,10 equiv) gota a gota com agitação a 0 oC durante 10 min. A solução resultante foi agitada durante 1,5 h a 0 oC. A solução resultante foi diluída com 200 ml de diclorometano. A mistura resultante foi lavada com 3x200 ml de água, 1x200 ml de solu- ção de bicarbonato de sódio saturada e 1x200 ml de solução de clore- to de sódio saturada, respectivamente. A mistura foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O pro- duto bruto foi recristalizado de acetato de etila/éter de petróleo na ra- zão de 1:1. Isso resultou em 6 g (60%) de PH-4 e PH-4S (5:1) como um sólido branco. MS m/z [M+H]+ (ESI): 503. Preparação de PH-5
[00237] A uma solução de PH-4 e PH-4S (5:1) (10 g, 19,90 mmol, 1,00 equiv) em tetrahidrofurano (150 ml), foi adicionada paládio carbo- no a 10% (3,0 g). O frasco foi evacuado e enxaguado três vezes com nitrogênio, seguido por enxágue com hidrogênio. A solução resultante foi agitada durante1 h à temperatura ambiente. Os sólidos foram filtra- dos. A mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto (10 g) foi purificado por Flash-Prep-HPLC com as se- guintes condições (IntelFlash-1): Coluna, C18; fase móvel, águas e acetonitrila (acetonitrila a 30% até 50% em 30 min); Detector, UV 254 nm. Isso resultou em 7 g (74%) de PH-5 como um sólido branco e 1,0 g de PH-5S como um sólido branco. MS m/z [M+H]+ (ESI): 477. Preparação de PH-6
[00238] A uma solução de PH-5 (4 g, 8,40 mmol, 1,00 equiv) em piridina (40 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionada 4-dimetilaminopiridina (1,5 g, 12,28 mmol, 1,50equiv) e cloreto de 4- metoxitrifenilmetila (10,3 g, 4,00 equiv) em ordem. A solução resultante foi agitada durante 16 h a 25 oC. A solução resultante foi diluída com 300 ml de diclorometano. A mistura resultante foi lavada com 1x300 ml de água e 3x300 ml de solução de bicarbonato de sódio saturada. A mistura resultante foi lavada com 1x300 ml de solução de cloreto de sódio saturada respectivamente. A mistura foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com diclorometano/metanol (100/1). Isso resultou em 5,7 g (91%) de PH-6 como um sólido branco. Preparação de PH-7
[00239] A uma solução de PH-6 (5g, 6,68 mmol, 1,00 equiv) em pi- ridina/metanol/água (32,2/14,7/2,4 ml), foi adicionado hidróxido de só- dio (2 mol/l) (7,2 ml, 1,10 equiv) gota a gota com agitação a 0 oC du- rante 5min. A solução resultante foi agitada durante 20 min a 0 oC. A reação foi então arrefecida bruscamente pela adição de 200 ml de água gelada. A solução resultante foi extraída com 400 ml de dicloro- metano e as camadas orgânicas combinadas. A mistura resultante foi lavada com 1x300 ml de água e 1x300 ml de solução de cloreto de só-
dio saturada. A mistura foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com metanol/ diclorometano (1:100). Isso resultou em 4,3 g (100%) de PH- 7 como um sólido branco. MS m/z [M+H]+ (ESI): 645. Preparação de PH-8
[00240] A uma solução de PH- 7 (19,4 g, 35,89 mmol, 1,00 equiv) em diclorometano (200 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionada 3-([bis [bis (propan-2-il) amino] fosfanil] oxi) propanonitrila (11,79 g, 39,12 mmol, 1,30 equiv). Isso foi seguido pela adição de 4, 5- Dicianoimidazol (4,26 g, 1,20 equiv) a 0 oC. A solução resultante foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com 1.000 ml de diclorometano. A mistura resultante foi la- vada com 3x800 ml de solução de bicarbonato de sódio saturada e 1x800 ml de solução de cloreto de sódio, respectivamente. A mistura foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por Flash-Prep-HPLC com as seguintes condições: Coluna, C18; fase móvel, águas e aceto- nitrila (acetonitrila a 40% até 80% em 6 min); Detector, UV 254 nm. Isso resultou em 15,2 g (50%) de PH-8 como um sólido branco. MS m/z [M+H] + (ESI): 845.
Preparação de PH-11
[00241] A uma solução de 2-amino-9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi- 5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-6,9-di-hidro-1H-purin-6-ona (700 g, 2,47mol, 1,00 equiv) em N,N-dimetilformamida (7 l) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionado imidazol (504 g, 7,41mol, 3,00 equiv). Isso foi seguido pela adição de 1, 3-Dicloro-1, 1, 3, 3-
tetraisopropildisiloxano (770 g, 2,44 mol, 1,00 equiv) gota a gota com agitação a 20 oC. A solução resultante foi agitada durante 16 h a 20 o C. A solução de reação foi então vertida em 70 l de água/gelo. Os só- lidos foram coletados por filtração. Isso resultou em 1.200 g (92%) de PH-11 como um sólido branco. MS m/z [M+H] + (ESI): 526. Preparação de PH-12
[00242] A uma solução de PH-11 (530 g, 1,01 mol, 1,00 equiv) em diclorometano (5.000 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionada piridina (725 g, 9,17mol, 9,00equiv) e 4- dimetilaminopiridina (147 g, 1,20mol, 1,20equiv) em ordem. Isso foi seguido pela adição de anidrido trifluorometanossulfônico (426 g, 1,51 mol, 1,20 equiv) gota a gota com agitação a 0 oC. A solução resultante foi agitada durante 15 min a 0 oC. Então a solução resultante foi deixa- da reagir com agitação, por mais 2 h a 20 oC. A solução resultante foi diluída com 5.000 ml de diclorometano. A solução resultante foi lavada com 2x3000 ml de bicarbonato de sódio saturado e 1x3.000 ml de clo- reto de sódio saturado, respectivamente. A solução foi seca sobre sul- fato de sódio anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. Isso resultou em 600 g (90%) de PH- 12 como um sólido marrom.
[00243] O produto foi usado na próxima etapa diretamente sem pu- rificação adicional. Preparação de PH-13
[00244] A uma solução de PH-12 (200 g, 304,04 mmol, 1,00 equiv) em N,N-dimetilformamida (1.000 ml) com uma atmosfera inerte de ar- gônio, foi adicionado nitrito de sódio (115 g, 1,67 mol, 5,00 equiv). A mistura resultante foi agitada durante 16 h a 25 oC. A solução resultan- te foi vertida em 5.000 ml de água/gelo. Os sólidos foram coletados por filtração. O produto bruto foi recristalizado de diclorometa- no/acetonitrila na razão de 1/4 (50 ml/g). Isso resultou em 78 g (49% sobre as duas últimas etapas) de PH-13 como um sólido. MS m/z [M+H] + (ESI): 526. Preparação de PH-14
[00245] A uma solução de PH- 13 (50 g, 95,10 mmol, 1,00 equiv) em tetra-hidrofurano (500 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adicionado fluoreto de tetrabutilamônio (95 ml, 1,00 equiv, 1N em tetra-hidrofurano). A mistura resultante foi agitada durante 12 h a 20 o C. A mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida. O pro- duto bruto foi recristalizado de metanol/acetato de etila na razão de 1/5 (20 ml/g) três vezes. Os sólidos foram coletados por filtração, e então purificados por Flash com as seguintes condições: Coluna, C18 sílica- gel; fase móvel, águas e acetonitrila (acetonitrila a 2% até 10% em 10 min); Detector, UV 254 nm. Isso resultou em 16 g (59%) de PH- 14 como um sólido marrom. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): 10,44(s, 1H), 6,49(s, 2H), 6,02(s, 1H), 5,55-5,65(m, 2H), 5,10(s, 1H), 4,08(m, 2H), 3,76(m, 1H), 3,64(m, 1H). Preparação de PH-15
[00246] À solução de PH-14 (220 g, 776,72 mmol, 1,00 equiv) em N,N-dimetilformamida (2.000 ml) com uma atmosfera inerte de argô- nio, foi adicionada trifenilfosfina (509 g, 1,94 mol, 2,50 equiv). A solu- ção resultante foi agitada durante 1,5 h a 0 oC. A essa foi adicionado azodicarboxilato de dietila (338 g, 1,94mol, 2,50 equiv) gota a gota com agitação a 0 oC. A solução resultante foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente. A mistura resultante foi vertida em 20 l de éter etílico gelado. Os sólidos foram coletados por filtração, então recristali- zados de metanol/ acetato de etila na razão de 1/10 (10 ml/g). Isso re- sultou em 100 g (49%) de PH-15 como um sólido marrom. MS m/z [M+H]+ (ESI): 266. Preparação de PH-16
[00247] A uma solução de PH-15 (100 g, 377,0 mmol, 1,00 equiv) em N,N-dimetilformamida (1.000 ml) com uma atmosfera inerte de ni- trogênio, foi adicionado imidazol (77 g, 1,131 mol, 3,00 equiv). Isso foi seguido pela adição de cloreto de terc-butildimetilsilila (142 g, 942 mmol, 1,50 equiv.) gota a gota com agitação a 0 oC. A solução resul-
tante foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente. A reação foi en- tão arrefecida bruscamente pela adição de metanol. A mistura resul- tante foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com diclorometano/metanol (100:1~15:1). Is- so resultou em 80 g (85%) de PH-16 como um sólido. MS m/z [M+H]+ (ESI): 380. Preparação de PH-17
[00248] A uma solução de PH-16 (73 g, 192,37 mmol, 1,00 equiv) em piridina (730 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogênio, foi adici- onada 4-dimetilaminopiridina (23,5 g, 192,35 mmol, 0,50 equiv). Isso foi seguido pela adição de anidrido isobutírico (213 g, 1,35mol, 5,00 equiv) gota a gota com agitação. A solução resultante foi agitada du- rante 3 h a 50 oC. A reação foi então arrefecida bruscamente pela adi- ção de água gelada. A solução resultante foi extraída com 3x2.000 ml de diclorometano e as camadas orgânicas combinadas. A mistura re- sultante foi lavada com 3x2.000 ml de bicarbonato de sódio saturado, 3x2.000 ml de água e 3x2.000 ml de cloreto de sódio saturado, respec- tivamente. As camadas orgânicas foram secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas, e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com diclorometano/metanol (100:1~20:1). Isso resultou em 52 g (60%) de PH-17 como um sólido amarelo. MS m/z [M+H]+ (ESI): 450. Preparação de PH-18
[00249] A uma solução de PH-17 (20 g, 44,4 mmol, 1,00 equiv) em N, N-dimetilformamida (100 ml) com uma atmosfera inerte de nitrogê- nio foi adicionada azida de sódio (18 g, 267 mmol, 6,00 equiv). A solu- ção resultante foi agitada durante 2 h a 80 oC. A mistura resultante foi diluída com 1.000 ml de diclorometano. A solução resultante foi lavada com 3x1.000 ml de bicarbonato de sódio saturado, 3x1.000 ml de água e 3x1.000 ml de cloreto de sódio saturado, respectivamente. A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob pressão re- duzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com diclo- rometano/metanol (100/1~40/1). Isso resultou em 11 g (50%) de PH- 18/PH-18S (5.2:1) como um sólido amarelo. MS m/z [M+H]+ (ESI): 493 Preparação de PH-19
[00250] A uma solução de PH-18/PH-18S (5,2:1) (16 g, 37,87 mmol, 1,00 equiv) em diclorometano (160 ml), foi adicionada piridina (23 g, 290,77 mmol, 9,00 equiv) e dimetilaminopiridina (4,35 g, 35,66 mmol, 1,20 equiv). Isso foi seguido pela adição de 1, 3-bis (trifluorometilsulfo- nil)trioxidano (11,9 g, 37,88 mmol, 1,20equiv) gota a gota com agitação a 0 oC. A solução resultante foi agitada durante 2 h a 20 oC. A reação foi arrefecida bruscamente pela adição de água/gelo. A mistura resul- tante foi extraída com 2x1.000 ml de diclorometano e as camadas or- gânicas combinadas. A solução resultante foi lavada com 1x1.000 ml de cloreto de sódio saturado. A solução resultante foi concentrada sob pressão reduzida. Isso resultou em 16 g (68%) de PH-19/PH-19S co-
mo um sólido marrom. O produto foi usado na próxima etapa direta- mente sem purificação adicional. Preparação de PH-20
[00251] A uma solução de PH-19/PH-19S (16 g, 25,61mmol, 1,00 equiv) em tetrahidrofurano (160 ml) com uma atmosfera inerte de ar- gônio, foi adicionado fluoreto de tetrabutilamônio (100 ml, 5,00 equiv) gota a gota com agitação a 0 oC. A solução resultante foi agitada du- rante 5 h à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com
1.000 ml de diclorometano. A solução resultante foi lavada com 1x500 ml de água e 1x500 ml de cloreto de sódio saturado, respectivamente. A solução resultante foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com diclorometano/metanol (100/1~20/1). Isso resultou em 8 g (85%) de PH-20/PH-20S (7:1) um sólido amarelo. MS m/z [M+H]+ (ESI): 381. Preparação de PH-21
[00252] A uma solução de PH-20/PH-20S (3,4 g, 8,94mmol, 1,00 equiv) em metanol (50 ml) foi adicionado paládio carbono a 10% (1,7 g). O frasco foi evacuado e enxaguado três vezes com nitrogênio, se- guido por enxágue com hidrogênio. A solução resultante foi agitada durante1 h à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com 100 ml de metanol. Os sólidos foram filtrados. A solução resultan- te foi concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por Flash-Prep-HPLC com as seguintes condições: Coluna, C18 sílica-
gel; fase móvel, águas e acetonitrila (acetonitrila a 5% até 50% em 35 min); Detector, UV 254 nm. Isso resultou em 1,7 g (54%) de PH-21 como um sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): 12,13 (s, 1H), 11,91 (s, 1H), 8,91 (s, 2H), 8,23 (s, 2H), 7,25 (m, 1H), 5,78 (m, 1H), 4,62-3,72 (m, 4H), 2,92 (m, 1H), 1,13 (s, 6H). Preparação de PH-22
[00253] A uma solução de PH-21 (6,0 g, 16,95 mmol, 1,00 equiv) em piridina/N,N-di-isopropiletilamino (100/20 ml) com uma atmosfera inerte de argônio, foi adicionado 1-(clorodifenilmetil)-4-metoxibenzeno (6,24 g, 20,34 mmol, 1,20 equiv). A solução resultante foi agitada du- rante16 h à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com
1.000 ml de diclorometano. A solução resultante foi lavada com 1x250 ml de bicarbonato de sódio saturado, 1x250 ml de água e 1x250 ml de cloreto de sódio saturado respectivamente. O resíduo foi aplicado em uma coluna de sílica-gel com diclorometano/metanol (100/1~50/1). Is- so resultou em 13 g (74%) de PH-22 como um sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): 12,15 (s, 1H), 11,70 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,49 (m, 4H), 7,24 (m, 6H), 7,15 (m, 2H), 6,72 (m, 2H), 5,82 (m, 1H), 5,30 (m, 1H), 4,04 (m, 3H), 3,62 (s, 3H), 3,45 (m, 1H), 2,83-2,62 (m, 3H), 1,10 (m, 6H). Preparação de PH-23
[00254] A uma solução de PH-22 (7,8 g, 12,45 mmol, 1,00 equiv.) em diclorometano (80 ml) com uma atmosfera inerte de argônio, foram adicionados 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloxi)propanonitrila (7,5 g, 24,92 mmol, 2,00 equiv.) e 4,5-dicianoimidazol (2,2 g, 18,63 mmol, 1,50 equiv.) em ordem. A solução resultante foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente. A mistura resultante foi diluída com 1.000 ml de diclorometano. A solução resultante foi lavada com 3x250 ml de bicar- bonato de sódio saturado, 3x250 ml de água e 3x250 ml de cloreto de sódio saturado respectivamente. A solução resultante foi concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por Flash-Prep- HPLC com as seguintes condições: Coluna, C18 sílica-gel; fase móvel, águas e acetonitrila (acetonitrila a 40% até 95% em 35 min); Detector, UV 254 nm. Isso resultou em 8,06 g (78%) de PH-23 como um sólido branco. MS m/z [M+H] + (ESI): 827. Blocos de construção 2'-F-3'-NHTr para síntese de oligômero
[00255] Os monômeros de fosforamidita 2'-O-Me 3'-NH-MMTr-5'-O- (2-cianoetil-N, N-di-isopropil) de 6-N-benzoiladenosina (ABz), 4-N- Benzilcitidina (CBz), 2-N-isobutirilguanosina (GiBu) e Uridina (U) como mostrado abaixo foram sintetizados com o uso do procedimento des- crito no documento WO 200118015 A1
Blocos de construção 2'-O-Me-3'-NHTr para síntese de oligômero
[00256] Fosforamidatos exemplificativos incluem: Descrição da matéria-prima 3'-NHTr-dA(Bz) 3'-NHTr-dC(Bz) 3'-NHTr-dG(iBu) 3'-NHTr-T: 3'-NHMMTr-2'-F-A(NH-Bz) 3'-NHMMTr-2'-F-C(NH-Bz) 3'-NHMMTr-2'-F-G(NH-iBu) 3'-NHMMTr-2'-F-U: 3'-NHMMTr-2'-OMe-A(NH-Bz) 3'-NHMMTr-2'-OMe-C(NH-Bz) 3'-NHMMTr-2'-OMe-G(NH-iBu) 3'-NHMMTr-2'-OMe U: 3'-NHTr (dA, dC, dG e dT)-CPG 500Å: Carregamento: 64 a 83 μmol/g
[00257] A fosforamidita reversa 3'-O-DMT-desóxi Adenosina (NH-
Bz), 5'-O-(2-cianoetil-N, N-di-isopropila fosforamidita, 3'-O-DMT-desóxi Guanosina (NH-ibu), 5'-O-(2-cianoetil-N, N-di-isopropila fosforamidita, 3'-O-DMT-desóxi Citosina (NH-Bz), 5'-O-(2-cianoetil-N, N-di-isopropila fosforamidita, 3'-O-DMT-desóxi Timidina (NH-Bz), 5'-O-(2-cianoetil-N, N-di-isopropila fosforamidita e suportes sólidos reversos foram adquiri- dos de fontes comercialmente disponíveis (Chemgenes).
Blocos de construção de DNA reverso para síntese de oligômero
[00258] Fosforamiditas reversas exemplificativas usadas para esta descrição incluem: Descrição da matéria-prima 3'-O-DMTr-2'-OMe-A(NH-Bz) 3'-O-DMTr-2'-OMe-C(NH-Bz) 3'-O-DMTr-2'-OMe-G(NH-iBu) 3'-O-DMTr-2'-OMe-U: 3'-ODMTr (dA, dC, dG e dT)-CPG 500Å: Carregamento: 64 a 83 μmol/g
[00259] Para produzir os oligômeros com as seguintes modifica-
ções: 2'-F-NPS-PS-2'-F-NPS; 2'-F-NP-PS-2'-F-NP; 2'-OMe-NP-PS-2'- OMe-NP; 2'-OMe-NPS-DNA-PS-2'-OMe-NPS, a síntese foi realizada em uma escala de 1 µM na direção 5' para 3' com os monômeros de 5'-fosforamidita diluídos para uma concentração de 0,1 M em CH3CN anidro na presença de ativador 5-(benziltio)-1H-tetrazol (tempo de acoplamento 2,0 a 4,0 min) a um oligonucleotídeo ligado a sólido se- guido por capeamento, oxidação e desproteção padrão proporcionou oligonucleotídeos modificados. A eficiência de acoplamento passo a passo de todos os fosforamiditos modificados foi superior a 98%. O DDTT (dimetilamino-metilideno) amino)-3H-1, 2,4-ditiazaolina-3-tiona foi usado como agente de transferência de enxofre para a síntese de fosforotioatos de oligoribonucleotídeo. Os suportes sólidos contendo oligonucleotídeos foram aquecidos à temperatura ambiente com solu- ção aquosa de amônia/metilamina (1:1) durante 3 h em agitador para clivagem do suporte e desproteção dos grupos de proteção instáveis de base. Exemplos 1 a 4
[00260] Os blocos de construção 2'-O-metoxietil-3'- aminonucleosídeo-5'-fosforamidita apropriadamente protegidos
(exemplos 1 a 4 foram preparados após transformações químicas mostradas nos Esquemas 1 a 4.
[00261] Primeiro, para a síntese de 3'-NH-MMTr-2'-O-metoxietil fos- foramiditas com base em uracila, exemplo 5, o intermediário 3'-azido- 2'-metoxietil chave 3 foi obtido em baixos rendimentos através de um intermediário -hidro 2, como mostrado no esquema 1.
[00262] Devido à alquilação de baixo rendimento, 3-1 foi reagido com BOMCl/DBU para dar o intermediário N-3 protegido 3-4, que foi alquilado com o uso de 2-bromoetil metil éter/Ag2O/NaI/DMF para dar o derivado 2'-O-metoxietil 3-5 como mostrado abaixo no esquema 1. A desproteção do grupo N-3-BOM com o uso da condição de hidrogena- ção (Pd/C/H2) resultou em 10 a 20% do intermediário 3'-amino 3-6a desejado juntamente com o produto secundário significativo sobre re- duzido 3-6b. Esquema 1
[00263] Alquilação de 2'-O- em alto rendimento é obtida como mos- trado abaixo no esquema 2. Para este propósito, 3-1 foi tratado com PMBCl/DBU/DMF para dar intermediário protegido N-3 4-2, o qual foi submetido a alquilação de 2'-O com o uso de 2-bromoetil metil éter/Ag2O/NaI/DMF para dar o derivado 2'-O-metoxietil 4-3. Em segui- da, a destritilação 5' de 4-3 e a reproteção do grupo 5'-hidroxila com o uso de cloreto de benzoíla deu 4-5. Esquema 2
[00264] A desproteção do grupo PMB do intermediário 4-5 em con- dições moderadas dá 4-6. O grupo 3'-azido do intermediário 4-6 foi reduzido a uma amina, que foi então imediatamente protegida, tal co- mo reação com cloreto de 4-monometoxitritila, para dar 4-8. O éster 5'- benzílico foi então clivado com o uso de uma solução alcalina, seguida por fosfitilação com o uso de protocolos conhecidos para dar o monô- mero de fosforamidita 2'-O-metoxietóxi uridina desejado 4-10.
[00265] Preparação de (4-2): A uma solução de 3-1 (45,30 g, 88,56 mmol) em DMF (120,00 ml) foi adicionado PMBCl (20,80 g, 132,84 mmol) e DBU (44,61 g, 177,12 mmol), a mistura foi agitada à tempera- tura ambiente durante 2 h. Água foi adicionada, extraída com EA. A camada orgânica foi concentrada e purificada por coluna para dar 4-2 (52,00 g, 82,32 mmol) como um sólido branco. ESI-LCMS: m/z 632,3 [M+H]+.
[00266] Preparação de (4-3): A uma solução de 4-2 (50,00 g, 79,15 mmol) em DMF (120,00 ml) foram adicionados 2-Bromoetil metil éter (16,50 g, 118,73 mmol) e Ag2O (18,34 g, 79,15 mmol, 2,57 ml), então NaI (5,93 g, 39,58 mmol) foi adicionado. A mistura da reação foi agita- da à temperatura ambiente durante 12 h. LC-MS mostrou funcionar bem. Então filtrada e adicionada água e EA, a camada orgânica foi concentrada e purificada por coluna para dar 4-3 (52,00 g, 75,39 mmol) como um óleo incolor. ESI-LCMS: m/z 690,4 [M+H]+.
[00267] Preparação de (4-4): A uma solução de 4-3 (52,00 g, 75,39 mmol) em DCM (200,00 ml) foi adicionado TFA (150,00 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura da reação foi adicionada lentamente a NH4OH frio, extraído com DCM. A camada orgânica foi concentrada e purificada para dar 4-4 (31,00 g, 69,28 mmol) como um óleo incolor. ESI-LCMS: m/z 448,2 [M+H]+. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): δ ppm 8,02 (d, J = 8,12Hz, 1H), 7,26-7,23 (m, 2H), 6,87-6,84 (m, 2H), 5,87-5,81 (m, 2H), 5,38 (t, J = 5,0Hz, 1H), 4,96- 4,85 (m, 2H), 4,36-4,34 (m, 1H), 4,17-4,14 (m, 1H), 4,00-3,97 (m, 1H), 3,83-3,77 (m, 1H), 3,75-3,72 (m, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,70-3,68 (m, 1H), 3,61-3,56 (m, 1H), 3,45-3,43 (m, 2H), 3,18 (s, 3H).
[00268] Preparação de (4-5): A uma solução de 4-4 (31,00 g, 69,28 mmol) em piridina (200,00 ml) foi adicionado BzCl (13,14 g, 93,87 mmol), a mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente duran- te 15 min e concentrada e purificada por coluna para dar 4-5 (35,10 g, 63,8 mmol) como um sólido branco. ESI-LCMS: m/z 552,2 [M+H]+.
[00269] Preparação de (4-6): A uma solução de 4-5 (35,10 g, 63,8 mmol) em acetonitrila (300,00 ml) e água (100,00 ml) foi adicionado Nitrato de amônio cérico (105 g, 191,40 mmol), a mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente durante 12 h e concentrada e extraída com EA. A camada orgânica foi concentrada e purificada por coluna para dar 4-6 (27,5 g, 63,75 mmol) como um sólido amarelo. ESI- LCMS: m/z 432,2 [M+H]+.
[00270] Preparação de (4-7): A uma solução de 4-6 (27,50 g, 63,75 mmol) em THF (500,00 ml) foi adicionado Pd/C (3,00 g), a mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente durante 12 h e filtrada e concentrada para dar 4-7 (25,00 g, 61,67 mmol) como um sólido ama- relo. ESI-LCMS: m/z 406,2 [M+H]+.
[00271] Preparação de (4-8): A uma solução de 4-7 (25,00 g, 61,67 mmol) em DCM (300,00 ml) foram adicionados MMTrCl (28,49 g, 92,51 mmol) e Colidina (14,95 g, 123,34 mmol), em seguida foi adicio- nado AgNO3 (15,7 g, 92,5 mmol). A mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1h., e filtrada e a camada orgânica foi lavada com água, seca sobre Na2SO4 e purificada por coluna de sílica- gel para dar 4-8 (33,00 g, 48,69 mmol) como um sólido amarelo.
[00272] Preparação de (4-9): A uma solução de 4-8 (14,50 g, 21,39 mmol) foi adicionado NaOH 1 N em metanol (200 ml) em água (20 ml), a mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. e concentrada e extraída com DCM, a camada orgânica foi concentrada e purificada por coluna de sílica-gel para dar 4-9 (11,50 g, 20,05 mmol) como um sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): δ ppm 11,26 (s, 1H), 7,95 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,47-7,44 (m, 4H), 7,34-7,17 (m, 8H), 6,82 (d, J = 8,8Hz, 2H), 5,50-5,48 (m, 2H), 5,13 (t, J = 3,6Hz, 1H), 4,05-3,98 (m, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,52-3,49 (m, 1H), 3,34-3,32 (m, 2H), 3,14 (s, 3H), 3,08-3,04 (m, 1H), 2,89-2,86 (m, 1H), 2,70 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 1,51 (d, J = 4,4Hz, 1H).
[00273] Preparação de (4-10): A uma solução de 4-9 (11,50 g,
20.05 mmol) em DCM (100,00 ml) foi adicionada DMAP (489,85 mg, 4,01 mmol) e DIPEA (10,36 g, 80,19 mmol, 14,01 ml). Em seguida CEPCl (5,70 g, 24.06 mmol) foi adicionado à solução. A mistura foi agi- tada à temperatura ambiente durante 30 min. A reação foi arrefecida bruscamente com NaHCO3 saturado. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4, concentrada para dar o produto bruto. O produto bruto foi purificado por Flash-Prep-HPLC. O produto foi dissolvido em tolueno anidro e concentrado por três vezes. Em se- guida o produto foi dissolvido acetonitrila anidro e concentrado por três vezes. Isso resultou em 13 g para dar 4-10 como um sólido branco. MS m/z [M-H] - (ESI): 772,3; 1H-RMN (CDCl3, 400MHz): 9,01(s, 1H), 8,07-7,61(m, 1H), 7,53-7,41(m, 6H), 7,29-7,15 (m, 5H), 6,79-6,76 (m,
2H), 5,63-5,57 (m, 2H), 4,27-4,15 (m, 2H), 4,06-3,95 (m, 1H), 3,85- 3,77(m, 1H), 3,75(s, 3H), 3,69-3,35(m, 7H), 3,23(d, J=4Hz, 1H), 2,26- 2,91(m, 3H), 2,59(t, J = 6,4Hz, 1H), 1,75-1,39(m, 1H), 1,21-1,11(m, 12H). 31PNMR (162 MHz, CDCl3): 149,10, 148,26. Exemplo 5
[00274] O composto de fosforamidita de 2'-O-metoxietoxi-NH- benzoil-citosina 5-4 foi obtido por conversão do intermediário de uridi- na 4-8 em análogo 3'-amino citidina 5-1 seguido por fosfitilação com o uso de protocolos conhecidos para dar o monômero de fosforamidita de 2'-O-metoxietóxi citidina desejado 5-4 como mostrado abaixo no esquema 3. Esquema 3
[00275] Preparação de (5-1): A uma solução de 4-8 (18,50 g, 27,30 mmol) em acetonitrila (250,00 ml) foram adicionados TPSCl (16,49 g, 54,60 mmol) e DMAP (6,67 g, 54,60 mmol), em seguida TEA (5,52 g, 54,60 mmol, 7,56 ml) foi adicionado à solução. A mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente durante 5 h sob N2. NH4OH (50,00 ml) foi adicionado à mistura da reação. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 12 h. A solução foi concentrada e extraída com EA. A camada orgânica foi lavada por salmoura e seco sobre Na2SO4. A camada orgânica foi concentrada e purificada por coluna de sílica-gel para dar 5-1 (16,00 g, 23,64 mmol) como um sólido amarelo.
[00276] Preparação de (5-2): A uma solução de 5-1 (16,00 g, 23,64 mmol) em piridina (100,00 ml) foi adicionado BzCl (4,96 g, 35,46 mmol) a 0°C. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A solução foi concentrada e purificada por coluna de sílica-gel para dar 5-2 (17,40 g, 22,28 mmol) como um sólido branco.
[00277] Preparação de (5-3): O composto 5-2 (17,40 g, 22,28 mmol) foi adicionado a 180 ml de solução de NaOH 1 N em piridi- na/MeOH/H2O (65/30/5) a 0 °C. A suspensão foi agitada a 0 °C duran- te 15 min. A mistura da reação foi arrefecida bruscamente por adição de solução saturada de NH4Cl. A solução foi extraída com EA e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaHCO3, salmoura, seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por coluna para dar 5-3 (12,50 g, 18,47 mmol) como sólido branco. 1H-RMN (DMSO-d6, 400MHz): δ ppm 12,25 (s, 1H), 8,53 (d, J = 7,6Hz, 1H), 8,01 (d, J = 5,2Hz, 2H), 7,64-7,60 (m, 1H), 7,52-7,42 (m, 6H), 7,31 (d, J = 8,8Hz, 2H), 7,26-7,14 (m, 7H), 6,79 (d, J = 8,8Hz, 2H), 5,55 (s, 1H), 5,23 (t, J = 3,6Hz, 1H), 4,09-3,97 (m, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,70-3,66 (m, 1H), 3,38-3,34 (m, 2H), 3,17 (s, 3H), 3,11- 3,05 (m, 1H), 2,96-2,91 (m, 1H), 2,68 (d, J=10,8Hz, 1H), 1,49 (d, J=4Hz, 1H).
[00278] Preparação de (5-4): A uma solução de 5-3 (12,50 g, 18,47 mmol) em DCM (100,00 ml) foram adicionados DMAP (451,30 mg, 3,69 mmol) e DIPEA (9,55 g, 73,88 mmol, 12,90 ml), em seguida CEPCl (5,25 g, 22,16 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min. A reação foi arrefecida brusca- mente com NaHCO3 saturado. A camada orgânica foi lavada com sal- moura, seca sobre Na2SO4, concentrada para dar o produto bruto. O produto bruto foi purificado por Flash-Prep-HPLC. O produto foi dissol- vido em tolueno anidro e concentrado por três vezes. Em seguida o produto foi dissolvido acetonitrila anidro e concentrado por três vezes.
Isso resultou em 13 g para dar 5-4 como um sólido branco. MS m/z [M- H] - (ESI): 875,4. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): δ ppm 8,64-8,20 (m, 2H), 7,90-7,88 (m, 2H), 7,62-7,58 (m, 1H), 7,53-7,39 (m, 8H), 7,25-7,15 (m, 6H), 6,78-6,74 (m, 2H), 5,69 (d, J=1,72Hz, 1H), 4,37-4,21 (m, 2H), 4,10-4,03 (m, 1H), 3,90-3,79 (m, 2H), 3,75 (d, J=1,64Hz, 3H), 3,68- 3,52 (m, 3H), 3,46-3,42 (m, 2H), 3,26 (d, J=1,2Hz, 3H), 3,17-2,97 (m, 2H), 2,94-2,87 (m, 1H), 2,67-2,48 (m, 2H), 1,79-1,51(m, 1H),1,26-1,18 (m, 12H). 31PNMR (162 MHz, CDCl3): 148,93, 148,03 Exemplo 6
[00279] A síntese do análogo 2'-O-metoxietil adenosina 6-10 foi al- cançada como mostrado abaixo no esquema 6. O intermediário 6-2 sob condição básica (NH3/MeOH) resultou em diol 6-3, que então após proteção do grupo 5'-hidróxi com o uso de TBDPSCl para dar 6-4 Intermediário 6-4. Em seguida, alquilação 2'-O de 6-4 com o uso de éter 2-bromoetilmetílico/NaH/DMF para dar o derivado 2'-O-metoxietil 6-5 sem a proteção da amina C-6-exocíclica de 6-4. De um modo in- ventivo, a alquilação seletiva do grupo 2'-OH do intermediário 6-4 foi alcançada. Esquema 4
[00280] Grupo 3'-azido do intermediário 6-5 foi reduzido à amina 6- 7, que foi então imediatamente protegida, tal como reação com cloreto de 4-monometoxitritila, para dar o precursor 6-8 após a desproteção do grupo 5'-OTBDPS com o uso de TBAF/THF. A fosfitilação de 6-9 com o uso de protocolos conhecidos é realizada para dar o monômero de fosforamidita de 2'-O-metoxietoxi-adenina-NH-benzoila desejado 6-
10.
[00281] Preparação de (6-2): A uma solução de composto 1 (79,50 g, 210,68 mmol) em ACN seco (1,20 L) foi adicionada N-(5H-Purin-6- il)benzamida (100,80 g, 421,36 mmol) e BSA (180.07 g, 884,86 mmol). A suspensão resultante foi agitada a 50°C até clarificar. Em seguida a mistura foi resfriada a -20 °C e TMSOTf (93,54 g, 421,36 mmol) foi adicionado por seringa. Em seguida a mistura foi agitada a 70°C du- rante 72 h sob N2 e arrefecida bruscamente com NaHCO3 sat e extraí- da com DCM. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, então sol- vente foi evaporado, e o resíduo foi purificado em sílica-gel para forne-
cer composto 6-2 (107,50 g, 192,26 mmol, 91,26% de rendimento) como um sólido amarelo. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): δ = 11,28 (s, 1H), 8,64 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 8,05 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,84 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,66 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,37 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 6,17 (dd, J = 6,0 Hz, 1H), 5,09 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 4,69-4,56 (m, 2H), 4,40-4,38 (m, 1H), 2,39 (s, 3H), 2,17 (s, 3H). ESI-LCMS: m/z 557,2 [M+H]+.
[00282] Preparação de (6-3): A uma solução de composto 6-2 (107,50 g, 192,26 mmol) dissolvido em 33% em peso de metilamina em etanol (600,00 ml), em seguida a mistura foram agitada a 20°C du- rante 16 h, então o solvente foi evaporado, lavado com EtOAc a 50% em éter de petróleo (1,5 L), filtrado para fornecer o composto 6-3 (52,50 g, 179,64 mmol, 93,44% de rendimento) como um sólido leve- mente amarelo. ESI-LCMS: m/z 293,1 [M+H]+.
[00283] Preparação de (6-4): A solução de composto 6-3 (52,50 g, 179,64 mmol), imidazol (18,32 g, 269,46 mmol) e TBDPS-Cl (54,34 g, 197,60 mmol) em piridina (500,00 ml) foi agitada a 20°C durante 2 h, LC-MS mostrou que 6-3 foi consumido. Em seguida arrefecida brus- camente com MeOH (30 ml), concentrada para dar o produto bruto que foi purificado em sílica-gel para fornecer o composto 6-4 (72,60 g, 136,81 mmol, 76,16% de rendimento) como um sólido branco. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): δ = 8,29 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,63-7,59 (m, 4H), 7,48-7,33 (m, 8H), 6,36 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,10-5,06 (m, 1H), 4,47 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,14-4,11 (m, 1H), 3,94 (dd, J = 11,2 Hz, 1H), 3,83 (dd, J = 11,6 Hz, 1H), 0,99 (s, 9H). ESI-LCMS: m/z 531,3 [M+H]+.
[00284] Preparação de (6-5): A uma solução de 6-4 (35,00 g, 65,96 mmol) e 1-Bromo-2-metoxietano (18,33 g, 131,91 mmol) em DMF seco (400,00 ml), foram adicionados NaI (19,77 g, 131,91 mmol) e Ag2O (15,29 g, 65,96 mmol), a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 h. Em seguida a reação foi vertida em água gelada, extraída com EA, lavada com salmoura e seca sobre Na2SO4 anidro. O solven- te foi evaporado, e o resíduo foi purificado em sílica-gel para dar 6-5 (23,70 g, 40,26 mmol, 61,04% de rendimento) como um sólido branco e o subproduto de TBDPS perdeu 5,20 g, 9,81 mmol, 14,87% de ren- dimento) como um sólido branco. 1H-RMN (400 MHz, DMSO): δ = 8,31 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,63-7,60 (m, 4H), 7,47-7,44 (m, 2H), 7,40-7,36 (m, 6H), 6,10 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,02 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,69 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,18-4,14 (m, 1H), 3,95 (dd, J = 11,6 Hz, 1H), 3,84 (dd, J = 11,6 Hz, 1H), 3,78-3,75 (m, 2H), 3,45 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,16 (s, 3H), 0,99 (s, 9H). ESI-LCMS: m/z 589,5 [M+H]+.
[00285] Preparação de (6-6): A uma solução de 6-5 (31,23 g, 53.04 mmol) em piridina (300,00 ml) a 0°C, foi adicionado BzCl (11,22 g, 79,56 mmol) gota a gota. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Em seguida a solução foi resfriada para 0 oC, e hidróxido de amônio (20 ml, 30%) foi adicionado e a mistura foi deixada aquecer para temperatura ambiente, em seguida o solvente foi evaporado, 300 ml de H2O e 600 ml de EA foram adicionados para separar a solução, o aquoso foi extraído por EA, combinado com o orgânico e lavado com salmoura, seco sobre Na2SO4 anidro, o solvente foi removido e o resí- duo foi purificado em sílica-gel para dar 6-6 (28,70 g, 41,42 mmol, ren- dimento de 78,09%) como um sólido branco. ESI-LCMS: m/z 693,4 [M+H]+.
[00286] Preparação de (6-7): A uma solução de 6-6 (28,70 g, 41,42 mmol) em EA (150,00 ml) foram adicionados Pd/C (3,00 g) e MeOH (150,00 ml) sob H2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente du- rante 5 h. Em seguida a reação foi filtrada e o filtrado concentrado para dar 6-7 (25,49 g, 38,22 mmol, 92,27% de rendimento) como um sólido cinza. ESI-LCMS: m/z 667,3 [M+H]+.
[00287] Preparação de (6-8): A uma solução de 6-7 (25,49 g, 38,22 mmol) e AgNO3 (12,98 g, 76,44 mmol) em DCM (300,00 ml) foi adicio- nada colidina (13,89 g, 114,66 mmol) e MMTrCl (19,43 g, 57,33 mmol), a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Em seguida a reação foi vertida em água gelada, a camada orgânica extraída com DCM, lavada com salmoura e seca sobre anidro Na2SO4, o solvente foi removido e o resíduo foi purificado em sílica-gel para dar 6-8 (32,79 g, 34,92 mmol, 91,36% de rendimento) como um sólido cinza.
[00288] Preparação de (6-9): A solução de 6-8 (32,79 g, 34,92 mmol) em THF (300,00 ml) foi adicionado TBAF (1M, 35,00 ml), a mis- tura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 h. Em seguida o solvente foi removido e o resíduo foi purificado em sílica-gel com EA para dar 6-9 (22,22 g, 31,71 mmol, 90,82% de rendimento) como um sólido branco. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): δ = 8,68 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,04 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,61-7,57 (m, 1H), 7,53-7,48 (m, 6H), 7,40 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,21-7,12 (m, 6H), 6,73 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,09 (d, J = 2,4 Hz, 2H), 4,08-4,02 (m, 2H), 3,93-3,87 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,58-3,53 (m, 1H), 3,43-3,39 (m, 3H), 3,24-3,19 (m, 4H), 2,19 (l, 1H).
[00289] Preparação de (6-10): A uma solução de 6-9 (14,00 g, 19,98 mmol), DMAP (488,19 mg, 4,00 mmol) e DIPEA (6,46 g, 49,95 mmol, 8,73 ml) em DCM seco (100,00 ml) foi adicionado CEPCl (5,68 g, 23,98 mmol) gota a gota sob Ar. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida a reação foi lavada com NaHCO3 a 10% (aq) e salmoura, seco sobre Na2SO4, o solvente foi removido e o resíduo foi purificado por c.c. com a mistura PE/EA, em seguida con- centrada para dar o produto bruto. O produto bruto (10 g, dissolvido em 10 ml de ACN) foi purificado por Flash-Prep-HPLC para obter 6-10 (12,60 g, 13,98 mmol, 69,99% de rendimento) como um sólido branco. Em seguida o produto foi dissolvido em tolueno seco (15 ml) e concen- trado três vezes, e com ACN seco três vezes. 1H-RMN (400 MHz,
CDCl3): δ = 9,12 (d, J = 46,8 Hz, 1H), δ = 8,71 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 8,50 (s, 0,6H), 8,22 (s, 0,4H), 8,04 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 7,63-7,59 (m, 1H), 7,55-7,46 (m, 6H), 7,40-7,37 (m, 2H), 7,19-7,06 (m, 6H), 6,69 (dd, J = 8,8 Hz, 2H), 6,03 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 4,36-4,24 (m, 2H), 3,92-3,78 (m, 2H), 3,71 (d, J = 11,6 Hz, 3H), 3,67-3,33 (m, 7H), 3,29 (d, J = 11,2 Hz, 3H), 3,17-3,10 (m, 1H), 2,88 (dd, J = 27,2 Hz, 1H), 2,65-2,50 (m, 2H), 2,38 (d, J = 4,4 Hz, 0,4H), 1,80 (d, J = 4,0 Hz, 0,6H), 1,23-1,15 31 (m, 12H). PNMR (400 MHz, CDCl3): 148,86, 148,22. ESI-LCMS: m/z 901,3 [M+H]+. Exemplo 7
[00290] A 2'-O-etil-3'-amino-5'-fosforamidita apropriadamente prote- gida (Exemplos 9, 10, 11, 12), foi preparada após transformações químicas mostradas no Esquema 5.
[00291] Primeiro para a síntese de fosforamiditas 3'-NH-MMtr-2'-O- etila com base em timina Exemplo 9, o intermediário 2 foi protegido, tal como propinoato de etila na presença de dimetilaminopiridina (Esque- ma 8) para dar o intermediário protegido N-3 de base 8-4 para facilitar a alquilação de 2'-O com maior rendimento. Desacetilação adicional de 8-4 para dar o intermediário C-2'-hidróxi 8-5. Esquema 5
[00292] A alquilação adicional com o uso de iodoetano proporcio- nou o nucleosídeo 2'O-etila 8-6. O intermediário 8-6 foi convertido em fosforamidita 2'-O-etil-3'-amino-5' com base em timina 8-11 seguindo a química semelhante para o composto 4-10 mostrado no Esquema 4 anterior.
[00293] Preparação de (8-4): A uma solução de 8-2 (22,0 g, 49,62 mmol) em MeCN (400 ml) foi adicionado DMAP (1,2 g, 9,92 mmol). Em seguida 3 (5,8 g, 419,5 mmol) foi adicionado, a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h sob N2, TLC mostrou que 8-2 foi consumido. Concentrado e purificado por uma coluna de sílica-gel por (PE:EA = 6:1) para fornecer 8-4 (22,0 g, 40,63 mmol, 81,9% de rendi- mento) como um óleo amarelo. ESI-LCMS: m/z 564 [M+Na]+.
[00294] Preparação de (8-5): A uma solução de 8-4 (28,0 g, 51,71 mmol) em MeOH (400 ml) foi adicionada solução aquosa con.de NH4OH (28 ml) a 0°C. A mistura da reação foi agitada a 0°C durante
1,5 h, TLC mostrou que 8-4 foi consumido. Concentrado e purificado pela coluna de sílica-gel por (PE:EA = 10:1~2:1) para fornecer 8-5 (21,0 g, 42,04 mmol, 81,3% de rendimento) como um óleo amarelo. ESI-LCMS: m/z 522 [M+Na]+.
[00295] Preparação de (8-6): A uma solução de 8-5 (20,0 g, 40,04 mmol) em iodoetano (100 ml) foi adicionado Ag2O (18,6 g, 80,08 mmol,). A mistura da reação foi agitada a 50 oC durante 5 h, após LC- MS mostrar consumo total de 8-5 filtrado com diatomita e concentrado para fornecer 8-6 (16,0, 30,33 mmol, 75,7% de rendimento) como um óleo amarelo que foi usado diretamente na próxima etapa. ESI-LCMS: m/z 528 [M+H]+.
[00296] Preparação de (8-7): A uma solução de 8-6 (16,0 g, 30,33 mmol) em MeCN (400 ml) foi adicionada pirrolidina (8,63 g, 121,32 mol, 12 ml), a mistura da reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, TLC mostrou que 8-6 foi totalmente consumido. Con- centrado e purificado pela coluna de sílica-gel por (DCM:MeOH = 100:1~50:1) para fornecer 7 (12,0 g, 27,94 mmol, 92,1% de rendimen- to) como um óleo amarelo. ESI-LCMS: m/z 430 [M+H]+.
[00297] Preparação de (8-8): A uma solução de 8-7 (12,0 g, 27,94 mmol) em THF (200 ml) foi adicionado Pd/C (1,2 g), a mistura foi agi- tada à temperatura ambiente sob H2 durante a noite. LC-MS mostrou que 7 foi totalmente consumido. Filtrado e lavado com DCM (100 ml * 3), em seguida concentrado para obter 8-8 (11,0 g, 27,27 mmol, 97,6% de rendimento) como um sólido cinza que foi usado diretamente na próxima etapa. ESI-LCMS: m/z 404 [M+H]+.
[00298] Preparação de (8-9): A uma solução de 8-8 (10,0 g, 24,79 mmol) em DCM (80 ml) foram adicionados MMTrCl (11,4 g, 37,18 mmol), 2,4,6-colidina (2,0 g, 16,61 mmol, 6,5 ml) e AgNO3 (6,3 g, 37,18 mmol), a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h. TLC mostrou que 8-8 foi totalmente consumido. Filtrado e a camada orgânica foi lavada com água e seca sobre Na2SO4, então concentra- da e purificada pela coluna de sílica-gel por (PE:EA=5:1~1:1) para ob- ter 8-9 (16,0 g, 23,68 mmol, 95,5% de rendimento) como um sólido amarelo claro.
[00299] Preparação de (8-10): 8-9 (4,0 g, 5,92 mmol) foi adicionado à solução de solução de NaOH 1,0 N (20 ml, MeOH/H2O = 9:1). A mis- tura da reação foi agitada a 40 oC durante 2 h, TLC mostrou que 8-9 foi consumido, concentrado e extraído com DCM (20 ml * 2), a camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada, o resíduo foi purificado pela coluna de sílica-gel por (DCM:MeOH=200:1~50:1) para obter 8-10 (3,0 g, 53,8 mmol, 90,9 rendimento) como um sólido branco.
[00300] Preparação de (8-11): A uma solução de 8-10 (2,36 g, 4.23 mmol) em DCM (2,00 ml) foram adicionados DMAP (103 mg, 0,8 mmol) e DIPEA (2,2 g, 16,92 mmol, 2,96 ml). Em seguida CEPCl (1,0 g, 4,23 mmol) foi adicionado. A mistura da reação foi agitada à tempe- ratura ambiente durante 1 h. TLC mostrou que 8-10 foi consumido, la- vado com NaHCO3 saturado (5 ml), separada a camada orgânica e lavada a camada de água com DCM (10 ml * 2). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4, concentrada e purificada por Flash-Prep-HPLC para obter 8-11 (2,45 g, 3,23 mmol, 76,36% de rendimento) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,62 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 1,4 Hz, 0,5H), 7,60-7,50 (m, 4H), 7,51-7,41 (m, 2H), 7,34- 7,16 (m, 7H), 7,12 (d, J = 1,4 Hz, 0,5H), 6,88- 6,76 (m, 2H), 5,66 (s, 1H), 4,37-4,23 (m, 1H), 4,16-4,05 (m, 1H), 4,05- 3,94 (m, 0,5H), 3,88-3,74 (m, 4,5H), 3,72-3,35 (m, 3H), 3,22 (td, J = 10,3, 4,7 Hz, 0,5H), 3,03-2,89 (m, 1,5H), 2,80-2,69 (m, 1H), 2,61 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 2,37 (td, J = 6,6, 1,3 Hz, 1H), 1,97 (d, J = 3,5 Hz, 0,5H), 1,91 (dd, J = 11,4, 1,2 Hz, 3H), 1,52 (d, J = 4,7 Hz, 0,5H), 1,29-1,17 31 (m, 12H), 1,08 (td, J = 7,0, 4,9 Hz, 3H). P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 149,31, 147,14. ESI-LCMS: m/z 576 [M+H]+.
Quantificação de Oligômero Bruto ou Análise Bruta
[00301] As amostras foram dissolvidas em água desionizada (1,0 ml) e quantificadas da seguinte forma: O branqueamento foi realizado primeiro com água somente (1,0 ml). 20 ul de amostra e 980 µl de água foram bem misturados em um tubo de microcentrífuga, transferi- dos para cubeta e leitura de absorbância obtida a 260 nm. O material bruto é seco e armazenado a -20 °C. Análise de HPLC/LC-MS bruta
[00302] Os 0,1 DO das amostras brutas foram submetidos à análise de MS bruta. Depois de confirmar os dados de LC-MS bruta, a etapa de purificação foi realizada.
PURIFICAÇÃO POR HPLC
[00303] Os oligonucleotídeos modificados com Fosforamidato (NP) e Tiofosforamidato (NPS) com e sem conjugados foram purificados por HPLC de troca aniônica. Os tampões eram fosfato de sódio 20 mM em CH3CN a 10%, pH 8,5 (tampão A) e fosfato de sódio 20 mM em CH3CN a 10%, NaBr 1,8 M, pH 8,5 (tampão B). Frações contendo oli- gonucleotídeos de comprimento total foram reunidas, dessalinizadas e liofilizadas. Dessalinização de Oligômero Purificado
[00304] O oligômero seco purificado foi então dessalinizado com o uso de Sephadex G-25 M (Amersham Biosciences). O cartucho foi condicionado três vezes com 10 ml de água desionizada. O oligômero purificado dissolvido completamente em 2,5 ml de água livre de RNAse foi em seguida aplicado ao cartucho com eluição gota a gota muito lenta. O oligômero sem sal foi eluído com 3,5 ml de água desio- nizada diretamente em um frasco com tampa de rosca. Ensaio in vitro
[00305] Os oligonucleotídeos antissenso (ASOs) direcionados ao éxon 5 de MAPT humano foram sintetizados. Um ASO com química de ligação de fosforotioato e grupos de proteção 2'-metoxietil (2'MOE) em asas de 5 nucleotídeos longas em cada extremidade da molécula foi sintetizado, e um ASO com a mesma sequência direcionado ao éxon 5 de MAPT com o uso de química ASO de ligação de fosforamidato P5'- N3' (em vez da química de fosforotioato) também foi sintetizado. Os níveis de mRNA MAPT foram avaliados em neurônios humanos dife- renciados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) após tratamento com a química do fosforotioato (OPS) ou do fosfora- midato (NPS), mas com os mesmos grupos de proteção 2'MOE nas asas para determinar se e em que medida esses ASOs reduziram efe- tivamente os níveis de mRNA e proteína tau, bem como seu efeito na patologia de tau em um modelo de camundongo transgênico de DA (DeVos et al., Sci Transl Med, 2017). Geração e diferenciação de iPSC em neurônios corticais.
[00306] A linha iPSC parental (catálogo Sigma # iPSC0028) foi ge- rada por reprogramação de células epiteliais de uma doadora de 24 anos com os quatro fatores Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc) com o uso de vetores retrovirais. IPSCs humanos foram cultivados sem alimentador e alimentados diariamente com meio mTeSR fresco (Stem Cell Technologies). As células foram passadas com EDTA (Gib- co) na confluência e a diferenciação em células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios corticais foi realizada com o uso do protocolo de inibição SMAD duplo clássico. Este protocolo gera principalmente neu- rônios corticais da camada V glutamatérgica que expressam TBR1 (aprox. 20%) e CTIP2 (aprox. 80%). Resumidamente, as iPSCs foram dissociadas em suspensão de célula única e a indução neuronal foi desencadeada após o tratamento que se segue com SB431542 e Dor- somorfina (meio de indução neural, consultar Tabela 1) por um perío- do de 12 dias.
TABELA 1. Meio N2B27 (composição) Componente (concentração final) Fornecedor No de Cat Meio Neurobasal® Gibco 21103-049 DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX Gibco 31331-028 Suplemento B-27, sem soro (1%) Gibco 17504-044 N-2 (0,5%) Gibco 17502-048 Solução de Aminoácidos Não Essen- Gibco 11140-035 ciais MEM (0,5%) Piruvato de sódio (0,5 mM) Gibco 11360-070 Suplemento GlutaMAX™ (0,5%) Gibco 35050-038 Penicilina-Estreptomicina (10 U/ml) Gibco 15140-122 2-Mercaptoetanol (25 µM) Gibco 31350-010 Solução de insulina humana (2,4 Sigma I9278 ug/ml)
[00307] Após a indução, as células progenitoras neuronais (NPCs) foram tratadas com dispase e subplaqueadas para amplificação mais três vezes (nos dias 17, 20 e 25 aproximadamente). Entre os dias 25 e 30, os estoques congelados de NPC foram preparados em meio de congelamento de progenitor neuronal (consultar Tabela 2) e mantidos em nitrogênio líquido para experimentos subsequentes. Os NPCs fo- ram descongelados em meio de reconstituição de NPC (consultar Ta- bela 3) e mantidos durante três dias em cultura antes do subplaquea- mento final para tratamento com ASO. TABELA 2. Meio de indução neural (composição) Componente (concentração final) Fornecedor No de Cat Meio N2B27 Dorsomorfina (1 µM) Tocris 3093 SB431542 (10 µM) Sigma S4317
TABELA 3. Meio de reconstituição neuronal (composição) Componente (concentração final) Fornecedor No de Cat Meio N2B27 Inibidor da ROCK Y-27632 (10 µM) Sigma Y0503 Proteína Humana Recombinante Gibco PHG0024 FGF-Basic (AA 10-155) (20 ng/ml)
[00308] Os NPCs foram plaqueados em meio N2B27 (consultar Ta- bela 3) a uma densidade de 15.000 células por poço em placas de 96 poços revestidas com poli-ornitina/laminina (Sigma).
[00309] Para bloquear a proliferação celular, as células receberam dois tratamentos com N- [N-(3,5-difluorofenacetil)-l-alanil] -S- fenilglicina t-butil éster 10 µM (DAPT, Sigma) nos dias 7 e 11 pós- subplaqueamento 14 dias após o descongelamento, o meio N2B27 foi substituído por meio de diferenciação final (consultar Tabela 4) que foi trocado 2 a 3 vezes por semana (50%) até o dia 15 ou 25, quando os tratamentos ASO foram realizados. TABELA 4. Meios de diferenciação neuronal final (composição) Componente (concentração final) Fornecedor No de Cat Meio N2B27 Proteína BDNF Hu/Mo/Rat/Can/Equi R&D Systems 248-D L recombinante (20 ng/ml) Proteína GDNF Humana Recombi- R&D Systems 212-GD nante (10 ng/ml) Sal de sódio monofosfato N6,2′-O- Sigma D0627 Dibutiriladenosina 3',5'-cíclico (500 µM) Ácido L-ascórbico (200 µM) Sigma A5960 DAPT (10 µM) Sigma D5942 Tratamento de oligonucleotídeo antissenso (ASO) para direcionar o mRNA MAPT.
[00310] ASOs foram sintetizados como fosforotioato total (OPS) como conhecido na técnica. A síntese de ASOs de tiofosforamidato
(NPS) foi feita de acordo com a presente descrição. ASOs NPS conti- nham nucleosídeos ligados por NPS nos 5 nucleotídeos em cada ex- tremidade do ASO e uma lacuna central de 10 nucleotídeos de com- primento com nucleotídeos ligados por OPS. Para ASOs tanto OPS quanto NPS, as asas de 5 nucleotídeos de comprimento de cada lado do ASO continham grupos de proteção 2' metoxietil (MOE). Os ASOs foram reconstituídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Sigma) e suas concentrações finais foram determinadas pela lei de Beer-Lambert medindo-se sua absorvância a 260 nm. Um ASO MAPT de 20 nucleotídeos de comprimento com a seguinte sequência: GCTTTTACTGACCATGCGAG (SEQ ID NO: 1) foi modificado com substituições 2' MOE e ligações fosforotioato (OPS) (Controle Modifi- cado por OPS SEQ ID NO: 1) e foi modificado com 2' substituições de MOE e ligações de tiofosforamidato (NPS) (NPS modificado SEQ ID NO: 1). Um ASO codificado sem direcionamento com a seguinte se- quência foi usado como controle negativo: CCTTCCCTGAAGGTT- CCTCC (Controle não MAPT). Neurônios corticais derivados de iPSC humano foram tratados por administração livre dos ASOs nas doses indicadas e durante os períodos de tempo indicados. Tabela 5 Sequência SEQUÊNCIAS Controle 5'- modificado por moeGps(5m)moeCps(5m)moeUps(5m)moeUps(5m) OPS SEQ ID moeUpsTpsAps(5m)CpsTps NO: 1 GpsAps(5m)Cps(5m)CpsApsTps moeGps(5m)moeCpsmoeGps moeApsmoeG-3' Modificado por 5'- NPS SEQ ID moeGnpsmoeCnpsmoeUnpsmoeUnpsmoeUnpsTps NO: 1 Aps(5m)CpsTpsGpsAps(5m)Cps (5m)CpsApsTps moeGnpsmoeCnpsmoeGnps moeAnpsmoeGn-3' Isolamento de RNA e PCR quantitativo em tempo real.
[00311] O RNA foi isolado com o uso do kit RNeasy96® (Qiagen)
de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células foram lisadas adicionando-se 150 µl de tampão RLT e agitando-se em um agitador orbital por 30 min seguido pela adição de um volume igual de etanol a 70% (v/v). A mistura foi subsequentemente transferida pa- ra colunas e o RNA foi ligado ao filtro por centrifugação a 5.600 x g durante 4 min à temperatura ambiente com o uso de uma centrífuga Sigma 4-18K. As etapas de lavagem em série com tampão RW1 (700 µl, 4 min), tampão RPE (700 µl, 4 min) e uma segunda etapa de tam- pão RPE (700 µl, 10 min) foram todas realizadas a 5.600 x g à tempe- ratura ambiente. O RNA foi eluído com o uso de 60 µl de água sem nuclease por centrifugação a 5.600 x g à temperatura ambiente por 4 min. A concentração de RNA foi determinada por espectroscopia com o uso do Nanodrop® ND-8000 (ThermoFisher). Quantidades iguais de RNA foram transcritas reversamente com o uso do kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (ThermoFisher) em um volume de reação final de 20 µl de acordo com as instruções do fabricante. Após uma incubação de 10 min a 25 °C, a transcrição reversa ocorreu durante 2 horas a 37 °C, seguida por inativação da enzima a 85 °C por 5 min. Para quantificar os níveis totais de mRNA MAPT, o cDNA foi diluído 1:10, misturado com master mix 2X Power SYBR™ Green Plus (ThermoFisher) e iniciadores de DNA para um volume de reação final de 10 µl. Os iniciadores que se seguem foram usados para detectar o mRNA MAPT total a uma concentração final de 500 nM (Tabela 6). Tabela 6 Ensaio_id direto inverso MAPT_B01 CCTCCAAGTGTGGCTCAT CAATCTTCGACTGGAC
TA TCTG MAPT_B02 CAGTGGTCCGTACTCCA TGGACTTGACATTCTT
CAGG MAPT_B04 ATTGAAACCCACAAGCTG GAGGAGACATTGCTGA
AC GATG
Ensaio_id direto inverso MAPT_B06 TCAGGTGAACTTTGAACC CTTCCATCACTTCGAA
AG CTCC MAPT_JPNV-1 CCAAGTGTGGCTCATTAG CCAATCTTCGACTGGA
GCA CTCTGT MAPT_JPNV-2 GAGTCCAGTCGAAGATT GGCGAGTCTACCATGT
GGGT CGATG 3R MAPT AGGCGGGAAGGTGCAAA GCCACCTCCTGGTTTA
TA TGATG 4R MAPT CGGGAAGGTGCAGATAA TATTTGCACACTGCCG
TTAA CCT
[00312] Ensaios que amplificam 8 genes de manutenção diferentes com o uso de iniciadores de DNA (consultar Tabela 8) também foram executados. Todos os iniciadores de DNA foram adquiridos da Integra- ted DNA Technologies. As reações TA-qPCR foram executadas em um termociclador HT7900 (Applied Biosystems) com o uso de parâme- tros de ciclagem padrão. A especificidade dos iniciadores de DNA foi confirmada com o uso de uma análise da curva de fusão. A análise GeNorm foi usada para determinar os genes de manutenção mais es- táveis com o uso de qBase + (Biogazelle). Todos os dados são norma- lizados para a média geométrica dos genes de manutenção mais está- veis e calibrados para uma condição de controle. Imunoensaio AlphaLISA®.
[00313] As células foram lisadas durante 30-60 min em placas de cultura de 96 poços à temperatura ambiente (TA) em um agitador orbi- tal com o uso de 40 µl por poço de tampão RIPA (Sigma) contendo inibidores de fosfatase (PhosSTOP™, Roche) e inibidores de protease (cOmplete™, Roche). A combinação de anticorpos HT7 (ThermoFis- her) e hTAU10 (Janssen) foi usada para quantificação de tau total com o uso da tecnologia AlphaLISA® (PerkinElmer). As medições foram realizadas em triplicado com o uso de 5 µl de lisado diluído 1:3 de ca- da vez. Cada amostra foi transferida para uma placa de ensaio de 384 poços para a reação AlphaLISA® na qual 5 µl de extratos celulares foram incubados por 2 horas à temperatura ambiente com uma mistura de anticorpo biotinilado e grânulos aceitadores (consultar Tabela 7). TABELA 7. Concentração de anticorpos e grânulos usados no en- saio AlphaLISA® (concentrações finais) Componente Concentração Final Ab biotinilado (HT7) 1,2 nM Grânulos receptores (hTAU10) 10 µg/ml Grânulos doadores 30 µg/ml
[00314] Subsequentemente, grânulos doadores foram adicionados aos poços e incubados à temperatura ambiente por 30 min antes da leitura a 615 nm (após iluminação a 680 nm) no leitor de placas EnVi- sion (Perkin Elmer). Quantificação de proteína total.
[00315] A quantificação da proteína total foi realizada com o uso do Kit de Ácido Bicinconínico (Sigma). A fim de avaliar a superioridade da química NPS sobre a química OPS, neurônios corticais derivados de iPSC humanos foram tratados com várias concentrações de ASOs MAPT. ASOs MAPT foram adicionados diretamente ao meio de cultura no dia 25 após o início do processo de diferenciação para concentra- ções finais variando de 1,25 µM a 10,0 µM. As concentrações equimo- lares de um ASO de controle não direcionado com a mesma química foram usadas como controle negativo. Após 5 dias, os níveis relativos de mRNA MAPT total foram determinados por TA-qPCR (Tabela 8). TABELA 8. Iniciadores de DNA para genes de manutenção Nome do gene Iniciador Sequência de iniciador (5' a 3') de manutenção direto/inverso GAPDH Direto AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC Inverso GGGGTCATTGATGGCAACAATA RNF20 Direto TTATCCCGGAAGCTAAACAGTGG Inverso GTAGCCTCATATTCTCCTGTGC
Nome do gene Iniciador Sequência de iniciador (5' a 3') de manutenção direto/inverso VIPAR Direto GGGAGACCCAAAGGGGAGTAT Inverso GGAGCGGAATCTCTCTAGTGAG SCLY Direto ACTATAATGCAACGACTCCCCT Inverso CTTCCTGCTGAATACGGGCTG PRDM4 Direto CACCTCCACAGTACATCCACC Inverso TGATAGGGATCTAGTGCTGAAGG ENOX2 Direto TCATTGTGGAAGTTTTCGAGCA Inverso TGCGGTAACCAGACAGATACA UBE4A Direto TAGCCGCTCATTCCGATCAC Inverso GGGATGCCATTCCCGCTTT ERCC6 Direto TCACGTCATGTACGACATCCC Inverso GTGGCAGCTTGAGGGCTAAG
[00316] Ambos os ASOs de controle negativo não afetaram os ní- veis de mRNA MAPT total (Tabela 9). TABELA 9. Níveis de mRNA MAPT total relativo após tratamento com ASO. SEQ ID NO: Modificação Concentra- Níveis relativos de mRNA ASO ção ASO MAPT (média ± DP) (% (µM) versus 0 µM) Controle OPS 2'MOE 0,00 124,0 ± 40,7 modificado MAPT 1,25 130,7 ± 21,4 por OPS 2,5 131,0 ± 14,6 SEQ ID NO: 5,0 72,9 ± 8,0 1 10,0 42,3 ± 2,7 Modificado NPS 2'MOE 0,00 97,5 ± 7,2 por NPS MAPT 1,25 55,0 ± 3,3 SEQ ID NO: 2,5 48,6 ± 7,0 1 5,0 40,5 ± 7,8 10,0 22,5 ± 2,5 Controle não Controle não 0,00 103,6 ± 14,2 MAPT Modi- MAPT por OPS 1,25 94,2 ± 7,2
SEQ ID NO: Modificação Concentra- Níveis relativos de mRNA ASO ção ASO MAPT (média ± DP) (% (µM) versus 0 µM) ficado por 2'MOE 2,5 94,4 ± 9,2 OPS 5,0 93,5 ± 11,4 10,0 83,6 ± 11,0 Controle não Controle não 0,00 97,3 ± 4,0 MAPT Modi- MAPT por NPS 1,25 82,4 ± 13,7 ficado por 2'MOE 2,5 87,6 ± 18,9
NPS 5,0 105,6 ± 10,9 10,0 113,6 ± 13,2
[00317] ASOs NPS reduziram os níveis totais de mRNA MAPT em 2x a quantidade de ASOs OPS como representado na Tabela 8.
[00318] A fim de avaliar se ASOs MAPT NPS também eram mais eficazes na redução dos níveis de proteína tau em comparação com ASOs MAPT OPS, neurônios corticais derivados de iPSC humanos foram tratados a partir do dia 15 após o início da diferenciação e ASOs foram adicionados a cada 5 dias por um período total de 15 dias. Esse paradigma de tratamento foi necessário, pois a meia-vida da proteína tau é considerada muito longa, devido à sua função de estabilizar mi- crotúbulos, principalmente em neurônios com seus longos axônios. Após este período prolongado de tratamento com ASO, as células fo- ram lisadas e os níveis de proteína tau foram avaliados com o uso de imunoensaios baseados em grânulos (Tabela 10). TABELA 10. Níveis relativos de proteína tau total determinados por AlphaLISA® após tratamento com ASO. SEQ ID NO: Modificação Concentra- Níveis relativos de proteí- ASO ção ASO na Tau (média ± DP) (% (µM) versus 0 µM) Controle OPS 2'MOE 0,00 100,0 ± 19,9 modificado MAPT 1,25 73,1 ± 16,6 por OPS 2,5 77,9 ± 8,7
SEQ ID NO: Modificação Concentra- Níveis relativos de proteí- ASO ção ASO na Tau (média ± DP) (% (µM) versus 0 µM) SEQ ID NO: 5,0 50,2 ± 10,1 1 10,0 39,9± 4,8 Modificado NPS 2'MOE 0,00 100,0 ± 16,9 por NPS MAPT 1,25 40,9 ± 12,7 SEQ ID NO: 2,5 31,7 ± 6,3 1 5,0 17,6 ± 3,2 10,0 19,6 ± 1,6 Controle não Controle não 0,00 100,0 ± 16,4 MAPT Modi- MAPT por OPS 1,25 81,7± 13,4 ficado por 2'MOE 2,5 94,9 ± 16,3
OPS 5,0 74,5 ± 8,5 10,0 90,4 ± 17,4 Controle não Controle não 0,00 100,0 ± 11,3 MAPT Modi- MAPT por NPS 1,25 104,9 ± 40,9 ficado por 2'MOE 2,5 86,3 ± 32,8
NPS 5,0 55,7 ± 28,5 10,0 106,2 ± 19,9
[00319] Os ASOs de controle negativo não afetaram os níveis de proteína tau. No entanto, ASOs MAPT NPS reduziram de forma de- pendente da dose os níveis de proteína tau 2x mais do que ASOs MAPT OPS como representado na tabela 9.
[00320] A partir desses exemplos, ASOs MAPT com química NPS foram determinados como sendo surpreendentemente superiores na redução de mRNA MAPT total e níveis de proteína tau em neurônios derivados de iPSC humanos em comparação com um ASO com a mesma sequência, mas com química OPS. Análise por HPLC IEX e Eletropulverização LC/MS Testes de Estabilidade de Oligonucleotídeos Complexos
[00321] Aproximadamente 0,10 OD do oligômero é dissolvido em água e, em seguida, pipetado em frascos especiais para análise por IEX-HPLC e LC/MS. HPLC analítico e ES LC-MS estabeleceram a in- tegridade dos oligonucleotídeos.
[00322] Em modalidades, os oligonucleotídeos descritos exibem uma afinidade aumentada com uma sequência de ácido nucleico alvo em comparação com um oligonucleotídeo não modificado da mesma sequência. Por exemplo, em algumas sequências, os oligonucleotí- deos divulgadosados têm uma sequência de nucleobase que é com- plementar e hibridiza com uma sequência de ácido nucleico alvo com uma afinidade superior a um oligonucleotídeo não modificado da mesma sequência. Em modalidades, o oligonucleotídeo divulgadoado complexado/hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo complementar tem uma temperatura de fusão Tm de > 37 °C. O dú- plex/complexo pode ser formado sob condições fisiológicas ou condi- ções quase fisiológicas, como em solução salina tamponada com fos- fato (PBS). Em modalidades, a Tm do dúplex/complexo é > 50 °C. Em modalidades, a Tm do dúplex/complexo é de 50 a 100 °C. Em modali- dades, a Tm do oligonucleotídeo divulgado duplexado com uma se- quência de ácido nucleico alvo sob condições fisiológicas ou condi- ções quase fisiológicas é > 50 °C.
[00323] A estabilidade do dúplex da ligação de oligonucleotídeos descritos com a sequência de RNA alvo foi avaliada com o uso de os dados de dissociação térmica dos dúplexes. Estudos de dissociação térmica foram realizados medindo a absorbância de UV dependente da temperatura a 260 nm de dúplexes com o uso do espectrômetro Shimadzu UV2600 conectado a um controlador de temperatura Shi- madzu e banho de temperatura constante Julabo F12-ED. O oligonu- cleotídeo divulgado e a sequência de ácido nucleico alvo foram mistu- rados em uma razão equimolar para dar uma concentração final de dúplex de 2 µM. Todas as amostras foram preparadas em condições de tampão PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10mM,KH2PO4 1,8 mM, pH 7,2). A absorbância de UV-Vis a 260 nm foi registrada e corrigida com o uso da absorbância a 380 nm (compri- mento do trajeto da célula UV = 1 cm). Os dados foram registrados a uma taxa de 1 oC/min, em intervalos de 1 oC, tanto para o aquecimento (20 a 95 oC) quanto para o resfriamento (95 a 20 oC). Os valores de Tm foram determinados tomando-se a primeira derivada dos perfis sig- moidais de aquecimento, com o uso de LabSolutions Tm Analysis Sof- tware. O Tm final é uma média de três tentativas independentes e os erros representam o desvio padrão. Como estabelecido na Tabela 11, NPS modificado SEQ ID NO: 1 tem uma Tm de ~ +0,8 oC por 3'-NH. Tabela 11 SEQ ID NO: Modificação ASO Tm com RNA (oC) Controle modificado OPS 2'MOE MAPT 62,4 (± 0,6) por OPS SEQ ID NO: 1 Modificado por NPS NPS 2'MOE MAPT 68,8 ((± 0,5) SEQ ID NO: 1 Validação de TAU GAPmers
[00324] Para avaliar a eficácia dos TAU GAPmers, uma linha celu- lar neuronal humana (células KELLY) foi tratada com várias concen- trações variando de 80 nM até 20 µM. Duas versões dos principais GAPmers: 2'-O-metil (2'OMe) e 2'-O-metoxietil (2'MOE) foram avalia- das. Esses GAPmers estão em uma forma 5-10-5, o que significa que os primeiros e os últimos 5 nucleotídeos incluem químicas NPS e 2', e os 10 nucleotídeos do meio são a "lacuna" que tem a química OPS. Três dias após o início do tratamento, o RNA total foi coletado e avali- ado quanto aos níveis de mRNA de Tau por TA-qPCR com o uso de 6 ensaios diferentes (consultar Tabela 6). A expressão de mRNA 3R e 4R Tau foi avaliada nas células tratadas por TA-qPCR (consultar Ta- bela 6).
Tabela 12 GAPmer Química de Ligação Sequência ASO Local alvo de Química 2'-O ASO A NPS-OPS-NPS GCUUUTTTGTCA Exon 5 2'MOE TCGCUUCC B NPS-OPS-NPS 2'OMe C NPS-OPS-NPS UUGAUATTATCC Exon 10 2'MOE TTTGAGCC D NPS-OPS-NPS 2'OMe E NPS-OPS-NPS GGUGATATTGTC Exon 12 2'MOE CAGGGACC F NPS-OPS-NPS 2'OMe
[00325] Todos os GAPmers mostraram uma redução dependente da dose do mRNA de Tau 3R e 4R total de uma maneira dependente da dose. Os GAPmers C e D que visam o éxon 10 do mRNA de Tau foram mais eficazes na redução dos níveis de mRNA de Tau 4R em comparação com os outros GAPmers.
[00326] Para confirmar que esses GAPmers também reduzem os níveis de mRNA de Tau em neurônios humanos, o mesmo experimen- to foi realizado em neurônios derivados de iPSC humanos e tratou es- sas células por 72 horas com os mesmos GAPmers. Resultados muito semelhantes foram obtidos para cada um dos GAPmers em neurônios derivados de iPSC em comparação com a célula KELLY. Biodistribuição GAPmer
[00327] GAPmers ASO adicionais foram sintetizados com química não modificada, bem como com a química NPS. Os IDs, química, se- quências e local de destino desses ASOs estão listados na Tabela 13. Esses GAPmers estão em uma forma 5-10-5, o que significa que os primeiros e os últimos 5 nucleotídeos incluem a ligação indicada e as químicas 2', e os 10 nucleotídeos do meio são a "lacuna" com a quími- ca OPS. A fim de avaliar se o GAPmer TAU NPS tinha um perfil de biodistribuição diferente/superior, o GAPmer E foi radiomarcado com Iodo-125. Uma abordagem semelhante foi seguida para marcar radioa- tivamente o GAPmer G com Iodo-125. Tabela 13 Química de Ligação Local alvo GAPmer Sequência ASO Química 2'-O de ASO OPS/OPO-OPS-OPS/OPO CCGTTTTCTTAC
G 2'MOE CACCCT NPS/NPO-OPS-NPS/NPO CCGUUTTCTTA H Intron 9 2'MOE CCACCCU NPS-OPS-NPS CCGUUTTCTTA
I 2'MOE CCACCCU
[00328] Os compostos radiomarcados foram administrados em ra- tos através de uma injeção intratecal em bólus e os animais imagea- dos em 4x durante a primeira hora após a injeção, seguido por aquisi- ções de imagens em 6 horas e 24 horas, bem como 7 dias e 14 dias após a injeção com o uso de tomografia computadorizada de emissão de pósitron única (SPECT/CT). Os resultados deste estudo de biodis- tribuição indicaram que o GAPmer G comparativo se desloca mais rá- pido para o cérebro, mas sai rapidamente do cérebro para atingir os níveis de estado estacionário 6 a 24 horas após a injeção (Tabelas 14 e 15). O GAPmer E parece se deslocar mais devagar para o cérebro, mas atinge níveis mais elevados de estado estacionário no cérebro em comparação com o GAPmer G comparativo (Tabelas 14 e 15). Além disso, o GAPmer E parece ser retido por um período mais longo em diferentes regiões do SNC (incluindo regiões mais profundas do cére- bro e a medula espinhal) em comparação com o GAPmer G compara- tivo (Tabelas 14 e 15). Em conclusão, este estudo indica que GAPmer E direcionado a TAU tem tempos de retenção mais longos no SNC de roedores em comparação com o GAPmer G.
Tabela 14 GAPmer E Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 168 336 ID de Porcentagem Meio 10,8321 8,47327 7,19433 6,66709 1,25181 0,865811 0,537386 0,284057 Cervical no LCR (% ID) SEM 0,866516 0,97213 1,1427 1,15989 0,181687 0,200669 0,260395 0,193775 ID de Porcentagem Meio 76,27 59,4654 50,4656 46,7394 9,35959 6,01616 3,29889 1,55895 Cervical do LCR/g (% ID/g) SEM 5,46944 5,69153 7,4367 7,62121 1,20537 1,20406 1,55303 1,02219 ID de Porcentagem Meio 0,578109 0,77805 0,723477 0,543578 0,357861 0,301755 0,205616 0,147592 Lombar do LCR (% ID) SEM 0,083627 0,162685 0,065018 0,099339 0,089864 0,085314 0,072481 0,066745 ID de Porcentagem Meio 9,35819 12,5983 11,6298 8,69566 5,99358 4,74398 2,40874 1,49488 Lombar do LCR/g (% ID/g) SEM 1,63028 2,93894 1,32603 1,6503 1,66635 1,3636 1,00223 0,783811 ID de Porcentagem Meio 6,95045 7,05609 6,70884 6,29832 1,53496 0,770341 0,287605 0,064824 Torácica do LCR (% ID) SEM 0,882792 0,607619 0,426338 0,308317 0,254473 0,100461 0,065515 0,036388 ID de Porcentagem Meio 40,8075 41,4428 39,4093 37,017 9,19442 4,52467 1,48717 0,316396 Torácica do LCR/g (% ID/g) SEM 4,87729 3,1295 1,91031 1,26842 1,46663 0,519338 0,352275 0,18884 ID de porcentagem de Meio 0,002162 0,015821 0,02634 0,027323 0,250848 0,304756 0,266843 0,259165 Linfonodos Cervicais Profundos (% ID) SEM 0,001526 0,010442 0,018233 0,016429 0,046625 0,020172 0,026647 0,053091 ID de porcentagem de Meio 0,078184 0,572226 0,952703 0,988237 9,07292 11,0227 9,65144 9,37372 Linfonodos Cervicais Profundos/g (% ID/g) SEM 0,055195 0,37767 0,659483 0,594218 1,68638 0,729592 0,963801 1,92026 ID de Porcentagem Meio 0 0 5,74E-05 5,98E-06 0,022633 0,003495 0,002469 0 Cardíaca (% ID) SEM 0 0 5,74E-05 3,85E-06 0,018774 0,001487 0,00104 0 ID de Porcentagem Meio 0 0 3,41E-05 3,55E-06 0,013466 0,002102 0,00132 0 Cardíaca/g (% ID/g) SEM 0 0 3,41E-05 2,29E-06 0,01117 0,000884 0,000537 0 ID de Porcentagem do Meio 0 0,2285 1,48109 3,79931 13,2502 14,9802 14,8239 14,6498 Rim Esquerdo (% ID) SEM 0 0,2285 0,836824 0,946707 0,551601 0,182297 0,319957 0,404948 ID de Porcentagem do Meio 0 0,120413 0,780397 2,00179 6,98143 7,89354 7,81194 7,71641 Rim Esquerdo/g (% ID/g) SEM 0 0,120413 0,440991 0,498757 0,29024 0,096685 0,171932 0,214333 ID de Porcentagem do Meio 0 6,83E-06 0,034992 0,427209 2,2748 2,27037 1,5343 0,577397 Fígado (% ID) SEM 0 6,83E-06 0,03359 0,225124 0,179946 0,130887 0,052462 0,214105
Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 168 336 ID de Porcentagem do Meio 0 6,62E-06 0,033893 0,413791 2,20335 2,19906 1,48612 0,559262 Fígado/g (% ID/g) SEM 0 6,62E-06 0,032535 0,218053 0,174294 0,126776 0,050804 0,207381 ID de Porcentagem do Meio 0 0,534098 2,54753 4,46871 13,0671 15,5683 14,6128 14,4735 Rim Direito (% ID) SEM 0 0,534098 0,871366 0,684733 0,939278 0,407473 0,264569 0,543962 ID de Porcentagem do Meio 0 0,278768 1,32942 2,33193 6,81815 8,12938 7,625 7,45214 Rim Direito/g (% ID/g) SEM 0 0,278768 0,454796 0,357303 0,490355 0,212582 0,136791 0,246694 ID de porcentagem de Meio 0 0,046892 0,076572 0,061611 0,145891 0,202045 0,1679 0,136729 Linfonodos Cervicais Superficiais (% ID) SEM 0 0,043098 0,061371 0,044305 0,030862 0,059684 0,02844 0,024512 ID de porcentagem de Meio 0 3,41878 5,5827 4,49193 10,6365 14,7306 12,2412 9,96856 Linfonodos Cervicais Superficiais/g (% ID/g) SEM 0 3,14216 4,47443 3,23018 2,25008 4,35143 2,07352 1,78707 Porcentagem de ID do Meio 22,6306 18,8312 16,329 14,815 8,66836 7,84457 6,01653 5,66245 Cérebro Inteiro (% ID) SEM 1,68624 1,35974 1,61868 1,73388 0,673152 0,358564 0,670171 0,594421 Porcentagem de ID do Meio 13,6667 11,3745 9,8642 8,95243 5,23969 4,71044 3,37774 2,9616 Cérebro Inteiro/g (% ID/g) SEM 1,05573 0,870626 1,01123 1,08442 0,4077 0,215852 0,355915 0,271713
GAPmer G comparativo Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 96 168 336 ID de Porcentagem Meio 11,152 9,78028 9,14125 8,59638 1,9599 1,31077 1,13882 1,2578 1,00442 Cervical no LCR (% ID) SEM 0,7156410,795605 1,21719 1,38085 0,1116310,099487 0,1995240,079583 0,056467 ID de Porcentagem Meio 69,7207 61,0495 57,0796 53,7526 13,4481 9,02884 6,94062 7,68471 5,66153 Cervical do LCR/g (% ID/g) SEM 5,26996 5,0583 7,88092 9,14163 1,06733 0,713906 0,9272260,479601 0,223667 ID de Porcentagem Meio 2,11315 2,30045 2,20845 2,08811 0,8762040,635229 0,6209640,614291 0,545859 Lombar do LCR (% ID) SEM 0,6183520,652777 1,03885 1,15341 0,4126480,250849 0,310111 0,32343 0,308902 ID de Porcentagem Meio 24,3213 26,6065 25,1407 23,8978 11,1123 8,07892 6,36672 5,77421 3,99638 Lombar do LCR/g (% ID/g) SEM 3,8726 4,01662 8,94291 10,8027 4,14563 2,4462 2,55276 2,66268 1,97635 ID de Porcentagem Meio 10,9876 11,8052 11,3563 10,3865 3,01616 1,81053 1,62123 1,69423 1,29347 Torácica do LCR (% ID) SEM 1,59735 2,20522 2,52628 2,30952 0,8027640,513927 0,5647670,637544 0,60702 ID de Porcentagem Meio 61,5725 66,1599 63,7407 58,4808 16,3486 9,67105 8,15431 7,78233 5,39928 Torácica do LCR/g (% ID/g) SEM 8,52219 12,087 14,1188 13,1369 4,11143 2,56419 2,62432 2,70691 2,47457
Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 96 168 336 ID de porcentagem de Meio 0,0026080,003654 0,00735 0,01125 0,2303410,309695 0,3148050,297415 0,277717 Linfonodos Cervicais Profundos (% ID) SEM 0,0009610,002209 0,0050150,004754 0,02465 0,015466 0,0213570,029098 0,032069 ID de porcentagem de Meio 0,09433 0,132166 0,2658260,406905 8,33121 11,2014 11,3862 10,7572 10,0447 Linfonodos Cervicais Profundos/g (% ID/g) SEM 0,0347450,079915 0,18137 0,171952 0,8915670,559385 0,772444 1,05244 1,15989 ID de Porcentagem Meio 0 0 0 2,83E-07 0,0008580,000364 6,15E-05 1,19E-05 0 Cardíaca (% ID) SEM 0 0 0 2,83E-07 0,0003960,000262 5,77E-05 8,74E-06 0 ID de Porcentagem Meio 0 0 0 1,73E-07 0,0005140,000219 3,66E-05 7,10E-06 0 Cardíaca/g (% ID/g) SEM 0 0 0 1,73E-07 0,0002380,000159 3,43E-05 5,20E-06 0 ID de Porcentagem do Meio 0 0 0 1,98E-07 6,35087 9,57737 8,88356 8,41903 7,18053 Rim Esquerdo (% ID) SEM 0 0 0 1,98E-07 0,4251380,291836 0,1046070,091393 0,192997 ID de Porcentagem do Meio 0 0 0 1,04E-07 3,34559 5,04636 4,68152 4,43653 3,78354 Rim Esquerdo/g (% ID/g) SEM 0 0 0 1,04E-07 0,224155 0,15366 0,0548210,048046 0,101955 ID de Porcentagem do Meio 0 7,87E-07 0,0495360,236671 2,22754 2,18954 2,15727 1,72129 0,679184 Fígado (% ID) SEM 0 7,87E-07 0,0495360,236671 0,3311240,179805 0,1439020,194392 0,131306 ID de Porcentagem do Meio 0 7,62E-07 0,04798 0,229237 2,15758 2,12077 2,08951 1,66723 0,657853 Fígado/g (% ID/g) SEM 0 7,62E-07 0,04798 0,229237 0,3207240,174158 0,1393820,188287 0,127182 ID de Porcentagem do Meio 0 5,51E-07 0,03343 0,30096 6,55483 9,28232 9,07276 8,78883 7,03309 Rim Direito (% ID) SEM 0 5,51E-07 0,03343 0,30096 0,40552 0,237102 0,49812 0,135909 0,145122 ID de Porcentagem do Meio 0 2,87E-07 0,0174430,157039 3,41996 4,84335 4,73405 4,58643 3,67066 Rim Direito/g (% ID/g) SEM 0 2,87E-07 0,0174430,157039 0,2119390,124033 0,2597180,070543 0,075382 ID de porcentagem de Meio 0 0 0 0 0,0836340,119283 0,0898150,079562 0,065506 Linfonodos Cervicais Superficiais (% ID) SEM 0 0 0 0 0,0095420,003165 0,01099 0,009958 0,012893 ID de porcentagem de Meio 0 0 0 0 6,09754 8,69663 6,54821 5,8007 4,77585 Linfonodos Cervicais Superficiais/g (% ID/g) SEM 0 0 0 0 0,6957180,230759 0,8012760,725998 0,939968 Porcentagem de ID do Meio 6,64123 9,64981 11,2795 12,5369 12,9323 11,3917 10,9299 10,5087 9,42048 Cérebro Inteiro (% ID) SEM 2,56605 2,14697 1,5151 1,90975 1,21462 0,926368 1,03752 0,787061 0,878424 Porcentagem de ID do Meio 3,88961 5,63422 6,57098 7,29032 7,62932 6,62764 6,20152 5,81735 4,91559 Cérebro Inteiro/g (% ID/g) SEM 1,53724 1,29676 0,901465 1,07932 0,6835750,493438 0,519785 0,38773 0,393178
Tabela 15
GAPmer E Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 168 336 ID de Porcenta- Meio 0,558254 0,465608 0,374387 0,363604 0,193671 0,145925 0,162403 0,132189 gem da Amígdala (% ID) SEM 0,146486 0,085887 0,061355 0,06376 0,01351 0,019712 0,018415 0,03282 ID de Porcenta- Meio 12,4998 10,4293 8,40708 8,20394 4,3689 3,30213 3,45771 2,5974 gem da Amígda- la/g (% ID/g) SEM 3,271 1,86942 1,3765 1,50888 0,219988 0,428221 0,34317 0,596509 ID de Porcenta- Meio 0,767519 0,62213 0,549693 0,510218 0,297928 0,264213 0,203043 0,225742 gem do Gânglio Basal (% ID) SEM 0,068608 0,083157 0,062964 0,055868 0,019889 0,007221 0,011892 0,017126 ID de Porcenta- Meio 7,25586 5,88199 5,19664 4,82425 2,82807 2,46257 1,77921 1,8301 gem do Gânglio Basal/g (% ID/g) SEM 0,67508 0,804694 0,611555 0,54622 0,229958 0,085794 0,115155 0,104202 ID de Porcenta- Meio 2,25101 2,49838 2,55948 2,42798 1,57106 1,66827 0,814148 0,825403 gem do Cerebelo (% ID) SEM 1,04215 1,01889 0,900513 0,90006 0,372103 0,229306 0,281224 0,239811 ID de Porcenta- Meio 8,96768 9,93683 10,1651 9,64754 6,18103 6,58847 2,98996 2,83458 gem do Cerebe- lo/g (% ID/g) SEM 4,22932 4,12692 3,65992 3,65352 1,44985 0,938476 1,02327 0,777901 ID de Porcenta- Meio 0,139098 0,137391 0,165203 0,142788 0,201672 0,202275 0,181619 0,161023 gem do Corpo Caloso (% ID) SEM 0,063509 0,040645 0,030314 0,018416 0,006557 0,015083 0,014325 0,012048 ID de Porcenta- Meio 2,52116 2,49178 3,00274 2,59406 3,59332 3,60851 3,05074 2,50267 gem do Corpo Caloso/g (%ID/g) SEM 1,15695 0,739006 0,558865 0,341001 0,064465 0,260085 0,1886 0,162241 ID de Porcenta- Meio 1,84462 1,96281 2,07334 2,01485 2,27264 2,15832 1,53834 1,35196 gem do Córtex (% ID) SEM 0,688596 0,505144 0,440341 0,311568 0,065798 0,138068 0,179699 0,159366 ID de Porcenta- Meio 3,75097 3,99196 4,21446 4,09784 4,62061 4,35001 2,90653 2,37314 gem do Córtex/g (% ID/g) SEM 1,39426 1,02969 0,895021 0,647193 0,113702 0,272193 0,300372 0,222281 ID de Porcenta- Meio 1,67603 1,44975 1,3333 1,24861 0,753141 0,621775 0,655031 0,622615 gem do Hipocam- po (% ID) SEM 0,395049 0,320656 0,247148 0,243271 0,042542 0,093431 0,051347 0,069541 ID de Porcenta- Meio 13,3312 11,5318 10,6079 9,93388 6,04367 4,96917 4,88174 4,32414 gem do Hipocam- po/g (% ID/g) SEM 3,11226 2,52497 1,94088 1,91141 0,22641 0,739201 0,319607 0,503837
Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 168 336 ID de Porcenta- Meio 1,79208 1,26239 0,822021 0,791454 0,309715 0,211226 0,232952 0,209212 gem do Hipotála- mo (% ID) SEM 0,018149 0,044894 0,084551 0,084724 0,038108 0,02012 0,019585 0,00656 ID de Porcenta- Meio 31,8662 22,4567 14,6046 14,0554 5,4763 3,65892 3,80714 3,15945 gem do Hipotála- mo/g (% ID/g) SEM 0,622153 0,985153 1,47659 1,45413 0,653269 0,367921 0,285807 0,194668 ID de Porcenta- Meio 8,43844 6,14699 4,92599 4,21695 1,50607 1,25278 1,06369 1,03389 gem do Mesencé- falo (% ID) SEM 0,549632 0,264854 0,452126 0,348737 0,115545 0,117172 0,118459 0,088184 ID de Porcenta- Meio 29,2339 21,3004 17,0721 14,6209 5,22178 4,3333 3,41371 3,10658 gem do Mesencé- falo/g (% ID/g) SEM 1,78711 0,839541 1,54884 1,22482 0,371463 0,409401 0,363526 0,234564 ID de Porcenta- Meio 3,09383 2,72917 2,23702 1,91561 1,01767 0,868984 0,679099 0,624027 gem do Órgão Olfativo (% ID) SEM 0,423405 0,335251 0,27618 0,246519 0,119007 0,04595 0,047811 0,010891 ID de Porcenta- Meio 38,9729 34,3305 28,1563 24,1244 12,8281 10,802 7,93742 6,82911 gem do Órgão Olfativo/g (% ID/g) SEM 5,78777 4,48914 3,75756 3,37889 1,61001 0,633288 0,584199 0,18264 ID de Porcenta- Meio 0,343633 0,279426 0,239164 0,209768 0,100025 0,08652 0,085407 0,085755 gem de Outros (Ventrículos) (% ID) SEM 0,059376 0,046773 0,034903 0,025436 0,005734 0,009182 0,004352 0,009717 ID de Porcenta- Meio 15,7006 12,7644 10,9255 9,58606 4,63014 3,97221 3,61689 3,41809 gem de Outros (Ventrículos)/g (% ID/g) SEM 2,70418 2,12314 1,58033 1,15794 0,165485 0,42827 0,121301 0,373455 ID de Porcenta- Meio 0,073996 0,058791 0,063152 0,050917 0,02835 0,026065 0,016707 0,018377 gem da Área Septal (% ID) SEM 0,045267 0,028474 0,016226 0,011536 0,002718 0,002504 0,001675 7,06E-05 ID de Porcenta- Meio 6,01601 4,78158 5,12945 4,13132 2,29807 2,04259 1,24867 1,33379 gem da Área Septal/g (% ID/g) SEM 3,70113 2,33093 1,33813 0,949408 0,276602 0,182851 0,154458 0,0225 ID de Porcenta- Meio 0,355264 0,293372 0,267919 0,271126 0,16181 0,136424 0,194221 0,189016 gem do Tálamo (% ID) SEM 0,107897 0,058708 0,039629 0,057802 0,017602 0,027896 0,006076 0,011428 ID de Porcenta- Meio 5,2993 4,37887 4,00206 4,04775 2,40781 2,02639 2,69809 2,39589 gem do Tálamo/g (% ID/g) SEM 1,59833 0,871224 0,598227 0,861554 0,226053 0,394538 0,073301 0,192872
Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 168 336 ID de Porcenta- Meio 1,29678 0,924978 0,718283 0,651161 0,254615 0,201785 0,189864 0,183236 gem da Matéria Branca (% ID) SEM 0,078326 0,045632 0,010753 0,044752 0,018402 0,019568 0,008725 0,017793 ID de Porcenta- Meio 24,0762 17,1758 13,3413 12,1025 4,75988 3,7307 3,28689 2,97632 gem da Matéria Branca/g (% ID/g) SEM 1,35368 0,787724 0,180212 0,879991 0,390942 0,330414 0,145634 0,272604 Porcentagem de Meio 22,6306 18,8312 16,329 14,815 8,66836 7,84457 6,01653 5,66245 ID do Cérebro Inteiro (% ID) SEM 1,68624 1,35974 1,61868 1,73388 0,673152 0,358564 0,670171 0,594421 Porcentagem de Meio 13,6667 11,3745 9,8642 8,95243 5,23969 4,71044 3,37774 2,9616 ID do Cérebro Inteiro/g (% ID/g) SEM 1,05573 0,870626 1,01123 1,08442 0,4077 0,215852 0,355915 0,271713
GAPmer G comparativo Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 96 168 336 ID de Porcentagem Meio 0,07025 0,157133 0,182216 0,204618 0,343688 0,239396 0,238917 0,269154 0,233677 da Amígdala (% ID) SEM 0,063589 0,103704 0,085755 0,077849 0,030438 0,005162 0,01289 0,008577 0,01741 ID de Porcentagem Meio 1,59871 3,55317 4,09803 4,58765 7,5081 5,19617 5,055 5,67473 4,60241 da Amígdala/g (% ID/g) SEM 1,45175 2,37755 1,9771 1,79353 0,641745 0,156614 0,257744 0,207565 0,250856 ID de Porcentagem Meio 0,117021 0,21681 0,26589 0,306323 0,381952 0,370599 0,337719 0,336959 0,313839 do Gânglio Basal (% ID) SEM 0,076931 0,088946 0,044903 0,051348 0,066725 0,023366 0,027073 0,005895 0,040156 ID de Porcentagem Meio 1,0588 1,96201 2,40278 2,76795 3,51276 3,33342 2,95949 2,87515 2,55187 do Gânglio Basal/g (% ID/g) SEM 0,696112 0,806687 0,414127 0,475621 0,611781 0,196289 0,218288 0,033142 0,308451 ID de Porcentagem Meio 0,377037 1,0096 1,6223 1,9812 2,21016 2,45293 2,25788 1,87032 1,68511 do Cerebelo (% ID) SEM 0,190099 0,127709 0,076476 0,217865 0,397162 0,248084 0,392909 0,16277 0,129536 ID de Porcentagem Meio 1,43098 3,80814 6,10942 7,43788 8,66211 9,3077 8,35519 6,85223 5,74023 do Cerebelo/g (% ID/g) SEM 0,73404 0,520186 0,338803 0,743845 1,65949 0,83535 1,37758 0,568067 0,397753 ID de Porcentagem Meio 0,022238 0,055967 0,080598 0,09326 0,320271 0,284835 0,303873 0,289287 0,24998 do Corpo Caloso (% ID) SEM 0,02222 0,041424 0,041437 0,037288 0,063501 0,024991 0,027853 0,028854 0,028791 ID de Porcentagem Meio 0,39108 0,9794 1,40316 1,61839 5,59917 4,88872 5,14219 4,79623 3,87539 do Corpo Caloso/g (%ID/g) SEM 0,39077 0,730546 0,730645 0,654849 1,08746 0,386997 0,447732 0,457439 0,399475 ID de Porcentagem Meio 0,220028 0,633967 0,867894 1,11482 2,9228 2,62081 2,57875 2,38031 2,0868 do Córtex (% ID)
Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 96 168 336 SEM 0,20834 0,32453 0,269076 0,261392 0,426537 0,262245 0,251051 0,250084 0,291286 ID de Porcentagem Meio 0,436481 1,2498 1,70512 2,18607 5,78025 5,13609 4,93298 4,41018 3,66582 do Córtex/g (% ID/g) SEM 0,413775 0,648254 0,538842 0,519404 0,806778 0,471369 0,420487 0,441617 0,461271 ID de Porcentagem Meio 0,35119 0,748223 0,836605 1,01328 1,24774 0,976929 0,9861 1,09848 0,96287 do Hipocampo (% ID) SEM 0,308774 0,413338 0,32756 0,327609 0,201253 0,042564 0,049536 0,086952 0,061749 ID de Porcentagem Meio 2,75325 5,82967 6,49002 7,83626 9,76959 7,54148 7,41702 8,09684 6,64111 do Hipocampo/g (% ID/g) SEM 2,43034 3,26845 2,58722 2,55293 1,5319 0,392925 0,41303 0,588516 0,324495 ID de Porcentagem Meio 0,310676 0,556035 0,632061 0,647227 0,468645 0,316754 0,294092 0,307265 0,277475 do Hipotálamo (% ID) SEM 0,19552 0,167087 0,086168 0,096156 0,072388 0,015545 0,029589 0,00855 0,052414 ID de Porcentagem Meio 5,45031 9,68302 10,9582 11,188 7,93032 5,33595 4,83903 4,86859 4,20649 do Hipotálamo/g (% ID/g) SEM 3,45552 2,98698 1,56155 1,64189 1,23903 0,312465 0,488397 0,069093 0,753838 ID de Porcentagem Meio 4,33614 4,6489 4,70957 4,77253 2,81178 2,22989 2,22287 2,24199 2,04046 do Mesencéfalo (% ID) SEM 1,09108 0,472434 0,556198 0,860335 0,311395 0,227459 0,239223 0,196013 0,167723 ID de Porcentagem Meio 14,6252 15,6356 15,8197 16,0115 9,51511 7,46745 7,27228 7,12792 6,11257 do Mesencéfalo/g (% ID/g) SEM 3,79365 1,65574 1,83494 2,81171 0,986306 0,733658 0,693298 0,567999 0,444177 ID de Porcentagem Meio 0,149962 0,632525 1,03599 1,26658 1,24326 1,13771 0,958425 0,900536 0,821473 do Órgão Olfativo (% ID) SEM 0,145638 0,32823 0,247651 0,241037 0,123074 0,089789 0,128224 0,064184 0,067165 ID de Porcentagem Meio 1,87276 7,74847 12,5673 15,3101 15,3729 13,899 11,474 10,5042 9,0143 do Órgão Olfativo/g (% ID/g) SEM 1,82129 4,07012 2,99221 2,78286 1,67593 0,859927 1,24418 0,559225 0,567696 ID de Porcentagem Meio 0,103703 0,185432 0,194473 0,217117 0,197903 0,151701 0,149739 0,171693 0,151244 de Outros (Ventrí- culos) (% ID) SEM 0,064701 0,053473 0,042229 0,048518 0,031704 0,012028 0,013804 0,020145 0,013969 ID de Porcentagem Meio 4,78859 8,43852 8,78707 9,76454 8,6628 6,77372 6,44925 7,21803 5,96959 de Outros (Ventrí- culos)/g (% ID/g) SEM 3,07256 2,59532 1,96278 2,10578 1,32337 0,539855 0,494456 0,807697 0,44098 ID de Porcentagem Meio 0,001539 0,006606 0,015932 0,018396 0,039833 0,035454 0,030647 0,032093 0,029051 da Área Septal (% ID) SEM 0,001539 0,003583 8,82E-05 0,003932 0,01193 0,003715 0,009077 0,001693 0,005864 ID de Porcentagem Meio 0,120801 0,527008 1,27118 1,46742 3,10952 2,7415 2,29345 2,38383 1,99012 da Área Septal/g (% ID/g) SEM 0,120767 0,282368 0,015955 0,309541 0,891273 0,298319 0,674918 0,108081 0,356811
Tempo (h) 0 0,25 0,5 0,75 6 24 96 168 336 ID de Porcentagem Meio 0,092871 0,150887 0,196566 0,219307 0,330367 0,230327 0,239492 0,267022 0,259107 do Tálamo (% ID) SEM 0,087919 0,09502 0,106559 0,089875 0,103733 0,028211 0,016836 0,038453 0,035847 ID de Porcentagem Meio 1,35285 2,1754 2,82156 3,12705 4,75564 3,29927 3,32141 3,61865 3,31424 do Tálamo/g (% ID/g) SEM 1,28417 1,39631 1,56503 1,3048 1,432 0,397001 0,246257 0,503694 0,400364 ID de Porcentagem Meio 0,488571 0,647725 0,639413 0,682258 0,413888 0,344319 0,331351 0,343591 0,309396 da Matéria Branca (% ID) SEM 0,165272 0,08416 0,056944 0,104846 0,047088 0,032138 0,028182 0,022572 0,029752 ID de Porcentagem Meio 8,95911 11,7844 11,5942 12,3289 7,60563 6,27336 5,76995 5,89313 4,99564 da Matéria Bran- ca/g (% ID/g) SEM 3,18773 1,61296 0,885738 1,64353 0,721249 0,575411 0,454626 0,362268 0,449234 Porcentagem de ID Meio 6,64123 9,64981 11,2795 12,5369 12,9323 11,3917 10,9299 10,5087 9,42048 do Cérebro Inteiro (% ID) SEM 2,56605 2,14697 1,5151 1,90975 1,21462 0,926368 1,03752 0,787061 0,878424 Porcentagem de ID Meio 3,88961 5,63422 6,57098 7,29032 7,62932 6,62764 6,20152 5,81735 4,91559 do Cérebro Intei- ro/g (% ID/g) SEM 1,53724 1,29676 0,901465 1,07932 0,683575 0,493438 0,519785 0,38773 0,393178 Avaliação de GAPmers de TAU em neurônios derivados de iPSC humanos
[00329] Em seguida, a eficácia de um dos principais GAPmers (GAPmer E) foi comparada com a eficácia do GAPmer de TAU Ionis (GAPmer G) na redução do mRNA de TAU em neurônios derivados de iPSC humanos (iNeurônios). Os iNeurônios foram tratados com várias doses de ambos os GAPmers por um período total de 72 horas e o RNA celular total coletado. O mRNA de TAU foi medido com 6 ensaios diferentes, bem como com ensaios específicos de TAU 3R e 4R (Ta- bela 16). Ambos os compostos reduziram os níveis de mRNA de TAU de maneira dependente da dose. No entanto, o GAPmer E mostrou consistentemente valores de IC50 ~4 a 5 vezes menores, indicando que o GAPmer é mais potente do que GAPmer G.
Tabela 16 Ensaio de mRNA de TAU total JPNV-1 GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 5,26 2,00 100,00 8,90 2,00 -4,11 105,73 7,76 2,00 66,20 7,97 2,00 -3,81 76,81 3,49 2,00 57,05 0,89 2,00 -3,51 59,15 5,15 2,00 53,71 4,27 2,00 -3,20 73,86 3,19 2,00 56,45 3,76 2,00 -2,90 75,20 1,16 2,00 52,56 2,43 2,00 -2,60 60,12 3,61 2,00 42,05 2,25 2,00 -2,30 51,36 4,79 2,00 39,61 3,82 2,00 -2,00 43,01 2,99 2,00 30,64 1,39 2,00 -1,70 43,88 1,82 2,00 33,58 1,55 2,00
Ensaio de mRNA de TAU total JPNV-2 GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 6,41 2,00 100,00 6,21 2,00 -4,11 24,84 1,80 2,00 20,00 1,19 2,00 -3,81 56,59 2,16 2,00 48,73 4,79 2,00 -3,51 51,51 3,69 2,00 35,98 1,63 2,00 -3,20 51,49 1,82 2,00 36,62 2,60 2,00 -2,90 53,65 1,19 2,00 37,02 0,96 2,00 -2,60 40,99 2,12 2,00 29,15 1,35 2,00 -2,30 39,59 1,79 2,00 29,71 2,44 2,00 -2,00 34,02 1,03 2,00 25,37 1,82 2,00 -1,70 29,58 2,78 2,00 24,24 0,94 2,00
Ensaio de mRNA de TAU 3R GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 5,06 2,00 100,00 6,68 2,00 -4,11 98,52 6,40 2,00 70,06 4,91 2,00 -3,81 67,36 2,95 2,00 51,92 1,81 2,00 -3,51 73,28 5,54 2,00 46,44 2,02 2,00 -3,20 78,75 7,03 2,00 54,94 4,38 2,00 -2,90 72,16 3,92 2,00 49,60 1,83 2,00 -2,60 55,58 6,73 2,00 36,87 3,68 2,00 -2,30 55,57 2,90 2,00 38,88 1,99 2,00 -2,00 46,08 3,19 2,00 31,61 3,47 2,00 -1,70 46,00 2,33 2,00 28,60 1,53 2,00
Ensaio de mRNA de TAU 4R GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 8,07 2,00 100,00 8,66 2,00 -4,11 98,95 10,45 2,00 68,72 10,10 2,00 -3,81 71,44 7,35 2,00 66,14 9,41 2,00 -3,51 86,77 10,41 2,00 45,76 5,40 2,00 -3,20 89,66 4,77 2,00 59,82 4,93 2,00 -2,90 75,93 5,07 2,00 51,76 4,18 2,00 -2,60 74,03 5,98 2,00 44,10 5,51 2,00 -2,30 62,73 4,05 2,00 43,65 5,14 2,00 -2,00 60,46 5,68 2,00 38,37 4,26 2,00 -1,70 61,52 5,36 2,00 28,82 1,55 2,00
Ensaio de mRNA de TAU total B01 GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 4,14 2,00 100,00 5,90 2,00 -4,11 111,85 13,42 2,00 67,28 2,70 2,00 -3,81 58,26 1,91 2,00 45,92 1,66 2,00 -3,51 57,40 5,01 2,00 39,63 3,68 2,00 -3,20 51,69 1,20 2,00 37,51 1,63 2,00 -2,90 49,11 3,05 2,00 35,71 3,17 2,00 -2,60 43,08 2,04 2,00 29,67 1,24 2,00 -2,30 36,56 3,01 2,00 27,05 1,49 2,00 -2,00 33,47 1,85 2,00 25,92 1,70 2,00 -1,70 31,96 1,35 2,00 23,63 1,12 2,00
Ensaio de mRNA de TAU total B02 GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 18,06 2,00 100,00 16,10 2,00 -4,11 89,43 13,92 2,00 86,50 6,39 2,00 -3,81 76,62 4,87 2,00 73,14 3,78 2,00 -3,51 76,28 5,80 2,00 70,26 5,44 2,00 -3,20 57,42 22,00 2,00 62,15 22,69 2,00 -2,90 56,07 17,26 2,00 66,44 25,75 2,00 -2,60 56,68 5,62 2,00 50,53 6,40 2,00 -2,30 56,02 5,75 2,00 54,94 3,18 2,00 -2,00 58,70 4,16 2,00 48,44 2,30 2,00 -1,70 60,05 4,55 2,00 50,47 2,71 2,00
Ensaio de mRNA de TAU total B04 GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 6,21 2,00 100,00 9,22 2,00 -4,11 99,83 7,72 2,00 71,27 4,72 2,00 -3,81 91,52 9,34 2,00 59,20 3,96 2,00 -3,51 91,28 6,40 2,00 62,05 3,23 2,00 -3,20 96,69 3,34 2,00 65,94 4,10 2,00 -2,90 88,52 4,15 2,00 57,63 4,19 2,00 -2,60 73,91 6,53 2,00 47,11 1,37 2,00 -2,30 72,26 3,42 2,00 46,09 3,69 2,00 -2,00 71,32 2,46 2,00 43,76 2,19 2,00 -1,70 74,91 5,87 2,00 42,52 3,95 2,00 Ensaio de mRNA de TAU total B06 GAPmer G GAPmer E Dose Log (mM) Média SEM N Média SEM N -4,41 100,00 105,59 2,00 100,00 110,27 2,00 -4,11 124,26 111,64 2,00 51,19 72,99 2,00 -3,81 150,32 81,10 2,00 42,93 62,90 2,00 -3,51 103,10 62,46 2,00 34,99 59,23 2,00 -3,20 53,75 77,99 2,00 44,52 62,24 2,00 -2,90 66,83 79,40 2,00 45,46 57,96 2,00 -2,60 105,07 63,48 2,00 14,83 46,37 2,00 -2,30 55,09 54,23 2,00 39,97 43,68 2,00 -2,00 39,68 45,41 2,00 23,71 33,79 2,00 -1,70 94,51 46,33 2,00 42,82 37,02 2,00 Método de Tratamento
[00330] Um adulto humano que sofre de uma tauopatia, como a do- ença de Alzheimer (DA), é administrado através de qualquer via de administração adequada, tal como a via intratecal ou intracerebroven- tricular de administração de um composto terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo da presente descrição, por exemplo, um oligonu- cleotídeo que tem uma sequência de nucleobase que corresponde a SEQ ID NO: 1 e modificado de acordo com a presente descrição.
As vias de administração adequadas podem incluir a administração sis- têmica, tal como as vias de administração intravenosa ou subcutânea ou a administração diretamente no SNC por meio das vias de adminis- tração intratecal ou intracerebroventricular.
O tratamento é continuado até que um ou mais sintomas de tauopatia, tal como a DA, sejam me- lhorados ou, por exemplo, os níveis de proteína tau sejam reduzidos.

Claims (102)

REIVINDICAÇÕES
1. Oligonucleotídeo complementar a pelo menos uma por- ção do gene MAPT, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais nucleotídeos de Fórmula (I): (I), em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nucleobase, R1 é –(CR'2)2OCR'3, e R' é independentemente em cada caso H ou F.
2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que cada nucleotídeo do dito oligonucleotídeo é um nucleotídeo de Fórmula (I).
3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende 2 a 40 nu- cleotídeos.
4. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende 2 a 26 nu- cleotídeos de Fórmula (I).
5. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende 5 a 10 nu- cleotídeos de Fórmula (I).
6. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que B é uma nucleobase não modificada em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I).
7. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que B é uma nucleobase modificada em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I).
8. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que B é uma nucleobase não modificada em cada nucleotídeo de Fórmula (I).
9. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que B é uma nucleobase modificada em cada nucleotídeo de Fórmula (I).
10. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que cada R' é H em pelo menos um nucleotí- deo de Fórmula (I).
11. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que cada R' é H em cada nucleotídeo de Fór- mula (I).
12. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)2OCH3 em pelo menos um nu- cleotídeo de Fórmula (I).
13. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)2OCH3 em cada nucleotídeo de Fórmula (I).
14. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende ainda um ou mais nucleotídeos de Fórmula (II): (II), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é uma nucleobase,
R2 é –CR'3, –CR'2OCR'3, –(CR'2)3OCR'3 ou –(CR'2)1-2CR'3, ou R2 é –(CR'2)2OCR'3 e Y é O, e R' é independentemente em cada caso H ou F.
15. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é –CR'3.
16. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é –(CR'2)1-2OCR'3.
17. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II), em que R2 é –(CR'2)1-2CR'3.
18. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que B é uma nucleobase modificada em pe- lo menos um nucleotídeo de Fórmula (II).
19. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que Y é S em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II).
20. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que Y é O em pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (II).
21. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que Y é S em cada nucleotídeo de Fórmula (II).
22. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que Y é O em cada nucleotídeo de Fórmula (II).
23. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende ainda um ou mais nucleotídeos de Fórmula (IIIa) ou Fór-
mula (IIIb): (IIIa) (IIIb), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, e B é uma nucleobase.
24. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende ainda um ou mais nucleotídeos de Fórmula (V'): (V'), em que Y é S ou O, R é H ou um contra-íon carregado positivamente, B é independentemente, em cada caso, uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, A é –(CR''R'')1-2– e R'' é independentemente em cada caso H, F ou Me.
25. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo está disposto em um construto de Fórmula (VI): 5' X—Y—Z 3' (VI), em que cada um de X, Y e Z é um domínio que compreende 2 a 10 nucleotídeos, sendo que pelo menos um dos domínios X e Z compre- ende pelo menos um nucleotídeo de Fórmula (I), e em que cada um dos nucleotídeos do domínio Y é um 2'-desoxinucleotídeo.
26. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende 18 a 22 nucleotídeos.
27. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os domínios X e Z compreendem, cada um, de 5 a 10 nucleotídeos.
28. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o domínio Y compreende 5 a 10 nucleo- tídeos.
29. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os domínios X e Z compreendem, cada um, 5 a 10 nucleotídeos e o domínio Y compreende 5 a 10 nucleotí- deos.
30. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os domínios X e Z compreendem, cada um, 5 nucleotídeos e o domínio Y compreende 10 nucleotídeos.
31. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que cada nucleotídeo dos domínios X e Z é um nucleotídeo de Fórmula (I).
32. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleotídeo do domínio X e pelo menos um nucleotídeo do domínio Z são, cada um, indepen- dentemente selecionados do grupo que consiste em um nucleotídeo de Fórmula (II), um nucleotídeo de Fórmula (IIIa) e um nucleotídeo de Fórmula (IIIb).
33. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que cada um dos pelo menos um nucleotí-
deo dos domínios X e Z é o mesmo nucleotídeo.
34. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que cada nucleotídeo do domínio Y é ligado através de ligações intersubunidades de tiofosfato.
35. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é de filamento único.
36. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é um oligonucleotí- deo antissenso.
37. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a sequência de nu- cleobases do oligonucleotídeo corresponde a SEQ ID NO: 1.
38. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é disposto em um construto de Fórmula (VI): 5' X—Y—Z 3' (VI), em que os domínios X e Z compreendem, cada um, 5 nucleotídeos, em que cada nucleotídeo tem a estrutura de Fórmula (II): (II), em que Y é S, RéH B é uma nucleobase, R2 é (CR'2)2OCR'3, em que cada R' é H; e o domínio Y compreende 10 nucleotídeos, cada um ligado por meio de ligações fosforotioato e cada um 2'-desoxinucleotídeo.
39. Oligonucleotídeo quimérico complementar a pelo menos uma porção do gene MAPT representado pela Fórmula (VI): 5' X—Y—Z 3' (VI), caracterizado pelo fato de que X — Y — Z é um oligonucleotídeo quimérico que compre- ende uma sequência de 18 a 22 nucleosídeos e é opcionalmente con- jugado na extremidade 5' e/ou 3' a um grupo alvo de ligante; X é um domínio que compreende uma sequência de nu- cleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; Z é um domínio que compreende uma sequência de nu- cleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; e Y é um domínio que compreende uma sequência de 2 a 10 2'-desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato.
40. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Y tem de 6 a 10 nucleosídeos de comprimento.
41. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os domínios X e/ou Z com- preendem uma sequência de nucleosídeos modificados ligados atra- vés de ligações intersubunidade de N3'→P5' fosforamidato ou N3'→P5' tiofosforamidato.
42. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Y compreende pe- lo menos uma ligação intersubunidade de fosfodiéster.
43. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Y consiste em 2'- desoxinucleosídeos ligados através de ligações de intersubunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ou duas ligações de intersubuni- dades de fosfodiéster.
44. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio X compreende nu- cleosídeos modificados em que a modificação é selecionada indepen- dentemente do grupo que consiste em 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'- OMe-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'-O-metoxietóxi-N3'→P5', nucleosí- deos conformacionalmente restritos, 2'-OH-N3′→P5′ tiofosforamidato e 2'-OH-N3′→P5′ fosforamidato.
45. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio funcional de Z compreende nucleosídeos modificados em que a modificação é sele- cionada do grupo que consiste em 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'- OMe-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'-O-metoxietóxi-N3'→P5', nucleosí- deos conformacionalmente restritos, 2'-OH-N3'→P5' tiofosforamidato e 2'-OH-N3'→P5' fosforamidato.
46. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os domínios X e/ou Z com- preendem um ou mais 2'-desoxinucleosídeos ligados através de uma ligação intersubunidade de N3'→P5' fosforamidato.
47. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os domínios X e Z compre- endem um ou mais nucleosídeos modificados 2'-arabino-F e/ou 2'-ribo- F, em que cada dito nucleosídeo é ligado independentemente através de pelo menos uma de uma ligação intersubunidade de N3′→P5′ fosfo- ramidato ou N3′→P5′ tiofosforamidato.
48. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os domínios X e Z compre- endem um ou mais nucleosídeos modificados 2'-OMe, em que cada dito nucleosídeo é ligado independentemente através de pelo menos um dentre ligação intersubunidade de N3′→P5′ fosforamidato, N3′→P5′ tiofosforamidato ou tiofosfato.
49. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados em cada um dos domínios X e Z são nucleosídeos modificados 2'-OMe ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato e em que os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 5-metilcitosina, mas opcionalmente não citosina.
50. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 2,6-diaminopurina, mas opcionalmente não ade- nina.
51. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila.
52. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados incluem nucleobases 2,6-diaminopurina, mas não nucleobases adeni- na e 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila.
53. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Y compreende 6-8 2'-desoxinucleosídeos.
54. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados em cada um dos domínios X e Z compreendem nucleosídeos modifi- cados 2'-OMe e nucleosídeos conformacionalmente restritos opcio- nalmente ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato, e em que os nucleosídeos modificados 2'-OMe incluem nucleobases 5- metilcitosina, mas opcionalmente não citosina.
55. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi-
cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados em cada um dos domínios X e Z compreendem 2'-OMe e nucleosídeos conformacionalmente restritos.
56. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados em cada um dos domínios X e Z compreendem nucleosídeos confor- macionalmente restritos e em que pelo menos um nucleosídeo modifi- cado inclui uma ligação intersubunidade de N3'→P5' fosforamidato ou N3'→P5' tiofosforamidato.
57. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Y compreende 7-8 2'-desoxinucleosídeos.
58. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados 2'-OMe incluem nucleobases 5-metiluracila, mas opcionalmente não uracila.
59. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Y compreende 9- 10 2'-desoxinucleosídeos.
60. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que os domínios X e Z compre- endem nucleotídeos representados pela Fórmula (A1): (A1);
em que A é independentemente em cada caso NH ou O; B é independentemente em cada caso uma nucleobase não modificada ou modificada; W é independentemente em cada caso OR ou SR, em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente; R' e R'' são, cada um, independentemente em cada caso selecionado do grupo que consiste em H, F, Cl, OH, OMe, Me e O- metoxietóxi; R''' é H, ou R' e R''' juntos formam –O-CH2– ou –O-(CH2) 2–, e a é um número inteiro de 3 a 9, em que quando R', R'' e R''' são, cada um, H, então A é NH, e opcionalmente quando A é O, então W é SR.
61. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio X e/ou Z compre- ende um ou mais oligonucleotídeos em que a modificação é 2'-O- metoxietoxi-N3'→P5'.
62. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio X compreende um ou mais oligonucleotídeos em que a modificação é 2'-O-metoxietoxi- N3'→P5'.
63. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio Z compreende um ou mais oligonucleotídeos em que a modificação é 2'-O-metoxietoxi- N3'→P5'.
64. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo corresponde a SEQ ID NO: 1.
65. Oligonucleotídeo quimérico que tem uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT, caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compre- ende um construto representado pela Fórmula (VII): 5'-X'—Y'—Z'-3' (VII), em que X'—Y'—Z' é um oligonucleotídeo quimérico que compreen- de uma sequência de 16 a 22 nucleosídeos e é opcionalmente conju- gado na extremidade 5' e/ou 3'; X' é um domínio que compreende uma sequência de nu- cleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; Z' é um domínio que compreende uma sequência de nu- cleosídeos modificados que tem 3 a 10 nucleosídeos de comprimento; e Y' é um domínio que compreende uma sequência de 2 a 4 2'-desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades. em que os domínios X' e/ou Z' compreendem uma sequên- cia de nucleosídeos modificados ligados através de ligação intersubu- nidade de N3′→P5′ fosforamidato ou N3′→P5′ tiofosforamidato.
66. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que o domínio Y' consiste em 2'- desoxinucleosídeos ligados através de ligações intersubunidades de tiofosfato e, opcionalmente, uma ligação intersubunidade de fosfodiés- ter.
67. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que o domínio X' tem 9 ou 10 nu- cleosídeos de comprimento.
68. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que o domínio X' compreende nucleosídeos modificados em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5',
2'-O-metoxietóxi, 2'-O-metoxietoxi-N3'→P5' e nucleosídeos conforma- cionalmente restritos.
69. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que o domínio Z' compreende nu- cleosídeos modificados em que a modificação é selecionada do grupo que consiste em 2'-F, 2'-F-N3'→P5', 2'-OH, 2'-OMe, 2'-OMe-N3'→P5', 2'-O-metoxietóxi, 2'-O-metoxietóxi-N3'→P5' e nucleosídeos conforma- cionalmente restritos.
70. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que os domínios X' e/ou Z' com- preendem um ou mais nucleosídeos modificados 2'-arabino-F e/ou 2'- ribo-F.
71. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados nos domínios X' e/ou Z' compreendem 2'-OMe e nucleosídeos confor- macionalmente restritos.
72. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos modificados nos domínios X' e/ou Z' compreendem nucleosídeos conformacional- mente restritos e uma modificação N3'→P5'.
73. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que a sequência é selecionada dentre aquelas na Tabela B que têm um domínio Y de 2 a 4 nucleotí- deos.
74. Oligonucleotídeo quimérico, de acordo com a reivindi- cação 65, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo corresponde a SEQ ID NO: 1.
75. Oligonucleotídeo que tem uma sequência complemen- tar a pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT, em que o dito oligonucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais nucleotídeos da Fórmula (A) que se segue: (VIII), em que XA é NH ou O, Y é OR ou SR, em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, BA é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, RA' e RA'' são, cada um, independentemente, em cada ca- so, selecionados de H, F, OH, OMe, Me, O-metoxietóxi, e RA''' é H ou RA' e RA''' juntos formam –O-CH2– ou –O- (CH2)2–.
76. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que RA' e RA''' são H; e RA'' é F.
77. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que RA' e RA'' são H; e RA''' é F, OH, H ou OMe.
78. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que XA é NH; BA é uma nucleobase não modificada ou modificada; RA' e RA''' juntos formam um nucleosídeo conformacionalmente restrito (por exemplo, –O-CH2– ou –O-(CH2) 2–); e RA'' é H.
79. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre RA' e RA'' é H.
80. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que, quando BA é uma nucleobase purina, pelo menos um dentre RA' e RA'' é OH ou F, e/ou quando BA é uma nu-
cleobase pirimidina, pelo menos um dentre RA' e RA'' é OMe, OH ou F.
81. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que a nucleobase modificada é selecionada de 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 5-metiluracila e um g-clamp.
82. Oligonucleotídeo que tem uma sequência complemen- tar a uma sequência do gene MAPT, em que o dito oligonucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende dez ou mais nucleotídeos da Fórmula (IX) que se segue: (IX), em que R é H ou um contra-íon carregado positivamente, BB é independentemente em cada caso uma nucleobase natural ou não modificada ou uma nucleobase modificada, RB' e RB'' são, cada um, independentemente, em cada ca- so, selecionados de H, F, OMe, Me, O-metoxietóxi, e RB''' é H ou RB' e RB''' juntos formam –O-CH2– ou –O-(CH2) 2–.
83. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que RB' e RB''' são H; e RB'' é F.
84. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que RB' e RB'' são H; e RB''' é F, OH, H ou OMe.
85. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que BB é uma nucleobase não modificada ou modificada; RB' e RB''' juntos formam um nucleosídeo conformacio- nalmente restrito (por exemplo, –O-CH2– ou –O-(CH2) 2–); e RB'' é H.
86. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 82,
caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre RB' e RB'' é H.
87. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que, quando BB é uma nucleobase purina, pelo menos um dentre RB' e RB'' é OH ou F, e/ou quando BB é uma nu- cleobase pirimidina, pelo menos um dentre RB' e RB'' é OMe, OH ou F.
88. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a nucleobase modificada é selecionada de 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 5-metiluracila e um g-clamp.
89. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 88, e um excipiente farmaceuticamente aceitá- vel.
90. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 89, caracterizada pelo fato de que a composição é adequada para administração intratecal ou intracerebroventricular.
91. Método para inibir a expressão do gene MAPT em uma célula do SNC, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição, como de- finidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 90.
92. Método para inibir a transcrição de mRNA MAPT em uma célula do SNC, caracterizado pelo fato de que compreende colo- car a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição, co- mo definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 90.
93. Método de tratamento de um indivíduo com tauopatia, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indiví- duo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotí- deo ou composição, como definidos em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 90.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que a tauopatia é a doença de Alzheimer.
95. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 94, caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotí- deo complexado com um gene MAPT tem uma temperatura de fusão (Tm) de > 37 °C.
96. Método de tratamento de um indivíduo com tauopatia, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indiví- duo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotí- deo ou composição, como definidos em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 90.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que a tauopatia é a doença de Alzheimer.
98. Método de inibição da expressão de um mRNA MAPT em uma célula do SNC, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com um oligonucleotídeo ou composição que compreende um oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 90, em que o oligonucleotídeo contém uma se- quência de nucleobase que é complementar ou hibridiza com pelo menos uma porção do mRNA MAPT.
99. Método para tratar um indivíduo com tauopatia, caracte- rizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo ou com- posição que compreende o dito oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 90, em que o oligonucleotídeo contém uma sequência de nucleobases que é complementar ou hibri- diza com pelo menos uma porção da sequência do gene MAPT.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que a tauopatia é a doença de Alzheimer.
101. Método para modular a expressão de um gene MAPT colocando um ácido nucleico alvo em contato com um composto antis- senso, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotí-
deo ou composição que compreende o dito oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 90, em que o oligo- nucleotídeo contém uma sequência de nucleobase que é complemen- tar ou hibridiza com pelo menos uma porção do gene MAPT.
102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 98, 99 e 101, caracterizado pelo fato de que a porção do gene MAPT é o éxon 5.
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