MX2008011200A - Molecula biespecifica de enlace tlr9 y cd32 y que comprende un epitopo de celula t para tratamiento de alergias. - Google Patents
Molecula biespecifica de enlace tlr9 y cd32 y que comprende un epitopo de celula t para tratamiento de alergias.Info
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Abstract
Una molécula o complejo de moléculas capaz de ligar a TLR9 y a CD32, comprende cuando menos un epítopo de al menos un antígeno, su producción y su uso como un medicamento, en especial para tratamiento de alergias.
Description
MOLECULA BIESPECIFICA DE ENLACE TLR9 Y CD32 Y QUE COMPRENDE UN EPÍTOPO DE CÉLULA T PARA TRATAMIENTO DE ALERGIAS La presente invención se refiere a moléculas |con especificidad de enlace tanto para Receptor tipo Toll 9 (TLR9) como CD32 que contiene uno o más epitopos | de antigeno de célula T. La invención además se refiere a la producción de estas moléculas y su uso para la preparación de medicamentos para el tratamiento de alergias. Introducción : La alergia se considera como una reacción hipersensible a proteínas del ambiente
(aire/agua/alimento) . Los alérgenos son antígenos a los cuales pacientes atópicos responden con respuestas de anticuerpo IgE, lo que lleva subsecuentemente a reacciones alérgicas. Los antígenos en los complejos o proteínas de fusión, pueden ser alérgenos ambientales (por ejemplo ácaros domésticos, polen de abedul, polen de pastos, antígenos de gatos, antígenos de cucarachas), o alérgenos de alimentos (por ejemplo de leche de vaca, cacahuate, camarón, soya), o una combinación de ambos. Moléculas IgE son importantes debido a su papel en activación de células efectoras (mastocitos, basófilos y eosinófilos ) . Más recientemente, se ha aceptado que IgE también juega un papel importante en la fase de inducción de enfermedades alérgicas, al regular a la alta el potencial de captura de
antigeno de células B y células dendriticas (DC = dendritic cells), tanto a través de receptores de baja afinjjdad (CD23) como de alta afinidad (FcfRI) [1]. Las funciones negativas de anticuerpos IgE pueden contra-atacarse por anticuerpos IgG específicos de alérgeno, por ejemplo debido a que dirigen la respuesta inmune lejos de las células B a monocitos y DC [2]. Además, compiten con moléculas ílgE para sitios de enlace de alérgeno. Por lo tanto las alergias pueden ser tratadas, curadas y evitadas por la inducción de moléculas IgG específicas de alérgeno. Las moléculas IgG tienen una vida media en suero de aproximadamente 3 semanas, en comparación con aproximadamente 3 días para moléculas IgE. Las moléculas IgE se inducen por la interacción entre células B sin tratamiento previo) y células Th2 que proporcionan IL-4 e IL-13, junto con la expresión CD40L necesaria para inducir un interruptor de clase a IgE en las células de B ! de memoria y células de plasma [3] . En contraste, las células Thl, que producen IFN- e IL-2, inducen un interruptor de clase a IgG. Por lo tanto, la inducción de Thl, en vez de respuestas de célula T auxiliar de Th2 contra alérgenos, es benéfica para la prevención, tratamiento y cura de enfermedades alérgicas. A la fecha se emplean varias formas de vacunaqión activa utilizando alérgenos. La más común es la |asi
denominada " Inmunoterapia" , que depende de frecuentes inmunizaciones con concentraciones relativamente altas de alérgenos. Esta técnica solo es moderadamente efectiva en una minoría de enfermedades alérgicas, tales como alergia a veneno de abejas y en algunos casos de Rinitis1 y Conjuntivitis, y recientemente algunos reportes ! han mostrado efectividad en asma y dermatitis atópica. Más recientemente, se ha propuesto inmunoterapia rápida, j en donde cantidades crecientes de alérgeno se inyectan en un marco de tiempo relativamente corto, con resultados i ligeramente mejores [4; 5]. Usualmente, la ruta subcutánea se utiliza para administración de los alérgenos, pero recientemente ésta ruta se ha comparado por aplicación oral o incluso aplicación local, los resultados en general json positivos pero no siempre son consistentes. Una técnica diferente para inmunoterapia es la descrita por Saint-Remy (EP 0 178 085 y 0 287 361), que hace el uso de anticuerpos IgG autólogos que forman complejo in vitro con los alérgenos relevantes. Esta técnica permite que cantidades bastante más pequeñas de alérgeno sean aplicadas con m nos efectos secundarios. El mecanismo tras estas terapias no es claro. | En la terapia clásica parece haber un efecto benéfico si la terapia induce un aumento en anticuerpos IgG específicos, aunque no todo aumento significante de IgG específico está
correlacionado con inmunoterapia exitosa. Un argumento posible por el que este es el caso, es la afinidad relativamente baja de anticuerpos IgG para CD32 en células B, monocitos y mastocitos. El enfoque Saint-Remy selecciona los anticuerpos IgG específicos del paciente, que subsecuentemente se mezclan con alérgenos relevantes in vitro. De esta manera se asegura que el alérgeno no pijieda reaccionar libremente con las células u otros isotipos de anticuerpo, en células tales como IgE en mastocitos. Además, reclaman que anticuerpos anti-idiotípicos ¡ se desarrollan contra las moléculas IgG específicas, que en el futuro evitarán la alergia. | I En WO 97/07218 se describen Proteínas de Fusión
Alergeno-anti-CD32. En esta publicación, los problemas con aislar moléculas IgG específicas y la baja afinidadi de estos anticuerpos IgG por CD32 se superan y se reducen los factores de riesgo de la inmunoterapia clásica, que utilizan alérgenos completos de "enlace IgE". Sin embargo, la inducción reivindicada de respuestas de memoria Thl debido a la dirección sola de la vacuna que contiene ariti- CD32 a células dendríticas, no puede ser substanciada. Incluso en vista de la investigación intensa por enfoques terapéuticos para tratar enfermedades alérgicas, todavía hay gran demanda por proporcionar medicamentos para tratamiento exitoso de alergias.
El objetivo de la invención por lo tanto] es I proporcionar moléculas novedosas con propiedades mejoradas para el tratamiento de enfermedades alérgicas. De acuerdo con la invención este objeto se logra por la materia de las reivindicaciones. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Antecedentes CD32 se expresa fuertemente en células dendriticas/monocitos y células B y de esta manera, la molécula de la presente invención se diseña para dirigir la respuesta inmune a estas células inmunológicas importantes , con la intención de evitar presentación de alérgeno por células B, mientras que se promueve la presentación de alérgeno por células dendriticas (DCs = Dendritic Cells) en especial, esto último lleva a la inducción de respuestas Thl contra los alérgenos en la molécula o complejo de moléculas que pueden formularse como vacuna. Conocimiento ! más reciente muestra que dos tipos de células dentriticas
(DC) existen: células mieloides (mDC) y células dendritij.cas i plasmacitoides (pDC = plasmacytoid dendritic cells) [6], que ha llevado al nuevo concepto de células DC1 y DC2 |7] . En este concepto, las células DC1 promueven la inducción de desarrollo de células Thl después de estimulo especificq de antigeno y las células DC2 soportan el desarrollo de células Th2. DC derivadas de monocitos (o mDC) en general
se consideran del tipo DC1, mientras que pDC se
del tipo DC2 [6] . Ambos tipos de DC expresan CD32'a e inducirán una respuesta de célula T específica de alérgeno; sin embargo no se garantiza que el resultado será del tipo Thl. De hecho, en donadores alérgicos las respuestas Th2 son más probables [8] . De manera importante, pDC expresa el receptor TLR9, que liga CpG-ODNs (oligodeoxinucleótidos
[ODNs] que contienen motivos CpG sin metilar) . La activación de este receptor en pDC lleva a una muy fuerte producción de IFN- a y IL-12 [9], que promueve inducción de
Thl y de esta manera transforma DC2 potenciales en células
DC1. I Por lo tanto, la molécula de la invención puede combinar la activación del receptor TLR9 en pDC, con el estímulo e inducción específicos de células Thl específicas de alérgeno y comprende por lo tanto una mejora significante de conceptos previos. La invención comprende una molécula o complejcj de moléculas que tiene especificidad de enlace para receptor tipo toll 9 y CD32, en donde la molécula o complejo de moléculas incluye cuando menos un epítopo, de preferencia al menos un epítopo de célula T, o al menos un antígeno La molécula o complejo de moléculas de | la invención también superará la función efectora de ¡los mastocitos, que transportan IgE, para el alérgeno natlivo
del cual epitopos de células T se han seleccionado parte de la proteina de fusión.
De preferencia, la molécula o complejo ! de moléculas de acuerdo con la invención pueden tener urja o más de las siguientes características únicas: | i Activación e inducción de células Thl específicas de alérgeno, sin activación de células B específicas! de
La o las estructuras de enlace TLR9 incorporadas en la molécula o complejo de moléculas de la invención son necesarias para la inducción de un conjunto de memoria Thl especifico de alérgeno, al ligar al receptor R9 citoplasmático [10; 11] . Activación del receptor TLR9 lleva a una fuerte inducción de IFN-a y producción de IL12 [9] . De acuerdo con la presente invención, ' una i molécula es una sola entidad constituida por átomos | y/u otras moléculas por enlaces covalentes. La molécula puede estar constituida por una sola clase de sustancias o una combinación de las mismas. Clases de sustancias por ejemplo son polipéptidos , carbohidratos, lipidos, ácidos nucleicos, etc. Un complejo de moléculas es un agregado de moléculas que interactúan entre si en forma especifica y fuerte. Un complejo de diversas moléculas puede formarse por interacciones hidrofóbicas (tales como por ejemplo- el enlace de regiones variables de anticuerpo en un Fv) o por fuerte enlace de una molécula con otra mediante interacciones de ligando/receptor, tales como enlace de anticuerpo-antigeno o avidina-biotina o por formación de complejo mediante grupos químicos quelantes y semejantes . Un antígeno puede ser una estructura que pueda reconocerse por un anticuerpo, un receptor de célula iB o receptor de célula T, cuando se presenta por moléculas
clase I o II HC. ; Un epitopo es la estructura más pequeña jbara ligar específicamente dentro de un anticuerpo, un receptor de célula B o un receptor de célula T, cuando se presenta por moléculas clase I o II MHC. La especificidad se define como un enlace preferido a una cierta estructura molecular I (en interacciones de anticuerpo/antígeno también denominadas epitopo) dentro de un cierto contexto. Un dominio es una región discreta que ! se encuentra en una proteína o polipéptido. Un dominio de monómero forma una estructura tri-dimensional nativa en solución, en la ausencia de secuencias de aminoácidos nativas de flanco. Dominios de la invención ligarán específicamente con CD32 y/o TLR9 y/o exhiben o presentan epítopos. Pueden emplearse dominios como dominios sencillos o dominios de monómeros o combinados para formar dímeros y dominios multiméricos . Por ejemplo, un polipéptido que forma una estructura tri-dimensional que liga a una molécula objetivo es un dominio de monómero. ' I De acuerdo con la presente invención, el término í anticuerpo incluye anticuerpos o derivados de anticuerpjo o sus fragmentos así como moléculas relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas (tal como receptores de célula T solubles) . Entre los fragmentos de anticuerpo están equivalentes funcionales u homólogos de anticuerpos
incluyendo cualquier polipéptido que comprende un dominio de enlace de inmunoglobulina o un pequeño dominiol de I inmunoglobulina montado o péptidos que imitan este dominio de enlace en conjunto con una región Fe o una región homologa a una región Fe o al menos parte de esta, j Se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de enlace de inmunoglobulina, o equivalentes, fusionados a i otro polipéptido. Los alérgenos son antigenos a los cuales responden pacientes atópicos con reacciones alérgicas. Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona una molécula o | un complejo de moléculas que es capaz de ligar a receptor tipo toll 9 (TLR9) y receptor Fe gamma RII (CD32) e incluyen cuando menos un epitopo de al menos un antigeno. En una modalidad de la invención, la molécula o complejo de moléculas comprende al menos tres partes, luna parte que es una estructura que liga específicamente a TLR9 (en forma monovalente, bivalente o multivalente) , otra parte es una estructura que liga específicamente a CD32 (en forma monovalente, bivalente o multivalente) y al menos otra parte es uno o más epítopos de células T de un antígeno y/o alérgeno. Las partes pueden ser estructuras independientes que se enlazan en conjunto ya sea por enlaces químicos o por fusión genética o por otras
interacciones (no-covalentes ) tales como interacciones! de anticuerpo o receptor-ligando. >' i Los enlaces entre las diferentes partes pueden ser diferentes. Por ejemplo, en una modalidad preferida,: el enlace entre las partes que ligan a TLR9 y CD32 es Ipor fusión genética y el enlace a cuando menos uno de j los epitopos de célula T es mediante una interacción ! de receptor/ligando (por ejemplo biotina-estreptavidina ) . La ventaja de esta configuración es la flexibilidad j en i producción. La parte genérica biespecifica (anti-TLR9/anti-CD32), del complejo de moléculas puede producirse en la misma forma para todos los pacientes, epitopos de células T se enlazan a la parte genérica del complejo de moléculas de acuerdo con la necesidad. La selección puede basarse en preponderancia de la enfermedad o en resultados de pruebas de especificidad individuales de los pacientes (ale gia especifica) . La formación de complejo puede realizarse centralizada o al lado de la cama o en el consultorio 'del i médico. I El enlace químico de moléculas de las diversas moléculas de enlace de la misma o diferentes clases químicas puede lograrse por muy diferentes técnicas dando ya sea una proporción molecular definida de las diveísas partes de la molécula o complejo de moléculas la invención. También puede llevar a una mezcla de moléculas
con diferentes proporciones moleculares de las diversas partes de la molécula o complejo de moléculas de la I invención . La proporción de las diversas partes de la invención puede ser equimolar o no equimolar. La molécula puede ser monovalente para enlace a TLR9 y/o CD32 j y/o epitopo(s) de célula T. También puede ser bi-, trl y i multivalente para al menos una de las partes de la molécula o complejo de moléculas. Si el enlace a TLR9 y/o CD32 es bivalente o de superior valencia, la especificidad de enlace puede ser para uno o más epitopos en CD32 y/o TLR9 respectivamente . En otra modalidad de la invención, las especificidades de enlace de la molécula se superponen de manera tal que una parte de la molécula o complejo de moléculas de la invención liga a ambos, TLR9 y CD32. Dicha parte puede seleccionarse por cribado simultáneo de jlas moléculas para enlazar tanto CD32 como TLR9 o por diseñó de una molécula para ligar ambos, CD32 y TLR9. Por ejemplojun andamio de proteínas puede utilizarse para exhibir bucles para ligar CD32 y otros bucles para ligar a TLR9. En una modalidad adicional de la invención,! un andamio de proteínas puede emplearse para exhibir estructuras que ligan CD32, estructuras que ligan TLRL y para exhibir epitopos de célula T.
Las moléculas de enlace especifico pueden ser ligandos naturales para CD32 y TLR9 y sus derivados. : Por ! ejemplo, la parte Fe de inmunoglobulina enlaza a CD32. CpG es un ligando de origen natural para TLR9. Las moléculas de enlace específico pueden ! ser péptidos. Péptidos específicos de CD32- y TLR9- de acuerdo con la invención pueden seleccionarse por diversos métodos tales como tecnología de expresión en fago o al cribar bibliotecas péptido combinatorias o hileras o colecciones ordenadas de péptido. Los péptidos pueden seleccionarse y utilizarse en diversos formatos tales como péptidos lineales, restringidos o cíclicos, los péptidos pueden ser químicamente modificados para estabilidad y/o especificidad . Un péptido de enlace específico también puede derivarse de análisis de interacción de un ligando proteináceo de origen natural a TLR9 y CD32 por aislamiento de sitio de enlace mínimo del ligando. I Los péptidos de enlace específico pueden emplearse como tales en la molécula o el complejo de moléculas de la invención o utilizarse para incorporar en otras estructuras tales como por injerto en andamios de proteínas, anticuerpos y dominios de proteínas o acople.dos químicamente a moléculas portadoras que pueden ser parte de la molécula o complejo de moléculas de la invención.
La parte de enlace de las moléculas o complejo de moléculas de la invención puede comprender proteínas tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (tales como
Fab, Fv, scFv, dAb, F(ab)2, mini cuerpo, dominios i de inmunoglobulina mutada pequeña, receptor de célula T soluble, etc) . Anticuerpos y fragmentos de anticuerpojs y derivados pueden ser generados y seleccionados para enlazar
dominio, por ejemplo dominios con mutaciones tales como substituciones, eliminaciones o inserciones de aminoáci.dos o dominios químicamente modificados pueden seleccionarse para ligar a TLR9 y/o C D32 de acuerdo con métodos conocidos (por ejemplo expresión en fago y superficie celular de bibliotecas de dominios o variantes de dominios y criba, hileras o colecciones ordenadas de moléculas variantes y criba) . Los dominios incluyen pero no están limitadoL ' a moléculas de las siguientes clases:
Dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio fibronectina tipo I, un dominio fibronectina tipo II,| un I dominio fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio
Gla, un dominio SRCR, un dominio de Inhibidor de tripsina pancreática Kunit z/Bovino, un dominio de inhibidor i de serina proteasa tipo Kazal, un dominio Trefoil o trébol
(tipo-P) , un dominio factor von illebrand tipo C, un dominio tipo Anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, un dominio LDL-receptor clase A, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio tipo
Trombospondina I, un dominio de inmunoglobulina , un dominio I tipo Inmunoglobulina, un dominio lectma tipo C, un dominio MAM, un dominio de factor von Willebrand tipo A, un dominio A, un dominio Somatomedina B, un dominio núcleo de cuatro i disulfuros tipo WAP, un dominio F5/8 tipo C, un dominio Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio semejante EGF- tipo laminina, un dominio CTLA-4, un dominio !
C2. I En una modalidad preferida, la parte de enlace de la molécula o complejo de moléculas de la invención comprende un dominio de inmunoglobulina mutado pequeño i
(SMID small mutated immunoglobulin domian) como se describe en PCT/EP2006/050059. La parte de enlace de la molécula o complejo de moléculas de la invención pueden ser ácidos nucleicos
como ARNs o ADNs que pueden seleccionarse para enlace especifico a TLR9 y/o CD32 de acuerdo con métodos conocidos tales como criba de aptámero y técnicas de evolución in vitro. Se contempla que también otras clases ¡ de I moléculas serán capaces de mostrar enlace especifico a TLR9 y/o CD32. Bibliotecas de otras entidades químicas1 a aquellas anteriormente mencionadas, incluyendo carbohidratos, lípidos, y moléculas orgánicas pequeñas, pueden cribarse para enlace específico con TLR9 y/o CD32 y pueden incorporarse en la molécula o complejo de moléculas de la invención. Una modalidad preferida de la invención es una proteína de fusión recombinante que consiste de cuando menos un epítopo de al menos un antígeno, al menos un sitio de enlace que interactúa con TLR9 y al menos un sitio| de enlace que interactúa con CD32. El antígeno puede ser :tan pequeño como un epítopo de célula T de un antígeno o pijede ser un cóctel o mezcla de uno o más epítopos de células T de uno o más diferentes antígenos fusionados o enlazados en conjunto en una forma que permite adecuado procesamientjo y presentación por moléculas MHC . El orden de los epíto'pos puede seleccionarse de acuerdo con diferentes criterios tales como procesamiento efectivo estabilidad de produqto, ( sin- ) reconocimiento por anticuerpos preformados en ¡las
i personas tratadas. En general se elegirá para una molécula estable que puede ser presentada eficientemente por MHC y que llevará a reconocimiento mínimo por anticue pos preformados. j La invención además comprende el acoplamiento físico de cuando menos una molécula que interactúa |con
reconoce un antigeno y VL otro chi-bAbs (como se describe en EP0640130) pequeños dominios de inmunoglobulina mutados, al incluir dominios de inmunoglobulina de ingeniería, ique ligan específicamente a CD32 y/o a TLR9 en construcciones que codifican ya sea para anticuerpos completos o para fragmentos de anticuerpo tales como Fab (de acuerdo con PCT/EP2006/050059) j en el contexto de esta invención, el enlacje a CD32 también ^puede lograrse por una o varias regiones Fe: de inmunoglobulina monomérica o multimérica o parte de las mismas especialmente cuando la afinidad para CD32 de las partes Fe se mejora, mientras que el enlace TLR9 se logia a través del sitio de enlace normal (VH/VL) del anticuerpo - una o varias regiones Fe de una inmunoglobulir a o sus partes, que ligan a CD32 fusionadas coh cualquier qtro motivo de enlace específico TLR9 la parte Fe del anticuerpo anteriormente mencionado puede ser de "glico-ingeniería" para incremeritar la afinidad para Fc^R's humano [15] ! andamios de ingeniería, que ligan específicamente a TLR9 y/o CD32 de cualquier tipo pueden utilizarse y enlazarse en conjunto según se requiera. Estos andamios de enlace pueden ser dominios de proteína, fibronectina III, lipocalinas, inhibidor de a-amilasa o Proteína A, Proteínas
de repetición Anquirina, un dominio C2, un dominio A,| un dominio tipo EGFR, un dab, un chi-bAb, CTLA-4, gámma cristalina o cualquier otra proteina, dominio de proteina o í parte de la misma. | La molécula o complejo de moléculas de j la invención consiste de uno o más epitopos y una o ¡más estructuras de enlace, que interactúan con TLR9, de preferencia TLR9 humano y una o más estructuras de enlace, I que interactúan con CD32, de preferencia CD32 humano, ara ¡ prueba fácil in vivo de la proteina de la invención, !las estructuras de enlace que reconocen TLR9 humano y CD32 humano, pueden reaccionar en forma cruzada con TLR9 de mono o ratón y CD32 de mono o ratón. Los antigenos/alergénos seleccionados pueden completar proteínas naturales/nati.vas o partes de estas, siempre que epítopes que puedan presentarse en moléculas MHC clase II reconocerse por células T, se presentan en presentes en la molécula o complejo de molé partes de la molécula o complejo de
interactúan con TLR9 y CD32 pueden ser anticuerpos completos o incompletos (modificados) o sus fragmentos o derivados, siempre que se retenga el enlace a TLR9 y CD32. i En forma alterna, anticuerpos anti-TLR9 y ariti- CD32 o sus derivados o fragmentos, que todavía reconocen específicamente y ligan a TLR9 y CD32 humano tal como
expresado por células B, y células dendríticas, pueden | ser empleados . En forma alterna, los anticuerpos que interactúan con TLR9 o CD32 son anticuerpos mejorados con superior afinidad a los anticuerpos originales. Moléculas de anticuerpo ejemplares son moléculas de inmunoglobulina intactas de aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen el parátopo, incluyendo aquellas porciones conocidas como Fab, Fab' , F(ab' )2, Fe y F(v) , dAb. Los anticuerpos pueden ser IgG, IgM, IgE, Ig'A o IgD. Las moléculas que interactúan con TLR9 o CD32 pueden ser de cualquier origen, de preferencia de origen de mamífero, de preferencia de origen humano, de ratón, camello, perro o gato o humanizadas. De preferencia ¡las moléculas son anticuerpos, de preferencia anticuerpos humanos o humanizados Como se emplea aquí, si la molécula o complejo de moléculas de la invención es una proteina de fusión, puede expresarse en células anfitrionas que cubren cualquier tipo de sistema celular que pueda ser modificado para expresar la proteina de fusión. Dentro del alcance de la invención, el término "células" significa células individuaJes , tejidos, órganos, células de insectos, células ' de aves, células de mamíferos, células de hibridoma, células
primarias, lineas celulares continuas, células madre I y/o células de ingeniería genética, tales como célúlas recombinantes que expresan un anticuerpo de acuerdo con la invención . Las células pueden ser células bacterianas, células fúngales, células de levadura, células de insecto, células de peces y células de plantas. ¡ De preferencia, las células son células | de animales, más preferiblemente células de mamíferos. Estas pueden ser por ejemplo células BSC-1, LLC-MK células, células CV-1, células CHO, células COS, células PerC6, células murino, células humanas, células HeLa, células ^93, células VERO, células MDBK, células DCK, células MDOK, células CRFK, células RAF, células TCMK, células LLC-PK, células PK15, células WI-38, células MRC-5, células T-FLY, células BHK, SP2/0, células NSO o sus derivados De preferencia, las estructuras de enlace de| la molécula o complejo de moléculas de la invención 'que i reconocen TLR9 y CD32, son pequeños dominios j de inmunoglobulina mutados, que son por ejemplo un fragmento Fab en donde un sitio de enlace (ya sea específico para
CD32 o para TLR9) se forma por VH/VL, y se combinan con un segundo sitio de enlace (ya sea específico para TLR9 o para
CD32 respectivamente) que puede ser CL de ingeniería o un dominio CH1, CH2, CH3, CH4 , VL o VH de ingeniería de
acuerdo con PCT/EP/2006/050059; o un anticuerpo completó en i donde un sitio de enlace se forma por VH/VL, y se combina con un segundo sitio de enlace que puede ser un dominio ICL, CH1, CH2, CH3, CH , VL o VH de ingeniería de acuerdo con PCT/EP/2006/050059. | De acuerdo con la invención, la molécula o complejo de moléculas, contiene cuando menos una estructura que liga específicamente CD32. j Un anticuerpo anti-CD32 puede derivarse jpor métodos conocidos (tales como tecnología de hibridoma, clonación de células B y criba de biblioteca I de anticuerpos) . Para selección, células que exhiben CD32 en un formato natural, pueden emplearse o una parte extracelular recombinante de CD32 puede utilizarsej o péptidos sintéticos seleccionados de secuencia j de aminoácido CD32, pueden emplearse. Criterios de selección son aquellos en donde la estructura de enlace reconoce CD32a. En caso que también CD32b se reconoce, se prefi.ere que la afinidad para CD32a > CD32b i Como un ejemplo, el fragmento Fab para el anticuerpo anti-CD32 IV.3 derivado de la línea celular HB- 217 puede emplearse. Utilizando el método e.g. descrito por Orlandi et al16, el fragmento Fab se clona de la línea celular HB-217. En forma alterna, otros formatos tales como scFv pueden construirse de las secuencias de gen V
conocidas. Sin embargo, para combinación óptima cori un anticuerpo anti-TLR9 o fragmento Fab o fragmento Fv, se prefieren seleccionar enlazadores específicos que utilizan una o más de las bibliotecas de dominio de inmunoglobulina i mutado pequeñas de CH1, CH2 CH3, CH , CL, VL o VH . | Dominios CH1, CH2 , CH3, CH4, CL, VL o VH selectos pueden entonces clonarse en la secuencia existente de un anticuerpo anti-TLR9 o un Fab o su fragmento Fv, de esta manera generando un anticuerpo bi-específico o fragmento Fab. Las entidades de enlace CD32 seleccionadas, de preferencia deberán tener las siguientes características: 1. Interacción con CD32a lleva a internalización del complejo estructura-enlace receptor, activación de la célula que presenta antígeno a través del motivo ITAM en la cola citoplásmica del receptor y presentación de antígeno I de los epítopos de célula T fusionados/enlazados. J 2. Interacción con CD32b lleva a señalización negativa del receptor a través del motivo ITIM. 3. Interacción deberá mostrar reactivida entre CD32 de humano y mono (para prueba de efica modelo in vivo relevante) . 4. Interacción deberá mostrar reactivida con CD32 de ratón (para prueba en un modelo establecido para alergia) .
Para obtener una estructura de enlace que iga específicamente a TLR9, pueden emplearse varios procedimientos (tales como tecnología de hibridpma, clonación de célula B y criba de biblioteca de anticuerpo) . Para selección, células que expresan TLR9 en un formato natural, pueden emplearse para aislar TLR9 natural oj un
TLR9 recombinante puede emplearse o péptidos sintéticos seleccionados de la secuencia aminoácidos TLR9 pueden emplearse. En forma alterna, TLR9 purificado o TLR9 expresado por líneas celulares puede emplearse. Genes de anticuerpo que codifican para VL y VH respectivamente pueden extraerse después de selección para enlace TLR9 y utilizarse para diseñar un anticuerpo recombinante o fragmento Fab específico para TLR9 humano. En forma alterna, un Fv de cadena sencilla también puede elaborarse y fusionarse con el scFv anti-CD32 anteriormente mencionado. Sin embargo, para combinación óptima con| el anticuerpo anti-CD32 o scFv o fragmento Fab se . prefieren seleccionar enlazadores específicos que emplean una o más de las bibliotecas de dominio de inmunoglobulina mutado pequeño de CH1, CH2 CH3, CH4, CL, VH o VL. Dominios selectos CH1, CH2, CH3, CH4, CL, VL o VH pueden entonces clonarse en el anticuerpo existente o fragmento Fab o ^cFv del anticuerpo anti-CD32, de esta manera generando i un fragmento Fab bi-específico . Las entidades de enlace TLR9
seleccionadas deberán de preferencia tener las siguientes características: ! I 1. Interacción con TLR9 lleva a transducción de señal y producción de citocina. i I 2. Interacción puede mostrar reactividad cruzada entre TLR9 de humano y de mono (para prueba de eficacia en un modelo in vivo relevante) . !
método por ejemplo descrito por Orlandi et al16, ¡ el fragmento Fab se clona a partir del clon 26C593 disponible de Imgenex Corp., como se decribió anteriormente para el fragmento Fab del aCD32 Ab IV.3. De nuevo para combinación óptima con el fragmento Fab anti-TLR9 es mejor seleccionar enlazadores específicos para CD32 utilizando una o más de las bibliotecas de dominio de inmunoglobulina mulada pequeña de CH1, CH2, CH3, CH4 , CL, VL o VH. Selectos dominios CHl, CH2, CH3 , CH4, CL, VL o VH pueden entonces ¡ clonarse en el fragmento Fab existente de anticuerpo ariti- TLR9 generando de esta manera una molécula bi-específica Finalmente, por ejemplo en la ausencia de Áb' s
existentes adecuados disponibles tanto para CD32 como TLR9, también es posible construir una molécula bi-especifica utilizando las bibliotecas de dominio de inmunoglobulina pequeño mutado de CH1, CH2 CH3 o CL para enlazadóres i específicos selectos para CD32 y TLR9 que subsecuentemente se combinan para formar nuevas estructuras existentes dé al menos 1 estructura de enlace específica para CD32 y 1 estructura de enlace específica para TLR9 derivada' de cualquiera de las bibliotecas posibles en cualquiera de | las combinaciones posibles (CH1-CH1 o CH1-CH2 o CH1 CH3 o GH2-CH4 , o CH3-CH4, o CH1-CH4 o CH2-CH3 etc) . j En forma alterna, un dominio variable sencillo de la superfami para enlazar seleccionado
i bucle no estructurales para generar una biblioteca | de dominios variables que se elige para otro antígeno I respectivo, es decir en el caso de un enlace de dominio variable con bucl-es CDR a TLR9, la selección es para enlazar el CD32 y vice versa. También es posible seleccionar una biblioteca de un dominio V que contiene variaciones en el bucle CDR al mismo tiempo que variaciones en los bucles no-CDR para enlace a TLR9 y CD32 en fojrma secuencial o simultánea. Estos dominios V bi-específieos también pueden
ser parte de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como Fvs de cadena sencilla, Fabs o anticuerpos completas. Selección de un epitopo TLR9 conveniente: ' Secuencia 244-256 (SEQ ID No 1) de la protéina TLR9 madura en un código de letras de aminos ácidos 1: ' CPRHFP QLHPDTFS i
244 250 257 ¡ cumplirá los criterios 1 y 2 pero no el 3, mientras que | La Secuencia 176-191 (SEQ ID No 2) de la protéina I madura TLR9 en el código de letras de aminos ácidos 1 j LTHL SLKYNNLTVV PR ; 176 180 191
y ; I La Secuencia 216-240 de la proteina madura TLR9 (SEQ ID No 3) en el código de 1 letra de aminos ácidos
ANLT ALRVLDVGGN CRRCDHAPNP C ¡ 216 220 230 240 1 cumplirá con todos los tres criterios y de esta manera se prefieren para utilizar en esta invención. ; El proceso para producir la molécula o complejo de moléculas se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo al* utilizar técnicas de clonación recombinantes o por entrelazamiento químico. ! Un producto como se describe en esta invención puede producirse de la siguiente forma:
El VH y VL obtenidos del anticuerpo anti-CD32 se fusionan con CH1 y CL respectivamente. El CL previamente se ha sometido a ingeniería utilizando tecnología SMID
(PCT/EP2006/050059) y selecciona utilizando expresión^ en i fago para ligar a TLR9 como se describe a continuación. !
CH1 se fusiona en su extremo C con una secuencia que codifica los epitopos de célula T selectos. Estos genes que codifican dos proteínas de fusión se clonan en¡ un i vector de expresión que permite la expresión de dos g^nes I independientes (o en dos vectores de expresión independientes) y se co-expresan en células de bacterias, levaduras o animales o cualquier otro sistema de expresión conveniente. De esta manera, se produce un Fab con jlas características deseadas, es decir enlace a CD32, enlazja a TLR9 y que llevan los epitopos de célula T relevantes. Ejemplos alternos que aplican tecnología SMID: Un scFv contra TLR9 se deriva de una biblioteca i de expresión en fago o de una hibridoma existente, y una molécula de enlace CD32 se deriva de CH2-CH4 o CH3-CH4¡, o CH1-CH4 o biblioteca de dominio de inmunoglobulina mutiada pequeña. Estas dos secuencias de codificación se ligan' en conjunto y una codificación de secuencia para epitopos de célula T se conecta. La proteína de fusión después se expresa en células de bacterias, levadura o animales cualquier otro sistema de expresión conveniente.
En forma alterna, se intercambia la especificidad TLR9 y la especificidad CD32 : Un scFv contra CD32j se deriva por ejemplo de una biblioteca de expresión en fago o de un hibridoma existente, y una molécula de enlace TLR9 se I deriva de CH2-CH4, o CH3-CH4, o CH1-CH4 o biblioteca de dominio de inmunoglobulina mutada pequeña. Estas dos secuencias de codificación se ligan en conjunto y una codificación de secuencia para epitopos de célula T se conecta. La proteina de fusión después se expresa en células de bacterias, levaduras o animales o cualquier otro sistema de expresión conveniente. i VH y VL de un anticuerpo anti-TLR9 se fusionan a
CH1 y CL respectivamente. CL previamente se ha diseñado y seleccionado utilizando expresión en fago para ligar a CD32 (SMID) . CHl se fusiona en su extremo C a una secuencia que codifica los epitopos de célula T. Estos dos genes ¡que codifican proteina de fusión, se clonan en un vector1, de expresión permitiendo la expresión de dos genes independientes (o en dos vectores de expresión independientes) y se co-expresan en células de bacterias, levaduras o animales o cualquier otro sistema de expresión conveniente. (de nuevo, anti-TLR9 y anti-CD32 pueden |ser intercambiados. CHl y CL también pueden iser intercambiados ) - Genes de cadena pesada y ligera de un anticue'rpo
anti-TLR9 se toman como un todo. En el gen de cadena pesada, la región CH2 (o CH1 o CH3 o CH4) se reemplaza por una región CH2 (o CH1 o CH3 o CH4 o CL o VH o VL) j que previamente se ha diseñado y seleccionado utilizando l exhibición en fago para ligar a CD32 (dominio ¡ de inmunoglobulina mutada pequeña). CH1, CH2, CH3 o CH4' se fusionan en su extremo C a una secuencia que codifica ' los epitopos de célula T. Estos dos genes de nuevo se clonan en vectores de expresión y expresan en células de animales. 2 dominios de inmunoglobulina mutada pequeña, ¡uno i especifico para TLR9, el otro especifico para CD32| se fusionan y combinan con epitopos de célula T 1 dominio de inmunoglobulina mutada pequeña con 2 especificidades diferentes (TLR9 y CD32) también se combina con epitopos de célula T Antigenos y Epitopos Los antigenos que son parte de la molécula o complejo de moléculas de acuerdo con la invención, pueden ser alérgenos completos, alérgenos desnaturalizados! o cualesquiera antigenos que se tratan en cualquier forma posible para evitar enlace a IgE. Este tratamiento puede consistir de blindaje ó protección de epitopos de : la i proteina antigénica, utilizando anticuerpos IgM, IgD, IgA o
IgG de alta afinidad dirigidos a los mismos epitopos que los anticuerpos IgE de dos pacientes, como se describió por
Leroy et al [20] . Estos anticuerpos también pueden ligarse I a los epitopos específicos de IgE, de esta manera evitando i el enlace con los anticuerpos IgE por impedimento estériico. Los alérgenos en general se definen como antígenos a los cuales responden pacientes atópicos con respuestas de anticuerpo IgE llevando subsecuentementie a I reacciones alérgicas. Antígenos empleados en la molécula o complejo de moléculas de la invención pueden ser alérgenos ambientales (por ejemplo ácaros domésticos, polen de abedul, polen de pastos, antígenos de gatos, antígenos de cucarachas) , o alérgenos de alimentos (por ejemplo leche de vaca, cacahuate, camarón, soya) , o una combinación de ambos. También antígenos no relevantes tales como HSA pueden ser parte de la molécula o complejo de moléculas de acuerdo con la invención. El antígeno puede ser un alérgeno completo, como ejemplo un alérgeno para el cual los pacientes con dermatitis atópica, asma alérgi.ca, rinitis alérgica o conjuntivitis alérgica, son alérgicos. De preferencia, el uso de alérgeno en la molécula o complejo de moléculas de acuerdo con la: invención . no licja a IgE del paciente que requiere tratamiento. \ Los antígenos y/o epitopos empleados de la invención pueden ser de fuentes naturales o producirse por tecnología recombinante o producirse sintéticamente. Antígenos y/o epitopos de la invención pueden contener
estructuras de ligandos que facilitan la incorporación de antígenos y/o epitopos en complejos de moléculas la invención mediante interacciones de ligando/receptor o enlace de anticuerpo. Antigenos y/o epitopos de la i i invención pueden contener grupos químicos que facilitan enlace covalente de los antígenos y/o epitopos a i las estructuras de enlace CD32 y/o TLR9 de la molécula de la invención. ! En una modalidad de la invención, los antígenos y epitopos de la molécula o complejo de moléculas de la invención pueden enlazarse covalentemente a la estructura de enlace CD32 y/o la estructura de enlace TLR9. En una modalidad, antígenos y/o epitopos también pueden enlazarse por una interacción de ligando/receptor tal como biotina y avidina a la molécula o complejoj de moléculas de la invención. Por ejemplo, los antígenojs o
enlace TLR9 pueden producirse con avidina u otro ligándo I especifico de biotina conectado. Después de mezclar estas moléculas con las diferentes conexiones o agregados, un complejo de molécula estable se forma de acuerdo con la invención. En forma alterna, un enlace de anticuerpo/antígeno puede emplearse para formar un complejo
de moléculas de la invención. Interacciones de alta afinidad se prefieren para estas modalidades (por ejemplo i anticuerpo anti-digoxigenina de alta afinidad y antig nos y/o epitopos etiquetados con digoxigenina) . ; En una modalidad de la invención, los antigenos y/o epitopos se fusionan genéticamente a la estructura de enlace CD32 y/o a la estructura de enlace TLR9. Si la molécula de la invención es una proteina de i fusión, el antigeno de preferencia se produce a partir de al menos una sub-secuencia de ADN que contiene epitopd de célula T de un alérgeno. Los epitopos de célula T pueden en forma alterna ser de uno o más alérgenos relacionados y/o no relacionados. ¡ I r I De preferencia, los epitopos de célula T comprenden una nueva proteina, que no es como tal, una proteina existente en la naturaleza y por lo tanto no, se i reconoce por anticuerpos IgE o IgG existentes en j el paciente. Por lo tanto, en lugar de seleccionar epitopos de célula T cortos que son separados por corte y fusionados en conjunto de nuevo en un orden diferente, también; se puede seleccionar un tramo más grande de epitopos de célula ¡
T (> 28 AA) que aún están en su orden natural pero que se i han seleccionado previamente para no ligar a IgE especifico del alérgeno [21] . j En principio todos los antigenos conocidos pue'den
utilizarse para incorporación en la molécula o complejo de moléculas de la invención a los cuales responden pacientes alérgicos con reacciones de hipersensibilidad mediada por IgE. Los alérgenos ambientales más comunes en los países desarrollados son: Acaros domésticos, polen de abediul, polen de pastos, de gatos y cucarachas. Cada uno de estos alérgenos tiene uno o más "alérgenos principales" (por ejemplo ácaros domésticos: alérgeno principal = Der Pl;lDer
Fl, polen de abedul: alérgeno principal = Bet VI) . Sin embargo, antígenos completos, aunque son posibles, no son necesarios, debido a que la molécula o complejo de moléculas deberán solo inducir respuestas de célula T, y las células T responden a péptidos pequeños (aproximadamente de 12-28 aminoácidos de largo) presentados en moléculas MHC Clase II. La selección de los epítopo-j de célula T deberá diseñarse de manera tal que la expresión en moléculas HLA de clase II posiblemente detodos los pacientes, sea garantizada. Algunas moléculas HLA clase II más frecuentemente se expresan que otras. Un buen ejemplo para esta molécula HLA clase II con amplia expresión es HLA DPw4, que se expresa en aproximadamente 78% de la población caucásica [22]. Por lo tanto una selección de epítopos| de célula T puede incluirse en la molécula o complejosI de moléculas para cada alérgeno, de esta manera reduciendoj el tamaño y peso molecular del complejo. Si están presentes,
se prefieren epítopos de reacción cruzada superpuesta entre alérgenos de diferentes organismos genéticamente relacionados, tales como Dermatophagoides pteronyssinus (Der Pl) y Dermatophagoides farinae, (Der Fl) . ' Para permitir un procesamiento de antigeno correcto, ADN que codifica tramos ligeramente más largos que el epitopo de célula T actual habrán de incluirse en la I molécula o complejo de moléculas y/o los epitopos pueden separarse entre si al introducir tramos de ADN espaciador i de preferencia que contienen epitopos (hidrofóbicos ) reconocidos por enzimas de procesamiento de proteina mayor en células que presentan antigeno tales la endopeptidasa especifica de asparagina (AEP = Asparagine-Specific Endopeptidase) o catepsina S, catepsina D o catepsina L [23] . Para fusión a los genes que codifican ¡las estructuras de enlace especificas para TLR9 y CD32,' de j preferencia secuencias cortas de ADN de alérgenos mayores se utilizan tales como alérgeno mayor de ácaro doméstico I (Der Pl, Der Fl) , alérgeno mayor de ácaro doméstico II (Der
P2, Der F2 ) , o alérgeno de polen de abedul (Bet VI). Estas I cortas secuencias de ADN contienen el código genético para uno o más epitopos de célula T, que después de procesar, aparecen en la superficie de células que presentan anticeno y por lo tanto inducen una respuesta inmune en las células
T especificas de alérgeno de respuesta. No solo epitopos de célula T de Der Pl y Der P2 sino también Der P3, Der>P4, Der P5, Der P6, Der P7 etc. y Der F3, Der F4, Der F5, Der F6, Der F7 etc., pueden emplearse en una molécula o complejo de moléculas de la invención. Epitopos de célula T de estos alérgenos pueden seleccionarse por cartografiado de epitopos clásico utilizando ciónos de célula T [24] o al utilizar . programa para pronóstico HLA Clase II moderno tal como el programa Tepitope [25 26]. Para la molécuija o complejos de moléculas, que pueden formularse como vacuna, no es necesario combinar epitopos de célula T de una sola fuente de alérgeno; al contrario se prefiere incluir tantos epitopos de célula T derivados de diferentes fuentes de alérgeno producidos por una o más especies diferentes, por ejemplo una combinación de alérgenos de ácaros domésticos y de alérgenos de polen de pastos, de gatos y/o de abedul. Como un ejemplo para Der Pl la mayoría de los epitopos de célula T puede encontrarse en las siguientes secuencias 101-143 de la proteína madura de un código; de letra de aminoácidos (SEQ ID No 4): QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPPNANKIRE ALAQPQRYCR HYWT 101 110 120 130 140 143 ! Especialmente la secuencia de aminoácidos 101-131 contiene cuando menos 3 epitopos24 de célula T que ligan a un número de moléculas HLA clase II en código de 1 letra de
aminoácidos (SEQ ID No 5) : j QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPPNANKIRE AL 101 110 120 131 La secuencia 107-119 contiene un epítopoj de I célula T importante que liga a HLA DPw4 asi como HLA DPw524. i
Estas moléculas HLA clase II se expresan por la mayoría de la población. El epítopo en el código de 1 letra de aminoácidos (SEQ ID No 6) : '. NAQ RFGISNYCQI !
Y YDGRTII QRDNGYQPNY HAVNIVGY (SEQ ID No 8) i| t
203 210 220 227 1 Ejemplos de epítopos de células T compartidos entre Der P2 y Der F2 se encuentran en las secuencias ¡26- 44, 89-107 y 102-123 PCII HRGKPFQLEA VFEAN (SEQ ID No 9) 26 30 40 44 K YTWNVPKIAP KSENVVVT (SEQ ID No 10)
89 100 107 ENVVVTVK VMGDDGVLAC AI T (SEQ ID No 11) !
102 110 123 127 i Los epitopos de la célula T anteriormente mencionadas de Der Pl/Fl y Der P2/F2 se pueden diseñar varias moléculas o complejos de moléculas funcionales, I por ejemplo: ' Al tomar de Der Pl las siguientes secuencias: j QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPP (Secuencia A, SEQ ID No 12) i 101 110 120 CQI YPPNANKIRE AL (Secuencia B, SEQ ID No 13) \ 117 120 130 IRE ALAQPQRYCR HY T (Secuencia C, SEQ ID No 14) | 127 130 140 143 \ RTVTPIRMQG GCGSCWAFSG VAATE (Secuencia D, SEQ ID No 7)
20 30 40 44 ¡
YDGRTII QRDNGYQPNY HAVNIVGY ( Secuencia . E, SEQ ID No 8) 203 210 220 227 i Y de Der P 2 i PCII HRGKPFQLEA VFEAN (Secuencia F, SEQ ID No 9) i 26 30 40 44 j
K YTWNVPKIAP KSENVVVT (Secuencia G, SEQ ID No 10) 89 100 107 ENVVVTVK VMGDDGVLAC AIAT (Secuencia H, SEQ ID No 11) 102 110 120 123
Se puede diseñar un ADNc con el o den
B, A, E, H, G, C, F, D o H, , D, C, F, G, E, B, pero cualquier ¡ combinación posible de las secuencias selectas funcionará.
El orden preferido de los epitopos será determinado substancialmente en base a la eficiencia de expresión de la molécula recombinante completa. También, duplicaciones de secuencias se permiten, por ejemplo B, B, A, E, E, G, C, G, F[ A, D etc. La parte de epitopo de célula T por supuesto también puede contener los códigos genéticos para péptidos | más cortos o péptidos más largos para más y para menos péptidos, siempre que uno o más epitopos de célula T de uno o más alergenos/antigenos diferentes se incluyan. Epitopos de otros alérgenos tales como Bet VI,
Lol Pl, Fel di con características similares serán preferidos para inclusión en la molécula o complejo! de moléculas de acuerdo con la invención. La invención también se refiere a un método para tratar enfermedades, en especial alergias, que comprende administrar a un sujeto que requiere este tratamiento, una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una molécula o complejo de moléculas de acuerdo con la invención para utilizar como un producto farmacéutico,! en especial como un agente contra alergias. La molécula o complejo de moléculas pueden mezclarse con diluyentes y portadores farmacéuticamente
aceptables convencionales y opcionalmente otros excipientes i se administran en forma parenteral, intravenosa! o enteralmente , por ejemplo en forma intramuscular y I subcutánea. Las concentraciones de la molécula o complejo de moléculas, por supuesto variarán dependiendo i. a. ¡del compuesto empleado, el tratamiento deseado y la naturaleza de la forma. Para diferentes indicaciones, las dosis apropiadas, por supuesto variarán dependiendo de por ejemplo, la molécula o complejo de moléculas empleados, el anfitrión, el modo de aplicación y la indicación pretendida. Sin embargo, en general, se indican resultados satisfactorios a obtener con 1 a 4 vacunas en 1-2 años, i pero de ser necesario puede realizarse vacunación adicional repetida. Se indica que para estos tratamientos la molécula o complejo de moléculas de la invención puede administrarse en 2-4 dosis y con un programa de aplicación similar a como se emplea convencionalmente. Además se refiere a una molécula o complejoj de moléculas de acuerdo con la invención para utilizar como un agente farmacéutico, particularmente para utilizar en un tratamiento y profilaxis de alergias. i La composición farmacéutica preparada de acuerdo con la presente invención para utilizar como una formulación de vacuna puede (pero no tiene que) cont
cuando menos un adyuvante comúnmente empleado en | la formulación de vacuna aparte, de la molécula o complejo de moléculas. Es posible mejorar la respuesta inmune I por estos adyuvantes. Como ejemplos de adyuvantes, sin embargo no están limitados a estos, los siguientes pueden citarse: hidróxido de aluminio (Alu gel) , QS-21, Enhanzyn, derivados de lipopolisacáridos , Bacillus Calmette Guerin (BCG) , preparaciones de liposoma, formulaciones con antigenos adicionales contra los cuales el sistema inmune ya ha producido una fuerte respuesta inmune, tal como por ejemplo toxoide de tétano, exotoxina seudomonas, o constituyentes de virus de influenza, opcionalmente en una preparación de liposomas, adyuvantes biológicos tales como Factor de Estimulo de Macrófago de Granulocitos (GM-CSF = Granulocyte acrophage Stimulating Factor) , interleucina 2 (IL-2 o gamma interferona (IFN/ ) . Hidróxido de aluminio es el adyuvante de vacuna más preferido Compendio de un modo de acción posible de la proteina de fusión de acuerdo con la invención: La proteina de fusión de acuerdo con la presente invención, puede ser formulada en cualquiera de las formulaciones farmacéuticas aceptables disponibles, pero¡ de preferencia se formula como una vacuna. La porción de enlace aCD32 de la proteina de fusión de acuerdo con| la
invención selecciona las células relevantes. La activación de CD32 en estas células inducirá en forma activa la internalización del receptor más la proteina de fusión anexa y al hacerlo facilita la interacción de la porción de enlace TLR9 de la proteina de fusión con el TLR9, que se expresa dentro del citoplasma de las células que presentan el antigeno relevante [10;11]. : Como una consecuencia de la internalización i mediada por CD32, el procesamiento y presentación subsecuentes de los epitopos de célula T selectos en moléculas MHC Clase II, combinado con la activación especifica de TRL9 citoplásmico en las células que presentan antigeno, células T especificas de alérgeno serán (re-) programadas para volverse células de memoria Thl. Estas células de memoria Thl especificas de alérgeno er. un punto en tiempo posterior inducirán una producción IgG especifica de alérgeno cuando encuentran los mismos epitopos derivados de los alérgenos naturales presentados por células B especificas de alérgeno naturalmente expuestas. Estas células Thl de esta manera son necesarias para volver a balancear el sistema inmune de producción de anticuerpos dominada por IgE a IgG. E emplos : Los siguientes ejemplos explicarán en la preselnte invención con más detalle, sin embargo, sin restringirla
Ejemplo 1: I Selección por ciclos de absorción-desorción d^ la I biblioteca fago CL humano en un péptido TLR-9 por ejemplo
Secuencia 216-240 de la proteina madura TLR9 (SEQ ID No 3) i en código de 1 letra de aminoácidos: 1 i
ANLT ALRVLDVGGN CRRCDHAPNP C ! i
216 220 230 240 ! i i 3 rondas de selección por ciclo de absorción-desorción habrán de realizarse de acuerdo con protocolos estándar. Brevemente, el siguiente método puede aplicarse. Placas de 96 pozos axisorp (Nunc) se revisten con el péptido (sintético) que representa parte de la secuencia de TLR-9. Para revestir los péptidos en los pozos, 200 µ? de la siguiente solución se agregan por pozo: amortiguador carbonato DNA 0.1M Na, pH 9.6, con las siguientes concentraciones de péptido disuelto: 1er ronda de selección por ciclos de absorción-desorción: 1 mg/ml de péptido TLR-9 2da ronda de selección por ciclos de absorcilón-desorción: 500 ug/ml de péptido TLR-9 3era ronda de selección por ciclos de absorción- desorción: 100 pg/ml de péptido TLR-9 La incubación es por 1 hora a 37 grados C, seguido por bloqueo con leche seca al 2% (M-PBS) con 200 µ? ¡por pozo por 1 hora a temperatura ambiente. La bibliotecal de
expresión en fago de superficie se deja entonces | que reaccione con el péptido ligado al agregar 100 µ?| de suspensión fago y 100 µ? de leche seca al 4% (M-PBS) , t seguido por incubación por 45 minutos con agitación y por ¡
90 minutos sin agitación a temperatura ambiente. Partículas fago sin ligar se lavan por arrastre como siejue. Después de la 1er ronda de selección por ciclos j de absorción-desorción: 10 x 300 µ? de T-PBS, 5x 300 µ?| de
PBS; después de la 2aa ronda de selección por de absorción-desorción: 15 x 300 µ? de T-PBS, lOx de
PBS; después de la 3er ronda de selección por de absorción-desorción: 20 x 300 µ? de T-PBS, 20 x de PBS. Elución de partículas de fago ligadas se al
agregar 200 µ? por pozo de glicina 0.1 M, pH 2.2 incubación con agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente, la suspensión fago se neutraliza al agregar 60 µ? de Base Tris 2 , seguido 'por infección en células TG1 de E. coli al mezclar 10 mi de cultivo de crecimiento exponencial con 0.5 mi de fago eluído e incubación por 30 minutos a 37 grados C. Finalmente, las bacterias infectadas se revisten en medio TYE con glucosa al 1% y 100 µg/ml de Ampicilina, e incuban a 30 grados C durante la noche. Ejemplo 2 : Clonación de ciónos selectos de mutantes I CL
humanos seleccionados contra TLR-9 para expresión soluble ADN fagémido del fago seleccionado a través de 3 i rondas de selección por ciclos de absorción-desorción se aisla con un midi-prep ADN que codifica regiones CL mutadas, se amplifica por lotes por PCR y clona Ncol-Notl en el vector pNOTBAD/ yc-His, que es el vector de expresión pBAD/Myc-His de E. coli (Invitrogen) con sitio de restricción Notl insertado para facilitar la clonación. Construcciones ligadas se transforman en células LMG19¿ de E. coli (Invitrogen) con electroporación, y desarrollan a 30 grados C en medio TYE con glucosa al 1% y ampicilma, durante la noche. Ciónos selectos se inoculan en 200 µ? de medio 2xYT con ampicilina, desarrollan durante la noche a
30 grados C, e inducen al agregar L-arabinosa una concentración de extremo de 0.1%. Después de expresión a 16 grados C durante la noche, las células se recolectan por centrifugación y tratan con amortiguador de borato de Na a 100 µ?, pH 8.0, a 4 grados C durante la noche para preparación de extractos periplásmicos . 50 µ? de extractos periplásmicos se emplearon en ELISA (ver a continuación) . Ejemplo 3 : ELISA de mutantes CL humanos seleccionados contra
TLR-9 Ciónos selectos se ensayan para enlace especifico al péptido TLR-9 por ELISA.
Revestimiento: Placa de microtitulación (NUNC, Maxisorp) , ¡
100 µ? por pozo, 20 pg de péptido TLR-9 /mi de amortiguador carbonato de Na 0.1 M, pH 9.6, lh a 37 grados C i
Lavado: 3x 200 ul de PBS I Bloqueo: BSA-PBS al 1%, lh a RT : Lavado: 3x 200 µ? de PBS j Enlace de extracto periplásmico : 50 µ? de extracto periplásmico : 50 µ? de BSA-PBS al 2%, a temperatura ambiente durante la noche i Lavado: 3x 200 µ? de PBS 1er anticuerpo: anti-His4 (Qiagen) , 1:1000 en BSA-PBS aljl%, 90 minutos a RT, 100 µ? por pozo Lavado: 3x 200 µ? de PBS 2do anticuerpo: HRP* cabra anti-ratón (SIG A) , i
1:1000 en BSA-PBS al 1%, 90 minutos a RT, 100 µ? por poz Lavado: 3x 200 µ? de PBS Detección: 3 mg/ml de OPD en amortiguador de citrato! de
Na/fosfato, pH 4.5, 0.4 µ? de H202 al 30% Parada: 100 mi de H2S04 3 Lectura de absorbancia: 492/620 nm Ciónos que dan una alta señal en este primer
ELISA preeliminar, se cultivan en un volumen de 20 ml| en las mismas condiciones que se describió anteriormente. |Sus extractos pre-plásmicos se aislan en 1/20 del volumenl de
cultivo como se describió anteriormente y prueban con ELISA (como se describió anteriormente) para confirmación. j Ejemplo 4: j Clonación de los dominios variables anti-CD32 a partir de HB-217. ARNm se aisla de la linea celular HB-217 (A^CC, anticuerpo IV.3 antiCD32) y se utiliza para preparar ADNc de acuerdo con protocolos de rutina establecidos. El ÁDNc además se utiliza como una plantilla para amplificar j las regiones de los genes que codifican par-a la cadena ligera y la cadena pesada del fragmento Fab del anticuerpo IV.3 respectivamente. Cebadores PCR corriente arriba que ceban el extremo 5' de las regiones variables, utilizados para esta amplificación, se derivan de las secuencias publicadas de las regiones variables de ratón (IMGT, the international ImMunoGeneTics information system® http://imgt.cines.fr). Cebadores degenerados y/o mezclas de diferentes cebadores se utilizan como cebadores corriente arriba. Cebadores corriente abajo se diseñan para cebar desde el extremo 3' de los dominios CL o CH1, respectivamente. En una siguiente etapa, el dominio CL ¡del anticuerpo IV.3 se retira y reemplaza por un dominiol CL selecto modificado por la tecnología SMID que tiene afinidad de enlace a TLR9, y que se elige como se describió anteriormente en los ejemplos 1-3. Para este reemplazo, PCR
subsecuentemente en vectores de expresión apropiados, o conjunto en un vector de expresión que permite la expresión de dos genes independientes. Como un sistema de expresión, células de bacterias, levadura, animales y cualquier otro sistema de expresión conveniente, pueden emplearse. Para este ejemplo aquí, la expresión de un vector en la levadura metilotrófica Pichia pastoris se ilustrará: La parte de cadena ligera del fragmento | PCR modificado es EcoRI / Kpnl clonado en el vector | de expresión de Pichia pastoris pPICZalphaA en el marco' de lectura correcto tal que lo fusione funcionalmente con la secuencia de señal de secreción de factor alfa que se proporciona por el vector. Similarmente, la parte de cadena pesada del fragmento Fab se clona en pPICZalphaA. Para preparar los insertos para este procedimiento de clonación, se utilizan cebadores PCR apropiadamente diseñados que agregan los sitios de restricción requeridos a los genes. En los extremos 3' de ambas regiones de codificación, tiene que insertarse un condón de parada y proporcionarse por igual por los cebadores PCR. El ca ete de expresión de cadena ligera después se corta del vector con enzimas de restricción BglII y BamHI y los extremos del ADN se hacen romos por tratamiento con fragmento Klenow de ADN polimerasa. El vector que contiene la parte de cadena pesada insertada del Fab se abre por digestión parcial |con
I
la enzima de restricción BglII, el ADN se hace romo por tratamiento con fragmento Klenow de ADN polimerasa, y el cásete de expresión que codifica la parte de cadena ligera se inserta. La digestión parcial del vector de cadena pesada es necesaria ya que el gen de cadena pesada insertado contiene un sitio BglII. Para cribar la construcción final, se debe tener cuidado de que este sitio BglII interno ha permanecido intacto. La construcción f;.nal tiene un sitio Pmel que se utiliza para linearizar la construcción antes de transformación en Pichia pastoris . Esta linearización es ventajosa para integración eficiente del vector de expresión en el genoma anfitrión por recombinación homologa. Pichia pastoris se transforma con el vector de expresión linearizado utilizando electroporación, se eligen clones transformados con el antibiótico Zeocin para el cual el vector confiere resistencia y los sobrenadantes de clones seleccionados al azar, se criban para expresión de la construcción Fab después de inducción de la expresión con metanol. Para cribar, por ejemplo un ELISA especifico de Fab puede emplearse. La producción de la proteína recombinante | se logra al cultivar el clon de Pichia seleccionado transformado en una escala más grande, de preferencia en matraces de agitación o en un termentador, induciendo la expresión al agregar metanol y purificando la proteína
I
recombinante por un método cromatográfico . Para s últimas etapas, se utilizan protocolos rutinarios.
Ejemplo 5: Clonación de los epitopos de célula T derivados de Der P1I/F1 y Der P2/F2: La combinación de los epitopos de célula T seleccionados formados por las secuencias B, A, E, H, G, C, F, D se ve como sigue (SEQ ID No 16) : CQIYPPNANKIREAL QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPP YDGRT11QRDNGYQPNYHAVNl| (Seq: B) (Seq. A) (Seq. E) VGY ENVWTVKVMGDDGVLACAIAT KYTWNVPKIAPKSENWVT IREALAQPQRYCRH (Seq. H) (Seq. G) (Seg. C) YWT PCIIHRGKPFQLEAVFEAN RTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATE (Seq. F) (Seg. D) A fin de construir un gen sintético que codifica para esta secuencia de aminoácidos, puede utilizarse traducción silico inversa. Programas de computadora están disponibles para este propósito tales como por ejemplo DNAWORKS (http://molbio.info.nih.gov/dnaworks/). A fin| de clonar el gen sintético que codifica para los epitoposi en cuadro, con el gen que codifica para la parte de cadena pesada de la estructura, se eligen dos sitios de restricción que ni cortan en esta región de codificación ni en el vector pPICZalphaA. Por ejemplo, AccIII y Spel puejden utilizarse para este propósito. Estos dos sitios de
restricción se conectan al gen que codifica para la parte de cadena pesada del Fab al utilizar cebadores PCR apropiadamente diseñados para el procedimiento de clonación como se describió anteriormente. Además, se debe tener cuidado en no tener un codón de parada al final de¡ la región de codificación de la parte de cadena pesada del Fab, ya que el codón de parada se proporcionará en| el extremo 3' del gen sintético que codifica para los epitopos. De nuevo, esta construcción con los dos sitios de restricción adicionales ubicados en su extremo 3' es
EcoRI / Kpnl clonado en el vector de expresión de Pichia pastoris pPICZalphaA. La construcción se abre entonces con las enzimas de restrucción AccIII y Spel y el inserto que codifica los epitopos, se inserta. Este inserto se geijiera como sigue: La secuencia de aminoácidos seleccionada. CQIYPPNANKIREAL QSCRRPNAQRFGISNYCQÍYPP
YDGRTIIQRDNGYQPNYHAVN IVGY ENVWTVKVMGDDGVLACAIAT
KYTWNVPKIAPKSENVWT IREALAQPQRYC RHYWT PCIIHRGKPFQLEAVFEAN RTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATE (SEQ ID No 16) junto con los sitios de restricción selectos, en este ejemplo AccIII en el extremo 5' y Spel en el extremo 3' ,| se utilizan como alimentación en el programa de computadora disponible al público DNAWORKS. Además, se agrega un codón de parada entre el fin de la secuencia de epitopo y| el
10 TCACAGTAACCACGACATTCTCGTAGCCGACGATGTTCAC 40 (SEQ ID No 26)
11 AGAATGTCGTGGTTACTGTGAAGGTAATGGGCGATGACGG 40 (SEQ ID No ,27)
12 AGCTATGGCGCAAGCTAGAACCCCGTCATCGCCCATTACC 40 (SEQ ID No ,28)
13 TCTAGCTTGCGCCATAGCTACCAAGTACACTTGGAACGTA 40 (SEQ ID No !29)
14 TTTTCGGCGCAATTTTGGGTACGTTCCAAGTGTACTTGGT 40 (SEQ ID No 30)
15 CCCAAAATTGCGCCGAAAAGTGAAAACGTCGTAGTGACCA 40 (SEQ ID No 31)
16 TGAGCCAATGCCTCCCTTATGGTCACTACGACGTTTTCAC 40 (SEQ ID No 32)
17 AGGGAGGCATTGGCTCAACCTCAAAGATACTGCAGACACT 40 (SEQ ID No ¡33)
18 TTATGCAGGGCGTCCAGTAGTGTCTGCAGTATCTTTGAGG 40 (SEQ ID No '34)
19 ACTGGACGCCCTGCATAATCCACCGTGGTAAACCCTTTCA 40 (SEQ ID No ¡35)
20 CTTCGAACACTGCCTCAAGTTGAAAGGGTTTACCACGGTG 40 (SEQ ID No ¡36)
21 ACTTGAGGCAGTGTTCGAAGCTAACAGGACGGTAACGCCA 40 (SEQ ID No ¡37)
22 CCGCACCCACCTTGCATACGAATTGGCGTTACCGTCCTGT 40 (SEQ ID No |38)
23 TGCAAGGTGGGTGCGGGTCTTGTTGGGCTTTTTCTGGTGT 40 (SEQ ID No '39)
24 ACTAGTTTATTCAGTAGCAGCCACACCAGAAAAAGCCCAACA 42 (SEQ ID No 40)
Estos 24 oligonucleótidos se disuelven, mezclan en conjunto, hierven por varios minutos y después' se enfrian a temperatura ambiente lentamente, para permitir alineación. En etapas PCR subsecuentes que utilizan grandes cantidades de los dos cebadores limítrofes (cebadores ü-1 y #24) se amplifica el gen hibridizado, el producto ¦ PCR después se escinde con las enzimas de restricción selectas (AccIII y Spel en este ejemplo) , y clonan en el vector' de expresión como se describió anteriormente, que contiene como un inserto al gen que codifica la parte de cadena
pesada del Fab modificado. La preparación del vector de expresión final que contiene ambas cadenas, transformación Pichia pastoris, selección de ciónos y criba para producir ciónos, se realiza como se describió anteriormente. Expresión y purificación de la proteina recombinante se realizan por los siguientes protocolos standard. Ejemplo 6 Fusión de VH y VL del anticuerpo IV.3 anti-CD32 fusión ; con dominios CH3 anti-TLR9 (SMIDS) Todo el modelado molecular se realiza con Swiss- i
PdbViewer 3.7 (http://swissmodel.expasy.org/spdbv/) ¡ Como un modelo de homología para un fragmento de Fab de ratón, el archivo de estructura 2BRR.pdb del banco de datos de proteínas Protein Data Bank (www.pdb. org)| se emplea, y lOQO.pdb se utiliza como una fuente paral la estructura de un dominio CH3 IgG humano. Modelos moleculares de VH y VL del anticuerpo
IV.3 se realizan con el "primer modo de enfoque" del
Swissmodel http: //swissmodel . expasy.org/SWISS-MODEL.htfml) utilizando las secuencias de aminoácidos de VH y | VL respectivamente . Utilizando la función "ajuste mágico" (magic flit) de Swiss-PdbViewer , dos copias de la estructura de dominio CH3 de lOQO.pdb se ajustan en el dominio CH1 y el | CL respectivamente de 2BRR . pdb . Subsecuentemente, los modelos
moleculares de IV.3 VH y VL respectivamente se ajustan¡ (de nuevo utilizando el "ajuste mágico") en VH y VLj de 2BRR . pd . Para construcción de una proteina tipo Fab en donde CH1 y CL ambos se reemplazan por un dominio CH3, es necesario decidir en que punto habrá de terminarse la secuencia de VH y conectarse a la secuencia de CH3, y en que punto la secuencia de VL deberá terminarse y conectarse a la secuencia de CH3. Para ambas construcciones, se elige un punto en el cual la cadena principal de las estructuras y modelos superpuestos (ver anteriormente) muestra una superposición óptima. Para la cadena ligera, se encontró que | la secuencia hasta Alall4 (numeración de 2BRR.pdb) | se utilizará y conectará a Pro343 (numeración de lOQO.pdb) |del dominio CH3. El punto de conexión entre estas ¡dos secuencias, por lo tanto se lee como sigue (parte VL] no esta definida) : - - -Lysll2 - Argll3-Alall4-Pro343-Arq344-Glu345 - A fin de permitir la unión de las dos secuencias de codificación utilizando sitios de enzima de restricción y ligación de ADN, la secuencia cercana al punto | de conexión se cambia por mutación silenciosa para introdu'cir un sitio Xhol único (ctcgag, subrayado) como sigue K R A P R E (SEQ ID No 41)
AAACGGGCTCCTCGAGAA (SEQ ID No 42) Para posterior inserción de los epitoposl de alérgeno, un sitio AscI (ggcgcgcc) se introduce justo antes del codón de parada de la construcción más una base extra para mantenimiento del cuadro de lectura: ggg cgc gcc Gly Arg Ala Además, para clonar en el vector de expre$ión pPICZalphaA (sistema de expresión de Pichia pastoris, Invitrogen) , un sitio EcoRI (gaattc) se agrega al ext::emo 5' (extremo N) y un sitio Kpnl (ggtacc) al extremo 3 (extremo C) de la construcción. El dominio CH3 a fusionarse a VH y VL respectivamente seleccionado como parte de la construcc ón, puede ser un dominio IgG CH3 humano de tipo silvestre que puede servir como un control negativo o un dominio CH2 de diseño previo por tecnología SMID y seleccionado para l:.gar específicamente a TLR9. En este ejemplo aquí, la secuencia de clon A23, que liga específicamente a TLR9 y que se describió en la solicitud de patente PCT/EP2006/050059, se fusiona a ambos VH y VL. Por lo tanto, la secuencia completa de la proteína de fusión VL-CH3 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (parte VL no está subrayada), (SEQ ID No 43) DIVMTQAAPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL HTNGNTYLH FLQRPGQSPQ
LLIYRMSVLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLSI SRVEAEDVGV FYCMQH ,???
LTFGAGTKLE LKRAPREPQV YTLPPSRDEL GIAQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVLGRRWT LGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK& Secuencia de ácidos nucleicos de la proteína de fusión VL-CH3 (sitios de restricción están subrayados), (SEQ ID No 44) : gaattcGACA TTGTGATGAC CCAGGCTGCA CCCTCTGTAC CTGTCACTCC TGGAGAGTCA GTATCCATCT CCTGCAGGTC TAGTAAGAGT CTCCTGCATA CTAATGGCAA CACTTACTTG CATTGGTTCC TACAGAGGCC AGGCCAGTCT CCTCAGCTCC TGATATATCG GATGTCCGTC CTTGCCTCAG GAGTCCCAGA CAGGTTCAGT GGCAGTGGGT CAGGAACTGC TTTCACACTG AGCATCAGTA GAGTGGAGGC TGAGGATGTG GGTGTTTTTT ACTGTATGCA ACATCTAGAA TATCCGCTCA CGTTCGGTGC TGGGACCAAG CTGGAACTGA AACGGGCTCC TCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAC GAGCTCGGCA TCGCGCAAGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAACGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC TTTCTTCCTC TACAGCAAGC TTACCGTGTT GGGCCGCAGG TGGACCCTGG GGAACGTCTT CTCATGQTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTQCCT GTCTCCGGGT AAATGAgggc gcgccggtac c ¦ Para la cadena pesada, se encontró que | la secuencia hasta Thrl23 (numeración de 2BRR . pdb ) deberá utilizarse y conectarse a Arg344 (numeración de lOQO.pdb) del dominio CH3. El punto de conexión entre estas Idos
secuencias por lo tanto se lee como sigue (parte VH esta subrayada) : - - - Ala121 - Lysl22 - Thrl23 - Arg344 - Glu345 - Pro346 -
A fin de permitir la unión de las dos secuencias de codificación utilizando sitios de enzima de restricción y ligación de ADN, la secuencia cercana al punto de conexión se cambió por una mutación silenciosa para introducir un sitio Xhol único (ctcgag, subrayado) (pomo sigue: A K T R E P (SEQ ID No 45) GCCAAAACTCGAGAACCA (SEQ ID No 46) Además, para clonación en el vector de expresión pPICZalphaA (sistema de expresión de Pichia pastoris , Invitrogen) , un sitio EcoRI (gaattc) se agrega al extremo 5' (extremo N) y un sitio Xbal (tctaga) al extremo 3'
(extremo C) de la construcción. No se agrega codón de parada a esta secuencia y el sitio Xbal se coloca en el marco de lectura correcto para fusionar la construcción al Hexa-His-tag proporcionado por el vector para posterior purificación de la proteína utilizando cromatografía de afinidad de metal inmovilizado. Por lo tanto, la secuencia completa de la proteína de fusión VH-CH3 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (parte VH esta subrayada), (SEQ ID No 47)·.
EVQLQQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW LNTYTGESIY PDDFKGRFAF SSETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARGD YGYDDPLDYW GQGTSVTVSS AKTREPQVYT LPPSRDELGI AQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVLGRRWTLG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKSLE QKLISEEDLN SAVDHHHHHH& Secuencia de ácidos nucleicos de proteinal de fusión VH-CH3 (sitios de restricción están subrayadcps) , (SEQ ID No 48) : GAATTCGAGG TTCAGCTTCA GCAGTCTGGA CCTGAGCTGA AGAAGCCTGG AGAGACAGTC AAGATCTCCT GCAAGGCTTC TGGGTATACC TTCACAAACT ATGGAATGAA CTGGGTGAAG CAGGCTCCAG GAAAGGGTTT AAAGTGGATG GGCTGGTTAA ACACCTACAC TGGAGAGTCA ATATATCCTG ATGACTTCAA GGGACGGTTT GCCTTCTCTT CGGAAACCTC TGCCAGCACT GCCTATTTGC AGATCAACAA CCTCAAAAAT GAGGACATGG CTACATATTT CTGTGCAAGA GGGGACTATG GTTACGACGA CCCTTTGGAC TACTGGGGTC AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACTCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGACGAGCTC GGCATCGCGC AAGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG AGAGCAACGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCTTTCTT CCTCTACAGC AAGCTTACCG TGTTGGGCCG CAGGTGGACC CTGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATCT CTAGAACAAA AACTCATCTC AGAAGAGGAT CTGAATAGCG CCGTCGACCA TCATCATCAT CATCATTGA Plan de clonación detallado
Cadena pesada; j La región VH del anticuerpo IV.3 se amplifica! PCR con cebadores 4.3HupEco y 4.3HdownXho, y subsecuentemente se digiere con EcoRI y Xhol. El clon de diseño CH3 SMiID- ! A23 se amplifica PCR con los cebadores CH3upXhoA y CH3XBA2 y subsecuentemente digiere con Xhol y Xbal. La secuencia VH y la secuencia CH3 se ligan en conjunto mediante el sitio Xhol y después ligan en pPICZalphaA (Invitrogen) , que se digirió previamente con EcoRI y Xbal. El vector result†nte se denomina pPICHA23. I i LISTA DE CEBADORES: !
4.3HUPECO cagagaattc gaggttcagc ttcagcagtc (SEQ ID No .49] 4.3HDOWNXHO gatgctcgag ttttggctga ggagacggtg (SEQ IjD No 50) CH3UPXHOA aaaactcgag aaccacaggt gtacaccctg ce (SEQ ID No! 51) CH3XBA2 actgatctag acctttaccc ggagacaggg agag (SEQ :ID 1
No 52) : I Cadena Ligera: J La región VL de anticuerpo IV.3 se amplifica ¡PCR con los cebadores 4.3 LupEco y 4.3LdownXho, ; y subsecuentemente se digiere con EcoRI y Xhol. El clon A23 Í de ingeniería CH3 SMID se amplifica PCR con los cebadqres CH3upXhoB y CH3StopKpn, y subsecuentemente digiere con |Soy y Kpnl . La secuencia VL y la secuencia CH3 se ligan] en
conjunto mediante el sitio Xhol y después ligan ; en pPICZalphaA ( Invitrogen) , que previamente se digirió en, con EcoRI y Kpnl . El vector resultante se denomina pPICLA23 LISTA DE CEBADORES: ! .3LUPEC0 gatagaattc gacattgtga tgacccaggc tg (SEQ ID No 53) 4.3LD0WNXH0 attactcgag gagcccgttt cagttccagc t (SEQ ID No 54) i CH3UPXH0B gctcctcgag aaccacaggt gtacaccctg ce (SEQ ID No; 55) CH3STOPKPN acgtggtacc tcaggcgcgc cctttacccg gagacaggga gag
(SEQ ID No 56) i i
COMBINACIÓN DE LOS DOS CASSETTES DE EXPRESIÓN EN UN VECTOR El cassette de cadena ligera se corta con BglII (pos.l) y BamHI (pos. 2319) a partir de pPICLA23 (4235 bp) , y el fragmento de 2319 bp se purifica mediante electroforésis en gel preparativa. El fragmento de 1916 bp se descarta. El vector pPICHA23 (4219 bp) de digiere :con BamHI, y el fragmento de 2319 bp previamente purificado de pPICLA23 se inserta. El vector de expresión de Piqhia pastoris resultante, que transporta dos cassettes de expresión, uno para la proteina de fusión VL-CH3 y uno para la proteína de fusión VH-CH3 se criban de manera tal jque ambos insertos tienen la misma dirección de transcripcijó . El vector resultante pPICHLA23 (6537 bp) después se
lineariza antes de transformación en Pichia pastoris, por I ejemplo con BamHI o con BssSI, transforma en Pichia pastoris por electroporación, y se eligen transformantes positivos con Zeocin. Varios clones se criban para expresión de la proteina recombinante. Un clon después se elije para producción a gran escala, y la proteina^ de fusión recombinante se purifica por cromatografía de afinidad—metal-inmovilizado utilizando procedimientos j estándar. Toda manipulación, cultivo y expresión de Picljiia, se realiza al seguir protocolos estándar (Invitrogen) . I Inserción de epítopos de alérgeno en el vector pPICHLA23 y expresión de la proteína de fusión recombinante ' La secuencia que codifica los epítopos i de alérgeno como se describe en ejemplo 5, se inserta erí el vector pPICHLA23 como sigue: El vector se digiere con AscI (4174-4182) lo que lleva a su linearización . En este sitio AscI, la secuencia I de ADN que codifica los epítopos de alérgeno, se inserta.
La secuencia que codifica los epítopos de alérgeno I se amplifica con los cebadores EpiTLRl y EpiTLR2 a fin' de conectar sitios AscI con ambos extremos de la secuencia.' LISTA DE CEBADORES :
EpiTLRl TAAAGGGCGC GCCTCCGGAT GCCAAATTTA CC (SEQ ID No 57) EpiTLR2 TACCTCAGGC GCGCCTTATT CAGTAGCAGC CACAC
(SEQ ID No 58) | i El producto PCR resultante se digiere con AscI y i liga en el vector previamente digerido. El vector resultante se denomina pHLA23EP (7046 bp) . Transformación, i expresión y purificación de Pichia de la proteina de fuáión recombinante se realiza como se describió anteriormente I para la construcción que no tiene epitopos insertados. ' VL de anticuerpo IV .3 : ¡ Secuencia de aminoácidos: DIVMTQAAPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL HTNGNTYLHW FLQRPGQSPQ LLIYRMSVLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLSI SRVEAEDVGV FYCMQHLEYP LTFGAGTKLE LKRA (SEQ ID No 59) Secuencia de ácidos nucleicos: GACATTGTGA TGACCCAGGC TGCACCCTCT GTACCTGTCA CTCCTGGAGA ¡
GTCAGTATCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTAA GAGTCTCCTG CATACTAATG
GCAACACTTA CTTGCATTGG TTCCTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCTCAG
CTCCTGATAT ATCGGATGTC CGTCCTTGCC TCAGGAGTCC CAGACAGGTT
CAGTGGCAGT GGGTCAGGAA CTGCTTTCAC ACTGAGCATC AGTAGAGTGG
AGGCTGAGGA TGTGGGTGTT TTTTACTGTA TGCAACATCT AGAATATCCG
CTCACGTTCG GTGCTGGGAC CAAGCTGGAA CTGAAACGGG CT (SEQ ID No
60) ! VH de anticuerpo IV.3: Secuencia de aminoácidos: EVQLQQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW LNTYTGESIY PDDFKGRFAF SSETSASTAY LQINNLKNED MATYFCÁRGD
YGYDDPLDYW GQGTSVTVSS AKT (SEQ ID No 61) Secuencia de ácidos nucleicos: GAGGTTCAGC TTCAGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA TACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG TTAAACACCT ACACTGGAGA GTCAATATAT CCTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTCGGAAA CCTCTGCCAG CACTGCCTAT TTGCAGATCA ACAACCTCAA AAATGAGGAC ATGGCTACAT ATTTCTGTGC AAGAGGGGAC ! TATGGTTACG ACGACCCTTT GGACTACTGG GGTCAAGGAA CCTCAGTCAC 1 CGTCTCCTCA GCCAAAACA (SEQ ID No 62) i
El vector de expresión final pPICHCLA23. seq. (SEQ ID No'63) i que contiene regiones de enlace TLR9 y CD32 i
6537 bp , i
1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag! i 61 ; gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 121 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 181 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta .
241 j acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta ' 301 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg ¡ 361
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 421 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 961 tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1021 agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1081 tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa
1141 tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc ' 1201 ! tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga 1261 : gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg ' 1321 í ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttaaaca cctacactgg j
1381 : agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg acggtttgcc ttctcttcgg aaacctctgc 1441 cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catatttctg ¡
1501 ; tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt I 1561 í i i caccgtctcc tcagccaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga |
1621 tgagctgggc atcgcgcaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga I
1681 '¦ catcgccgtg gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1 1741 cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag 1801 gtggaccctg gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1861
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatctcta gaacaaaaac tcatctcaga 1921 agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt gtagccttag 1981 acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct 2041 aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt 2101 ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga 2161 gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa 2221 aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat 2281 taagtgagac cttcgtttgt gcagatccaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct 2341 ttttgccatc cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg 2401 ggatacacta gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac 2461 ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc 2521 aattccttct attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc 2581 tggcgaggtt catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat
2641 cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc 2701 caaaactgac agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc 2761 aagatgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc 2821 caaaagtcgg cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc 2881 tcattaatgc ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa 2941 cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt 3001 ccaagattct ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt 3061 ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt 3121 tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt 3181 tgattttaac gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa 3241 cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg 3301 ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg 3361
gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa 3421 ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg 3481 tatctctcga gaaaagagag gctgaagctg aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac 3541 cctctgtacc tgtcactcct ggagagtcag tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc 3601 tcctgcatac taatggcaac acttacttgc attggttcct acagaggcca ggccagtctc 3661 ctcagctcct gatatatcgg atgtccgtcc ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg
gcagtgggtc aggaactgct ttcacactga gcatcagtag agtggaggct gaggatgtgg} 3781 i gtgtttttta ctgtatgcaa catctagaat atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc 3841 tggaactgaa acgggctcct cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg , j
3901 j agctgggcat cgcgcaagtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca ¡
tcgccgtgga gtgggagagc aacgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg ' 4021 | tgctggactc cgacggctct ttcttcctct acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt ¦ 4081 ggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 4141 ! I i I
cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aagggcgcgc ctgaggtacc tcgagccgcg 4201 gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc 4261 gaccatcatc atcatcatca ttgagtttgt agccttagac atgactgttc ctcagttcaa 4321 gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc 4381 catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt ttatttgtaa cctatatagt 4441 ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc ttgctcctga tcagcctatc 4501 tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa tcattcgagt ttgatgtttt 4561 tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta agtgagacct tcgtttgtgc 4621 ggatccccca cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt 4681 tctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt 4741 tccctctttc ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa 4801 aagagaccgc ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt 4861 tctttttctt gaaatttttt tttttagttt ttttctcttt cagtgacctc cattgatatt
4921 taagttaata aacggtcttc aatttctcaa gtttcagttt catttttctt gttctattac 4981 aacttttttt acttcttgtt cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aaggggcggt 5041 gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac 5101 taaaccatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga 5161 gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc 5221 gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg 5281 ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg 5341 tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc 5401 gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc 5461 gtggccgagg agcaggactg acacgtccga cggcggccca cgggtcccag gcctcggaga 5521 tccgtccccc ttttcctttg tcgatatcat gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg 5581 ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt 5641
ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt 5701 tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga 5761 gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcaagctg gagaccaaca tgtgagcaaa 5821 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 5881 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 5941 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 6001 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 6061 tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 6121
6421 ' caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac j
6481 : i ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagatc ! // ¡
Vector de expresión final pHIA23EP.seq (SEQ ID No 64) 1 que contiene las regiones de enlace TLR9 y CD32 y secuencia
I
481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 961 tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1021
tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga 1261 gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg 1321 ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttaaaca cctacactgg 1381 agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg acggtttgcc ttctcttcgg aaacctctgc 1441 cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catatttctg 1501 tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt 1561 caccgtctcc tcagccaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga 1621 tgagctgggc atcgcgcaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga 1681 catcgccgtg gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1741 cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag 1801 gtggaccctg gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta
ga cggca a ccaac ac gccaga c acccccca a cga gggcg acaa ca ac 4321 agcgtgataa cggctatcag cctaactacc acgccgtgaa catcgtcggc tacgagaatg
cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt 5041 ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt cccactcctc ttcagagtac 5101
tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg ccggtgtggt ccgggacgac gtgaccctgt 5761 tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc cggacaacac cctggcctgg gtgtgggtgc 5821 gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt cggaggtcgt gtccacgaac ttccgggacg 5881 cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg agcagccgtg ggggcgggag ttcgccctgc
Der Pl = alérgeno mayor 1 de Dermatofagoides pteronissyus 1 Der P2 = alérgeno mayor 2 de Dermatofagoides pteronissyus 2 Der Fl = alérgeno mayor de Dermato agoides farine 1 | !
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Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Una molécula o complejo de moléculas capaz de ligar a TLR9 y a CD32 que comprende cuando menos un epítopo de al menos un antigeno. 2. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el epitopo es un epitopo de célula T. 3. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el epitopo se deriva de un alérgeno. 4. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque al menos un epitopo se enlaza en forma no covalente con la molécula. 5. Una molécula o complejo de moléculas | de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 4, caracterizada porque al menos un epitopo se enlaza en forma no covalente con la región de enlace TLR9 y/o CD32 6. Una molécula o complejo de moléculas! de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque al menos un epitopo se enlaza a la región de enlace 1jLR9 y/o CD32 mediante interacción de anticuerpos |y/o interacción de ligandos. 7. Una molécula o complejo de moléculas | de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a| 6, conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a|12, caracterizada porque es de estructura murina o parcialmente murina . 14. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a |13, caracterizada porque es de estructura de camello o parcial de camello 15. Una molécula o complejo de moléculas | de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque comprende cuando menos un andamio de enlace de ingeniería. 16. Una molécula o complejo de moléculasl de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada poique el andamio de enlace se elige del grupo que consistel de fibronectina III, lipocalinas, Proteina A, inhibidor de ¡ a-amilasa, Proteínas de Repetición de Anquirina, un dominio C2, un dominio A, un dominio tipo- EGFR, un dab, un chi-bAb, CTLA-4, gamma cristalina y cualquier otra proteína 17. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque cuando menos una parte de un dominio de inmunoglobulina mutada pequeña (SMID = Small Muta.ted Immunoglobulin Domain) . 18. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, i caracterizada porque comprende al menos una parte de| un anticuerpo anti-CD32 o su derivado o fragmento. 19. Una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque comprende una secuencia aminoácidos de SEQ ID No 59 o una parte de la misma. 20. Una molécula o complejo de moléculas j de i conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque comprende una secuencia aminoácidos, de SEQ ID No 61 o una parte de la misma. 21. Composición farmacéutica que comprende cuándo menos una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, opcionalmente junto con al menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. 22. Uso de una preparación farmacéutica | de conformidad con la reivindicación 21, para inmunoterapia activa . 23. Método para tratamiento de alergias en donde una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de al menos una molécula o complejo de moléculas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, se administra a un sujeto que requiere dicho tratamiento, opcionalmente junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable. 24. Uso de al menos una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de I las reivindicaciones 1 a 20, para la fabricación de | un medicamento para el tratamiento de alergias, 25. Proceso para producir una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que utiliza técnica recombinante en donde los genes que codifican para las estructuras] de enlace para TLT9, CD32 y el epitopo se construyen enj un vector y expresan en una célula anfitriona. 26. Vector de ácido nucleico para expresar una molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende! la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID No 60. 27. Vector de ácido nucleico para expresar una molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID No 62. 28. Vector de ácido nucleico para expresar una molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID No 63. 29. Vector de ácido nucleico para expresar una molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID No 64. 30. Proceso para producir una molécula o complejo de moléculas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, utilizando entrelazamiento químico. ¡
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