BRPI0708549A2 - molécula biespecìfica ligando tlr9 e cd32 e compreendendo um epitopo de célula t para o tratamento de alergias - Google Patents

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Abstract

MOLéCULA BIESPECIFICA LIGANDO TLR9 E CD32 E COMPREENDENDO UM EPITOPO DE CéLULA T PARA O TRATAMENTO DE ALERGIAS. A presente invenção refere-se a molécula ou complexo de moléculas capaz de ligar a TLR9 e a CD32 compreendendo no mínimo um epitopo de no mínimo um antígeno, sua produção e seu uso como medicamento, especialmente para o tratamento de alergias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULABIESPECÍFICA LIGANDO TLR9 E CD32 E COMPREENDENDO UM EPI-TOPO DE CÉLULA T PARA O TRATAMENTO DE ALERGIAS".
A presente invenção refere-se a moléculas com especificidadede ligação tanto a Receptor 9 tipo Toll (TLR9) quanto a CD32 contendo umou mais epitopos antigênicos de células Τ. A presente invenção refere-se,adicionalmente, à produção destas moléculas e seu uso para a preparaçãode medicamentos para o tratamento de alergias.
Introdução:
Alergia é considerada uma reação de hipersensibilidade a prote-ínas no ambiente (ar/água/alimento). Alérgenos são antígenos aos quaispacientes atópicos respondem com reações de anticorpos IgE levando sub-seqüentemente a reações alérgicas. Antígenos nos complexos ou proteínasde fusão podem ser alérgenos ambientais (por exemplo, ácaro de poeiradoméstica, pólen de bétula, pólen de grama, antígenos de gato, antígenosde barata), ou alérgenos alimentares (por exemplo, leite de vaca, amendo-im, camarão, soja), ou uma combinação de ambos. As moléculas de IgE sãoimportantes devido a sua função na ativação de células efetoras (mastóci-tos, basófilos e eosinófilos). Mais recentemente, se reconheceu que a IgEtambém tem um papel importante na fase de indução de doenças alérgicas,regulando para cima o potencial de captura antigênica de células B e célulasdendríticás (DC), tanto através de receptores de baixa afinidade (CD23)quanto de alta afinidade (FceRI) [1]. As funções negativas de anticorpos IgEpodem ser neutralizadas por anticorpos IgG alérgeno específicos, por e-xemplo, porque eles dirigem a reação imune para longe das células B paramonócitos e DC [2]. Além disso, competem com moléculas de IgE por sítiosde ligação de alérgenos. Portanto as alergias podem ser tratadas, curadas eprevenidas pela indução de moléculas de IgG alérgeno específicas.
As moléculas de IgG têm uma meia-vida sérica de aproximada-mente 3 semanas comparadas com cerca de 3 dias para as moléculas deIgE. As moléculas de IgE são induzidas pela interação entre células B(naíve) e células Th2 as quais proporcionam a IL-4 e IL-13 junto com ex-pressão de CD40L necessária para induzir uma troca de classe para IgE emcélulas B da memória e células plasmáticas [3]. Em contraste, células Th1,as quais produzem IFN-ye IL-2, induzem uma troca de classe para IgG. Por-tanto, a indução de Th1, ao invés de reações de células T auxiliares Th2contra alérgenos, é benéfica para a prevenção, o tratamento e a cura dedoenças alérgicas.
Até o momento são usadas várias formas de vacinação ativausando alérgenos. A mais comum é a denominada "Imunoterapia", a qualdepende de imunizações freqüentes com concentrações relativamente ele-vadas de alérgenos. Esta técnica é somente moderadamente eficaz em umaminoria de doenças alérgicas tais como alergia a veneno de abelha e emalguns casos de rinite e conjuntivite, e recentemente alguns relatórios mos-traram eficácia em asma e dermatite atópica. Mais recentemente foi propos-to ataque imunoterápico, onde quantidades crescentes de alérgeno são inje-tadas em um estrutura de tempo bastante curto, com resultados ligeiramen-te melhores [4; 5]. Geralmente a via subcutânea é usada para administraçãodos alérgenos, mas recentemente esta via tem sido comparada com aplica-ção oral ou mesmo aplicação local, os resultados são geralmente positivosmas nem sempre consistentes. Uma técnica diferente para imunoterapia é atécnica descrita por Saint-Remy (Patentes Européias Nos. EP 0 178 085 e 0287 361), a qual faz uso de anticorpos IgG autólogos os quais formam com-plexos in vitro com os alérgenos relevantes. Esta técnica permite que quan-tidades muito menores de alérgeno sejam aplicadas com menos efeitos co-laterais.
O mecanismo por trás destas terapias é incerto. Na terapia clás-sica parece haver um efeito benéfico se a terapia induz um aumento nosanticorpos IgG específicos, embora nem todo aumento significativo de IgGespecífica seja correlacionado com imunoterapia bem-sucedida. Um possí-vel argumento o qual este é o caso é a afinidade relativamente baixa de IgGanticorpos para CD32 sobre células B, monócitos e mastócitos. A aborda-gem de Saint-Remy seleciona os anticorpos IgG específicos do paciente, osquais são subseqüentemente misturados com alérgenos relevantes in vitro.Deste modo, assegura-se que o alérgeno não pode reagir livremente comcélulas ou outros isotipos de anticorpo sobre células tais como IgE sobremastócitos. Além disso, reivindica-se que anticorpos antiidiotípicos sejamcultivados contra as moléculas de IgG específicas, as quais, no futuro, evita-rão alergia.
Na publicação WO 97/07218, são descritas proteínas de fusãoalérgeno-anti-CD32. Nesta publicação, os problemas com isolamento demoléculas IgG específicos e a baixa afinidade destes anticorpos IgG paraCD32 são evitados e os fatores de risco da imunoterapia clássica, a qualusa alérgenos de "ligação de IgE" completa, são reduzidos. No entanto, aindução reivindicada respostas de memória Th1 devidas a somente dirigir avacina contendo anti-CD32 para células dendríticas não pode ser compro-vada.
Mesmo em vista do estudo intensivo para abordagens terapêutí-cas para tratar doenças alérgicas, ainda há uma grande demanda para pro-porcionar medicamentos para tratamento de alergias bem-sucedidos.
O objetivo da invenção é portanto, proporcionar novas molécu-las com propriedades aprimoradas para o tratamento de doenças alérgicas.
De acordo com a invenção este objetivo é realizado pelo temadas reivindicações.
Breve descrição da invenção:Antecedentes:
CD32 é fortemente expressado sobre monócitos/células dendrí-ticas e células B e portanto a molécula da presente invenção é criada paradirigir a reação imune para estas importantes células imunológicas, com aintenção de prevenir a apresentação de alérgeno pelas células B, ao mesmotempo que promovendo apresentação de alérgeno por especialmente célu-las dendríticas (DCs), as últimas levam a indução de reações de Th1 contraos alérgenos na molécula ou complexo de moléculas que podem ser formu-lados como vacina. Conhecimento mais recente mostra que existem doistipos de células dendríticas (DC) : células dendríticas mielóides (mDC) eplasmacitóides (pDC) [6], o que leva ao novo conceito de células DC1 e DC2[7]. Neste conceito células DC1 promovem a indução do desenvolvimentode células Th1 depois de estimulação de antígeno específica e células DC2suportarem o desenvolvimento de células Th2. DC derivadas de monócitos(ou mDC) são geralmente consideradas como sendo do tipo DC1, ao passoque pDC são consideradas como sendo do tipo DC2 [6]. Ambos os tipo deDC expressam CD32a e induzirão uma reação de células T alérgeno especí-ficas; no entanto, não está garantido que o resultado será do tipo Th1. Defato, em doadores alérgicos são mais prováveis reações de Th2 [8]. De mo-do importante, o pDC expressa o TLR9 receptor, o qual liga CpG-ODNs (oli-godesoxinucleotídeos [ODNs] contendo motivos CpG não-metilados). A ati-vação deste receptor no pDC leva a uma produção muito forte de IFN-α eIL-12 [9], a qual promove indução de Th1 e portanto transforma as DC2 po-tenciais em células DC1.
Portanto, a molécula da invenção pode combinar a ativação doTLR9 receptor em pDC com a estimulação específica e indução de célulasTh1 alérgeno específicas e compreende portanto um aprimoramento signifi-cativo de conceitos anteriores.
A invenção compreende uma molécula ou um complexo de mo-léculas tendo especificidade de ligação para receptor 9 tipo Toll e CD32, emque a molécula ou complexo de moléculas inclui no mínimo um epitopo, pre-ferencialmente no mínimo um epitopo de células T, de no mínimo um antí-geno.
A molécula ou complexo de moléculas da invenção tambémdesviará a função efetora de mastócitos, os quais carregam IgE, para o a-lérgeno nativo do qual foram selecionados epitopos de células T para serparte da proteína de fusão.
Preferencialmente a molécula ou complexo de moléculas de a-cordo com a invenção pode ter uma ou mais das seguintes característicasúnicas:
Ativação e indução de células Th1 alérgeno específicas, semativação de células B alérgeno específicas.
Ativação e indução de células Th1 alérgeno específicas, semativação de mastócitos ou qualquer outra célula efetora, a qual, por meio deIgE ou IgG alérgeno específica, pode ser tornar ativada pelos alérgenos na-turais dos quais os epitopos de células T selecionados são representadosna molécula ou complexo de moléculas da invenção.
A parte de ligação de CD32 da molécula ou complexo de molé-culas da invenção seleciona as células relevantes, as quais devem internali-zar a molécula completa ou complexo de moléculas.
Depois de internalização da proteína de fusão de acordo com apresente invenção por células apresentando antígeno a molécula da inven-ção é degradada e vários peptídeos, incluindo o um ou mais epitopos decélulas T incorporados são apresentados sobre moléculas MHC classe Ildas células apresentando antígeno, portanto estimulando células T alérgenoespecíficas.
A uma ou mais estruturas de ligação de TLR9 incorporadas namolécula ou complexo de moléculas da invenção são necessárias para aindução de um pool de memória Th 1 alérgeno específico, por ligação aoTLR9 receptor citoplasmático [10;11]. A ativação do TLR9 receptor leva auma forte indução de IFN-α e produção de IL12 [9].
De acordo com a presente invenção, uma molécula é uma enti-dade única composta de átomos e/ou outras moléculas por ligações cova-lentes. A molécula pode ser composta de uma única classe de substânciasou uma combinação dos mesmos. Classes de substâncias são, por exem-plo, polipeptídeos, carboidratos, lipídeos, ácidos nucléicos e etc.
Um complexo de moléculas é um agregado de moléculas intera-gindo especificamente e fortemente umas com as outras. Um complexo devárias moléculas pode ser formado por interações hidrofóbicas (tais como,por exemplo, a ligação de regiões variáveis de anticorpo em um Fv) ou porligação forte de uma molécula a outra através de interações ligante/receptortais como ligação anticorpo-antígeno ou avidina-biotina ou por formação decomplexo através de grupamentos químicos quelantes e similares.
Um Antígeno pode ser uma estrutura a qual pode ser reconheci-da por um anticorpo, um receptor de células B ou um receptor de células Tquando apresentado por moléculas MHC classe I ou II.
Um epitopo é a menor estrutura a ser ligada especificamentedentro por um anticorpo, um receptor de células B ou um receptor de célulasT quando apresentado por moléculas MHC classe I ou II. Especificidade édefinida como ligação preferido a uma determinada estrutura molecular (eminterações anticorpo/antígeno também denominada epitopo) dentro de umdeterminado contexto.
Um domínio é uma região distinta encontrada em uma proteínaou polipeptídeo. Um domínio de monômero forma uma estrutura tridimensi-onal nativa em solução na ausência de seqüências de aminoácidos nativasflanqueantes. Domínios da invenção especificamente ligarão a CD32 e/ouTLR9 e/ou mostram ou apresentam epitopos. Domínios podem ser usadoscomo domínios únicos ou domínios de monômeros ou combinados paraformar dímeros e domínios multiméricos. Por exemplo, um polipeptídeo queforma uma estrutura tridimensional que liga a uma molécula-alvo é um do-mínio de monômero.
De acordo com a presente invenção o termo anticorpo inclui an-ticorpos ou derivados de anticorpos ou fragmentos dos mesmos bem comomoléculas relacionadas da superfamília de imunoglobulina (tais como recep-tores de células T solúveis). Entre os fragmentos de anticorpo estão equiva-lentes funcionais ou homólogos de anticorpos incluindo qualquer polipeptí-deo compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina ou um pe-queno domínio de imunoglobulina mutada ou peptídeos simulando este do-mínio de ligação junto com uma região Fc ou um homólogo da região a umaregião Fc ou no mínimo parte desta. São incluídas moléculas quiméricascompreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalentes,fundidas a outros polipeptídeo.
Alérgenos são antígenos aos quais pacientes atópicos respon-dem com reações alérgicas.
Descrição detalhada da invenção
A invenção proporciona uma molécula ou um complexo de mo-léculas sendo capaz de ligar-se ao receptor 9 tipo Toll (TLR9) e Fc gamareceptor Rll (CD32) e incluindo no mínimo um epitopo de no mínimo um an-tígeno.
Em uma modalidade da invenção a molécula ou complexo demoléculas compreende no mínimo três partes, uma parte sendo uma estru-tura ligando especificamente a TLR9 (de modo monovalente, de modo biva-Iente ou de modo multivalente), outra parte sendo uma estrutura ligando es-pecificamente a CD32 (de modo monovalente, de modo bivalente ou demodo multivalente) e no mínimo uma outra parte sendo um ou mais epitoposde células T de um antígeno e/ou alérgeno. As partes podem ser estruturasindependentes as quais são ligadas juntas ou por ligações químicas ou porfusão genética ou por outras interações (não-covalentes) tais como intera-ções ligante-receptor ou de anticorpos.
As ligações entre as diferentes partes podem ser diferentes. Porexemplo, em uma modalidade preferido, a ligação entre as partes ligando-sea TLR9 e CD32 é por fusão genética e a ligação a no mínimo um dos epito-pos de células T é através de uma interação receptor/ligante (por exemplo,biotina-estreptavidina). A vantagem de uma estrutura similar é a flexibilidadena produção. A parte geral biespecífica (anti-TLR9/anti-CD32), do complexode moléculas pode ser produzida do mesmo modo para todos os pacientes,epitopos de células T selecionados são ligados à parte geral do complexode moléculas de acordo com a necessidade. A seleção pode se basear emprevalência de doença ou em resultados de testes de especificidade indivi-duais dos pacientes (alergia específica). A formação de complexo pode serrealizada centralizada ou na cabeceira ou em um consultório médico.
A ligação química de moléculas das várias moléculas de ligaçãoda mesma classe química ou diferente pode ser realizada por muitas técni-cas diferentes produzindo ou uma proporção molecular definida das váriaspartes da molécula ou complexo de moléculas da invenção. Também podelevar a uma mistura de moléculas com diferentes proporções molecularesdas várias partes da molécula ou complexo de moléculas da invenção.
A proporção das várias partes da invenção pode ser uma equi-molar ou não-equimolar. A molécula pode ser monovalente para ligação aTLR9 e/ou CD32 e/ou um ou mais epitopos de células T. Também pode serbi-, tri- e multivalente para no mínimo uma das partes da molécula ou docomplexo de moléculas. Se a ligação a TLR9 e/ou CD32 for bivalente ou demaior valência, a especificidade de ligação pode ser para um ou para maisepitopos em CD32 e/ou TLR9 respectivamente.
Em outra modalidade da invenção às especificidades de ligaçãoda molécula estão sobrepostas de modo que uma parte da molécula ou docomplexo de moléculas da invenção está ligando a ambos, TLR9 e CD32.
Uma parte similar pode ser selecionada por triagem simultânea de molécu-Ias para ligação a tanto CD32 quanto TLR9 ou por produção de uma molé-cula para ligar ambos, CD32 e TLR9. Por exemplo, uma proteína de arca-banço do arcabanço pode ser usado para exibir Ioops para ligar CD32 e ou-tras Ioops que ligam a TLR9.
Em uma modalidade adicional da invenção, uma proteína dearcabanço pode ser usado para exibir estruturas que ligam CD32, estruturasque ligam TLR9 e para exibir epitopos de células T.
As moléculas de ligação específica podem ser Iigantes naturaispara CD32 e TLR9 e derivados dos mesmos. Por exemplo, a parte Fc daimunoglobulina está ligando a CD32. CpG é um Iigante que ocorre natural-mente para TLR9.
As moléculas de ligação específica podem ser peptídeos. Peptí-deos CD32- e TLR9-específicos de acordo com a invenção podem ser sele-cionados por vários métodos tais como tecnologia de display de fago ou portriagem de bibliotecas de peptídeos combinatoriais ou arranjos de peptí-deos. Os peptídeos podem ser selecionados e usados em vários formatostais como peptídeos lineares, comprimidos ou cíclicos, os peptídeos podemser quimicamente modificados para estabilidade e/ou especificidade.
Um peptídeo ligando especificamente também pode ser deriva-do da análise de interação de um Iigante proteináceo que ocorre natural-mente para TLR9 e CD32 por isolamento do sítio de ligação mínima do Iigante.
Os peptídeos de ligação específica podem ser usados como taisna molécula ou no complexo de moléculas da invenção ou usados para se-rem incorporados em outras estruturas tal como enxertando em arcabançosde proteínas, anticorpos e domínios de proteínas ou quimicamente ligados amoléculas de veículo as quais podem ser parte da molécula ou complexo demoléculas da invenção.
A parte de ligação das moléculas ou complexo de moléculas dainvenção pode consistir em proteínas tais como anticorpos ou fragmentos deanticorpo (tais como Fab, Fv, scFv, dAb, F(ab)2, minicorpo, pequenos domí-nios de imunoglobulina mutada, receptor de células T solúvel, e etc). Anti-corpos e fragmentos de anticorpo e derivados podem ser gerados e selecio-nados para ligação a TLR9 e/ou CD32 de acordo com métodos conhecidostais como tecnologia de hibridoma, clonagem de células B, display de fago,display de ribossoma ou display da superfície celular de bibliotecas de anti-corpos, triagem de arranjo de anticorpos variantes.
As partes de ligação das moléculas ou complexo de molécula-ses da invenção podem ser domínios de proteína os quais ocorrem natural-mente ou domínios os quais são modificados artificialmente. Domínios deproteína ou derivados de domínios, por exemplo, domínios com mutaçõestais como substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos ou domí-nios quimicamente modificados podem ser selecionados para ligação aTLR9 e/ou CD32 de acordo com métodos conhecidos (por exemplo, displayde fago e da superfície celular de bibliotecas de domínios ou variantes dedomínios e triagem, arranjos de moléculas variantes e triagem). Os domíniosincluem mas não estão limitados a moléculas das sedguintes classes:
Domínio tipo EGF, um domínio de Kringle, um domínio de fibro-nectina tipo I, um domínio de fibronectina tipo II, um domínio de fibronectinatipo III, um domínio PAN, um domínio Gla, um domínio SRCR, um domínioinibidor de tripsina pancreática de Kunitz/Bovino, um domínio inibidor de pro-tease serina tipo Kazal, um domínio Trefoil (tipo P), um domínio de fator devon Willebrand tipo C, um domínio tipo Anaphylatoxin, um domínio CUB,uma repetição de tiroglobulina tipo I, um domínio classe A receptor de LDL,um domínio de Sushi, um domínio de Link, um domínio de Trombospondinatipo I, um domínio de imunoglobulina, um domínio semelhante a Imunoglo-bulina, um domínio de Iectina tipo C, um domínio MAM, um domínio de fatorde von Willebrand tipo A domain, um Α-domínio, um domínio de Somatome-dina B, um domínio de quatro núcleos dissulfeto do tipo WAP, um domínioF5/8 tipo C, um domínio de Hemopexin, um domínio SH2, um domínio SH3,um domínio semelhante a EGF do tipo Laminina, um domínio CTLA-4, umdomínio C2.
Em uma modalidade preferido, a parte de ligação de uma molé-cula ou complexo de moléculas da invenção compreende um pequeno do-mínio de imunoglobulina mutado (SMID) conforme descrito na publicação depatente PCT/EP2006/050059.
A parte de ligação da molécula ou complexo de moléculas dainvenção pode ser ácidos nucléicos tais como RNAs ou DNAs os quais po-dem ser selecionados para ligação específica a TLR9 e/ou CD32 de acordocom métodos conhecidos tais como triagem de aptâmeros e técnicas deevolução in vitro.
É contemplado que também outras classes de moléculas serãocapazes de exibir ligação específica a TLR9 e ou CD32. Bibliotecas de ou-tras entidades químicas diferentes daquelas mencionadas acima, incluindocarboidratos, lipídeos, e pequenas moléculas orgânicas, podem ser tríadaspara ligação específica a TLR9 e/ou CD32 e podem ser incorporadas namolécula ou complexo de moléculas da invenção.
Uma modalidade preferida da invenção é uma proteína de fusãorecombinante consistindo em no mínimo um epitopo de no mínimo um antí-geno, no mínimo um sítio de ligação interagindo com TLR9 e no mínimo umsítio de ligação interagindo com CD32. O antígeno pode ser tão pequenoquanto um epitopo de célula T de um antígeno ou pode ser um coquetel oumistura de um ou mais epitopos de célula T de um ou mais antígenos dife-rentes fundidos ou ligados juntos em um modo que possibilita apropriadoprocessamento e apresentação por moléculas MHC. A ordem dos epitopospode ser selecionada de acordo com diferentes critérios tais como estabili-dade do produto processamento eficaz, (não-)reconhecimento por anticor-pos preformados nas pessoas tratadas. Geralmemente se selecionará umamolécula estável a qual pode ser apresentada de modo eficaz por MHC e aqual levará ao reconhecimento mínimo por anticorpos preformados.
A invenção adicionalmente compreende a ligação física de nomínimo uma molécula interagindo com TLR9, no mínimo uma molécula inte-ragindo com CD32 e um ou mais epitopos de células T de um ou mais antí-genos ligados juntos em uma forma aleatória.
Adicionalmente, a invenção proporciona a preparação de ummedicamento contendo a proteína de fusão de acordo com a invenção e seuuso para tratamento de alergias. O medicamento pode ser uma formulaçãode vacina contendo a molécula ou complexo de moléculas de acordo com ainvenção, útil especialmente para imunoterapia ativa.
A produção recombinante de estruturas de ligação biespecíficada molécula ou do complexo de moléculas da invenção (isto é, ligação aCD32 e a TLR9) pode ser realizada de diferentes modos, por exemplo, por
• tecnologia de Quadroma (hibridomas fundidos) [12; 13]
• scFvs biespecíficos, ou como "diabodies" ou simplesmente porfusão genética de scFvs diferentes [14]
• anticorpos de domínio único nos quais VH reconhece um antí-geno e VL outro antígeno
• chi-bAbs (conforme descrito na patente européia No. EP0640130)
• pequenos domínios de imunoglobulina mutados, incluindo do-mínios de imunoglobulina produzidos por engenharia, especificalmente Ii-gando a CD32 e/ou a TLR9 em constructos codificando ou para anticorposcompletos ou para fragmentos de anticorpos tais como Fab (de acordo coma publicação de patente No. PCT/EP2006/050059)
• No contexto desta invenção, ligação a CD32 também pode serrealizada por uma ou mais regiões Fc de imunoglobulina monomérica oumultimérica ou algumas partes das mesmas especialmente quando a afini-dade por CD32 das partes Fc é reforçada, enquanto a ligação de TLR9 érealizada através do sítio de ligação normal (VH/VL) do anticorpo• uma ou mais regiões Fc de uma imunoglobulina ou partes dasmesmas, ligando a CD32, fundida a qualquer outro motivo de ligação espe-cífico TLR9
• a parte Fc do anticorpo mencionado acima pode ser "glico-produzida" para aumentar a afinidade por FcyR1S humanas [15]arcabanços produzidos, ligando especificamente a TLR9 e/ouCD32 de qualquer tipo pode ser usado e ligado junto conforme necessário.Estes arcabanços de ligação podem ser domínios de proteína, fibronectinaIII, lipocalinas, Proteína A ou inibidor de α-amilase, proteínas de repetiçãode Ankyrin, um domínio C2, um Α-domínio, um domínio semelhante a EG-FR, um dab, um chi-bAb, CTLA-4, gama cristalino ou qualquer outra proteí-na, domínio protéico ou parte dos mesmos.
A molécula ou complexo de moléculas da invenção consistemem um ou mais epitopos e uma ou mais estruturas de ligação, as quais inte-ragem com TLR9, preferencialmente TLR9 humana e uma ou mais estrutu-ras de ligação, as quais interagem com CD32, preferencialmente CD32 hu-mana. Para fácil experimentação in vivo da proteína da invenção as estrutu-ras de ligação que reconhecem TLR9 humana e CD32 humana podem terreação cruzada com TLR9 de macaco ou de camundongo e CD32 de maca-co ou de camundongo. Os antígenos/alérgenos selecionados podem serproteínas naturais/nativas completas ou partes destas, contanto que epito-pos os quais podem ser apresentados sobre moléculas MHC classe Il e osquais podem ser reconhecidos por células T estejam presentes sobre asseqüências presentes na molécula ou complexo de moléculas. A uma oumais partes da molécula ou complexo de moléculas, os quais interagemcom TLR9 e CD32 podem ser anticorpos completos ou incompletos (modifi-cados) ou fragmentos ou derivados dos mesmos, contanto que a ligação aTLR9 e CD32 seja conservada.
Alternativamente, podem ser usados anticorpos anti-TLR9 e an-ti-CD32 ou derivados ou fragmentos dos mesmos, os quais ainda reconhe-cem e ligam especificamente a TLR9 e CD32 humanas tal como expressadopor células B, e células dendríticas.Alternativamente, os anticorpos interagindo com TLR9 ou CD32são anticorpos aprimorados com maior afinidade do que os anticorpos originais.
Moléculas de anticorpo típicas são moléculas de imunoglobulinaintactas e as porções de uma molécula de imunoglobulina que contém oparatope, incluindo as porções conhecidas como Fab, Fab', F(ab')2 ,Fc eF(v), dAb.
Os anticorpos podem ser IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. As moléculasinteragindo com TLR9 ou CD32 podem ser de qualquer origem, preferenci-almente de origem mamífera, preferencialmente de origem humana, de ca-mundongo, camelo, cão ou gato ou humanizado. Preferencialmente as mo-léculas são anticorpos, preferencialmente anticorpos humanos ou humani-zados.
Conforme usado aqui, se a molécula ou complexo de moléculasda invenção for uma proteína de fusão, pode ser expressada em célulashospedeiras as quais cobrem qualquer tipo de sistema celular o qual podeser modificado para expressar a proteína de fusão. Dentro do âmbito da in-venção, o termo "células" significa células individuais, tecidos, órgãos, célu-las de inseto, células avócilas, células mamíferas, células de hibridoma, cé-lulas primárias, linhagens celulares contínuas, células-tronco e/ou célulasproduzidas por engenharia genética, tais como células recombinantes ex-pressando um anticorpo de acordo com a invenção.
Células podem ser células bacterianas, células fúngicas, célulasde leveduras, células de insetos, células de peixes e células de plantas.
Preferencialmente as células são células de animal, mais prefe-rencialmente células mamíferas. Estas podem ser, por exemplo, célulasBSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células CHO, células COS, célulasPerC6, células murinas, células humanas, células HeLa, células 293, célulasVERO, células MDBK, células MDCK, células MDOK, células CRFK, célulasRAF, células TCMK1 células LLC-PK, células PK15, células WI-38, célulasMRC-5, células T-FLY, células BHK, SP2/0, células NSO ou derivados dasmesmas.Preferencialmente as estruturas de ligação da molécula ou docomplexo de moléculas da invenção reconhecendo TLR9 e CD32 são pe-quenos domínios de imunoglobulina mutados, sendo, por exemplo, um frag-mento Fab no qual um sítio de ligação (ou específico para CD32 ou paraTLR9) é formado por VH/VL, e é combinado com um segundo sítio de liga-ção (ou específico para TLR9 ou para CD32 respectivamente) o qual podeser um CL produzido ou um domínio CH1, CH2, CH3, CH4, VL ou VH pro-duzido de acordo com PCT/EP/2006/050059; ou um anticorpo completo noqual um sítio de ligação é formado por VH/VL, e é combinado com um se-gundo sítio de ligação o qual pode ser um domínio CL, CH1, CH2, CH3,CH4, VL ou VH produzido de acordo com a publicação de patente No.PCT/EP/2006/050059.
De acordo com a invenção, a molécula ou complexo de molécu-las contém no mínimo uma estrutura que liga especificamente a CD32.
Um anticorpo anti-CD32 pode ser derivado por métodos conhe-cidos (tais como tecnologia de hibridoma, clonagem de células B e triagemde biblioteca de anticorpos). Para seleção, células apresentando CD32 emum formato natural podem ser usadas ou uma parte extracelular recombi-nante de CD32 pode ser usada ou podem ser usados peptídeos sintéticosselecionados entre a seqüência de aminoácidos CD32. Critérios de seleçãosão que a estrutura de ligação reconheça CD32a. No caso de tambémCD32b ser reconhecido, é preferido que a afinidade por CD32a seja >CD32b.
Como um exemplo, pode ser usado o fragmento Fab do anticor-po anti-CD32 IV.3 derivado da linhagem celular HB-217. Usando o método,por exemplo, descrito por Orlandi et al16, o fragmento Fab é clonado da li-nhagem celular HB-217. Alternativamente, outros formatos tais como scFvpodem ser construídos das seqüências de V-gene conhecidas. No entanto,para ótima combinação com um anticorpo anti-TLR9 ou fragmento Fab oufragmento Fv1 é preferrencial selecionar Iigantes específicos usando uma oumais das bibliotecas de pequenos domínios de imunoglobulina mutados deCH1, CH2 CH3, CH4, CL, VL ou VH. Domínios CH1, CH2, CH3, CH4, CL,VL ou VH selecionados podem ser então clonados na seqüência existentede um anticorpo anti-TLR9 ou um fragmento Fab ou um Fv dos mesmosdeste modo gerando um anticorpo biespecífico ou fragmento Fab.
As entidades de ligação CD32 selecionadas preferencialmentedevem ter as seguintes características:
1. Interação com CD32a que leva a internalização do complexoreceptor-estrutura de ligação, ativação da célula apresentando antígeno a-través do motivo ITAM na cauda citoplásmica do receptor e apresentaçãoantigênica dos epitopos de células T ligados/fundidos
2. Interação com CD32b que leva a sinalização negativa do re-ceptor através do motivo ITIM
3. Interação deve mostrar reatividade cruzada entre CD32 hu-mano e de macaco (para prova da eficácia em um modelo in vivo relevante)
4. Interação deve mostrar reatividade cruzada com CD32 decamundongo (para prova em um modelo estabelecido in vivo para alergia)
Para obter uma estrutura de ligação que liga especificamente aTLR9, podem ser usados vários procedimentos (tais como tecnologia dehibridoma, clonagem de células B e triagem de biblioteca de anticorpos).
Para seleção, células expressando TLR9 em um formato natural podem serusadas para isolar TLR9 natural ou um TLR9 recombinante pode ser usadoou peptídeos sintéticos selecionados entre a seqüência de aminoácidosTLR9 podem ser usados. Alternativamente, pode ser usado TLR9 purificadoou TLR9 expressado por linhagens celulares. Genes de anticorpos codifi-cando para VL e VH respectivamente podem ser extraídos depois de sele-ção por ligação a TLR9 e ser usados para criar um anticorpo recombinanteou fragmento Fab específico para TLR9 humano. Alternativamente, um Fvde cadeia única também pode ser preparado e fundido com o scFv anti-CD32 mencionado acima. No entanto, para ótima combinação com o anti-corpo anti-CD32 ou scFv ou fragmento Fab é preferido selecionar Iigantesespecíficos usando uma ou mais das bibliotecas de pequenos domínios deimunoglobulina mutados de CH1, CH2 CH3, CH4, CL1 VH ou VL. DomíniosCH1, CH2, CH3, CH4, CL, VL ou VH selecionados podem ser então clona-dos no anticorpo existente ou fragmento Fab ou scFv de anticorpo anti-CD32 deste modo gerando um fragmento Fab biespecífico. As entidades deligação TLR9 selecionadas preferencialmente debem ter as seguintes carac-terísticas:
1. Interação com TLR9 que leva a transdução de sinal e produ-ção de citocina
2. Interação que pode apresentar reatividade cruzada entreTLR9 humano e de macaco (para prova da eficácia em um modelo in vivorelevante)
3. Interação que pode apresentar reatividade cruzada com TLR9de camundongo (para prova em um modelo in vivo para alergia estabeleci-do) e CD32
Logicamente a proteína de fusão pode ser preparada similar-mente usando a parte Fab de um anticorpo monoclonal aTRL9 existente.
Usando o método, por exemplo, descrito por Orlandi et al16, o fragmento Fabé clonado a partir de, por exemplo, clone 26C593 disponível na ImgenexCorp., conforme decrito acima para o fragmento fab do aCD32 Ab IV.3. No-vamente para ótima combinação com um fragmento Fab anti-TLR9 é melhorselecionar Iigantes específicos para CD32 usando uma ou mais das bibliote-cas de pequenos domínios de imunoglobulina mutados de CH1, CH2, CH3,CH4, CL, VL ou VH. Domínios CH1, CH2, CH3, CH4, CL, VL ou VH selecio-nados podem ser então clonados no fragmento Fab existente de anticorpoanti-TLR9 deste modo gerando uma molécula biespecífica.
Finalmente, por exemplo, na ausência de Ab's existentes ade-quados disponíveis para tanto CD32 quanto TLR9, também é possível cons-truir uma molécula biespecífica usando as bibliotecas de pequenso domíniosde imunoglobulina mutados de CH1, CH2 CH3 ou CL para selecionar Iigan-tes específicos para tanto CD32 quanto TLR9 os quais são subseqüente-mente combinados para formar novas estruturas existentes de no mínimo 1estrutura de ligação específica para CD32 e 1 estrutura de ligação específi-ca para TLR9 derivada de quaisquer das bibliotecas possíveis em quaisquerdas combinações possíveis (CH1-CH1 ou CH1-CH2 ou CH1 CH3 ou CH2-CH4, ou CH3-CH4, ou CH1-CH4 ou ou CH2-CH3 e etc).
Alternativamente, um único domínio variável da superfamília deimunoglobulinas pode ser selecionado para ligação a TLR9 ou CD32 comIoops de CDR. O Iigante selecionado é em seguida randomizado em posi-ções de Ioop não-estrutural para gerar uma biblioteca de domínios variáveis
0 qual é selecionado para o outro antígeno respectivo, isto é, no caso deuma ligação de domínio variável com Ioops de CDR a TLR9 a seleção é pa-ra ligação a CD32 e vice versa.
Também é possível selecionar uma biblioteca de um V-domíinoo qual contém variações nos Ioops de CDR ao mesmo tempo que variaçõesnos Ioops não-CDR para ligação a TLR9 e CD32 seqüencialmente ou simul-taneamente.
Os V-domínios biespecíficos referidos também podem ser partede anticorpos ou fragmentos de anticorpos tais como Fvs de cadeia única,Fabs ou anticorpos completos.
Seleção de um epitopo TLR9 adequado:
A Seqüência 244-256 (SEQ ID No 1) da proteína madura TLR9no código de 1 letra de aminoácido:
CPRHFP QLHPDTFS
244 250 257
satisfará o critério 1 e 2 mas não 3, ao passo que a seqüência 176-191(SEQ ID No 2) da proteína madura TLR9 no código de 1 letra de aminoácido
LTHL SLKYNNLTVV PR
176 180 191
e
a seqüência 216-240 da proteína madura TLR9 (SEQ ID No 3) no código de1 letra de aminoácido
ANLT ALRVLDVGGN CRRCDHAPNP C
216 220 230 240
satisfarão todos os três critérios e portanto são preferidos para uso nestainvenção.
O processo para produzir a molécula ou complexo de moléculasé realizado de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, usando técni-cas de clonagem recombinante ou por reticulação química.
Um produto conforme descrito nesta invenção pode ser produzi-do do seguinte modo:
A VH e VL obtidas do anticorpo anti-CD32 são fundidas a CH1 eCL respectivamente. A CL foi produzida previamente usando tecnologia deSMID (PCT/EP2006/050059) e selecionada usando display de fago paraligar a TLR9 conforme descrito abaixo. CH1 é fundida em seu C-término auma seqüência codificando os epitopos de células T selecionados. Estesdois genes codificando proteína de fusão são clonados em um vetor de ex-pressão possibilitando a expressão de dois genes independentes (ou emdois vetores de expressão independentes) e são co-expressados em célulasde bactérias, levedura ou animais ou qualquer outro sistema de expressãoadequado. Portanto, é produzido um Fab com as características desejadas,isto é, ligando-se a CD32, ligando-se a TLR9 e carregando os epitopos decélulas T relevantes.
Exemplos alternativos aplicando tecnologia de SMID:
• Um scFv contra TLR9 é derivado de uma biblioteca de displayde fago ou de um hibridoma existente, e uma molécula de ligação de CD32é derivada de um CH2-CH4, ou CH3-CH4, ou CH1-CH4 ou biblioteca depequenos domínios de imunoglobulina mutados. Estas duas seqüências co-dificantes são ligadas juntas e uma seqüência codificante para epitopos decélulas T é fixada. A proteína de fusão é em seguida expressada em célulasde bactérias, levedura ou animal ou qualquer outro sistema de expressãoadequado
• Alternativamente, especificidade para TLR9 e especificidadepara CD32 são permutadas: Um scFv contra CD32 é derivado, por exemplo,de uma biblioteca de display de fago ou de um hibridoma existente, e umamolécula de ligação de TLR9 é derivada de um CH2-CH4, ou CH3-CH4, ouCH1-CH4 ou biblioteca de pequenos domínios de imunoglobulina mutados.Estas duas seqüências codificantes são ligadas juntas e uma seqüência co-dificante para epitopos de células T é fixada. A proteína de fusão é em se-guida expressada em células de bactérias, levedura ou animal ou qualqueroutro sistema de expressão adequado
• VH e VL de um anticorpo anti-TLR9 são fundidos a CH1 e CLrespectivamente. CL foi produzido previamente e selecionado usando dis-play de fago para ligar a CD32 (SMID). CH1 é fundido em seu C-término auma seqüência codificando os epitopos de células T. Estes dois genes codi-ficando proteína de fusão são clonados em um vetor de expressão possibili-tando a expressão de dois genes independentes (ou em dois vetores de ex-pressão independentes) e são coexpressados em células de bactérias, Ie-vedura ou animal ou qualquer outro sistema de expressão adequado, (no-vamente, anti-TLR9 e anti-CD32 podem ser permutados. CH1 e CL tambémpodem ser permutados)
• Genes de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo anti-TLR9 são tomados como um todo. No gene de cadeia pesada, a região CH2(ou CH1 ou CH3 ou CH4) é substituída por uma região CH2 (ou CH1 ouCH3 ou CH4 ou CL ou VH ou VL) a qual foi produzida previamente e sele-cionada usando display de fago para ligar a CD32 (pequeno domínio de i-munoglobulina mutado). CH1, CH2, CH3 ou CH4 é fundida em seu C-término a uma seqüência codificando os epitopos de células T. Estes doisgenes são de novo clonados em vetores de expressão e expressados emcélulas de animal.
• 2 pequenos domínios de imunoglobulina mutados, um especí-fico para TLR9, o outro específico para CD32 são fundidos e combinadoscom epitopos de células T
1 pequeno domínio de imunoglobulina mutado com 2 especifi-cidades diferentes (TLR9 e CD32) é combinado com epitopos de células TAntíqenos e Epitopos
Os antígenos que são parte da molécula ou complexo de molé-culas de acordo com a invenção podem ser alérgenos completos, alérgenosdesnaturados ou quaisquer antígenos que são tratados em qualquer modopossível para prevenir ligação a IgE. O tratamento referido pode consistir deproteção de epitopo da proteína antigênica usando anticorpos IgM1 IgD, IgAou IgG de alta afinidade dirigidos para os mesmos epitopos que os anticor-pos IgE do paciente conforme descrito por Leroy et al [20]. Tais anticorpostambém podem ligar-se próximos aos epitopos IgE específicos deste modoprevenindo ligação dos anticorpos IgE por ocultação estérica.
Alérgenos são geralmente definidos como antígenos aos quaispacientes atópicos respondem com reações de anticorpos IgE subseqüen-temente levando a reações alérgicas. Antígenos usados na molécula ou nocomplexo de moléculas da invenção podem ser alérgenos ambientais (porexemplo, ácaro de poeira doméstica, pólen de bétula, pólen de grama, antí-genos de gato, antígenos de barata), ou alérgenos de alimentos (por exem-plo, leite de vaca, amendoim, camarão, soja), ou uma combinação de am-bos. Além disso antígenos não relevantes tais como HSA podem ser parteda molécula ou complexo de moléculas de acordo com a invenção. O antí-geno pode ser um alérgeno completo, tipicamente um alérgeno para o qualpacientes com dermatite atópica, asma alérgica, rinite alérgica ou conjuntivi-te alérgica são alérgicos. Preferencialmente o uso do alérgeno no moléculaou complexo de moléculas de acordo com a invenção não liga a IgE do pa-ciente que necessita de tratamento.
Os antígenos e/ou epitopos usados na invenção podem ser defontes naturais ou ser produzidos por tecnologia recombinante ou ser produ-zidos sinteticamente. Antígenos e/ou epitopos da invenção podem conterestruturas de Iigantes as quais facilitam a incorporação de antígenos e/ouepitopos em complexos de moléculas da invenção através de interaçõesligante/receptor ou ligação de anticorpos. Antígenos e/ou epitopos da inven-ção podem conter grupamentos químicos os quais facilitam ligação covalen-te dos antígenos e/ou epitopos às estruturas de ligação de CD32 e/ou deTLR9 da molécula da invenção.
Em uma modalidade da invenção os antígenos e epitopos damolécula ou complexo de moléculas da invenção podem ser ligados de mo-do covalente à estrutura de ligação de CD32 e/ou à estrutura de ligação deTLR9.
Em uma modalidade antígenos e/ou epitopos também podemser ligados por uma interação ligante/receptor tal como biotina e avidina àmolécula ou complexo de moléculas da invenção. Por exemplo, o antígenosor epitopos a serem usados na molécula da invenção podem ser produzidoscom biotina ou um mimético de biotina fixado a esta. A estrutura de ligaçãode CD32 e/ ou a estrutura de ligação de TLR9 pode ser produzida com avi-dina ou outro Iigante biotina-específico fixado a esta. Depois da mistura des-tas moléculas com as diferentes ligações, forma-se um complexo de molé-culas estável de acordo com a invenção. Alternativamente, uma ligação an-ticorpo/antígeno pode ser usada para formar um complexo de moléculas dainvenção. Interações de alta afinidade são preferidos para estas modalida-des (por exemplo, anticorpo antidigoxigenina de alta afinidade e antígenose/ou epitopos rotulados como digoxigenina).
Em uma modalidade da invenção os antígenos e/ou epitopossão fundidos geneticamente à estrutura de ligação CD32 e/ou à estrutura deligação TLR9.
Se a molécula da invenção for uma proteína de fusão, o antíge-no é produzidos preferencialmente a partir de no mínimo uma subseqüênciade DNA de um alérgeno contendo epitopo de células T. Os epitopos de célu-las T podem ser alternativamente de um ou mais alérgenos relacionadose/ou não relacionados.
Preferencialmente, os epitopos de células T compreendem umanova proteína, a qual não é como uma proteína naturalmente existente eportanto não é reconhecida por anticorpos IgE ou IgG existentes no pacien-te. Portanto, ao invés de selecoinar epitopos de células T curtos os quaissão cortados separadamente e fundidos juntos de novo em uma ordem dife-rente, também se pode selecionar um trecho maior de epitopos de células T(> 28 AA) os quais ainda estão em sua ordem natural mas os quais foramselecionados previamente para não se ligarem a IgE alérgeno específica [21].
Em princípio todos os antígenos conhecidos podem ser usadospara incorporação na molécula ou complexo de moléculas da invenção aosquais pacientes alérgicos respondem com reações de hipersensibilidademediadas por IgE. Os alérgenos ambientais mais comuns nos países de-senvolvidos são: ácaro de poeira doméstica, pólen de bétula, pólen de gra-ma, gato, e barata. Cada um destes alérgenos tem um ou mais "alérgenosmaiores" (por exemplo, ácaro de poeira doméstica: alérgeno maior = Der P1;
Der F1, pólen de bétula: alérgeno maior = Bet V1). No entanto, antígenoscompletos, embora possíveis, não são necessários, porque a molécula oucomplexo de moléculas devem somente induzir reações de células T, e cé-lulas T respondem a pequenos peptídeos (cadeia de 12 a 28 aminoácidosde extensão) apresentados em moléculas MHC Classe II. A seleção de epi-topos de células T deve ser criada de tal modo que expressão sobre molé-culas HLA classe Il de possivelmente todas as patientes seja garantida. Al-gumas moléculas HLA classe Il são mais freqüentemente expressadas doque outras. Um bom exemplo para uma molécula HLA classe Il semelhantecom ampla expressão é HLA DPw4, a qual é expressada sobre aproxima-damente 78% da população Caucasiana [22]. Portanto uma seleção de epi-topos de células T deve ser incluída na molécula ou complexo de moléculaspara cada alérgeno, deste modo reduzindo o tamanho e o peso moleculardo complexo. Se epitopos reativos cruzados recobrindo entre alérgenos dediferentes organismos relacionados geneticamente, tais como Dermatopha-goides pteronyssinus (Der P1) e Dermatophagoides farinae, (Der F1), estãopresentes, eles são preferidos.
Para possibilitar processamento antigênico correto, DNA codifi-cando para trechos ligeiramente mais longos do que o epitopo de células Treal deve ser incluído na molécula ou complexo de moléculas e/ou os epito-pos podem ser separados de cada outro introduzindo trechos de DNA espa-çador preferencialmente contendo epitopos (hidrofóbicos) reconhecidos porproteína maior processando enzimas em células apresentando antígeno taiscomo a endopeptidase asparagina-específica (AEP) ou catepsina S, catep-sina D ou catepsina L [23].
Para fusão aos genes codificando para as estruturas de ligaçãoespecíficas para TLR9 e CD32, preferencialmente seqüências de DNA cur-tas de alérgenos maiores são usadas tais como alérgeno maior de ácaro depoeira doméstica I (Der P1, Der F1 ), alérgeno maior de ácaro de poeiradoméstica Il (Der P2, Der F2), ou alérgeno de pólen de bétula (Bet V1). Es-tas seqüências de DNA curtas contêm o código genético para um ou maisepitopos de células T, os quais depois do processamento, aparecem sobre asuperfície de células apresentando antígeno e portanto induzem uma reaçãoimune nas células T alérgeno específicas sensíveis. Não somente epitoposde células T de Der P1 e Der P2 mas também Der P3, Der P4, Der P5, DerP6, Der P7 etc. e Der F3, Der F4, Der F5, Der F6, Der F7 etc podem ser u-sados em uma molécula ou complexo de moléculas da invenção. Epitoposde células T destes alérgenos podem ser selecionados por mapeamento deepitopo clássico usando clones de células T [24] ou usando software deprognóstico de HLA Classe Il moderno tal como o programa Tepitope [25;26]. Para a molécula ou complexos de moléculas, os quais podem ser for-mulados como vacina, não é necessário combinar epitopos de células T deuma única fonte de alérgeno; ao contrário é preferido incluir tantos epitoposde células T derivados de diferentes fontes de alérgenos produzidas poruma ou mais espécies diferentes, por exemplo, uma combinação de alérge-nos de ácaros da poeira doméstica e de alérgenos de pólen de grama, gatose/ou pólen de bétula.
Como um exemplo para Der P1 a maioria dos epitopos de célu-las T pode ser encontrada nas seguintes seqüências 101-143 da proteínamadura no código de 1 letra de aminoácido (SEQ ID No 4):
QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPPNANKIRE ALAQPQRYCR HYWT101 110 120 130 140 143
Especialmente a seqüência de aminoácidos 101-131 contém nomínimo 3 epitopos de células T24, os quais ligam a uma série de moléculasHLA classe Il no código de 1 letra de aminoácido (SEQ ID No 5):
QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPPNANKIRE AL101 110 120 131
A seqüência 107-119 contém um importante epitopo de célulasT que liga a HLA DPw4 bem como HLA DPw5 24. Estas moléculas HLAClasse Il são expressadas pela maioria da população. O epitopo no códigode 1 letra de aminoácido (SEQ ID No 6):
NAQ RFGISNYCQI107 110 119
Outros importantes epitopos de células T os quais além dissosão partilhados entre Der P1 e Der F1 são encontrados nas seqüências 20-44 e 203-226 da proteína madura no código de 1 letra de aminoácido:
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Exemplos de epitopos de células T partilhados entre Der P2 eDer F2 são enconrtrados na seqüência 26-44, 89-107 e 102-123
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A partir dos epitopos de células T mencionados acima de DerP1/F1 e Der P2/F2 pode-se criar várias moléculas funcionais ou complexosde moléculas, por exemplo,
Tomando de Der P1 as seguintes seqüências:
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Pode-se criar um cDNA com a ordem B1A1E1H1G1C1F1D ouH1A1D1C1F1G1E1B1 mas qualquer combinação possível das seqüências sele-cionadas servirá. A ordem preferido dos epitopos será largamente determi-nada com base na eficiência da expressão da molécula recombinante com-pleta. Além disso duplicações de seqüências são permitidas, por exemplo,B1B1A1E1E1G1C1G1F1A1D etc. A parte do epitopo de células T Iogicametnetambém pode conter os códigos genéticos para peptídeos mais curtos oupeptídeos mais longos para mais ou para menor peptídeos, contanto queum ou mais epitopos de células T de um ou mais diferentes alérge-nos/antígenos sejam incluídos.
Epitopos de outros alérgenos tais como Bet V1, Lol P1, Fel d1com características similares serão preferidos para inclusão na molécula oucomplexo de moléculas de acordo com a invenção.
A invenção também refere-se a um método para tratar doenças,especialmente alergias, o qual compreende administrar a um sujeito quenecessite de similar tratamento uma quantidade profilaticamente ou terapeu-ticamente eficaz de uma molécula ou complexo de moléculas de acordocom a invenção para uso como um farmacêutico, especialmente como umagente contra alergias.
A molécula ou complexo de moléculas podem ser misturadoscom diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais e,opcionalmente, outros excipientes e administrados parenteralmente por viaintravenosa ou enteralmente, por exemplo, por via intramuscular e por viasubcutânea. As concentrações da molécula ou complexo de moléculas, logi-camente, variarão dependendo, entre outros, do composto empregado, dotratamento desejado e da natureza da forma.
Para diferentes indicações as doses apropriadas, logicamente,variarão dependendo, por exemplo, da molécula ou complexo de moléculasusados, do hospedeiro, do modo de aplicação e da indicação pretendida. Noentanto, em geral, são indicados resultados satisfatórios para serem obtidoscom 1 a 4 vacinações em 1 a 2 anos, mas caso necessário pode ser feitavacinação adicional repetida. É indicado que para estes tratamentos a molé-cuia ou complexo de moléculas da invenção podem ser administrados em 2a 4 doses e com um esquema de aplicação similar conforme empregadoconvencionalmente.
Isso refere-se adicionalmente a uma molécula ou complexo demoléculas de acordo com a invenção para uso como um farmacêutico, parti-15 cularmente para uso no tratamento e profilaxia de alergias.
A composição farmacêutica preparada de acordo com a presen-te invenção para uso como formulação de vacina pode (mas não tem de)conter no mínimo um adjuvante usado comumente na formulação de vaci-nas à parte da molécula ou complexo de moléculas. É possível reforçar areação imune por similares adjuvantes. Como exemplos de adjuvantes, noentanto sem ser limitados a estes, podem ser listados os seguintes: hidróxi-do de alumínio (Alu gel), QS-21, Enhanzyn, derivados de lipopolissacarí-deos, Bacillus Calmette Guerin (BCG), preparações de lipossoma, formula-ções com antígenos adicionais contra os quais o sistema imune já foi produ-zida uma forte reação imune, tal como, por exemplo, toxóide tetânico, exo-toxina de Pseudomonas, ou constituintes dos vírus da gripe, opcionalmenteem uma preparação de lipossoma, adjuvantes biológicos tais como fator es-timulante de macrofago granulócito (GM-CSF), interleucina 2 (IL-2) ou gamainterferon (IFNy).
Hidróxido de alumínio é o adjuvante de vacina mais preferido.
Sumário de um modo de ação possível da proteína de fusão deacordo com a invenção:A proteína de fusão de acordo com a presente invenção, podeser formulada em quaisquer das formulações farmacêuticas aceitáveis dis-poníveis, mas preferencialmente é formulada como uma vacina. A porção deligação aCD32 da proteína de fusão de acordo com a invenção seleciona ascélulas relevantes. A deflagração de CD32 sobre estas células induzirá ati-vamente internalização do receptor mais a proteína de fusão fixada e fazen-do isto facilita a interação da porção de ligação TLR9 da proteína de fusãocom a TLR9, a qual é expressada dentro do citoplasma das células apresen-tando antígenos relevantes [10;11].
Em conseqüência da internalização mediada por CD32, o pro-cessamento e apresentação subseqüentes dos epitopos de células T sele-cionados sobre moléculas MHC Classe II, combinados com a ativação es-pecífica de TRL9 citoplásmico nas células apresentando antígeno, células Talérgeno específicas serão (re-)programadas para se tornarem células dememória Th1. Estas células de memória Th1 alérgeno específicas em umponto de tempo posterior induzirá produção de IgG alérgeno específica aoencontrar os mesmos epitopos derivados de alérgenos naturais apresenta-dos por células B alérgeno específicas expostas naturalmente. Estas célulasTh1 portanto são necessárias para reequilibrar o sistema imune de produ-ção de anticorpos dominados por IgE para IgG.Exemplos:
Os seguintes exemplos explicarão a presente invenção em maisdetalhes, sem, no entanto, a restringir.Exemplo 1:
Varredura da bibliioteca de fago CL humano sobre um peptídeoTLR-9, por exemplo, seqüência 216-240 da proteína matura TLR9 (SEQ IDNo 3) em código de a letra de aminoácidoANLT ALRVLDVGGN CRRCDHAPNP C216 220 230 240
3 rodadas de varredura serão realizadas de acordo com proto-colos de rotina. Em resumo, pode ser aplicado o método seguinte. LâminasMaxisorp de 96 cavidades (Nunc) são revestidas com o peptídeo (sintético)representando parte da seqüência do TLR-9. Para revestir os peptídeos nascavidades, 200 μΙ da seguinte solução são adicionados por cavidade: tam-pão de carbonato de Na, pH 9.6 a 0,1 M, com as seguintes concentraçõesde peptídeo dissolvido:
1 - rodada de varredura: 1 mg/ml de peptídeo TLR-9
2- rodada de varredura: 500 pg/ml de peptídeo TLR-9
3- rodada de varredura: 100 pg/ml de peptídeo TLR-9
A incubação é por 1 hora a 37 °C, seguida por bloqueio com 2%de leite em pó (M-PBS) com 200 μΙ por cavidade por 1 hora em temperaturaambiente. A biblioteca de fago de display superficial é em seguida deixadapara reagir com o peptídeo ligado adicionando 100 μΙ de suspensão de fagoe 100 μΙ de leite em pó a 4% (M-PBS)1 seguida por incubação por 45 minu-tos com agitação e por 90 minutos sem agitação em temperatura ambiente.Partículas de fago não-ligadas são lavadas como se segue. Depois da 1§rodada de varredura: 10 χ 300 μΙ de T-PBS1 5x 300 μΙ de PBS; depois da 2§rodada de varredura: 15 χ 300 μΙ de T-PBS1 10x 300 μΙ de PBS; depois da 3grodada de varredura: 20 χ 300 μΙ de T-PBS, 20 χ 300 μΙ de PBS. Elutriaçãode partículas de fago ligadas é realizada adicionando 200 μΙ por cavidade deglicina a 0,1 μ, pH 2.2, e incubação com agitação por 30 minutos em tempe-ratura ambiente. Subseqüentemente, a suspensão de fago é neutralizadapor adição de 60 μΙ a 2M de Tris-Base, seguida por infecção em células TG1de E. coli misturando 10 ml de cultura crescendo exponencialmente com 0,5ml de fago elutriado e incubação por 30 minutos a 37 °C. Finalmente, bacté-rias infectadas são colocadas sobre meio TYE com 1% de glicose e 100 μg/ml de Ampicilina, e incubadas a 30 °C de um dia para o outro.Exemplo 2:
Clonagem de clones selecionados de mutantes CL humanos selecionadoscontra TLR-9 para expressão solúvel
DNA de fagemídeo do fago selecionado através da 3 rodadas devarredura é isolado com uma midi-prep. DNA codificando regiões CL muta-das é amplificado por PCR em lotes e Ncol-Notl clonado no vector pNOT-BAD/Myc-His, o qual é o vetor de expressão de E. coli pBAD/Myc-His (Invi-trogen) com um sítio de restrição Notl inserido para facilitar a clonagem.Constructos ligados são transformados em células de E. coli LMG194 (Invi-trogen) com eletroporação, e cultivados a 30 0C sobre meio TYE com 1% deglicose e ampicilina de um dia para o outro. Clones selecionados são inocu-lados em 200 μΙ de meio 2xYT com ampicilina, cultivados de um dia para ooutro a 30 °C, e induzidos adicionando L-arabinose para uma concentraçãofinal de 0,1%. Depois de expressão a 16 0C de um dia para o outro, as célu-las são colhidas por centrifugação e tratadas com 100 μΙ de tampão de bora-to de Na, pH 8.0, a 4 0C de um dia para o outro para preparação de extratosperiplásmicos. 50 μI dos extratos periplásmicos foram usados em ELISA(vide abaixo).
Exemplo 3:
ELISA de mutantes CL humanos selecionados contra TLR-9
Clones selecionados são testados para ligação específica aopeptídeo TLR-9 por ELISA.
Revestimento: lâmina de microtítulo (NUNC, Maxisorp), 100 μΙpor cavidade, 20 μg de peptídeo TLR-9/ml de tampão de carbonato de Na a0,1 M, pH9.6, 1 ha 37 0C
Lavagem: 3x 200 μΙ de PBS
Bloqueio: BSA-PBS a 1%, 1 h em temperatura ambiente
Lavagem: 3x 200 μ I PBS
Ligação de extrato periplásmico: 50 μΙ de extrato periplásmicoμl de BSA-PBS a 2%, em temperatura ambiente de um diapara o outro
Lavagem: 3x 200 μI de PBS
19 anticorpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 em BSA-PBS a 1%, 90min em temperatura ambiente, 100 μΙ por cavidadeLavagem: 3x 200 μΙ de PBS
2e anticorpo: anticamundongo*HRP de cabra (SIGMA), 1:1000em 1% de BSA-PBS, 90 min em temperatura ambiente, 100 μΙ por cavidadeLavagem: 3x 200 μΙ de PBS
Detecção: 3 mg/ml de OPD em tampão de Na citrato/fosfato, pH4.5, 0,4 μΙ de Η202 a 30%
Tamponamento: 100 ml de 3M H2S04Leitura da absorvência: 492/620 nm
Clones que dão um elevado sinal neste primeiro ELISA prelimi-nar são cultivados em um volume de 20 ml nas mesmas condições confor-me descrito acima. Seus extratos periplásmicos são isolados em 1/20 dovolume da cultura conforme descrito acima e testados com ELISA (conformedescrito acima) para confirmação.Exemplo 4:
Clonagem dos domínios variáveis anti-CD32 de HB-217mRNA é isolado a partir da linhagem celular HB-217 (ATCC,anticorpo antiCD32 IV.3) e é usado para preparar cDNA de acordo com pro-tocolos de rotina estabelecidos. O cDNA é adicionalmente usado como ummodelo para amplificar as regiões dos genes codificando para a cadeia levee a cadeia pesada do fragmento Fab do anticorpo IV.3 respectivamente.Iniciadores de PCR a montante, os quais prime a partir da extremidade 5'das regiões variáveis, usados para esta amplificação são derivados das se-qüências publicadas de regiões variáveis de camundongo (IMGT, o interna-tional ImMunoGeneTics information system® http://imgt.cines.fr). Iniciadoresdegenerados e/ou misturas de diferentes iniciadores são usados como inici-adores a montante. Iniciadores a jusante são designados de modo a prime apartir da extremidade 3' dos domínios CL ou os CH1 respectivamente.
Na etapa seguinte, o domínio CL do anticorpo IV.3 é removido esubstituído por um domínio CL selecionado modificado por tecnologia SMIDo qual tem afinidade de ligação a TLR9, e o qual é selecionado conformedescrito acima nos exemplos 1 a 3. Para esta substituição, pode ser usadoPCR por sobreposição de acordo com protocolos de rotina. Alternativamen-te, para unir VL ao CL modificado por SMID pode ser usado um sítio de res-trição de corte unicamente o qual ou ocorre naturalmente na seqüência ou oqual é introduzido artificialmente pela mutagênese sítio dirigida (como umamutação silenciosa a qual não altera a seqüência de aminoácidos). Por e-xemplo, um sítio BstAPI pode ser gerado na região de articulação entre VL eCL mudando a seqüência de:
KRADAAPTVS IF (SEQ ID No 65)
AAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC (SEQ ID No 66)para:
KRADAAPTVS IF (SEQ ID No 65)
AAACGG GCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC (SEQ ID No 15)o sítio BstAPI recém criado é realçado na seqüência acima. A nova seqüên-cia é introduzida nas regiões codificantes amplificando a parte VL e a parteCL respectivamente com iniciadores de PCR adequadamente criados, cor-tando os produtos de PCR com BstAPI1 ligando os mesmos, e amplificandoo produto de ligação resultante completo com iniciadores de PCR conformeusado inicialmente para amplificar a parte de cadeia leve original do frag-mento Fab.
Para expressão do fragmento Fab modificado, os genes codifi-cando para as cadeias pesada e leve são subseqüentemente clonados emvetores de expressão apropriados, ou junto em um vetor de expressão oqual possibilita a expressão de dois genes independentes. Como um siste-ma de expressão, podem ser usadas bactérias, levedura, células de animalou qualquer outro sistema de expressão adequado. Para este exemplo aqui,será mostrada expressão de um vetor na levedura metilotrófica Pichia pasto-ris:
A parte de cadeia leve do fragmento de PCR modificado é Eco-Rl/Kpnl clonado no vetor de expressão de Pichia pastoris pPICZalphaA naestrutura de leitura correta tal como para fundir este funcionalmente com aseqüência de sinal de secreção de alfa-fator proporcionada pelo vetor. Simi-larmente, a parte de cdeia pesada do fragmento Fab é clonada em pPIC-ZalphaA. De modo a preparar os insertos para este procedimento de clona-gem, iniciadores de PCR adequadamente criados são usados os quais fi-xam os sítios de restrição necessários aos genes. Nas extremidades 3' deambas as regiões codificantes, um códon de parada tem de ser inserido eproporcionado pelos iniciadores de PCR também. O cassete de expressãode cadeia leve é em seguida cortado do vetor com enzimas de restrição B-glll e BamHI1 e as extremidades do DNA são tornadas neutralizadas por tra-tamento com fragmento Klenow de DNA polimerase. O vetor contendo aparte do Fab de cadeia pesada inserida é aberta por um digesto parcial comenzima de restrição Bglll, o DNA é tornado neutralizado por tratamento comfragmento Klenow de DNA polimerase, e o cassete de expressão codifican-do para a parte de cadeia leve é inserido. O digesto parcial do vetor de ca-deia pesada é necessário uma vez que o gene de cadeia pesada é inseridocontém um sítio Bglll. Para triagem do constructo final, deve-se tomar cui-dado para que este um sítio Bglll interno permaneça intacto. O constructofinal tem um sítio Pmel o qual é usado para Iinearizar o constructo antes detransformação em Pichia pastoris. Esta linearização é vantajosa para inte-gração eficiente do vetor de expressão no genoma do hospedeiro por re-combinação homóloga. Pichia pastoris é transformado com o vetor de ex-pressão Iinearizado usando eletroporação, clones transformados são sele-cionados com o antibiótico Zeocin para o qual o vetor confere resistência, esobrenadantes de clones escolhidos aleatoriamente são triados para ex-pressão do constructo Fab depois de indução de expressão com metanol.Para triagem, por exemplo, pode ser usado um ELISA Fab-específico. Aprodução da proteína recombinante é realizada cultivando o clone Pichiaselecionado transformado em uma escala maior, preferido em frascos deagitação ou em um fermentador, induzindo expressão por adição de metanole purificando a proteína recombinante por um método cromatográfico. Paraestas últimas etapas, são usados protocolos de rotina.Exemplo 5:
Clonagem dos epitopos de células T derivados Der P11/F1 e Der P2/F2 :
A combinação dos epitopos de células T selecionados formadospor seqüências B,A,E,H,G,C,F,D se mostra como se segue (SEQ ID No 16):
CQIYPPNANKIREAIi QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPP YDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNISeqs B) (Seg. A) (Seq. E)
VGY ENVWTVKVMGDDGVLACAIAT KYTWNVPKIAPKSENVWT IREALAQPQRYCRH
(Seq. H) (Seq. G) (Seg. C)YWT PCXIHRGKPFQLEAVFEAN RTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATB
(Seq. F) [Seq. D)
De modo a construir um gene sintético codificando para estaseqüência de aminoácidos, pode ser usada translação reversa in silico. Pro-gramas de computador estão disponíveis para este fim, tais como, por e-xemplo, DNAWORKS (http://molbio.info.nih.gov/dnaworks/). De modo a clo-nar o gene sintético codificando para os epitopos em estrutura com o genecodificando para a parte de cadeia pesada da estrutura, dois sítios de restri-ção são selecionados os quais nem cortam sobre esta região codificante nem sobre o vetor pPICZalphaA. Por exemplo, Acclll e Spel podem ser u-sados para este fim. Estes dois sítios de restrição são fixados ao gene codi-ficando para a parte de cadeia pesada do Fab usando iniciadores de PCRdesenhados de modo apropriado para o procedimento de clonagem confor-me descrito acima. Além disso, deve-se ter cuidado para não ter um códon de parada na extremidade da região codificante da parte de cadeia pesadado Fab, uma vez que o códon de parada será proporcionado na extremidade3' do gene sintético codificando para os epitopos. Novamente, este construc-to com os dois sítios de restrição adicionais localizados em sua extremidade3' é EcoRI/Kpnl clonado no vetor de expressão de Pichia pastoris pPICZal-phaA. O constructo é em seguida aberto com as enzimas de restrição Accllle Spel e o inserto codificando os epitopos é inserido. Este inserto é geradocomo se segue:
A seqüência de aminoácidos escolhida
CQIYPPNANKIREAL QSCRRPNAQRFGISNYCQIYPP YDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGY ENWVTVKVMGDDGVLACAIAT KYTWNVPKIAPKSENVWT IREALAQPQRYCRHYWT PCIIHRGKPFQLEAVFEAN RTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATE (SEQ ID No 16)junto com os sítios de restrição escolhidos, neste exemplo Acclll na extremi-dade 5' e Spel na na extremidade 3' são usados como entrada no programade computador disponível publicamente DNAWORKS. Além disso, um có-don de parada é adicionado entre a extremidade da seqüência de epitopo eo sítio Spel.
Os parâmetros os quais o programa usa para projetar os oligo-nucleotídeos são deixados nos valores-padrão propostos, e o programa éinstruído para evitar as seqüências dos sítios de restrição os quais são ne-cessários para as etapas de clonagem e transformação, tais como Acclll,Spel e Pmel.
Acclll: tccgga
Spe I: actagt
Pmel: gtttaaac
DNAWORKS gera uma série de oligonucleotídeos os quais sãosobrepostos e os quais representam ambos os filamentos das regiões codi-ficantes desejadas.
Por exemplo, é gerada a seguinte série de 24 oligonucleotídeos,a partir da qual é gerado o gene sintético codificante para os epitopos de alérgenos: 1 TCCGGATGCCAAATTTACCCGCCAAACG 2 8 (SEQ ID No 17) 2 AGCCTCTCTGATCTTGTTCGCGTTTGGCGGGTAAATTTGG 40 (SEQ ID No 18) 3 CGAACAAGATCAGAGAGGCTTTGCAATCTTGCAGGAGGCC 40 (SEQ ID No 19) 4 TATGCCGAATCTCTGCGCATTGGGCCTCCTGCAAGATTGC 40 (SEQ ID No 20) 5 GCGCAGAGATTCGGCATATCCAACTACTGCCAGATCTACC 40 (SEQ ID No 21) 6 GTACGCCCATCGTATGGGGGGTAGATCTGGCAGTAGTTGG 40 (SEQ ID No 22) 7 CCCATACGATGGGCGTACAATCATACAGCGTGATAACGGC 40 (SEQ ID No 23) 8 GCGTGGTAGTTAGGCTGATAGCCGTTATCACGCTGTATGA 40 (SEQ ID No 24) 9 TATCAGCCTAACTACCACGCCGTGAACATCGTCGGCTACG 40 (SEQ ID No 25) 10 TCACAGTAACCACGACATTCTCGTAGCCGACGATGTTCAC 40 (SEQ ID No 26) 11 AGAATGTCGTGGTTACTGTGAAGGTAATGGGCGATGACGG 40 (SEQ ID NO 27) 12 AGCTATGGCGCAAGCTAGAACCCCGTCATCGCCCATTACC 40 (SEQ ID NO 28) 13 TCTAGCTTGCGCCATAGCTACCAAGTACACTTGGAACGTA 40 (SEQ ID NO 29) 14 TTTTCGGCGCAATTTTGGGTACGTTCCAAGTGTACTTGGT 40 (SEQ ID No 30) 15 CCCAAAATTGCGCCGAAAAGTGAAAACGTCGTAGTGACCA 40 (SEQ ID No 31) 16 TGAGCCAATGCCTCCCTTATGGTCACTACGACGTTTTCAC 40 (SEQ ID No 32) 17 AGGGAGGCATTGGCTCAACCTCAAAGATACTGCAGACACT 40 (SEQ ID No 33) 18 TTATGCAGGGCGTCCAGTAGTGTCTGCAGTATCTTTGAGG 40 (SEQ ID No 34) 19 ACTGGACGCCCTGCATAATCCACCGTGGTAAACCCTTTCA 40 (SEQ ID No 35)20 CTTCGAACACTGCCTCAAGTTGAAAGGGTTTACCACGGTG 40 (SEQ ID No 36)
21 ACTTGAGGCAGTGTTCGAAGCTAACAGGACGGTAACGCCA 40 (SEQ ID No 37)
22 CCGCACCCACCTTGCATACGAATTGGCGTTACCGTCCTGT 40 (SEQ ID No 38)
23 TGCAAGGTGGGTGCGGGTCTTGTTGGGCTTTTTCTGGTGT 40 (SEQ ID No 39)
24 ACTAGTTTATTCAGTAGCAGCCACACCAGAAAAAGCCCAACA 42 (SEQ ID No 40)
Estes 24 oligonucleotídeos são dissolvidos, misturados juntos,fervidos por vários minutos e em seguida resfriados até a temperatura ambi-ente lentamente para permitir pareando ("annealing"). Em algumas etapasde PCR subseqüentes usando grandes quantidades dos dois iniciadores deborda (iniciadores no. 1 e no. 24), o gene pareado ("annealed") é amplifica-do, o produto de PCR é em seguida clivado com as enzimas de restriçãoescolhidas (Acclll e Spel neste exemplo), e clonado no vetor de expressãoconforme descrito acima, o qual contém como um inserto o gene codificandopara a parte de cadeia pesada do Fab modificado. Preparação do vetor deexpressão final contendo ambas as cadeias, transformação de Pichia pasto-ris, seleção de clones e triagem para produção de clones é feita conformedescrito acima. Expressão e purificação da proteína recombinante são reali-zadas seguindo protocolos de rotina.
Exemplo 6
Fusão de VH e VL da fusão do anticorpo anti-CD32 IV.3 com domínios CH3anti-TLR9 (SMIDS)
Toda modelagem molecular foi feita com Swiss-PdbVievyer 3.7(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)
Como um modelo de homologia para um fragmento Fab de ca-mundongo, é usado o arquivo de estrutura 2BRR.pdb do banco de dados deproteína Protein Data Bank (www.pdb.org). e lOQO.pdb é usado como umafonte para a estrutura de um domínio CH3 de IgG humana.
Modelos moleculares de VH e VL do anticorpo IV.3 são fabrica-dos com o "primeiro modo de abordagem" da Swissmodelhttp://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html) usando as seqüênciasde aminoácidos de VH e VL respectivamente.
Usando a função "magic fit" do Swiss-PdbViewer, duas cópiasda estrutura do domínio CH3 de lOQO.pdb são ajustadas sobre o domínioCH1 e o CL respectivamente de 2BRR.pdb. Subseqüentemente, os modelosmoleculares do IV.3 VH e VL respectivamente são ajustados (novamenteusando "magic fit") sobre VH e VL de 2BRR.pdb.
Para construção de uma proteína tipo Fab na qual CH1 e CLsão ambos substituídos por um domínio CH3, é necessário decidir em qualponto a seqüência de VH deve ser terminada e conectada à seqüência deCH3, e em qual ponto a seqüência de VL deve ser terminada e conectada àseqüência de CH3. Para ambos os constructos, é escolhido um ponto noqual a cadeia principal das estruturas sobrepostas e modelos (vide acima)mostra uma sobreposição ótima.
Para a cadeia leve, foi visto que a seqüência até Alai 14 (nume-ração de 2BRR.pdb) será usada uma conectada a Pro343 (numeração delOQO.pdb) do domínio CH3. O ponto de conexão entre estas duas seqüên-cias, portanto se lê como se segue (a parte, VL está sublinhada):
Lvs112 - Arai 13-Ala114-Pro343-Arg344-Glu345
De modo a permitir união das duas seqüências codificantes u-sando sítios enzimáticos de restrição e ligação de DNA, a seqüência próxi-ma do ponto de conexão é alterada por mutação silenciosa para introduzirum único sítio Xhol (ctcgag, sublinhado) como se segue:
KRAP RE (SEQ ID No 41)
AAACGGGCTCCTCGAGAA (SEQ ID No 42)
Para inserção posterior dos epitopos de alérgeno, um sítio Ascl(ggcgcgcc) é introduzido logo antes do códon de parada do constructo maisuma base extra para manutenção da estrutura de leitura:
ggg cgc gccGly Arg Ala
Além disso, para clonagem no vetor de expressão pPICZalphaA(sistema de expressão de Pichia pastoris, Invitrogen), um sítio EcoRI (ga-attc) é adicionado à extremidade 5' (N-término) e um sítio Kpnl (ggtacc) àextremidade 3' (C-término) do constructo.
O domínio CH3 a ser fundido a VH e VL respectivamente sele-cionado como parte do constructo pode ser um domínio CH3 de IgG huma-na selvagem o qual pode servir como um controle negativo, ou um domínioCH3 previamente produzido por tecnologia SMID e selecionado para ligarespecificamente a TLR9. Neste exemplo aqui, a seqüência do clone A23, aqual liga especificamente a TLR9 e a qual foi descrita no requerimento depatente PCT/EP 2006/050059 é fundido a ambos, VH e VL.
Portanto, a seqüência completa da proteína de fusão VL-CH3tem a seguinte seqüência de aminoácidos (a parte VL está sublinhada),(SEQ ID No 43):
DIVMTQAAPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL HTNGNTYLHW FLQRPGQSPQLLIYRMSVLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLSI SRVEAEDVGV FYCMQHLEYPLTFGAGTKLE LKRAPREPQV YTLPPSRDEL GIAQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVLGRRWT LGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK&
Seqüência de ácido nucléico da proteína de fusão VL-CH3 (sí-tios de restrição estão sublinhados), (SEQ ID No 44): gaattcGACA TTGTGATGAC CCAGGCTGCA CCCTCTGTAC CTGTCACTCCTGGAGAGTCA GTATCCATCT CCTGCAGGTC TAGTAAGAGT CTCCTGCATACTAATGGCAA CACTTACTTG CATTGGTTCC TACAGAGGCC AGGCCAGTCTCCTCAGCTCC TGATATATCG GATGTCCGTC CTTGCCTCAG GAGTCCCAGACAGGTTCAGT GGCAGTGGGT CAGGAACTGC TTTCACACTG AGCATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATGTG GGTGTTTTTT ACTGTATGCA ACATCTAGAATATCCGCTCA CGTTCGGTGC TGGGACCAAG CTGGAACTGA AACGGGCTCCTCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAC GAGCTCGGCATCGCGCAAGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAACGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC TTTCTTCCTC TACAGCAAGCTTACCGTGTT GGGCCGCAGG TGGACCCTGG GGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAATGAgggc gcgccggtac C
Para a cadeia pesada, foi visto que a seqüência até Thr123(numeração de 2BRR.pdb) deve ser usada uma conectada a Arg344 (nume-ração de lOQO.pdb) do domínio CH3. O ponto de conexão entre estas duasseqüências portanto se lê como se segue (a parte VH está sublinhada):
- - - Alai 21 - Lvs 122 - ThM 23 - Arg344 - Glu345 - Pro346 - - -
De modo a permitir a união das duas seqüências codificantesusando sítios enzimáticos de restrição e ligação de DNA, a seqüência pró-xima do ponto de conexão foi alterada por mutação silenciosa para introdu-zir um único sítio Xhol (ctcgag, sublinhado) como se segue:
AKTREP (SEQ ID No 45)
GCCAAAACTCGAGAACCA (SEQ ID No 46)
Além disso, para clonagem no vetor de expressão pPICZalphaA(sistema de expressão de Pichia pastoris, Invitrogen), um sítio EcoRI (ga-attc) é adicionado à extremidade 5' (N-término) e um sítio Xbal (tctaga) àextremidade 3' (C-término) do constructo. Não é adicionado códon de para-da a esta seqüência e o sítio Xbal é colocado na estrutura de leitura corretade modo a fundir o constructo à etiqueta Hexa-His proporcionada pelo vetorpara purificação posterior da proteína usando cromatografia por afinidadepor metal imobilizado.
Portanto, a seqüência completa da proteína de fusão VH-CH3tem a seguinte seqüência de aminoácidos (a parte VH está sublinhada),(SEQ ID No 47):
EVQLQQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGWLNTYTGESIY PDDFKGRFAF SSETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARGDYGYDDPLDYW GQGTSVTVSS AKTREPQVYT LPPSRDELGI AQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVLGRRWTLGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKSLE QKLISEEDLN SAVDHHHHHH&
Seqüência de ácido nucléico da proteína de fusão VH-CH3 (sí-tios de restrição estão sublinhados), (SEQ ID No 48):
GAATTCGAGG TTCAGCTTCA GCAGTCTGGA CCTGAGCTGA AGAAGCCTGGAGAGACAGTC AAGATCTCCT GCAAGGCTTC TGGGTATACC TTCACAAACTATGGAATGAA CTGGGTGAAG CAGGCTCCAG GAAAGGGTTT AAAGTGGATGGGCTGGTTAA ACACCTACAC TGGAGAGTCA ATATATCCTG ATGACTTCAAGGGACGGTTT GCCTTCTCTT CGGAAACCTC TGCCAGCACT GCCTATTTGCAGATCAACAA CCTCAAAAAT GAGGACATGG CTACATATTT CTGTGCAAGAGGGGACTATG GTTACGACGA CCCTTTGGAC TAC TGGGGTC AAGGAACCTCAGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAAC TC GAGA ACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCG GGACGAGCTC GGCATCGCGC AAGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG AGAGCAACGGGCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCTTTCTT CCTCTACAGC AAGCTTACCG TGTTGGGCCG CAGGTGGACCCTGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCACTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATCT CTAGAACAAAAACTCATCTC AGAAGAGGAT CTGAATAGCG CCGTCGACCA TCATCATCAT
CATCATTGA
Plano de clonagem detalhadoCadeia pesada:
A região VH do anticorpo IV.3 é amplificada por PCR com inicia-dores 4.3HupEco e 4.3HdownXho, e subseqüentemente digerida com EcoRIe Xhol. O clone A23 produzido por CH3 SMID é amplificado por PCR cominiciadores CH3upXhoA e CH3XBA2 e subseqüentemente digerido comXhol e Xbal. A seqüência VH e a seqüência CH3 são ligadas juntas atravésdo sítio Xhol e em seguida ligadas no pPICZalphaA (Invitrógen), o qual foipreviamente digerido com EcoRI e Xbal. O vetor resultante é denominadopPICHA23.
LISTA DE INICIADORES:
4.3HUPEC0 cagagaattc gaggttcagc ttcagcagtc (SEQ ID No 49)
4.3HDOWNXHO gatgctcgag ttttggctga ggagacggtg (SEQ ID No 50)
CH3UPXH0A aaaactcgag aaccacaggt gtacaccctg cc (SEQ ID No 51)
CH3XBA2 actgatctag acctttaccc ggagacaggg agag (SEQ ID No 52)
Cadeia leve:
A região VL do anticorpo IV.3 é amplificada por PCR com inicia-dores 4.3LupEco e 4.3LdownXho, e subseqüentemente digerida com EcoRIe Xhol. O clone A23 produzido por CH3 SMID é amplificado por PCR cominiciadores CH3upXhoB e CH3StopKpn e subseqüentemente digerido comXhol e Kpnl. A seqüência VL e a seqüência CH3 são ligadas juntas atravésdo sítio Xhol e em seguida ligadas no pPICZalphaA (Invitrogen), o qual foipreviamente digerido com EcoRI e Kpnl. O vetor resultante é denominadopPICLA23.
LISTA DE INICIADORES:
4.3LUPECO gatagaattc gacattgtga tgacccaggc tg (SEQ ID No 53)
4.3LD0WNXH0 attactcgag gagcccgttt cagttccagc t (SEQ ID No 54)
CH3UPXH0B gctcctcgag aaccacaggt gtacaccctg cc (SEQ ID No 55)
CH3STOPKPN acgtggtacc tcaggcgcgc cctttacccg gagacaggga gag(SEQ ID No 56)
COMBINAÇÃO DOS DOIS CASSETES DE EXPRESSÃO EM UM VETOR
O cassete de cadeia leve é cortado com Bglll (pos.1) e BamHI(pos. 2319) de pPICLA23 (4235 bp), e o fragmento de 2319 bp é purificadoatravés de eletroforese por gel do preparativo. O fragmento de 1916 bp édescartado. O vetor pPICHA23 (4219 bp) é digerido com BamHI, e o frag-mento de pPICLA23 de 2319 bp previamente purificado é inserido. O vetorde expressão de Pichia pastoris resultantes, o qual transporta dois cassetesde expressão, um para a proteína de fusão VL-CH3 e um para a proteína defusão VH-CH3 é triado de modo que ambos os insertos que têm a mesmadireção de transcrição. O vetor resultante pPICHLA23 (6537 bp) é em se-guida Iinearizado antes de transformação em Pichia pastoris, por exemplo,com BamHI ou com BssSI, transformado em Pichia pastoris por eletropora-ção, e transformantes positivos são selecionados com Zeocina. Vários clo-nes são triados para expressão da proteína recombinante. Um clone é emseguida selecionado para produção em larga escala, e a proteína de fusãorecombinante é purificada por cromatografia por afinidade por metal imobili-zado usando procedimentos de rotina. Toda a manipulação, cultura e ex-pressão de Pichia é feita seguindo protocolos de rotina (Invitrogen).Inserção de epitopos de alérgenos no vetor pPICHLA23 e expressão da pro-teína de fusão recombinante
A seqüência codificando os epitopos de alérgeno conforme des-crito no exemplo 5 é inserida no vetor pPICHLA23 como se segue:
o vetor é digerido com Ascl (4174-4182) o qual leva a sua Iinea-rização. Neste sítio Asei, a seqüência de DNA codificando os epitopos dealérgeno é inserida. A seqüência codificando os epitopos de alérgeno é am-plificada com iniciadores EpiTLRI e EpiTLR2 de modo a fixar sítios Ascl aambas as extremidades da seqüência.
Lista de iniciadores
EpiTLRI TAAAGGGCGC GCCTCCGGAT GCCAAATTTA CC(SEQ ID No 57)
EpiTLR2 TACCTCAGGC GCGCCTTATT CAGTAGCAGC CACAC(SEQ ID No 58)
O produto de PCR resultante é digerido com Ascl e ligado novetor previamente digerido. O vetor resultante é denominado pHLA23EP(7046 bp). Transformação de Pichia, expressão e purificação da proteína defusão recombinante é realizada conforme descrito acima para o constructoque não tem epitopos inseridos.
VL de anticorpo IV.3:
seqüência de aminoácidos:
divmtqaaps vpvtpgesvs iscrssksll htngntylhw flqrpgqspqlliyrmsvla sgvpdrfsgs gsgtaftlsi srveaedvgv fycmqhleypltfgagtkle lkra (seq id No 59)
seqüência de ácido nucléico:
gacattgtga tgacccaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggagagtcagtatcc atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catactaatggcaacactta cttgcattgg ttcctacaga ggccaggcca gtctcctcagctcctgatat atcggatgtc cgtccttgcc tcaggagtcc cagacaggttcagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagcatc agtagagtggaggctgagga tgtgggtgtt ttttactgta tgcaacatct agaatatccgctcacgttcg gtgctgggac caagctggaa ctgaaacggg ct (SEQ ID No 60)
VH de anticorpo IV.3:seqüência de aminoácidos:
EVQLQQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGWLNTYTGESIY PDDFKGRFAF SSETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARGDYGYDDPLDYW GQGTSVTVSS AKT (SEQ ID No 61)seqüência de ácido nucléico:
GAGGTTCAGC TTCAGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGACAGTCAAGATC TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA TACCTTCACA AACTATGGAATGAACTGGGT GAAGCAGGCT CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGGTTAAACACCT ACACTGGAGA GTCAATATAT CCTGATGACT TCAAGGGACGGTTTGCCTTC TCTTCGGAAA CCTCTGCCAG CACTGCCTAT TTGCAGATCAACAACCTCAA AAATGAGGAC ATGGCTACAT ATTTCTGTGC AAGAGGGGACTATGGTTACG ACGACCCTTT GGACTACTGG GGTCAAGGAA CCTCAGTCACCGTCTCCTCA GCCAAAACA (SEQ ID No 62)
Vetor de expressão final pPICHCLA23.seq. (SEQ ID No 63) contendo regi-ões de ligação TLR9 e CD326537 bp
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag
61
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt121
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc181
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta241
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta301
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg361
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct421
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg481
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt541
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct601
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct661
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact721
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat781
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt841
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga901
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt961
tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga
1021
agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga1081
tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa1141
tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc1201
tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga1261
gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg1321
ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttaaaca cctacactgg1381
agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg acggtttgcc ttctcttcgg aaacctctgc1441
cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catatttctg1501
tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt1561
caccgtctcc tcagccaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga1621
tgagctgggc atcgcgcaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga
1681
catcgccgtg gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc1741
cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag1801
gtggaccctg gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta1861
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatctcta gaacaaaaac tcatctcaga1921
agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt gtagccttag1981
acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct2041
aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt2101
ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga2161
gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa2221
aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat
2281
taagtgagac cttcgtttgt gcagatccaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct2341
ttttgccatc cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg2401
ggatacacta gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac2461
ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc2521
aattccttct attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc2581
tggcgaggtt catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat2641
cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc2701
caaaactgac agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc2761
aagatgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc2821
caaaagtcgg cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc2881
tcattaatgc ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa2941
cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt3001
ccaagattct ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt3061
ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt3121
tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt3181
tgattttaac gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa3241
cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg3301
ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg3361
gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa3421
ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg3481
tatctctcga gaaaagagag gctgaagctg aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac3541
cctctgtacc tgtcactcct ggagagtcag tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc3601
tcctgcatac taatggcaac acttacttgc attggttcct acagaggcca ggccagtctc3661
ctcagctcct gatatatcgg atgtccgtcc ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg3721 gcagtgggtc aggaactgct ttcacactga gcatcagtag agtggaggct gag-gatgtgg
3781 gtgtttttta ctgtatgcaa catctagaat atccgctcac gttcggtgct gggacca-agc
3 841 tggaactgaa acgggctcct cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgg-gatg
3901 agctgggcat cgcgcaagtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagc-gaca3961
tcgccgtgga gtgggagagc aacgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg4021
tgctggactc cgacggctct ttcttcctct acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt
4081 ggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccac-
taca
4141
cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aagggcgcgc ctgaggtacc tcgagccgcg4201
gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc4261
gaccatcatc atcatcatca ttgagtttgt agccttagac atgactgttc ctcagttcaa4321
gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc4381
catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt ttatttgtaa cctatatagt4441
ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc ttgctcctga tcagcctatc4501
tegcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa tcattcgagt ttgatgtttt4561
tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta agtgagacct tcgtttgtgc4621
ggatccccca cacaccataig cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt4681
tctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt4741
tccctctttc ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa4801
aagagaccgc ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt4861
tctttttctt gaaatttttt tttttagttt ttttctcttt cagtgacctc cattgatatt4921
taagttaata aacggtcttc aatttctcaa gtttcagttt catttttctt gttctattac4981
aacttttttt acttcttgtt cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aaggggcggt5041
gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac5101
taaaccatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga5161
gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc5221
gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg5281
ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg5341
tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc5401
gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg5461
gtggccgagg agcaggactg acacgtccga5521
tccgtccccc ttttcctttg tcgatatcat5581
ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa5641
ccctatttat ttttttatag ttatgttagt5701
tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc5761
gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 5821
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa5881
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg5941
aggactataa agataccagg cgtttccccc6001
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc6061
tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc
6121
tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg6181
gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc6241
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga6301
cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc
cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc
cggcggccca cgggtcccag gcctcggaga
gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg
ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt
attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt
atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga
ttgcaagctg gagaccaaca tgtgagcaaa
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga
actggcagca gccactggta acaggattag
gttcttgaag tggtggccta actacggcta
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag6361
agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg6421
caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac6481
ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagatc
Vetor de expressão final pHLA23EP.seq (SEQ ID No 64) contendo regiõesde ligação TLR9 e CD32 e seqüência de epitopo (vide a SEQ ID No 16)7046 bp
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag61
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt
121
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc181
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta241
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta301
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg361
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct421
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg481
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt541
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct601
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct661
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact721
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat781
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt841
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga901
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt961
tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga1021
agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga
1081
tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa1141
tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc1201
tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga1261
gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg1321
ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttaaaca cctacactgg 1381
agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg acggtttgcc ttctcttcgg aaacctctgc1441
cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catatttctg1501
tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt1561
caccgtctcc tcagccaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga1621
tgagctgggc atcgcgcaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga1681
catcgccgtg gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc1741
cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag1801
gtggaccctg gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta1861
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatctcta gaacaaaaac tcatctcaga1921
agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt gtagccttag1981
acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaá gaccggtctt gctagattct2041
aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt2101
ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga2161
gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa2221
aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat2281
taagtgagac cttcgtttgt gcagatccaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct2341
ttttgccatc cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg2401
ggatacacta gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac2461
ccacttttgc catcgaaaaa ecagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc2521
aattccttct attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc2581
tggcgaggtt catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat2641
cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc 2701
caaaactgac agtttaaaçg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc2761
aagatgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc2821
caaaagtcgg cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc2881
tcattaatgc ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa2941
cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt
3001
ccaagattct ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt3061
ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt3121
tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt3181
tgattttaac gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa3241
cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg 3301
ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg3361
gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa3421
ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg3481
tatctctcga gaaaagagag gctgaagctg aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac3541
cctctgtacc tgtcactcct ggagagtcag tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc3601
tcctgcatac taatggcaac acttacttgc attggttcct acagaggcca ggccagtctc3661
ctcagctcct gatatatcgg atgtccgtcc ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg3721
gcagtgggtc aggaactgct ttcacactga gcatcagtag agtggaggct gaggatgtgg3781
gtgtttttta ctgtatgcaa catctagaat atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc3841
tggaactgaa acgggctcct cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg3901
agctgggcat cgcgcaagtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca3961
tcgccgtgga gtgggagagc aacgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg4021
tgctggactc cgacggctct ttcttcctct acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt4081
ggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca4141
cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aagggcgcgc ctccggatgc caaatttacc4201
cgccaaacgc gaacaagatc agagaggctt tgcaatcttg caggaggccc aatgcgcaga4261
gattcggcat atccaactac tgccagatct accccccata cgatgggcgt acaatcatac4321
agcgtgataa cggctatcag cctaactacc acgccgtgaa catcgtcggc tacgagaatg4381
tcgtggttac tgtgaaggta atgggcgatg acggggttct agcttgcgcc atagctacca4441
agtacacttg gaacgtaccc aaaattgcgc cgaaaagtga aaacgtcgta gtgaccataa4501
gggaggcatt ggctcaacct caaagatact gcagacacta ctggacgccc tgcataatcc4561
accgtggtaa accctttcaa cttgaggcag tgttcgaagc taacaggacg gtaacgccaa4621
ttcgtatgca aggtgggtgc gggtcttgtt gggctttttc tggtgtggct gctactgaat4681
aaggcgcgcc tgaggtacct cgagccgcgg cggccgccag ctttctagaa caaaaactca4741
tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta4801
gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct4861
agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgcctga gagatgcagg cttcattttt 4921
gatacttttt tatttgtaac ctatatagta taggattttt tttgtcattt tgtttcttct4981
cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt5041
ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt cccactcctc ttcagagtac5101
agaagattaa gtgagacctt cgtttgtgcg gatcccccac acaccatagc ttcaaaatgt5161
ttctactcct tttttactct tccagatttt ctcggactcc gcgcatcgcc gtaccacttc5221
aaaacaccca agcacagcat actaaatttt ccctctttct tcctctaggg tgtcgttaat5281
tacccgtact aaaggtttgg aaaagaaaaa agagaccgcc tcgtttcttt ttcttcgtcg5341
aaaaaggcaa taaaaatttt tatcacgttt ctttttcttg aaattttttt ttttagtttt5401
tttctctttc agtgacctcc attgatattt aagttaataa acggtcttca atttctcaag5461
tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta cttcttgttc attagaaaga5521
aagcatagca atctaatcta aggggcggtg ttgacaatta atcatcggca tagtatatcg5581
gcatagtata atacgacaag gtgaggaact aaaccatggc caagttgacc agtgccgttc5641
cggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggag cggtcgagtt ctggaccgac cggctcgggt5701
tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg ccggtgtggt ccgggacgac gtgaccctgt5761
tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc cggacaacac cctggcctgg gtgtgggtgc5821
gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt cggaggtcgt gtccacgaac ttccgggacg5881
cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg agcagccgtg ggggcgggag ttcgccctgc5941
gcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcg tggccgagga gcàggactga cacgtccgac6001
ggcggcccac gggtcccagg cctcggagat ccgtccccct tttcctttgt cgatatcatg6061
taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag6121
gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta
6181
ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca6241
tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt6301
tgcaagctgg agaccaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag6361
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga6421
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct6481
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc6541
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg6601
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc6661
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca6721
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag6781
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct
6841
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc6901
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga6961
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca7021
cgttaaggga ttttggtcat gagatc
Todas as temperaturas são em graus Celsius. São usadas asseguintes abreviações:
CD32 = FcyRI I
TLR9 = Receptor Toll semelhante 9
Der P1 = Alérgeno maior 1 de Dermatophagoides pteronissyusDer P2 = Alérgeno maior 2 de Dermatophagoides pteronissyus
Der F1 = Alérgeno maior 1 de Dermatophagoides farinae
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<120> Moléculas novas
<130> R 49641
<150> EP 06110672.0
<151> 2006 03 03
<160> 66
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> humano
<400> 1
Cys Pro Arg His Phe Pro Gln Leu His Pro Asp Thr Phe Ser1 5 10
<210> 2<211> 16<212> PRT
<213> humano
<400> 2
Leu Thr His Leu Ser Leu Lys Tyr Asn Asn Leu Thr Val Val Pro Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> humano
<400> 3
Ala Asn Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Val Gly Gly Asn Cys Arg1 5 10 15
Arg Cys Asp His Ala Pro Asn Pro Cys
20 25
<210> 4<211> 43
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 4
Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1 5 10 15
Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala
20 25 30
Gln Pro Gln Arg Tyr Cys Arg His Tyr Trp Thr
35 40
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 5
Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1 5 10 15
Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu
20 25 30
<210> 6<211> 13
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 6
Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile
1 5 10
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 7
Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp1 5 10 15
Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu
20 25
<210> 8<211> 25
<212> PRT
<213> Dermatophàgoides pteronyssinus
<400> 8
Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn1 5 10 15
Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr
20 25
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 9
Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe1 5 10 15
Glu Ala Asn
<210> 10<211> 19
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 10
Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val1 5 10 15
Val Val Thr
<210> 11<211> 22<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 11
Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu1 5 10 15
Ala Cys Ala Ile Ala Thr20
<210> 12<211> 22<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 12
Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr1 5 10 15
Cys Gln Ile Tyr Pro Pro20
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 13
Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu1 5 10 15
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 14
Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Pro Gln Arg Tyr Cys Arg His Tyr Trp1 5 10 15
Thr
<210> 15<211> 36
<212> DNA
<213> humano
<400> 15
aaacgggcag atgctgcacc aactgtatcc atcttc
<210> 16
<211> 164
<212> PRT
<213> humano
<400> 16
Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Gln1 5 10 15
Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys
20 25 30
Gln Ile Tyr Pro Pro Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn
35 40 45
Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Glu Asn
50 55 60
Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys65 70 75 80
Ala Ile Ala Thr Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys
85 90 95
Ser Glu Asn Val Val Val Thr Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Pro Gln
100 105 110
Arg Tyr Cys Arg His Tyr Trp Thr Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys
115 120 125
Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Arg Thr Val Thr Pro
130 135 140
Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val145 150 155 160
Ala Ala Thr Glu<210> 17<211> 28<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucléotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epitopo do alérgeno<400> 17
tccggatgcc aaatttaccc gccaaacg 28
<210> 18<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epitopo do alérgeno<400> 18
agcctctctg atcttgttcg cgtttggcgg gtaaatttgg 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epitopo do alérgeno<400> 19
cgaacaagat cagagaggct ttgcaatctt gcaggaggcc 40
<210> 20<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando<400>
tatgccgaat<210><211><212><213><220><223>
<400>
gcgcagagat<210><211><212><213><220><223>
<400>
gtacgcccat<210><211><212><213><22 0><223>
<400>
cccatacgat<210><211>
epítopo do alérgeno20
ctctgcgcat tgggcctcct gcaagattgc 40
2140DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotideo para geraçãod e gene sintético codificandoepítopo do alérgeno21
tcggcatatc caactactgc cagatctacc 40
2240DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificandoepítopo do alérgeno22
cgtatggggg gtagatctgg cagtagttgg 40
2340DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificandoepítopo do alérgeno
23
gggcgtacaa tcatacagcg tgataacggc 40
2440<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 24
gcgtggtagt taggctgata gccgttatca cgctgtatga 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 25
tatcagccta actaccacgc cgtgaacatc gtcggctacg 40
<210> 26<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 26
tcacagtaac cacgacattc tcgtagccga cgatgttcac 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 27
agaatgtcgt ggttactgtg aaggtaatgg gcgatgacgg 40
<210> 28<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 28
agctatggcg caagctagaa ccccgtcatc gcccattacc 40
<210> 2 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 29
tctagcttgc gccatagcta ccaagtacac ttggaacgta 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 30
ttttcggcgc aattttgggt acgttccaag tgtacttggt 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 31
cccaaaattg cgccgaaaag tgaaaacgtc gtagtgacca 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 32
tgagccaatg cctcccttat ggtcactacg acgttttcac 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 33
agggaggcat tggctcaacc tcaaagatac tgcagacact 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 34ttatgcaggg<210><211><212><213><220><223>
<400>
actggacgcc<210><211><212><213><220><223>
<400>
cttcgaacac<210><211><212><213><220><223>
<400>
acttgaggca<210><211><212><213>
cgtccagtag tgtctgcagt atctttgagg 40
3540DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificandoepitopo do alérgeno
35
ctgcataatc caccgtggta aaccctttca 40
3640DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificandoepitopo do alérgeno
36
tgcctcaagt tgaaagggtt taccacggtg 40
3740DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificandoepitopo do alérgeno
37
gtgttcgaag ctaacaggac ggtaacgcca 40
3840DNA
Seqüência artificial<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 38
ccgcacccac cttgcatacg aattggcgtt accgtcctgt 40
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 39
tgcaaggtgg gtgcgggtct tgttgggctt tttctggtgt 40
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo para geraçãod e gene sintético codificando
epítopo do alérgeno<400> 40
actagtttat tcagtagcag ccacaccaga aaaagcccaa ca 42
<210> 41
<211> 6<212> PRT
<213> humano
<400> 41
Lys Arg Ala Pro Arg Glu1 5<210> 42
<211> 18<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Mutação silenciosa para introduzir sítio XhoI único
<400> 42
aaacgggctc ctcgagaa
<210> 43
<211> 219
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência completa de uma proteína de fusão VL-CH3
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Thr
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Val Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Ser Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
115 120 125
Glu Leu Gly Ile Ala Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
130 135 140
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu145 150 155 160
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
165 170 175
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Arg Trp Thr Leu Gly180 185 190
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
195 20Ò 205
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215
<210> 44
<211> 681<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de ácido nucléico de proteína de fusão VL-CH3
<400> 44
gaattcgaca ttgtgatgac ccaggctgca ccctctgtac ctgtcactcc tggagagtcagtatccatct cctgcaggtc tagtaagagt ctcctgcata ctaatggcaa cacttacttgcattggttcc tacagaggcc aggccagtct cctcagctcc tgatatatcg gatgtccgtccttgcctcag gagtcccaga caggttcagt ggcagtgggt caggaactgc tttcacactgagcatcagta gagtggaggc tgaggatgtg ggtgtttttt actgtatgca acatctagaatatccgctca cgttcggtgc tgggaccaag ctggaactga aacgggctcc tcgagaaccacaggtgtaca ccctgccccc atcccgggac gagctcggca tcgcgcaagt cagcctgacctgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacgggcagccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc tttcttcctctacagcaagc ttaccgtgtt gggccgcagg tggaccctgg ggaacgtctt ctcatgctccgtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctccgggtaaatgagggc gcgccggtacc<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Parte da cadeia pesada de domínio CH3
<400> 45
Ala Lys Thr Arg Glu Pro
1 5
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CH3 com mutação silenciosa para introduzir sítio XhoI
<400> 46
gccaaaactc gagaacca
<210> 47
<211> 250
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> seqüência completa de uma proteína de fusão VL-CH3
<400> 47
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Pro Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Asp Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Arg Glu Pro Gln Val115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Gly Ile Ala Gln Val Ser130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Leu Gly Arg Arg Trp Thr Leu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser210 215 220
Pro Gly Lys Ser Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn225 230 235 240
Ser Ala Val Asp His His His His His His 245 250
<210> 48
<211> 759
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de ácido nucléico da proteína de fusão CH-CH3 completa
<400> 48
gaattcgagg ttcagcttca gcagtctgga cctgagctga agaagcctgg agagacagtc 60
aagatctcct gcaaggcttc tgggtatacc ttcacaaact atggaatgaa ctgggtgaag 120
caggctccag gaaagggttt aaagtggatg ggctggttaa acacctacac tggagagtca 180
atatatcctg atgacttcaa gggacggttt gccttctctt cggaaacctc tgccagcact 240
gcctatttgc agatcaacaa cctcaaaaat gaggacatgg ctacatattt ctgtgcaaga 300ggggactatg gttacgacga ccctttggac
tcctcagcca aaactcgaga accacaggtg
ggcatcgcgc aagtcagcct gacctgcctg
gtggagtggg agagcaacgg gcagccggag
gactccgacg gctctttctt cctctacagc
ctggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatct
ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer 4.3HupEco para amplificação do PCR
<400> 49
cagagaattc gaggttcagc ttcagcagtc 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer 4.3HDOWNXHO para amplificação do PCR
<400> 50
gatgctcgag ttttggctga ggagacggtg 30
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer CH3UPXHOA para amplificação do PCR
<400> 51
aaaactcgag aaccacaggt gtacaccctg cc 32
tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tacaccctgc ccccatcccg ggacgagctc 420
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 480
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540
aagcttaccg tgttgggccg caggtggacc 600
catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660
ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat 720
catcattga 759<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer CH3XBA2 para amplificação do PCR
<400> 52
actgatctag acctttaccc ggagacaggg agag
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer 4.3LUPECO para amplificação do PCR
<400> 53
gatagaattc gacattgtga tgacccaggc tg
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer 4.3LDOWNXHO para amplificação do PCR
<400> 54
attactcgag gagcccgttt cagttccagc t
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> primer CH3UPXHOB para amplificação do PCR
<400> 55
gctcctcgag aaccacaggt gtacaccctg cc5643DNA
Seqüência artificial
<210><211><212><213><220>
<223> primer CH3STOPKPN para amplificação do PCR
<400> 56
acgtggtacc tcaggcgcgc cctttacccg gagacaggga gag<210> 57
32DNA
Seqüência artificial
43
<211><212><213><220>
<223> primer EpiTLRl para amplificação do PCR
<400> 57
taaagggcgc gcctccggat gccaaattta cc<210> 58
35DNA
Seqüência artificial
32
<211><212><213><220>
<223> primer EpiTLR2 para amplificação do PCR
<400> 58
tacctcaggc gcgccttatt cagtagcagc cacac<210> 59
114PRT
Seqüência artificial
35
<211><212><213><220><223><400>
Produção de anticorpo recombinante59
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly15 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Thr
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Val Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Ser Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105 110
Arg Ala
<210> 60
<211> 342
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência de ácido nucléico de anticorpo recombinante produzido
<400> 60
gacattgtga tgacccaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catactaatg gcaacactta cttgcattgg 120
ttcctacaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc cgtccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcággaa ctgctttcac actgagcatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt ttttactgta tgcaacatct agaatatccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggaa ctgaaacggg ct 342
<210> 61
<211> 123
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> Produção de anticorpo recombinante
<400> 61
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Pro Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Asp Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
115 120
<210> 62<211> 369
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de ácido nucléico de anticorpo recombinante produzido
<400> 62
gaggttcagc ttcagcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ttaaacacct acactggaga gtcaatatat 180cctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tcttcggaaa cctctgccag cactgcctat 240ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtgc aagaggggac 300tatggttacg acgacccttt ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360gccaaaaca 369<210> 63
<211> 6537
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> vetor de expressão final contendo versões ligantes TLR9 e CD32<400> 63
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960
tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1020
agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1080
tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1140
tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc 1200
tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga 1260
gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg 1320
ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttaaaca cctacactgg 1380
agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg acggtttgcc ttctcttcgg aaacctctgc 1440
cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catatttctg 1500tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt 1560caccgtctcc tcagccaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga 1620tgagctgggc atcgcgcaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga 1680catcgccgtg gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1740cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag 1800gtggaccctg gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1860cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatctcta gaacaaaaac tcatctcaga 1920agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt gtagccttag 1980acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct 2040aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt 2100ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga 2160gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa 2220aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat 2280taagtgagac cttcgtttgt gcagatccaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct 2340ttttgccatc cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg 2400ggatacacta gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac 2460ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc 2520aattccttct attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc 2580tggcgaggtt catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc. tccgcattac acccgaacat 2640cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc 2700caaaactgac agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc 2760aagatgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc 2820caaaagtcgg cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc 2880tcattaatgc ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa 2940cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt 3000ccaagattct ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt 3060ctaaccccta c.ttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt 3120tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt 3180tgattttaac gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa 3240cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg 3300ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg 3360gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa 3420ataacgggtt attgtttata aatactactatatctctcga gaaaagagag gctgaagctgcctctgtacc tgtcactcct ggagagtcagtcctgcatac taatggcaac acttacttgcctcagctcct gatatatcgg atgtccgtccgcagtgggtc aggaactgct ttcacactgagtgtttttta ctgtatgcaa catctagaattggaactgaa acgggctcct cgagaaccacagctgggcat cgcgcaagtc agcctgaccttcgccgtgga gtgggagagc aacgggcagctgctggactc cgacggctct ttcttcctctggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccgcgcagaagag cctctccctg tctccgggtagcggccgcca gctttctaga acaaaaactcgaccatcatc atcatcatca ttgagtttgtgttgggcact tacgagaaga ccggtcttgccatttgcctg agagatgcag gcttcattttataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttctcgcagctga tgaatatctt gtggtaggggtcttggtatt tcccactcct cttcagagtaggatccccca cacaccatag cttcaaaatgtctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactttccctctttc ttcctctagg gtgtcgttaaáagagaccgc ctcgtttctt tttcttcgtctctttttctt gaaatttttt tttttagttttaagttaata aacggtcttc aatttctcaaaacttttttt acttcttgtt cattagaaaggttgacaatt aatcatcggc atagtatatctaaaccatgg ccaagttgac cagtgccgttgcggtcgagt tctggaccga ccggctcggggccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctgccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg
ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg 3480
aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac 3 540
tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc 3600
attggttcct acagaggcca ggccagtctc 3660
ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg 3720
gcatcagtag agtggaggct gaggatgtgg 3780
atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc 3840
aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 3900
gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 3 960
cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 4020
acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt 4080
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 4140
aagggcgcgc ctgaggtacc tcgagccgcg 4200
atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc 4260
agccttagac atgactgttc ctcagttcaa 4320
tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc 43 80
tgatactttt ttatttgtaa cctatatagt 4440
tcgtacgagc ttgctcctga tcagcctatc 4500
tttgggaaaa tcattcgagt ttgatgtttt 4560
cagaagatta agtgagacct tcgtttgtgc 4620
tttctactcc ttttttactc ttccagattt 4680
caaaacaccc aagcacagca tactaaattt 4740
ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa 4800
gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt 4860
ttttctcttt cagtgacctc cattgatatt 4920
gtttcagttt catttttctt gttctattac 4980
aaagcatagc aatctaatct aaggggcggt 5040
ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac 5100
ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga 5160
ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc 5220
ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg 52 80
cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg 5340tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc 5400
gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc 5460
gtggccgagg agcaggactg acacgtccga cggcggccca cgggtcccag gcctcggaga 5520
tccgtccccc ttttcctttg tcgatatcat gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg 5580
ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt 5640
ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt 5700
tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga 5760
gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcaagctg gagaccaaca tgtgagcaaa 5820
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 5880
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 5940
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 6000
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 6060
tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 6120
tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 6180
gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 6240
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 6300
cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 6360
agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 6420
caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 6480
ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagatc 6537
<210> 64
<211> 7046
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Vetor de expressão final contendo versões ligantes TLr9 e CD32 e
seqüência de epítopo
<400> 64
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960
tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1020
agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1080
tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1140
tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc 1200
tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agcctggaga 1260
gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg 1320
ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttaaaca cctacactgg 1380
agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg acggtttgcc ttctcttcgg aaacctctgc 1440
cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catatttctg 1500
tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt 1560
caccgtctcc tcagccaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga 1620
tgagctgggc atcgcgcaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga 1680
catcgccgtg gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1740
cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag 1800
gtggaccctg gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1860
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatctcta gaacaaaaac tcatctcaga 1920
agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt gtagccttag 1980
acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct 2040
aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt 2100
ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga 2160gcttgctcct gatcagccta tctcgcagctaatcattcga gtttgatgtt tttcttggtataagtgagac cttcgtttgt gcagatccaattttgccatc cgacatccac aggtccattcggatacacta gcagcagacc gttgcaaacgccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagtaattccttct attaggctac taacaccatgtggcgaggtt catgtttgtt tatttccgaacactccagat gagggctttc tgagtgtgggcaaaactgac agtttaaacg ctgtcttggaaagatgaact aagtttggtt cgttgaaatgcaaaagtcgg cataccgttt gtcttgtttgtcattaatgc ttagcgcagt ctctctatcgcgcaaatggg gaaacacccg ctttttggatccaagattct ggtgggaata ctgctgatagctaaccccta cttgacagca atatataaactttttatcat cattattagc ttactttcattgattttaac gacttttaac gacaacttgacgatgagatt tccttcaatt tttactgctgctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaagttactcaga tttagaaggg gatttcgatgataacgggtt attgtttata aatactactatatctctcga gaaaagagag gctgaagctgcctctgtacc tgtcactcct ggagagtcagtcctgcatac taatggcaac acttacttgcctcagctcct gatatatcgg atgtccgtccgcagtgggtc aggaactgct ttcacactgagtgtttttta ctgtatgcaa catctagaattggaactgaa acgggctcct cgagaaccacagctgggcat cgcgcaagtc agcctgaccttcgccgtgga gtgggagagc aacgggcagctgctggactc cgacggctct ttcttcctctgatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaà 2220tttcccactc ctcttcagag tacagaagat 2280catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct 2340tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg 2400caggacctcc actcctcttc tcctcaacac 2460tattgggctt gattggagct cgctcattcc 2520actttattag cctgtctatc ctggcccccc 2580tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat 2640gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc 2700acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc 2760ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc 2 820gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc 2 880cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa 2 940gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt 3 000cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt 3 060agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt 3120aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt 3180gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa 3240ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg 3300cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg 33 60ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa 3420ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg 3480aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac 3540tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc 3600attggttcct acagaggcca ggccagtctc 3660ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg 3720gcatcagtag agtggaggct gaggatgtgg 3780atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc 3840aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 3900gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 3960cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 4020acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt 4080ggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccgcgcagaagag cctctccctg tctccgggtacgccaaacgc gaacaagatc agagaggcttgattcggcat atccaactac tgccagatctagcgtgataa cggctatcag cctaactacctcgtggttac tgtgaaggta atgggcgatgagtacacttg gaacgtaccc aaaattgcgcgggaggcatt ggctcaacct caaagatactaccgtggtaa accctttcaa cttgaggcagttcgtatgca aggtgggtgc gggtcttgttaaggcgcgcc tgaggtacct cgagccgcggtctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcggccttagaca tgactgttcc tcagttcaagagattctaat caagaggatg tcagaatgccgatacttttt tatttgtaac ctatatagtacgtacgagct tgctcctgat cagcctatctttgggaaaat cattcgagtt tgatgtttttagaagattaa gtgagacctt cgtttgtgcgttctactcct tttttactct tccagattttaaaacaccca agcacagcat actaaatttttacccgtact aaaggtttgg aaaagaaaaaaaaaaggcaa taaaaatttt tatcacgttttttctctttc agtgacctcc attgatattttttcagtttc atttttcttg ttctattacaaagcatagca atctaatcta aggggcggtggcatagtata atacgacaag gtgaggaactcggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggagtctcccggga cttcgtggag gacgacttcgtcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgcgcggcctgga cgagctgtac gccgagtggtcctccgggcc ggccatgacc gagatcggcggcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcgtgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 4140aagggcgcgc ctccggatgc caaatttacc 4200tgcaatcttg caggaggccc aatgcgcaga 4260accccccata cgatgggcgt acaatcatac 4320acgccgtgaa catcgtcggc tacgagaatg 4380acggggttct agcttgcgcc atagctacca 4440cgaaaagtga aaacgtcgta gtgaccataa 4500gcagacacta ctggacgccc tgcataatcc 4560tgttcgaagc taacaggacg gtaacgccaa 4620gggctttttc tggtgtggct gctactgaat 4680cggccgccag ctttctagaa caaaaactca 4740accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 4800ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 4860atttgcctga gagatgcagg cttcattttt 4920taggattttt tttgtcattt tgtttcttct 4980cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt 5040cttggtattt cccactcctc ttcagagtac 5100gatcccccac acaccatagc ttcaaaatgt 5160ctcggactcc gcgcatcgcc gtaccacttc 5220ccctctttct tcctctaggg tgtcgttaat 5280agagaccgcc tcgtttcttt ttcttcgtcg 5340ctttttcttg aaattttttt ttttagtttt 5400aagttaataa acggtcttca atttctcaag 5460acttttttta cttcttgttc attagaaaga 5520ttgacaatta atcatcggca tagtatatcg 5580aaaccatggc caagttgacc agtgccgttc 5640cggtcgagtt ctggaccgac cggctcgggt 5700ccggtgtggt ccgggacgac gtgaccctgt 5760cggacaacac cctggcctgg gtgtgggtgc 5820cggaggtcgt gtccacgaac ttccgggacg 5880agcagccgtg ggggcgggag ttcgccctgc 5940tggccgagga gcaggactga cacgtccgac 6000ggcggcccac gggtcccagg cctcggagat ccgtccccct tttcctttgt cgatatcatg 6060
taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag 6120
gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta 6180
ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca 6240
tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt 6300
tgcaagctgg agaccaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 6360
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 6420
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 6480
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 6540
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 6600
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 6660
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 6720
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 6780
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 6840
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 6900
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 6960
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 7020
cgttaaggga ttttggtcat gagatc 7046<210> 65<211> 12<212> PRT<213> humano<400> 65
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe
1 5 10
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> humano
<400> 66
aaacgggctg atgctgcâcc aactgtatcc atcttc 36

Claims (30)

1. Molécula ou complexo de moléculas capaz de ligar a TLR9 ea CD32 compreendendo no mínimo um epitopo de no mínimo um antígeno.
2. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizada pelo fato de que o epitopo é um epitopo de células T.
3. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o epitopo éderivado de um alérgeno.
4. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que no mínimo umepitopo é ligado de modo não covalente à molécula.
5. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que no mínimo umepitopo é ligado de modo não covalente à região de ligação de TLR9 e/ouCD32.
6. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com a reivin-dicação 5, caracterizada pelo fato de que no mínimo um epitopo é ligado àregião de ligação de TLR9 e/ou CD32 através de interação com anticorpoe/ou interação com ligante.
7. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o epitopo éproduzido a partir de no mínimo um trecho de DNA contendo epitopo de cé-lulas T de um antígeno ou um peptídeo sintético.
8. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o epitopo éselecionado entre o gropo consistindo em alérgenos em dermatite atópica,asma alérgica, rinite alérgica ou conjuntivite alérgica.
9. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o epitopo éisolado entre antígenos completos, antígenos desnaturados ou antígenosmodificados para prevenir ligação a IgE.
10. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compre-ende no mínimo um anticorpo ou derivado ou fragmento dos mesmos.
11. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com a reivin-dicação 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento ou deri-vado dos mesmos é IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD.
12. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é de es-trutura humana ou humanizada.
13. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que é de es-trutura murina ou parcialmente murina.
14. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é de es-trutura de camelo ou parcialmente camelo.
15. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que compre-ende no mínimo um arcabanço de ligação produzido.
16. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com a reivin-dicação 15, caracterizada pelo fato de que o arcabanço de ligação é sele-cionado entre o grupo consistindo em fibronectina III, lipocalinas, Proteína A,inibidor de α-amilase, proteínas de repetição de Ankyrin, um domínio C2, umΑ-domínio, um domínio tipo EGFR, um dab, um chi-bAb, CTLA-4, gama cris-talino e qualquer outra proteína.
17. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que compre-ende no mínimo uma parte de um domínio de imunoglobulina mutado pe-queno (SMID).
18. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que compre-ende no mínimo parte de um anticorpo anti-CD32 ou derivado ou fragmentodos mesmos.
19. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 18 compreendendo uma seqüência de a-minoácidos de SEQ ID No 59 ou parte da mesma.
20. Molécula ou complexo de moléculas de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 19 compreendendo uma seqüência de a-minoácidos de SEQ ID No 61 ou parte da mesma.
21. Composição farmacêutica compreendendo no mínimo umamolécula ou complexo de moléculas como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 opcionalmente junto com no mínimo um veículo oudiluente farmaceuticamente aceitável.
22. Uso de uma composição farmacêutica como definida na rei-vindicação 21 para imunoterapia ativa.
23. Método para tratar alergias em que uma quantidade profilati-camente ou terapeuticamente eficaz de no mínimo uma molécula ou com-plexo de moléculas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20é administrada a um indivíduo que necessite de semelhante tratamento op-cionalmente junto com no mínimo um veículo farmaceuticamente aceitável.
24. Uso de no mínimo uma molécula ou complexo de moléculascomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para a fabricaçãode um medicamento para o tratamento de alergias.
25. Processo para produzir uma molécula ou complexo de molé-culas como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, usandotécnica recombinante em que os genes codificando para as estruturas deligação para TLR9, CD32 e o epitopo são construídos em um vetor e ex-pressados em uma células hospedeira.
26. Vetor de ácido nucléico para expressão de uma moléculacomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, compreendendoa seqüência de ácido nucléico de SEQ ID No 60.
27. Vetor de ácido nucléico para expressão de uma moléculacomo definida em quaisquer das reivindicações 1 a 20, compreendendo aseqüência de ácido nucléico de SEQ ID No 62.
28. Vetor de ácido nucléico para expressão de uma moléculacomo definida em quaiquer das reivindicações 1 a 20, compreendendo aseqüência de ácido nucléico de SEQ ID No 63.
29. Vetor de ácido nucléico para expressão de uma moléculacomo definida em quaiquer das reivindicações 1 a 20, compreendendo aseqüência de ácido nucléico de SEQ ID No 64.
30. Processo para produzir uma molécula ou complexo de molé-culas como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, usandoreticulação química.
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