NUEVA SAL DE CITRATO DE UN DERIVADO DE INDOL Y SU USO FARMACEUTICO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sal nueva farmacéuticamente aceptable de 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo, el citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo, un proceso para su preparación, formulaciones farmacéuticas que contienen dicha sal y el uso de dicha sal activa en terapia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lfí-indol-5-carbonitrilo como base libre y su sal de clorhidrato se describen en WO 03/082853. Este compuesto es útil debido a que posee actividad farmacológica ya que presenta efecto inhibitorio sobre la GSK3 (WO 03/082853) . Este compuesto se podría usar para tratar la enfermedad de Alzheimer, las demencias, las enfermedades neurodegenerativas crónicas y agudas, los trastornos bipolares, la esquizofrenia, la diabetes, la pérdida del cabello, los trastornos óseos y todos los trastornos mencionados descritos en WO 03/082853, que se incorpora en esta especificación por referencia. La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) es una proteína serina-treonina quinasa compuesta de dos isoformas (a y ß) ,
REF. : 194846
que son codificadas por genes diferentes pero que tienen una gran homología dentro del dominio catalítico. La GSK3 se expresa mucho en el sistema nervioso central y periférico. La GSK3 fosforila a varios sustratos, entre ellos, tau, ß-catenina, glucógeno sintasa, piruvato deshidrogenasa y el factor de iniciación de la elongación 2b (eIF2b) . La insulina y los factores de crecimiento activan a la proteína quinasa B, que fosforila a la GSK3 en el residuo de serina 9 y la inactiva . Enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés) , demencias y taupatias . La AD se caracteriza por disminución cognitiva, disfunción colinérgica y muerte neuronal, ovillos neurofibrilares y placas seniles que consisten en depósitos ß-amiloides. La secuencia de estos sucesos en la AD es poco clara, pero se cree que está relacionada. La glucógeno sintasa quinasa 3ß (GSK3 ) o quinasa fosforilante de tau fosforila selectivamente a la proteína tau asociada a los microtúbulos de las neuronas en los sitios que están hiperfosforilados en los cerebros con AD. La proteína tau hiperfosforilada tiene menor afinidad por los microtúbulos y se acumula como filamentos helicoidales apareados, que son los componentes principales que constituyen los ovillos neurofibrilares y las hebras de neuropilo en los cerebros con AD. Esto provoca la despolimerización de los microtúbulos, que conduce a
degeneración axonal de inicio distal y progresión proximal ("dying back") y distrofia neurítica. Los ovillos neurofibrilares se encuentran sistemáticamente en enfermedades como la AD, la esclerosis lateral amiotrófica, el parkinsonismo-demencia de Guam, la degeneración corticobasal , la demencia pugilística y el traumatismo craneoencefálico, el síndrome de Down, el parkinsonismo postencefalítico, la parálisis supranuclear progresiva, la enfermedad de Niemann-Pick y la enfermedad de Pick. La adición de proteína ß-amiloide a cultivos primarios de hipocampo produce la hiperfosforilación de tau y un estado semejante a filamentos helicoidales . apareados a través de la inducción- de la actividad de la GSK3 , seguida de la interrupción del transporte axonal y la muerte neuronal (Imahori y Uchida., J. Biochem 121:179-188, 1997). La GSK3 marca preferentemente los ovillos neurofibrilares y se ha demostrado que es activa en las neuronas pre-ovillo en cerebros con AD. Los niveles de proteína GSK3 también están aumentados en un 50 % en el tejido cerebral de pacientes con AD. Además, la GSK3fi fosforila la piruvato deshidrogenasa, una enzima clave en la vía glucolítica y evita la conversión del piruvato en acetil-Co-A (Hoshi et al., PNAS 93:2719-2723, 1996). La acetil-Co-A es fundamental para la síntesis de la acetilcolina , un neurotransmisor con funciones cognitivas. La acumulación de ß-amiloide es un fenómeno precoz de la AD. Los ratones
transgénicos de GSK muestran niveles superiores a los normales de ß-amiloide en el cerebro. También ratones PDAPP alimentados con litio presentaron menores niveles de ß-amiloide en el hipocampo y menos área de placa amiloide (Su et al., Biochemistry 2004, 43:6899-6908) . Por consiguiente, la inhibición de la ???3ß puede tener efectos beneficiosos en el progreso de la enfermedad de Alzheimer asi como en los déficits cognitivos asociados con esta enfermedad y en otras enfermedades mencionadas precedentemente. Enfermedades neurodegenerativas crónicas y agudas Se demostró que la activación de la vía PI3K/Akt mediada por el factor de crecimiento desempeña una función clave en la supervivencia neuronal. La activación de esta vía produce la inhibición de la GSK3p. Estudios recientes (Bhat et al., PNAS 97:11074-11079 (2000) indican que la actividad de GSK3p está aumentada en los modelos celulares y animales de neurodegeneración como la isquemia cerebral o posterior a la privación del factor de crecimiento. Por ejemplo, la fosforilación del sitio activo estaba aumentada en las neuronas vulnerables a apoptosis, un tipo de muerte celular que comúnmente se pensaba que ocurría en las enfermedades degenerativas crónicas y agudas como los trastornos cognitivos, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de
Huntington y la demencia por VIH y la lesión cerebral traumática; y como en el accidente cerebrovascular isquémico. El litio fue neuroprotector al inhibir la apoptosis en las células y en el cerebro a las dosis que produjeron la inhibición de la ????ß. Por lo tanto los inhibidores de la GSK33 podrían ser útiles al atenuar el curso de las enfermedades neurodegenerativas. Trastornos bipolares (BD, por sus siglas en inglés) Los trastornos bipolares se caracterizan por episodios maníacos y episodios depresivos. Se ha utilizado litio para tratar los BD basándose en sus efectos de estabilización del humor. La desventaja del litio es la estrecha ventana terapéutica y el peligro de sobredosis que puede conducir a la intoxicación con litio. El descubrimiento de que el litio inhibe la GSK3 a las concentraciones terapéuticas planteó la posibilidad de que esa enzima constituya un objetivo clave de la acción del litio en el cerebro (Stambolic et al., Curr. Biol. 6:1664-1668, 1996; Klein y Melton; PNAS 93:8455-8459, 1996; Gould et al., Neuropsychopharmacology , 1:32-8, 2004) . Se demostró que el inhibidor de la GSK3 reduce el tiempo de inmovilización en la prueba de nado forzado, un modelo para evaluar el comportamiento depresivo (O'Brien et al., J Neurosci 2004, 24:66791-6798) La GSK3 se asoció con un polimorfismo encontrado en el trastorno bipolar II ( Szczepankiewicz et al., Neuropsychobiology . 2006;5 3(1) : 51-
6) . La inhibición de la GSK3 puede, por consiguiente, ser de importancia terapéutica en el tratamiento del BD asi como en los pacientes con AD que padecen trastornos afectivos. Esquizofrenia La acumulación de pruebas implica la actividad anormal de la GSK3 en los trastornos del humor y la esquizofrenia. La GSK3 participa en las cascadas de transducción de señales de varios procesos celulares, en particular durante el desarrollo neural. Kozlovsky et al (Am J Psychiatry mayo de 2000; 157 (5) : 831-3) encontraron que los niveles de GS-?ß eran 41 % inferiores en los pacientes esquizofrénicos que en los sujetos de comparación. Este estudio indica que la esquizofrenia implica una patología del desarrollo nervioso y que la regulación anormal de la GSK3 podría tener un papel en la esquizofrenia. Además, se ha informado de niveles reducidos de ß-catenina en pacientes que presentan esquizofrenia (Cotter et al., Neuroreport 9:1379-1383 (1998 )). Los antipsicóticos atípicos como olanzapina, clozapina, quetiapina y ziprasidona, inhiben la GSK3 al aumentar la fosforilación de ser9 lo que sugiere que los antipsicóticos pueden ejercer sus efectos beneficiosos a través de la inhibición de la GSK3 (Rosborough et al., Int J Neuropsychopharmacol , 4:1-13 2006). Diabetes La insulina estimula la síntesis de glucógeno en los músculos esqueléticos a través de la desfosforilación y por lo
tanto la activación de la glucógeno sintasa. En condiciones de reposo, la GSK3 fosforila e inactiva a la glucógeno sintasa a través de la desfosforilación. La GSK3 también se sobreexpresa en los músculos de los pacientes con diabetes tipo II (Nikoulina et al., Diabetes feb de 2000; 49 (2) : 263-71) . La inhibición de la GSK3 aumenta la actividad de la glucógeno sintasa disminuyendo de ese modo los niveles de glucosa mediante su conversión en glucógeno. En los modelos animales de diabetes, los inhibidores de la GSK3 redujeron los niveles plasmáticos de glucosa hasta en 50 % (Cline et al., Diabetes, 2002, 51:2903-2910; Ring et al., Diabetes 2003, 52:588-595). La inhibición de la GSK3 puede ser por consiguiente de importancia terapéutica en el tratamiento de la diabetes tipo I y tipo II y la neuropatía diabética. Alopecia La GSK3 fosforila y degrada a la ß-catenina. La ß-catenina es un efector de la vía para la síntesis de queratonina. La estabilización de la ß-catenina puede provocar que aumente el desarrollo de pelos. Los ratones que expresan una ß-catenina estabilizada mediante la mutación de los sitios fosforilados por la GSK3 experimentan un proceso que se asemeja a la morfogénesis de pelo de novo (Gat et al., Cell 1998 Nov 25; 95 (5): 605-14)) . Los folículos nuevos formaron glándulas sebáceas y papilas dérmicas, que normalmente se establecen sólo en la embriogénesis . Por lo tanto la
inhibición de la GSK3 puede ofrecer un tratamiento para la calvicie . Trastornos y afecciones óseos Los inhibidores de la GSK3 se podrían usar para el tratamiento de trastornos u otras afecciones óseos, que implica la necesidad de nueva y mayor formación ósea. La remodelación del esqueleto es un proceso continuo, controlado por hormonas sistémicas como la hormona paratiroidea (PTH, por sus siglas en inglés) , factores locales (por ejemplo, la prostaglandina E2) , citocinas y otras sustancias biológicamente activas. Dos tipos de células son de importancia fundamental: los osteoblastos (responsable de la formación ósea) y los osteoclastos (responsables de la resorción ósea) . A través del sistema regulador del RANK (receptor activador del factor de transcripción NF-K, ) , el ligando del RANK y la osteoprotegerina estos dos tipos de células interactúan para mantener el recambio óseo normal (Bell NH, Current Drug Targets -Inmune, Endocrine & Metabolic Disorders, 2001, 1:93-102) . La osteoporosis es un trastorno esquelético en el cual una masa ósea baja y el deterioro de la microarquitectura ósea provocan mayor fragilidad ósea y riesgo de fracturas. Para tratar la osteoporosis, las dos estrategias principales son inhibir la resorción ósea o estimular la formación ósea. La mayoría de los fármacos que están actualmente en el mercado
para el tratamiento de la osteoporosis actúan aumentando la masa ósea inhibiendo la resorción ósea osteoclástica . Se admite que un fármaco con la capacidad de aumentar la formación ósea seria de gran valor en el tratamiento de la osteoporosis y asimismo tendría el potencial para mejorar la consolidación de la fractura en los pacientes. El uso de inhibidores de la GSK3 en la osteoporosis primaria y secundaria, donde la osteoporosis primaria incluye la osteoporosis postmenopáusica y la osteoporosis senil tanto en hombres como en mujeres y la osteoporosis secundaria incluye la osteoporosis inducida por cortisona, así como otro tipo de osteoporosis secundaria inducida. Ademas de esto, los inhibidores de la GSK3 también se pueden usar en los tratamientos del mieloma. Los inhibidores de la GSK3 se pueden administrar local o sistémicamente , en diferentes regímenes de formulación, para tratar estas afecciones. Enfermedad inflamatoria El descubrimiento de que los inhibidores de la GSK3 tienen efectos antiinflamatorios ha planteado la posibilidad de usar dichos inhibidores de la GSK3 para la intervención terapéutica en las enfermedades inflamatorias. (Martin et al., Nat Immunol 2005, 6:777-784; rev. en Jope et al., Neurochem Res 2006, Aug 30) . La inflamación es una característica común de una gran variedad de afecciones incluida la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del humor.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El objetivo de la presente invención es proporcionar una sal del compuesto 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo (compuesto (I)), a saber el citrato del 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il] lfí-indol-5-carbonitrilo,
que tiene un efecto inhibidor selectivo sobre la GSK3, una buena biodisponibilidad, una buena solubilidad y un higroscopicidad baja que lo hacen adecuado para ser formulado en formas farmacéuticas. Se encontró que sorprendentemente la sal de citrato del compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la presente invención tiene mayor estabilidad química que la sal de clorhidrato del 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il ] líf-indol-5-carbonitrilo preparada según se describe en WO 03/082853 que la hace particularmente adecuada para ser formulada en formas farmacéuticas . En la formulación de formas farmacéuticas, es importante que el compuesto farmacéuticamente aceptable (el principio
activo) esté en una forma en la cual pueda ser manipulado y procesado convenientemente. Esto es importante, no sólo desde el punto de vista de la obtención de un proceso de fabricación comercialmente viable, sino también desde el punto de vista de la fabricación posterior de formas farmacéuticas que comprendan el principio activo. La estabilidad química, la estabilidad en el estado sólido y "la vida útil" de los principios activos también son factores muy importantes. El fármaco y las formas farmacéuticas que lo contienen deben ser capaces de ser almacenados eficazmente durante períodos prolongados, sin presentar un cambio significativo en las características fisicoquímicas del principio activo, por ejemplo, su composición química, densidad, higroscopicidad y solubilidad. El término "estabilidad química" significa que el compuesto se puede almacenar en forma aislada, o en una formulación en la cual se encuentra mezclado con portadores, diluyentes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables (por ej . , en una forma farmacéutica oral, como un comprimido, una cápsula, etc.), en condiciones de almacenamiento normal, con poca o ninguna degradación o descomposición química. Por lo tanto, en la fabricación de formas farmacéuticas comercialmente viables y farmacéuticamente aceptables es importante, siempre que sea posible, proporcionar el principio activo en una forma sustancialmente cristalina y estable.
Según se usa aquí, la expresión "sustancialmente cristalina" significa al menos aproximadamente 50 % cristalina y variando hasta 100 % cristalina. La presente invención estipula citrato de 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il] lfí-indol-5-carbonitrilo que está al menos aproximadamente 50 Q, en forma cristalina, al menos aproximadamente 60 o en forma cristalina, al menos aproximadamente 70 o en forma cristalina , al menos aproximadamente 80 o o en forma cristalina, al menos aproximadamente 90 o o en forma cristalina , al menos aproximadamente 95 o, en forma cristalina, al menos aproximadamente 98 % en forma cristalina, o aproximadamente 100 % en forma cristalina. FORMAS FARMACÉUTICAS De acuerdo con un aspecto de la presente la invención se proporciona una forma farmacéutica que comprenden la sal de citrato del compuesto (I), 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo, para usar en la prevención y/o el tratamiento de afecciones asociadas con la glucógeno sintasa quinasa-3. La formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, por ejemplo como un comprimido, para inyección parenteral como una solución o suspensión estéril, para administración local en una cavidad corporal o en una cavidad ósea, por ejemplo como una solución o suspensión
inyectable estéril. En general la formulación anterior se puede preparar de manera convencional usando excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las dosis diarias adecuadas de la sal del compuesto de fórmula (I) en el tratamiento de un mamífero, incluido el hombre, son de aproximadamente 0,01 a 250 mg/kg de peso corporal en la administración peroral y de aproximadamente 0,001 a 250 mg/kg de peso corporal en la administración parenteral. La dosis diaria típica de los principios activos varía dentro de un amplio margen y dependerá de diversos factores como la indicación pertinente, la vía de administración, la edad, el peso y el sexo del paciente, y puede ser determinada por un médico. Para el uso veterinario las cantidades de los diferentes componentes, la forma farmacéutica y la dosis del medicamento pueden variar y dependerán de diversos factores como por ejemplo la necesidad individual del animal tratado. Se puede usar una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula (I), tal cual, pero generalmente se administrará como una forma farmacéutica en la cual la sal del compuesto de fórmula (I) (principio activo) está asociada con diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dependiendo de la modalidad de administración, la forma farmacéutica puede contener entre 0,05 y 99 % p (por ciento en peso), por ejemplo entre 0,10 y 50 % p, de principio activo,
basándose todos los porcentajes en peso en la composición total. Un diluyente o portador inerte puede ser agua, poli (etilenglicol ) acuoso, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, un azúcar (como lactosa) , pectina, dextrina, almidón, goma tragacanto, celulosa microcristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio o manteca de cacao . Una formulación de la invención puede estar en forma de comprimido o inyectable. El comprimido puede contener además un desintegrante y/o puede estar recubierto (por ejemplo con un recubrimiento entérico o recubierto con un agente de recubrimiento como hidroxipropilmetilcelulosa ) . La invención estipula además un proceso para la preparación de una forma farmacéutica de la invención que comprende mezclar una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula (I), como la definida precedentemente, con un diluyente o portador inerte farmacéuticamente aceptables . Un ejemplo de una forma farmacéutica de la invención es una solución inyectable que contiene un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable, como la definida precedentemente, y agua estéril y, si fuera necesario, hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para llevar el pH de la formulación final aproximadamente a pH 5, y
opcionalmente un tensioactivo para facilitar la disolución. Un ejemplo de una formulación adecuada es una solución liquida que comprende citrato de 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin- -ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo 5,0 % mg/mL disuelto en agua pura hasta 100 %. USOS MÉDICOS Se encontró, sorprendentemente, que el nuevo citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4 -ilmetil ) piridin-2-il] lfí-indol-5-carbonitrilo definido en la presente invención, es muy adecuado para inhibir la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3). En consecuencia, se espera que dicho compuesto de la presente invención sea útil en la prevención y/o el tratamiento de las afecciones asociadas con la actividad de la glucógeno sintasa quinasa-3, es decir el compuesto se puede usar para producir un efecto inhibitorio de la GSK3 en los mamíferos, incluido el hombre, que necesiten tal prevención y/o tratamiento. La GSK3 se expresa mucho en el sistema nervioso central y periférico y en otros tejidos. Por lo tanto, se espera que el compuesto de la invención sea adecuado para la prevención ylo el tratamiento de las afecciones asociadas con la glucógeno sintasa quinasa-3 en el sistema nervioso central y periférico. En particular, se espera que el compuesto de la invención sea adecuado para la prevención y/o el tratamiento de afecciones asociadas con trastornos cognitivos y estados predementes, especialmente demencia, enfermedad de Alzheimer (AD) , déficit
cognitivo en la esquizofrenia (CDS) , deficiencia cognitiva leve (MCI), deterioro de la memoria asociado con la edad (AAMI), disminución cognitiva relacionada con la edad (ARCD) y trastorno cognitivo sin demencia (CIND) , enfermedades asociadas con ovillos neurofibrilares, demencia frontotemporal (FTD), demencia frontotemporal asociada a Parkinson (FTDP) , parálisis supranuclear progresiva (PSP), enfermedad de Pick, enfermedad de Niemann-Pick, degeneración corticobasal (CBD) , lesión cerebral traumática (TBI) y demencia pugilistica. Una realización de la invención se refiere a la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, especialmente al uso en el retraso de progreso de la enfermedad de Alzheimer. Otras afecciones se seleccionan del grupo que consiste en síndrome de Down, demencia vascular, enfermedad de Parkinson (PD), parkinsonismo postencefalítico, demencia con cuerpos de Lewy, demencia por VIH, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (AL) , enfermedades de la neurona motora (MND) , enfermedad de Creut zfeldt-Jakob y enfermedades por priones. Otras afecciones se seleccionan del grupo que consiste en el trastorno por déficit de atención (ADD) , el trastorno de hiperactividad por déficit de atención (ADHD) y los trastornos afectivos, donde los trastornos afectivos son el trastorno bipolar incluidos la manía aguda, la depresión bipolar y el
mantenimiento bipolar, los trastornos depresivos mayores (MDD) incluida la depresión, la depresión mayor y la estabilización del humor, los trastornos esquizoafectivos incluida la esquizofrenia, y la distimia. Otras afecciones se seleccionan del grupo que consiste en diabetes tipo I, diabetes tipo II, neuropatía diabética, alopecia y enfermedades inflamatorias. Una realización de la invención se refiere a la prevención y/o el tratamiento de los trastornos óseos en los mamíferos. Otro aspecto de la invención apunta al uso del citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il ] lJí-indol-5-carbonitrilo en la prevención y/o el tratamiento de la osteoporosis en los mamíferos. Un aspecto de la invención apunta al uso del citrato de
2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo para promover y/o aumentar la formación ósea en los mamíferos. Un aspecto de la invención apunta al uso del citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo para aumentar la densidad mineral ósea en los mamíferos . Otro aspecto de la invención apunta al uso del citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] lfl-indol-5-carbonitrilo para reducir la tasa de fracturas y/o aumentar la
tasa de consolidación de las fracturas en los mamíferos. Otro aspecto de la invención apunta al uso del citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo para aumentar la formación de hueso canceloso y/o la formación de hueso nuevo en los mamíferos. La dosis requerida para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad particular o de una afección particular variará necesariamente según el huésped tratado, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o la lesión en tratamiento. La presente invención se refiere también al uso del citrato de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] 1H-indol-5-carbonitrilo en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de afecciones asociadas con la glucógeno sintasa quinasa-3. En el contexto de la presente especificación, el término "terapia" también incluye la "prevención" a menos que específicamente se indique lo contrario. Los términos "terapéutico/a" y "terapéuticamente" deben interpretarse en consecuencia. La invención también estipula un método de tratamiento y/o prevención de afecciones asociadas con la glucógeno sintasa quinasa-3 que comprende la administración a un mamífero, hombre o animal, que necesite dicho tratamiento y/o prevención de una cantidad terapéuticamente eficaz de citrato
1
de 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] líí-indol-5-carbonitrilo . MÉTODO DE FORMACIÓN DE SALES La formación de la sal del compuesto de fórmula (I), sal de citrato del 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lJí-indol-5-carbonitrilo, se puede preparar mezclando el 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo con ácido cítrico en presencia de un solvente. El equivalente de ácido cítrico puede variar entre 1 y 3 equivalentes molares. La reacción se puede llevar a cabo en un solvente, los solventes adecuados son éteres como 1,4-dioxano y éter dietílico o alcoholes como metanol, etanol y propanol, o cetonas como acetona e isobutilmetilcetona, o acetatos como el acetato de etilo y acetato de butilo, o ácidos orgánicos como ácido acético, o sus mezclas, usando opcionalmente agua como aditivo. El solvente, que es una mezcla de etanol y agua o ácido acético, es adecuado. El volumen total de solventes usado puede variar entre 1 (v/p) y 100 (v/p) partes en volumen por peso del material de partida, preferentemente entre 10 (v/p) y 45 (v/p) partes en volumen por peso del material de partida. La temperatura de la reacción puede ser entre -30 °C y +150 °C, preferentemente entre -5 °C y +100 °C. El compuesto puro de fórmula (I), citrato de 2-hidroxi-3-
[5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il ] lfí-indol-5-carbonitrilo, se puede obtener por cristalización con o sin un aditivo en solventes apropiados para obtener un sólido cristalino con una pureza de aproximadamente 95 % y preferentemente de aproximadamente 98 %. Otro objetivo de la presente invención es el proceso para la formación de sales como el descrito antes. EJEMPLO DE TRABAJO Los ejemplos siguientes describirán, pero no limitarán, la invención. Ejemplo 1 Sal de citrato del compuesto 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo Se suspendió 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo (5,14 kg, 15,4 mol) en etanol (54 L) a temperatura ambiente. La suspensión se calentó a una temperatura interna de 70 °C y se agregó una solución de ácido cítrico (3, 424 kg, 17,82 mol) en agua (103 L) manteniendo la temperatura interna por encima de 65 °C. La mezcla se calentó a reflujo. Después de esto la solución resultante se mezcló con carbón activado (0,412 kg) y se continuó calentando a reflujo durante 3,5 h después de lo cual la mezcla de reacción se separó por filtración a 83 °C, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante 20 h. Después de la filtración, el precipitado se lavó dos veces con una mezcla fría de
etanol/agua (6,9 L/13,7 L) . El secado al vacío a 50 °C dio 6,648 kg, rendimiento del 82,2 % de citrato de 2-hidroxi-3- [ 5-(morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo con una pureza de al menos 98 %. El contenido de paladio fue menos de 1 ppm y el contenido de cinc fue inferior a 10 ppm. 1H NMR (d6-DMSO, 400 MHz) d 14,7 (br s, 1 H) ; 11,55 (s, 1 H) ; 10,98 (s, 1H) ; 8,31 (s, 1 H) ; 8,08 (br d, J= 1,84Hz, 1H) ; 8,02 (s, 1H) ; 7,90 (br d, J = 8,92Hz, 1 H) ; 7,31 (d, J = 8,0 Hz, 1 H) ; 7,02 (d, J= 8,0Hz); 4,28 (s, 2 H) ; 3,97 (m, 2 H) ; 3,94 (m, 2H) ; 3,35 (m, 9H) ; 3,32 (m, 2H) ppm; 13C NMR (d6-DMSO, 400MHz) 5 168,9; 148,5; 142,7; 139,8; 137,5; 126,4; 124,9; 124,8; 120,9; 119,4; 118,4; 113,3; 109,0; 101,6; 85,7; 63,1; 55,5; 50,3; 40,1; 39,9; 39,7; 39,2; 39,0; 38,8 ppm; MS (ES) m/z [M++l] 335. Los cristales se analizaron por difracción de rayos X de polvo (XRPD) . El difractograma de la forma A muestra los valores d siguientes informados en Angstroms e intensidades relativas: 12,7(vs); 7,6(w); 6,8(vs); 6,3(s); 5,9(w); 5,7(m); 5,l(m); 4,87(w); 4,57(m); 4,38(s); 4,23(s); 4,16(w); 4,07(m); 3,80(w); 3,69(m); 3,65(w); 3,41(m); 3,37(w); 3,32(m); 3,17(m); 3,12(m); 2,88(w); 2,86(m); 2,78(w); 2,65(w); 2,50(w); 2,45(w).
Los valores d significativos informados en Angstroms e intensidades relativas son: 12,7(vs); 6,8 (vs); 6,3(s); 4, 38 (s) ; 4,23 (s) ; 3, 41 (m) .
La cristalinidad del citrato de 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo se analizó usando difracción de rayos X de polvo (XRPD) según se describe a continuación: Los picos, identificados con valores d calculados a partir de la fórmula de Bragg y las intensidades, fueron extraídos del difractograma de la sal de citrato cristalina. Sólo se tabularon los picos principales, que son los más característicos, significativos, diferentes y/o reproducibles, pero se pueden extraer otros picos del difractograma, usando métodos convencionales. La presencia de estos picos principales, reproducibles y dentro del límite de error, es en la mayoría de las circunstancias suficiente para establecer la presencia de dicha sal cristalina. Las intensidades relativas (int. reí.) son menos confiables y en vez de valores numéricos se usan las definiciones siguientes: vs (muy fuerte) : >60 % int. reí. s (fuerte) : 23-60 % int. reí. m (media): 9-23 % int. reí. w (débil): 4-9 % int. reí. vw (muy débil) : <4 % int. reí.
Los análisis de difracción de rayos X se llevaron a cabo usando un difractómetro PANalytical X' Pert Pro MPD durante 64 minutos desde 1 a 40° 2T con y sin estándar interno de
referencia. Los ángulos 2T se corrigieron con respecto a los valores del estándar después de lo cual se hizo el cálculo a valores d (valores de distancia) . Los valores d pueden variar en el rango de ±2 en el lugar del último decimal informado. La preparación de muestras se realizó según los métodos corrientes, por ejemplo los descritos en Giacovazzo, C. et al (1995), Fundamentáis of Crystallography, Oxford University Press; Jenkins, R. y Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley e hijos, Nueva York; Bunn, C. . (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, Londres o Klug, H. P. y Alexander, L. E. (1974), X-Ray Difraction Procedures, John Wiley e hijos, Nueva York. FARMACOLOGÍA Determinación de la competencia con el ATP en el ensayo de proximidad de centelleo para la 6SK3P . Ensayo de proximidad de centelleo para la GSK3p. Los experimentos de competencia se llevaron a cabo por duplicado con 10 concentraciones diferentes del inhibidor en placas de microtitulación de fondo transparente (Wallac, Finlandia) . Se agregó un péptido biotinilado como sustrato, Biotina-Ala-Ala-Glu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser (P03H2) -Pro-Gln-Leu (AstraZeneca, Lund) , a una concentración final de 1 µ? en una solución amortiguadora de ensayo que contenia a 1 mU de GSK3P recombinante humana (Universidad de Dundee, Reino
Unido) , ácido morfolinopropanosulfónico 12 mM (MOPS) de pH 7,0, EDTA 0,3 mM, ß-mercaptoetanol al 0,01 %, Brij 35 (un detergente natural) al 0,004 %, glicerol al 0,5 % y 0,5 µg de BSA/25 µ?. La reacción se inició mediante la adición de 0,04 µ?? de [?-33?]??? (Amersham, Reino Unido) y ATP sin marcar a una concentración final de 1 µ? y un volumen de ensayo de 25 µ?. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, cada reacción se terminó por adición de 25 µ? de solución de detención que contenia EDTA 5 mM, ATP 50 µ?, Tritón X-100 al 0,1 % y 0,25 mg de perlas para el ensayo de proximidad de centelleo (SPA) recubiertas con estreptavidina (Amersham, Reino Unido) . Después de 6 horas se determinó la radiactividad en un contador de centelleo liquido (1450 MicroBeta Trilux, Wallac) . Las curvas de inhibición se analizaron por regresión no lineal usando un prisma GraphPad, EE.UU. El valor de Km del ATP para la GSK3P, usado para calcular las constantes de inhibición (Ki) del compuesto, fue de 20 µ?. Se usaron las abreviaturas siguientes: MOPS Ácido morfolinopropanosulfónico EDTA Ácido etilendiaminotetraacético BSA Albúmina sérica bovina ATP Trifosfato de adenosina SPA Ensayo de proximidad de centelleo
GSK3 Glucógeno sintasa quinasa-3 Resultados El valor de Ki para el citrato de 2-hidroxi-3- [ 5-(morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo de la presente invención están en el rango de 0,001 nM a 300 nM. ESTABILIDAD QUÍMICA Higroscopicidad Análisis de sorción dinámica de vapor (DVS) Los estudios se llevaron a cabo usando un aparato de sorción dinámica de vapor (DVS, Sistemas de Medición de Superficies, Londres, Reino Unido) . El aparato consiste en una microbalanza Cahn alojada dentro de un gabinete controlado por temperatura. Todos los experimentos se realizaron a 25 °C. El DVS se usó para caracterizar la captación de humedad (p/p %) a diferentes humedades relativas (HR) . Las muestras (5-10 mg) se pesaron directamente en la cubeta para muestras del DSV y se expusieron a diferentes humedades relativas. Resultados Muestra Humedades relativas (HR) 40 % 60 % 80 % HC1 8,7 11,5 13,0 Citrato 7,1 7,6 8,0
Surge claramente de los resultados anteriores que la sal de citrato de 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-
il] lJí-indol-5-carbonitrilo tiene menor higroscopicidad que la sal de clorhidrato y es por lo tanto más adecuada para preparar formas farmacéuticas. Estabilidad de la solución Se prepararon soluciones isotónicas de la sal de citrato y de la sal de clorhidrato del 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lfí-indol-5-carbonitrilo (0,1 mg/ml), respectivamente, que contenían ácido ascórbico (0,5 % (p/v) ) y se ajustaron a pH 2 y 4 con HC1 (2 ) y NaOH (2 M) y se almacenaron durante cuatro semanas entre 4 °C y 8 °C. Método para el análisis. HPLC: HP1100 Columna: Symmetry C18, 5 µ?t?, 3,9 x 150 mm
Tiempo de detención: 5 min Longitud de onda: 361 nm Volumen de inyección: 10 µ? Flujo: 1 ml/min Fase móvil solución amortiguadora de fosfato 0,05 M de pH 3: acetonitrilo : solución amortiguadora de fosfato (80:20). Resultados Después del análisis se observó que la sal de clorhidrato del 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo se degradaba aproximadamente en un 10 % mientras que la sal de citrato del 2-hidroxi-3- [ 5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il ] lH-indol-5-carbonitrilo era estable y no
presentaba ningún producto de degradación. Fotoestabilidad del principio activo La base libre, la sal de clorhidrato y la sal de citrato del 2-hidroxi-3-[5- (morfolin-4-ilmetil ) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo correspondientes, se evaluaron con respecto a su estabilidad frente a la luz en un gabinete Suntest CPS+. La exposición fue de 250 Wh/m2 y 1,2 millones de horas lux durante 29 horas. Resultados
Surge claramente de los resultados anteriores que la sal de citrato del 2-hidroxi-3- [5- (morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il ] líí-indol-5-carbonitrilo tiene una fotoestabilidad mucho mayor que tanto la sal de clorhidrato como la base libre y por lo tanto es más adecuada para preparar formulas farmacéuticas.
Conclusiones Surge claramente de las comparaciones entre la base libre
y las sales de clorhidrato y de citrato del 2-hidroxi-3- [ 5-(morfolin-4-ilmetil) piridin-2-il] lH-indol-5-carbonitrilo que la sal de citrato es más estable frente a la descomposición en comparación con la sal de clorhidrato y por lo tanto más adecuada para preparar formas farmacéuticas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.