MX2007010037A - Agentes antiangiogenicos con aldesleucina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a las terapias en combinacion con las composiciones de IL-2 y agentes antiangiogenicos para el tratamiento del cancer. Se proporcionan ademas los metodos para aliviar las toxicidades e incrementar la eficacia asociada con la administracion de las composiciones de IL-2 o composiciones antiangiogenicas.

Description

AGENTES ANTIANGIOGENICOS CON ALDESLEUCINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos de terapia para enfermedades asociadas con la proliferación celular anormal. En algunas modalidades, la IL-2 recombinante es combinada con agentes antiangiogénicos para el uso en el tratamiento del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los capilares llegan casi a todos los tejidos del cuerpo humano y le suministran a los tejidos oxigeno y nutrientes asi como también eliminan productos de desecho. Bajo condiciones típicas, las células endoteliales que revisten los capilares no se dividen, y los capilares, por lo tanto, no se incrementan normalmente en número o en tamaño en un adulto humano. Bajo ciertas condiciones, no obstante, tal como cuando un tejido es dañado, durante ciertas partes del ciclo menstrual, los capilares comienzan a proliferar rápidamente. Este proceso de formación de nuevos capilares a partir de los vasos sanguíneos preexistentes es conocido como angiogénesis o neovascularización. Ver Folkman, J. Scientific American 275, 150-154 (1996). La angiogénesis durante el sanado de heridas es un ejemplo de la neovascularización patofisiológica durante la vida adulta. Ref.: 185559 Durante el sanado de las heridas, los capilares adicionales proporcionan un suministro de oxigeno y nutrientes, promueven el tejido de granulación y ayudan a la eliminación de desechos. Después de la terminación del proceso de sanado, los capilares regresan normalmente. Lymboussaki, A. "Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos, Adults, and in Tumors" Academic Dissertation, University of Helsinki, Molecular/Cáncer Biology Laboratory and Department of Pathology, Haartman Institute, (1999). La angiogénesis también juega un papel importante en el crecimiento de las células cancerosas. Se sabe que una vez que un nido de células cancerosas alcanza un cierto tamaño, de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, las células cancerosas deben desarrollar un suministro de sangre con el fin de que el tumor crezca, ya que la difusión no será suficiente para suministrarle suficiente oxigeno y nutrientes a las células cancerosas. De este modo, se espera que la inhibición de la angiogénesis impida el crecimiento de las células cancerosas. De los factores angiogénicos identificados, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF por sus siglas en ingles) es el más potente y especifico y ha sido identificado como un regulador crucial de la angiogénesis normal y patológica; aunque otros factores tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF por sus siglas en ingles) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF por sus siglas en ingles) , y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF por sus siglas en ingles) han sido implicados en la angiogénesis y en la supervivencia de las células cancerosas. Curr Opin Investig Drugs. 2001 Feb; 2 (2) :280-ß. La inmunidad anti-tumoral específica involucra la activación de múltiples tipos celulares en el sistema inmune, siendo el más eficiente los linfocitos T citolíticos. Para inducir la respuesta inmune mediada por linfocitos T, anti-tumoral, específica, el reconocimiento no solamente del antígeno tumoral de interés, sino también de las interacciones coestimuladoras entre los ligandos específicos presentes ya sea sobre la célula tumoral o la célula presentadora de antígeno, y los linfocitos T objetivo, son requeridos. Esta segunda señal co-estimuladora puede también ser proporcionada por factores solubles, tales como citocinas u otras moléculas peptídicas que se enlazan a receptores específicos de la superficie celular e inician diversas vías de transducción de señales, dando como resultado el aumento de la función efectora. La interleucina 2 (IL-2) es una citocina derivada de linfocitos T que se enlaza a los receptores específicos presentes sobre las células T y las células asesinas naturales (NK por sus siglas en ingles) , y las activarán para la citólisis tumoral, la secreción de citocina, y otras funciones efectoras. Los linfocitos T CD4 y CD8 expresan el receptor para IL-2, y desarrollan la función efectora citolítica incrementada y la función sintética de citocina, incrementada, después de la exposición al producto biológico. Los efectos funcionales de la IL-2 son mediados vía el acoplamiento con el receptor de IL-2 (IL-2R) , el cual está estructuralmente compuesto de tres subunidades: a, ß y una cadena ? común que es compartida con otros receptores de citocina (Caligiuri et al., J. Exp . Med. 1990 171(5): 1509-1526; Bazan, J.F., Science 1992 257(5068): 410-413; Theze et al., Immunol . Today 1996 17(10): 481-486). La activación de los receptores de IL-2 y la señalización consecuente es dependiente de los tipos de receptores de IL-2 sobre las células (Caligiuri et al., J. Exp . Med. 1990 171(5): 1509-1526; Voss et al., J. Exp. Med. 1992 176(2): 531-541; Expinoza et al., J. Leukoc. Biol. 1995 57(1): 13-29; Theze et al., Immunol . Today 1996 17(10): 481-486). Las células T expresan IL-2Raß? de alta afinidad, mientras que las células NK, los monocitos y los macrófagos expresan predominantemente la forma de afinidad intermedia, IL-2Rß? (Caligiuri et al., J. Exp . Med. 1990 171(5): 1509-1526; Voss et al., J. Exp. Med. 1992 176(2): 531-541; Theze et al., Immunol . Today 1996 17(10): 481-486; Nagler et al, J. Exp. Med. 1990 171(5): 1527-1533) . Central a su mecanismo, IL-2 activa JAKs (JAK1, JAK3), que fosforilan las tirosinas clave sobre IL-2Rß, que sirven como sitios de plataforma para las moléculas de señalización con dirección 3 Y incluyendo Shc y Stat5, que catalizan luego la activación de dos vías distintas: Shc/Ras/Raf/MAPK, y JAK/STAT5, que se transloca al núcleo y regula directamente una familia de factores de transcripción reguladores de genes -STATs (O'Shea, J. J. , Immuni ty 1997 7(1): 1-11). Shc recluta el complejo Grb-2/Sos y activa la vía de Ras/Raf/MAPK, y Grb-2/Gab-2, que activa la vía de la fosfatidil-inositol-3-cinasa (PI3K) . Conjuntamente, estas proteínas de señalización regulan los factores de transcripción de genes, controlando al final el crecimiento celular, la división, la diferenciación y la actividad inmune de las mismas. Además, la IL-2 también incluye los efectos anti-apoptóticos al regular los genes pro-mitogénicos, conduciendo a bcl-2, bcl-xl, c-myb incrementados, lo cual afecta el control del ciclo celular a través de la activación de cdk 2, 4, 6 y la inhibición de p27kipl, o puede ser regulado negativamente por SOCS (supresores de la señalización de citocina) (Smith, K.A., Science 1988 240(4856): 1169-1176; Theze et al., Immunol . Today 1996 17(10) : 481-486) . Se reporta que la interacción entre IL-2 e IL-2R dispara la activación con dirección 3' de las vías de señalización de MAPK, PI-3K y JAK/STAT, conduciendo a la supervivencia y proliferación celulares (Miyazaki et al., Science 1994 266(5187): 1045-1047; Beadling et al., Embo J. 1996 15(8): 1902-1913; Nakajima et al., Immuni ty 1997 7(5): 691-701; Moriggl et al., Immuni ty 1999 11(2): 225-230). Estudios preclínicos en modelos tumorales murinos diversos han demostrado que la IL-2 humana recombinante, cuando se administra a animales que poseen tumores, por periodos de 10 a 14 días, puede dar como resultado la regresión de las cargas tumorales, la supervivencia a largo plazo y la resistencia incrementada del recrecimiento tumoral. El análisis de los linfocitos esplénicos obtenidos a partir de estos animales ha mostrado que los efectos antitumorales son debidos al menos en parte al momento de la función citolítica de las células T. Este efecto incluye la activación de la citólisis directa de las células tumorales por las CTL, así como una síntesis incrementada de otras citocinas derivadas de linfocitos T, las cuales pueden tener también efectos anti-tumorales directos o indirectos adicionales . El melanoma metastático y el carcinoma de células renales (RCC) son enfermedades ampliamente incurables y son resistentes a la mayoría de los tipos de quimioterapias sistémicas, por lo tanto sigue existiendo una necesidad considerable para desarrollar terapias más efectivas. Los datos clínicos recientes han apoyado el desarrollo de inhibidores del receptor de molécula pequeña tirosina-cinasa (RTK) particularmente BAY 43-9006 o SU11248 en melanoma y carcinoma de células renales. BAY 43-9006 y SU11248 inhiben múltiples cinasas que están involucradas en el crecimiento, proliferación y antiangiogénesis tumorales. BAY 43-9006 es un potente inhibidor de Raf-1, un miembro de la vía de señalización de la vía de Raf/MEK/ERK (Richly et al., Int . J. Clin . Pharma col . Ther. 2003 41(12): 620-621; Wilhelm et al., Cáncer Res . 2004 64(19): 7099-7109; Awada et al., Br . J. Cáncer 2005 92(10): 1855-1861), e inhibe B-Raf WT y B-Raf mutante V599E. Además de los efectos de BAY 439006 sobre Raf, se cree que una gran parte de su actividad puede ser mediada por la inhibición de otros RTKs, particularmente VEGFRs (VEGFR-2 Y VEGFR-3), PDGFRß, y otras cinasas clave FLT-3, y cKIT (Wilhelm et al., Cáncer Res . 2004 64(19): 7099-7109) . Las respuestas con BAY 43-9006 en las pruebas tempranas de tumores sólidos han establecido que las administraciones diarias o dos veces al día puede dar como resultado estabilizaciones de la enfermedad incluyendo algunas respuestas parciales. A la fecha, los estudios en Fase I han indicado que BAY 43-9006 es en general bien tolerado en pacientes. Las toxicidades más comunes con BAY 43-9006 involucraron efectos del tracto gastrointestinal (diarrea, nausea, retortijones abdominales) o reacciones dermatológicas incluyendo prurito en la piel o comezón (Richly et al., In t . J. Clin . Pharmacol . Ther. 2003 41(12): 620-621; Ahmad y Eisen, Clin . Cáncer Res . 2004 10(18 Pt 2): 6388S-92S; Awada et al., Br. J. Cáncer 2005 92(10): 1855-1861; Strumberg et al., J. Clin . Oncol . 2005 23(5): 965-972). En contraste, SU11248 es un inhibidor de RTK selectivo, altamente potente de VEGFR-1-3, PDGFRa, cKIT, FLT3 y PDGFRß (Abrams et al., Mol . Cáncer Ther. 2003 2(5): 471-478; Mendel et al., Clin . Cáncer Res . 2003 9(1): 327-337; O'Farrell et al., Clin . Cáncer Res . 2003 9(15): 5465-5476). SU11248 ha mostrado actividad antitumoral en un número de tumores sólidos avanzados (RCC, neuroendócrinos, estromales y adenocarcinomas) (Faivre et al., J. Clin . Oncol . 2006 24(1): 23-35; Motzer et al., J. Clin . Oncol . 2006 24(1): 16-24). Los datos clínicos de SU11248 también indican que el fármaco es en general tolerado con toxicidades manejables, que incluyen fatiga, linfopenia, neutropenia, hiperlipasemia (Faivre et al., J. Clin . Oncol . 2006 24(1): 23-35; Motzer et al., J. Clin . Oncol . 2006 24(1): 16-24). Los estudios de la forma hereditaria del carcinoma renal de células claras, que aparece en el síndrome de von Hippel-Lindau, condujeron a la identificación del gen supresor del tumor von Hippel-Lindau (VHL) . El gen es mutado en carcinoma hereditario de células renales (donde una mutación es una mutación de línea germinal) y en la mayoría de los casos del carcinoma renal esporádico de células claras (donde ambos alelos han adquirido mutaciones o supresiones). Gnarra JR, Duan DR, Weng Y, et al. Molecular cloning of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene and its role in renal carcinoma. Biochimica et Biophysica Acta . 1996; 1242(3): 201-10. Una consecuencia de estas mutaciones es la sobreproducción del factor de crecimiento endotelial vascular a través del mecanismo que involucra el factor inducible por hipoxia. O Iliopoulous AL, C Jiang, et al. Negative Regulation of Hypoxia-inducable genes by the Von-Hippel Lindu protein. Proc Na ti Acad Sci USA. 1996; 93: 10595- 10599. De este modo, por su regulación del factor de crecimiento endotelial vascular, la proteína de von Hippel-Lindau está fuertemente ligada a la angiogénesis. El factor de crecimiento endotelial vascular estimula el crecimiento de las células endoteliales y, como se mencionó, parece ser un factor central en la angiogénesis, particularmente durante la embriogénesis, la ovulación, el sanado de heridas, y el crecimiento tumoral. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J. Mol . Med. 1999; 77: 527-543. El factor de crecimiento endotelial vascular representa un buen objetivo para el tratamiento de cáncer renal de células claras, debido a que las mutaciones en el gen supresor del tumor von Hippel-Lindau, da como resultado la sobreproducción de este factor de crecimiento por los tumores. Un estudio controlado por placebo, de doble ciego, aleatorizado del anticuerpo monoclonal humanizado (bevacizumab) en pacientes con cáncer renal metastático de células claras, fue conducido por Yang et al. A randomized trial of bevacizumab, an anti-vascular endothelial growth factor antibody, for metastatic renal cáncer. New England Journal of Medicine . 2003; 349(5): 427-34. El tiempo hasta la progresión del tumor fue prolongado por un factor de 2.55 en pacientes a los que se les administró bevacizumab por kilogramo (10 mg/kg cada dos semanas), en comparación con los pacientes en el grupo de placebo. La supervivencia no fue un punto final primario en esta prueba, lo cual permitió que los pacientes se cruzaran del placebo a la terapia con bevacizumab al tiempo de la progresión de la enfermedad. Id. Los tratamientos para el cáncer renal que se dirige a los mecanismos angiogénicos puede también ser efectivo a través de las vías diferentes de aquella mediada por el factor de crecimiento endotelial vascular. Existen otras proteínas en el microambiente local de algunos tumores, que pueden promover la angiogénesis. Como tal, existe una necesidad para la terapia antiangiogénica utilizando una combinación racional de inhibidores, dirigidos por el entendimiento de la biología del carcinoma de células renales. La interleucina 2 humana recombinante (aldesleucina) fue aprobada por la FDA (Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos) para el tratamiento del cáncer renal metastático basado en los resultados de varios centros múltiples en 255 pacientes quienes recibieron un régimen de bolo de alta dosis, intermitente. En estas pruebas, las respuestas objetivas fueron observadas en 15% de los pacientes, y la supervivencia media fue de 16.3 meses (Fisher y Rosenberg 2000 Cáncer J Sci Am 6S1: S55-57). Debido a la toxicidad significativa asociada con este régimen, se emplearon una serie de pruebas en fase I y fase II empleando rIL-2 a diferentes dosis y utilizando diferentes rutas de administración. Una revisión reciente de la eficacia de rIL-2 como un agente simple indicó una respuesta general de 15% en más de 1700 pacientes con RCC metastático quienes fueron tratados en esta serie de estudios. Las respuestas completas fueron notadas en 3 a 5% de los pacientes. (Bukowski RM. Natural history and therapy of metastatic renal cell carcinoma: the role of interleukin-2. Cáncer. 1997; 80(7): 1198-220). Las proporciones no parecen diferir entre estas rutas. Una comparación aleatorizada entre el régimen intravenoso de bolo de alta dosis y el régimen intravenoso de bolo de baja dosis y el régimen subcutáneo de paciente externo, no mostró diferencia en la supervivencia media entre los grupos, pero los regímenes de baja dosis y de paciente externo fueron significativamente menos tóxicos. Yang JC, Sherry RM, Steinberg SM, et al. Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cáncer.

Journal of Clinical Oncology. 2003; 21(16): 3127-32. Además de tener efectos inmunomoduladores directos, rIL-2 puede también prevenir la proliferación tumoral al provocar liberación secundaria de citocina (IFN?) a partir de las células NK activadas. Saraya KLA, Balkwill FR. Temporal sequence and cellular origin of interleukin-2 stimulated cytokine gene expression. Bri tish Journal of Cáncer. 1993; 67 (3) : 514-21. Las proporciones de respuesta y los resultados de los pacientes con cáncer renal de células claras, pueden ser mejorados. Las pruebas clínicas que emplean nuevas combinaciones de fármaco son necesarias. La combinación de rIL2 y los agentes antiangiogénicos, tales como bevacizumab pueden tener efectos aditivos que podrían traducirse en beneficio clínico agregado para los pacientes con carcinoma metastático de células renales, así como otros cánceres. Otra ventaja más al procedimiento complementario a la regresión del cáncer es que éste proporciona una plataforma menos fácilmente desviada por las mutaciones de resistencia. Donde los objetivos terapéuticos están tan polarizados y específicos (lo cual puede ser necesario con el fin de evitar dirigirse a las células del hospedero) , tal como un sustrato particular en un replicón viral o una cinasa en una línea de células cancerosas, una mutación puntual simple en el estado de enfermedad puede hacerla no afectada por un fármaco, dando como resultado cepas aún más severas de la enfermedad en generaciones futuras. Los novedosos métodos y mecanismos para tratar a pacientes que tienen trastornos asociados con la proliferación anormal que son resistentes a, o inadecuadamente tratados por procedimientos convencionales, utilizando agentes que se dirigen a los mecanismos de respuesta inmune en el cuerpo y los sustratos de estado de enfermedad, son necesarios. La presente invención proporciona tales agentes terapéuticos, y proporciona además otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en parte en las terapias de combinación única utilizando inhibidores de tirosina-cinasa del receptor de molécula pequeña, y rIL-2 con toxicidades no traslapadas. Dado que los melanomas y RCC son en general respondedores a la inmunoterapia tal como rIL-2, combinaciones racionales de rIL-2 con inhibidores potenciales del receptor de la tirosina-cinasa, basados en la farmacología de los agentes inhibidores, han sido evaluados en la presente. La invención proporciona esquemas de fármaco clínicamente aplicables para circunvenir las interacciones potenciales de los fármacos, con base en el perfil toxicológico de estos agentes. El potencial de las interacciones farmacocinéticas/farmacodinámicas adversas y las interacciones farmacológicas adversas, son también elucidados. Se describen los efectos de rIL-2 y los inhibidores de tirosina-cinasa del receptor de molécula pequeña, tales como BAY 43-9006, sobre las células T y el impacto sobre las vías de señalización mediadas por IL-2 (MAPK y JAK/STAT5) . De este modo, la presente invención expande la indicación de la eficacia anti-tumoral de los compuestos IL-2, tales como IL-2 recombinante (rIL-2, también conocido como aldesleucina) contra líneas de células cancerosas que responden pobremente a las terapias convencionales, dando como resultado supervivencia a largo plazo e inmunidad incrementadas hacia el nuevo reto tumoral. Además, los efectos inmunoestimuladores de rIL-2 se dirigen a aliviar los efectos colaterales existentes provocados por la administración de las composiciones antiangiogénicas para la co-administración con éstas. Se proporcionan los métodos de tratamiento de un sujeto que sufre de proliferación celular anormal, particularmente carcinoma de células renales utilizando una combinación de un compuesto IL-2, tal como rIL-2 y al menos un agente antiangiogénico. Además, son proporcionados también los métodos para el tratamiento de un sujeto que sufre de la proliferación celular anormal, particularmente carcinoma de células renales utilizando una combinación de un compuesto IL-2, tal como rIL-2 y una molécula pequeña. Las moléculas pequeñas preferidas de la presente invención son listadas en las Tablas 1-5. Las moléculas particularmente preferidas son N-(2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida (también conocido como SU11248) y l-(4-(2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea (también conocido como Bay 43-9006) . La aldesleucina y los agentes antiangiogénicos pueden ser administrados conjuntamente o separadamente como composiciones farmacéuticas individuales. Si se administran separadamente, la aldesleucina puede ser preparada antes de, concurrente con o subsecuente al agente antiangiogénico . Se proporcionan los regímenes particulares que comprenden esquemas de dosificación diaria, semanal y mensual (o iteraciones de los mismos) para la co-administración de la aldesleucina con el agente antiangiogénico, tal como 6,7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il)metil) ftalazin-1-amina, y 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( -cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea .

En una modalidad, los agentes antiangiogénicos, preferentemente uno de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, y l-(4-(2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3-(trifluorometil) fenil) urea son coadministrados con las proteínas antiangiogénicas, tales como los anticuerpos monoclonales capaces de inhibir VEGF. En una modalidad más particular las proteínas antiangiogénicas de la presente invención son bevacizumab o VEGF-Trap. En otra modalidad más particular, la proteína es un inhibidor de EGF, tal como cetuximab. En otra modalidad más, la administración de la aldesleucina y el o los agentes antiangiogénicos conjuntamente de la manera descrita en la presente, potencia la efectividad del agente antiangiogénico, dando como resultado una respuesta terapéutica positiva/sinérgica que es mejorada con respecto a aquella observada con el inhibidor solo. Otras modalidades proporcionan un paquete terapéutico adecuado para la venta comercial para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, que comprende un recipiente, una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina, y una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico y/o molécula pequeña, preferentemente listados en las Tablas 1-5, tales como 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2-dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il)metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4 -iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea. En otras modalidades adicionales, se proporciona un kit. El kit comprende una combinación de medicamentos para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, que comprende: (a) aldesleucina, y (b) un agente antiangiogénico seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N-(4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea, para el uso simultáneo, secuencial o separado. Los métodos de fabricación de las combinaciones descritas en la presente, son proporcionados y contemplados para caer dentro del alcance de la invención como es el uso de las combinaciones en métodos para fabricar medicamentos para el uso en los métodos de la invención. Las modalidades adicionales de la invención incluyen aquellas descritas en la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la actividad de agente simple de rIL-2, BAY 43-9006 o SU11248 en los modelos tumorales murinos competentes de células T, que responden a IL-2. Las células de melanoma B16-F10 (2 x 106) , de carcinoma de colon CT26 (2 x 106) o de carcinoma renal RENCA (1 x 106) fueron implantadas subsecuentemente dentro del flanco derecho de ratones hembra C57BL6 o BALB/c. Los tratamientos fueron iniciados cuando los tumores fueron establecidos hasta un tamaño medio de 50 a 225 mm3, como se describe en los métodos. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos de tratamiento (10 ratones/grupo). rIL-2 fue administrada diariamente de manera subcutánea (0.2-3 mg/kg/d) . BAY 43-9006 o SU11248 (1-100 mg/kg) fueron administrados diariamente como una solución vía cebadura oral. La Figura 1 ilustra la inhibición media del crecimiento tumoral (calculada como [1- (volumen tumoral medio del grupo tratado/volumen tumoral medio del grupo con vehículo) x 100]) de los agentes simples en el modelo de tumores B16-F10, CT26 y RENCA entre los días 10-14. Los datos son recopilados a partir de múltiples estudios independientes con cada estudio de 10 ratones/grupo. *denota la significancia estadística versus el tratamiento con vehículo (p<0.05, ANOVA) (análisis de variancia). La Figura 2 muestra la eficacia de la terapia concomitante con rIL-2 y BAY 43-9006 en el modelo de melanoma murino B16-F10. Células F16-F10 (2 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra C57BL6. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 50 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0 ya sea con vehículo, los días 0-6 (*), rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., los días 0-6) (?) o BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 0-6) (x) o rIL-2 combinado (3.3 mg/kg, s.c., días 0-6) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 0-6) (") La Figura 2 ilustra el volumen tumoral medio (mm3 ± SE) versus días después de la repartición aleatoria (n=10 ratones/grupo) . Las Figuras 3A y 3B muestran la eficacia de la terapia secuencial con rIL-2 y BAY 43-9006 en el modelo de melanoma murino B16-F10. Las células B16-F10 (2 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra C57BL6. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 50 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0. La Figura 3A muestra los resultados a partir del régimen secuencial con rIL-2 administrado primeramente, luego BAY 43-9006. El panel ilustra: vehículo, los días 0-6, 7-13 (»); rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., los días 0-6) (?) o BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 7-13) (x) o combinó rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c. días 0-6) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 7-13) (•) . La Figura 3B muestra los resultados del régimen secuencial con BAY 43-9006 administrado primeramente, seguido por rIL-2. El panel ilustra: vehículo, los días 0-6, 7-23 { * ) ; BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 0-6) (x) ; rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., los días 7-13) (D) o BAY 43-9006 combinado (30 mg/kg, p.o. días 0-6) + rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 7-13) (A). Las gráficas muestran el volumen tumoral medio (mm3 ± SE) versus los días después de la repartición aleatoria (n=10 ratones/grupo) . La Figura 4 muestra la eficacia de la terapia concomitante con rIL-2 y SU11248 en el modelo de melanoma murino B16-F10. Las células B16-F10 (2 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra C57BL6. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 50 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0 ya sea con el vehículo, los días 0-6 (0) o rIL-2 combinado (3.3 mg/kg, s.c., días 0-6) (D) o SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0.6) (O) o rIL-2 combinado (3.3 mg/kg, s.c, días 0.6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0-6) (A). La Figura 4 ilustra el volumen tumoral medio (mm3 ± SE9 versus los días después de la repartición aleatoria (n=10 ratones/grupo) . Las Figuras 5A y 5B muestran la eficacia de la terapia concomitante con rIL-2 y SU11248 en el modelo de melanoma murino B16-F10. Las células B16-F10 (2 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra C57BL6. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 50 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0. La Figura 5A muestra los resultados del régimen secuencial con rIL-2 administrado primeramente, luego SU11248. El panel ilustra: vehículo (0) días 06, 7-13; rlL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 0-6) (o) o SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 7-13) (x) o rIL-2 combinado (3.3 mg/kg, s.c., días 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 7-13) (•) . La Figura 5B muestra los resultados del régimen secuencial con SU11248 administrado primeramente, seguido por rIL-2. El panel ilustra: vehículo (0) días 0-6, 7-13; SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0-6) (O); rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 7-13) (?) o SU11248 combinado (40 mg/kg, p.o. días 0-6) + rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 7-13) (") . La gráfica muestra el volumen tumoral medio (mm3 ± SE) versus los días después de la repartición aleatoria (n=10 ratones/grupo) .

La Figura 6 muestra la eficacia de la terapia secuencial con rIL-2 y BAY 43-9006 en el modelo de adenocarcinoma de colon murino CT26. Las células CT26 (2 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 225 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0. El panel ilustra el régimen secuencial con rIL-2 administrado primeramente, luego BAY 43-9006: vehículo (*) días 0-6, 7-13; rIL-2 (1 mg/kg, s.c., días 0-6) (o) o BAY 43-9006 (40 mg/kg, p.o. días 7-13) (?) o rIL-2 combinado (1 mg/kg, s . c . , días 0-6) + BAY 43-9006 (40 mg/kg, p.o. días 7-13) (-). La Figura 7 muestra la eficacia del tratamiento concomitante de rIL-2 y SU11248 en el modelo de adenocarcinoma de colon murino CT26. Las células CT26 (2 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 225 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0. El panel ilustra: vehículo (*) días 0-6; rIL-2 (1 mg/kg, s.c., días 0-6) (D) O SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0- 6) (O) o rIL-2 combinado (1 mg/kg, s.c., días 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0-6) (•) . Las Figuras 8A y 8B muestran la eficacia de la terapia secuencial con rIL-2 y SU11248 en el modelo adenocarcinoma de colon murino CT26. Las células CT26 (2 x 106 células) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 225 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0. El panel ilustra: la Figura 8A muestra los resultados del régimen secuencial con rIL-2 administrado primeramente, luego SU11248: vehículo ( * ) días 0-6, 7-13; rIL-2 (1 mg/kg, s.c., días 0-6) (D) O SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 7-13 (O) o rIL-2 combinado (1 mg/kg, s.c., días 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 7-13) (•) . La Figura 8B muestra los resultados del régimen secuencial con SU11248 administrado primeramente, seguido por rIL-2. El panel ilustra: vehículo (*) días 0-6, 7-13; SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0-6) (O); rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 7-13) (o) o SU11248 combinado (40 mg/kg, p.o. días 0-6) + rIL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 7-13) (A). La gráfica muestra el volumen tumoral medio (mm3 ± SE) versus los días después de la repartición aleatoria (n=10 ratones/grupo) . La Figura 9 muestra la eficacia de la terapia concomitante con rIL-2 y BAY 43-9006 en el modelo de tumor RCC RENCA. Las células RENCA (1 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 50 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0 ya sea con vehículo, los días 0-8 (»), rIL-2 (1 mg/kg, s.c., días 0-4, 7-11) (?) o BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 0-8) (x) o rIL-2 combinado (1 mg/kg, s.c., días 0-4, 7-11) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. días 0-8 ("). La Figura 9 ilustra el volumen tumoral medio (mm3 ± SE) versus los días después de la repartición aleatoria (n=10 ratones/grupo) . La Figura 10 muestra la eficacia del tratamiento concomitante de rIL-2 y SU11248 en la terapia en el modelo de tumor murino RCC RENCA. Las células RENCA (1 x 106 células) fueron implantadas subsecuentemente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos cuando los tumores fueron de aproximadamente 50 mm3, y los tratamientos iniciaron en el día 0. El panel ilustra: vehículo (*) días 0-6; rIL-2 (1 mg/kg, s.c., días 0-6) C) o SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0-6) (x) o rIL-2 combinado (1 mg/kg, s.c., días 0-6 + SU11248 (40 mg/kg, p.o. días 0-6) ( A) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Utilizando un ensayo de detección, han sido caracterizados diversos tipos de cánceres como susceptibles al tratamiento con inhibidores de la angiogénesis/VEGF y la administración de citocina o modulación con rIL-2. Tales cánceres incluyen, por ejemplo, CML, AML, de mama, gástrico, endometrial, de glándulas salivales, adrenales, pulmonar de células pequeñas, pancreático, renal, rectal, cutáneo, melanoma, mieloma múltiple, de cerebro/sistema nervioso central, de cerviz, de nasofaringe, mesotelioma maligno, de hipofaringe, carcinoide gastrointestinal, cáncer de peritoneo, omentum, de mesenterio, de vesícula biliar, de testículos, de esófago, de pulmón, de tiroides, de ovario, de peritoneo, de próstata, de cabeza y cuello, de vejiga, de colon, colorrectal, linfomas, y glioblastomas. Los métodos descritos en la presente son útiles en el tratamiento de cualquiera de tales cánceres. La terapia con una combinación de aldesleucina y al menos un agente antiangiogénico de la manera descrita en la presente provoca una respuesta fisiológica que es benéfica con respecto al tratamiento de los cánceres cuyas células proliferantes no abatidas son altamente dependientes de la vascularización, tales como VEGF. Una modalidad de la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer que sufre de hipotensión, a partir de la administración de aldesleucina, que comprende: co-administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico para atenuar la hipotensión. Otra modalidad más particular de la presente invención comprende el mejoramiento del cáncer en el paciente. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente con cáncer que sufre de hipertensión a partir de la administración de un agente antiangiogénico, que comprende: co-administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina para atenuar la hipertensión. Otra modalidad más particular de la presente comprende el mejoramiento del cáncer del paciente. En ciertas modalidades, el cáncer es susceptible a la inhibición de la angiogénesis y/o la estimulación inmune. En una modalidad más particular de cualquiera de las modalidades previas, dicho agente antiangiogénico se selecciona de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- ( 3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- ( 3-morfolinopropoxi) -N- ( 3-cloro-4-fluorofenil ) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N-(2- (dimetilamino) etil) -5- ( ( 5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea .

Otra modalidad de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar al paciente aldesleucina y un compuesto seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi ) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para incrementar la eficacia de la aldesleucina en un paciente con cáncer, que comprende administrar primeramente un agente antiangiogénico en una dosis capaz de inducir la hipoxia en el paciente y luego administrar la aldesleucina. Otra modalidad más proporciona un método para incrementar la eficacia de un agente antiangiogénico en un paciente con cáncer, que comprende reducir la sintasa del óxido nítrico por la administración de la aldesleucina al paciente. Otra modalidad más proporciona un método para incrementar la eficacia de un agente antiangiogénico en un paciente con cáncer, que comprende la administración de aldesleucina al paciente en donde la sintasa del óxido nítrico es por ende reducida por la administración de la aldesleucina al paciente. En una modalidad más particular de la presente, el agente antiangiogénico se selecciona de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin- -iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende los pasos de administrar primeramente al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina, seguida por la administración de un agente antiangiogénico (tal como) seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( ( 5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N-(4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea . Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende los pasos de administrar primeramente al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico, tal como, 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N-(2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3-(trifluorometil) fenil) urea seguido por la administración de aldesleucina . Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar separadamente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico y aldesleucina, de acuerdo a un esquema de dosificación, en donde la aldesleucina es administrada de 1 a 3 veces al día en una dosis entre aproximadamente 9 y aproximadamente 130 MlU/día por un periodo de al menos 3 días consecutivos, seguido opcionalmente por un periodo de descanso de al menos 3 días consecutivos. En una modalidad más particular de la presente invención, el agente antiangiogénico es administrado de 1 a 6 veces cada 2 a 3 semanas. En una modalidad más particular de la presente, el agente antiangiogénico es un inhibidor de VEGF. En una modalidad más particular de la presente, el agente antiangiogénico se selecciona de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quina zol in- 4 -amina , 6- ( 3-morfolinopropoxi ) -N- ( 3-cloro-4 -fluorofenil ) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil ) -2, 4-dietil-lH-pirrol- 3-carboxamida , N- ( 4-clorofenil ) -4- ( (piridin-4-il ) metil ) ftalazin-1-amina, o l-(4-(2- (metilcarbamoil )piridin-4 -iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- ( trifluorometil ) fenil) urea. En una modalidad particular de la presente, la aldesleucina es administrada intravenosamente y el periodo de descanso está presente. En una modalidad particular de la presente, la aldesleucina es administrada subcutáneamente y el periodo de descanso está ausente. En una modalidad particular de la presente, la aldesleucina es administrada 3 veces al día en una dosis de aproximadamente 30 a 100 MlU/día. En una modalidad particular de la presente, la aldesleucina es administrada por un periodo de 5 días consecutivos seguido por un periodo de descanso de 9 días . En una modalidad más particular el esquema de dosificación es repetido por al menos dos cursos. En una modalidad más particular todavía, cada curso consiste de tratamientos de 2 a 5 días seguido por un periodo de descanso de 9 a 15 días. En otra modalidad más particular de la presente, la aldesleucina es administrada 3 veces para el primer día y una vez al día cada día subsecuente. En una modalidad más de la presente, el esquema de dosificación es repetido por al menos dos cursos, o 3 cursos, o 4 cursos, o 5 cursos, o 6 cursos, o 7 cursos, u 8 cursos, o 9 cursos, o 10 cursos. En una modalidad más particular de cualquiera de las modalidades previas, el cáncer es cáncer de colon, carcinoma de células renales o melanoma maligno. En una modalidad más particular de cualquiera de las modalidades previas, después de la administración de la aldesleucina al menos un compuesto seleccionado de acetaminofen, meperidina, indometacina, ranitidina, nizatidina, diastop, loperamida, difenhidramina, o furosemida es administrado al paciente. En una modalidad preferida de cualquiera de las modalidades precedentes, el agente antiangiogénico es 6, 7-bis ( 2 -metoxietoxi ) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- ( 3-morfolinopropoxi ) -N- ( 3-cloro-4-fluorofenil ) -7-metoxiquinazolin-4-amina , N- ( 2- (dimetilamino) etil ) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4 -clorofenil) -4- ( (piridin-4-il ) metil ) ftalazin-1-amina, o l-(4-(2- (metilcarbamoil )piridin-4 -iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- ( trifluorometil ) fenil) urea. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrarle la aldesleucina y: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrarle aldesleucina y: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrarle aldesleucina y: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrarle aldesleucina y: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrarle aldesleucina y: un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrarle aldesleucina y un compuesto de la Fórmula I : en donde: Ri es alquilo, -aril(R?)p, o heterociclilo; R2 es H o alquilo; o, Ri y R2 están ambos enlazados entre sí para formar R?-2; R3 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRd, o heterociclilo; R4 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, -0- (CH2) q-Rg, -0- (CH2)q-0-Re, -NRaRb, -S(0)nRd, o -heterociclil-Rf; R5 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, -0- (CH2) q-Rg, -0- (CH2)q-0-Re, -NRaRb, -S(0)nRd, o heterociclilo; R6 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRd, o heterociclilo; R es H, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -S(0)nRd, o heterociclilo; cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo, -C(0)Rc, arilo, heterociclilo, o alcoxi; o, Ra y Rb están ambos enlazados entre sí para formar R?-2; cada Rc es independientemente H, alquilo, alcoxi, -C (0) alquilo, -C(0) arilo, -CHO, arilo, o heterociclilo; cada Rd es independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo, o -NRaRb; cada Re es independientemente H o alquilo; Rf es H, halógeno, -OH, -CN, - (CH2) qNRaRh, alcoxi, -C(0)Rc, -(CH2)qCH3. cada Rg es independientemente H, halógeno, -C(0)Rc, arilo, heterociclilo, o -NRaRb; Rh es H, o - (CH2)qS(0)n d; cada Ri es independientemente H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, o -0(CH2)q-Rg; cada n es independientemente 0, 1 ó 2; cada p es independientemente 0, 1, 2 ó 3; cada q es independientemente 0, 1 ó 2; R?_2 tiene la estructura general como se muestra: en donde : cada R8 es independientemente H, -OH, halógeno, alquilo, alcoxi, -NRaRb, o -S(0)nRd; cada Rg es independientemente H, alquilo, -C(0)Rc, o está ausente si X es O, S, o está ausente; cada X es independientemente O, S, N, CH, o ausente, con lo cual se forma un enlace covalente; y cada m es independientemente 0, 1 ó 2; o un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. En una modalidad más particular de la presente, el compuesto es: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. En otra modalidad más particular de la presente el compuesto es: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar aldesleucina y un compuesto de la fórmula II en donde Rn es alquilo, arilo o heterociclilo; Ri2í Ri3 R14 y is son cada uno independientemente hidrógeno, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd, o heterociclilo; cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo, -C(0)Rz, arilo, heterociclilo o alcoxi; cada Rz es independientemente H, alquilo, alcoxi, -NH2, -NH (alquilo) , -N (alquilo) 2, arilo o heterociclilo; cada Rd es independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo o -NRaRb; cada n es independientemente 0, 1 ó 2; y cada q es independientemente 0, 1 ó 2; o un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. En una modalidad más particular de la presente, Rn es Rlla; en donde, Ri6/ Rp y Ríe son cada uno independientemente H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd, o heterociclilo. En una modalidad más particular de la presente, el compuesto es , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar aldesleucina y un compuesto de la fórmula III: III en donde , la línea discontinua representa una colocación opcional de un enlace adicional; R20 es H o =0; R21Í R22f 23f y R24 son cada uno independientemente H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd, o heterociclilo; R25 es H, alquilo, o -C(0)Rz; R26 y R27 son cada uno independientemente H, -OH, halógeno, alquilo, -NRaRb, -C(0)R2, o -S(0)nRd; R28 es H, -CH3, o halógeno; cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo, -C(0)Rz, arilo, heterociclilo, o alcoxi; cada Rz es independientemente H, alquilo, alcoxi, -NH2, -NH (alquilo) , -N (alquilo) 2, arilo, o heterociclilo; cada Rd es independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo, o -NRaRb; cada n es independientemente 0, 1 ó 2; y cada q es independientemente 0, 1 ó 2; o un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. En una modalidad más particular de la presente, el compuesto es , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. En una modalidad más particular de la presente, el compuesto es: , un tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero. Otra modalidad de la invención proporciona un método para disminuir la toxicidad asociada con la administración de aldesleucina a un paciente con cáncer, que comprende administrar una quinolinona, preferentemente un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6,7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea al paciente. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para disminuir la toxicidad asociada con la administración de un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, -dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4-(2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea, a un paciente con cáncer, que comprende administrar aldesleucina al paciente. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para disminuir la resistencia a IL-2 en un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil ) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3-(4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea al paciente . Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende los pasos de administrar primeramente al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina, seguida por la administración de un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4-(2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3-(trifluorometil) fenil ) urea . Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar separadamente al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil ) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- ( trifluorometil ) fenil) urea y aldesleucina de acuerdo a un esquema de dosificación, en donde la aldesleucina es administrada de 1 a 3 veces al día en una dosis entre aproximadamente 9 y aproximadamente 130 MlU/día por un periodo de al menos 3 días consecutivos, seguido opcionalmente por un periodo de descanso de al menos 3 días consecutivos. Más específicamente, la dosis está entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 MlU/día. Más específicamente, la dosis está entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60 MlU/día. Más específicamente, la dosis está entre aproximadamente 30 y aproximadamente 40 MlU/día. Más específicamente, la dosis está entre aproximadamente 17 y aproximadamente 30 MlU/día. Más específicamente, la dosis está entre aproximadamente 9 y aproximadamente 30 MlU/día. En una modalidad más particular el agente angiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3-(4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea se administra de 1 a 9 veces cada 2 a 3 semanas. En una modalidad más particular el agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( ( 5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea es un inhibidor de VEGF. En otra modalidad, el agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N-(2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3-(4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea es también administrado con bevacizumab, o cetuximab, o VEGF-Trap. Más específicamente, el bevacizumab es administrado en una dosis entre 1 y 12 mg/kg una vez cada 12 a 16 días. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 72 horas de la administración de rlL-2; en donde "dentro" se entiende que indica antes o después, como en: el agente antiangiogénico es administrado 72 horas antes o 72 horas después de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 14 días de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 7 días de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 6 días de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 5 días de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 4 días de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 48 horas de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 36 horas de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 24 horas de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 12 horas de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 6 horas de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado dentro de 1 hora de la administración de rIL-2. En otra modalidad más, el agente antiangiogénico es administrado al mismo tiempo que administración de rIL-2. En otra modalidad, el agente antiangiogénico es administrado en combinación con rIL-2. En una modalidad más de la presente, el agente antiangiogénico se selecciona de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- ( 3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( ( 5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il ) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4 -iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3-(trifluorometil) fenil) urea. Otra modalidad más de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, que comprende co-administrar aldesleucina y un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- ( 3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- ( 3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il)metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea. Otra modalidad más de la invención proporciona un paquete terapéutico adecuado para la venta comercial para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, que comprende un recipiente, una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina, y una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6,7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- ( 3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il)metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3-(4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea. Un paquete terapéutico de la presente, en donde el paciente está sufriendo de carcinoma de células renales. Un paquete terapéutico del mismo, que comprende además un material escrito que instruye que el paciente reciba el tratamiento con aldesleucina antes del tratamiento con un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi ) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea . Otra modalidad más proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il ) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea y aldesleucina. El carcinoma de células renales claras (RCC) está asociado con vascularización incrementada, particularmente expresión de VEGF. VEGF es una proteína que juega un papel crucial en la angiogénesis tumoral (la formación de nuevos vasos sanguíneos hacia el tumor) y el mantenimiento de los vasos sanguíneos tumorales, establecidos. Éste se enlaza a receptores específicos sobre los vasos sanguíneos para estimular extensiones a los vasos sanguíneos existentes. Algunos pero no todos los casos de RCCa tienen niveles séricos incrementados de VEGF. Existe evidencia de que VEGF incrementada correlaciona con la resistencia a IL-2 (Lissoni et al, Anticancer Res. 2001; 21: 777-9). Los efectos inmunosupresores de VEGF sobre las células T y las células dendríticas (Gabrilovich et al, J Leukoc Biol. 2002; 72: 285-96) podría representar un mecanismo para la resistencia inducida por VEGF hacia el tratamiento con IL-2. Además, VEGF incrementa la permeabilidad vascular y el tratamiento con anti-VEGF ha sido notado que conduce a presión sanguínea incrementada de algunos pacientes. Es probable por lo tanto que algunas de las toxicidades mayores de anti-VEGF (por ejemplo la hipertensión) y rIL-2 (por ejemplo hipotensión) podrían ser mutuamente contraatacados y conducir a un índice terapéutico mejorado general si las combinaciones de la presente invención fueran administradas a pacientes que sufren de cáncer, tales como RCCa.

Combinaciones adicionales de la presente invención, tales como aldesleucina con bevacizumab o cetuximab producen una proporción más alta y/o mejor durabilidad de respuestas en comparación a los agentes administrados solos. Los regímenes de dosificación particulares con aldesleucina descritos en la presente, proporcionan estimulación intermitente de la actividad de las células asesinas naturales (NK) y riesgo disminuido de efectos colaterales relacionados a rIL-2 que puedan estar asociados con la exposición a largo plazo a la dosificación con rIL-2. Es de hacer notar que la hipotensión típicamente asociada con la dosificación con rIL-2 es desplazada por la administración de las composiciones antiangiogénicas de la presente invención, ya que éstas están en general asociadas con la hipertensión. Además, la hipoxia típicamente asociada con los inhibidores de VEGF incrementará la sensibilidad a la eficacia del tratamiento con rIL-2, mientras que proporciona simultáneamente también beneficios paliativos. Otra modalidad de la invención proporciona el uso de la aldesleucina en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, en donde el medicamento es para el uso separado, simultáneo o secuencial con un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- ( 3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea . En una modalidad más de la presente el agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil ) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( ( 5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea es una sal de lactato. En otra modalidad más, el cáncer es carcinoma de células renales. Otra modalidad más de la invención proporciona el uso de un agente antiangiogénico, preferentemente seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- ( 3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N-(2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( 4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, en donde el medicamento es para el uso separado, simultáneo, o secuencial con aldesleucina. Las moléculas preferidas asociadas con angiogénesis, moduladas (tales como la inhibición) por las composiciones de la presente invención incluyen: Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) , Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF), Interleucina 8 (IL-8), angiogenina, angiotropina, Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) , Factor de Crecimiento de Células Endoteliales Derivado de Plaquetas, Factor de Crecimiento Transformante a (TGF-a) , Factor ß de Crecimiento transformante (TGF-ß), u óxido nítrico. También la modulación (tal como el potenciamiento) por las composiciones de la presente invención de la trombospondina, angiostatina y endostatina es contemplada dentro de la presente invención.

Composiciones Generales para la co-administración con rIL-2 QUINAZOLINA Los compuestos de la Fórmula I tienen la siguiente estructura: Fórmula I: en donde: Ri es alquilo, -aril?R p, o heterociclilo; R2 es H o alquilo; o, Ri y R2 están ambos enlazados entre sí para formar R?-2; R3 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRd, o heterociclilo; R4 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, -0- (CH2) q-Rg, -0- (CH2)q-0-Re, -NRaRb, -S(0)nRd, o -heterociclil-Rf; R5 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, -0- (CH2) q-Rg, -0- (CH2)q-0-Re, -NRaRb, -S(0)nRd, o heterociclilo; R6 es H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRd, o heterociclilo; R7 es H, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -S(0)nRdf o heterociclilo; cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo, -C(0)Rc, arilo, heterociclilo, o alcoxi; o, Ra y Rb están ambos enlazados entre sí para formar R?-2; cada Rc es independientemente H, alquilo, alcoxi, -C (0) alquilo, -C(0) arilo, -CHO, arilo, o heterociclilo; cada Rd es independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo, o -NRaRb; cada Re es independientemente H o alquilo; Rf es H, halógeno, -OH, -CN, - (CH2) qNRaRh, alcoxi, -C(0)Rc, -(CH2)qCH3. cada Rg es independientemente H, halógeno, -C(0)Rc, arilo, heterociclilo, o -NRaRb; Rh es H, o -(CH2)qS(0)nRd; cada Ri es independientemente H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, o -0(CH2)q-Rg; cada n es independientemente 0, 1 ó 2; cada p es independientemente 0, 1, 2 ó 3; cada q es independientemente 0, 1 ó 2; R?_2 tiene la estructura general como se muestra: en donde: cada R8 es independientemente H, -OH, halógeno, alquilo, alcoxi, -NRaRb, o -S(0)nRd; cada Rg es independientemente H, alquilo, -C(0)Rc, o está ausente si X es O, S, o está ausente; cada X es independientemente O, S, N, CH, o ausente, con lo cual se forma un enlace covalente; y cada m es independientemente 0, 1 ó 2. En una modalidad más particular de la invención, R2 es hidrógeno. En una modalidad particular adicional, Ri es -arilíR p. En una modalidad adicional en donde Ri es -aril(R1)p, el arilo dentro de Ri es fenilo, p dentro de Ri es 2 y ambos grupos Rx dentro de Ri son halo. En una modalidad adicional en donde Ri es -aril (R- p, el arilo dentro de Ri es fenilo, p dentro de Ri es 1 y los grupos Rx dentro de Ri son alquinilo, preferentemente etinilo. En una modalidad adicional en donde Ri es -arilíR p, el arilo dentro de Ri es fenilo, p dentro de Ri es 2, un grupo Rx dentro de Ri es halo y el otro grupo Rx dentro de Ri es -0(CH2)q-Rg. En una modalidad más particular de la presente, q dentro de Ri es 1 y Rg dentro de Ri es halofenilo. En una modalidad adicional en donde Ri es -arilíR p, p dentro de Ri es 1 y Rx dentro de Ri es alquinilo. Otra modalidad más particular de la invención es proporcionada, en donde R y R2 son ambos enlazados para formar R?_2; en donde R8 es hidrógeno, X es N, y Rg es -C(0)NHR . En una modalidad más particular de la misma, Rb dentro de Rg es -fenil-0-CH2(CH3)2. En una modalidad más particular de la invención, R3 y Re son hidrógeno. En una modalidad más particular de la invención, R4 es -O- (CH2) q-Rg. En una modalidad más particular de la presente, q dentro de R4 es 1 y Rg es hidrógeno. En otra modalidad en donde R4 es -O- (CH2) q-Rg, Rg dentro de R4 es heterociclilo. En una modalidad más particular de la invención, R4 y R5 son cada uno -0- (CH2) q-0-Re. En una modalidad más particular de la presente, q dentro de R4 y R5 es 2 y Re dentro de R4 y R5 es metilo. En una modalidad más particular de la invención, R es -heterociclil-Rf y R5 es hidrógeno. En una modalidad más particular de la misma, el heterociclilo dentro de R es furanilo. En una modalidad más particular todavía, Rf dentro de R4 es -(CH2)qNHRh. Adicionalmente, Rh es - (CH2) qS (0) 2CH3. En una modalidad más particular de la invención, R5 es -0- (CH2) q-Rg. En otra modalidad de la misma, Rg dentro de R5 es heterociclilo. Otra modalidad es proporcionada en donde R7 es hidrógeno. Otra modalidad es proporcionada en donde R3, Rs y R7 son todos hidrógeno.

IND0LIN0NA Los compuestos de la Fórmula II tienen la siguiente estructura : II en donde: Rii es alquilo, arilo o heterociclilo; 12 Ri3-- 1 y is son cada uno independientemente hidrógeno, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd, o heterociclilo; cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo, -C(0)Rz, arilo, heterociclilo o alcoxi; cada Rz es independientemente H, alquilo, alcoxi, -NH2, -NH (alquilo) , -N (alquilo) 2, arilo o heterociclilo; cada Rd es independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo o -NRaRb; cada n es independientemente 0, 1 ó 2; y cada q es independientemente 0, 1 ó 2 ; En una modalidad particular, Rn es heterociclilo.

En una modalidad más particular de la presente, Rp es Rna; Rla en donde, Ri6, R17 y Ri8 son cada uno independientemente H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd, o heterociclilo. En otra modalidad más particular, en donde Ri es R?a, R7 es -C (O) - (CH2) p-N (H) (2_r) (alquilo) r ? en donde p es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5 y r es 0, 1 ó 2. En otra modalidad más particular, en donde Rn es Rna, R?3 es F. En otra modalidad más particular, en donde Rn es Rna, R?7 es -(CH2)tCOOH, en donde t es 1, 2, 3 ó 4. En otra modalidad más particular, en donde Rn es Rna, Rß y R8 son ambos metilo. En otra modalidad más particular, en donde Ru es Rna, R? es H. En otra modalidad más particular de la invención, Rp es arilo. En otra modalidad más particular, Rn es fenilo sustituido o no sustituido. En otra modalidad más, R?3 es yodo.

ISOINDOLINONAS Los compuestos de la Fórmula III tienen la siguiente estructura: Fórmula III: en donde, III la línea discontinua representa una colocación opcional de un enlace adicional; R2o es H o =0; R2i, R22, R23, y R24 son cada uno independientemente H, -CN, -OH, halógeno, alquilo, arilo, alcoxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd, o heterociclilo; R25 es H, alquilo, o -C(0)Rz; R26 y R27 son cada uno independientemente H, -OH, halógeno, alquilo, -NRaRb, -C(0)Rz, o -S(0)nRd; R28 es H, -CH , o halógeno; cada Ra y Rb es independientemente H, alquilo, -C (0) Rz, arilo, heterociclilo, o alcoxi; cada Rz es independientemente H, alquilo, alcoxi, -NH2, -NH (alquilo) , -N (alquilo) 2, arilo, o heterociclilo; cada Rd es independientemente H, alquilo, alquenilo, arilo, o -NRaRb; cada n es independientemente 0, 1 ó 2; y cada q es independientemente 0, 1 ó 2.

DEFINICIONES : AUC área bajo la curva CR respuesta completa DLT toxicidad limitante de la dosis IL interleucina IL-2 interleucina-2 IU unidades internacionales IV Intravenoso (como un modo de administración) LAK asesino activado por linfocina MTD dosis tolerada máxima MIU millones de unidades internacionales NK asesino natural PK farmacocinética PR respuesta parcial RCC carcinoma de células renales RCCa carcinoma de células renales de células claras rIL-2 interleucina-2 recombinante RTK receptor de tirosina-cinasa TNF Factor de necrosis tumoral VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular En general, la referencia a un cierto elemento tal como hidrógeno o H se entiende que incluye todos los isótopos de ese elemento. Por ejemplo, si un grupo R es definido para incluir hidrógeno o H, éste también incluye deuterio y tritio . Por "agente antiangiogénico" se entiende cualquier molécula pequeña, más específicamente, cualquier compuesto que tenga un peso molecular menor de 1,100 g/mol que ha mostrado o que mostrará que suprime la angiogénesis en un sistema. Las moléculas preferidas asociadas con angiogénesis, moduladas (tales como la inhibición) por las composiciones de la presente invención incluyen: Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) , Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF), interleucina 8 (IL-8), angiogenina, angiotropina, Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) , Factor de Crecimiento de Células Endoteliales Derivado de Plaquetas, Factor de Crecimiento Transformante (TGF-a) , Factor de Crecimiento Transformante ß (TGF-ß), u óxido nítrico. También la modulación (tal como el potenciamiento) por las composiciones de la presente invención de la trombospondina, angiostatina y endostatina es contemplada dentro de la presente invención. Las composiciones antiangiogénicas preferidas de la presente invención incluyen: 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- ( 3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea . El término "cantidad efectiva" es una cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un compuesto para tratar el carcinoma de células renales puede ser una cantidad necesaria para provocar la regresión del crecimiento tumoral en células renales. La cantidad efectiva puede variar, dependiendo, por ejemplo, de la condición tratada, del peso del sujeto, de la severidad de la enfermedad. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad efectiva empíricamente sin experimentación indebida. Como se utiliza en la presente "una cantidad efectiva para el tratamiento" se refiere a una cantidad suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, retardar o alentar la progresión de una condición, tal como un estado de enfermedad. Un "sujeto" o "paciente" se entiende que describe un humano o animal vertebrado incluyendo un perro, gato, mascota de bolsillo, tití, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, elefante, jirafa, pollo, león, mono, buho, rata, ardilla, lori esbelto y ratón. Una "mascota de bolsillo" se refiere a un grupo de animales vertebrados capaces de caber dentro de una bolsa de abrigo cómodamente, tales como por ejemplo, hámsteres, chinchillas, urones, ratas, cobayos, gerbos, conejos y deslizadores de azúcar. Como se utiliza en la presente, el término "éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a los esteres, los cuales se hidrolizan in vivo e incluyen aquellos que se desintegran fácilmente en el cuerpo humano para dejar el compuesto progenitor o una sal del mismo. Los grupos éster adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos derivados de los ácidos carboxílicos alifáticos farmacéuticamente aceptables, particularmente los ácidos alcanoicos, alquenoicos, cicloalcanoicos y alcanodioicos, en los cuales cada porción alquilo o alquenilo tiene ventajosamente no más de 6 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de esteres particulares incluyen, pero no están limitados a, formiatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos y etilsuccinatos . Los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados en la forma de sales como en las "sales farmacéuticamente aceptables" derivadas de ácidos orgánicos o inorgánicos. Estas sales incluyen pero no están limitadas a las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, ciclopentanpropionato, dodeciisulfato, etansulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, metansulfonato, nicotinato, 2-naftalensulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, sulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, p-toluensulfonato y undecanoato. También, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden ser cuaternizados con agentes tales como haluro de alquilo inferior, tales como los cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como los sulfatos de dimetilo, de dietilo, de dibutilo y de diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, de laurilo, de miristilo y de estearilo, haluros de aralquilo como los bromuros de bencilo y de fenetilo, y otros. Los productos solubles o dispersables en agua o en aceite son obtenidos con esto. El término "profármacos farmacéuticamente aceptables" como se utiliza en la presente, se refiere a aquellos profármacos de los compuestos de la presente invención los cuales, dentro del alcance del sano juicio médico, son adecuados para el uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, conmensurados con una proporción razonable de beneficio/riesgo, y efectivos para su uso pretendido, así como las formas anfotéricas, donde sea posible, de los compuestos de la invención. El término "profármaco" se refiere a los compuestos que son rápidamente transformados in vivo para producir el compuesto progenitor de la fórmula anterior, por ejemplo mediante hidrólisis en sangre. Una discusión completa es proporcionada en T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. Los profármacos como se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,284,772 por ejemplo pueden ser utilizados . La referencia a "halo", "haluro" o "halógeno" se refiere a los átomos de flúor, cloro, bromo o yodo. La frase "alquilo" se refiere a los grupos alquilo sustituidos y no sustituidos tales como los grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo y similares. La frase también incluye los isómeros de cadena ramificada de los grupos alquilo de cadena lineal incluyendo pero no limitados a, los siguientes que son proporcionados a manera de ejemplo: -CH(CH3)2, -CH(CH3) (CH2CH3) , -CH (CH2CH3) 2, -C(CH3)3, -C(CH2CH3)3) -CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3) (CH2CH3) , -CH2CH (CH2CH3) 2, -CH2C(CH3)3, -CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH(CH3) (CH2CH3) , -CH2CH2CH (CH3) 2, -CH2CH2CH(CH3) (CH2CH3) , -CH2CH2CH (CH2CH3) 2, -CH2CH2C (CH3) 3, -CH2CH2C (CH2CH3) 3, -CH (CH3) CH2CH (CH3) 2, -CH (CH3) CH (CH3) CH (CH3) 2, -CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3) (CH2CH3) , y otros. La frase también incluye los grupos cíclicos tales como los grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo, cicioheptilo, y ciclooctilo, y tales anillos sustituidos con los grupos alquilo de cadena lineal o ramificada, como se definieron anteriormente. La frase también incluye los grupos alquilo policíclicos tales como, pero no limitados a, adamantilo, norbornilo y biciclo [2.2.2] octilo y tales anillos sustituidos con grupos alquilo de cadena lineal y ramificada como se definieron anteriormente. La frase alquilo también incluye los grupos en los cuales uno o más enlaces a uno o varios carbonos o uno o varios hidrógenos, están reemplazados por un enlace a los átomos no de hidrógeno y no de carbono tales como, pero no limitados a, un átomo de halógeno en los haluros tales como flúor, cloro, bromo y yodo; y un átomo de oxígeno en los grupos tales como los grupos hidroxilo, grupos alcoxi, grupos ariloxi y grupos éster; un átomo de azufre en los grupos tales como los grupos tiol, los grupos sulfuro de alquilo y de arilo, los grupos sulfona, grupos sulfonilo, y grupos sulfóxido; un átomo de nitrógeno en los grupos tales como las aminas, las amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas, y enaminas; un átomo de silicio en los grupos tales como en los grupos trialquilsililo, grupos dialquilarilsililo, grupos alquildiarilsililo, y grupos triarilsililo; y otros heteroátomos en otros diversos grupos. Los grupos alquilo son aquellos limitados a los que tienen 1 a 20 átomos de carbono y tantos como 5 heteroátomos adicionales como se describe anteriormente. Los grupos alquilo más preferidos tienen de 1 a 5 átomos de carbono y tantos como 2 heteroátomos . La frase "arilo" se refiere a los grupos arilo sustituidos y no sustituidos que no contienen heteroátomos. De este modo la frase incluye, pero no está limitada a, los grupos tales como fenilo, bifenilo, antracenilo, naftenilo, a manera de ejemplo. Los grupos arilo también incluyen aquellos en los cuales uno de los carbonos aromáticos está enlazado a átomos no de carbono o no de hidrógeno como se describieron anteriormente (en la definición de alquilo) y también incluye los grupos arilo en los cuales uno o más grupos carbonos aromáticos del grupo arilo están enlazados a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo sustituido o no sustituido, como se definieron en la presente. Esto incluye los arreglos de enlace en los cuales dos átomos de carbono de un grupo arilo están enlazados a dos átomos de un grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo para definir un sistema de anillo fusionado (por ejemplo dihidronaftilo o tetrahidronaftilo) . De este modo, la frase "arilo" incluye, pero no está limitada a tolilo, e hidroxifenilo entre otros. La frase "alquenilo" se refiere a los grupos de cadena lineal y ramificada y cíclicos tales como aquellos descritos con respecto a los grupos alquilo como se definieron anteriormente, excepto que al menos un doble enlace existe entre dos átomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a vinilo, -CH=C(H) (CH3) , -CH=C(CH3)2, -C(CH3)=C(H)2, -C (CH3) =C (H) (CH3) , -C (CH2CH3) =CH2, ciciohexenilo, ciclopentenilo, ciclohexadienilo, butadienilo, pentadienilo, y hexadienilo entre otros. Incluidos también están los grupos en los cuales un átomo no de carbono o no de hidrógeno está enlazado a un carbono con doble enlace a otro carbono y aquellos en los cuales uno de los átomos no de carbono y no de hidrógeno están enlazados a un carbono no involucrado en un doble enlace a otro carbono. Los grupos alquenilo son aquellos limitados a los que tienen 2 a 15 átomos de carbono y tantos como 4 heteroátomos adicionales como se describieron anteriormente. Los grupos alquenilo más preferidos tienen de 2 a 5 átomos de carbono y tantos como 2 heteroátomos . La frase "alcoxi" se refiere a los grupos alcoxi sustituidos o no sustituidos de la fórmula -O-alquilo, en donde el punto de enlace es el grupo oxi y el grupo alquilo es como se definió anteriormente. Los grupos alcoxi son aquellos limitados a los que tienen 1 a 20 átomos de carbono y tanto como 5 heteroátomos adicionales, incluyendo el átomo de oxígeno. Grupos alcoxi más preferidos tienen de 1 a 5 átomos de carbono y tantos como 2 heteroátomos, incluyendo el átomo de oxígeno. La frase "alquinilo" se refiere a los grupos de cadena lineal y ramificada tales como aquellos descritos con respecto a los grupos alquilo como se definieron anteriormente, excepto que al menos un triple enlace existe entre 2 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a -C=C(H), -C=C(CH3), -C=C (CH2CH3) , -C(H2)C=C(H) , -C(H)2C=C(CH3) , y -C (H) 2C=C (CH2CH3) entre otros. Se incluyen también los grupos alquinilo en los cuales un átomo no de hidrógeno o no de carbono está enlazado a un carbono enlazado con triple enlace a otro carbono, y aquellos en los cuales un átomo no de carbono o no de hidrógeno está enlazado a un carbono no involucrado en un triple enlace a otro átomo de carbono. Los grupos alquinilo son aquellos limitados a los que tienen 2 a 15 átomos de carbono y tantos como 4 heteroátomos adicionales como se describen anteriormente. Los grupos alquinilo más preferidos tienen de 2 a 5 átomos de carbono y tantos como 2 heteroátomos. La frase "heterociclilo" se refiere a los compuestos de anillo aromático y no aromático que incluyen los compuestos de anillo monocíclico, bicíclico y policíclico tales como, pero no limitados a, quinuclidilo, que contiene 3 o más miembros en el anillo de los cuales uno o más es un heteroátomo tal como, pero no limitado a, nitrógeno, oxígeno y azufre. Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen, pero no están limitados a: anillos insaturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 4 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a pirrolilo, pírrolinilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, dihidropiridilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, triazolilo (por ejemplo 4H-1,2,4-triazolilo, 1H-1 , 2, 3-triazolilo, 2H-1, 2, 3-triazolilo etc.), tetrazolilo, (por ejemplo lH-tetrazolilo, 2H tetrazolilo, etc.); anillos saturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 4 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, pirrolidinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo; grupos heterocíclicos insaturados condensados que contienen 1 a 4 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, indolilo, isoindolilo, indolinilo, indolizinilo, bencimidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, indazolilo, benzotriazolilo; anillos insaturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno tales como, pero no limitados a furanilo; anillos de 3 a 8 miembros insaturados que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno y 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo (por ejemplo 1, 2, 4-oxadiazolilo, 1, 3, 4-oxadiazolilo, 1, 2 , 5-oxadiazolilo, etc.); anillos saturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno y 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, morfolinilo; grupos heterocíclicos condensados insaturados que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno y 1 a 3 átomos de nitrógeno, por ejemplo, benzoxazolilo, benzoxadiazolilo, benzoxazinilo (por ejemplo 2H-1,4-benzoxazinilo etc.); anillos insaturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 3 átomos de azufre y 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo (por ejemplo 1, 2, 3-tiadiazolilo, 1, 2, 4-tiadiazolilo, 1, 3, -tiadiazolilo, 1, 2, 5-tiadiazolilo, etc.); anillos saturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 2 átomos de azufre y 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, tiazolodinilo; anillos saturados e insaturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 2 átomos de azufre tales como, pero no limitados a, tienilo, dihidroditiinilo, dihidroditionilo, tetrahidrotiofeno, tetrahidrotiopirano; anillos heterocíclicos condensados insaturados que contienen 1 a 2 átomos de azufre y 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzotiazinilo (por ejemplo 2H-1, 4-benzotiazinilo, etc.), dihidrobenzotiazinilo (por ejemplo 2H-3, 4-dihidrobenzotiazinilo, etc.), anillos heterocíclicos condensados insaturados que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno tales como benzodioxolilo (por ejemplo 1,3-benzodioxolilo, etc.); anillos insaturados de 3 a 8 miembros que contiene un átomos de oxígeno y 1 a 2 átomos de azufre tales como, pero no limitados a, dihidrooxatiinilo; anillos saturados de 3 a 8 miembros que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno y 1 a 2 átomos de azufre tales como 1, 4-oxatiano; anillos condensados insaturados que contienen 1 a 2 átomos de azufre tales como benzotienilo, benzoditiinilo; y anillos heterocíclicos condensados insaturados que contienen un átomo de oxígeno y 1 a 2 átomos de azufre tales como benzoxatiinilo. Los grupos heterociclilo también incluyen aquellos descritos anteriormente en los cuales uno o más átomos de azufre en el anillo está unido con doble enlace a uno o dos átomos de oxígeno (sulfóxidos y sulfonas) . Por ejemplo, los grupos heterociclilo incluyen tetrahidrotiofeno, óxido de tetrahidrotiofeno, y 1,1-dióxido de tetrahidrotiofeno. Los grupos heterociclilo preferidos contienen 5 ó 6 miembros en el anillo. Grupos heterociclilo más preferidos incluyen morfolina, morfolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, imidazol, pirazol, 1, 2, 3-triazol, 1, 2, 4-triazol, tetrazol, tiomorfolina, tiomorfolina en la cual el átomo de azufre de la tiomorfolina está enlazado a uno o más átomos de oxígeno, pirrol, homopiperazina, oxazolidin-2-ona, pirrolidin-2-ona, oxazol, quinuclidina, tiazol, isoxazol, furano y tetrahidrofurano. "Heterociclilo" también se refiere a aquellos grupos como se definen anteriormente en los cuales uno de los miembros del anillo está enlazado a un átomo no de hidrógeno tal como se describió anteriormente con respecto a los grupos alquilo sustituidos y los grupos arilo sustituidos. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, 2-metilbencimidazolilo, 5-metilbencimidazolilo, 5-clorobenztiazolilo, 1-metilpiperazinilo, y 2-cloropiridilo entre otros. Los grupos heterociclilo son aquellos limitados a los que tienen 2 a 15 átomos de carbono y tantos como 6 heteroátomos adicionales como se describe anteriormente. Los grupos heterociclilo más preferidos tienen de 3 a 5 átomos de carbono y tantos como 2 heteroátomos. El término "sustituido" como es aplicado a un grupo no definido, todavía bien conocido en la técnica tal como fenilo, tendrá el mismo significado con respecto a los sustituyentes adicionales como se describen en la definición de alquilo.

Dentro de la presente invención se debe entender que los compuestos descritos en la presente pueden mostrar el fenómeno de tautomerismo y que los dibujos de las fórmulas dentro de esta especificación pueden representar únicamente una de las posibles formas tautoméricas. Se debe entender que la invención abarca cualquier forma tautomérica que posea actividad antiangiogénica y no ha de estar limitado meramente a cualquiera de las formas tautoméricas utilizadas dentro de los grupos de las fórmulas. Se debe entender también que ciertos compuestos y modalidades de la invención pueden existir en las formas solvatada así como no solvatada tales como, por ejemplo, las formas hidratadas. Se debe entender también que la invención abarca todas las formas solvatadas tales que posean actividad antiangiogénica. La invención también incluye los compuestos isotópicamente marcados, que son estructuralmente idénticos a aquellos descritos anteriormente, pero por el hecho de que uno o más átomos están reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o número de masa usualmente encontrado en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos pueden ser incorporados en los compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, de carbono, de nitrógeno, de oxígeno, de fósforo, de azufre, de flúor y de cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 31P, 32P, 35S, 18F y 36C1, respectivamente. Los compuestos de la presente invención, los profármacos de los mismos, y las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos de los profármacos que contienen los isótopos anteriormente mencionados y/o otros isótopos de otros átomos están dentro del alcance de esta invención. Ciertos compuestos isotópicamente marcados de la presente invención, por ejemplo aquellos en los cuales están incorporados los isótopos radioactivos tales como 3H y 14C, son útiles en los ensayos de distribución de fármacos y/o de tejido sustrato. Los isótopos tritiados, por ejemplo, 3H, y de carbono 14, por ejemplo 14C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y capacidad de detección. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, por ejemplo, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de mayor estabilidad metabólica, por ejemplo vida media incrementada in vivo o requerimientos de dosis reducida y, por lo tanto, pueden ser preferidos en algunas circunstancias. Los compuestos isotópicamente marcados de esta invención y los profármacos de los mismos pueden ser preparados en general al llevar a cabo procedimientos conocidos o referidos y al sustituir un reactivo isotópicamente marcado, fácilmente disponible, por un reactivo no isotópicamente marcado. La referencia a "IL-2" o "interleucina 2" indica un linfocito que es producido por linfocitos normales de sangre periférica y está presente en la sangre a bajas concentraciones. IL-2 fue primeramente descrita por Morgan et al. (1976) Science 193: 1007-1008 y originalmente llamado factor de crecimiento de células T debido a su habilidad para inducir la proliferación del linfocito T estimulado. Ésta es una proteína con un peso molecular reportado en el intervalo de 13,000 a 17,000 (Gillis y Watson (1980) J. Exp. Med. 159: 1709) , y tiene un punto isoeléctrico en el intervalo de 6-8.5. Para los fines de la presente invención, el término "IL-2" está destinado a abarcar cualquier fuente de IL-2, incluyendo fuentes de mamífero tales como, por ejemplo, ratón, rata, conejo, primate, cerdo, mascota de bolsillo y humano, y puede ser nativo u obtenido mediante técnicas recombinantes, tales como los polipéptidos de IL-2 recombinante producidos por hospederos microbianos. La IL-2 puede ser la secuencia polipeptídica natural, o puede ser una variante del polipéptido de IL-2 nativo como se describe en la presente más adelante, siempre y cuando el polipéptido de IL-2 variante conserve la actividad biológica de IL-2 de interés como se define en la presente. Preferentemente, el polipéptido de IL-2 o la variante del mismo es derivado de una fuente humana, e incluye la IL-2 humana que es recombinantemente producida, tal como los polipéptidos de IL-2 humana producidos por los hospederos microbianos, y variantes de los mismos que conservan la actividad biológica de IL-2 de interés. Cualquier composición farmacéutica que comprende IL-2 como un componente terapéuticamente activo puede ser utilizada para practicar la presente invención.

Agentes Anticancerosos Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas en conjunto con otros agentes anticancerosos. En particular, las composiciones serán formuladas ya sea conjuntamente como una combinación terapéutica o bien administradas separadamente. Los agentes anticancerosos para el uso con la invención incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes descritos enseguida : A. Inhibidores de Cinasa Los inhibidores de cinasa para el uso como agentes anticancerosos en conjunto con las composiciones de la presente invención incluyen los inhibidores de las cinasas del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) tales como las quinazolinas de molécula pequeña, por ejemplo gefitinib (US 5457105, US 5616582, y US 5770599), ZD-6474 (WO 01/32651), eriotinib (Tarceva®, US 5,747,498 y WO 96/30347), y lapatinib (US 6,727,256 y WO 02/02552); inhibidores de cinasa del Receptor del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGFR), incluyendo SU-11248 (WO 01/60814), SU 5416 (US 5,883,113 y WO 99/61422), SU 6668 (US 5,883,113 y WO 99/61422), CHIR-258 (US 6,605,617 y US 6,774,237), vatalanib o PTK-787 (US 6,258,812), VEGF-Trap (WO 02/57423), B43-Genisteína (WO-09606116) , fenretinida (p-hidroxifenilamina del ácido retinoico) (US 4,323,581), IM-862 (WO 02/62826), bevacizumab o Avastin® (WO 94/10202), KRN-951, 3-[5-(metilsulfonilpiperidinmetil) -indolil] -quinolona, AG-13736 y AG-13925, pirrolo[2, 1-f] [1,2,4] triazinas, ZK-304709, Veglin®, VMDA-3601, EG-004, CEP-701 (US 5,621,100), Cand5 (WO 04/09769); inhibidores de la tirosina-cinasa Erb2 tales como pertuzumab (WO 01/00245) , trastuzumab, y rituximab; inhibidores de la proteína cinasa AKT, tales como RX-0201; inhibidores de la proteína cinasa C (PKC), tales como LY-317615 (WO 95/17182) y perifosina (US 2003171303); inhibidores de la 3-cinasa de fosfoinosituro (PI3K) incluyendo SF-1126 y PI-103, PI-509, PI-516 y PI-540 (producidos por PIramed) ; inhibidores de cinasa de Raf/Map/MEK/Ras incluyendo sorafenib (BAY 43-9006), ARQ-350RP, LErafAON, BMS-354825 AMG-548, y otros descritos en WO 03/82272; inhibidores de cinasa del receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR) ; inhibidores de la Cinasa Dependiente de Células (CDK) , incluyendo CYC-202 o roscovitina (WO 97/20842 y WO 99/02162); inhibidores de la cinasa del Receptor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PGFR) tales como CHIR-258, 3G3 mab, AG-13736, SU-11248 y SU6668; e inhibidores de la cinasa Bcr-Abl y proteínas de fusión tales como STI-571 o Gleevec®.

B . An ti -Estrógenos Los agentes que se dirigen a los estrógenos para el uso en terapia anti-cáncer en conjunto con las composiciones de la presente invención incluyen los Moduladores del Receptor de Estrógeno Selectivos (SERMs) incluyendo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno; inhibidores de aromatasa incluyendo Arimidex® o anastrozol; Subreguladores del Receptor de Estrógeno (ERDs) incluyendo Faslodex® o fulvestrant .

C. An t i - Andrógenos Los agentes que se dirigen a andrógenos para el uso en terapia anticáncer en conjunto con las composiciones de la presente invención incluyen flutamida, bicalutamida, finasterida, aminoglutetamida, quetoconazol y corticosteroides.

D. Otros Inhibidores Otros inhibidores para el uso como agentes anticancerosos en conjunto con las composiciones de la presente invención incluyen los inhibidores de la proteína farnesil-transferasa incluyendo tipifarnib o R-115777 (US 2003134846 y WO 97/21701), BMS-214662, AZD-3409, y FTI-277; inhibidores de topoisomerasa incluyendo merbarona y diflomotecan (BN-80915) ; inhibidores de la proteína de husillo de cinesina mitótica (KSP) incluyendo SB-743921 y MKI-833; moduladores de proteasa tales como bortezomib o Velcade® (US 5,780,454), XL-784; e inhibidores de ciclooxigenasa 2 (COX-2) incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroides I (NSAIDs) .

E. Fármacos Quimioterapéuticos para el Cáncer Los agentes quimioterapéuticos para el cáncer, particulares para el uso como agentes anticancerosos en conjunto con las composiciones de la presente invención incluyen anastrozole (Arimidex®) , bicalutamida (Casodex®) , sulfato de bleomicina (Blenoxane®) , busulfan (Myleran®) , inyección de busulfan (Busulfex®) , capecitabina (Xeioda®) , N4-pentoxicarboni1-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino ( Paraplatin®) , carmustina (BiCNU®) , clorambucilo (Leukeran®) , cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®) , ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®) , citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®) , inyección liposomal de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®) , dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan) , clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine®) , inyección liposomal de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®) , dexametasona, docetaxel (Taxotere®, US 2004073044), clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®) , etopósido (Vepesid®) , fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®) , flutamida (Eulexin®) , tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesoxicitidina) , hidroxiurea (Hydrea®) , Idarrubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecan (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®) , leucovorina calcica, melfalan (AIkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), mylotarg, paclitaxel (Taxol®) , phoenix (Yttrium90/MX-DTPA) , pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel®) , citrato de tamoxifeno (Nolvadex®) , tenipósido (Vumon®) , 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®) , clorhidrato de topotecan para inyección (Hycamptin®) , vinblastina (Velban®) , vincristina (Oncovin®) , y vinorelbina (Navelbine®) .

F. Agentes Alquilantes Los agentes alquilantes para el uso en conjunto con las composiciones de la presente invención para productos terapéuticos anticancerosos incluyen VNP-40101M o cloretizina, oxaliplatino (US 4,169,846, WO 03/24978 y WO 03/04505) , glufosfamida, mafosfamida, etopofos (US 5,041,424), prednimustina; treosulfan; busulfan; irofluven (acylfulvene) ; penclomedina; pirazoloacridina (PD-115934); 06-bencilguanina; decitabina (5-aza-2-desoxicitidina) ; brostalicina; mitomicina C (MitoExtra) ; TLK-286 (Telcyta®) ; temozolomida; trabectedina (US 5,478,932); AP-5280 (formulación de platinato de cisplatino) ; porfiromicina; y clearazida (mecloretamina) .

G. Agen tes Quelan tes Los agentes quelantes para el uso en conjunto con las composiciones de la presente invención para productos terapéuticos anticancerosos incluyen tetratiomolibdato (WO 01/60814); RP-697; T84.66 quimérico (cT84.66); gadofosveset (Vasovist®) ; deferoxamina; y bleomicina opcionalmente en combinación con electroporación (EPT) .

H. Modifi cadores de la Respuesta Biológica Los modificadores de la respuesta biológica tales como moduladores inmunes, para el uso en conjunto con las composiciones de la presente invención para agentes anticancerosos incluyen las estaurosporina y análogos macrocíclicos de la misma, incluyendo UCN-01, CEP-701 y midostaurina (ver WO 02/30941, WO 97/07081, WO 89/07105, US 5,621,100, WO 93/07153, WO 01/04125, WO 02/30941, WO 93/08809, WO 94/06799, WO 00/27422, WO 96/13506 y WO 88/07045); escualamina (WO 01/79255); DA-9601 (WO 98/04541 y US 6,025,387); alemtuzumab; interferones (por ejemplo IFN-a, IFN-b etc.); interleucinas, específicamente IL-2 o aldesleucina así como IL-I, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, y variantes biológicas activas de los mismos que tienen secuencias de aminoácidos mayores de 70% de la secuencia humana natural; altretamina (Hexalen®) ; SU 101 o leflunomida (WO 04/06834 y US 6,331,555); imidazoquinolinas tales como resiquimod y imiquimod (US 4,689,338, 5,389,640, 5,268,376, 4,929,624, 5,266,575, 5,352,784, 5,494,916, 5,482,936, 5,346,905, 5,395,937, 5,238,944, y 5,525,612); y SMIPs, incluyendo benzazoles, antraquinonas, tiosemicarbazonas, y triptantrinas (WO 04/87153, WO 04/64759, y WO 04/60308) .

I . Va cunas para el cáncer: Las vacunas anticancerosas para el uso en conjunto con las composiciones de la presente invención incluyen Avicine® (Tetrahedron Letters 26, 1974 2269-70) ; oregovomab (OvaRex®) ; Theratope® (STn-KLH) ; vacunas de melanoma; de la serie GI-4000 (GI-4014, GI-4015, y GI-4016) , que están dirigidas a cinco mutaciones en la proteína Ras; GlioVax-1; MelaVax; Advexin® o INGN-201 (WO 95/12660); Sig/E7/LAMP-1, que codifica para HPV-16 E7; la vacuna MAGE-3 o M3TK (WO 94/05304); HER-2VAX; ACTIVE, que estimula las células T específicas para tumores; vacuna para el cáncer GM-CSF; y vacunas basadas en Listeria monocytogenes.

J. Terapia antisentido : Los agentes anticancerosos para el uso en conjunto con las composiciones de la presente invención también incluyendo composiciones antisentido, tales como AEG-35156 (GEM-640); AP-12009 y AP-11014 (oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-beta2) ; AVI-4126; AVI-4557; AVI-4472; oblimersen (Genasense®) ; JFS2; aprinocarsen (WO 97/29780) ; GTI-2040 (oligo antisentido de mARN de reductasa de ribonucleótido R2) (WO 98/05769); GTI-2501 (WO 98/05769); oligodesoxinucleótidos antisentido de c-Raf encapsulados en liposma (LErafAON) (WO 98/43095); y Sirna-027 (mARN de VEGFR-I de objetivo terapéutico basado en el ARNi).

K. IL-2 : Un compuesto IL-2 preferido es la "aldesleucina" o "Proleukin®", fabricado por Chiron Corporation de Emeryville, California. La IL-2 en esta formulación es una muteína de IL-2 humana, no glucosilada, recombinante producida, que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-2 humana natural, por poseer el residuo de alanina inicial, eliminado y el residuo de cisteína en la posición 125 reemplazado por un residuo de serina (denominada como des-alanil-1, interleucina-2 humana de serina-125) . Esta muteína de IL-2 puede ser expresada en E. coli , y subsecuentemente purificada mediante diafiltración y cromatografía de intercambio catiónico como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4, 931,543. La aldesleucina ha sido comparada a la IL-2 natural (Jurkat) ín vi tro . No han sido observadas diferencias significativas y la inducción in vivo de las células citolíticas en ratones y la vida en suero después de la administración IV es equivalente para la aldesleucina y la IL-2 natural (Jurkat) ; aunque existen atributos benéficos de la forma de IL-2 abarcada por aldesleucina y por lo tanto de la referencia a la "aldesleucina" abarca únicamente aquella composición y no todas las posibles formas de la proteína IL-2. En 1983 cuando fue desarrollado el bioensayo de proliferación de linfocitos de Cetus, no existía preparación de referencia de IL-2 oficial, disponible. Una unidad Cetus fue obtenida para esta preparación como en la cantidad de IL-2 en 1 ml que inducía a las células T murinas dependientes de IL-2 a incorporar la timidina tritiada al 50% de su nivel máximo después de 24 horas de incubación. El producto que contenía IL-2 fue asignado con una actividad específica de 3 x 106 unidades Cetus por mg. En 1988, el Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos National Institute of Biological Standards and Controls (NIBSC) , que es un laboratorio de WHO para estándares biológicos en Inglaterra, estableció un Estándar Internacional de IL-2. También en 1988, fue cambiado el procedimiento de ensayo para el bioensayo de proliferación de linfocitos de Cetus. El estándar doméstico de Cetus fue calibrado contra el Estándar Internacional de IL-2 en el nuevo procedimiento de bioensayo. Se estableció el siguiente factor de corrección: Unidades Internacionales = Unidades Cetus x 6 Las cantidades de aldesleucina serán designadas con unidades en masa basado en 1 mg de la aldesleucina que tenga una actividad específica nominal de 18 x 106 Unidades Internacionales (18 MIU) . El protocolo incorpora Unidades Internacionales . Las composiciones farmacéuticas útiles en los métodos de la invención pueden comprender variantes biológicamente activas de IL-2. Tales variantes deben conservar la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, tal que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido variante tiene el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido nativo cuando se administra a un sujeto. Es decir, el polipéptido variante servirá como un componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica, de una manera similar a aquella observada para el polipéptido nativo. Están disponibles los métodos en la técnica para determinar si un polipéptido variante conserva la actividad biológica deseada, y por lo tanto si sirve como un componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica. La actividad biológica puede ser medida utilizando ensayos específicamente diseñados para medir la actividad del polipéptido nativo o la proteína, incluyendo los ensayos descritos en las presentes invenciones. Además, los anticuerpos producidos contra un polipéptido nativo biológicamente activo, pueden ser probados para sus habilidades de enlazarse al polipéptido variante, donde el enlace efectivo es indicador de un polipéptido que tiene una conformación similar a aquella del polipéptido nativo. Para los fines de la presente invención, la actividad biológica de IL-2 de interés es la habilidad de IL-2 para activar y/o expandir las células asesinas naturales (NK) para mediar la actividad asesina activada por linfocitos (LAK) y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . De este modo, una variante de IL-2 (por ejemplo, una luteína de IL-2 humana) para el uso en el método de la presente invención activará y/o expandirá las células NK para mediar la actividad LAK y ADCC. Los ensayos para determinar la activación de IL-2 o la expansión de las células NK y la mediación de la actividad de LAK o ADCC son bien conocidas en la materia. Las variantes biológicamente activas adecuadas de la IL-2 natural o de origen natural, pueden ser fragmentos, análogos y derivados de ese polipéptido. Por "fragmento" se entiende un polipéptido que consiste únicamente de una parte de la secuencia y estructura del polipéptido intacto, y puede ser una supresión C-terminal o una supresión N-terminal del polipéptido nativo. Por "análogo" se entiende un análogo ya sea del polipéptido nativo o de un fragmento del polipéptido nativo, donde el análogo comprende una secuencia del polipéptido nativo y la estructura que tiene una o más sustituciones de aminoácidos, inserciones o supresiones de aminoácidos. "Muteínas", tales como aquellas descritas en la presente, y los polipéptidos que tienen uno o más peptoides (miméticos peptídicos) son también abarcados por el término análogo (ver Publicación Internacional No. WO 91/04282). Por "derivado" se entiende cualquier modificación adecuada del polipéptido nativo de interés o de un fragmento del polipéptido nativo, o de sus análogos respectivos, tales como análogos de glucosilación, fosforilación, de conjugación polimérica (tal como con polietilenglicol) , u otra adición de porciones extrañas, siempre y cuando la actividad biológica deseada del polipéptido nativo sea conservada. Los métodos para elaborar fragmentos, análogos y derivados polipeptídicos, son en general disponibles en la técnica. Por ejemplo, las variantes de las secuencias de aminoácidos del polipéptido pueden ser preparadas mediante mutaciones en la secuencia del ADN clonado que codifica para el polipéptido nativo de interés. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones en la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la materia. Ver por ejemplo, Waiker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) ; Patente de los Estados Unidos No. 4,873,192; y las referencias citadas en éstas; incorporadas por referencia en la presente. La guía respecto a las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés puede ser encontrada en el modelo de Dayhoff et al. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C), incorporada por referencia en la presente. Las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser preferidas. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen, pero no están limitadas a, Gly: Ala, Val: lie: Leu, Asp: Glu, Lys: Arg, Asn: Gln, y Phe: Trp: Tyr. En la construcción de las variantes del polipéptido de IL-2 de interés, son realizadas las modificaciones tales que las variantes continúan poseyendo la actividad deseada, cualesquiera mutaciones elaboradas en el ADN que codifica para el polipéptido variante deben colocar la secuencia fuera de la estructura de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que pudieran producir una estructura de mARN secundaria. Las variantes biológicamente activas de IL-2 en general tendrán al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente aproximadamente 90% a 95% o más, y lo más preferentemente aproximadamente 98% o más de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de la molécula del polipéptido de referencia, que sirve como la base para la comparación. De este modo, donde la molécula de referencia de IL-2 es la IL-2 humana, una variante biológicamente activa de la misma tendrá al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente aproximadamente 90% a 95% ó más, y lo más preferentemente aproximadamente 98% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos para la IL-2 humana. Una variante biológicamente activa de un polipéptido nativo de interés puede diferir del polipéptido nativo por tan pocos como 1-15 aminoácidos, tan pocos como 1-10, tan pocos como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido. Por "identidad secuencial" o "identidad de secuencia" se entiende los mismos residuos de aminoácidos que son encontrados dentro del polipéptido variante y la molécula del polipéptido que sirve como una referencia, cuando un segmento contiguo específico de la secuencia de aminoácidos de las variantes está alineado y comparado de la secuencia de aminoácidos de la molécula de referencia. La identidad secuencial porcentual entre dos secuencias de aminoácidos es calculada al determinar el número de posiciones en las cuales aparece el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias, para producir el número de posiciones con concordancia, dividiendo el número de posiciones con concordancia entre el número total de posiciones en el segmento que sufre comparación a la molécula de referencia, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad secuencial. De este modo, la determinación de la identidad porcentual entre cualesquiera dos secuencias puede ser lograda utilizando un algoritmo matemático. Preferentemente, las variantes naturales o de origen no natural de IL-2 tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 70%, preferentemente 80%, más preferentemente, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ó 95%, idénticas a la secuencia de aminoácidos a la molécula de referencia, por ejemplo, la IL-2 humana natural, o a una porción más corta de la molécula de IL-2 de referencia. Más preferentemente, las moléculas son 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas. El porcentaje de identidad secuencial es determinado utilizando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, utilizando una búsqueda de espacio afinada con una penalidad por apertura de espacio vacío de 12 y una penalidad por extensión de espacio vacío de 2, la matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman es mostrado en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir por tan pocos como 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como as 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido. Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia variante de aminoácidos puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos suprimidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para la comparación a la secuencias de aminoácidos de referencia incluirá al menos veinte (20) residuos de aminoácidos contiguos, y pueden ser 30, 40, 50 o más residuos de aminoácidos. Las correcciones para la identidad secuencial asociada con las sustituciones de residuos conservadoras o espacios vacíos pueden ser realizadas (ver el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman) . La estructura química precisa de un polipéptido que tiene actividad de IL-2 depende de un número de factores. Ya que están presentes grupos amino y carboxilo ionizable en la molécula, puede ser obtenido un polipéptido particular como una sal acida o base, o en forma neutra. Todas las preparaciones tales que conservan su actividad biológica cuando son colocados en condiciones ambientales adecuadas son incluidas en la definición de polipéptidos que tienen actividad de IL-2 como se utiliza en la presente. Además, la secuencia de aminoácidos primaria de los polipéptidos puede ser aumentada por la derivatización utilizando porciones azúcar (glucosilación) o por otras moléculas suplementarias tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Esta puede ser aumentada por la conjugación con sacáridos. Ciertos aspectos de tal aumento son logrados a través de sistemas de procesamiento post-traduccionales del hospedero productor; otras modificaciones tales pueden ser producidas in vitro. En cualquier caso, tales modificaciones son incluidas en la definición de un polipéptido de IL-2 utilizado en la presente, siempre y cuando la actividad IL-2 del polipéptido no sea destruida. Se espera que tales modificaciones puedan afectar de manera cuantitativa o cualitativa la actividad, ya sea mediante el aumento o disminución de la actividad del polipéptido, en los diversos ensayos. Además, los residuos de aminoácidos individuales en la cadena pueden ser modificados mediante oxidación, reducción u otra derivatización, y el polipéptido puede ser escindido para obtener fragmentos que conservan la actividad.

Tales alteraciones que no destruyen la actividad no eliminan la secuencia del polipéptido de la definición de polipéptidos de IL-2 de interés, como se utiliza en la presente . La técnica proporciona una guía sustancial respecto a la preparación y uso de las variantes del polipéptido. En la preparación de las variantes de IL-2, una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente cuáles modificaciones a la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos natural darán como resultado una variante que sea adecuada para el uso como un componente terapéuticamente activo, de una composición farmacéutica utilizada en los métodos de la presente invención. La IL-2 o variantes de la misma para el uso en los métodos de la presente invención puede ser proveniente de cualquier fuente, pero preferentemente es IL-2 recombinante. Por "IL-2 recombinante" se entiende la interleucina-2 que tiene actividad biológica comparable a la secuencia natural de IL-2 y que ha sido preparada mediante técnicas de ADN recombinante como se describe, por ejemplo, por Taniguchi et al. (1983) Nature 302:305-310 y Devos (1983) Nucleic Acids Research 11:4307-4323 o la IL-2 mutacionalmente alterada como se describe por Wang et al. (1984) Science 224:1431-1433. En general, el gen que codifica para IL-2 es clonado y luego expresado en organismos transformados, preferentemente un microorganismo, y lo más preferentemente, E. coli, como se describe en la presente. El organismo hospedero expresa el gen extraño para producir la IL-2 bajo condiciones de expresión. La IL-2 recombinante sintética puede también ser elaborada en eucariotes, tales como células de levadura o de humano. Los procesos para desarrollar, cosechar, perturbar o extraer la IL-2 de las células son sustancialmente descritos en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,604,377; 4,738,927; 4,656,132; 4,569,790; 4,748,234; 4,530,787; 4,572,798; 4,748,234; y 4,931,543. Para ejemplos de las proteínas variantes de IL-2, ver la Publicación de Patente Europea EP 136,489 (la cual describe una o más de las siguientes alteraciones en la secuencia de aminoácidos de la IL-2 de origen natural: Asn26 a Gln26; Trpl21 a Phel21; Cys58 a Ser58 ó Ala58, Cysl05 a Serl05 ó Alal05; Cysl25 a Serl25 ó Alal25; la supresión de todos los residuos después de Arg 120; y las formas de Met-1 de las mismas) ; y las luteínas de IL-2 recombinantes descritas en la Solicitud de Patente Europea No. 83306221.9, presentada el 13 de Octubre de 1983 (publicada el 30 de Mayo de 1984 bajo la Publicación No. EP 109,748), la cual es equivalente a la Patente Belga No. 893,016, y la Patente de los Estados Unidos comúnmente poseída No. 4,518,584 (las cuales describen la muteína de IL-2 humana recombinante en donde la cisteína en la posición 125, numerada de acuerdo con la IL-2 humana natural, está suprimida o reemplazada por un aminoácido neutro; alanil-serl25-IL-2; y las des-alanil-serl25-IL-2) . Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 4,752,585 (la cual describe las siguientes proteínas variantes de IL-2: alal04 serl25 IL-2, alal04 IL-2, alal04 alal25 IL-2, vall04 serl25 IL-2, vall04 IL-2, vall04 alal25 IL-2, des-alai alal04 serl25 IL-2, des-alai alal04 IL-2, 10 des-alai alal04 alal25 IL-2, des-alai vall04 serl25 IL-2, des-alai vall04 IL-2, des-alai vall04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 alal04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 alal04 IL-2, des-alai des-pro2 alal04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 vall04 serl25 IL-2, des-alai des pro2 vall04 IL-2, des-alai des-pro2 vall04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 alal04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 alal04 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 alal04 15 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 vall04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 vall04 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 vall04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des ser4 alal04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall04 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 vallO420 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 serl25 IL-2, des-alai des pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 IL-2, des- alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vall04 serl25 IL-2, des alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 val 104 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vall04 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 25 alal25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 IL-2, des-alai des pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des ser4 des-ser5 des-ser6 vall04 serl25 IL-2, des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des ser6 vall04 IL-2, y des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 vall04 alal25 IL-2) y la Patente de los Estados Unidos No. 4,931,543 (la cual describe la muteína de IL-2 des-alanil-1, serina 30 125 utilizada en los ejemplos de la presente, así como otras muteínas de IL-2) . Ver también la Publicación de Patente Europea No. 200,280 (publicada el 10 de Diciembre de 1986), la cual describe las muteínas de IL-2 recombinantes, en donde la metionina en la posición 104, ha sido reemplazado por un aminoácido conservador. Los ejemplos incluyen las siguientes muteínas: ser4 des-ser5 alal04 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 alal25 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04 serl25 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des ser4 des-ser5 glul04 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04 alal25 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-serd alal04 alal25 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-serd alal04 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 5 des-ser6 alal04 serl25 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-serd glul04 serl25 IL-2; des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04 IL-2; y des-alai des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-serd glul04 alal25 IL-2. Ver también Publicación de Patente Europea No. EP 118,617 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,700,913, las cuales describen las variantes de IL-2 humanas, no glucosiladas que poseen alanina en vez de la mentionina de las IL-2 naturals como el aminoácido N-terminal, una IL-2 humana no glucosilada con la metionina inicial suprimida tal que la metionina es el aminoácido N-terminal; y una IL-2 no glucosilada con una alanina insertada entre la metionina N-terminal y los aminoácidos prolina. Otras muteínas de IL-2 incluyen aquellas descritas en el documento WO 99/60128 (sustituciones del aspartato en la posición 20 con histidina o isoleucina, la asparagina en la posición 88 con arginina, glicina, o isoleucina, o la glutamina en la posición 126 con leucina o ácido glutámico) , las cuales al parecer tienen actividad selectiva para los receptores de IL-2 de alta afinidad expresados por las células que expresan receptores de células T en preferencia a las células NK y toxicidad reducida de IL-2; las muteínas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 5,229, 109 (sustituciones de arginina en la posición 38 con alanina, o sustituciones de fenilalanina en la posición 42 con lisina) , que muestran enlace reducido al receptor de IL-2 de alta afinidad cuando se comparan a la IL-2 natural, mientras que se mantiene la habilidad para estimular las células LAK; las muteínas descritas en la Publicación Internacional No. WO 00/58456 (la alteración o supresión de una secuencia (x)D(y) de origen natural en la IL-2 natural donde D es ácido aspártico, (x) es leucina, isoleucina, glicina, o valina, e (y) es valina, leucina o serina) , que se reclama reducen el síndrome de fuga vascular; el péptido IL-2 pl-30 descrito en la Publicación Internacional No. WO 00/04048 (correspondiente a los primeros 30 aminoácidos de IL-2, que contiene la a-hélice A completa de IL-2 e interactúa con la cadena b del receptor de IL-2), que al parecer estimula las células NK y la inducción de células LAK; y una forma mutante del péptido IL-2 pl-30 también descrito en WO 00/04048 (sustitución de ácido aspártico en la posición 20 con lisina) que al parecer es incapaz de inducir sangrados vasculares, pero permanece capaz de generar células LAK. Además, la IL-2 puede ser modificada con polietilenglicol para proporcionar solubilidad aumentada y un perfil farmacocinético alterado (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,766,106).

El término IL-2, como se utiliza en la presente, está también destinado a incluir las fusiones de IL-2 o conjugados que comprenden IL-2 fusionado a una segunda proteína o covalentemente conjugado a poliprolina o un polímero soluble en agua para reducir las frecuencias de dosificación o para mejorar la tolerancia de IL-2. Por ejemplo, la IL-2 (o una variante de la misma, como se define en la presente) puede ser fusionada a albúmina humana o a un fragmento de albúmina utilizando métodos conocidos en la materia (ver WO 01/79258) . Alternaturalmente, la IL-2 puede ser covalentemente conjugada a la poliprolina o a homopolímeros de polietilenglicol y polioles polioxietilados, en donde el homopolímero está no sustituido o sustituido en un extremo con un grupo alquilo y el poliol está no sustituido, utilizando métodos conocidos en la materia (ver por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,766, 106, 5,206,344, y 4,894,226). Cualquier composición farmacéutica que comprende IL-2 o un componente terapéuticamente activo puede ser utilizada en los métodos de la invención. Tales composiciones farmacéuticas son conocidas en la materia, e incluyen, pero no están limitadas, aquellas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,745,180; 4,766,106; 4,816,440; 4,894,226; 4,931,544; y 5,078,997. De este modo, las composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por rocío, que comprenden IL-2 o variantes de la misma, que son conocidas en la técnica, pueden ser preparadas como una solución o suspensión acuosa o no acuosa, para la administración subsecuente a un sujeto de acuerdo con los métodos de la invención. Cada una de estas composiciones comprenderá IL-2 o variantes de la misma como un componente terapéutica o profilácticamente efectivo. Por "componente profiláctico o terapéuticamente activo" se entiende que la IL-2 o variante de la misma están específicamente incorporados en la composición para dar origen a una respuesta terapéutica o profiláctica deseada con respecto al tratamiento, prevención o diagnóstico de una enfermedad o condición dentro de un sujeto, cuando la composición farmacéutica es administrada a ese sujeto. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende agentes estabilizadores apropiados, agentes de volumen o ambos para reducir al mínimo los problemas asociados con la pérdida de estabilidad de la proteína y actividad biológica durante la preparación y almacenamiento. En modalidades preferidas de la invención, las composiciones farmacéuticas que contienen IL-2, útiles en los métodos de la invención, son composiciones que comprenden la IL-2 monomérica, estabilizada o variante de la misma, las composiciones que comprenden IL-2 multimérica o variantes de la misma, y composiciones que comprenden IL-2 liofilizada o secada por rocío, estabilizada, o variantes de las mismas. Las composiciones farmacéuticas que comprenden la IL-2 monomérica estabilizada o variantes de la misma, son descritas en la Publicación Internacional No. WO 01/24814, titulada "Composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos, líquidas, estabilizadas". Por IL-2 "monoméricas" se entienden las moléculas de proteína que están presentes sustancialmente en su forma monomérica, no en una forma agregada, en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente. Por lo tanto, los oligómeros agregados covalentes o hidrofóbicos de IL-2 no están presentes. En resumen, la IL-2 en estas composiciones líquidas es formulada con una cantidad de una base de aminoácido suficiente para disminuir la formación del agregado de la IL-2 durante el almacenamiento. La base de aminoácido es un aminoácido o una combinación de aminoácidos, donde cualquier aminoácido dado está presente ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Los aminoácidos preferidos se seleccionan del grupo que consiste de arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. Estas composiciones comprenden además un agente amortiguador para mantener el pH de las composiciones líquidas dentro de un intervalo aceptable para la estabilidad de la IL-2, donde el agente amortiguador es un ácido sustancialmente libre de su forma de sal, un ácido en su forma de sal o una mezcla de un ácido y su forma de sal. Preferentemente, el ácido se selecciona de un grupo que consiste de ácido succínico, ácido cítrico, ácido fosfórico y ácido glutámico. Tales composiciones son referidas en la presente como composiciones farmacéuticas de IL-2 monomérica, estabilizadas. La base de aminoácidos en estas composiciones sirve para estabilizar la IL-2 contra la formación de agregados durante el almacenamiento de la composición farmacéutica líquida mientras que el uso de un ácido sustancialmente libre en su forma de sal, un ácido en su forma de sal, o una mezcla de un ácido y su sal como el agente amortiguador, da como resultado una composición líquida que tiene una osmolaridad que es casi isotónica. La composición farmacéutica líquida puede además incorporar otros agentes estabilizadores, más particularmente metionina, un surfactante no iónico tal como polisorbato 80, y EDTA, para incrementar adicionalmente la estabilidad del polipéptido. Tales composiciones farmacéuticas líquidas se dice que están estabilizadas, por la adición de base de aminoácido en combinación con un ácido sustancialmente libre de su forma de sal, un ácido en su forma de sal o una mezcla de un ácido y su forma de sal, da como resultado las composiciones que tienen estabilidad incrementada al almacenamiento con relación a las composiciones farmacéuticas líquidas formuladas en ausencia de la combinación de estos dos componentes. Estas composiciones farmacéuticas líquidas que comprenden IL-2 monomérica estabilizada pueden ser utilizadas ya sea en una forma líquida acuosa o almacenadas para el uso posterior en un estado congelado, o en una forma anhidra para la reconstrucción posterior en un líquido, u otra forma adecuada para la administración a un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención. Por "forma seca o anhidra" se entiende la composición farmacéutica líquida o formulación que es secada ya sea mediante secado por congelamiento (por ejemplo, liofilización; ver por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol . 38:48 59), secado por rocío (ver Masters (1991) en Spray-Drying Handbook (Sth ed; Longman Scientific and Technical, Essez, Reino Unido), pp . 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; y Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), o secado al aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; y Roser (1991) Biopharm. 4:47-53) . Otros ejemplos de formulaciones de IL-2 que comprenden IL-2 en su estado monomérico no agregado incluyen aquellas descritas en Whittington y Faulds (1993) Drugs 46 ( 3 ) : 446-514. Estas formulaciones incluyen el producto de IL-2 recombinante en el cual la muteína de IL-2 recombinante, Teceleucina (11-2 humana no glucosilada con un residuo de metionina agregado al extremo amino) es formulada con albúmina sérica humana al 0.25% en un polvo liofilizado que es reconstituido en solución salina isotónica, y la muteína de IL-2 recombinante, Bioleucina (IL-2 humana con un residuo de metionina agregado en el extremo amino, y una sustitución del residuo de cisteína en la posición 125 de la secuencia de IL-2 humana con alanina), formulada tal que 0.1 a 1.0 mg/ml de muteína IL-2 es combinada con ácido, en donde la formulación tiene un pH de 3.0 a 4.0, 10 ventajosamente sin amortiguador, y una conductividad de menos de 1000 mmhos/cm (ventajosamente menos de 500 mmhos/cm) . Ver Patente Europea EP 373,679; Xhang et al. (1996) Pharmaceut. Res. 13 ( 4 ) : 643-644 , y Prestrelski et al. (1995) Pharmaceut. Res. 12 ( 9 ): 1250-1258. Los ejemplos de composiciones farmacéuticas que comprenden IL-2 multimérica son descritos en la Patente de los Estados Unidos comúnmente poseída No. 4,604,377. Por "mult imérico ( a ) " se entiende que son las moléculas de proteína que están presentes en la composición farmacéutica en una forma microagregada que tienen una asociación promedio de 10-50 moléculas. Estos multímeros están presentes como moléculas de IL-2 físicamente asociadas, enlazadas flojamente. Una forma liofilizada de estas composiciones está comercialmente disponible bajo el nombre comercial Proleukin® IL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, California). Las formulaciones liofilizadas descritas en esta referencia comprenden IL-2 recombinante microbianamente producida, selectivamente oxidada, en la cual la IL-2 recombinante es mezclada con un portador soluble en agua tal como manitol que proporciona volumen, y una cantidad suficiente de dodecil-sulfato de sodio para asegurar la solubilidad de la IL-2 recombinante en agua. Estas composiciones son adecuadas para la reconstrucción en inyecciones acuosas para la administración parenteral y son estables y bien toleradas en pacientes humanos. Cuando es reconstituida, la IL-2 conserva su estado multimérico. Tales composiciones liofilizadas o líquidas que comprenden IL-2 multimérica son abarcadas por los métodos de la presente invención. Tales composiciones son denominadas en la presente como composiciones farmacéuticas de IL-2 multimérica. Los métodos de la presente invención pueden también utilizar composiciones farmacéuticas liofilizadas o secadas por rocío, estabilizadas, que comprenden IL-2, que pueden ser reconstituidas en un líquido u otra forma adecuada para la administración de acuerdo con los métodos de la invención. Tales composiciones farmacéuticas son descritas en la Publicación Internacional No. WO 01/49274 titulada "Métodos para la distribución pulmonar de interleucina-2" . Estas composiciones pueden comprender además al menos un agente de volumen, al menos un agente en una cantidad suficiente para estabilizar la proteína durante el proceso de secado, o ambas. Por "estabilizado" se pretende que la proteína IL-2 o variantes de la misma, conserven su forma monomérica o multimérica, así como sus otras propiedades clave de calidad, pureza y potencia después de la liofilización o el secado por rocío, para obtener la forma de polvo sólido o seco de la composición. En estas composiciones, los materiales portadores preferidos para el uso como un agente de volumen incluyen glicina, manítol, alanina, valina, o cualquier combinación de las mismas, más preferentemente, glicina. El agente de volumen está presente en la formulación en el intervalo de 0% a aproximadamente 10% (p/v) , dependiendo del agente utilizado. Los materiales portadores preferidos para el uso como un agente estabilizador incluyen cualquier azúcar o alcohol de azúcar o cualquier aminoácido. Los azúcares preferidos incluyen sucrosa, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, sorbitol, glucosa, lactosa, dextrosa o cualquier combinación de las mismas, preferentemente sucrosa. Cuando el agente estabilizador es un azúcar, éste está presente en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 9.0% (p/v), preferentemente aproximadamente 0.5% a aproximadamente 5.0%, más preferentemente aproximadamente 1.0% a aproximadamente 3.0%, lo más preferentemente aproximadamente 1.0%. Cuando el agente estabilizador es un aminoácido, éste está presente en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 1.0% (p/v), preferentemente aproximadamente 0.3% a aproximadamente 0.7%, lo más preferentemente aproximadamente 0.5%. Estas composiciones estabilizadas liofilizadas o secadas por rocío pueden comprenden opcionalmente metionina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o una de sus sales tales como EDTA disódico u otro agente quelante, que protegen a la IL-2 o las variantes de la misma contra la oxidación de la metionina. El uso de estos agentes de esta manera es descrito en la Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 09/677,643, incorporada por referencia en la presente. Las composiciones liofilizadas o secadas por rocío, estabilizadas pueden ser formuladas utilizando un agente amortiguador, el cual mantiene el pH de la composición farmacéutica dentro de un intervalo aceptable, preferentemente entre aproximadamente pH 4.0 hasta aproximadamente pH 8.5, cuado están en una fase líquida tal como durante el proceso de formulación o después de la reconstitución de la forma seca de la composición. Los amortiguadores son elegidos tal que éstos son compatibles con el proceso de secado y no afectan la calidad, la pureza, la potencia y la estabilidad de la proteína durante el procesamiento después del almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas de IL-2 monómericas, multiméricas, y liofilizadas o secadas por rocío, estabilizadas, previamente descritas representan composiciones adecuadas para el uso en los métodos de la invención. No obstante, cualquier composición farmacéutica que comprende un compuesto de IL-2 como un componente terapéuticamente activo es abarcado por los métodos de la invención. También se proporciona en la presente un kit o envase que contiene al menos una composición en combinación de la invención, acompañada por instrucciones para el uso. Por ejemplo, en casos en los cuales cada uno de los fármacos mismos son administrados como formas de dosis individuales o separadas. El kit comprende cada uno de los fármacos junto con las instrucciones para el uso. Los componentes farmacológicos pueden ser envasados de cualquier manera adecuada para la administración, siempre y cuando el envasado, cuando se considere junto con las instrucciones para administración, indica claramente la manera en la cual va a ser administrado cada uno de los componentes farmacéuticos. Alternaturalmente, cada uno de los compuestos farmacéuticos de la combinación pueden ser combinados en una forma de dosis administrable única tal como una composición simple. Por ejemplo, para un kit ilustrativo que comprende rIL-2 y un agente antiangiogénico, el kit puede ser organizado mediante cualquier periodo de tiempo apropiado, tal como por día. Como un ejemplo, para el Día 1, un kit representativo puede comprender dosis unitarias de cada uno de rIL-2 y el agente antiangiogénico. Si cada uno de los fármacos van a ser administrados dos veces al día, entonces el kit puede contener, correspondiente al Día 1, dos hileras de formas de dosis unitaria de cada de rIL-2 y el agente antiangiogénico, con instrucciones para la sincronización de la administración. Alternaturalmente, si uno o más de los fármacos difieren en la sincronización o cantidad de fármaco que va a ser administrado en comparación a los otros miembros farmacéuticos de la combinación, entonces tal cosa podría ser reflejada en el envasado y en las instrucciones. Por ejemplo, si la rIL-2 va a ser administrada dos veces al día, y el agente antiangiogénico va a ser tomado una vez al día, el empaquetamiento ejemplar de un día, puede corresponder a las formas de dosis unitarias de rIL-2, como "Día 1, Dosis 1 " , junto con las formas de dosis para el agente antiangiogénico correspondiente a "Día 1, Dosis 2".

Pueden ser fácilmente consideradas diversas modalidades de acuerdo a lo anterior, y podrían por supuesto, depender de la combinación particular de los fármacos empleados para el tratamiento, sus formas de dosis correspondientes, las dosis recomendadas, la población de pacientes destinadas y similares. El envasado puede ser cualquier forma comúnmente empleada para envasar los productos farmacéuticos, y puede utilizar cualquiera de un número de características tales como diferentes colores, envolturas, envases resistentes al uso inadecuado, paquetes tipo blister, desecadores y similares .

EJEMPLOS En seguido se encuentran ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos son ofrecidos para fines ilustrativos únicamente, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera. Han sido realizados esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero por supuesto, pueden ser permitidos algunos errores experimentales y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1 Composiciones para la co-administración con rIL-2 A. COMPUESTOS Tabla 3 : Compuestos adicionales Compuesto Estructura Nombre Patente N-( -clorofenil)-4-((piridin-4- ¡l)metil)ftalaz¡n-1-amin 10 US 6.258.812 Tabla 4: Compuesto Macrocíclico Tabla 5: Compuestos de Isoindolinona 11 B . Síntesis QUINAZOLINAS Esquema de reacción 1: El Esquema de reacción 1 describe un método modular para sintetizar una gran cantidad de compuestos de quinazolina sustituidos. La referencia a AG indica un grupo de activación tal como, por ejemplo, un haluro, triflato o cetona, en donde tantos como cuatro grupos AG pueden estar presentes. Ya que la posición 4-cloro, mostrada en el tercer paso, es más activa que la posición 5-8 sobre el anillo de bencilo, el desplazamiento con NHRR' puede proceder sin mucho desplazamiento concomitante de AG en cualquiera de las posiciones 5-8. El desplazamiento subsiguiente del grupo AG por R" en el paso final puede proceder en presencia de una base débil a moderada. Alternaturalmente, el o los grupos AG pueden ser modificados para producir el producto deseado, por ejemplo, un grupo N02 puede ser reducido con Fe y AcOH en etanol y agua para producir un sustituyente amino, que puede ser posteriormente sustituido, por ejemplo, mediante aminación reductiva con paraformaldehído. Como será aparente por una persona experta en la técnica, una plétora de materiales iniciales de 2-aminobenzamida funcionalizados son ya sea comercialmente disponibles, o fácilmente sintetizados mediante procedimientos conocidos. Subsiguientemente, el o los grupos AG en el material inicial pueden ser un sustituyente deseado en el producto final (como en R") , tal como, por ejemplo uno o varios grupos alcoxi o uno o varios grupos alquilo sustituidos. Además, están disponibles un número de materiales iniciales de 2-nitrobenzamida funcionalizados, los cuales son fácilmente convertidos al material inicial de 2-aminobenzamida en presencia de un agente reductor, tal como H2/Pd/C en etanol. Los métodos alternativos para elaborar las quinazolinas de la invención son descritos en WO 04/24703, WO 01/32651, US 5,457,105, US 5,616,582, US 5,770,599, WO 02/16351, US 6,727,256, WO 02/02552, US 5,747,498, y WO 96/30347.

INDOLINONAS Esquema de reacción 2a: El Esquema de reacción 2a es realizado como un procedimiento en un solo recipiente, con reactivos en el paso a que son hidróxido de amonio, CuCl en agua. Seguido por adición de HCl acuoso en el paso b. R2-Rs son como se definen en la presente.

En el Esquema de reacción 2b, los reactivos son agitados en etanol, en presencia de piperidina (a) para proporcionar el producto final. Como será aparente por una persona experta, la reacción puede ser calentada para mejorar el rendimiento, dependiendo de la reactividad de los materiales iniciales particulares.

Esquema de reacción 2c: En el Esquema de reacción 2c, los reactivos son calentados a reflujo en etanol en presencia de NaOBu-t (a) para proporcionar el producto final. Rg como se muestra en el Esquema 2, es hidrógeno, -OH, -CN, alquilo, arilo, heterociclilo, alcoxi, o -NR3Rb como se define en la presente. Se contempla que la estructura anterior puede reemplazar a la fórmula II para permitir la sustitución en R9, con lo cual todos los otros sustituyentes son como se definen en la presente .

Esquema de reacción 2d (Síntesis del compuesto 6) : 74% FTALAZINAS La preparación de las ftalazinas sustituidas con el compuesto 10, se describe como sigue, como se extrae de la Patente de los Estados Unidos No. 6,258,812, la cual también incluye otros esquemas de reacción que pueden ser de auxilio en la síntesis de los compuestos de la presente invención.

Esquema de reacción 3a: Clorhidrato de 1- (4-cloroanilino) -4- (4-piridilmetil) ftalazina Una mezcla de 15.22 g (59.52 mmol) l-cloro-4- ( 4-piridilmetil) ftalazina (para la preparación ver Germán Auslegeschriftno. 1 061 788 publicada el 23 de Julio de 1959]), 7.73 g (60.59 mmol) de 4-cloroanilina y 200 ml de 1-butanol se calienta por 2 horas a reflujo. El cristalizado que es obtenido cuando la mezcla se enfría lentamente hasta 5°C es luego filtrado y lavado con 1-butanol y éter. El residuo del filtro es disuelto en aproximadamente 200 ml de metanol caliente, la solución se trata con 0.75 g de carbón activado y se filtra por medio de Hyflo Super Cel, y el pH del filtrado es ajustado a aproximadamente 2.5 con 7 ml de HCl metanólico 3N. El filtrado se evapora hasta aproximadamente la mitad del volumen original y se agrega éter hasta que aparece una ligera turbidez; el enfriamiento conduce luego a la precipitación de los cristales. El cristalizado se filtra, se lava con una mezcla de metanol/éter (1:2) así como éter, se seca por 8 horas a 110°C, baja HV, y se equilibra por 72 horas a 20°C y a presión atmosférica. De esta manera, el compuesto del título es obtenido con un contenido de agua de 8.6%; p.f. >270°C; RMN XH (DMSO-d6) 11.05-12.20 (amplio), 9.18-9.23 (m, ÍH) , 8.88 (d, 2H) , 8.35-8.40 (m, ÍH) , 8.18-8.29 (m, 2H) , 8.02 (d, 2H) , 7.73 (d, 2H) , 7.61 (d, 2H) , 5.02 (s, 2H) ; ESI-MS: (M+H)+ = 347.

Esquema de reacción 3b: Clorhidrato de 1- ( 4-cloroanilino) -4- (4-piridilmetil) ftalazina Una mezcla de 0.972 g (3.8 mmol) l-cloro-4- (4-piridilmetil) ftalazina, 0.656 g (4 mmol) clorhidrato de 4-cloroanilina (Research Organics, Inc., Cleveland, Ohio, Estados Unidos) y 20 ml etanol se calienta por 2 horas a reflujo. La mezcla de reacción se enfría en un baño de hielo, se filtra, y el cristalizado se lava con un poco de etanol y éter. Después de secar bajo HV por 8 horas a 110°C, y por 10 horas a 150°C, se obtiene el compuesto del título como resultado de la eliminación térmica del HCl; p.f. >270°C; RMN 1H (DMSO-d6) 9.80-11.40 (amplio), 8.89-8.94 (m, ÍH) , 8.67 (d, 2H), 8.25-8.30 (m, ÍH) , 8.06-8.17 (m, 2H) , 7.87 (d, 2H), 7.69 (d, 2H) , 7.49 (d, 2H) , 4.81 (s, 2H) ; ESI-MS: (M+H)+ =347.

Esquema de reacción 3c: Clorhidrato de 1- (4-cloroanilino) -4- (4-piridilmetil) ftalazina Una mezcla de 1.28 g (5 mmol) l-cloro-4- (4-piridilmetil) ftalazina, 0.67 g (5.25 mmol) 4-cloroanilina y ml de 1-butanol se calienta por 0.5 horas a 100°C mientras que se agita en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfría luego a temperatura ambiente se filtra y el filtrado se lava con 1-butanol y éter. Para la purificación, el cristalizado se disuelve en 40 ml de metanol caliente, la solución se trata con carbón activado, se filtra por medio de Hyflo Super Cel, y el filtrado se evapora hasta aproximadamente la mitad de su volumen original, dando como resultado la formación de un precipitado cristalino. Después del enfriamiento a 0°C, filtración, lavado del residuo del filtro con éter, y secado bajo HV por 8 horas a 130°C, se obtiene el compuesto del título; p.f. >270° C; RMN 1H (DMSO-d6) 9.80-11.40 (amplio), 8.89-8.94 (m, ÍH) , 8.67 (d, 2H) , 8.25-8.30 (m, ÍH) , 8.06-8.17 (m, 2H) , 7.87 (d, 2H) , 7.69 (d, 2H), 7. 49 (d, 2H) , 4.81 (s, 2H) ; ESI-MS: (M+H)+ = 347.

Ejemplo 2 Preparación de rIL-2 Preparación de Aldesleucina, rIL-2 (NSC3773364) (Proleukin®, Chiron) : El ARN mensajero proveniente de la línea de células Jurkat humanas se utiliza para crear cADN (ácido desoxirribonucleico) de doble hebra, el cual se hibrida en los plásmidos pBR322. Un clon que contiene el gen de IL-2 es identificado utilizando una sonda oligonucleotídica marcada con 32P, correspondiente a una secuencia base de IL-2 de longitud corta. El gen es insertado dentro de una región del plásmido pBR322, que tiene un sitio de restricción conveniente. El promotor apropiado y el sitio de enlace al ribosoma es insertado enfrente del gen de IL-2, y el clon de expresión resultante codifica para un rIL-2 recombinante modificado. La mutagénesis in vitro del IL-2 clonado es utilizado para realizar una sustitución conservadora de serina por cisteína en la posición 125. La molécula resultante es indistinguible de IL-2 natural en su actividad biológica in vitro. Una cepa de producción de E. coli que posee el gen de la aldesleucina es desarrollada en fermentadores. El cultivo es cosechado y se extrae la aldesleucina. Se realizan una serie de pasos cromatográficos para purificar la aldesleucina. El producto formulado es ajustado a pH 7.2-7.8. El peso molecular de Proleukin® es de aproximadamente 15,600 daltones. El análisis mediante la composición de aminoácidos y el secuenciamiento N-terminal ha confirmado que la aldesleucina tiene la secuencia predicha de proteínas .

Procedimiento de Reconstitución y Dilución: Proleukin® es una torta liofilizada en frascos de 5 cm3 que contienen 1.3 mg de proteína. Los frascos de Proleukin® para la inyección son reconstituidos con 1.2 ml de agua estéril para inyección, USP. El diluyente es dirigido contra el lado del frasco para evitar la formación de espuma en exceso, agitando los contenidos suavemente hasta que se disuelven completamente, mientras que se evita la sobreagitación. Cuando se reconstituye cada ml contiene 1.1 mg (18 millones de IU) de Proleukin®. Proleukin® reconstituida es adecuada para la inyección intravenosa directamente o puede ser diluida como sea necesario en volúmenes de 50 ml hasta 500 ml con 5% de inyección de dextrosa, USP con 0.1% de albúmina humana, USP. Cuando se diluye, la albúmina humana, USP es agregada a la inyección de dextrosa al 5% USP, antes de la adición de la Proleukin® reconstituida .

Ejemplo 3 La composición de rIL-2 de agente simple versus terapia en combinación con la composición de rIL-2 y agentes antiangiogénicos Los resultados de la rIL-2 de alta dosis han sido resumidos en la tabla 6.

Tabla 6: Pruebas de los esquemas de infusión de bolos de rIL-2 con agente simple1 Autores Programación Intervalo de Número de CR PR Duración de de rlL-2 dosis (M I U) pacientes respuesta media/supervivencia At ins et al.(7) Q 8 hrs Días 1-5 24/m2 71 16+/15.5 Fyfe et al.(8) Q 8 hrs Días 1 -5 0.6-0.72/kg 255 12 24 20.3/16.3 Yang et al.(9) Q 8 hrs Días 1-5 0.72/kg 65 11 NS Q8 hrs Días 1-5 0.072/kg 60 NS Rosenberg et Q 8 hrs Días 1-5 0.72/kg 149 10 20 15/20 al.(IO) Rosenberg et Q 8 hrs Días 1-5 0.72/kg 48 4 6 NS al.(11) Taneja et Q 8 hrs Días 1-5 0.6-0.72/lcg 28 1 4 NS al.(12) Bukowsld et al. 3 x por semana 60/m2 41 1 5 5/10.8 (13) Abrams et al Q 8 hrs Días 1-5 0.06/kg 16 0 0 NS [Abrams, 1990, #30] Total (%) 733 38 83 (5.2) (11.3) rIL-2: interleucina-2 recombinante; MIU: Millones de unidades internacionales; CR: respuesta completa; PR: respuesta parcial; q: cada uno; NS: no establecido. Respuesta completa + respuesta parcial = 16.5% (intervalo de confidencia del 95%, 13.8%-19.2%) . 1 Adaptado en parte de Bukowski (39) .

Un número de factores han dado origen al ímpetu para terapias en combinación con composiciones antiangiogénicas. La morbididad significativa asociada con la alta dosis de rIL-2 requirió selección cuidadosa de los pacientes, disminuyendo dramáticamente el número de pacientes potenciales quienes pueden beneficiarse de la terapia. Desafortunadamente, la enfermedad concomitante es más frecuentemente encontrada en aquellos quienes tienen la incidencia más alta de RCC. El requerimiento para el monitoreo cuidadoso de los pacientes y el cuidado médico intensivo ocasional han hecho costosa la administración de rIL-2 de alta dosis de agente simple, y han restringido su uso a centros médicos grandes. El efecto práctico de lo cual es restringir la disponibilidad únicamente a una minoría de pacientes . Dosis más bajas de rIL-2 han sido críticamente evaluadas como se observa en la tabla 7.

Tabla 7: Pruebas en fase II de rIL-2 de agente simple Esquemas subcutáneos1 Duración / Media intervalo de dosis media3 Respuesta / Programación (MIU) Número de CR PR autores de rl -2 pacientes Sobrevivencia Schomburg et 5 días/semanas 4.8-14.4/m2/ 15 NS al. x 8 semanas día Lissoni et al. Dias 1 y 2 18.0/m2/día 14 9+/NS 5 días/semanas 3.6/m2/día x 6 semanas Lissoni et al. Días 1 y 2 18.0/m2/día 50 1 13 13+/14+ 5 días/semanas 6.0/m2/día x 6 semanas López 5 18.0/m /día 16 0 1 NS Hanninen et al días/semanas, semanas 1-6 Buter et al. Días 1-5 18.07m2/día 47 2 7 11.0/12.0 Días 8- 12, etc. 9.0/m2/día Casamassima Dias 1 y 2 18.0/m2/día 11 0 2 NS et al. Días 8- 12, etc. 3.6/m2/día deLena et al. Días 1 y 2 18.0/m2/día 10 0 1 NS Días 8-12, etc. 3.6/m2/día Whitehead et Elevación de 3.0- 15 0 0 NS al. dosis cada 30.0/m /día 2 semanas Marumo et al. i.v. (2 hr, días 1.0/m2/día 12 3 0 1-28) 31.0/NS Luego cada día 1 .0/m2/día Total (%) 190 6(3.2) 28(14.7) rIL-2: interleucina-2 recombinante; MIU: Millones de unidades internacionales; CR: respuesta completa; PR: 1 respuesta parcial; q: cada uno; NS: no establecido; i.v.: intravenosa . Respuesta completa + respuesta parcial = 18.6% (intervalo de confianza del 95%, 15.8%-21.5%) . a Dosis total b Tipo de unidad no especificado 1 Adaptado en parte de Bukowski El régimen subcutáneo más comúnmente utilizado ha sido publicado por Buter et al. En Buter, rIL-2 fue administrado una vez al día, 5 días por semana por 6 semanas. Durante el primer ciclo de 5 días, se administraron 18 x 106 IU (MIU) una vez al día; en los siguientes ciclos, las dosis después de los primeros 2 días fueron reducidas a 9 MIU. Las promociones de respuesta y los datos de supervivencia fueron similares a aquellos publicados para la administración de bolo IV de alta dosis de rIL-2. El régimen de Buter/Sleij fer ha sido comparado recientemente a rIL-2 de alta dosis en una prueba aleatorizada prospectiva. Noventa y seis pacientes fueron repartidos aleatoriamente a rIL-2 IV de alta dosis y noventa y seis pacientes a SQ rIL-2 (esquema de dosis de Buter/Sleijfer) . Previamente, la respuesta a la alta dosis de rIL-2 fue de 20% y a rIL-2 SQ fue de 10%. No obstante, la supervivencia general no fue diferente (p = 0.34) de la alta dosis. Como tal, un catalizador para la combinación con una composición antiangiogénica existe para incrementar la eficacia y la capacidad de respuesta general a los pacientes al régimen de más baja dosis. Los regímenes para combinaciones de aldesleucina con agentes antiangiogénicos son críticamente evaluados, como se observa en la tabla 8.

Tabla 8: Tratamiento, dosis y duración.

• Una dosis de agente antiangiogénico (igual a la dosis planeada de acuerdo al nivel de dosis) es administrada en el día -7. El agente antiangiogénico es administrado nuevamente en el día 1 y luego cada 2 semanas continuamente en un sitio de tratamiento de 8 semanas.

El tratamiento con rIL-2 es continuado por semanas consecutivas (días 1-42, Lunes-Viernes de cada semana) seguido por un periodo de descanso de 2 semanas, dando como resultado un ciclo de tratamiento de 8 semanas.

Ejemplo 4 Terapia en combinación con rIL-2 e inhibidores de tirosina- cinasa del receptor de molécula pequeña BAY43-9006 y SUI12 8 A. Materiales y métodos Fármacos La interleucina 2 humana recombinante (Proleukin®, Aldesleucina/rIL-2) ; 18 MlU/ml, Chiron Corporation, Emeryville, CA) fue reconstituida con agua estéril para inyección y formulada en 5% de dextrosa antes de la administración. La vincristina (sulfato de vincristina) proveniente de Mayne Pharma Ltd (Mulgrave, Australia) . CHIR- 258 es 4-amino-5-fluoro-3- [5- (4-metilpiperazin-l-il) -1H-bencimidazol-2-il]quinolin-2 (ÍH) -ona (Chiron). BAY 43-9006 (Sorafanib/Nexavar®) (Riedl et al., Proc . Am . Assoc . Cáncer Res . 2001 42 (Abs 4956); Lowinger et al., Curr . Pharm . Des . 2002 8 (25) :2269-2278; WO 9932455) y SUI 1248 (Sunitinib/Sutent®) (Sun et al., J. Med. Chem . 2003 46(7) :1116-1119; WO 0160814) fueron sintetizadas y purificadas domésticamente de acuerdo a los procedimientos y patentes publicadas. Las soluciones de reserva de 43-9006 o SU11248 (20 mM) fueron preparadas en DMSO, y las alícuotas fueron almacenadas a -20°C antes del uso. Para los ensayos in vi tro, todos los fármacos fueron diluidos en medio de cultivo óptimo. Para la administración in vivo se formuló BAY 43-9006 en 100% de PEG 400 como vehículo, mientras que las soluciones de dosis de SU11248 fueron preparadas en amortiguador de citrato 5 mM. Todos los otros productos químicos utilizados fueron de grado investigación.

Líneas celulares Todas las líneas celulares murinas, CTLL-2 (línea de célula T dependiente de IL-2), melanoma B16-F10, colon CT26 y carcinoma renal RENCA se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (Rockville, MD) . CTLL-2 fue desarrollada en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS (suero fetal bovino, Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD) , L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 25 mM, rIL-2 0.5 mM, ß-mercaptoetanol 2 mM. Las células RENCA fueron cultivadas en un medio que contenía EMEM con 10% de FBS, 2% de vitamina 100X, 1% de glutamina 200 mM, NaPy 100 mM al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%. Para desarrollar las células CT26, los medios contenían EMEM, 10% de FBS, 2% de vitaminas, 1% de glutamina 200 mM, 1% de piruvato de sodio 100 mM, 1% de aminoácidos no esenciales. Las células B16-F10 fueron desarrolladas en RPMI 1640 con 10% de FBS, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio 100 mM, 2% de vitaminas; l-glutamina 2 mM; 2% de bicarbonato de sodio. Las células Yac-1 (ATCC) fueron cultivadas en RPMI + 10% de FBS y subcultivadas 1-2 días antes del ensayo para asegurar el crecimiento de fase logarítmica. Las células fueron mantenidas como suspensión con cultivos adherentes en una atmósfera humidificada a 37°C y 5% de C02. Las células fueron utilizadas en fase de crecimiento exponencial (no excediendo 6-8 pases) con viabilidad >98% (evaluado utilizando tinción con azul de tripan) y se determinó libre de micoplasma.

Estudios de eficacia in vivo Ratones hembra BALB/c o C57BL6 (de 4-6 semanas de edad, 18-22 g) fueron obtenidos de Charles River (Wilmington, MA) y aclimatados por 1 semana en alojamiento libres de patógeno antes del inicio del estudio. Los animales recibieron croquetas para roedor estériles y agua ad libi tum y se alojaron en jaulas con filtros superiores estériles con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad. Todos los experimentos fueron bajo los lineamientos de la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio . Para la implantación tumoral, las células B16-F10 (2 x 106) , CT26 (2 x 106) o RENCA (1 x 106) fueron cosechadas, lavadas tres veces, y resuspendidas en PBS. Los ratones fueron afeitados sobre el flanco, e implantados con 0.2 ml subcutáneamente dentro del flanco derecho de los ratones. Para el modelo de tumor B16-F10, se utilizaron ratones C57BL6, mientras que los tumores CT26 y RENCA fueron implantados en ratones BALB/c. Los tratamientos fueron iniciados cuando los tumores fueron establecidos hasta un tamaño medio de 50-250 mm3 (día 0) como se describe en los diseños de estudio específicos. Los ratones fueron repartidos aleatoriamente en grupos de tratamiento (típicamente 10 ratones/grupo) . rIL-2 fue administrado diariamente s.c. (0.2-3 mg/kg/día) en los días 0-6 ó 7-13 ó los días 0-4, 7-11. BAY 43-9006 o SU11248 (1-100 mg/kg) fueron administrados diariamente (por 5-12 días) como una solución vía la cebadura oral, comenzando en el día 0 ó día 7. Todas las combinaciones de monoterapia y fármaco a las dosis seleccionadas, descritas en los estudios individuales fueron bien toleradas.

Evaluación de la inhibición del tumor y respuestas Los volúmenes tumorales y los pesos corporales fueron evaluados 2-3 veces semanalmente. Mediciones con calibrador de los tumores fueron convertidas al volumen tumoral medio (mm3) utilizando la fórmula: 1A (longitud (mm) x [anchura (mm)]2). La inhibición del crecimiento tumoral (TGl) fue calculada como [1- (volumen tumoral medio del grupo tratado/volumen tumoral medio del grupo control) x 100] . Las respuestas fueron definidas ya sea como una respuesta completa (CR, sin tumor mensurable), o respuesta parcial (PR, reducción del volumen tumoral de 50-99%) en comparación al volumen del tumor para cada animal al inicio del tratamiento. El análisis de supresión del crecimiento tumoral fue calculado como: [(número de días para que un grupo tratado alcance un volumen tumoral medio de 1000 mm3) - (número de días para que el grupo control alcance un volumen tumoral medio de 1000 mm3) ] . Fueron definidos efectos sinérgicos cuando la proporción de la inhibición esperada del crecimiento tumoral porcentual de la terapia en combinación (% T/Cexp = % T/C tratamiento 1 x % T/C tratamiento 2) dividido entre el % T/C elevado (% T/Cobs) del tratamiento en combinación fue >1. Los efectos aditivos fueron definidos cuando % T/Cexp/% T/Cobs = 1, y el antagonismo cuando % T/Cexp/% T/Cobs <1 (Yokoyama et al., Cáncer Res . 2000 60 (80 ): 2190-2196) .

Farmacocinética Para la evaluación de la farmacocinética del fármaco, los ratones fueron tratados con una dosis simple subcutánea de rIL-2 (6 mg/kg, 0.2 ml) o BAY 43-9006 (20 mg/kg, p.o., 0.2 ml) y la sangre fue recolectada a diversos tiempos después de la administración del fármaco. Los niveles plasmáticos de BAY 43-9006 y el rIL-2 fueron determinados utilizando HPLC o un bioensayo de ELISA.

Análisis de Western Blot Después de las incubaciones de los fármacos bajo las condiciones indicadas, las células fueron cosechadas, lavadas con PBS enfriado con hielo y usadas con amortiguador RIPA (1% de Nonidet P-40, 0.5% de desoxicolato de sodio, 0.1% de dodeciisulfato de sodio en solución salina amortiguada con fosfato IX, pH 7.2) que contenía inhibidores de proteasa (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) e inhibidores de fosfatasa (Sigma, St . Louis, MO) . Los lisados del contenido de proteína fueron determinados utilizando el ensayo de BCA (Bio-Rad, Hercules, CA) . Para el análisis de transferencia de Western, 60 µg de proteína fueron sometidos a electroforesis y la detección de pERK fue realizada con un anticuerpo de ratón para pERK (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA) e incubadas a 4°C toda la noche. La detección del anticuerpo pSTAT5 (1:1000 Upstate) y pAKT (1:1000 Cell Signaling) se realizó con la misma cantidad de proteína mediante el sondeo con los anticuerpos apropiados anti-fosfotirosina por 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas fueron luego incubadas por 1 hora a temperatura ambiente con IgG anti-conejo conjugada a peroxidasa de rábano 1:5000 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) . Para verificar la carga igual, las manchas fueron retiradas y sondeadas nuevamente con los anticuerpos anti-ERK (Cell Signaling), anti-STAT5 (BD Biosciences), y anti-AKT (Cell Signaling) para medir la proteína ERK, STAT5 y AKT total, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas utilizando quimioluminiscencia aumentada (ECL; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra) y visualizadas después de la exposición a película Kodak. La densitometría de exploración fue realizada para cuantificar las intensidades de las bandas. La cantidad de pERK, pSTAT5 o pAKT fue normalizada a los niveles de proteína total de ERK, STAT5 o AKT y comparados con los controles de vehículo o no tratados.

Inmunofenotipificación celular en ratones BALB/c desnudos después del tratamiento con el fármaco Se recolectaron muestran de sangre a diversos tiempos después de tratamientos indicados. La sangre completa (100 µl) fue transferida a tubos FACS/TruCount (BD BioSciences) y se mantuvieron sobre hielo. Las muestras fueron tratadas con 0.5 µg de bloque Fc de ratón (CD16/CD32 anti-ratón; BD BioSciences), y se incubaron sobre hielo a 20 minutos. Anticuerpos conjugados al fluorocromo, como se indica más adelante, fueron agregados a las muestras e incubados sobre hielo por 20 minutos protegidos de la luz.

Las muestras de sangre fueron agitadas en torbellino antes de agregar 2 ml de solución de lisis lx FACS (BD BioSciences) , seguido por la incubación a temperatura ambiente por 10 minutos, luego se centrifugaron a 1250 rpm. Todas las muestras fueron lavadas dos veces, suspendidas en PBS y 2% de FBS, y almacenadas a 4°C antes de la adquisición de la muestra sobre BD FACScalibur, y el análisis subsiguiente por el software CellQuest Pro. Los números absolutos de células fueron determinados con relación a la esfera de referencia TruCount. Poblaciones de células fueron identificadas e introducidas con base en las características de FSC y SSC, así como los marcadores para los linfocitos totales (CD45, BD BioSciences) ; las poblaciones de linfocitos de células T fueron identificadas con base en la tinción de CD3 y las subpoblaciones identificadas por tinción de CD4 ó CD8 (BD Biosciences). Poblaciones de células individuales fueron identificadas por eventos apropiadamente introducidos.

Histopatología e inmunohistoquímica Los tumores de ratón fueron fijados en 10% de formalina amortiguada neutra y luego transferidos a etanol al 70% y subsecuentemente procesos para la incrustación en parafina utilizando un procesador de tejidos Excelsior (Thermo Electron Corporation, Pittsburgh, PA) . Secciones titulares de 4 µm fueron cortadas sobre un microtomo giratorio (RM2125, Leica Microsystems, Nussloch, Alemania) . Se prepararon secciones teñidas con hemotoxilina y eosina (H & E) . Las inmunotinciones fueron realizadas utilizando un sistema de tinción de portaobjetos automatizado Discovery XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) . Las células T murinas fueron tratadas con anticuerpo de conejo anti-CD3 (dilución 1:60, Dako Norden A/S, Glostrup Dinamarca), y los monocitos/macrófagos fueron detectados utilizando F4/80 (Serotec) . Para la proliferación celular, los tumores de ratón fueron teñidos para Ki-67 utilizando un anticuerpo monoclonal de rata anti-ratón (dilución 1:15, DAKO). La recuperación del epitopo reducido por calor, fue realizado utilizando CC 1 (Ventana Medical Systems) . Las muestras fueron luego incubadas con los anticuerpos secundarios apropiados (anticuerpo biotinilado de cabra anti-lgG de conejo, dilución 1:100, Jackson Im unoReseach Laboratories). Un sistema de estreptavidina-biotina marcado con peroxidasa de rábano con el cromógeno 3-3 ' -diaminobencidina (Ventana Medical Systems) fue utilizada para localizar los anticuerpos. Las secciones fueron contrateñidas con rojo rápido nuclear para aumentar la visualización de la morfología tisular. Para tumores B16-F10, el kit Ventana Bluemap - un método de tinción alternativo de NBT/BCIP fue utilizado debido a los depósitos de melanina observados en tejidos de H & E, que ayudaron a la visualización de las células T en tumores.

Ensayo de proliferación de células T CTLL-2 Las células T CTLL-2 fueron incubadas con o sin BAY 43-9006 (3 µM) a 37°C por 2 horas. Las células fueron luego lavadas y sembradas en placas de microtitulación de 96 pozos, a 5,000 células/pozo en medio de cultivo con diluciones en serie de rIL-2 (1 pM hasta 100 nM) . Al final del periodo de incubación (72 horas a 37°C) , la viabilidad celular fue determinada mediante un ensayo de colorante de tetrazolio utilizando el reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) .

Ensayos de citotoxicidad in vi tro Las células fueron sembradas en placas de microtitulación de 96 pozos (CTLL-2:5000 células/pozo; RENCA: 1500/pozo; B16-F10 : 1000/pozo; MV4 ; 11 : 5000/pozo) y se trataron con diluciones en serie de BAY 43-9006/SU11248 o vincristina. CTLL-2 es una línea celular dependiente de IL-2, y por lo tanto para estas células, el ensayo de citotoxicidad fue conducido en el medio que contenía rIL-2 5 nM. Al final del periodo de incubación (72 horas a 37°C) , la viabilidad cellular fue determinada mediante un ensayo con colorante de tetrazolio (WST-1) o un ensayo quimioluminiscente (BrdU) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) . Los valores de EC50 fueron definidos como la concentración necesaria para una reducción de 50% en la absorbancia de las células control tratadas versus no tratadas .

Ensayos de citotoxicidad de esplenocitos ex vivo Los esplenocitos fueron obtenidos de ratones BALB/c tratados con fármaco (n = 3-5/grupo) bajo condiciones asépticas y homogenizados en PBS frío. Después del pase a través de un colador celular de nailon de 70 µm, las células fueron brevemente centrifugadas a 4°C. Las células en líneas rojas fueron usadas utilizando amortiguador de lisis de RBC (Sigma, St. Louis, MO) . Las células fueron lavadas y sembradas en placa con las células objetivo Yac-1 marcadas con 51Cr a diversas proporciones E:T (100:1, 50:1, 25:1, 12/5:1, 6.25:1, 3:1) en un ensayo de citotoxicidad de 4 horas. Los datos fueron obtenidos utilizando un lector de placas Wallac y expresados en cuentas por minuto (cpm) . La cuantificación es expresada como el porcentaje de lisis específica y fue calculada como: % de lisis específica = 100 x ( (medio experimental - liberación espontánea media) / (liberación máxima media - liberación espontánea media) ) . La liberación espontánea fue determinada a partir de los pozos que contenían las células objetivo marcadas y células no efectoras, y la liberación máxima fue determinada a partir de los pozos que contenían células objetivo marcadas en 1% de Tritón X-100.

Análisis estadístico Se realizaron múltiples comparaciones utilizando el análisis de varianza de una vía (ANDEVA) , y la post-prueba para comparar los diferentes medios de tratamiento se realizó utilizando la prueba de Student-Newman Keuls (SigmaStat) . Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas a p < 0.05.

B. Estudios in vitro con rIL-2 y BAY 43-9006 sobre las vias de señalización de células T y células tumorales rIL-2 activa JAK/STAT y la señalización de MAPK en células CTLL-2 in vi tro Para elucidar el inicio, el curso en el tiempo y la duración de la vías de transducción de señales de IL-2/IL-2R en células T, las células CTLL-2 (1 x 107 células) fueron privadas de suero por 24 horas antes del tratamiento con diversas concentraciones de rIL-2 (1 pM hasta 100 nM) por 2 horas y las vías de señalización clave: MAPK, STAT5, AKT fueron evaluadas utilizando análisis de transferencia de western. Las células CTLL-2 privadas de suero fueron tratadas in vi tro con una amplia gama de concentraciones de rIL-2 (de 1 pM hasta 100 nM) con el fin de delinear las interacciones de los dos complejos predominantes de IL-2R: la alta afinidad (IL-2R ß? KD = 10_11M) y el receptor de afinidad intermedia (IL-2ß? KD = 10"9M) . En algunos experimentos, las células fueron expuestas a anticuerpo libre anti-IL-2a (exceso >1000 veces; 10 nM) incubados por 1 hora antes de la adición de rIL-2. Para evaluar el curso de tiempo de la activación de IL-2/IL-2R, las células CTLL-2 privadas de suero fueron activadas con rIL-2 10 nM, y la señalización de IL-2 fue examinada a diversos tiempos desde 10 minutos hasta 48 horas. La fosforilación corriente abajo (3') de IL-2R de ERK1/2, STAT5 y AKT fue evaluada en células tratadas con rlL-2 utilizando análisis de transferencia de Western. Los niveles relativos de pERK, pSTAT5 o pAKT fueron comparados a los niveles de proteína total para ERK, STAT5 o AKT, respectivamente . La activación de pERKl/2 fue observada después de la exposición de las células CTLL-2 con rIL-2. ERK fosforilada fue ligeramente activada a 1 pM a las 2 horas, sin embargo, la activación máxima fue observada a concentraciones > 100 pM. La vía de JAK/STAT5 fue activada máximamente a la concentración de 1 pM; y concentraciones cada vez mayores de rIL-2 no cambiaron los niveles de pSTAT5 (hasta 100 nM) . La vía de pAKT basal en CTLL-2 pareció ser activada en células T bajo condiciones privadas de suero.

Además, los niveles de pAKT permanecieron largamente sin cambio a las concentraciones probadas de rIL-2 (1 pM hasta 100 nM; utilizando un anticuerpo para pAKT hacia el sitio de fosforilación 483) . Un anticuerpo de bloqueo para IL-2Ra fue utilizado para confirmar que las vías de señales de IL-2 son mediadas específicamente por el enlace a IL-2R. Los niveles de pSTAT5 en las células CTLL-2 fueron analizados mediante transferencia de Western. Las células CTLL fueron privadas de suero y tratadas con anticuerpo libre en exceso anti-IL-2Ra (10 nM, > 1000 veces) por 1 hora antes del tratamiento con rIL-2 (0.1 pM hasta 10 nM) . En ausencia del anticuerpo de bloqueo de IL-2R , pSTAT5 fue activado a 1 pM después del tratamiento con rIL-2, sin embargo, en presencia de la inhibición de IL-2R , la señalización de pSTAT5 fue abrogada (inhibición > 95%), confirmando el requerimiento de la IL-2R en la señalización de STAT5. De manera interesante, los niveles de pSTAT5 fueron restaurados en células CTLL-2 con concentraciones cada vez mayores de rIL-2 (> 10 pM) , sugiriendo que rIL-2 desplaza ya sea competitivamente el anticuerpo anti-IL-2Ra y/o activa la señalización de pSTAT5 mediante el enlace a la cadena IL-2Rß? de baja afinidad (KD 10" M: Activación de rIL-2 de pSTAT5 rápida y sostenida en células CTLL-2 Para evaluar el tiempo de inicio y duración de la respuesta de señalización de IL-2R en células CTLL-2, las células privadas de suero fueron tratadas in vi tro con rIL-2 (10 nM) y los efectos sobre la fosforilación de ERKl/2, STAT5 y AKT fue evaluado utilizando los análisis de transferencia de Western. La fosforilación de STAT5 fue activada en minutos (< 10 minutos) después de la adición de rIL-2 a las células CTLL-2 y la duración de la respuesta de pSTAT5 fue mantenida hasta 48 horas. La activación de la vía de MAPK (pERK) por rIL-2 pareció ser ligeramente retrasada y fue activada por 1 hora. La intensidad de pERK fue menor que la respuesta máxima obtenida por la estimulación de las células CTLL-2 privadas de suero con PMA (50 ng/ml) + ionomicina (0.4 µg/ml) por 15 minutos. Además, los niveles de pERK fueron sostenidos hasta 24 horas y regresados a los niveles antecedentes por 48 horas. No se observaron efectos discernibles sobre pAKT, confirmando que la señalización por la vía de PI-3K/AKT fue continuamente activa en células CTLL-2.

Tratamiento con BAY 43-9006 inhibe pERK y no pSTAT5 en células CTLL-2 BAY-43-9006 es un potente inhibidor de Raf-1, que también inhibe BRAF de tipo Silvestre mutante. Además, BAY-43-9006 inhibe múltiples cinasas particularmente VEGF2, 3; PDGFRß; FLT3 y cKIT (Wilhelm, SM et al. Cáncer Res 2004; y Chiron' s kinase profiling data), e inhibe en cierto grado Lck y Fyn, dos cinasas que están involucradas en las respuestas funcionales de células T. Dado el perfil inhibitorio de la cinasa de BAY 43-9006, y el impacto potencial sobre la señalización de MAPK/señalización de células T, se pensó que BAY 43-9006 podría interferir potencialmente con la señalización de IL-2/IL-2R en células T. Por lo tanto, fueron evaluadas interacciones potenciales de BAY 43-9006 sobre la señalización de IL-2 en células CTLL-2, B16-F10, o RENCA in vi tro . Para examinar los efectos de BAY 43-9006 sobre las células de modelo CTLL-2, B16-F10 o RENCA, células privadas de suero fueron tratadas con diversas concentraciones de BAY 43-9006 (0.01-20 µM) . Como un control apropiado, las células fueron estimuladas con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (0.4 µg/ml) por 15 minutos. Para examinar los efectos de los tratamientos concomitantes y secuenciales de rIL-2 y BAY 43-9006 en células CTLL-2 in vi tro, las células CTLL-2 privadas de suero fueron tratadas con rIL-2 (10 nM) en presencia o ausencia de BAY 43-9006 (3 µM) por 2 horas. Para los tratamientos secuenciales, BAY 43-9006 fue tratada por 2 horas. Las células fueron luego lavadas y luego tratadas con rIL-2, y viceversa. Fueron también examinados los efectos inhibitorios de BAY 43-9006 (3 µM) con o sin estimulación con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (0.4 µg/ml) por 15 minutos. Ya que la concentración de BAY 43-9006 requerida para inhibir MAPK en diferentes tipos celulares es muy variable, fueron evaluados los efectos de diversas concentraciones de BAY 43-9006 (en el intervalo de 0 a 20 µM) sobre las células CTLL-2 privadas de suero, por 2 horas con o sin estimulación con PMA + ionomicina. Al final del periodo de incubación, las células CTLL-2 tratadas fueron luego usadas y los lisados de proteína fueron sometidos a análisis de transferencia de Western para la determinación de los niveles de pERK. BAY 43-9006 inhibió sustancialmente pERK a concentraciones > 1 µM en células CTLL-2 murinas y la línea de células T Jurkat humanas. Los efectos del tratamiento de BAY 43-9006 sobre las células CTLL-2 no alteró los niveles de pSTAT5 y pAKT en células, indicando que la vía de JAK/STAT5 y PI-3K/AKT en células T no fueron afectadas en gran medida. Para investigar la base terapéutica de combinar rIL-2 y BAY 43-9006 in vi tro, se estudiaron los efectos de rIL-2 y BAY 43-9006 sobre células T y el impacto sobre las dos vías de señalización mediadas por IL-2 (MAPK y JAK/STAT5) en células CTLL-2. Los efectos de señalización de células T mediadas por IL-2 con los regímenes concomitantes secuenciales de los dos fármacos fueron investigados en las células CTLL-2. Las células CTLL-2 privadas de suero fueron tratadas con BAY 43-9006 (3 µM) por 2 horas y luego tratadas ya sea con vehículo, rIL-2 (10 nM) o PMA + ionomicina. Alternaturalmente, el tratamiento con rIL-2 (10 nM, 2 horas) seguido por BAY 43-9006 (3 µM, 2 horas) fue también investigado. Después de la exposición al fármaco y/o la estimulación con PMA + ionomicina, los análisis de transferencia de Western de pERK y pSTAT5 en los lisados celulares fueron realizados (como se describe al principio) . El tratamiento con BAY 43-9006 (3 µM) inhibió los niveles de pERK, mientras que los niveles de pERK activados por rIL-2 en células CTLL-2 privadas de suero (versus los niveles de pERK de línea base, confirmaron los efectos opuestos de los dos fármacos sobre la vía de MAPK. Todos los tratamientos con las combinaciones de 43-9006 (exposiciones concomitante y secuencial al fármaco) inhibieron sustancialmente pERK en las células CTLL-2. No se observaron efectos sobre la vía de STAT5 o la vía de AKT, con todos los tratamientos en combinación probados (como se describe en los métodos).

BAY 43-9006 a altas concentraciones inhibe los niveles de pERK en líneas de células tumorales Los efectos del tratamiento con BAY 43-9006 sobre las líneas de células tumorales murinas-melanoma B16-F10, colon CT26 y el modelo RCC RENCA, fueron determinados. Las líneas celulares murinas fueron seleccionadas con base en su capacidad de respuesta a la terapia con rIL-2 in vivo en modelos inmunocompetentes (ratones competentes T-/NK-/monocito-/macrófago) , donde los efectos de la terapia combinada con rIL-2 y BAY 43-9006 pudieron ser investigados. El melanoma B16-F10 y las células RENCA privadas de suero, fueron expuestas a una gama de concentraciones de BAY 43-9006 desde 0 hasta 20 µM. Los niveles de fosfo-ERK en los lisados celulares después de la exposición al fármaco fueron determinados mediante análisis de transferencia de Western. BAY 43-9006 inhibió los niveles de pERK en ambas líneas celulares probadas (B16-F10 y RENCA) a concentraciones muy altas de = 5 µM, con abolición casi completa de pERK observada a 20 µM.

C. Efectos in vitro de BAY 43-9006 sobre la proliferación celular mediada por IL-2 Para examinar si la inhibición de pERK por BAY 43-9006 afectó la respuestas proliferativas mediadas por IL-2 en células CTLL-2, fueron conducidos ensayos de proliferación mediante preincubación de las células CTLL-2 (5000 células/pozo) a concentraciones de BAY 43-9006 (3 µM, 2 horas) que inhiben pERK. Después de una incubación de 2 horas de las células con BAY 43-9006 (3 µM) , las células fueron sembradas en placas de 96 pozos y expuestas a diversas concentraciones de rIL-2 (0-100 nM) por 72 horas. Las células no tratadas fueron administradas con pseudotratamientos después de la incubación con rIL-2 (a las mismas concentraciones) . Las respuestas proliferativas de las células CTLL-2 tratadas con BAY 43-9006 y no tratadas, fueron evaluadas utilizando el ensayo de WST-1. La preincubación de las células con BAY 43-9006 (3 µM) inhibió la señalización de pERK pero no afectó las respuestas proliferativas inducidas por IL-2 en la línea celular CTLL-2.

D. Actividad antiproliferativa de BAY 43-9006 o SU11248 sobre CTLL-2 y células tumorales in vitro Para evaluar la actividad de ácido citotóxico in vi tro de BAY 43-9006 o SU11248 en cada uno de estos tipos celulares (CTLL-2, B16-F10, RENCA, CT26) , las células fueron sembradas en placas de microtitulación de 96 pozos y tratadas con diluciones en serie de BAY 43-9006 (desde 0 hasta 50 µM) por 72 horas a 37°C. Ya que la línea cellular CTLL-2 es dependiente de IL-2 para la proliferación, la citotoxicidad para estas células fue conducida en medios que contenían rlL-2 5 nM. Al final del periodo de incubación de 72 horas, se determinó la viabilidad celular ya sea mediante un ensayo de tinción con tetrazolio (WST-1) o un ensayo quimioluminiscente (BrdU). Como controles, MV4;11 (línea celular humana FLT3 ITD AML) fue tratada con BAY 43-9006 (0 a 50 µM) o las células B16-F10 fueron tratadas con vincristina (O a l µM) para confirmar la citotoxicidad de los agentes y la validez de los ensayos. Las concentraciones inhibitorias de los fármacos fueron expresadas como un valor EC50, el cual fue definido como la concentración necesaria para una reducción del 50% en la respuesta proliferativa medida en absorbancia, de las células tratadas con fármaco versus los controles no tratados/vehículo. La EC5o relativa de BAY 43-9006 o SU11248 se presentan en la tabla 9.

Tabla 9. Actividad antiproliferativa de BAY 43-9006 o SU11248 sobre las diversas líneas celulares Las células fueron sembradas en placas de microtitulación de 96 pozos (CTLL-2:5000 células/pozo; RENCA: 1500/pozo; B16- F10:1000/pozo; CT26:1000 células/pozo; MV4 ; 11 : 5000/pozo) y tratadas con diluciones en serie de BAY 43-9006, SU11248 o vincristina. CTLL-2 es una línea cellular dependiente de IL-2 y por lo tanto fue conducido el ensayo de citotoxicidad en el medio que contenía rIL-2 5 nM. Al final del periodo de incubación (72 horas a 37°C), la viabilidad cellular fue determinada ya sea por el ensayo de tinción con tetrazolio (WST-1) . a EC5o = concentración necesaria para una reducción del 50% en la respuesta proliferativa medida como absorbancia de las células tratadas con fármaco versus los controles no tratados/vehículo. b MV4 ; 11 es una línea cellular de leucemia mielogénica aguda humana (AML) que expresa una duplicación en tándem interna de FLT3 (ITD) . BAY 43-9006 (potente inhibidor de la cinasa FLT3; IC50 = 58 nM) demuestra actividad antiproliferativa potente in vi tro con las células MV ; 11. d La viabilidad cellular fue evaluada utilizando el ensayo Promega Cell-Titer GloMR que midió el contenido de ATP de las células .

En general, concentraciones relativamente altas de BAY 43-9006 (o SU11248) fueron necesarias para inhibir la proliferación de células CTLL-2 así como diversas líneas celulares (B16-F10, RENCA, CT26) , en comparación al agente antimicótico vincristina (definido por las EC50 ' s relativas; ver tabla 9) . La citotoxicidad de los efectos de BAY 43-9006 sobre las células RENCA fue también examinada utilizando el ensayo BrdU para evaluar el efecto sobre la síntesis de ADN (versus la actividad antiproliferativa utilizando el ensayo con colorante de tetrazolio mitocondrial) . La EC50 para BAY 43-9006 (~5 µM) sobre las células RENCA obtenidas utilizando el método BrdU fue similar a aquella observada con el ensayo de WST-1. No se observaron respuestas proliferativas directas (o citotoxicidad) cuando las células tumorales RENCA fueron expuestas al intervalo de concentraciones de rIL-2 (desde 0 hasta 1 µM) , confirmando el mecanismo de rIL-2 que confía en la activación del componente de células efectoras inmunes .

E. Estudios de Eficacia. In Vivo Farmacocinética de rIL-2 y BAY 43-9006 en Ratones En reportes publicados de fase I de BAY 43-9006 (a una dosis de 400 mg) , alta Cmax de 10 a 20 µM y vidas medias del fármaco prolongadas de aproximadamente 24 horas, fueron logradas en pacientes (Strumberg, et al., J. Clin . Oncol . 2005 23(5): 965-972). Para determinar si la exposición plasmática del fármaco puede impactar la viabilidad de las células T y las respuestas proliferativas in vivo, la farmacocinética de dosis simple de rIL-2 y BAY 43-9006 en ratones, fueron medidas. Una dosis oral simple de 30 mg/kg de BAY 43-9006 en ratones alcanzó una Cmax de aproximadamente 5500 a 8000 ng/ml (aproximadamente 10 µM) a una tmax de 2 horas. La velocidad de eliminación plasmática de BAY 43-9006 fue claramente lenta y la vida media consecuente fue de aproximadamente 4 horas. En contraste, el perfil PK de rIL-2 después de la administración subcutánea de 6 mg/kg demostró una Cmax de aproximadamente 550-850 ng/ml a una tmax de aproximadamente 30 minutos. La t?/2 de rIL-2 en ratones fue aproximadamente 1 hora, con exposiciones de >50 ng/ml logradas para 4 horas. De manera interesante, ambos tratamientos después de una dosis simple y a las rutas respectivas de administración demostró Cmax no traslapada (a tmax) , elucidando que los tratamientos concomitantes y secuenciales pueden ser factibles como es apoyado por los hallazgos de PK. Dado que BAY 43-9006 puede ser una proteína principalmente enlazada en la sangre, el impacto de estas exposiciones al fármaco sobre la viabilidad de las células T in vivo, queda por ser enfrentado.

El tratamiento con rIL-2 y BAY 43-9006 disminuye la función efectora inmune ex vivo Ya que la inhibición de una o múltiples cinasas de linfocitos T (Lck, Fyn, Syk, Btk, Src, Tck2, MAPK, JAKs) puede abrogar la expansión de las células T y la función efectora inmune, los efectos de rIL-2 y BAY 43-9006 sobre las respuestas proliferativa y funcional de células T in vivo, fue investigada. En estos experimentos, los ratones BALB/c que poseen tumores RENCA fueron tratados con rIL-2 (1 mg/kg/día, s.c. días 6-10), BAY 43-9006 (30 mg/kg/día, p.o., días 6-10) o combinaciones de rIL-2 y BAY 43-9006 administrados ya sea concomitantemente o secuencialmente (rIL-2, 1 mg/kg/día, s.c., días 1-5 + BAY 43-9006, 30 mg/kg/día, p.o., días 6-10; o BAY 43-9006, 30 mg/kg/día, p.o., días 1-5 + rIL-2, 1 mg/kg/día, s.c., días 6-10). Esplenocitos aislados provenientes de ratones tratados fueron luego sometidos a ensayos de muerte ex vivo contra las células objetivo Yac-1 a diversas proporciones de efector : objetivo (E:T), y el porcentaje de lisis específica de células Yac-1 marcadas con 51Cr, fueron determinadas. Los ratones tratados con rIL-2 (1 mg/kg) incrementaron significativamente la muerte de los objetivos de Yac-1, mediados por esplenocitos, en comparación al tratamiento con vehículo (23% con rIL-2 versus 0% con tratamiento con vehículo) . Los efectos de muerte específicos observados con el tratamiento con BAY 43-9006 (1%) fue despreciable y no diferente del tratamiento con vehículo. Todos los tratamientos con rf y BAY 43-9006 condujeron a actividad lítica reducida, mediada por esplenocitos (tratamiento concomitante = 16%; tratamientos secuenciales <9% versus monoterapia con rIL-2 = 23%) .

Efecto de rIL-2 y Terapia con BAY 43-9006 sobre Poblaciones de Células Efectoras Inmunes Circulantes Se examinaron los efectos farmacodinámicos de la terapia con rIL-2 y/o BAY 43-9006 sobre poblaciones de linfocitos y monocitos circulantes en ratones BALB/c que poseen tumores. En estos estudios, fue recolectada la sangre después del agente simple o la combinación de la terapia de rIL-2 y BAY 43-9006 (tratamientos concomitante o secuencial como se describe al principio) . Las cuenteas absolutas de linfocitos y sub-poblaciones de células T (CD4+ o CD8+) fueron cuantificadas en sangre completa utilizando los tubos TruCountMR e inmunotinción apropiada. El tratamiento con rIL-2 disminuyó los números absolutos de linfocitos circulantes y monocitos (células CD45+: 2387 células/µl con vehículo), y células T (1550 células/µl versus 664 células/µl con vehículo) en ratones con tumor. Una proporción significativamente incrementada de células CD4:CD8 fue observada con la terapia con rIL-2 en comparación al tratamiento con vehículo (5:3; rIL-2: vehículo, por ejemplo, 1.7 veces), como es indicador del metabolismo de acción de rIL-2 en la expansión de los números de células T. Los números relativos de células no T y monocíticas (CD45+CD3-) después del tratamiento con rIL-2 fueron similares al tratamiento con vehículo (837 células/ (µl versus 911 células/µl con vehículo) .

En contraste, el agente simple BAY 43-9006 o BAY 43-9006 combinado con rIL-2 tuvo poco impacto o incrementó los números absolutos de linfocitos y monocitos (intervalo de 2417-3577 células/µl versus 2387 células/µl con vehículo) , y también incrementó las poblaciones de células no T y de monocitos (1241-1563 células/µl versus 837 células/µl con vehículo) . El efecto de la terapia con BAY 43-9006 sobre los números totales de células T fue similar al tratamiento con vehículo (1827 células/µl versus 1550 células/µl con vehículo) . Números de células T totales ligeramente incrementado (incluyendo poblaciones CD4+ y CD8+) observadas con el régimen secuencial de rIL-2 y BAY 43-9006 cuando comenzaron con rIL-2 (2081 células T/µl versus 1550 células/µl con vehículo) . Cuando rIL-2 y BAY 43-9006 fueron administrados concomitantemente o secuenciados como BAY 43-9006 y luego rIL-2, los números de células T totales disminuyeron ligeramente en comparación al tratamiento con vehículo (aproximadamente 1170-1244 células T/µl versus 1550 células/µl con vehículo) . Tendencias similares fueron observadas en poblaciones individuales de células T CD4+ y CD8+. Además, la histología de los tumores después del tratamiento con rIL-2 y BAY 43-9006 o terapia con SU11248 (como se describió previamente) fue determinada. Para examinar la f armacodinámica de las células T i n vi vo , células T que se infiltran a los tumores fueron detectadas con un anticuerpo de ratón anti-CD3. Los efectos antiproliferativos en los tumores después de los tratamientos con fármaco fueron evaluados utilizando la tinción con Ki67. Con el tratamiento con rIL-2, fueron observados números incrementados de células T que infiltran los tumores RENCA (y tumores B16-F10) en comparación al tratamiento con vehículo. En general, menos células T fueron detectadas en el grupo tratado con BAY 43-9006 en el modelo de RENCA. Los efectos de la terapia con rIL-2 y BAY 43-9006 o SU11248 sobre las células T de infiltración en tumores B16-F10, fueron equívocos, ya que algunas células T fueron detectadas en todos los grupos tratados. Los tumores que demostraron necrosis incrementada (inhibición del tumor), mostraron en general mayores números de células T interdispersos entre las células tumorales. Colectivamente, los datos sugieren que rIL-2 activa las células T en circulación y trafica las células hacia los sitios ext ravasculares incluyendo los tumores, y que el tratamiento con BAY 43-9006 o SU11248 puede abrogar parcialmente las respuestas proliferativas y el tráfico de células T.

La Terapia con rIL-2 y BAY 43-9006 Aumenta la Eficacia de los Modelos Tumorales Murinos que Responden a IL-2 Las interacciones farmacéuticas de rIL-2 con BAY 43-9006 o SU11248 fueron examinadas (ver Figuras 1-10 y Tablas 10-12) . Los tratamientos en combinación fueron evaluados en tres modelos experimentales de tumores que responden a IL-2 murinos, competentes a las células T (melanoma B16-FIO, colon CT26, modelo RCC RENCA) (Figuras 1-10) . En estos estudios, los ratones fueron repartidos aleatoriamente cuando los tumores fueron establecidos a un tamaño de 50-225 mm3 , y el crecimiento de los tumores fue monitorizado por mediciones con calibrador después de la dosis oral diaria de BAY 43-9006 o SU11248 o la administración diaria subcutánea de rIL-2 (como se indica en los métodos) . La eficacia del agente simple y la capacidad de tolerancia de rIL-2, BAY 43-9006 y SU11248 fueron investigadas a un intervalo de dosis y esquemas de tratamiento (Figura 1) . En todos los modelos, rIL-2 demostró potente eficacia, y las inhibiciones tumorales a dosis efectivas estuvieron en general en el intervalo de 40 a 60% (versus tratamiento con vehículo) (Figura 1) . La dosis efectiva mínima para BAY 43-9006 fue de >30 mg/kg/día (versus tratamiento con vehículo) . SU11248 fue en general efectiva a dosis >40 mg/kg/día, con la excepción del modelo tumoral B16-F10 (Figura 1) . Con base en la eficacia de agente simple y la capacidad de tolerancia, rIL-2 fue luego combinada con BAY 43-9006 o SU11248 a dosis que fueron toleradas y no mostraron efectos dañinos sobre el peso corporal o cualesquiera síntomas clínicos adversos. Los esquemas de tratamiento secuenciales y concomitantes fueron examinados en los modelos tumorales B16-F10 y CT26 (Figuras 2-8, Tablas 10 y 11) . En los modelos tumorales B16-F10 y CT26, casi todas las terapias en combinación (regímenes concomitante o secuencial) investigados con rIL-2 y BAY 43-9006 o rIL-2 y SU11248 aumentaron la actividad antitumoral comparada a los tratamientos de monoterapia o con vehículo (Figuras 2-5) . Un resumen de las interacciones del fármaco en combinación de las diversas terapias en combinación, se resumen en las Tablas 10 y 11.

Tabla 10. Eficacia del agente simple rIL-2 , BAY 43-9006, SU11248 y combinaciones de rIL-2 y BAY 43-9006/SU11248 en el modelo de tumor de melanoma murino B16-F10 en ratones C57BL6 Tratamiento8 Volumen 0" E' &o>(% Interacción del tumoral medio (T/Cobs) (T/Ce*P) T/Cexp/% fármaco6 ) Eficacia de rlL-2 + BAY 43- 9006 1. Vehículo (días 0-4, 7-11) 2121 1.00 N/A N/A N/A 2. rlL-2 (3.3 mg/kg, s.c, días 1354 0.77 N/A N/A N/A 0-6) 3 rlL-2 (3.3 mg/kg, s.c. días 1637 0.64 N/A N/A N/A 7-13). 4. BAY 43-9006 (30 mg/kg, 1025 0.48 N/A N/A N/A p.o. días 0-6) 5. BAY 43-9006 (30 mg/kg, 1392 0.66 N/A N/A N/A p.o. días 7-13) 6. rlL-2 (3.3 mg/kg s.c. días 687 0.32 0.42 1.29 aditivo 0-6) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o., días 7-13) 7. BAY 43-9006 (30 mg/kg, 800 0.38 0.37 0.99 aditivo p.o., días 0-6) + rlL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 7-13) 8. rlL-2 (3.3 mg/kg, s.c., días 848 0.40 0.31 1.02 (día aditivo 0-6) + BAY 43-9006 (30 8) mg/kg, p.o. días 0-6) B. Eficacia de rlL-2 + SU11248: 1. Vehículo 2415 1.00 N/A N/A N/A 2. rlL-2 3.3 mg/kg/d, s.c., 934 0.39 N/A N/A N/A días 0-6 3. rll-2 3.3 mg/kg/d, s.c, 1042 0.43 N/A N/A N/A días 7-13 4. SU11248 40 mg/kg/d, p.o. 1756 0.72 N/A N/A N/A días 0-6 5. SU11248 40 mg/kg/d, 1701 0.70 N/A N/A N/A p.o., días 7-13 6. rll-2 3.3 mg/kg/d, s.c. 583 0.24 0.28 1.20 aditivo días 0-6 + SU11248 40 mg/kg/d, s.c. días 7-13 7. SU11248 40 mg/kg/d, p.o. 583 0.24 0.31 1.30 aditivo días 0-6 + rlL-2 3.3 mg/kg/d, s.c. días 7-13 8. rlL-2 3.3 mg/kg/d, s.c. 743 0.31 0.28 0.90 aditivo días 0-6 + SU11248 40 mg/kg/d, p.o., días 0-6 an=10 ratones C57BL6/grupo en cada estudio. Los ratones con tumor B16-F10 fueron tratados cuando los tumores fueron establecidos a un tamaño medio de aproximadamente 50 mm3. T / C0bservado ( O ) = ~° T / C cT/CobServado (E) = % T/C tratamiento 1 x % T/C tratamiento 2 dlos efectos sinérgicos fueron definidos cuando la proporción de la inhibición esperada del crecimiento tumoral porcentual de la terapia en combinación (%T/Cesp=%T/C tratamiento 1 x %T/C tratamiento 2) dividido entre el %T/C observado (%T/Cobs) del tratamiento en combinación fue >1. eLas interacciones del fármaco fueron definidas como aditivas cuando %T/Cesp/%T/Cobs=l, y el antagonismo cuando %T/Cesp/%T/Cobs<l. N/A, no aplicable Tabla 11. Eficacia de rIL-2 , BAY 43-9006, SU11248 y combinaciones de rIL-2 y BAY 43-9006/SU11248 en el modelo de tumor de colon murino CT26 en ratones BALB/c Tratamiento8 Volumen 0" Ec E/Od (% Interacción tumoral medio (T/Cobs) (T/Cexp) T/Cexp/%T del fármacoe (mm3; día 13) /Cobs) Estudio de eficacia de rlL-2 + BAY 43-9006: 1. Vehículo 2579 1.00 N/A N/A N/A 2. rlL-2 1 mg/kg/d, s.c, días 1974 0.76 N/A N/A N/A 0-6) 3 rlL-2 1 mg/kg/d, s.c. días 7- 2462 0.95 N/A N/A N/A 13). 4. BAY 43-9006 40 mg/kg/d, 1773 0.68 N/A N/A N/A p.o. días 0-6) 5. BAY 43-9006 40 mg/kg/d, 2572 0.99 N/A N/A N/A p.o. días 7-13) 6. SU11248 40 mg/kg/d, s.c. 2127 0.83 N/A N/A N/A días 0-6) 7. SU11248 40 mg/kg/d, p.o., 1581 0.61 N/A N/A N/A días 7-13 8. rlL-2, días 0-6 + BAY 43- 1 114 0.43 0.76 1.77 aditivo/ 9006, 40 mg/kg/d, p.o. días 7- sinergico 13 9. rlL-2 1 mg/kg/d, s.c., días 0- 1250 0.49 0.47 0.97 aditivo 6 + SU11248 40 mg/kg/d, p.o. días 7-13 10. BAY 43-9006 40 mg/kg/d, 2336 0.91 0.66 0.72 sub-aditívo p.o. días 0-6 + rlL-2 1 mg/kg/d, s.c., días 7-13 11. SU11248, días 0-6 + rlL-2 1006 0.39 0.79 2.02 aditivo/ 1 mg/kg/d, s.c, días 7-13 sinergico 12. rlL-2 1 mg/kg/d, s.c., días 1502 0.58 0.53 0.90 aditivo 0-6 + BAY 43-9006 40 mg/kg/d, p.o. días 0-6 13. rlL-2 1 mg/kg/d, s.c., días 1137 0.44 0.63 1.43 aditivo 0-6 + SU11248 40 mg/kg/d, p.o., días 0-6 an=10 ratones C57BL6/grupo en cada estudio. Los ratones con tumor CT26 fueron tratados cuando los tumores fueron establecidos a un tamaño medio de aproximadamente 225 mm3.

T /C0bservado ( O ) = -5 T / C cT/Cesperado (E) = % T/C tratamiento 1 x % T/C tratamiento 2 dlos efectos sinérgicos fueron definidos cuando la proporción de la inhibición esperada del crecimiento tumoral porcentual de la terapia en combinación (%T/Cesp=%T/C tratamiento 1 x %T/C tratamiento 2) dividido entre el %T/C observado (%T/Cobs) del tratamiento en combinación fue >1. eLas interacciones del fármaco fueron definidas como aditivas cuando %T/Cesp/%T/Cobs=l, y el antagonismo cuando %T/Cesp/%T/Cobs<l. N/A, no aplicable Únicamente en un caso en el modelo CT26, cuando BAY 43- 9006 (40 mg/kg/día, p.o. días 1-7) fue administrado antes de rIL-2 (1 mg/kg/día, s.c., días 8-13), los efectos del tratamiento combinado fueron sub-óptimos. En el modelo RENCA, únicamente fueron evaluados los esquemas concomitantes (Figuras 9-10; Tabla 12) , y las combinaciones de rIL-2 con BAY 43-9006 o SU11248 demostraron mayor inhibición del tumor en comparación a la terapia con el agente simple.

Tabla 12. Eficacia del agente simple rIL-2 , BAY 43-9006, SU11248 y combinaciones de rIL-2 y BAY 43-9006/SU11248 en el modelo de tumor murino RCC RENCA en ratones BALB/c Tratamiento3 Volumen 0" Ec E/Od (% Interacción tumoral medio (T/Cobs) (T/Cexp) T/Cexp/%T/Cobs) del (mm3) día 10 fármaco8 ó 17) A. Eficacia de rlL-2 + BAY 43-9006 1. Vehículo, días 0-8 579 1.00 N/A N/A N/A 2. rll-2 1 mg/kg/d, s.c, días 0- 288 0.50 N/A N/A N/A 4, 7-11 3 BAY 43-9006 30 mg/kg/d, 273 0.47 N/A N/A N/A p.o. días 0-8. 4. rlL-2 1 mg/kg/d, s.c. días 0- 154 0.27 0.23 0.88 aditivo 4 7-11 + BAY 43-9006 30 mg/kg/d, p.o., días 0-8 (concomitante) B. Eficacia de rlL-2 + SU 11248: 1. Vehículo 712 1.00 N/A N/A N/A 2. rll-2 1 mg/kg/d„ días 0-6 525 0.74 N/A N/A N/A 3. 169549 40 mg/kg/d, días 0- 527 0.74 N/A N/A N/A 6 4- 169549 40 mg/kg/d, días 0- 414 0.58 0.55 0.94 aditivo 6/rlL-2 1.0 mg/kg/d, días 0-6 (concomitante) an=10 ratones BALB/c/grupo en cada estudio. Los ratones con tumor modelo RENCA fueron tratados cuando los tumores fueron establecidos a un tamaño medio de aproximadamente 50-70 mm3. Los regímenes concomitantes son presentados como modelo tumoral RENCA que muestran caquexia severa (debilitamiento del animal) haciendo no posible la administración secuencial de los agentes, y no es evaluable. T / C0bservado ( O ) = S T / C cT/Cesperado (E) = % T/C tratamiento 1 x % T/C tratamiento 2 los efectos sinérgicos fueron definidos cuando la proporción de la inhibición esperada del crecimiento tumoral porcentual de la terapia en combinación (%T/Cesp=%T/C tratamiento 1 x %T/C tratamiento 2) dividido entre el %T/C observado (%T/Cobs) del tratamiento en combinación fue >1. eLas interacciones del fármaco fueron definidas como aditivas cuando %T/Cesp/%T/Cobs=l, y el antagonismo cuando %T/Cesp/%T/Cobs<l. N/A, no aplicable Los tratamientos secuenciales en el modelo RENCA no fueron factibles debido a la corta duración del modelo y a la caquexia de los ratones (debilitamiento del animal/pérdida de peso corporal). Colectivamente, los datos demuestran actividad aumentada cuando rIL-2 fue combinado con las terapias con molécula pequeña dirigida, como BAY 43-9006 y SU11248 en modelos preclínicos, indicando que tales estrategias terapéuticas podrían ser trasladadas a la clínica. Mientras que la invención ha sido descrita con respecto a los ejemplos específicos incluyendo las modalidades actualmente preferidas para llevar a cabo la invención, aquellos expertos en la técnica apreciarán que existen numerosas variaciones y permutaciones de los sistemas anteriormente descritos y las técnicas que caen dentro del espíritu y alcance de la invención.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA Los contenidos de todas las patentes, solicitudes de patente y artículos de revista anteriormente citados, son incorporados por referencia como si se describieran completamente en la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para tratar a un paciente que sufre de cáncer, caracterizado porque comprende administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina y un agente antiangiogénico seleccionado de 6,7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4 -iloxi) fenil) -3- ( -cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la aldesleucina es administrada antes del agente antiangiogénico.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la aldesleucina es administrada subsecuente al agente antiangiogénico.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la aldesleucina es administrada concurrente con el agente antiangiogénico.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la aldesleucina es administrada en una composición separada del agente antiangiogénico.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende administrar separadamente al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina y un agente antiangiogénico de acuerdo a un esquema de dosificación, en donde la aldesleucina es administrada de 1 a 3 veces al día en una dosis entre aproximadamente 9 y aproximadamente 130 MlU/día por un periodo de al menos 3 días consecutivos, seguido opcionalmente por un periodo de descanso de al menos 3 días consecutivos.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente antiangiogénico es administrado de 1 a 6 veces cada 2 a 3 semanas.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la aldesleucina es administrada intravenosamente y el periodo de descanso está presente.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la aldesleucina es administrada subcutáneamente y el periodo de descanso está ausente.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la aldesleucina es administrada 1 a 3 veces al día en una dosis de aproximadamente 9-30 MlU/día.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la aldesleucina es administrada 3 veces al día en una dosis de aproximadamente 30-130 MlU/día.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la aldesleucina es administrada por un periodo de 5 días consecutivos, seguido por un periodo de descanso de 9 días.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el esquema de dosificación es repetido por al menos dos cursos.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el esquema de dosificación es repetido por 3 cursos.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el esquema de dosificación es repetido por 4 cursos.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la aldesleucina es administrada 3 veces para el primer día y una vez diariamente cada día subsiguiente .
17. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque el cáncer es carcinoma de células renales, melanoma o cáncer de colon.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además administrarle al paciente al menos un compuesto seleccionado de acetaminofen, meperidina, indometacina, ranitidina, nizatidina, diastop, loperamida, difenhidramina, o furosemida subsecuentemente a o concurrentemente con la administración de la aldesleucina.
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque da como resultado el mejoramiento del cáncer en el paciente.
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque da como resultado la atenuación de la hipotensión en el paciente.
21. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque da como resultado la atenuación de la hipertensión en el paciente.
22. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque da como resultado la reducción de la sintasa del óxido nítrico en el paciente.
23. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el cáncer es susceptible a la inhibición de la angiogénesis y/o a la estimulación inmune.
24. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizado porque el agente antiangiogénico es N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida.
25. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizado porque el agente antiangiogénico es 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- ( -cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea.
26. 26. Una composición caracterizada porque comprende: (a) una cantidad terapéuticamente efectiva de aldesleucina; (b) una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiangiogénico seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea; y (c) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. 27. Un kit, caracterizado porque comprende una combinación de medicamentos para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, que comprende: (a) aldesleucina, y (b) un agente antiangiogénico seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il)metil) ftalazin-1-amina, o 1- (4- (2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3- (trifluorometil) fenil) urea, para el uso simultáneo, secuencial o separado.
28. 28. El kit de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque cada uno de los medicamentos es separadamente envasado.
29. 29. El uso de aldesleucina y un agente antiangiogénico seleccionado de 6, 7-bis (2-metoxietoxi) -N- (3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropoxi) -N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino) etil) -5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden) metil) -2, 4-dietil-lH-pirrol-3-carboxamida, N- (4-clorofenil) -4- ( (piridin-4-il) metil) ftalazin-1-amina, o l-(4-(2- (metilcarbamoil) piridin-4-iloxi) fenil) -3- (4-cloro-3-(trifluorometil) fenil) urea, en la fabricación de uno o más medicamentos para tratar a un paciente que sufre de cáncer.
30. 30. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en donde la aldesleucina es formulada para la administración antes del agente antiangiogénico.
31. 31. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en donde la aldesleucina es formulada para la administración subsecuente al agente antiangiogénico.
32. 32. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en donde la aldesleucina es formulada para la administración concurrente con el agente antiangiogénico.