CN101146549A - 抗血管新生剂与阿地白介素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗癌症的IL-2组合物和抗血管新生剂联合疗法。本发明还提供了减轻与给予IL-2组合物或抗血管新生组合物相关的毒性和提高与给予IL-2组合物或抗血管新生组合物相关的效力的方法。
Description
相关申请的交叉参考
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求2005年2月18日提交的临时申请60/654,341的优先权,将该申请全文纳入本文作参考。
发明领域
本发明涉及与细胞增殖异常相关的疾病的治疗方法。在一些实施方式中,重组IL-2与抗血管新生剂联合用于治疗癌症。
发明背景
毛细血管伸入几乎所有人体组织中,为组织提供氧气和养料,并带走废产物。在一般条件下,内衬毛细血管的内皮细胞不分裂,因此,成人体内毛细血管的数量或尺寸通常不会增加。然而,在某些条件下,如组织损伤或在月经周期的某个阶段,毛细血管开始快速增殖。这种从现有血管形成新毛细血管的过程称为血管新生或新血管形成。参见Folkman,J.Scientific American275,150-154(1996)。伤口愈合期间的血管新生是成年人病理生理性新血管形成的一个例子。在伤口愈合过程中,额外的毛细血管提供氧气和养料,促进肉芽组织,并帮助清除废物。通常,愈合过程终止后,这些毛细血管就退化了。Lymboussaki,A.“胚胎、成年人和肿瘤中的血管内皮生长因子和其受体”(Vascular Endothelial Growth Factors and their Recepcors inEmbryos,Adults,and in Tumors),赫尔辛基大学学位论文,分子/癌症生物学实验室和病理系,Haartman Institute(1999)。
血管新生也在癌细胞生长中起重要作用。已知一旦癌细胞团达到一定大小,直径约1-2mm,癌细胞必须获得血液供应才能使肿瘤生长得更大,因为扩散已经不足以给癌细胞提供足够的氧气和养料。因此,预计抑制血管新生能中止癌细胞生长。在鉴定到的血管新生因子中,血管内皮生长因子(VEGF)是最为有效和特异的,且已被鉴定为正常和病理性血管新生的重要调节物;虽然其它因子如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)也参与了血管新生和癌细胞存活。Curr Opin Investig Drugs.2001Feb;2(2):280-6。
特异性抗肿瘤免疫包括活化免疫系统中的多种细胞类型,最有效的是溶细胞性T淋巴细胞。为了诱导特异性抗肿瘤T淋巴细胞介导的免疫应答,不仅需要识别感兴趣的肿瘤抗原,而且需要肿瘤细胞或抗原递呈细胞上存在的特异性配体和目标T淋巴细胞之间的共同刺激相互作用。可溶性因子,如结合于特定细胞表面受体并启动各种信号转导通路,导致效应器功能增加的细胞因子或其它肽分子也可提供这第二种共同刺激信号。
白介素-2(IL-2)是T淋巴细胞衍生的细胞因子,它能结合于T细胞和天然杀伤(NK)细胞上的特定受体,并能激活它们产生肿瘤细胞溶解、细胞因子分泌和其它效应器功能。CD4和CD8T淋巴细胞都表达IL-2的受体,并在接触生物物质后提高溶细胞效应器和细胞因子合成功能。IL-2的功能作用通过与IL-2受体(IL-2R)的作用介导,IL-2R在结构上由以下三个亚基组成:α、β和与其它细胞因子受体共有的γ链(Caligiuri等,J.Exp.Med.1990 171(5):1509-1526;Bazan,J.F.,Science 1992 257(5068):410-413;Theze等,Immunol.Today 1996 17(10):481-486)。激活IL-2受体和后续信号转导取决于细胞上的IL-2受体类型(Caligiuri等,J.Exp.Med.1990 171(5):1509-1526;Voss等,J.Exp.Med.1992 176(2):531-541;Expinoza等,J.Leukoc.Biol.1995 57(1):13-29;Theze等,Immunol.Today 1996 17(10):481-486)。T细胞表达高亲和IL-2Rαβγ,而NK细胞、单核细胞和巨噬细胞主要表达中等亲和力的IL-2Rβγ形式(Caligiuri等,J.Exp.Med.1990 171(5):1509-1526;Voss等,J.Exp.Med.1992,176(2):531-541;Theze等,Immunol.Today 1996 17(10):481-486;Nagler等,J.Exp.Med 1990 171(5):1527-1533)。其核心机制是,IL-2激活JAK(JAK1、JAK3),JAK磷酸化用作下游信号分子(包括She和Stat5)停靠位点的IL-2Rβ上的关键酪氨酸,这些下游分子然后催化激活两条不同的通路:Shc/Ras/Raf/MAPK和JAK/STAT5,其随后转运至核并直接调节基因调节转录因子家族-STAT(O′Shea,J.J.,Immunity 1997 7(1):1-11)。She募集Grb-2/Sos复合物并活化Ras/Raf/MAPK通路,并募集Grb-2/Gab-2以活化磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路。总之,这些信号蛋白调节基因转录因子,最终控制细胞生长、分裂、分化和免疫活性。此外,IL-2也通过调节导致bcl-2、bcl-xl、c-myb增加的促分裂基因诱导抗凋亡作用,这能通过激活cdk2、4、6和抑制p27kipl影响细胞周期控制,或者可被SOCS(细胞因子信号转导的阻抑物)负调节(Smith,K.A.,Science 1988 240(4856):1169-1176;Theze等,Immunol.Today 1996 17(10):481-486)。据报道,IL-2和IL-2R的相互作用引发下游的MAPK、PI-3K和JAK/STAT信号转导途径激活,导致细胞存活和增殖(Miyazaki等,Science 1994 266(5187):1045-1047;Beadling等,Embo J.1996 15(8):1902-1913;Nakajima等,Immunity 1997 7(5):691-701;Moriggl等,Immunity 1999 11(2):225-230)。
在各种小鼠肿瘤模型中进行的临床前研究证明,在10-14天的周期中给予荷瘤动物重组人IL-2时,可导致肿瘤负担消退、长期存活并且对肿瘤再生长的抗性增加。对获自这些动物的脾淋巴细胞的分析显示,所述抗肿瘤作用至少部分由溶细胞性T细胞功能增加产生。这种作用包括由CTL激活肿瘤细胞的直接溶解以及其它T淋巴细胞衍生的细胞因子合成增加,这种增加可能也具有直接或间接的抗肿瘤作用。
转移性黑色素瘤和肾细胞癌(RCC)大部分是不治之症,它们对大多数类型的全身化疗有抗性,因此仍然非常需要开发出更有效的疗法。近期的临床数据支持对用于黑色素瘤和肾细胞癌的小分子受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂(尤其是BAY43-9006或SU11248)的开发。BAY43-9006和SU11248都能抑制参与肿瘤生长、增殖和抗血管新生的多种激酶。BAY43-9006是Raf/MEK/ERK信号转导途径成员Raf-1的有效抑制剂(Richly等,Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.2003 41(12):620-621;Wilhelm等,Cancer Res.2004 64(19):7099-7109;Awada等,Br.J.Cancer2005 92(10):1855-1861),它能抑制野生型B-Raf和突变的V599E B-Raf。除了BAY43-9006对Raf的作用以外,认为它的大部分活性是通过抑制其它RTK,尤其是VEGFR(VEGFR-2和VEGFR-3)、PDGFRβ和其它关键激酶FLT-3以及cKIT(Wilhelm等,Cancer Res.2004 64(19):7099-7109)介导的。在早期实体瘤试验中用BAY43-9006的反应已证明,每日一次或每日两次给药可导致疾病稳定,包括一些部分反应。迄今为止,I期研究表明,BAY43-9006在患者中通常耐受良好。Bay43-9006的最常见毒性包括胃肠道反应(腹泻、恶心、异常痉挛)或皮肤病反应,包括皮肤搔痒症或皮疹(Richly等,Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.200341(12):620-621;Ahmad和Eisen,Clin.Cancer Res.2004 10(18Pt2):6388S-92S;Awada等,Br.J.Cancer 2005 92(10):1855-1861;Strumberg等,J.Clin.Oncol.200523(5):965-972)。
相反,SU11248是VEGFR-1-3、PDGFRα、cKIT、FLT3和PDGFRβ的非常有效的选择性RTK抑制剂(Abrams等,Mol.Cancer Ther.20032(5):471-478;Mendel等,Clin.Cancer Res.20039(1):327-337;O′Farrell等,Clin.Cancer Res.20039(15):5465-5476)。SU11248已在许多晚期实体瘤(RCC、神经内分泌、基质和腺癌)中显示出抗肿瘤活性(Faivre等,J.Clin.Oncol.2006 24(1):23-35;Motzer等,J.Clin.Oncol.2006 24(1):16-24)。SU11248的临床数据也表明,该药物通常耐受,带有易处理的毒性,包括疲劳、淋巴细胞减少、嗜中性白血球减少、脂酶过高(Faivre等,J.Clin.Oncol.2006 24(1):23-35;Motzer等,J.Clin.Oncol.2006 24(1):16-24)。
对von Hippel-Lindau综合征中出现的透明细胞肾癌的遗传类型的研究鉴定出vonHippel-Lindau肿瘤抑制基因(VHL)。在遗传性肾细胞癌(其中一个突变是种系突变)和大多数散发性透明细胞肾癌(其中两个等位获得突变或缺失)中该基因发生突变。Gnarra JR,Duan DR,Weng Y等。Molecular cloning of the von Hippel-Lindau tumorsuppressor gene and its role in renal carcinoma(von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因的分子克隆和它在肾癌中的作用),Biochimica et Biophysica Acta.1996;1242(3):201-10。这些突变的结果之一是通过涉及缺氧诱导因子的机制过度产生血管内皮生长因子。OIliopoulous AL,C Jiang等,Negative Regulation of Hypoxia-inducable gene by theVon-Hippel Lindu Protein(Von-Hippel Lindu蛋白下调缺氧诱导基因),Proc Natl AcadSci USA.1996;93:10595-10599。因此,通过其对血管内皮生长因子的调节,yonHippel-Lindau蛋白与血管新生紧密相关。血管内皮生长因子刺激内皮细胞的生长,并且(如上所述)似乎是血管新生中,特别是胚胎发育、排卵、伤口愈合和肿瘤生长期间的核心因子。Ferrara N.Molecular and biological properties of vascular endothelialgrowth factor(血管内皮生长因子的分子和生物学特性),J.Mol.Med.1999;77:527-543。
血管内皮生长因子是治疗透明细胞肾癌的良好靶点,因为von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因的突变导致肿瘤过度产生这种生长因子。Yang等A randomized trial ofbevacizumab,an anti-vascular endothelial growth factor antibody,for metastatic renalcancer(抗血管内皮生长因子抗体贝伐单抗用于转移性肾癌的随机试验),New EnglandJournal ofMedicine 2003;349(5):427-34描述了在转移性透明细胞肾癌患者中进行人源化单克隆抗体(贝伐单抗)的随机双盲安慰剂对照研究。与安慰剂组患者相比,在每千克给予贝伐单抗(每两周10mg/kg)的患者中,肿瘤进展时间(time to tumor progression)延长了2.55倍。在该试验中存活不是主要终点,其使患者在疾病进展时能从安慰剂组转移到贝伐单抗治疗组。通过除血管内皮生长因子介导途径以外的途径靶向血管新生机制治疗肾癌也可能有效。在一些肿瘤的局部微环境中还有可促进血管新生的其它蛋白。同样,对在对肾细胞癌生物学机制的理解的指导下、采用合理组合抑制剂的抗血管新生治疗法存在需求。
根据对接受间歇性高剂量推注方案的255位患者进行的几项多中心试验的结果,FDA批准将重组人白介素-2(阿地白介素)用于治疗转移性肾癌。在这些试验中,在15%患者中观察到客观反应,存活期中值为16.3个月(Fisher和Rosenberg 2000 Cancer J SciAm 6S1:S55-57)。由于这种方案产生显著毒性,进行了以不同剂量采用不同给药途径给予rIL-2的一系列临床I期和II期试验。最近,一篇关于rIL-2作为单一药物的效力的综述表明,在用这一系列研究治疗的1700多名转移性RCC患者中总体反应率为15%。在3-5%的患者中观察到完全反应。Bukowski RM.Natural history and therapy ofmetastatic renal cell carcinoma:the role ofinterleukin-2(转移性肾细胞癌的天然历史和治疗:白介素-2的作用),Cancer,1997;80(7):1198-220。在这些途径中反应率看起来没有不同。高剂量静脉内(IV)推注方案和低剂量IV推注方案和对门诊病人皮下给药方案之间的随机比较显示,组间的存活期中值没有差异,但低剂量和门诊病人方案的毒性明显较低。Yang JC,Sherry RM,Steinberg SM等,Randomized study ofhigh-dose and low-dose interleukin-2in patients with metastatic renal cancer(在转移性肾癌患者中高剂量和低剂量白介素-2的随机研究),JournalofClinical Oncology.2003;21(16):3127-32。
除了具有直接的免疫调节作用,rIL-2也可通过引起活化NK细胞释放二级细胞因子释放(IFNγ)防止肿瘤增殖。Saraya KLA,Balkwill FR,Temporal sequence and cellularorigin of interleukin-2 stimulated cytokine gene expression(白介素-2刺激细胞因子基因表达的时间序列和细胞来源),British Journal of Cancer.1993;67(3):514-21。
可提高透明细胞肾癌患者的反应率和治疗结果。需要采用新型药物组合的临床试验。rIL2和抗血管新生剂如贝伐单抗的联用可具有加成作用,这可转变为对转移性肾细胞癌以及其它癌症患者的更多的临床获益。这一令人称赞的方法对于消退癌症的另一优点是它提供了更不容易被抗性突变规避的平台。当治疗靶点非常极化和特异(可能是避免靶向宿主细胞所必需的),如靶向病毒复制子的特定底物或癌细胞系的激酶时,疾病状态中的一个点突变即可使其不受药物的作用,从而在后代中产生该疾病的更难对付的品系。
需要利用靶向体内免疫应答机制和疾病状态底物的药物治疗患有对常规方法有抗性或常规方法不足以治疗的与异常增殖相关的疾病的患者的新方法和机制。本发明提供了这种治疗剂,还提供了其它相关优点。
发明概述
本发明部分基于采用具有非叠加毒性的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂和rIL-2的独特的联合治疗。由于黑色素瘤和RCC通常对免疫治疗如rIL-2有反应,所以本文根据单个药物的药理学评价了rIL-2与可能的受体酪氨酸激酶抑制剂的合理组合。本发明根据这些药物的毒理学特性提供了临床上可应用的药物方案,以规避可能的药物相互作用。也阐述了不利的药代动力学/药效学相互作用和不利的药理学相互作用的可能性。描述了rIL-2和小分子受体酪氨酸激酶抑制剂如BAY43-9006对T细胞的作用和对IL-2-介导的信号转导途径(MAPK和JAK/STAT5)的影响。
因此,本发明扩展了IL-2化合物如重组IL-2(rIL-2,也称为阿地白介素)对常规治疗反应差的癌细胞系的抗肿瘤效力的适应症,导致长期存活增加和对肿瘤复发(rechallenge)的免疫力。而且,rIL-2的免疫刺激作用旨在减轻与其共同给予的抗血管新生性组合物引起的现有的副作用。提供了用IL-2化合物如rIL-2和至少一种抗血管新生剂联合治疗患有细胞增殖异常,尤其是肾细胞癌的对象的方法。而且,也提供了用IL-2化合物如rIL-2和小分子联合治疗患有细胞增殖异常,尤其是肾细胞癌的对象的方法。优选的本发明小分子见表1-5。尤其优选的分子是N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺(也称为SU11248)和l-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲(也称为Bay43-9006)。
阿地白介素和抗血管新生剂可以一起给药或者作为单独的药物组合物分别给药。如果分别给药,可以在给予所述抗血管新生剂之前、同时或之后给予阿地白介素。提供的具体方案包括每天、每周和每月共同给予阿地白介素与抗血管新生剂的给药方案(或其重复),所述抗血管新生剂例如6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺和1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
在一个实施方式中,优选为6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺和1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲之一的抗血管新生剂与抗血管新生蛋白如能够抑制VEGF的单克隆抗体共同给药。在一个更具体的实施方式中,本发明抗血管新生蛋白是贝伐单抗或VEGF-Trap。在另一个更具体的实施方式中,所述蛋白是EGF抑制剂,如西妥昔单抗。
在另一实施方式中,以本文所述方式一起给予阿地白介素和抗血管新生剂能增强所述抗血管新生剂的有效性,导致相对于单用所述抑制剂提高的阳性/协同治疗反应。
其它实施方式提供了适合商业出售的治疗癌症患者的治疗包装,其包括容器、治疗有效量的阿地白介素和治疗有效量的抗血管新生剂和/或小分子,优选表1-5所列物质,如6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
在其它实施方式中,提供了一种药盒。所述药盒包括同时、依次或分别应用的治疗癌症患者的药物组合,包括:(a)阿地白介素和(b)抗血管新生剂,所述抗血管新生剂选自:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
提供了制造本文所述组合物的方法,并认为这种方法应该落入本发明范围,因为制造用于本发明方法的药物的方法中采用了所述组合。
本发明的其它实施方式包括详细说明中所述的实施方式。
附图简要说明
图1显示了在IL-2反应性、T细胞有功能的小鼠肿瘤模型中rIL-2、BAY43-9006或SU11248的单一药物活性。将B16-F10黑色素瘤(2×106)、CT26结肠(2×106)或RENCA肾癌(1×106)细胞皮下植入雌性C57BL6或BALB/c小鼠的右侧。肿瘤生长至平均大小为50-225mm3时开始治疗,如方法部分所述。将小鼠随机分成治疗组(10只小鼠/组)。每天皮下给予rIL-2(0.2-3mg/kg/d)。通过管饲法每天给予溶液形式的BAY43-9006或SU11248(1-100mg/kg)。图1说明了在B16-F10、CT26和RENCA肿瘤模型中一种药物处理后第10-14天的平均肿瘤生长抑制(按照[1-(治疗组的平均肿瘤体积/载体组的平均肿瘤体积)×100]计算)。这些数据由多次独立研究汇编而来,各研究为10只小鼠/组。*指相对于载体治疗的统计学显著性(p<0.05,ANOVA)。
图2显示了在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中rIL-2和BAY43-9006同步治疗的效力。将B16-F10细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性C57BL6小鼠右侧。当肿瘤生长至~50mm3时将小鼠随机分组,从第0天开始用载体(第0-6天)(◆)、rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)(△)或BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天)(×)或组合的rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)+BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天)(■)进行治疗。图2说明了与随机分组后天数相对的平均肿瘤体积(mm3±SE)(n=10只小鼠/组)。
图3A和3B显示了在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中rIL-2和BAY43-9006连续治疗的效力。将B16-F10细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性C57BL6小鼠右侧。当肿瘤生长至~50mm3时将小鼠随机分组,第0天开始治疗。图3A显示了首先给予rIL-2、然后给予BAY43-9006的连续方案的结果。图中指出:载体(◆)第0-6、7-13天;rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)(△)或BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第7-13天)(×)或联合给予rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)+BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第7-13天)(●)。图3B显示了首先给予BAY43-9006、然后给予rIL-2的连续方案的结果。图中指出:载体(◆)第0-6、7-13天;BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天)(×);rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)(□)或联合给予BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天)+rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)(▲)。曲线图显示了与随机分组后天数相对的平均肿瘤体积(mm3±SE)(n=10只小鼠/组)。
图4显示了在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中rIL-2和SU11248同步治疗的效力。将B16-F10细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性C57BL6小鼠右侧。当肿瘤生长至~50mm3时将小鼠随机分组,从第0天开始用载体(第0-6天)(◇)、rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)(□)或SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(O)或组合的rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(▲)进行治疗。图4说明了与随机分组后天数相对的平均肿瘤体积(mm3±SE)(n=10只小鼠/组)。
图5A和5B显示了在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中rIL-2和SU11248连续治疗的效力。将B16-F10细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性C57BL6小鼠右侧。当肿瘤生长至~50mm3时将小鼠随机分组,第0天开始治疗。图5A显示了首先给予rIL-2、然后给予SU11248的连续方案的结果。图中指出:载体(◇)第0-6、7-13天;rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)(□)或SU11248(40mg/kg,p.o.第7-13天)(x)或联合给予rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg,p.o.第7-13天)(●)。图5B显示了首先给予SU11248、然后给予rIL-2的连续方案的结果。图中指出:载体(◇)第0-6、7-13天;SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(O);rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)(Δ)或联合给予SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)+rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)(■)。曲线图显示了与随机分组后天数相对的平均肿瘤体积(mm3±SE)(n=10只小鼠/组)。
图6显示了在CT26小鼠结肠腺癌模型中rIL-2和BAY43-9006连续治疗的效力。将CT26细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性BALB/c小鼠右侧。当肿瘤生长至~225mm3时将小鼠随机分组,第0天开始治疗。图中说明首先给予rIL-2、然后给予BAY43-9006的连续方案:载体(◆)第0-6、7-13天;rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)(□)或BAY43-9006(40mg/kg,p.o.第7-13天)(△)或联合给予rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)+BAY43-9006(40mg/kg,p.o.第7-13天)(●)。
图7显示了在CT26小鼠结肠腺癌模型中rIL-2和SU11248的同步治疗的效力。将CT26细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性BALB/c小鼠右侧。当肿瘤生长至~225mm3时将小鼠随机分组,第0天开始治疗。图中指出:载体(◆)第0-6天;rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)(□)或SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(O)或联合给予rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(●)。
图8A和8B显示了在CT26小鼠结肠腺癌模型中rIL-2和SU11248连续治疗的效力。将CT26细胞(2×106个细胞)皮下植入雌性BALB/c小鼠右侧。当肿瘤生长至~225mm3时将小鼠随机分组,第0天开始治疗。图中指出:图8A显示了首先给予rIL-2、然后给予SU11248的连续方案的结果:载体(◆)第0-6、7-13天;rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)(□)或SU11248(40mg/kg,p.o.第7-13天)(O)或联合给予rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg,p.o.第7-13天)(■)。图8B显示了首先给予SU11248、然后给予rIL-2的连续方案的结果。图中指出:载体(◆)第0-6、7-13天;SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(O);rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)(□)或联合给予SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)+rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)(▲)。曲线图显示了与随机分组后天数相对的平均肿瘤体积(mm3±SE)(n=10只小鼠/组)。
图9显示了在小鼠RCC RENCA肿瘤模型中rIL-2和BAY43-9006同步治疗的效力。将RENCA细胞(1×106个细胞)皮下植入雌性BALB/c小鼠右侧。当肿瘤生长至~50mm3时将小鼠随机分组,从第0天开始用载体(第0-8天)(◆)、rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-4、7-11天)(△)或BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-8天)(×)或组合的rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-4、7-11天)+BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-8天)(■)进行治疗。图9说明了与随机分组后天数相对的平均肿瘤体积(mm3±SE)(n=10只小鼠/组)。
图10显示了在小鼠RCC RENCA肿瘤模型中rIL-2和SU11248同步治疗的效力。将RENCA细胞(1×106个细胞)皮下植入雌性BALB/c小鼠右侧。当肿瘤生长至~50mm3时将小鼠随机分组,从第0天开始治疗。图中指出:载体(◆)第0-6天;rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)(■)或SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(x)或联合给予rIL-2(1mg/kg,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg,p.o.第0-6天)(▲)。
发明详述
利用检测试验,几种类型的癌症被表征为对采用抗血管新生剂/VEGF抑制剂和细胞因子给药治疗或用rIL-2调节敏感。这种癌症包括例如:CML、AML、乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾上腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、直肠癌、皮肤癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、脑/CNS癌、宫颈癌、鼻咽癌、恶性间皮瘤、喉咽癌、胃肠道良性肿瘤、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、胆囊癌、睾丸癌、食道癌、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌、头颈癌、膀胱癌、结肠癌、结直肠癌、淋巴瘤和成胶质细胞瘤。本文所述方法可用于治疗任何上述癌症。
阿地白介素和至少一种抗血管新生剂以本文所述方式联合治疗对于其未减少的增殖细胞高度依赖于血管形成(如VEGF)的癌症的治疗能引起有利的生理反应。本发明的一种实施方式提供了治疗因为给予阿地白介素而发生低血压的癌症患者的方法,所述方法包括:将治疗有效量的抗血管新生剂共同给予所述患者以减轻低血压。本发明的另一更具体实施方式包括改善患者的癌症。
本发明的另一实施方式提供了治疗因为给予抗血管新生剂而发生高血压的癌症患者的方法,所述方法包括,将治疗有效量的阿地白介素共同给予所述患者以减轻高血压。
本发明的另一更具体实施方式包括改善患者的癌症。在某些实施方式中,所述癌症对血管新生抑制和/或免疫刺激敏感。
在前述任一实施方式的更具体实施方式中,所述抗血管新生剂选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明的另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予所述患者阿地白介素和选自下组的化合物:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明的另一实施方式提供了提高阿地白介素在癌症患者中的效力的方法,所述方法包括,首先给予能够诱导患者缺氧的剂量的抗血管新生剂,然后给予阿地白介素。另一实施方式提供了提高抗血管新生剂在癌症患者中的效力的方法,所述方法包括通过将阿地白介素给予该患者减少一氧化氮合酶。另一实施方式提供了提高抗血管新生剂在癌症患者中的效力的方法,所述方法包括给予所述患者阿地白介素,从而通过将阿地白介素给予该患者使一氧化氮合酶减少。
在本发明的更具体实施方式中,所述抗血管新生剂选自:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明的另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括以下步骤:首先将治疗有效量的阿地白介素给予所述患者,然后给予选自下组的抗血管新生剂:(如)6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明的另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括以下步骤:首先将治疗有效量的抗血管新生剂,如6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲给予所述患者,然后给予阿地白介素。
本发明的另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,包括按照给药方案分别给予所述患者治疗有效量的抗血管新生剂和阿地白介素,其中在至少连续3天中每天以约9-130MIU/天的剂量给予阿地白介素1-3次,然后任选为至少连续3天的停药期。
在本发明的更具体实施方式中,每2-3周给予所述抗血管新生剂1-6次。
在本发明的更具体实施方式中,所述抗血管新生剂是VEGF抑制剂。
在本发明的更具体实施方式中,所述抗血管新生剂选自:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。在本发明的更具体实施方式中,静脉内给予阿地白介素,并存在所述停药期。
在本发明的更具体实施方式中,皮下给予阿地白介素,不存在所述停药期。
在本发明的更具体实施方式中,每天以约30-100MIU/天的剂量给予阿地白介素3次。
在本发明的更具体实施方式中,连续给予阿地白介素5天,然后停药9天。
在更具体的实施方式中,将所述给药方案重复至少两个疗程。在更具体的实施方式中,各疗程由2-5天治疗后接9-15天停药期组成。
在本发明另一更具体的实施方式中,在第一天给予阿地白介素3次,随后每天给药一次。
在本发明的更具体实施方式中,将所述给药方案重复至少两个疗程、或3个疗程、或4个疗程、或5个疗程、或6个疗程、或7个疗程、或8个疗程、或9个疗程、或10个疗程。
在任何前述实施方式的更具体实施方式中,所述癌症是结肠癌、肾细胞癌或恶性黑色素瘤。
在任何前述实施方式的更具体实施方式中,给予阿地白介素后,也将选自下组的至少一种化合物给予所述患者:对乙酰氨基酚、哌替啶、吲哚美辛、雷尼替丁、尼扎替丁、diastop、洛哌丁胺、苯海拉明或呋塞米。在任何前述实施方式的优选实施方式中,所述抗血管新生剂是6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明的另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和:
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和:
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和:
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和:
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和式I化合物或其互变异构体、其药学上可接受的盐或其互变异构体的药学上可接受的盐:
式中:
R1是烷基、-芳基(Ri)p或杂环基;
R2是H或烷基;或
R1和R2结合在一起形成R1-2;
R3是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rc、-S(O)nRd或杂环基;
R4是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、-O-(CH2)q-Rg、-O-(CH2)q-O-Re、-NR3Rb、-S(O)nRd或-杂环基-Rf’;
R5是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、-O-(CH2)q-Rg、-O-(CH2)q-O-Re、-NRaRb、-S(O)nRd或杂环基;
R6是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rc、-S(O)nRd或杂环基;
R7是H、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-S(O)nRd或杂环基;
Ra和Rb各自独立地是H、烷基、-C(O)Rc、芳基、杂环基或烷氧基;或者
Ra和Rb结合在一起形成R1-2;
Rc各自独立地是H、烷基、烷氧基、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-CHO、芳基或杂环基;
Rd各自独立地是H、烷基、烯基、芳基或-NRaRb;
Re各自独立地是H或烷基;
Rf是H、卤素、-OH、-CN、-(CH2)qNRaRh、烷氧基、-C(O)Rc、-(CH2)qCH3。
Rg各自独立地是H、卤素、-C(O)Rc、芳基、杂环基或-NRaRb;
Rh是H或-(CH2)qS(O)nRd;
Ri各自独立地是H、卤素、烷基、烯基、炔基或-O(CH2)q-Rg;
n各自独立地是0、1或2;
p各自独立地是0、1、2或3;
q各自独立地是0、1或2;
R1-2具有下示通用结构:
式中,
R8各自独立地是H、-OH、卤素、烷基、烷氧基、-NRaRb或-S(O)nRd;
如果X是O、S或不存在,R9各自独立地是H、烷基、-C(O)Rc或不存在;
X各自独立地是O、S、N、CH或不存在,从而形成共价键;和
m各自独立地是0、1或2。
在本发明的更具体实施方式中,所述化合物是:
其互变异构体、其药学上可接受的盐或其互变异构体的药学上可接受的盐。
在本发明的更具体实施方式中,所述化合物是:
其互变异构体、其药学上可接受的盐或其互变异构体的药学上可接受的盐。
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和式II化合物或其互变异构体、其药学上可接受的盐或其互变异构体的药学上可接受的盐:
式中,
R11是烷基、芳基或杂环基;
R12、R13、R14和R15各自独立地是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rz、-S(O)nRd或杂环基;
Ra和Rb各自独立地是H、烷基、-C(O)Rz、芳基、杂环基或烷氧基;
Rz各自独立地是H、烷基、烷氧基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、芳基或杂环基;
Rd各自独立地是H、烷基、烯基、芳基或-NRaRb;
n各自独立地是0、1或2;和
q各自独立地是0、1或2。
在本发明的更具体实施方式中,R11是R11a:
式中,
R16、R17和R18各自独立地是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rz、-S(O)nRd或杂环基。
在本发明的更具体实施方式中,所述化合物是:
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予阿地白介素和式III化合物或其互变异构体、其药学上可接受的盐或其互变异构体的药学上可接受的盐:
式中,
虚线代表任选地安置另一个键;
R20是H或=O;
R21、R22、R23和R24各自独立地是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rz、-S(O)nRd或杂环基;
R25是H、烷基或-C(O)Rz;
R26和R27各自独立地是H、-OH、卤素、烷基、-NRaRb、-C(O)Rz或-S(O)nRd;
R28是H、-CH3或卤素;
Ra和Rb各自独立地是H、烷基、-C(O)Rz、芳基、杂环基或烷氧基;
Rz各自独立地是H、烷基、烷氧基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、芳基或杂环基;
Rd各自独立地是H、烷基、烯基、芳基或-NRaRb,;
n各自独立地是0、1或2;和
q各自独立地是0、1或2。
在本发明的更具体实施方式中,所述化合物是:
在本发明的更具体实施方式中,所述化合物是:
本发明另一实施方式提供了降低将阿地白介素给予癌症患者伴随的毒性的方法,所述方法包括给予所述患者喹啉酮,优选抗血管新生剂,优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明另一实施方式提供了降低将优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲的抗血管新生剂给予癌症患者伴随的毒性的方法,所述方法包括给予所述患者阿地白介素。
本发明另一实施方式提供了降低癌症患者的IL-2抗性的方法,所述方法包括给予所述患者抗血管新生剂,优选选白6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明另一实施方式提供了治疗癌症患者的方法,所述方法包括以下步骤:首先给予所述患者治疗有效量的阿地白介素,然后给予抗血管新生剂,优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明另一实施方式提供了治疗癌症患者的方法,所述方法包括按照给药方案分别给予所述患者治疗有效量的抗血管新生剂和阿地白介素,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲,其中在至少连续3天中每天以约9-130MIU/天的剂量给予阿地白介素1-3次,然后任选为至少连续3天的停药期。更具体说,所述剂量约为30-100MIU/天。更具体说,所述剂量约为30-60MIU/天。更具体说,所述剂量约为30-40MIU/天。更具体说,所述剂量约为17-30MIU/天。更具体说,所述剂量约为9-30MIU/天。
在更具体的实施方式中,每2-3周给予所述抗血管新生剂1-9次,所述所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。在更具体的实施方式中,所述抗血管新生剂是VEGF抑制剂,优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
在另一实施方式中,所述抗血管新生剂也与贝伐单抗或西妥昔单抗或VEGF-Trap一起给予,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。更具体说,所述贝伐单抗的给药剂量为每12-16天一次1到12mg/kg之间。
在另一实施方式中,在给予rIL-272小时内给予所述抗血管新生剂;其中“内”指之前或之后,如:在给予rIL-272小时前或72小时后给予抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-214天内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-27天内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-26天内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-25天内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-24天内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-248小时内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-236小时内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-224小时内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-212时内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-26小时内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-21小时内给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,在给予rIL-2的同时给予所述抗血管新生剂。在另一实施方式中,将抗血管新生剂与rIL-2联合给药。在本发明的更具体实施方式中,所述抗血管新生剂选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明另一实施方式提供了一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括共同给予阿地白介素和抗血管新生剂,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
本发明另一实施方式提供了适合商业出售的治疗癌症患者的治疗包装,其包括容器、治疗有效量的阿地白介素和治疗有效量的抗血管新生剂,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。一种本发明所述治疗包装,其中所述患者患有肾细胞癌。一种本发明所述治疗包装,还包括指导患者在接受抗血管新生剂治疗之前接受阿地白介素的治疗的书面材料,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
另一实施方式提供了含有抗血管新生剂和阿地白介素的药物组合物,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
透明细胞肾细胞癌(RCC)与血管形成增加,尤其是VEGF表达有关。VEGF是在肿瘤血管新生(向肿瘤形成新血管)和维持已建立的肿瘤血管中起重要作用的蛋白。它结合于血管上的特定受体,刺激现有血管延伸。一些(而非所有)RCCa病例的血清VEGF水平升高。
有证据显示,VEGF增加与IL-2抗性有关(Lissoni等,AntiCancer Res.2001;21:777-9)。VEGF对T细胞和树突细胞的免疫抑制作用(Gabrilovich等,JLeukoc Biol.2002;72:285-96)可能代表了VEGF诱导的对IL-2治疗产生抗性的机制。
此外,VEGF提高了血管通透性,用抗VEGF治疗会导致一些患者的血压升高。因此,如果本发明联合用药给予了癌症如RCCa的患者,抗VEGF(如高血压)和rIL-2(如低血压)的一些主要毒性可能互相抵消,导致治疗指数总体提高。
与单独给予药物相比,本发明的其它联合用药,如阿地白介素与贝伐单抗或西妥昔单抗产生更高的反应比例和/或更好的反应持久性。本文所述的具体阿地白介素给药方案提供了间歇性刺激天然杀伤(NK)细胞活性并降低了可能与长期进行rIL-2给药有关的rIL-2-相关性副作用的风险。需要注意,通过给予本发明抗血管新生性组合物抵消了一般与rIL-2给药有关的低血压,因为这种组合物通常与高血压相关。而且,一般与VEGF抑制剂相关的缺氧能提高rIL-2治疗效力的敏感性,同时也提供了缓解效果。
本发明另一实施方式提供了阿地白介素在制造用于治疗癌症的药物中的应用,其中所述药物与抗血管新生剂分别、同时或连续应用,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。在本发明的更具体实施方式中,优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲的所述抗血管新生剂是乳酸盐。在另一实施方式中,所述癌症是肾细胞癌。
本发明另一实施方式提供了抗血管新生剂在制造用于治疗癌症的药物中的应用,所述抗血管新生剂优选选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲,其中所述药物与阿地白介素分别、同时或连续应用。
与血管新生有关、受本发明组合物调节(如抑制)的优选分子包括:血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白介素-8(IL-8)、血管生成素、促血管素、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生内皮细胞生长因子、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)或一氧化氮。本发明也考虑了由本发明组合物调节(如增强)的血小板反应蛋白、血管抑制素和内皮抑制素。
与rIL-2共同给予的通用组合物:
喹唑啉
式I化合物具有以下结构:
式中,
R1是烷基、-芳基(Ri)p或杂环基;
R2是H或烷基;或
R1和R2结合在一起形成R1-2;
R3是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rc、-S(O)nRd或杂环基;
R4是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、-O-(CH2)q-Rg、-O-(CH2)q-O-Re、-NR3Rb、-S(O)nRd或-杂环基-Rf;
R5是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、-O-(CH2)q-Rg、-O-(CH2)q-O-Re、-NRaRb、-S(O)nRd或杂环基;
R6是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rc、-S(O)nRd或杂环基;
R7是H、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-S(O)nRd或杂环基;
Ra和Rb各自独立地是H、烷基、-C(O)Rc、芳基、杂环基或烷氧基;或者
Ra和Rb结合在一起形成R1-2;
Rc各自独立地是H、烷基、烷氧基、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-CHO、芳基或杂环基;
Rd各自独立地是H、烷基、烯基、芳基或-NRaRb;
Re各自独立地是H或烷基;
Rf是H、卤素、-OH、-CN、-(CH2)qNRaRh、烷氧基、-C(O)Rc、-(CH2)qCH3。
Rg各自独立地是H、卤素、-C(O)Rc、芳基、杂环基或-NRaRb;
Rh是H或-(CH2)qS(O)nRd;
Ri各自独立地是H、卤素、烷基、烯基、炔基或-O(CH2)q-Rg;
n各自独立地是0、1或2;
p各自独立地是0、1、2或3;
q各自独立地是0、1或2;
R1-2具有下示通用结构:
式中,
R8各自独立地是H、-OH、卤素、烷基、烷氧基、-NRaRb或-S(O)nRd;
如果X是O、S或不存在,R9各自独立地是H、烷基、-C(O)Rc或不存在;
X各自独立地是O、S、N、CH或不存在,从而形成共价键;和
m各自独立地是0、1或2。
在本发明的更具体的实施方式中,R2是H。在更具体的实施方式中,R1是-芳基(Ri)p。在R1是-芳基(Ri)p的另一实施方式中,R1中的芳基是苯基,R1中的p是2,R1中的两个Ri基团都是卤素。
在R1是-芳基(Ri)p的另一实施方式中,R1中的芳基是苯基,R1中的p是1,R1中的Ri基团是炔基,优选乙炔基。
在R1是-芳基(Ri)p的另一实施方式中,R1中的芳基是苯基,R1中的p是2,R1中的一个Ri基团是卤素,R1中的另一个Ri基团是-O(CH2)q-Rg。在其更具体实施方式中,R1中的q是1,R1中的Rg是卤代苯基。
在R1是-芳基(Ri)p的另一实施方式中,R1中的p是1,R1中的Ri是炔基。
提供了本发明的另一个更具体的实施方式,其中R1和R2结合在一起形成R1-2:
其中,R8是H,X是N,R9是-C(O)nHRb。在其更具体实施方式中,R9中的Rb是-苯基-O-CH2(CH3)2。
在本发明的更具体的实施方式中,R3和R6是H。
在本发明的更具体的实施方式中,R4是-O-(CH2)q-Rg。在其更具体实施方式中,R4中q是1,Rg是H。
在R4是-O-(CH2)q-Rg的另一实施方式中,R4中的Rg是杂环基。
在本发明的更具体的实施方式中,R4和R5各自是-O-(CH2)q-O-Re。在其更具体实施方式中,R4和R5中的q都是2,R4和R5中的Re都是甲基。
在本发明的更具体的实施方式中,R4是-杂环基-Rf,R5是H。在其更具体实施方式中,R4内的所述杂环基是呋喃基。在更具体的实施方式中,R4中的Rf是-(CH2)qNHRh。进一步,Rh是-(CH2)qS(O)2CH3。
在本发明的更具体的实施方式中,R5是-O-(CH2)q-Rg。在其另一实施方式中,R5中的Rg是杂环基。
本发明提供了另一实施方式,其中R7是H。
本发明提供了另一实施方式,其中R3、R6和R7都是H。
二氢吲哚酮
式II化合物具有以下结构:
式中,
R11是烷基、芳基或杂环基;
R12、R13、R14和R15各自独立地是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rz、-S(O)nRd或杂环基;
Ra和Rb各自独立地是H、烷基、-C(O)Rz、芳基、杂环基或烷氧基;
Rz各自独立地是H、烷基、烷氧基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、芳基或杂环基;
Rd各自独立地是H、烷基、烯基、芳基或-NRaRb;
n各自独立地是0、1或2;和
q各自独立地是0、1或2。
在更具体实施方式中,R11是杂环基。在更具体的实施方式中,R11是R11a:
式中,
R16、R17和R18各自独立地是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rz、-S(O)nRd或杂环基。在R1是R1a的又一更具体的实施方式中,R7是-C(O)-(CH2)p-N(H)(2-r)(烷基)r,其中p是0、1、2、3、4或5,r是0、1或2。在R11是R11a的又一更具体的实施方式中,R17是F。在R11是R11a的又一更具体的实施方式中,R17是-(CH2)tCOOH,其中t是1、2、3或4。在R11是R11a的又一更具体的实施方式中,R6和R8都是甲基。在R11是R11a的又一更具体的实施方式中,R17是H。
在本发明另一更具体的实施方式中,R11是芳基。更具体说,R11是取代或未取代的苯基。在另一实施方式中,R13是碘。
异二氢吲哚酮
式III化合物具有以下结构:
式中,
虚线代表任选地安置另一个键;
R20是H或=O;
R21、R22、R23和R24各自独立地是H、-CN、-OH、卤素、烷基、芳基、烷氧基、-NRaRb、-C(O)Rz、-S(O)nRd或杂环基;
R25是H、烷基或-C(O)Rz;
R26和R27各自独立地是H、-OH、卤素、烷基、-NRaRb、-C(O)Rz或-S(O)nRd
R28是H、-CH3或卤素;
Ra和Rb各自独立地是H、烷基、-C(O)Rz、芳基、杂环基或烷氧基;
Rz各自独立地是H、烷基、烷氧基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、芳基或杂环基;
Rd各自独立地是H、烷基、烯基、芳基或-NRaRb,;
n各自独立地是0、1或2;和
q各自独立地是0、1或2。
定义:
AUC 曲线下面积
CR 完全反应
DLT 剂量限制毒性
IL 白介素
IL-2 白介素-2
IU 国际单位
IV 静脉内(作为给药方式)
LAK 淋巴因子活化的杀伤细胞
MTD 最大耐受剂量
MIU 百万国际单位
NK 天然杀伤细胞
PK 药代动力学
PR 部分反应
RCC 肾细胞癌
RCCa 透明细胞肾细胞癌
rIL-2 重组白介素-2
RTK 受体酪氨酸激酶
TNF 肿瘤坏死因子
VEGF 血管内皮生长因子
通常,提到某些元素如氢或H,旨在包括该元素的所有同位素。例如,如果将R基团定义为包含氢或H,它也包含氘和氚。
“抗血管新生剂”指已证明或将被证明能在系统中抑制血管新生的任何小分子,更具体说,是分子量小于1,100g/mol的任何化合物。与血管新生相关、受本发明组合物调节(如抑制)的优选分子包括:血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白介素-8(IL-8)、血管生成素、促血管素、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生内皮细胞生长因子、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)或一氧化氮。本发明也考虑了由本发明组合物调节(如增强)的血小板反应蛋白、血管抑制素和内皮抑制素。优选的本发明抗血管新生组合物包括:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺和1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
术语“有效量”是实现所需生物学作用所必需的量或足以实现所需生物学作用的量。例如,治疗肾细胞癌的化合物的有效量可以是引起肾细胞肿瘤生长消退所必需的量。有效量可能取决于(例如)所治疗疾病、对象体重和疾病的严重程度。本领域技术人员无需过度的实验就能凭经验确定有效量。
本文所用“治疗有效量”指足以缓解、改善、稳定、逆转、减缓或延迟病症进展如疾病状态的量。
“对象”或“患者”指人或脊椎动物,包括犬、猫、口袋宠物、狨、马、牛、猪、绵羊、山羊、象、长颈鹿、鸡、狮子、猴、猫头鹰、大鼠、松鼠、懒猴和小鼠。
“口袋宠物”指能够装入宽大的外套口袋的脊椎动物类群,如仓鼠、栗鼠、雪貂、大鼠、豚鼠、沙鼠、兔和蜜袋鼯。
本文所用术语“药学上可接受的酯”指在体内水解的酯,包括那些在人体内容易降解而留下母体化合物或其盐的酯。合适的酯基包括例如:衍生自药学上可接受的脂族羧酸,尤其是链烷酸、链烯酸、环烷酸和链烷二羧酸的酯基,其中各烷基或烯基部分宜含有不多于6个碳原子。具体酯的代表性例子包括但不限于:甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。
可以盐形式应用本发明化合物,如衍生自无机或有机酸的“药学上可接受的盐”。这些盐包括但不限于:乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。同时,可用一些物质使碱性含氮基团季铵化,这种物质有:低级烷基卤化物,如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物;二烷基硫酸酯如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯;长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物;芳烷基卤化物,如苄基和苯乙基溴等。从而获得可溶于或可分散于水或油的产物。
本文所用术语“药学上可接受的前药”指那些根据合理的医学判断,适用于接触人和低等动物的组织的、具有过度毒性、刺激性、过敏反应等、具有合理的获益/风险比、并能有效用于其所需应用的本发明化合物的前药,以及在可能情况下本发明化合物的两性离子形式。术语“前药”指在体内快速转化产生上式母体化合物(如通过在血液中水解)的化合物。T.Higuchi和V.Ste1la,Pro-drugs as Novel DeliverySystems(作为新型递送系统的前药),A.C.S.研讨会系列第14卷和Edward B.Roche编,Bioreversible Carrier in Drug Design(药物设计中的生物可逆性运载体),AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中进行了充分讨论。可采用例如如美国专利6,284,772所述的前药。
“卤”、“卤化物”或“卤素”指F、Cl、Br或I原子。
术语“烷基”指取代或未取代的烷基,如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基,壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。该术语也包括直链烷基的支链异构体,包括但不限于(例如):-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3)-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)等。该术语也包括环烷基如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基,以及用上述直链和支链烷基取代的这些环。该术语也包括聚环烷基,例如但不限于:金刚烷基降冰片基和双环[2.2.2]辛基以及用上述直链和支链烷基取代的这些环。术语烷基也包括连接于碳或氢的一个或多个键被连接于非氢和非碳原子的键取代的基团,所述非氢和非碳原子例如但不限于卤化物中的卤素原子如F、Cl、Br和I;和诸如羟基、烷氧基、芳氧基和酯基等基团中的氧原子;诸如巯基、烷硫基和芳硫基、砜基、磺酰基和亚砜基团等基团中的硫原子;诸如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、亚酰胺和烯胺等基团中的氮原子;诸如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基等基团中的硅原子;和各种其它基团中的其它杂原子。烷基是限于含有1-20个碳原子和至多5个上述其它杂原子的基团。更优选的烷基含有1-5个碳原子和至多2个杂原子。
术语“芳基”指不含杂原子的取代和未取代的芳基。因此,该术语包括但不限于(例如)苯基、联苯基、蒽基、萘基。芳基也包括一个芳香碳与上述(烷基定义中)非碳或非氢原子键合的芳基,也包括芳基的一个或多个芳香碳与取代和/或未取代的如本文所述的烷基、烯基或炔基键合的芳基。这包括芳基的两个碳原子与烷基、烯基或炔基的两个原子键合的键合形式,以形成稠合环系统(如二氢萘基或四氢萘基)。因此,术语“芳基”包括但不限于:甲苯基和羟基苯基等。
术语“烯基”指如上述烷基所述的直链和支链和环状基团,不同之处在于至少存在一个两个碳原子之间的双键。例子包括但不限于:乙烯基、-CH=C(H)(CH3)、-CH=C(CH3)2、-C(CH3)=C(H)2、-C(CH3)=C(H)(CH3)、-C(CH2CH3)=CH2、环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、丁间二烯基、戊二烯基和己二烯基等。也包括非碳或非氢原子键合于与另一个碳形成双键的碳的基团和一个非碳或非氢原子键合于未与另一个碳形成双键的碳的基团。烯基是限于含有2-15个碳原子和至多4个上述其它杂原子的基团。更优选的烯基含有2-5个碳原子和至多2个杂原子。
术语“烷氧基”指具有式-O-烷基的取代或未取代的烷氧基,其中连接点是氧基,烷基的定义如上所述。烷氧基是限于含有1-20个碳原子和至多5个上述其它杂原子(包括该氧原子)的基团。更优选的烷氧基含有1-5个碳原子和至多2个杂原子,包括该氧原子。
术语“炔基”指如上述烷基所述的直链和支链基团,不同之处在于至少存在一个两个碳原子之间的三键。例子包括但不限于:-C≡C(H)、-C≡C(CH3)、-C≡C(CH2CH3)、-C(H2)C≡C(H)、-C(H)2C≡C(CH3)和-C(H)2C≡C(CH2CH3)等。也包括非碳或非氢原子键合于与另一个碳形成三键的碳的炔基和非碳或非氢原子键合于未与另一个碳形成三键的碳的炔基。炔基是限于含有2-15个碳原子和至多4个上述其它杂原子的基团。更优选的炔基含有2-5个碳原子和至多2个杂原子。
术语“杂环基”指芳族和非芳族环化合物,包括含有3个或多个环原子的单环、双环和多环化合物,例如但不限于奎宁环基,其中一个或多个环原子是杂原子,例如但不限于N、O和S。杂环基的例子包括但不限于:含有1-4个氮原子的3-8元不饱和环,例如但不限于:吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(如4H-1,2,4-三唑基、1H-1,2,3-三唑基、2H-1,2,3-三唑基等)、四唑基(如1H-四唑基、2H四唑基等);含有1-4个氮原子的3-8元饱和环,例如但不限于:吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基;含有1-4个氮原子的稠合不饱和杂环基团,例如但不限于:吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、中氮茚基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基;含有1-2个氧原子的3-8元不饱和环,例如但不限于呋喃基;含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的3-8元不饱和环,例如但不限于:噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(如1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基等);含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的3-8元饱和环,例如但不限于:吗啉基;含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环基团,例如,苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(如2H-1,4-苯并噁嗪基等);含有1-3个硫原子和1-3个氮原子的3-8元不饱和环,例如但不限于:噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(如1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等);含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的3-8元饱和环,例如但不限于噻唑烷基;含有1-2个硫原子的3-8元饱和和不饱和环,例如但不限于噻吩基、二氢二硫杂环己二烯基、二氢二硫酮基、四氢噻吩、四氢噻喃;含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环,例如但不限于:苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(如2H-1,4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(如2H-3,4-二氢苯并噻嗪基等),含有1-2个氧原子的不饱和稠合杂环,如苯并间二氧杂环戊烯基(如1,3-苯并间二氧杂环戊烯基等);含有氧原子和1-2个硫原子的3-8元不饱和环,例如但不限于二氢氧硫杂环己二烯基;含有1-2个氧原子和1-2个硫原子的3-8元饱和环,如1,4-氧硫杂环己烷;含有1-2个硫原子的不饱和稠合环,如苯并噻吩基、苯并二硫杂环己二烯基;以及含有氧原子和1-2个氧原子的不饱和稠合杂环如苯并氧硫杂环己二烯基。杂环基也包括环中一个或多个S原子与一个或两个氧原子形成双键的上述基团(亚砜和砜)。例如,杂环基包括四氢噻吩、四氢噻吩氧和四氢噻吩1,1-二氧。优选的杂环基含有5或6个环原子。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、硫代吗啉、硫代吗啉(硫代吗啉的S原子键合于一个或多个O原子)、吡咯、高哌嗪、噁唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、噁唑、奎宁环、噻唑、异噁唑、呋喃和四氢呋喃。“杂环基”也指环原子之一与非氢原子如上述取代烷基和取代芳基中的非氢原子键合的上述基团。例子包括但不限于:2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶基等。杂环基是限于含有2-15个碳原子和至多6个上述其它杂原子的基团。更优选的杂环基含有3-5个碳原子和至多2个杂原子。
术语“取代”应用于未限定、但本领域熟知的基团如苯基时,与烷基定义中所述的任选附加物含义相同。
在本发明内,应理解,本文所述化合物可能具有本发明互变异构现象,本说明书中的化学式可能仅代表一种可能的互变异构体形式。应理解,本发明包括具有抗血管新生活性的任何互变异构体形式,而不仅限于所附化学式中利用的任何一种互变异构体形式。
也应理解,本发明的某些化合物和实施方式可以溶剂合物以及非溶剂合物形式如水合形式存在。应理解,本发明包括具有抗血管新生活性的所有这种溶剂合物形式。本发明也包括与上述化合物结构相同、但一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常所用天然原子质量或质量数的原子取代的同位素标记的化合物。可掺入本发明化合物的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素,分别如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32p、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其它原子的同位素的本发明化合物、其前药以及所述化合物和所述前药的药学上可接受的盐落入本发明范围。某些同位素标记的本发明化合物,如掺入了放射性同位素如3H和14C的本发明化合物,可用于药物和/或底物组织分布试验。尤其优选氚即3H和碳14即14C同位素,因为它们易于制备和检测。而且,用较重同位素如氘即2H取代可产生某些治疗益处,因为它们的代谢稳定性更高,如体内半衰期增加或剂量需求降低,因此在某些情况下优选用较重同位素取代。通常可通过进行已知或参考的方法并用容易获得的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂来制备同位素标记的本发明化合物及其前药。
“IL-2”或“白介素-2”指由正常的外周血淋巴细胞产生并且以低浓度存在于体内的淋巴细胞。IL-2首先由Morgan等.(1976)Science193:1007-1008描述,起初称为T-细胞生长因子,因为它能诱导经刺激的T淋巴细胞增殖。它是报道分子量为13,000-17,000的蛋白质(Gillis和Watson(1980)J.Exp.Med.159:1709),它的等电点为6-8.5。出于本发明目的,术语“IL-2”旨在包括任何来源的IL-2,包括哺乳动物来源如小鼠、大鼠、兔、灵长动物、猪、口袋宠物和人,并且可以是天然蛋白或由重组技术获得的蛋白,如由微生物宿主产生的重组IL-2多肽。IL-2可以是天然多肽序列,或者可以是天然IL-2多肽的变体(如下所述),只要该变异IL-2多肽保持了本文所述的感兴趣的IL-2生物学活性。IL-2多肽或其变体优选衍生自人来源,包括重组产生的人IL-2例如由微生物宿主产生的重组人IL-2多肽以及保持了感兴趣的IL-2生物学活性的它的变体。含有IL-2作为治疗活性成分的任何药物组合物均可用于实施本发明。
抗癌剂:
本发明组合物可与其它抗癌剂联合给药。具体说,组合物可配制在一起形成联合治疗剂或分别给药。用于本发明的抗癌剂包括但不限于以下一种或多种物质:
A.激酶抑制剂
用作与本发明组合物联用的抗癌剂的激酶抑制剂包括表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂如小分子喹唑啉,如吉非替尼(gefitinib)(US5457105、US5616582和US5770599)、ZD-6474(WO01/32651)、埃罗替尼(erlotinib)(Tarceva_、US5,747,498和WO96/30347)和拉帕替尼(lapatinib)(US6,727,256和WO02/02552);血管内皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制剂,包括SU-11248(WO01/60814)、SU5416(US5,883,113和WO99/61422)、SU6668(US5,883,113和WO99/61422)、CHIR-258(US6,605,617和US6,774,237)、伐他拉尼(vatalanib)或PTK-787(US6,258,812)、VEGF-Trap(WO02/57423)、B43-染料木素(B43-Genistein)(WO-09606116)、芬维A胺(fenretinide)(视黄酸对羟基苯胺)(US4,323,581)、IM-862(WO02/62826)、贝伐单抗(bevacizumab)或Avastin_(WO94/10202)、KRN-951、3-[5-(甲磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、AG-13736和AG-13925、吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪、ZK-304709、Veglin_、VMDA-3601、EG-004、CEP-701(US5,621,100)、Cand5(WO04/09769);Erb2酪氨酸激酶抑制剂如帕妥珠单抗(pertuzumab)(WO01/00245)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和利妥昔单抗(rituximab);AKT蛋白激酶抑制剂如RX-0201;蛋白激酶C(PKC)抑制剂,如LY-317615(WO95/17182)和哌立福新(perifosine)(US2003171303);磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂,包括SF-1126和PI-103、PI-509、PI-516和PI-540(PIramed生产);Raf/Map/MEK/Ras激酶抑制剂,包括索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006)、ARQ-350RP、LErafAON、BMS-354825AMG-548和WO03/82272公开的其它物质;成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶抑制剂;细胞依赖性激酶(CDK)抑制剂,包括CYC-202或roscovitine(WO97/20842和WO99/02162);血小板衍生生长因子受体(PGFR)激酶抑制剂如CHIR-258、3G3mAb、AG-13736、SU-11248和SU6668;以及Bcr-Ab1激酶抑制剂和融合蛋白如STI-571或格列卫_(Gleevec_)。
B.抗雌激素药
与本发明组合物联合用于抗癌治疗的雌激素靶向药物包括选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene);芳香酶抑制剂,包括Arimidex_或阿那曲唑(anastrozole);雌激素受体下调剂(ERD),包括Faslodex_或氟维司群(fulvestrant)。
C.抗雄激素药
与本发明组合物联合用于抗癌治疗的雄激素靶向药物包括氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、非那雄胺(finasteride)、氨鲁米特(aminoglutethamide)、酮康唑和皮质类固醇。
D.其它抑制剂
作为抗癌剂与本发明组合物联合用药的其它抑制剂包括蛋白质法呢基转移酶抑制剂,包括替匹法来(tipifamib)或R-115777(US2003134846和WO97/21701)、BMS-214662、AZD-3409和FTI-277;拓扑异构酶抑制剂,包括硫巴妥苯胺(merbarone)和二氟替康(BN-80915);有丝分裂驱动蛋白(kinesin)纺锤体蛋白(KSP)抑制剂,包括SB-74392l和MKI-833;蛋白酶调节剂如硼替佐米(bortezomib)或Velcade_(US5,780,454)、XL-784;和环加氧酶2(COX-2)抑制剂,包括非固醇抗炎药I(NSAID)。
E.癌症化疗药
作为抗癌剂与本发明组合物联合用药的具体癌症化疗药包括阿那曲唑(Arimidex_)、比卡鲁胺(Casodex_)、硫酸博来霉素(Blenoxane_)、白消安(Myleran_)、白消安注射剂(Busulfex_)、卡培他滨(Xeloda_)、N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂(Paraplatin_)、卡莫司汀(BiCNU_)、苯丁酸氮芥(Leukeran_)、顺铂(Platinol_)、克拉屈滨(Leustatin_)、环磷酰胺(Cytoxan_或Neosar_)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷(Cytosar-U_)、阿糖胞苷脂质体注射剂(DepoCyt_)、达卡巴嗪(DTIC-Dome_)、放线菌素d(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸道诺霉素(Cerubidine_)、柠檬酸道诺霉素脂质体注射剂(DaunoXome_)、地塞米松、多西他赛(Taxotere_、US2004073044)、盐酸多柔比星(阿霉素_、Rubex_)、依托泊甙(Vepesid_)、磷酸氟达拉滨(Fludara_)、5-氟尿嘧啶(Adrucil_、Efudex_)、氟他胺(Eulexin_)、tezacitibine、吉西他滨(difluorodeoxycitidine)、羟基脲(Hydrea_)、黄胆素(Idamycin_)、异环磷酰胺(IFEX_)、伊立替康(Camptosar_)、L-天冬酰胺酶(ELSPAR_)、甲酰四氢叶酸钙、美法仑(Alkeran_)、6-巯基嘌呤(Purinethol_)、甲氨蝶呤(Folex_)、米托蒽醌(二羟基蒽醌_)、麦罗塔、紫杉醇(泰素_)、phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、具有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20(polifeprosan20with carmustine implant)(Gliadel_)、柠檬酸他莫昔芬(Nolvadex_)、替尼泊苷(Vumon_)、6-硫鸟嘌呤、硫替派、替拉扎明(Tirazone_)、注射用盐酸拓扑替康(Hycamptin_)、长春碱(Velban_)、长春新碱(Oncovin_)和长春瑞滨(诺维本_)。
F.烷化剂
与本发明组合物联合用于抗癌治疗的烷化剂包括VNP-40101M或氯乙肼脲、奥沙利铂(US4,169,846、WO03/24978和WO03/04505)、葡磷酰胺、马磷酰胺、凡毕复(US5,041,424)、泼尼莫司汀;曲奥舒凡;白消安;伊洛福芬(acylfulvene);本可麦定;吡唑并吖啶(PD-115934);O6-苄基鸟嘌呤;地西他滨(5-氮杂-2-脱氧胞苷);溴他利新;丝裂霉素C(MitoExtra);TLK-286(Telcyta_);替莫唑胺;曲贝替定(US5,478,932);AP-5280(顺铂的铂酸盐制剂);泊非霉素;和clearazide(meclorethamine)。
G.螯合剂
与本发明组合物联合用于抗癌治疗的螯合剂包括四硫钼酸酯(WO01/60814);RP-697;嵌合T84.66(cT84.66);钆膦维司(Vasovist_);去铁胺;和任选与电穿孔(EPT)联用的博来霉素。
H.生物应答修饰剂
与本发明组合物联合用于抗癌治疗的生物应答修饰剂如免疫调节剂包括星孢素和其大环类似物,包括UCN-01、CEP-701和米哚妥林(参见WO02/30941、WO97/07081、WO89/07105、US5,621,100、WO93/07153、WO01/04125、WO02/30941、WO93/08809、WO94/06799、WO00/27422、WO96/13506和WO88/07045);角鲨胺(WO01/79255);DA-9601(WO98/04541和US6,025,387);阿来组单抗;干扰素(如IFN-α、IFN-β等);白介素,具体是IL-2或阿地白介素以及IL-I、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12和具有超过70%天然人序列的氨基酸序列的它们的生物活性变体;六甲蜜胺(Hexalen_);SU101或来氟米特(WO04/06834和US6,331,555);咪唑并喹啉如瑞喹莫德和咪喹莫特(US4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612);和SMIP,包括吲哚、蒽醌、缩氨基硫脲和色胺酮(WO04/87153、WO04/64759和WO04/60308)。
I.癌症疫苗:
与本发明组合物联合用于抗癌治疗的抗癌疫苗包括Avicine_(Tetrahedron Letters26,19742269-70);oregovomab(OvaRex_);Theratope_(STn-KLH);黑色素瘤疫苗;GI-4000系列(GI-4014、GI-4015和GI-4016),它们针对Ras蛋白中的五种突变;GlioVax-1;MelaVax;Advexin_或INGN-201(WO95/12660);Sig/E7/LAMP-1,其编码HPV-16E7;MAGE-3疫苗或M3TK(WO94/05304);HER-2VAX;ACTIVE,其刺激肿瘤特异性T细胞;GM-CSF癌症疫苗;和基于单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的疫苗。
J.反义治疗:
与本发明组合物联用的抗癌剂也包括反义组合物,如AEG-35156(GEM-640);AP-12009和AP-11014(TGF-β2-特异性反义寡核苷酸);AVI-4126;AVI-4557;AVI-4472;oblimersen(Genasense_);JFS2;aprinocarsen(WO97/29780);GTI-2040(R2核糖核苷酸还原酶mRNA反义寡核苷酸)(WO98/05769);GTI-2501(WO98/05769);脂质体封装的c-Raf反义寡脱氧核苷酸(LErafAON)(WO98/43095);和Sirna-027(靶向VEGFR-1mRNA的基于RNAi的治疗剂)。
K.IL-2:
一种优选的IL-2化合物是由加州Emeryville的Chiron Corporation生产的“阿地白介素”或“Proleukin_”。这种制剂中的IL-2是重组产生的未糖基化的人IL-2突变蛋白,它与天然人IL-2氨基酸序列的不同之处在于消除了第一个丙氨酸残基,位置125上的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代(称为脱丙氨酰-1、丝氨酸-125人白介素-2)。可以在大肠杆菌(E.coli)中表达这种IL-2突变蛋白,然后用渗滤和阳离子交换层析纯化,如美国专利号4,931,543所述。
在体外将阿地白介素与天然(Jurkat)IL-2相比。没有观察到显著性差异,IV给药后阿地白介素和天然(Jurkat)IL-2在小鼠中对溶细胞性细胞诱导作用和血清半衰期相等;但阿地白介素所含IL-2形式有有益属性,因此提到“阿地白介素”仅包括该组合物,不包括IL-2蛋白的所有可能形式。
1983年,在开发Cetus淋巴细胞增殖生物试验时,没有可用的正式IL-2参照制剂。将此制剂的一个Cetus单位定义为在孵育24小时后诱导IL-2依赖性小鼠T细胞掺入其最高水平50%的含氚胸苷的1mL中的IL-2的量。含有IL-2的产物被赋予具体活性3x106 Cetus单位/mg。1988年,作为WHO在英国的生物标准实验室的National Institute ofBiological Standards and Controls(NIB SC)建立了IL-2国际标准。也在1988年,改变了Cetus淋巴细胞增殖生物试验的测定步骤。在新生物试验方法中根据IL-2国际标准校准了Cetus的内部标准。建立以下校正因子:
国际单位=Cetus单位x6
根据1mg阿地白介素的标称特定活性为18x106国际单位(18MIU),将阿地白介素量表示为质量单位。该方案引入了国际单位。
用于本发明方法的药物组合物可含有IL-2的生物活性变体。这种变体应该保持天然多肽的所需生物学活性,以使含有该变异多肽的药物组合物与含有天然多肽的药物组合物给予对象时疗效相同。就是说,该变异多肽将以类似于对天然多肽所观察到的方式用作该药物组合物的治疗活性组分。本领域已知确定变异多肽是否保持所需生物学活性、从而用作该药物组合物的治疗活性组分的方法。可用特别为测定天然多肽或蛋白的活性设计的试验,包括本发明所述试验测定生物学活性。此外,可测试用生物活性天然多肽产生的抗体结合该变异多肽的能力,其中有效结合说明该多肽的构象类似于天然多肽。
出于本发明目的,感兴趣的IL-2生物学活性是IL-2激活和/或扩展天然杀伤(NK)细胞以介导淋巴因子活化的杀伤(LAK)活性和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力。因此,用于本发明方法的IL-2变体(例如人IL-2的突变蛋白)将激活和/或扩展NK细胞以介导LAK活性和ADCC。本领域熟知确定IL-2激活或扩展NK细胞和介导LAC或ADCC活性的试验。
天然或天然产生的IL-2的合适的生物活性变体可以是该多肽的片段、类似物和衍生物。“片段”指仅由完整多肽序列和结构的一部分组成的多肽,可以是C末端缺失或N末端缺失的天然多肽。“类似物”指天然多肽或天然多肽的片段的类似物,其中该类似物含有具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的天然多肽序列和结构。术语类似物也包括本文所述“突变蛋白”和含有一种或多种类肽(肽模拟物)的肽(参见国际公开号WO91/04282)。“衍生物”指经过任何合适修饰的感兴趣天然多肽、天然多肽的片段或其各自的类似物,合适修饰如糖基化、磷酸化、聚合物偶联(如与聚乙二醇偶联)或添加其它外来部分,只要保持天然多肽的所需生物学活性。本领域通常知道制备多肽片段、类似物和衍生物的方法。
例如,可通过在编码感兴趣天然多肽的克隆DNA序列中进行突变制备多肽的氨基酸序列变体。诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域熟知的。参见例如,Walker和Gaastra编,(1983)《分子生物学技术》(Techniques in Molecular Biology)(MacMillanPublishing Company,纽约);Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492;Kunkel等。(1987)Methods Enzymol.154:367-382;Sambrook等(1989)《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Plainview,纽约);美国专利号4,873,192;和其中引用的参考文献;将其纳入本文作参考。不影响感兴趣多肽的生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见Dayhoff等(1978),Atlas ofProtein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,华盛顿特区)的模型,纳入本文作参考。可优选保守取代如用特性相似的一个氨基酸交换另一个氨基酸。保守取代的例子包括但不限于:Gly:Ala、VaI:ILe:Leu、Asp:Glu、Lys:Arg、Asn:Gln和Phe:Trp:Tyr。在构建感兴趣IL-2多肽的变体的过程中,进行修饰时应使变体继续具有所需活性。在编码变异多肽的DNA中进行的任何突变不得将该序列置于阅读框之外,优选不产生可产生二级mRNA结构的互补区。IL-2的生物活性变体与用作比较基础的参比多肽分子的氨基酸序列相同性通常为至少70%,优选至少80%,更优选约90%-95%或更高,最优选约98%或更高。因此,当IL-2参比分子是人IL-2时,其生物活性变体与人IL-2的氨基酸序列的序列相同性为至少70%,优选至少80%,更优选约90%-95%或更高,最优选约98%或更高。与感兴趣天然多肽相比,该天然多肽的生物活性变体具有的不同氨基酸残基少至1-15个氨基酸,少至1-10个如6-10个,少至5个,少至4、3、2或1个氨基酸残基。“序列相同性”指比对变体的氨基酸序列的特定连续节段与参比分子的氨基酸序列对齐排列并作比较时,在变异多肽和用作参比的多肽分子中发现的相同的氨基酸残基。两个氨基酸序列之间的序列相同性百分数的计算方法如下:确定两个序列中氨基酸残基相同的位置的数量以产生匹配位置数,将匹配位置数除以与参比分子进行比较的节段的总位置数,将该结果乘以100得到序列相同性百分数。
因此,可用数学算法测定任意两个序列之间的相同性百分数。优选地,天然或非天然产生的IL-2变体的氨基酸序列与参比分子如天然人IL-2或参比IL-2分子的较短部分的氨基酸序列至少70%,优选80%,更优选85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%相同。更优选地,这些分子96%、97%、98%或99%相同。采用使用仿射缺口检索的Smith-Waterman同源检索算法测定序列相同性百分数,其中缺口开放罚分12,缺口延伸罚分2,BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源检索算法参见Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.(1981)2:482-489。变体的差异可以是(例如)少至1-10个氨基酸残基如6-10个,少至5个,少至4、3、2或1个氨基酸残基。
就两个氨基酸序列的最优比对而言,变异氨基酸序列的连续节段相对于参比氨基酸序列可以具有加入的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。用于与参比氨基酸序列作比较的连续节段包括至少二十(20)个连续氨基酸残基,可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可校正与保守性残基取代或缺口相关的序列相同性(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。
具有IL-2活性的多肽的准确化学结构取决于许多因素。由于该分子中存在可离子化的氨基和羧基,所以可以获得酸盐或碱盐、或中性形式的具体多肽。本文所用具有IL-2活性的多肽的定义包括放入合适环境条件中时保持其生物学活性的所有这些制剂。
而且,通过用糖部分衍生(糖基化)或其它补充分子如脂质、磷酸、乙酰基等衍生化可增加该多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联增加。这种增加的某些方面是通过生产宿主的翻译后加工系统完成的;可在体外引入其它这种修饰。在任何情况下,本文所用IL-2多肽的定义都包括这种修饰,只要没有破坏该多肽的IL-2活性。预计在不同试验中这种修饰可能定量或定性地影响活性,即提高或降低该多肽的活性。而且,可通过氧化、还原或其它衍生化方法修饰链中的单个氨基酸残基,可切割该多肽以获得保持活性的片段。
不破坏活性的这种改变不会使该多肽序列被本文所用的感兴趣IL-2多肽的定义排除。
本领域提供了大量关于制备和使用多肽变体的指南。在制备IL-2变体的过程中,本领域技术人员不难确定对天然蛋白的核苷酸或氨基酸序列进行何种修饰将产生适合用作本发明方法所用的药物组合物中的治疗活性组分的变体。
用于本发明方法的IL-2或其变体可来自任何来源,但优选为重组IL-2。“重组IL-2”指与天然序列的IL-2生物学活性相当并通过重组DNA技术制备的白介素-2或者突变的IL-2(如Wang等(1984)Science224:1431-1433所述),所述重组DNA技术如Taniguchi等(1983)Nature302:305-310和Devos(1983)Nucleic Acids Research11:4307-4323所述。通常,克隆IL-2的编码基因,然后在转化生物体、优选微生物、最优选大肠杆菌中表达,如本文所述。宿主生物在表达条件下表达该外来基因,以产生IL-2。也可在真核细胞,如酵母或人细胞中制备合成的重组IL-2。培养、收获、裂解或提取细胞中的IL-2的方法主要如美国专利4,604,377;4,738,927;4,656,132;4,569,790;4,748,234;4,530,787;4,572,798;4,748,234;和4,931,543所述。
变异IL-2蛋白的例子参见欧洲专利(EP)公开号EP136,489(其公开了天然产生IL-2的氨基酸序列中发生的一个或多个以下改变:Asn26至Gln26;Trp121至Phe121;Cys58至Ser58或Ala58、Cys105至Ser105或Ala105;Cys125至Ser125或Ala125;缺失Arg120之后的所有残基;和其Met-1形式);以及1983年10月13日提交的欧洲专利申请号83306221.9所述的重组IL-2突变蛋白(1984年5月30日公开,公开号为EP109,748),其等效于比利时专利号893,016和共有的美国专利号4,518,584(它公开了位置125(按照天然人IL-2编号)上的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸取代的重组人IL-2突变蛋白;丙氨酰-ser125-IL-2;和脱丙氨酰-ser125-IL-2)。也参见美国专利号4,752,585(它公开了以下变异IL-2蛋白:ala104ser125IL-2、ala104IL-2、ala104ala125IL-2、val104ser125IL-2、val104IL-2、val104ala125IL-2、des-alal ala104ser125IL-2、des-alal ala104IL-2、10des-alal ala104ala125IL-2、des-alal val104ser125IL-2、des-alal val104IL-2、des-alalval104ala125IL-2、des-alal des-pro2ala104ser125IL-2、des-alal des-pro2ala104IL-2、des-alal des-pro2ala104aia125IL-2、des-alal des-pro2val104ser125IL-2、des-alal despro2val104IL-2、des-ala l des-pro2val104ala125IL-2、des-ala l des-pro2des-thr3ala104ser125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3ala104IL-2、des-alal des-pro2des-thr3ala10415ala125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3val104ser125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3val104IL-2、des-ala l des-pro2des-thr3val104ala125IL-2、des-ala l des-pro2des-thr3des ser4ala104ser125IL-2、des-ala l des-pro2des-thr3des-ser4ala104IL-2、des-ala1des-pro2des-thr3des-ser4ala104ala125IL-2、des-ala l des-pro2des-thr3des-ser4val104ser125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4val104IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4val10420ala125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5ala104ser125IL-2、des-alal des pro2des-rhr3des-ser4des-ser5ala104IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5ala104ala125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5val104ser125IL-2、des alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5val104IL-2、des-ala1des-lpro2des-thr3des-ser4des-ser5val104ala125IL-2、des-ala l des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6ala10425ala125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6ala104IL-2、des-alal des pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6ala104ser125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des ser4des-ser5des-ser6val104ser125IL-2、des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des ser6val104IL-2和des-alaldes-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6val104ala125IL-2)和美国专利号4,931,543(它公开了用于本文所述实施例的IL-2突变蛋白脱丙氨酰-1、丝氨酸30125人IL-2,以及其它IL-2突变蛋白)。
也参见欧洲专利公开号EP200,280(1986年12月10日公开),其公开了位置104上的甲硫氨酸被保守性氨基酸取代的重组IL-2突变蛋白。
例子包括以下突变蛋白:ser4des-ser5ala104IL-2;des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5ala104ala125IL-2;des-ala l des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5glu104ser125IL-2;des-alal des-pro2des-thr3des ser4des-ser5glu104IL-2;des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5glu104ala125IL-2;des-ala l des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6ala104ala125IL-2;des-ala1des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6ala104IL-2;des-ala l des-pro2des-thr3des-ser4des-ser55des-ser6ala104ser125IL-2;des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6glu104ser125IL-2;des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6glu104IL-2;和des-alal des-pro2des-thr3des-ser4des-ser5des-ser6glu104ala125IL-2。也参见欧洲专利公开号EP118,617和美国专利号5,700,913,它们公开了用丙氨酸代替天然IL-2的甲硫氨酸作为N-末端氨基酸的未糖基化的人IL-2变体;缺失了第一个甲硫氨酸使得脯氨酸成为N末端氨基酸的未糖基化的人IL-2;和丙氨酸插入N-末端甲硫氨酸和脯氨酸之间的未糖基化的人IL-2。
其它IL-2突变蛋白包括WO99/60128所述的突变蛋白(用组氨酸或异亮氨酸取代位置20上的天冬氨酸,用精氨酸、甘氨酸或异亮氨酸取代位置88上的天冬酰胺,或者用亮氨酸或谷氨酸取代位置126上的谷氨酰胺),据报道,这些突变蛋白对表达T细胞受体的细胞表达的高亲和IL-2受体有选择性活性(优先于NK细胞),且IL-2毒性降低;美国专利5,229,109公开的突变蛋白(用丙氨酸取代位置38上的精氨酸,或者用赖氨酸取代位置42上的苯丙氨酸),与天然IL-2相比,它对高亲和IL-2受体的结合力降低,但仍然能够刺激LAK细胞;国际公开号WO00/58456公开的突变蛋白(改变或缺失了天然IL-2中天然产生的(x)D(y)序列,其中D是天冬氨酸,(x)是亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸或缬氨酸,(y)是缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸),声称能减轻血管泄漏综合征;国际公开号WO00/04048公开的IL-2pl-30肽(对应于IL-2的前30个氨基酸,其含有IL-2的整个α-螺旋A,并与IL-2受体的β链相互作用),据报道,它能刺激NK细胞并诱导LAK细胞;和WO00/04048公开的IL-2pi-30肽的突变形式(用赖氨酸取代位置20上的天冬氨酸),据报道,它不能诱导血管出血,但仍然能够产生LAK细胞。此外,可用聚乙二醇修饰IL-2,以提高溶解度和改变药代动力学概况(参见美国专利号4,766,106)。
本文所用术语IL-2也包括IL-2融合于第二种蛋白质或共价偶联于聚脯氨酸或水溶性聚合物以减少给药频率或提高IL-2耐受性的IL-2融合物或偶联物。例如,可用本领域已知方法将IL-2(或本文所述的它的变体)融合于人白蛋白或白蛋白片段(参见WO01/79258)。或者,采用本领域已知方法(参见例如美国专利4,766,106、5,206,344,和4,894,226)可将IL-2共价偶联于聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙烯化多元醇,其中该均聚物未取代或用烷基在一端取代,该多元醇未取代。含有IL-2作为治疗活性成分的任何药物组合物均可用于本发明方法。本领域已知这种药物组合物,包括但不限于:美国专利4,745,180;4,766,106;4,816,440;4,894,226;4,931,544和5,078,997所述的药物组合物。因此,本领域已知的含有IL-2或其变体的液体、冻干或喷雾干燥组合物可制备成水性或非水性的溶液或悬液,随后按照本发明方法给予对象。这些组合物各自含有IL-2或其变体作为治疗或预防活性成分。“治疗或预防活性成分”指将所述IL-2或其变体特别掺入该组合物,以在该药物组合物给予对象时对于该对象的疾病或病症产生治疗、预防或诊断等所需的治疗或预防反应。优选地,该药物组合物含有合适的稳定剂、填充剂或稳定剂和填充剂以最大程度减少在制备和储存过程中损失蛋白质稳定性和生物学活性带来的问题。在本发明优选实施方式中,用于本发明方法的含有IL-2的药物组合物是含有稳定的单体IL-2或其变体的组合物、含有多聚IL-2或其变体的组合物以及含有稳定的冻干或喷雾干燥IL-2或其变体的组合物。
题为“含有稳定的液体多肽的药物组合物”的国际公开WO01/24814公开了含有稳定的单体IL-2或其变体的药物组合物。“单体”IL-2指在本文所述的药物组合物中该蛋白分子主要以单体形式、而非聚集形式存在。因此,不存在共价或疏水的IL-2低聚物或聚集体。简要说,这些液体组合物中的IL-2是与足以减少储存期间的IL-2聚集体形成的氨基酸基料量配制的。氨基酸基料是氨基酸或氨基酸组合,其中任何给定氨基酸以其游离碱形式或盐形式存在。优选的氨基酸选自:精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。这些组合物还含有缓冲剂,以将该液体组合物的pH维持在IL-2稳定性可接受的范围内,其中该缓冲剂是基本不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸和其盐形式的混合物。优选地,所述酸选自琥珀酸、柠檬酸、磷酸和谷氨酸。
在本文中将这种组合物称为稳定的单体IL-2药物组合物。这些组合物中的氨基酸基料用于稳定IL-2,使其不在液体药物组合物的储存期间形成聚集体,而将基本不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸和其盐形式的混合物用作缓冲剂产生其渗透压接近等渗的液体组合物。该液体药物组合物还可掺入其它的稳定剂,更具体是甲硫氨酸、非离子表面活性剂如聚山梨醇酯80和EDTA,以进一步提高该多肽的稳定性。据称,这种液体药物组合物是稳定的,因为加入氨基酸基料以及基本不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸和其盐形式的混合物导致相对于在没有这两种组分组合的情况下配制的液体药物组合物,这种组合物的储存稳定性升高。含有稳定的单体IL-2的这些液体药物组合物可以水性液体形式使用,或以冷冻状态储存待用,或以干燥形式储存,以备按照本发明方法给予对象时重建成合适的液体形式或其它形式。“干燥形式”指通过冷冻干燥(即冻干;参见例如,Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38:4859)、喷雾干燥(参见Masters(1991),《喷雾干燥手册》(Spray-DryingHandbook)(Sth编;Longman Scientific and Technical,Essez,英国),第491-676页;Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18:1169-1206;和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11:12-20)或空气干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology25:459-470;和Roser(1991)Biopharm.4:47-53)使液体药物组合物或制剂干燥。
含有非聚集单体状态的IL-2的IL-2制剂的其它例子包括Whittington和Faulds(1993)Drugs46(3):446-514所述制剂。这些制剂包括重组IL-2产物,其中重组IL-2突变蛋白Teceleukin(在氨基末端加入甲硫氨酸残基的未糖基化的人IL-2)与0.25%用等渗盐水重建的冻干粉末形式的人血清白蛋白配制在一起,和配制重组IL-2突变蛋白Bioleukin(在氨基末端加入甲硫氨酸残基、用丙氨酸取代人IL-2的位置125上的半胱氨酸残基的人IL-2)使得0.1-1.0mg/ml IL-2突变蛋白与酸混合,其中该制剂的pH为3.0-4.0,宜不含缓冲液,电导率小于1000mmhos/cm(宜小于1500mmhos/cm)。参见EP373,679;Xhang等(1996)Pharmaceut.Res.13(4):643-644和Prestrelski等(1995)Pharmaceut.Res.12(9):1250-1258。
共有美国专利4,604,377中公开了含有多聚IL-2的药物组合物的例子。“多聚”指蛋白质分子以微聚集形式存在于药物组合物中,平均分子结合度为10-50个分子。这些多聚体为松散结合的、物理结合的IL-2分子。可以商品名Proleukin_IL-2(ChironCorporation,Emeryville,加州)购得这些组合物的冻干形式。此处公开的冻干制剂含有选择性氧化的微生物产生的重组IL-2,其中重组IL-2与提供填充料的水溶性载体如甘露醇和能保证重组IL-2在水中溶解性的足量十二烷基硫酸钠混合。
这些组合物适用于重建成用于胃肠道外给药的水性注射剂,它们稳定且在人患者中耐受良好。重建时,IL-2保持了多聚状态。本发明方法包括这种含有多聚IL-2的冻干或液体组合物。在本文中将这种组合物称为多聚IL-2药物组合物。
本发明方法也可采用含有IL-2的稳定的冻干或喷雾干燥药物组合物,它可重建成适合按照本发明方法给药的液体或其它适当形式。题为“Methods for PulmonaryDelivery of Interleukin-2”(经肺递送白介素-2的方法)的国际公开号WO01/49274公开了这种药物组合物。这些组合物还可含有至少一种填充剂、至少一种其量足以在干燥过程中稳定蛋白质的物质或二者皆含。“稳定”指冻干或喷雾干燥获得该组合物的固体或干燥粉末形式后,IL-2蛋白或其变体保持了其单体或多聚体形式以及质量、纯度和效力的其它关键特性。在这些组合物中,用作填充剂的优选载体材料包括甘氨酸、甘露醇、丙氨酸、缬氨酸或其任意组合,最优选甘氨酸。在制剂中所述填充剂的含量范围是0%-约10%(w/v),取决于所用填充剂。用作稳定剂的优选载体材料包括任何糖和糖醇,或任何氨基酸。优选糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖或其任意组合,优选蔗糖。所述稳定剂是糖时,其含量范围约为0-9.0%(w/v),优选约0.5-5.0%,更优选约1.0-3.0%,最优选约1.0%。所述稳定剂是氨基酸时,其含量范围约为0-1.0%(w/v),优选约0.3-0.7%,最优选约0.5%。这些稳定的冻干或喷雾干燥的组合物可任选地含有甲硫氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐之一如EDTA二钠或其它螯合剂,它能保护IL-2或其变体免受甲硫氨酸氧化。美国申请序列号09/677,643中描述了以这种方式使用这些物质,纳入本文作参考。可用缓冲剂配制稳定的冻干或喷雾干燥组合物,在液相中时,如配制过程中或干燥形式的组合物重建后,所述缓冲剂能将药物组合物的pH维持在可接受的范围内,优选约pH4.0-pH8.5。选择缓冲液,以使它们与干燥过程相容,并且在加工期间和储存期间不影响该蛋白的质量、纯度、效力和稳定性。
上述稳定的单体、多聚体和稳定的冻干或喷雾干燥IL-2药物组合物代表了适用于本发明方法的组合物。然而,本发明方法包括含有IL-2化合物作为治疗活性成分的任何药物组合物。
本发明也提供了含有本发明组合物的至少一种组合并附有使用说明书的药盒或包装。例如,在各药物本身作为单个或单独剂型给药的情况下,该药盒包括各个药物,以及使用说明书。可以适合给药的任何方式包装药物组分,只要该包装与给药说明书一起考虑时能明确表明各药物组分给药的方式。或者,可将该组合的各个药物组分组合在一种给药剂型如单一组合物中。
例如,对于含有rIL-2和抗血管新生剂的说明性药盒,可通过任何合适的时间周期如按天来编制该药盒。例如,对于第1天,代表性药盒可含有单位剂量的rIL-2和单位剂量的抗血管新生剂。如果每种药物每天给予两次,那么该药盒可含有(对应于第1天)各自两排rIL-2和抗血管新生剂的单位剂量形式,附有给药时间说明书。或者,如果一种或多种药物与该组合其它药物成员的给药时机和给药量不同,那么应该在包装和说明书中有所反应。例如,如果rIL-2每天给予两次,抗血管新生剂每天仅给予一次,第1天的示范性包装可以是:rIL-2的单位剂量形式对应为“第1天,剂量1”,抗血管新生剂的剂量形式对应于“第1天,剂量2”。
如上所述,不难想像本发明的各种实施方式,当然这些实施方式取决于用于治疗的药物的特定组合、它们的相应剂型、推荐剂量、适应的患者群等。包装可以是通常用于药物包装的任何形式,并可利用多种特征如不同颜色、包装材料、抗干扰包装、起泡包装、干燥剂等。
实施例
下面是实施本发明的特定实施方式的实施例。提供这些实施例仅为说明性目的,不旨在以任何方式限制本发明范围。
我们努力保证所用数字(如量、温度等)的准确性,但当然应该允许一些实验误差和偏差。
实施例1
与rIL-2共同给药的组合物
A.化合物
表1:喹唑啉实施例
表2:二氢吲哚酮化合物
表3:其它化合物
表4:大环化合物
表5:异二氢吲哚化合物
B.合成
喹唑啉
案1:
方案1描述了合成多种取代的喹唑啉化合物的模块化方法。AG指活化基团如卤素、三氟甲磺酸酯或酮,其中可存在至多4个AG基团。由于第三步所示的4-氯位置的活性高于苄基环上的位置5-8,NHRR′的取代不大可能同时取代位置5-8中任一位置的AG。随后,最后一个步骤中用R″取代AG基团可以在弱-中等强度的碱的存在下进行。或者,可修饰AG基团以产生所需产物,如可用Fe和AcOH的EtOH和H2O溶液还原NO2基团产生氨基取代基,它可被进一步取代,例如通过多聚甲醛的还原性胺化取代。
本领域技术人员应明白,可购得或不难用已知方法合成多种官能化的2-氨基苯甲酰胺原料。随后,原料中的AG基团可以是最终产物中需要的取代基(如R″),如烷氧基或取代烷基。而且,可获得许多官能化的2-硝基苯甲酰胺原料,它们不难在还原剂如H2/Pd/C的EtOH溶液存在下转化为2-氨基苯甲酰胺原料。
制备本发明喹唑啉的其它方法参见WO04/24703、WO01/32651、US5,457,105、US5,616,582、US5,770,599、WO02/16351、US6,727,256、WO02/02552、US5,747,498和WO96/30347。
二氢吲哚酮
方案2a:
以单罐方法的形式进行方案2a,步骤a中的试剂是NH4OH、CuCl的H2O溶液。然后在步骤b中加入盐酸水溶液。R2-R5的定义如本文所述。
方案2b:
在方案2b中,在哌啶的存在下在EtOH中搅拌试剂(a),以提供终产物。如本领域技术人员所知,可加热该反应,以提高产率,这取决于具体原料的反应性。
方案2c:
在方案2c中,在NaOBu-t的存在下在EtOH中回流试剂(a),以提供终产物。方案2所示的R9是如本文所述的H、-OH、-CN、烷基、芳基、杂环基、烷氧基或-NRaRb。考虑到上述结构可取代式II以便在R9上取代,所以所有其它取代基的定义如本文所述。
方案2d(合成化合物6):
酞嗪
如化合物10中所述的取代酞嗪的制备如下所述,参见US6,258,812,其也包括可能有助于合成本发明化合物的其它反应方案。
方案3a:二盐酸1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪
将15.22g(59.52mmol)1-氯-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪(其制备参见1959年7月23日公开的德国专利(Auslegeschriftno)1061788])、7.73g(60.59mmol)4-氯苯胺和200ml1-丁醇的混合物加热回流2小时。然后滤出混合物缓慢冷却至5℃时获得的结晶。用1-丁醇和醚洗涤。将滤渣溶解于约200ml热甲醇中,用0.75g活性碳处理该溶液,并通过Hyfio Super Cel过滤,用7ml3N甲醇HCl将滤出液的pH调整到约2.5。将滤出液蒸发至约为原始体积的一半,加入醚直到出现轻微混浊;然后冷却导致结晶沉淀。滤出结晶,用甲醇/醚(1∶2)的混合物以及醚洗涤,在HV下110℃干燥8小时,在20℃和常压下平衡72小时。依此方式,获得水含量为8.6%的标题化合物;m.p.>270℃;1H NMR(DMSO-d6)11.05-12.20(br),9.18-9.23(m,IH),8.88(d,2H),8.35-8.40(m,1H),8.18-8.29(m,2H),8.02(d,2H),7.73(d,2H),7.61(d,2H),5.02(s,2H);ESI-MS:(M+H)+=347。
方案3b:盐酸1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪
将0.972g(3.8mmol)1-氯-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪、0.656g(4mmol)盐酸4-氯苯胺(Research Organics,Inc.,美国俄亥俄州克利夫兰)和20ml乙醇的混合物加热回流2小时。在冰浴中冷却该反应混合物,过滤,用少量乙醇和醚洗涤结晶。HV下110℃干燥8小时和150℃干燥10小时后,由于加热去除HCl而获得标题化合物;m.p.>270℃;1H NMR(DMSO-d6)9.80-11.40(br),8.89-8.94(m,1H),8.67(d,2H),8.25-8.30(m,IH),8.06-8.17(m,2H),7.87(d,2H),7.69(d,2H),7.49(d,2H),4.81(s,2H);ESI-MS:(M+H)+=347。
方案3c:盐酸1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪
将1.28g(5mmol)1-氯-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪、0.67g(5.25mmol)4-氯苯胺和15ml1-丁醇的混合物在100℃加热0.5小时,同时在氮气下搅拌。然后将该混合物冷却至室温,过滤,用1-丁醇和醚洗涤滤出液。为了纯化,将该结晶溶解于40ml热甲醇中,用活性碳处理该溶液,通过Hyfio Super Cel过滤,将滤出液蒸发至约为原始体积的一半,形成结晶沉淀。冷却至0℃后,过滤,用醚洗涤滤渣,在130℃、HV下干燥8小时,获得标题化合物;m.p.>270℃;1H NMR(DMSO-d6)9.80-11.40(br),8.89-8.94(m,1H),8.67(d,2H),8.25-8.30(m,1H),8.06-8.17(m,2H),7.87(d,2H),7.69(d,2H),7.49(d,2H),4.81(s,2H);ESI-MS:(M+H)+=347。
实施例2
rIL-2的制备
阿地白介素、rIL-2(NSC3773364)(Proleukin_,Chiron)的制备:将人Jurkat细胞系的信使RNA用于产生双链cDNA,将其杂交到pBR322质粒中。用对应于短IL-2基本序列的32p-标记的寡核苷酸探针鉴定含有IL-2基因的克隆。将该基因插入具有方便的限制性位点的pBR322质粒的一段区域中。将合适的启动子和核糖体结合位点插入IL-2基因之前,得到的表达克隆编码修饰的重组rIL-2。通过克隆IL-2的体外诱变用丝氨酸保守取代位置125上的半胱氨酸。得到的分子在体外生物学活性上与天然IL-2无区别。在发酵罐中培养携带阿地白介素基因的大肠杆菌生产菌株。收获培养物,提取阿地白介素。进行一系列层析步骤以纯化阿地白介素。将配方产品的pH调整到7.2-7.8。Proleukin_的分子量约为15,600道尔顿。通过氨基酸组成和N末端测序分析确认,该阿地白介素具有预计的蛋白序列。
重建和稀释方法:
Proleukin_是以冻干饼的形式存放在含有1.3mg蛋白质的5cc小瓶中。用1.2mL注射用无菌水(USP)重建Proleukin_用于注射。顺瓶侧导入稀释剂以避免产生过多泡沫,温和涡旋内容物直到完全溶解,但应避免振荡。重建后,每mL含有1.1mg(1千8百万IU)Proleukin_。重建的Proleukin_适合直接静脉内注射,或者可根据需要用含有0.1%人白蛋白(USP)的5%右旋糖注射液(USP)稀释到50mL-500mL。稀释时,在加入重建的Proleukin_之前将人白蛋白(USP)加入5%右旋糖注射液中。
实施例3
单用rIL-2组合物的治疗与用rIL-2组合物和抗血管新生剂联合治疗的对比表6小结了高剂量rIL-2的结果。
表6:单一药物rIL-2推注方案的临床试验1
作者 | 方案rIL-2 | 剂量范围(MIU) | 患者数 | CR | PR | 反应持续时间中值/存活率中值(mos) |
Atkins等(7) | Q8小时第1-5天 | 24/m2 | 71 | 4 | 8 | 16+/15.5 |
Fyfe等(8) | Q8小时第1-5天 | 0.6-0.72/kg | 255 | 12 | 24 | 20.3/16.3 |
Yang等(9) | Q8小时第1-5天 | 0.72/kg | 65 | 2 | 11 | NS |
Rosenberg等(10) | Q8小时第1-5天Q8小时第1-5天 | 0.072/kg0.72/kg | 60149 | 410 | 520 | NS15/20 |
Rosenberg等(11) | Q8小时第1-5天 | 0.72/kg | 48 | 4 | 6 | NS |
Taneja等(12) | Q8小时第1-5天 | 0.6-0.72/kg | 28 | 1 | 4 | NS |
Bukowski等(13) | 每周3次 | 60/m2 | 41 | 1 | 5 | 5/10.8 |
Abrams等[Abrams,1990#30] | Q8小时第1-5天 | 0.06/kg | 16 | 0 | 0 | NS |
总计(%) | 733 | 38(5.2) | 83(11.3 |
rIL-2:重组白介素-2;MIU:百万国际单位;CR:完全反应;PR:部分反应;q:每;NS:未说明完全反应+部分反应=16.5%(95%置信区间,13.8%-19.2%)1由Bukowski(39)部分调整而来
许多因素都促进了与抗血管新生组合物联合治疗。与高剂量rIL-2有关的高发病率需要仔细进行患者选择,这显著降低了可能从治疗中获益的患者的数量。不幸的是,在RCC发生率最高的患者中发现伴发性疾病的频率最高。对仔细进行患者监测和偶尔进行重症监护的要求使得单独给予高剂量rIL-2的成本很高,并且限制了它在大型医疗中心中的应用。其实际效果使其实用性仅限于一小部分患者。
严格评价了更低剂量rIL-2,如表7所示。
表7:单用rIL-2的II期临床试验:皮下方案1
作者 | 方案rIL-2 | 剂量范围a(MIU) | 患者数 | CR | PR | 反应持续时间中值/存活率中值(mos) |
Schomburg等Lissoni等 | 5天/周×8周第1天和第2天5天/周×6周 | 4.8-14.4/m2/天18.0/m2/天3.6/m2/天 | 1514 | 00 | 04 | NS9+NS |
Lissoni等 | 第1天和第2天5天/周×6周 | 18.0/m2/天6.0/m2/天 | 50 | 1 | 13 | 13+/14+ |
Lopez Hanninen等Buter等 | 5天/周,第1-6周第1-5天第8-12天等 | 18.0/m2/天18.0/m2/天9.0/m2/天 | 1647 | 02 | 17 | NS11.0/12.0 |
Casamassima等 | 第1天和第2天第8-12天等 | 18.0/m2/天3.6/m2/天 | 11 | 0 | 2 | NS |
deLena等 | 第1天和第2天第8-12天等 | 18.0/m2/天3.6/m2/天 | 10 | 0 | 1 | NS |
Whitehead等 | 每两周增加剂量 | 3.0-30.0/m2/天 | 15 | 0 | 0 | NS |
Marumo等 | i.v.(2小时,第1-28天)然后每天 | 1.0/m2/天1.0/m2/天 | 12 | 3 | 0 | 31/NS |
总计(%) | 190 | 6(3.2) | 28(14.7) |
rIL-2:重组人白介素-2;MIU:百万国际单位;CR:完全反应;PR:部分反应;NS:未说明;i.v.:静脉内完全反应+部分反应=18.6%(95%置信区间,15.8-21.5%)
a总剂量
b单位类型未说明
1由Bukowski(39)部分调整而来
Buter等公开了最常用的皮下方案。在Buter的方案中,rIL-2每天给药一次,每周5天,给药6周。在第一个5天周期中,每天给予一次18x106IU(MIU);在接下来的周期中,头两天后将剂量降低到9MIU。反应率和存活率数据可能与高剂量IV推注给予rIL-2所公开的相似。最近,在前瞻性随机试验中将Buter/Sleijfer方案与高剂量rIL-2作比较。随机将96名患者分到高剂量IV rIL-2组,将92名患者分到SQ rIL-2组(Buter/Sleijfer剂量方案)。先前,对高剂量rIL-2的反应率是20%,对SQ rIL-2的反应率是10%。然而,总体存活率并未与高剂量组不同(p=0.34)。同样,存在针对与抗血管新生组合物联合的催化剂,以提高效力和患者对较低剂量方案的总体反应性。
严格评价了阿地白介素与抗血管新生剂联用方案,如表8所示。
表8:治疗、剂量和持续时间
剂量水平 | 在第-7、1、15、29和42天给予抗血管新生剂(mg/kg) | 阿地白介素(IU/kg/d;SC)第1周(d1-5) | 阿地白介素(IU/kg/d;SC)第2-6周(d1-5) |
-I | 5 | 125,000 | 65,000 |
I | 5 | 250,000 | 125,000 |
II | 10 | 250,000 | 125,000 |
■在第-7天给予一个剂量的抗血管新生剂(等于对应于剂量水平的计划剂量)。
■在第1天再次给予抗血管新生剂,然后在为期8周的连续治疗周期中每2周给药一次。
继续用rIL-2连续治疗6周(第1-42天,各周的周一-周五),然后是2周停药期,它们一起构成8周治疗周期。
实施例4
用rIL-2与小分子受体酪氨酸激酶抑制剂BAY43-9006和SU11248联合治疗
A.材料和方法
药物
用注射用无菌水重建重组人白介素-2(Proleukin_,阿地白介素/rIL-2;18MIU/ml,Chiron Corporation,Emeryville,CA),并用5%右旋糖配制,然后进行给药。长春新碱(硫酸长春新碱)得自Mayne Pharma Ltd(Mulgrave,澳大利亚)。CHIR-258是4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(Chiron)。按照公开的方法和专利内部(in-house)合成和纯化BAY43-9006(Sorafanib/Nexavar_)(Ried1等,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.200142(Abs4956);Lowinger等,Curr.Pharm.Des.20028(25):2269-2278;WO9932455)和SU11248(Sunitinib/Sutent_)(Sun等,J.Med.Chem.200346(7):1116-1119;WO0160814)。在DMSO中制备BAY43-9006或SU11248(20mM)的母液,将试样量储存于-20℃待用。在体外试验中,用优化培养基稀释所有药物。在体内给药时,用100%PEG400载体配制BAY43-9006,而用5mM柠檬酸缓冲液制备SU11248给药溶液。所用的所有其它化学试剂都是研究级试剂。
细胞系
所有小鼠细胞系,CTLL-2(IL-2依赖性T细胞系)、B16-F10黑色素瘤、CT26结肠癌和肾癌RENCA都获自美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)。用补充有10%FBS(胎牛血清,Gibco Life Technologies,Gaithersburg,MD)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、25mM HEPES、0.5nM rIL-2、2mMβ-巯基乙醇的RPMI1640培养CTLL-2。用含有10%FBS、2%100X维生素、1%200mM谷氨酰胺、1%100mM NaPy、1%非必需氨基酸的EMEM培养基培养RENCA细胞。用含有EMEM、10%FBS、2%维生素、1%200mM谷氨酰胺、1%100mM丙酮酸钠、1%非必需氨基酸的培养基培养CT26细胞。用含有10%FBS、1%非必需氨基酸、1%100mM丙酮酸钠、2%维生素;2mM1-谷氨酰胺;2%碳酸氢钠的RPMI1640培养B16-F10细胞。用RPMI+10%FBS培养Yac-1细胞(ATCC),并在测定前亚培养1-2天以保证对数期生长。在37℃和5%CO2的湿环境中将细胞维持为悬液或贴壁培养物。采用指数生长期(不超过6-8代)、活力>98%(用台盼蓝染色评价)并经测定不含支原体的的细胞。
体内效力研究
雌性BALB/c或C57BL6小鼠(4-6周龄,18-22g)获自Charles River(Wilmington,MA),使其在无病原环境中适应1周,然后开始研究。动物随意接受无菌啮齿动物饲料和水,在顶部装有无菌滤器的笼子中以12-小时明/暗周期饲养。按照国际实验室动物护理评价和鉴定协会(Association for Assessment and Accreditation ofLaboratoryAnimal Care International)的指南进行所有实验。
植入肿瘤时,收获B16-F10(2×106)、CT26(2×106)或RENCA(1×106)细胞,洗涤三次,重悬于PBS。在小鼠的体侧剃毛,皮下(s.c.)植入(0.2ml)小鼠右侧。对于B16-F10肿瘤模型,采用C57BL6小鼠,而将CT26和RENCA肿瘤植入BALB/c小鼠。肿瘤的平均尺寸达到50-250mm3时开始治疗(第0天),如具体研究设计所述。将小鼠随机分成治疗小组(一般是10只小鼠/组)。在第0-6或7-13天或者第0-4、7-11天每天s.c.给予rIL-2(0.2-3mg/kg/天)。从第0天或第7天开始通过管饲法每天给予溶液形式的BAY43-9006或SU11248(1-100mg/kg)(5-12天)。单个研究中所述的所有选择剂量的单独治疗和联合用药都耐受良好。
肿瘤抑制和反应的评价
每周评价肿瘤体积和体重2-3次。用下式将游标卡尺测定的肿瘤尺寸转变成平均肿瘤体积(mm3):1/2(长度(mm)×[宽(mm)]2)。肿瘤生长抑制(TGI)计算为[1-(治疗组的平均肿瘤体积/对照组的平均肿瘤体积)×100]。与开始治疗时各动物的肿瘤体积相比,将反应分为完全反应(CR,无可测定肿瘤)或部分反应(PR,肿瘤体积减小50-99%)。用下式进行肿瘤生长延迟(TGD)分析:[(治疗组的平均肿瘤体积达到1000mm3的天数)-(对照组的平均肿瘤体积达到1000mm3的天数)]。
联合治疗组的预计肿瘤生长抑制%(%T/C预计=%T/C治疗1×%T/C治疗2)除以联合治疗组的%T/C观察值(%T/C观察)的比值>1时,定义为协同作用。%T/C预计/%T/C观察=1时定义为加成作用,%T/C预计/%T/C观察<1时定义为拮抗作用(Yokoyama等,Cancer Res.200060(80):2190-2196)。
药代动力学
为了评价药物的药代动力学,单用s.c.剂量的rIL-2(6mg/kg,0.2ml)或BAY43-9006(20mg/kg,p.o.,0.2ml)处理小鼠,在给药后不同时间采血。用HPLC或ELISA生物试验测定BAY43-9006和rIL-2的血浆水平。
Western印迹分析
在所示条件下进行药物孵育后,收获细胞,用冰冷的PBS洗涤,用含有蛋白酶抑制剂(Roche Molecular Biochemicals,印第安纳州印第安纳波利斯)和磷酸酶抑制剂(Sigma,密苏里州圣路易斯)的RIPA缓冲液(用1X磷酸盐缓冲盐水(pH7.2)配制的1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠)裂解。用BCA试验(Bio-Rad,Hercules,加州)测定裂解物的蛋白含量。在Western印迹分析中,电泳分析60μg蛋白质,用pERK的小鼠抗体(1:1000,Cell Signaling,马萨诸塞州贝弗利)检测pERK,4℃孵育过夜。通过与合适的抗-磷酸化酪氨酸抗体在室温下反应2小时,用相同量的蛋白质进行pSTAT5抗体(1:1000Upstate)和pAKT(1:1000Cell Signaling)的检测。然后用1:5000辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)在室温下孵育膜1小时。为了验证上样量相等,洗提印迹,并用抗ERK(Cell Signaling)、抗STAT5(BD Biosciences)和抗AKT(Cell Signaling)抗体再次检测,以分别测定总ERK、STAT5和AKT蛋白。用增强的化学发光(ECL;Amersham Biosciences,英格兰白金汉郡)检测蛋白质,曝光至Kodak胶片后观察。进行扫描密度测定,以定量条带强度。将pERK、pSTAT5或pAKT的量标准化至ERK、STAT5或AKT总蛋白水平,并与载体或未处理对照作比较。
药物处理后BALB/c裸小鼠中的细胞免疫表型分析
在所示处理后不同时间收集血样。将全血(100μl)转移到FACS/TruCount试管(BDBioSciences)中,保持在冰上。用0.5μg小鼠Fc部件(抗-小鼠CD16/CD32;BDBioSciences)处理样品,在冰上孵育20分钟。将如下所示的荧光染料偶联抗体加入样品中,冰上避光孵育20分钟。涡旋血样,同时加入2ml1x FACS裂解溶液(BDBioSciences),然后室温孵育10分钟,然后1250rpm离心。将所有样品洗涤两次,悬浮于PBS和2%FBS中,储存于4℃,然后上样至BD FACScalibur上,随后用CellQuestPro软件分析。相对于TruCount珠参比测定绝对细胞数。鉴定细胞群体,根据FSC和SSC特性以及总淋巴细胞标记物(CD45,BD BioSciences)进行门控分析;根据CD3染色鉴定T细胞淋巴细胞群体,用CD4或CD8染色(BD Biosciences)鉴定亚群体。通过适当门控事件鉴定单个细胞群体。
组织病理学和免疫组织化学
用10%福尔马林中性缓冲液固定小鼠肿瘤,然后转移至70%乙醇中,随后用Excelsior组织处理器(Thermo Electron Corporation,美国宾西法尼亚州匹兹堡)处理,以进行石蜡包埋。在轮转切片机(RM2125,Leica Microsystems,Nussloch,德国)上切出组织切片(4μm)。制备苏木精和伊红(H&E)染色的切片。然后用Discovery XT自动玻片染色系统(Ventana Medical Systems,美国亚利桑那州图森)进行免疫染色。用兔抗-CD3抗体(1∶60稀释,Dako Norden A/S,Glostrup Denmark)检测小鼠T细胞,用F4/80(Serotec)检测单核细胞/巨噬细胞。对于细胞增殖,用单克隆大鼠抗小鼠抗体(1∶15稀释,DAKO)染色小鼠肿瘤中的Ki-67。用CCl(Ventana Medical Systems)进行热诱导表位恢复。然后用合适的第二抗体(山羊抗兔IgG生物素化抗体,1∶100稀释,JacksonImmunoResearch Laboratories)孵育样品。含3-3′-二氨基联苯胺色原(Ventana MedicalSystems)的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素-生物素系统用于定位所述抗体。切片用核坚牢红(nuclear fast red)复染,以提高组织形态的观察效果。对于B16-F10肿瘤,由于观察到H&E组织中的黑色素沉积,采用Ventana Bluemap试剂盒(另一种NBT/BCIP染色方法),这有助于观察肿瘤中的T细胞。
CTLL-2T细胞增殖试验
用或不用BAY43-9006(3μM)37℃预孵育CTLL-2T细胞2小时。然后洗涤细胞,接种于96孔微量滴定板,5,000个细胞/孔,所用培养基含有连续稀释的rhIL-2(1μM-100nM)。孵育期(37℃72小时)结束时,通过四唑鎓染料试验用细胞增殖试剂WST-1(Roche Applied Science,印第安纳州印第安纳波利斯)测定细胞活力。
体外细胞毒实验
将细胞接种于96孔微量滴定板(CTLL-2:5000个细胞/孔;RENCA:1500个/孔;B16-F10:1000个/孔;MV4;11:5000个/孔),用连续稀释的BAY43-9006/SU11248或长春新碱处理。CTLL-2是IL-2依赖性细胞系,因此对这些细胞而言,用含有5nM rIL-2的培养基进行所述细胞毒实验。孵育期(37℃72小时)结束时,通过四唑鎓染料(WST-1)实验或化学发光(BrdU)实验(Roche Applied Science,印第安纳州印第安纳波利斯)测定细胞活力。EC50值定义为相对于未处理对照细胞处理组的吸光度降低50%所需的浓度。
离体脾细胞细胞毒实验
在无菌条件下从药物治疗的BALB/c小鼠(n=3-5只/组)获得脾细胞,在冰冷的PBS中匀浆。通过70μm尼龙细胞滤器后,4℃简短离心细胞。用RBC裂解缓冲液(Sigma,密苏里州圣路易斯)裂解红细胞。洗涤细胞,以不同的E:T比(100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3:1)与51Cr-标记的Yac-1靶细胞一起种板,进行4小时细胞毒实验。用Wallac平板阅读器获得数据,并以每分钟计数(cpm)表示。定量结果表示为特定裂解百分数,计算方法如下:%特定裂解=100×((平均实验值-平均自发释放值)/(平均最大释放值-平均自发释放值))。从含有标记的靶细胞但不含效应细胞的孔获得自发释放值,从含有标记靶细胞和1%Triton X-100的孔测定最大释放值。
统计学分析
用单向方差分析(ANOVA)进行多重比较;用Student-Newman Keuls检验(SigmaStat)完成事后检验,以比较不同治疗方式。p<0.05时认为差异具有统计学意义。
B.rIL-2和BAY43-9006对T细胞和肿瘤细胞信号转导途径的体外研究。
rIL-2在体外激活CTLL-2细胞的JAK/STAT和MAPK信号转导
为了阐明T细胞中IL-2/IL-2R信号转导通路的启动、时程和持续期间,血清饥饿CTLL-2细胞(1x107个细胞)24小时,然后用不同浓度的rIL-2(1pM-100nM)处理2小时,用Western印迹分析评价关键信号转导途径MAPK、STAT5、AKT。在体外用不同浓度的rIL-2(1pM-100nM)处理血清饥饿的CTLL-2细胞,以描述这两种主要IL-2R复合物:高亲和力(IL-2RαβγKD=10-11M)和中等亲和力(IL-2pγKD=10-9M)受体的相互作用。在一些实验中,使细胞接触游离的抗IL-2α抗体(过量>1000倍;10nM),孵育1小时,然后加入rIL-2。为了评价IL-2/IL-2R激活的时程,用10nM rIL-2活化血清饥饿的CTLL-2细胞,在10分钟至48小时的不同时间上检测IL-2信号转导。用Western印迹分析以rIL-2处理的细胞评价了IL-2R下游ERK1/2、STAT5和AKT的磷酸化。分别将pERK、pSTAT5或pAKT的相对水平与ERK、STAT5或AKT总蛋白水平作比较。
CTLL-2细胞与rIL-2接触后观察到pERK1/2的活化。1pM处理2小时能轻微激活磷酸化ERK,然而,在浓度≥100pM时观察到最大激活。在1pM浓度下最大激活JAK/STAT5通路;提高rIL-2的浓度不会改变pSTAT5水平(最高100nM)。在血清饥饿条件下的T细胞中,似乎激活了CTLL-2中的基本pAKT途径。而且,在所测试的rIL-2浓度下pAKT水平基本保持不变(1pM-100nM;用磷酸化位点483的pAKT抗体)。
用IL-2Rα的阻断抗体验证IL-2信号通路由与IL-2R的结合特异性介导。用Western印迹分析CTLL-2细胞中的pSTAT5水平。血清饥饿CTLL细胞,用过量游离的抗IL-2Rα抗体(10nM,>1000倍)处理1小时,然后用rIL-2(0.1pM-10nM)处理。在没有阻断性IL-2Rα抗体的情况下,1pM rIL-2处理后能激活pSTAT5,然而,存在IL-2Rα抑制的情况下,pSTAT5信号转导被终止(>95%抑制),这验证了STAT5信号转导中需要IL-2Rα。有趣的是,随着rIL-2浓度的提高(≥10pM),CTLL-2细胞中的pSTAT5水平得到了恢复,这表明rIL-2竞争性取代了抗IL-2Ro抗体和/或通过结合于低亲和力IL-2Rβγ(KD=10-9M)链激活了pSTAT5信号转导。
在CTLL-2细胞中rIL-2快速和持续性激活pSTAT5
为了评价CTLL-2细胞中IL-2R信号转导反应的启动时间和持续时间,用rIL-2(10nM)体外处理血清饥饿的细胞,用Western印迹分析评价其对ERK1/2、STAT5和AKT的磷酸化的影响。将rIL-2加入CTLL-2细胞后数分钟(<10分钟)内就激活了STAT5的磷酸化,pSTAT5反应的持续时间维持了长达48小时。rIL-2对MAPK途径的激活(pERK)似乎稍有延迟,至1小时后才激活。pERK的强度低于用PMA(50ng/ml)+伊屋诺霉素(0.4μg/ml)刺激血清饥饿的CTLL-2细胞15分钟获得的最大反应。此外,pERK水平保持了长达24小时,到48小时恢复到背景水平。没有观察到对pAKT的影响,这表明在CTLL-2细胞中通过PI-3K/AKT途径的信号转导是持续活化的。
在CTLL-2细胞中BAY43-9006处理抑制了pERK而不抑制pSTAT5
BAY-43-9006是Raf-1的有效抑制剂,它也抑制野生型和突变的BRAF。此外,BAY-43-9006抑制多种激酶,具体是VEGF2、3;PDGFRβ;FLT3和cKIT(Wilhelm,SM等,Cancer Res2004;和Chiron的激酶概况分析数据),并在某种程度上抑制Lck和Fyn,Lck和Fyn是参与T细胞功能反应的两种激酶。鉴于BAY43-9006的抑制激酶特性和对MAPK信号转导/T细胞信号转导的潜在影响,认为BAY43-9006可能干扰T细胞中的IL-2/IL-2R信号转导。因此,在CTLL-2、B16-F10或RENCA细胞中体外评价了BAY43-9006对IL-2信号转导的可能作用。
为了检测BAY43-9006对CTLL-2、B16-F10或RENCA模式细胞的影响,用不同浓度的BAY43-9006(0.01-20μM)处理血清饥饿的细胞。作为合适的对照,用PMA(50ng/ml)和伊屋诺霉素(0.4μg/ml)刺激细胞15分钟。为了检测用rIL-2和BAY43-9006在体外同步和连续处理CTLL-2细胞的作用,在存在或不存在BAY43-9006(3μM)的情况下用rIL-2(10nM)处理血清饥饿的CTLL-2细胞2小时。对于连续处理,BAY43-9006处理2小时。然后洗涤细胞,然后用rIL-2处理,反之亦然。也通过或不通过PMA(50ng/ml)和伊屋诺霉素(0.4μg/ml)刺激15分钟检测BAY43-9006(3μM)的抑制作用。
由于在不同细胞类型中用BAY43-9006抑制MAPK途径所需的浓度差异相当大,所以评价了不同浓度(0-20μM)BAY43-9006处理经过或不经过PMA+伊屋诺霉素刺激的血清饥饿CTLL-2细胞2小时的影响。孵育期结束时,裂解经处理的CTLL-2细胞,将蛋白质裂解物进行Western印迹分析,以测定pERK水平。在小鼠CTLL-2细胞和人Jurkat T细胞系中浓度>1μM的BAY43-9006基本上抑制了pERK。BAY43-9006处理对CTLL-2细胞的影响没有改变细胞的pSTAT5和pAKT水平,这表明T细胞中的JAK/STAT5途径和PI-3K/AKT基本未受影响。
为了研究rIL-2和BAY43-9006体外联合处理的治疗基础,研究了rIL-2和BAY43-9006对T细胞的影响和对CTLL-2细胞中两种IL-2介导的信号转导途径(MAPK和JAK/STAT5)的影响。在CTLL-2细胞中研究了这两种药物的同步或连续给药方案对IL-2介导的T细胞信号转导的影响。用BAY43-9006(3μM)处理血清饥饿的CTLL-2细胞2小时,然后用载体、rIL-2(10nM)或PMA+伊屋诺霉素处理。或者,也研究了rIL-2(10nM,2小时)处理后接BAY43-9006处理(3μM,2小时)。药物接触和/或PMA+伊屋诺霉素刺激后,用Western印迹分析细胞裂解物中的pERK和pSTAT5(如前所述)。BAY43-9006(3μM)处理抑制了pERK水平,然而,rIL-2激活了血清饥饿的CTLL-2细胞中的pERK水平(相对于基线pERK水平),这验证了这两种药物对MAPK途径的相反作用。所有用BAY43-9006的联合处理(同步和连续接触药物)都基本上抑制了CTLL-2细胞中的pERK。没有观察到所测试的所有联合处理(如方法部分所述)对STAT5途径或AKT途径的影响。
高浓度的BAY43-9006抑制肿瘤细胞系中的pERK水平
测定了BAY43-9006处理对小鼠肿瘤细胞系-B16-F10黑色素瘤、CT26结肠癌和RCC RENCA模型的影响。根据免疫活性模型(T-/NK-/单核细胞-/巨噬细胞-有活性的小鼠)中小鼠细胞系对体内rIL-2治疗的反应选择小鼠细胞系,其中可研究rIL-2和BAY43-9006联合治疗的影响。使血清饥饿的B16-F10黑色素瘤和RENCA细胞接触不同浓度(0-20μM)的BAY43-9006。用Western印迹分析测定药物处理后细胞裂解物中的磷酸化-ERK水平。在两种测试细胞系(B16-F10和RENCA)中非常高浓度(>5μM)的BAY43-9006抑制了pERK水平,20μM时观察到几乎完全抑制了pERK。
C.BAY43-9006对IL-2介导的细胞增殖的体外作用
为了检测BAY43-9006引起的pERK抑制是否影响CTLL-2细胞中IL-2介导的增殖反应,通过能抑制pERK的浓度的BAY43-9006预孵育CTLL-2细胞(5000个细胞/孔)(3μM,2小时),以进行增殖试验。用BAY43-9006(3μM)孵育细胞2小时后,将细胞接种于96孔板,并接触不同浓度的rIL-2(0-100nM)72小时。对未处理细胞进行假处理,然后用rIL-2(相同浓度)孵育。用WST-1试验评价BAY43-9006处理和未处理的CTLL-2细胞的增殖反应。在CTLL-2细胞系中,用BAY43-9006(3μM)预孵育细胞能抑制pERK信号转导,但不影响IL-2诱导的增殖反应。
D.BAY43-9006或SU11248对CTLL-2和肿瘤细胞的体外抗增殖活性
为了评价BAY43-9006或SU11248在这些细胞类型(CTLL-2、B16-F10、RENCA、CT26)中的体外细胞毒活性,将细胞接种于96孔微量滴定板中,用连续稀释的BAY43-9006(0-50μM)37℃处理72小时。由于CTLL-2细胞系的增殖依赖IL-2,所以在含有5nM rIL-2的培养基中进行针对这些细胞的细胞毒研究。在72小时孵育期结束时,通过四唑鎓染料(WST-1)试验或化学发光(BrdU)试验测定细胞活力。作为对照,用BAY43-9006(0-50μM)处理MV4;11(人FLT3ITD AML细胞系),或用长春新碱(0-1μM)处理B16-F10细胞,以确认药物的细胞毒性和试验的有效性。药物的抑制浓度表示为EC50值,EC50值定义为根据相对于未处理/载体对照的药物处理细胞的吸光度测定的使增殖反应降低50%所需的浓度。
BAY43-9006或SU11248的相对EC50见表9。
表9.BAY43-9006或SU11248对不同细胞系的抗增殖活性。
EC50(μM)a | ||||
细胞系 | 细胞类型 | BAY43-9006 | SU11248 | 长春新碱 |
CTLL-2 | 小鼠T细胞 | 10 | 0.03 | |
B16-F10 | 小鼠黑色素瘤 | 15 | 2 | 0.001 |
RENCA | 小鼠肾细胞癌 | 5 | ||
CT26 | 小鼠结肠癌 | >10 | 3 | |
MV4;11b | 人FLT3ITD AML | 0.01/0.006d | 0.02d |
将细胞接种于96孔微量滴定板(CTLL-2:5000个细胞/孔;RENCA:1500个/孔;B16-F10:1000个/孔;CT26:1000个/孔;MV4;11:5000个/孔),用连续稀释的BAY43-9006、SU11248或长春新碱处理。CTLL-2是IL-2依赖性细胞系,因此在含有5nM rIL-2的培养基中进行细胞毒试验。在孵育期结束时(37℃72小时),用四唑鎓染料(WST-1)试验测定细胞活力。
aEC50=根据相对于未处理/载体对照的药物处理细胞的吸光度测定的使增殖反应降低50%所需的浓度。
bMV4;11是表达FLT3内部串联重复(ITD)的人急性成髓细胞性白血病(AML)细胞系。BAY43-9006(有效的FLT3激酶抑制剂;IC50=58nM)对MV4;11细胞有显著的体外抗增殖活性。
d用测定细胞的ATP含量的Promega Cell-Titer GloTM试验评价细胞活力。
通常,与抗有丝分裂剂长春新碱相比(由相对EC50确定;见表9),需要相对高浓度的BAY43-9006(或SU11248)来抑制CTLL-2细胞以及各种细胞系(B16-F10、RENCA、CT26)增殖。也用评价对DNA合成影响的BrdU试验检测BAY43-9006对RENCA细胞的细胞毒性作用(相对于用线粒体四唑鎓染料试验检测的抗增殖活性)。用BrdU方法获得的BAY43-9006对RENCA细胞的EC50(~5μM)与用WST-l试验观察到的相似。RENCA肿瘤细胞接触不同浓度的rIL-2(0-1μM)时,没有观察到直接的增殖反应(或细胞毒性),这验证了rIL-2的机制依赖于免疫效应细胞组分的活化。
E.体内效力研究
rIL-2和BAY43-9006在小鼠中的药代动力学
在公开的BAY43-9006(剂量400mg)的I期报道中,在患者中实现了10-20μM的高Cmax和约24小时的长药物半衰期(Strumberg,等,J.Clin.Oncol.200523(5):965-972)。为了确定血浆药物接触可否影响体内T细胞活力和增殖反应,测定了rIL-2和BAY43-9006在小鼠中的单剂量药代动力学。
单剂量口服30mg/kg BAY43-9006在tmax为2小时时在小鼠中达到的Cmax约为5500-8000ng/ml(~10μM)。BAY43-9006的血浆清除相当缓慢,其半衰期约为4小时。相反,皮下给予6mg/kg的rIL-2后PK图谱显示,在tmax约为30分钟时的Cmax约为550-850ng/ml。rIL-2在小鼠中的t1/2约为1小时,在4小时内其接触量≥50ng/ml。有趣的是,单一给药治疗和不同给药途径治疗都显示出非重叠的Cmax(在tmax时),表明如PK结果所支持的,同步和连续治疗都可以是可行的。鉴于BAY43-9006在血液中大部分结合于蛋白质,所以这些药物接触量在体内对T细胞活力的影响仍然有待研究。
rIL-2和BAY43-9006处理能降低离体的免疫效应器功能
由于抑制一种或多种T淋巴细胞激酶(Lck、Fyn、Syk、Btk、Src、Tck2、MAPK、JAK)可能抑制T细胞扩展和免疫效应器功能,所以研究了rIL-2和BAY43-9006在体内对T细胞增殖和功能反应的影响。
在这些实验中,用rIL-2(1mg/kg/天,s.c.第6-10天)、BAY43-9006(30mg/kg/天,p.o.,第6-10天)或rIL-2和BAY43-9006的组合同步或连续给药(rIL-2,1mg/kg/天,s.c.第1-5天+BAY43-9006,30mg/kg/天,p.o.,第6-10天;或BAY43-9006,30mg/kg/天,p.o.,第1-5天+rIL-2,1mg/kg/天,s.c.第6-10天)处理荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠。然后以不同的效应器:靶点(E:T)比对分离自治疗小鼠的脾细胞进行针对Yac-1靶细胞的离体杀伤试验,测定51Cr-标记的Yac-1细胞的特定裂解百分数。与载体治疗相比,用rIL-2(1mg/kg)处理的小鼠脾细胞介导的Yac-1靶点杀伤作用显著增强(用rIL-2为23%,用载体治疗为0%)。用BAY43-9006治疗观察到的特定杀伤作用(1%)可以忽略,与载体治疗无区别。用rIL-2和BAY43-9006进行的所有治疗导致脾细胞介导的裂解活性降低(同步治疗=16%;连续治疗≤9%,相对于rIL-2单独治疗=23%)。
rIL-2和BAY43-9006治疗对循环的免疫效应细胞群体的影响
检测了rIL-2和/或BAY-43-9006治疗对BALB/c荷瘤小鼠中循环的淋巴细胞和单核细胞群体的药效学影响。在这些研究中,单药物或rIL-2和BAY43-9006联合治疗(如前所述的同步或连续治疗)后采血。用TruCountTM试管和合适的免疫染色定量全血中淋巴细胞和T细胞亚群体(CD4+或CD8+)的绝对计数。
rIL-2治疗降低了荷瘤小鼠中循环的淋巴细胞和单核细胞(CD45+细胞:2387个细胞/μ1,相对于载体为1575个细胞/μ1)和T细胞(1550个细胞/μ1,相对于载体为664个细胞/μl)的绝对数量。与载体治疗相比,rIL-2治疗显著提高了CD4:CD8细胞比率(5:3;rIL-2:载体,即1.7倍),这表明了rIL-2的作用机制是扩增T细胞数量的作用。rIL-2治疗后非T和单核细胞(CD45+CD3-)的相对数量与载体治疗组相似(837个细胞/μ1,相对于载体为911个细胞/μ1)。相反,单一药物BAY43-9006或BAY43-9006与rIL-2联用对淋巴细胞和单核细胞的绝对数量影响很小或能增加该数量(在2417-3577个细胞/μ1范围内,相对于载体为2387个细胞/μ1),也增加了非T细胞和单核细胞群体(1241-1563个细胞/μ1,相对于载体为837个细胞/μ1)。BAY43-9006治疗对T细胞总数的影响与载体治疗组相似(1827个细胞/μ1,相对于载体为1550个细胞/μ1)。以rIL-2开始进行rIL-2和BAY43-9006的连续方案能少量增加总T细胞数(包括CD4+和CD8+群体)(2081个T细胞/μ1,相对于载体为1550个细胞/μ1)。当rIL-2和BAY43-9006同步给药或先给予BAY43-9006再给予rIL-2时,与载体治疗组相比总T细胞数稍有降低(~1170-1244个T细胞/μ1,相对于载体为1550个细胞/μ1)。在单独的CD4+和CD8+T细胞群体中观察到的趋势相似。
此外,用rIL-2和BAY43-9006或SU11248治疗(如前所述)后,测定了肿瘤的组织学。为了检测体内T细胞的药效学,用小鼠抗-CD3抗体检测肿瘤浸润性T细胞。用Ki67染色评价药物治疗后对肿瘤的抗增殖作用。与载体治疗相比,rIL-2治疗后,观察到浸润RENCA肿瘤(和B16-F10肿瘤)的T细胞数增加。通常,在RENCA模型中,Bayer43-9006治疗组中检测到的T细胞较少。在B16-F10肿瘤中rIL-2和BAY43-9006或SU11248治疗对浸润性T细胞的影响模棱两可,因为在所有治疗组中都检测到一些T细胞。显示出坏死增加的肿瘤(肿瘤抑制)通常显示,肿瘤细胞之间分散的T细胞数量较多。总之,数据表明,rIL-2能活化循环中的T细胞,并将细胞运输到包括肿瘤在内的血管外位点,BAY43-9006或SU11248治疗可部分抑制T细胞增殖反应和运输。
rIL-2和BAY43-9006治疗提高了IL-2反应性小鼠肿瘤模型的效力
检测了rIL-2与BAY43-9006或SU11248的药物相互作用(见图1-10和表10-12)。在三种T细胞有活性的实验小鼠IL-2反应性肿瘤模型(B16-F10黑色素瘤、CT26结肠癌、RCC RENCA模型)中评价了联合治疗(图1-10)。在这些研究中,肿瘤大小达到50-225mm3时将小鼠随机分组,每天口服给予BAY43-9006或SU11248或每天皮下给予rIL-2(如方法所示)后用游标卡尺监测肿瘤生长。用多种剂量和治疗方案研究rIL-2、BAY43-9006和SU11248的单一药物效力和耐受性(图1)。在所有模型中,rIL-2显示出强大效力,有效剂量下的肿瘤抑制通常为40-60%(相对于载体治疗组)(图1)。BAY43-9006的最小有效剂量为≥30mg/kg/天(相对于载体治疗组)。除了B16-F10肿瘤模型,SU11248的有效剂量通常为≥40mg/kg/天(图1)。
根据单独用药的效力和耐受性,随后将rIL-2与能耐受并对体重没有任何不利影响也没有临床不利症状的剂量的BAY43-9006或SU11248联用。在B16-F10和CT26肿瘤模型中检测连续和同步治疗方案(图2-8,表10和11)。在B16-F10和CT26肿瘤模型中,相对于单一治疗或载体治疗,几乎所有用rIL-2和BAY43-9006或rIL-2和SU12248研究的联合治疗(同步或连续方案)都提高了抗肿瘤活性(图2-5)。表10和11中小结了各种联合治疗的药物相互作用。
表10.C57BL6小鼠中小鼠黑色素瘤B16-F10肿瘤模型中rIL-2、BAY43-9006、SU11248单独用药以及rIL-2和BAY43-9006/SU11248联合用药的效力。
治疗a | 平均肿瘤体积(mm3;第14或15天) | Ob(T/C观察值) | Ec(T/C实验值) | E/Od(%T/C实验值/%T/C观察值) | 药物相互作用e |
A.rIL-2+BAY43-9006效力 | |||||
1.载体(第0-4、7-11天)2.rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)3.rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)4.BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天)5.BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第7-13天)6.rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0-6天)+BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第7-13天)7.BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天)+rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第7-13天)8.rIL-2(3.3mg/kg,s.c.第0·6天)+BAY43-9006(30mg/kg,p.o.第0-6天) | 21211354163710251392687800848 | 1.000.770.640.480.660.320.380.40 | N/AN/AN/AN/AN/A0420.370.31 | N/AN/AN/AN/AN/A1.290.991.02(第8天) | N/AN/AN/AN/AN/A加成加成加成 |
B.rIL-2+SU11248效力 | |||||
1.载体(第0-4、7-11天)2.rIL-2(3.3mg/kg/d,s.c.第0-6天)3.rlL-2(3.3mg/kg/d,s.c.第7-13天)4.SU11248(40mg/kg/d,p.0.第0-6天)5.SU11248(40mg/kg/d,p.o.第7-13天)6.rlL-2(3.3mg/kg/d,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg/d,p.o.第7-13天)7.SU I1248(40mg/kg/d,p.o.第0-6天)+rlL-2(3.3mg/kg/d,s.c.第7-13天)8.rIL-2(3.3mg/kg/d,s.c.第0-6天)+SU11248(40mg/kg/d,p.o.第0-6天) | 2415934104217561701583583743 | 1.000.390.430.720.700.240.240.31 | N/AN/AN/AN/AN/A0.280.310.28 | N/AN/AN/AN/AN/A1.201.300.90 | N/AN/AN/AN/AN/A加成加成加成 |
an=各研究中10只C57BL6小鼠/组。当肿瘤生长至平均尺寸约为50mm3时治疗B16-F10荷瘤小鼠。
bT/C观察值(O)=%T/C
cT/C实验值(E)=%T/C治疗1×%T/C治疗2
d联合治疗组的预计肿瘤生长抑制%(%T/C预计=%T/C治疗1×%T/C治疗2)除以联合治疗组的%T/C观察值(%T/C观察)的比值>1时,定义为协同作用。
e%T/C预计/%T/C观察=1时,将药物相互作用定义为加成作用,%T/C预计/%T/C观察<1时定义为拮抗作用。
N/A,无
表11.BALB/C小鼠中小鼠CT26肿瘤模型中rIL-2、BAY43-9006、SU11248单独用药以及rIL-2和BAY43-9006/SU11248联合用药的效力。
治疗a | 平均肿瘤体积(mm3;第13天) | Ob(T/C观察值) | Ec(T/C实验值) | E/Od(%T/C实验值/%T/C观察值) | 药物相互作用e |
A.rIL-2+BAY43-9006/SU11248效力研 究 | |||||
1.载体2.rIL-21mg/kg/d,s.c.第0-6天3.rIL-21mg/kg/d,s.c.第7-13天4.BAY43-900640mg/kg/d,p.o.第0-6天5.BAY43-900640mg/kg/d,p.o.第7-13天6.SU1124840mg/kg/d,p.o.第0-6天7.SU1124840mg/kg/d,p.o.第7-13天8.rIL-2第0-6天+BAY43-900640mg/kg,p.o.第7-13天9.rIL-21mg/kg/d,s.c.第0-6天+SU1124840mg/kg,p.o.第7-13天10.BAY43-900640mg/kg,p.o.第0-6天+rIL-21mg/kg/d,s.c.第7-13天11.SU1124840mg/kg/d,p.o.第0-6天+rIL-21mg/kg/d,s.c.第7-13天12.rIL-21mg/kg/d,s.c.第0-6天+BAY43-900640mg/kg,p.o.第0-6天13.rIL-21mg/kg/d,s.c.第0-6天+SU1124840mg/kg/d,p.o.第0-6天 | 2579197424621773257221271581111412502336100615021137 | 1.000.760.950.680.990.830.610.430.490.910.390.580.44 | N/AN/AN/AN/AN/AN/AN/A0.760.470.660.790.530.63 | N/AN/AN/AN/AN/AN/AN/A1.770.970.722.020.901.43 | N/AN/AN/AN/AN/AN/AN/A加成/协同加成亚加成加成/协同加成加成 |
an=各研究中10只BALB/C小鼠/组。当肿瘤生长至平均尺寸约为225mm3时治疗CT26荷瘤小鼠。
bT/C观察值(O)=%T/C
cT/C实验值(E)=%T/C治疗1×%T/C治疗2
d联合治疗组的预计肿瘤生长抑制%(%T/C预计=%T/C治疗1×%T/C治疗2)除以联合治疗组的%T/C观察值(%T/C观察)的比值>1时,定义为协同作用。
e%T/C预计/%T/C观察=1时,将药物相互作用定义为加成作用,%T/C预计/%T/C观察<1时定义为拮抗作用。
N/A,无
在CT26模型中仅有一种情况,在rIL-2(1mg/kg/天,s.c.,第8-13天)之前给予BAY43-9006(40mg/kg/天,p.o.,第1-7天)时,联合治疗的效果不是最优的。
在RENCA模型中,只评价了同步方案(图9-10;表12),rIL-2与BAY43-9006或SU11248联合治疗的肿瘤抑制作用高于单一药物治疗。
表12.BALB/C小鼠中小鼠RCC RENCA肿瘤模型中rIL-2、BAY43-9006、SU11248单独用药以及rIL-2和BAY43-9006/SU11248联合用药的效力。
治疗a | 平均肿瘤体积(mm3;第13天) | Ob(T/C观察值) | Ec(T/C实验值) | E/Od(%T/C实验值/%T/C观察值) | 药物相互作用e |
A.rIL-2+BAY43-9006效力 | |||||
1.载体,第0-8天 | 579 | 1.00 | N/A | N/A | N/A |
2.rIL-21mg/kg/d,s.c.第0-4、7-11天 | 288 | 0.50 | N/A | N/A | N/A |
3.BAY43-900630mg/kg/d,p.o.第0-8天 | 273 | 0.47 | N/A | N/A | N/A |
4.rIL-21mg/kg/d,s.c.第0-4、7-11天+BAY43-900630mg/kg/d,p.o.第0-8天(同步) | 154 | 0.27 | 0.23 | 0.88 | 加成 |
B.rIL-2+SU11248效力 | |||||
1.载体 | 712 | 1.00 | N/A | N/A | N/A |
2.rIL-21mg/kg/d,第0-6天 | 525 | 0.74 | N/A | N/A | N/A |
3.16954940mg/kg/d,第0-6天 | 527 | 0.74 | N/A | N/A | N/A |
4.16954940mg/kg/d,第0-6天/rIL-21.0mg/kg/d,s.c.第0-6天(同步) | 414 | 0.58 | 0.55 | 0.94 | 加成 |
an=各研究中10只BALB/C小鼠/组。当肿瘤生长至平均尺寸约为50-70mm3时治疗RENCA荷瘤小鼠模型。显示了同步方案,由于RENCA肿瘤模型产生严重的恶病质(动物浪费),以致不可能进行连续给药,也无法评价。
bT/C观察值(O)=%T/C
cT/C实验值(E)=%T/C治疗1×%T/C治疗2
d联合治疗组的预计肿瘤生长抑制%(%T/C预计=%T/C治疗1×%T/C治疗2)除以联合治疗组的%T/C观察值(%T/C观察)的比值>1时,定义为协同作用。
e%T/C预计/%T/C观察=1时,将药物相互作用定义为加成作用,%T/C预计/%T/C观察<1时定义为拮抗作用。
N/A,无
由于RENCA模型持续期间短和小鼠恶病质(动物浪费/体重损失),在RENCA模型中采用连续治疗不可行。总之,数据显示,在临床前模型中rIL-2与靶向小分子治疗如BAY43-9006和SU11248联用时活性提高,这表明可将这种治疗方案转移到临床上。虽然根据具体实施例(包括目前优选的本发明实施方式)描述了本发明,但本领域技术人员将理解,上述系统和技术有多种改变和替换形式,它们都落入本发明的构思和范围。
纳入本文作参考
将上面引用的所有专利、专利申请和期刊文章的内容纳入本文作参考,就像它们在本文中完整列出的那样。
Claims (32)
1.一种治疗癌症患者的方法,所述方法包括给予所述患者治疗有效量的阿地白介素和一种抗血管新生剂,所述抗血管新生剂选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在给予所述抗血管新生剂之前给予阿地白介素。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在给予所述抗血管新生剂之后给予阿地白介素。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在给予所述抗血管新生剂的同时给予阿地白介素。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在与所述抗血管新生剂不同的组合物中给予阿地白介素。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,包括按照给药方案单独给予所述患者治疗有效量的阿地白介素和抗血管新生剂,其中在至少连续3天的周期中每天以约9-130 MIU/天的剂量给予阿地白介素1-3次,任选地后接至少连续3天的停药期。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,每2-3周给予所述抗血管新生剂1-6次。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,静脉内给予阿地白介素,存在所述停药期。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,皮下给予阿地白介素,不存在所述停药期。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,每天以约9-30 MIU/天的剂量给予阿地白介素1-3次。
11.如权利要求6所述的方法,其特征在于,每天以约30-130 MIU/天的剂量给予阿地白介素3次。
12.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在连续5天的周期中给予阿地白介素,后接为期9天的停药期。
13.如权利要求6所述的方法,其特征在于,将所述给药方案重复至少两个疗程。
14.如权利要求6所述的方法,其特征在于,将所述给药方案重复3个疗程。
15.如权利要求6所述的方法,其特征在于,将所述给药方案重复4个疗程。
16.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在第一天给予阿地白介素3次,随后每天给药一次。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其特征在于,所述癌症是肾细胞癌、黑色素瘤或结肠癌。
18.如权利要求17所述的方法,还包括在给予阿地白介素之后或同时给予所述患者选自下组的至少一种化合物:对乙酰氨基酚、哌替啶、吲哚美辛、雷尼替丁、尼扎替丁、diastop、洛哌丁胺、苯海拉明或呋塞米。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法导致所述患者的癌症改善。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法导致所述患者的低血压减轻。
21.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法导致所述患者的高血压减轻。
22.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法导致所述患者的一氧化氮合酶减少。
23.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其特征在于,所述癌症对血管新生抑制和/或免疫刺激敏感。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其特征在于,所述抗血管新生剂是N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺。
25.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其特征在于,所述抗血管新生剂是1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
26.一种组合物,其含有:(a)治疗有效量的阿地白介素;(b)治疗有效量的一种抗血管新生剂,所述抗血管新生剂选自:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺、1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲;和(c)药学上可接受的赋形剂。
27.一种药盒,其包括同时、依次或分别应用的治疗癌症患者的药物组合,包括(a)阿地白介素和(b)一种抗血管新生剂,所述抗血管新生剂选自:6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基]喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
28.如权利要求26所述的药盒,其特征在于,所述药物各自分开包装。
29.阿地白介素和一种抗血管新生剂在制造治疗癌症患者的一种或多种药物中的应用,所述抗血管新生剂选自6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺、6-(3-吗啉代丙氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-((5-氟-2-氧代二氢吲哚-3-亚基)甲基)-2,4-二乙基-1H-吡咯-3-羧酰胺、N-(4-氯苯基)-4-((吡啶-4-基)甲基)酞嗪-1-胺或1-(4-(2-(甲基氨甲酰基)吡啶-4-基氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲。
30.如权利要求29所述的应用,其特征在于,配制在所述抗血管新生剂之前给药的阿地白介素。
31.如权利要求29所述的应用,其特征在于,配制在所述抗血管新生剂之后给药的阿地白介素。
32.如权利要求29所述的应用,其特征在于,配制与所述抗血管新生剂同时给药的阿地白介素。
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