CN112538071A

CN112538071A - 用作raf-1抑制剂的化合物、制备方法和用途

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Publication number: CN112538071A
Application number: CN202011384100.0A
Authority: CN
Inventors: 洪振宇; 文卡塔·普拉塔·雷迪·伽拉帕里; 拉亚·瑟哈拉·雷迪·毕吉维穆拉; 牛红蕊; 苗站会; 刘鼎; 路平
Original assignee: First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-03-23

Abstract

本发明涉及医药化学技术领域，具体涉及用作RAF‑1抑制剂的化合物、制备方法和用途。本发明提供具有改进结构的吡唑啉酮‑吲哚啉酮衍生物或其药学上可接受的盐，通过试验验证，本发明化合物对Raf‑1具有显著的抑制作用，能够用于治疗和预防对抑制Raf‑1过量表达或活性紊乱具有响应的疾病，比如某些癌症和纤维化疾病。

Description

用作RAF-1抑制剂的化合物、制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药化学技术领域，具体涉及用作RAF-1抑制剂的化合物、制备方法和用途。

背景技术

蛋白激酶参与非常复杂的信号级联，所述信号级联调节大部分细胞功能，包括细胞存活和增殖，已经对这些信号传导通路进行了大量研究，特别是在细胞功能失调导致的障碍例如癌症的情况中。例如，已经对促分裂原-激活的蛋白激酶(MAPK)级联进行了深入地研究，该通路中的激酶，例如RAS、RAF、MEK和ERK，已经被开发利用为药物研究的靶点。Raf激酶家族有3个成员:Raf-1/C-Raf、B-Raf和A-Raf。三个家族成员都与肿瘤发生相关。Raf-1是首先被验证的亚型[Bonner TI et al Mol Cell Biol 1985；5(6):1400-7],它在调控生长因子信号通路的细胞效应方面发挥关键作用[Wasylyk C et al Mol Cell Biol 1989；9(5):2247-50；Kolch W et al Nature 1991；349(6308):426-8；Jamal S et al Nature1990；344(6265):463-6]。Raf-1能介导肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等多种生理过程,对肿瘤的发生和发展有重要促进作用[Li J et al Pharmazie 2012；67(8):718-24]。

Raf-1的调控是以激活/去激活循环的方式进行的。在Raf-1处于非激活状态时,Raf-1以封闭环的形式存在。封闭环是N端调控区域折叠封闭了催化区域而形成(Tran NHet al J Biol Chem 2003；278(13):11221-6)。当激素、生长因子等与细胞表面受体结合时,细胞中的Ras-GTP增加,进而激活Ras；Ras的激活会引发Ras-GTP与Raf-1直接结合,从而将细胞浆中的Raf-1二聚体募集到细胞膜上。募集到膜上的Raf-1发生磷酸化而激活。最终,激活的Raf-1与蛋白磷酸化酶PP5特异性结合从而使得Raf-1发生去磷酸化,导致Raf-1回到非激活状态。Raf-1通过参与细胞凋亡的调节、促进肿瘤细胞的运动、抑制肿瘤细胞的增殖与分化等作用，影响癌症的发生和发展进程。具体体现在一下几个方面：

Raf-1可以通过线粒体途径来发挥抑制细胞凋亡的作用(Leicht DT et alBiochim Biophys Acta 2007；1773(8):1196-212；Dhillon AS et al Oncogene 2007；26(22):3279-90；Kholodenko BN et al Nat Rev Mol Cell Biol 2010；11(6):414-26)。当凋亡抑制蛋白Bcl-2过表达时,Raf-1被Bcl-2激活并将抑制细胞凋亡信号传递至线粒体(Wang HG et al Cell 1996；87(4):629-38.)。此外,部分生长因子和p21活化激酶(P21-activated kinases,PAK)共同参与了Raf-1激酶的S338位点的磷酸化(Wu X et al J CellBiochem 2008；105(1):167-75；Jin S et al J Biol Chem 2005；280(26):24698-705),进而促进Raf-1转位至线粒体。另外，Raf-1介导了Bcl-2家族成员促凋亡蛋白BAD的磷酸化失活(Wang HG et al Cell 1996；87(4):629-38)。Raf-1作为支架蛋白来募集蛋白激酶C-θ(PKC-θ),进而诱导BAD磷酸化(Hindley A et al Cell Signal 2007；19(3):547-55)。Raf-1与线粒体的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channels,VDACs)直接相互作用,可能抑制了细胞色素C从线粒体向胞浆的释放[Le Mellay V et al BMC CellBiol 2002；3:14]。且与Raf激酶抑制蛋白RKIP分离的Raf-1转位至线粒体,抑制了细胞凋亡,最终促进癌症发生(Kim SY et al J Microbiol Biotechnol 2011；21(5):525-8；HsuYL et al J Agric Food Chem 2012；60(3):852-61)。

Fas是肿瘤坏死因子受体家族成员,广泛存在于组织细胞。研究显示,Rock2激酶活性增高可促进细胞骨架连接蛋白(ezrin)发生磷酸化而激活,进而促进Fas在Raf-1敲除的胚胎成纤维细胞的细胞膜上募集和表达,最终促进细胞凋亡[Piazzolla D et al J CellBiol 2005；171(6):1013-22；Ehrenreiter K et al J Cell Biol 2005；168(6):955-64]。Fas活化可促进Raf-1-Rock2络合物的形成,下调Rock2激酶的活性。因此,Raf-1通过与Rock2直接结合来降低Rock2的活性,从而反馈性地抑制Fas在细胞膜表面的表达,最终抑制细胞凋亡的发生。

Raf-1在抑制细胞凋亡过程中其他的作用靶点是促凋亡激酶:细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signalregulating2(mammalian Sterile20-like kinase 2,MST2),Raf-1直接与之结合,并抑制该激酶的活性。这些抑制效应不需要Raf-1激酶的活性而是通过Raf-1与促凋亡激酶直接结合而介导的。ASK1位于JNK MPAK和p38MPAK上游,通过激活死亡受体(如TNF-α、Fas)途径来促进细胞凋亡(Rubiolo C et al Blood 2006；108(1):152-9；Tobiume K et al EMBO Rep 2001；2(3):222-8)。在人内皮细胞中，Raf-1通过结合并抑制线粒体中ASK1的激酶活性，抑制细胞凋亡的发生。在大鼠心脏中特异性的敲除raf-1基因,导致由心肌细胞凋亡增加而引起的心室扩大症和纤维症，同时，敲除ASK1能抑制上述症状的发生。以上研究阐明了Raf-1对ASK1的抑制效应的病理生理学意义(Yamaguchi O etal J Clin Invest2004；114(7)：937-43.)。Raf-1与MST2的SARAH结构域结合，进而干扰了MST2二聚化作用及募集。Raf-1激酶失活的突变体也可以抑制MST2激活。MST2活性在raf-1敲除的细胞中显著提高(O’Neill E et al Science 2004；306(5705)：2267-70)。这些都表明了Raf-1可以直接与ASK1激酶和MST2激酶结合,进而抑制它们的活性,最终发挥抑制细胞凋亡的作用。

Raf-1可通过下调Rho激酶-α(Rok-α)的活性来促进肿瘤细胞的运动(EhrenreiterK et al J Cell Biol 2005；168(6):955-64)。raf-1敲除的细胞中,使用Rok-α的化学抑制剂抑制Rok-α的活性或诱导Rok-α的负调控结构域发生突变,可以逆转因raf-1敲除而对细胞运动的抑制作用,该结果表明,在细胞运动过程中Rok-α是Raf-1的唯一作用靶点(Ehrenreiter K et al J Cell Biol 2005；168(6):955-64)。对其机理的研究发现,Raf-1半胱氨酸富集域(CRD)在该过程中起到了至关重要的作用。Rok-α像Raf-1一样,具有自身抑制活性的特性,其C端调控区域高度类似于Raf-1的CRD。Raf-1的CRD调控结构域能够与Rok-α激酶结构交联结合,并抑制Rok-α激酶的活性,进而促进肿瘤细胞的运动(Niault T et alJ Cell Biol 2009；187(3):335-42)。Raf-1和Rok-α相互作用的生物学相关性在Ras诱导的小鼠皮肤肿瘤模型中得了很好的验证(Ehrenreiter K et al Cancer Cell 2009；16(2):149-60)。

Raf-1可以通过诱导转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)产生来抑制肿瘤细胞的增殖与分化。TGF-β是一个抑制肿瘤细胞增殖的关键诱导物。许多肿瘤通过下游调控或TGF-β受体突变体来使TGF-β信号转导失效，或通过使其下游靶点失活，如视网膜母细胞瘤蛋白Rb，从而使其迅速增殖(Wang X et al J Biol Chem 2004；279(4):2528-34)。而激活的Raf-1则可以通过诱导TGF-β的产生来抑制肿瘤细胞的分化和凋亡(Riesco-Eizaguirre G et al Cancer Res 2009；69(21):8317-25；Samuel DS et alHorm Metab Res 1999；31(2/3):55-64)。此外,Raf-1可以通过Raf/MEK/ERK级联激酶通路参与细胞分化的调节。ERK1/2影响细胞分化可能与M期细胞内微管结构有关(EhrenreiterK et al J Cell Biol 2005；168(6):955-64)。最近研究表明,在表皮肿瘤中,内源性Raf-1对于维持表皮肿瘤细胞未分化状态至关重要。激活的Rho激酶-α(Rok-α)可以诱导Raf-1有条件消融,进而导致已有肿瘤通过MEK/ERK依赖性激活一个分化程序(Zebisch A et alCancer Res 2006；66(7):3401-8)。

抑制Ras信号以治疗癌症的临床前及临床研究失败后,以Raf蛋白家族及其下游效应器为靶点的药物研发逐渐成为人们研究的重点。药物研发采用如下策略:采用小分子抑制剂来抑制Raf激酶的活性；或者利用反义寡核苷酸来减少Raf蛋白的表达水平；或者以Raf蛋白与其他蛋白之间的相互作用为目标,尤其是Raf-Ras之间相互作用。第一个研发出来的药物就是Raf-1的抑制剂,随着B-Raf激活的突变体在肿瘤中越来越多地被发现,人们也开始致力于研发B-Raf和MEK1/2的抑制剂，例如靶向于C-Raf或B-Raf(或这二者)的抑制剂包括索拉菲尼(sorafenib)、XL281、RAF265和BAY43-9006，用于治疗各种癌症。

发明内容

本发明的目的之一在于提供用作Raf-1抑制剂的化合物，抑制Raf的活性或过量表达。

本发明的目的之二在于提供本发明所述用作Raf-1抑制剂的化合物的制备方法。

本发明的目的之三在于提供本发明所述化合物治疗与过量或不期望的Raf活性水平紊乱相关的疾病的用途，比如某些癌症或纤维化疾病。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种化合物，选自式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R1选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、苯甲基、烯丙基、溴代乙基、溴代丙基、辛基。

作为优选的，所述R1为H；作为另一个优选的方案，所述R1为甲基；在另一个优选实施例中，所述R1为乙基；在另一个优选的实施例中，所述R1为丙基；在另一个优选的实施例中，所述R1为异丙基；在另一个优选的实施例中，所述R1为苯甲基；在另一个优选的实施例中，所述R1为烯丙基；在另一个优选的实施例中，所述R1为溴代乙基；在另一个优选的实施例中，所述R1为溴代丙基；在另一个优选的实施例中，所述R1为辛基；

上述化合物的制备方法，以式(Ⅱ)和式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示化合物为原料制备而成：

具体制备方法包括：分别取式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示化合物、三乙胺加入乙醇(浓度70％)中室温下混合搅拌均匀，采用TLC监测反应进程，反应完成后冷却至室温，过滤得固体反应产物，依次洗涤、干燥后得所述化合物。

作为优选的，在本发明的实施例中，式(Ⅱ)所示化合物与式(Ⅲ)所示化合物的摩尔质量比为1：2。

应当可以理解的是，可以采用式(Ⅳ)所示化合物代替式(Ⅲ)所示化合物按照上述方法制备本发明所述化合物。另外，应当可以理解的是，式(Ⅰ)所示化合物药学上可接受的盐可基于上述制备方法，通过游离碱或酸与等化学当量或过量酸(无机酸或有机酸)或碱(无机碱或有机碱)在合适的溶剂或溶剂组合物中反应制得。

一种药物组合物，包含至少一种药用辅料和作为活性成分的治疗有效量的上述化合物；所述药用辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

根据治疗目的可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂(溶液和悬浮液)等，优选片剂、胶囊、液体、悬浮液、和针剂(溶剂和悬浮液)。

上述药物组合物的给药方法没有特殊限制，可根据患者年龄、性别和其他条件及症状，选择各种剂型的制剂给药

上述化合物在制备用于治疗和预防对抑制Raf-1过量表达或活性紊乱具有响应的疾病的药物的用途。进一步的，所述疾病为癌症或其他纤维化疾病。更进一步的，所述癌症为癌症选自黑色素瘤和甲状腺癌、Barret腺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、血癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌症、胆道癌、子宫内膜癌、大肠结肠癌、组织细胞性淋巴瘤。更进一步的，所述纤维化疾病为所述纤维化疾病为放射性肺纤维化，酒精性或非酒精性肝硬化(肝纤维化)，慢性阻塞性肺疾病(肺纤维化)。。

具体实施方式

定义：

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所述技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。

术语“烷基”指的是C1-C10烃并且可以包括C6～C10芳族的碳环，烷基可以包含一个或更多个不饱和的基团，比如烯基和炔基。

术语“卤素”指的是氟、氯、溴、或碘，通常涉及核心结构中H原子的取代。

本发明技术方案的详细描述：

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明提供一种化合物，选自式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐：

式(Ⅰ)所示化合物的制备方法，以式(Ⅱ)和式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示化合物为原料制备而成：

具体制备方法包括：分别取式(Ⅱ)所示α,β-不饱和吲哚酯1mmol和式(Ⅲ)所示吡唑啉酮2mmol和三乙胺加入10ml乙醇(浓度70％)中室温下混合搅拌均匀，采用TLC监测反应进程，反应完成后冷却至室温，过滤得固体反应产物，将固体反应产物采用乙醇充分洗涤后干燥得所述化合物，其中产率可达到85％～90％。

其中式(Ⅲ)所示化合物还可用式(Ⅳ)所示化合物替代。

整个反应过程如下式(Ⅴ)所示：

实施例1

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-1)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-1)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-甲基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率85％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)11.41(br.s.,1H),7.77-7.91(m,2H),7.37-7.48(m,2H),7.34(t,J＝7.6Hz,1H),7.19-7.29(m,1H),7.03-7.19(m,2H),6.90(d,J＝7.8Hz,1H),4.04-4.19(m,3H),3.89(d,J＝4.4Hz,1H),3.29(s,3H),2.21(s,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H).；LRMS(ESI)m/z:407.5(M+H)⁺。

实施例2

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-2)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-2)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-乙基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率91％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)7.75-7.83(m,2H),7.37-7.46(m,2H),7.30-7.37(m,1H),7.17-7.25(m,2H),7.05-7.13(m,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,1H),4.07-4.18(m,3H),3.77-3.95(m,3H),2.21(s,3H),1.63(s,1H),1.29(t,J＝7.3Hz,3H),1.15-1.20(m,3H)；LRMS(ESI)m/z:421.3(M+H)⁺。

实施例3

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-3)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-3)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-异丙基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率89％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)10.12(br.s.,1H),7.75-7.91(m,2H),7.37-7.48(m,2H),7.30(t,J＝7.6Hz,1H),7.19-7.29(m,1H),7.06-7.16(m,2H),6.90(d,J＝7.8Hz,1H),4.04-4.25(m,3H),3.56(d,J＝4.4Hz,1H),3.29-3.30(m,1H),2.21(s,6H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H).；LRMS(ESI)m/z:407.5(M+H)⁺；LRMS(ESI)m/z:435.0(M+H)⁺。

实施例4

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-4)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-4)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率85％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)11.04(br.s.,1H),8.73(br.s.,1H),7.62-7.89(m,2H),7.30-7.46(m,3H),7.18-7.30(m,3H),6.93-7.18(m,2H),6.67-6.93(m,1H),4.00-4.27(m,3H),2.02-2.32(m,4H),1.15-1.24(m,3H)LRMS(ESI)m/z:391.6(M+Na)⁺。

实施例5

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-5)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-5)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-烯丙基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率91％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)7.75-7.83(m,2H),7.37-7.46(m,2H),7.30-7.37(m,1H),7.17-7.25(m,2H),7.05-7.13(m,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,1H),4.07-4.18(m,3H),3.77-3.95(m,3H),2.21(s,3H),1.63(s,1H),1.29(t,J＝7.3Hz,3H),1.15-1.20(m,3H)；LRMS(ESI)m/z:431.5(M+H)⁺。

实施例6

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-6)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-6)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-苄基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率91％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)7.75-7.83(m,7H),7.37-7.46(m,2H),7.30-7.37(m,1H),7.17-7.25(m,2H),7.05-7.13(m,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,1H),4.07-4.18(m,3H),3.77-3.95(m,3H),2.21(s,3H),1.9(s,2H),LRMS(ESI)m/z:481.02(M+H)⁺。

实施例7

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-7)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-7)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-丙基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率95％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)7.78-7.81(m,2H),7.37-7.42(m,2H),7.3-7.35(m,1H),7.12-7.22(m,2H),7.05-7.13(m,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,1H),4.07-4.18(m,3H),3.77-3.95(m,3H),2.21(s,3H),1.53(t,2H),1.2(s,3H),0.93(s,3H).；LRMS(ESI)m/z:433.2(M+H)⁺。

实施例8

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-8)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-8)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-辛基-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率88％；结构表征为¹H NMR(氘代氯仿,400MHz):δ(ppm)7.82-7.88(m,2H),7.37-7.40(m,2H),7.35-7.38(m,1H),7.05-7.21(m,2H),7.05-7.13(m,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,1H),4.07-4.18(m,3H),3.36(s,3H),12.6-1.29(m,10H),0.8(s,3H).；LRMS(ESI)m/z:504.5(M+H)。

实施例9

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-9)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-9)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-(3-溴代丙基)-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率85％；结构表征为¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ(ppm)11.20(br.s.,1H),7.45-7.54(m,2H),7.56(q,J＝8.1Hz,2H),7.05-7.21(m,4H),6.67-7.11(m,2H),3.91-4.32(m,6H),3.61(t,J＝6.5Hz,2H),1.80-2.20(m,3H),0.86-1.22(m,3H)；LRMS(ESI)m/z:512.1(M+H)。

实施例10

本实施例提供一种化合物，选自式(Ⅰ-10)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其制备方法的反应过程如下式(Ⅴ-10)所示：

具体制备过程包括：在室温下，将(Z)-2-(1-(2-溴代乙基)-2-氧吲哚啉-3-乙烯基)乙酸乙酯(1mmol)、吡唑啉酮(2mmol)和Et3N在10mL EtOH中的混合物搅拌。通过TLC进行监测，当反应完成后，反应混合物被冷却到室温，并从溶剂中过滤出固体产物。固体产物用乙醇洗涤以得到纯产品，白色固体，收益率85％；结构表征为¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz):δ(ppm)11.10(br.s.,1H),7.58-7.97(m,2H),7.44(q,J＝8.1Hz,2H),7.04-7.29(m,4H),6.67-7.04(m,2H),3.92-4.31(m,6H),3.64(t,J＝6.5Hz,2H),1.80-2.20(m,3H),0.86-1.22(m,3H).；LRMS(ESI)m/z:498.1(M+H)⁺。

试验例1本发明提供的上述化合物对Raf-1的抑制作用验证试验

试验材料：

分析缓冲液：50mM Tris，pH 7.5，15mM氯化镁，0.01％牛血清白蛋白(BSA)，1mM二硫苏糖醇(DTT)；

停止缓冲液：60mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.01％

20b-Raf(V600E)；

蛋白激酶抑制活性筛查试剂盒(Perkineller^TM，#676061 7R)；

抗磷酸-MEK1/2(Cell Signaling Technology，Inc.#9121)；

384孔低容量分析板(White

板)；

Raf-1激酶4nM；生物素化MEK1 10nM、本发明实施例制备的激酶抑制剂、ATP 1uM；

试验方法：

处于激酶失活状态的Raf-1、生物素化Mek在2倍于最终浓度的缓冲液(50mM Tris，pH7.5，15mM MgCI2，0.01％BSA和1mM DTT)中结合，将该溶液5ml分配到试验板(Greinerwhite 384well试验板#781207)中。后将0.25ml 40倍于100％DMSO稀释的Raf激酶抑制剂试验化合物溶液平均分配到该试验板，在室温下孵育60分钟。Raf激酶活性反应是在试液中将0.5ml稀释的2x ATP溶液分配到每孔后开始，1小时后停止反应，在每孔中抗磷酸-MEK1/2(Cell Signaling,#9121)antibody对产物进行磷酸化，采用蛋白激酶抑制活性筛查试剂盒(Perkineller^TM，#676061 7R)进行检测；在黑暗条件下添加抗体混合物、检测珠和停止缓冲液。将盖子放在孔板顶部，在室温下孵育1小时，然后在PerkinElmer Envision仪器上读取发光。采用XL-Fit数据分析软件，通过非线性回归计算各化合物的50％抑制浓度(IC50)。

使用上述分析，本发明化合物显示如表1所示的抑制效果：

表1选定的化合物结构和Raf抑制数据

由上述表1所示的试验结果可知，本发明提供的化合物对Raf-1激酶的活性具有显著的抑制作用。基于该试验结果，本发明化合物作为药物活性成分，对抑制Raf-1过量表达或活性紊乱具有响应的疾病的治疗和预防能够产生医学药用作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种化合物，其特征在于，选自式(Ⅰ)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其中R1选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、苯甲基、烯丙基、溴代乙基、溴代丙基、辛基。

2.一种如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，以式(Ⅱ)和式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示化合物为原料制备而成：

3.一种药物组合物，其特征在于，包含至少一种药用辅料和作为活性成分的治疗有效量的权利要求1～2中任一项所述化合物；所述药用辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

4.一种如权利要求1～2任一项所述化合物在制备用于治疗和预防对抑制Raf-1过量表达或活性紊乱具有响应的疾病的药物的用途。

5.如权利要求4所述用途，其特征在于，所述疾病为癌症或其他纤维化疾病。

6.如权利要求5所述用途，其特征在于，所述癌症为癌症选自黑色素瘤和甲状腺癌、Barret腺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、血癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌症、胆道癌、子宫内膜癌、大肠结肠癌、组织细胞性淋巴瘤。

7.如权利要求5所述用途，其特征在于，所述纤维化疾病为放射性肺纤维化，酒精性或非酒精性肝硬化，慢性阻塞性肺疾病。