PT1638574E

PT1638574E - Nova utilizaão de derivados de staurosporina

Info

Publication number: PT1638574E
Application number: PT04740016T
Authority: PT
Inventors: Steven Coutre
Original assignee: Novartis Ag; Novartis Pharma Gmbh
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2010-07-14
Also published as: HUS000503I2; US20070299049A1; CN1805749A; AU2004248909A1; HUS1700053I1; LUC00055I9; CN100457111C; NL300917I2; EP1638574A2; FR17C1063I1; CA2527703A1; WO2004112794A2; TWI324604B; JP5057780B2; MXPA05013722A; EP1638574B1; ES2344700T3; DK1638574T3; CY2017048I1; CY2017048I2

Description

ΡΕ1638574 1 DESCRIÇÃO "NOVA UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS DE STAUROSPORINA" A presente invenção relaciona-se com a utilização do derivado de staurosporina, MIDOSTAURINA, em forma livre ou sob a forma de um seu sal farmaceuticamente aceitável, na manufactura de uma composição farmacêutica para tratamento curativo, paliativo ou profilático de mastocitose; e com a utilização de MIDOSTAURINA para manufactura de um medicamento para utilização num método de tratamento de animais de sangue quente, preferencialmente seres humanos, em que é administrado ao animal de sangue quente sofrendo da doença ou condição acima mencionada, uma dose terapeuticamente eficaz de MIDOSTAURINA.

Kurosova et al. (Annals of Allergy, Set. De 1989, Vol. 63, N°. 3, páginas 231-234) revela que a staurosporina (composto 48/80) inibe a libertação de histamina a partir de mastócitos serosos de rato.

Amon et al. (Pharmacology 1993, 47, 200-208) revelam que a PKC412 inibe a activação imunológica (libertação de histamina) em mastócitos da pele humana e basófilos humanos.

Tharp et al. (Current Problems in Dermatology, 1998, Vol. 10, N°. 5, páginas 181-210) revela que a 2 ΡΕ1638574 mastocitose representa um espectro de distúrbios clínicos que resultam na anormal acumulação de tecidos de células mastoidais e que não existe cura para a mastocitose.

Lonqley et al. (Hematology/Oncology Clinicis in North America, Junho de 2000, Vol. 14, N°. 3, páginas (689-695) revela que algumas formas de mastocitose são causadas por mutações c-kit e que não existe terapia dirigida especificamente a uma causa de mastocitose. O DERIVADO DE STAUROSPORINA de acordo com a invenção é a N-[(9S, 10R, 11R, 13R)-2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-l-oxo-9,13-epoxi-lH,9H-diindo-lo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonil-ll-il]-N- metilbenzamida de fórmula (VII):

(VH) ou um seu sal (daqui em diante, "Composto de fórmula VI ou MIDOSTAURINA"). O Composto de formula VII também é conhecido por 3 ΡΕ1638574 MIDOSTAURINA [Denominação Comum Internacional] ou PKC412. A MIDOSTAURINA é um derivado do alcaloide de ocorrência natural, staurosporina, e foi especificamente descrito na Patente Europeia N°. 0 296 110, publicada em 21 de Dezembro de 1988, assim como na Patente US N° . 5 093 330, publicada em 3 de Março de 1992 e na Patente Japonesa N°. 2 708 047.

Verificou-se agora, com surpresa, que a MIDOSTAURINA possui propriedades terapêuticas que a tornam particularmente útil para o tratamento de mastocitose. Particularmente surpreendente é a Midostaurina ser também eficaz na prevenção ou tratamento da doença e condição aqui mencionada anteriormente, que desenvolveu resistência contra inatinib ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. A MIDOSTAURINA foi originalmente identificada como inibidora da proteína quinase C (PHC) (Meyer, T., Regenass, U., Fabbro, D. et al., Int. J. Câncer, 43: 851-856, 1989).

Consequentemente, a presente invenção relaciona-se com a utilização de MIDOSTAURINA para a preparação de um fármaco para tratamento de mastocitose. Adicionalmente, a presente invenção relaciona-se com a utilização de MIDOSTAURINA para a preparação de um fármaco para tratamento de mastocitose com resistência a imatinib ou a um seu sal farmaceuticamente aceitável. 4 ΡΕ1638574

Noutra realização, a presente invenção relaciona-se com um método para tratamento de mastocitose, desta doença e condição também com resistência a imatinib ou a um seu sal farmaceuticamente aceitável, compreendendo a administração ao mamífero necessitando de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de MIDOSTAURINA, de um seu sal farmaceuticamente aceitável ou de um seu pró-fármaco. A presente invenção também se relaciona com um método em que a quantidade terapeuticamente eficaz de composto de fórmula VII é administrada a um mamífero, 7 a 4 vezes por semana ou cerca de 100% a 50% de dias no período de tempo, durante um período de uma a seis semanas, seguido por um período de uma a três semanas em que o agente não é administrado, sendo este ciclo repetido de uma a diversas vezes.

Noutra realização, a presente invenção relaciona-se com a utilização de MIDOSTAURINA para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de mastocitose, mais particularmente para tratamento de mastocitose com resistência a imatinib. A actividade da MIDOSTAURINA, pode ser demonstrada, in vivo, por exemplo, pou uma única ou até três administrações orais por dia, a animais, com intervalos de dosagem de 0,1 a 10 ou 1 a 5 mg/kg de peso corporal por dia. 5 PE1638574 A mastocitose pode, em alguns casos, ser tratada com o inibidor da tirosina quinase imatibina, mas frequentemente ocorre relapso e verificou-se com surpresa que a MIDOSTAURINA ainda é activa neste casos. A dosagem precisa de MIDOSTAURINA a ser empregue para tratamento da doença e condição aqui anteriormente mencionada, depende de diversos factores, incluindo o hospedeiro, a natureza e gravidade da condição a ser tratada, do modo de administração. Contudo, em geral, podem ser conseguidos resultados satisfatórios quando a MIDOSTAURINA é administrada parenteralmente, e.g., intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, intratumoralmente ou rectalmente ou enteralmente, e.g., oralmente, preferencialmente intravenosamente ou, preferencialmente, oralmente, com uma dose diária intravenosa de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, preferencialmente de 1 a 5 mg/kg de peso corporal. Em ensaios com seres humanos, uma dose total de 225 mg/dia foi, presumivelmente, a Dose Máxima Tolerada (DMT). Uma dosagem diária intravenosa preferida é de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal ou, para a maior parte dos primatas maiores, uma dosagem diária de 200-300 mg. Uma dosagem intravenosa típica é de 3 a 5 mg/kg, três a cinco vezes por semana. A MIDOSTAURINA é, mais preferencialmente, administrada oralmente, por meio de formas de dosagem tais como microemulsões, geles macios ou dispersões sólidas, em dosagens até 250 mg/dia, em particular 225 mg/dia, 6 ΡΕ1638574 administrados uma, duas ou três vezes por dia.

Geralmente, é administrada inicialmente uma dose baixa e aumenta-se gradualmente a dosagem até se determinar a dosagem óptima para o paciente em tratamento. 0 limite superior de dosagem é o imposto pelos efeitos laterais e pode ser determinado por ensaios no paciente em tratamento. A MIDOSTAURINA pode ser combinada com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, um ou mais outros adjuvantes farmacêuticos convencionais e ser administrada enteralmente, e.g., oralmente, sob a forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos revestidos, etc., ou parenteralmente, e.g., intraperitonealmente ou intravenosamente, sob a forma de soluções ou suspensões estéreis injectáveis. As composições enterais e parenterais podem ser preparadas por formas convencionais.

As soluções para infusão de acordo com a presente invenção são preferencialmente estéreis. Isto pode ser facilmente conseguido, e.g., por filtração através de filtração estéril. A formação asséptica de qualquer composição em forma liquida, o enchimento asséptico de frascos, e/ou a combinação de uma composição farmacêutica da presente invenção com um diluente adequado, sob condições assépticas, são condições bem conhecidas pelos técnicos da matéria. A MIDOSTAURINA pode ser formulada tanto em 7 ΡΕ1638574 composições farmacêutica entéricas como parenterais contendo uma quantidade de substância activa que seja eficaz para tratamento da doença e condição aqui acima nomeada, estando tais composições numa forma de dosagem unitária e compreendendo tais composições um veiculo farmaceuticamente aceitável. A MIDOSTAURINA pode ser utilizada só ou combinada com pelo menos um outro composto farmaceuticamente activo para utilização nestas patologias. Estes compostos activos podem ser combinados na mesma preparação farmacêutica, ou na forma de preparações combinadas, "kit de componentes", no sentido que os componentes da combinação podem ser doseados independentemente ou por utilização de diferentes composições fixas, com quantidades distintas de componentes da combinação, i.e., simultaneamente ou em diferentes pontos temporais. As partes do Kit de componentes podem, e.g., ser administradas simultaneamente ou cronologicamente desfasados, quer dizer, em diferentes pontos temporais e com intervalos de tempo iguais ou diferentes para qualquer dos componentes do kit de componentes. Exemplos não-limitantes de compostos que podem ser citados para utilização em combinação com a MIDOSTAURINA, são fármacos quimioterápicos citotóxicos, tais como citosina arabinósido, daunorubicina, doxorubicina, ciclofosfamida, VP-16 ou imatinib, etc. Adicionalmente, a MIDOSTAURINA pode ser combinada com outros inibidores da transducção de sinal ou outros fármacos dirigidos a oncógenos, com a expectativa que resulte uma sinergia significativa. ΡΕ1638574

Exemplos de composições úteis sao descritas nas Patente Europeia N° . 0 296 110, N° . 0 657 164, N° . 0 733 372, N°. 0 711 556 e N°. 0 711 557.

As composições preferidas são descritas na

Patente Europeia N°. 0 657 164, publicada em 14 de Junho de 1995. As composições farmacêuticas descritas compreendem uma solução ou dispersão de compostos de fórmula I, tal como a MIDOSTAURINA, num glicérido saturado de polialquileno glicol, em que o glicérido de glicol é uma mistura de esteres de glicerilo e de polietileno glicol de um ou mais ácidos gordos C8-C18 saturados. São seguidamente descritos dois processos de manufactura de tais composições.

Composição A:

Fundiu-se Gelucire 44/14 (82 partes) por aquecimento a 60°C. Adicionou-se MIDOSTAURINA em pó (18 partes) ao material fundido. Homegenizou-se a mistura resultante e introduziu-se a dispersão obtida em cápsulas de gelatina rija de diferentes tamanhos, de modo a algumas conterem uma dosagem de 25 mg e outras uma dosagem de 75 mg de MIDOSTAURINA. As cápsulas resultantes são adequadas para administração oral. PE1638574 9

Composição B:

Fundiu-se Gelucire 44/14 (86 partes) por aquecimento a 60°C. Adicionou-se MIDOSTAURINA em pó (14 partes) ao material fundido. Homogeneizou-se a mistura resultante e introduziu-se a dispersão obtida em cápsulas de gelatina rija de diferentes tamanhos, de modo a algumas conterem uma dosagem de 25 mg e outras uma dosagem de 75 mg de MIDOSTAURINA. As cápsulas resultantes são adequadas para administração oral. A Gelucire 44/14 é disponibilizada comercialmente por Gattefossé; é uma mistura de esteres ácidos gordos C8-C18 saturados com glicerol e um polietileno glicol, possuindo um peso molecular de cerca de 1500, sendo as especificações para a composição do componente ácido gordo do produto, em peso, de 4-10% de ácido caprilico, 3-9% de ácido cáprico, 40-50% de ácido láurico, 14-24% de ácido miristico, 4-14% de ácid palmitico e 5-15% de ácido esteárico.

Um exemplo preferido de formulação com Gelucire, consiste em:

Gelucire (44/14): 47 g MIDOSTAURINA: 3,0 g, enchendo frascos Twist off de 60 mL. 10 PE1638574

Um exemplo preferido de gel macio conterá a seguinte microemulsão:

Glicéridos de óleo de milho 85, 0 mg Polietilenoglicol 400 128,25 mg Cremophor RH 40 213,75 mg MIDOSTAURINA 25, 0 mg DL alfa tocoferol 0,5 mg Etanol absoluto 33, 9 mg Total 486, 4 mg

Contudo, deve ser claramente entendido que se destina apenas a fins ilustrativos.

Numa realização preferida, esta invenção relaciona-se com a utilização ou o método tal como aqui descrito, em que a quantidade eficaz diária de composto de fórmula VII, é de 100 a 300 mg, preferencialmente de 125 a 250 mg, mais preferencialmente de 220 a 230 mg, preferencialmente, 225 mg.

Mais preferencialmente, o composto de fórmula VII é administrado uma, duas ou três vezes por dia, para uma dose diária total de 100 a 300 mg.

Numa realização muito preferida, o composto de fórmula VII é administrado três vezes por dia, para uma dose diária total de 220 a 230 , preferencialmente, 225 mg, e preferencialmente com uma administração, por dose, de 70 11 ΡΕ1638574 a 80 mg, preferencialmente 75 mg.

Ainda noutra realização, a invenção relaciona-se com um artigo de manufactura, compreendendo material de embalagem e N-[(9S, 10R, 11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-meti1-1-oxo-9,13-epoxi-lH,9H-diindo-lo[1, 2,3-gh:3',2',l'-lm]pirrolo[3,4-j][l,7]benzodiazonil-ll-il]-N-metilbenzamida de fórmula (VII) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, contido no referido material de embalagem, compreendendo esse material um rótulo indicando que referido composto de fórmula (VII) ou sal farmaceuticamente aceitável deve ser administrado ao mamífero sofrendo de rinite alérgica, dermatite alérgica, alergia farmacológica ou alergia alimentar, angioedema, urticária, síndroma de morte súbita infantil, aspergilose broncopulmonar, esclerose múltipla ou mastocitose, numa quantidade desde 50 a 500 mg, preferencialmente de 100 a 300 mg, preferencialmente de 125 mg a 250 mg, mais preferencialmente, 220 a 230 mg, mais preferencialmente, 225 mg, seguindo um regime específico de dosagem, para inibir o desenvolvimento das doenças e condições acima mencionadas. A invenção também se relaciona, preferencialmente, com um artigo manufacturado em que o composto de fórmula VII é administrado três vezes por dia, para uma dose total de 220 a 230 mg, preferencialmente, 225 mg diários e, preferencialmente, uma dose de 70 a 80 mg, mais preferencialmente, 75 mg, por administração, para o 12 PE1638574 tratamento de síndroma hipereosinofílico ou síndroma hipereosinofílico com resistência a imatinib. Uma realização preferida relaciona-se com um artigo manufacturado compreendendo cápsulas de gelatina mole contendo 25 mg de composto de fórmula VII. A invenção também se relaciona com a combinação de MIDOSTAURINA, como aqui acima descrito, com imatinib, para o tratamento de doenças e condições aqui acima descritas. A administração da tal combinação pode ser efectuada, simultaneamente, por exemplo, na forma de composição ou preparação farmacêutica combinada fixa ou sequencialmente ou separada no tempo. A administração de MIDOSTAURINA numa forma de dosagem como acima descrito e de imatinib, na sua forma comercial GLEEVEC® nos US/GLIVEC® na Europa e com as dosagens calculadas para estas formas de dosagem, é actualmente preferida. 0 tratamento de mastocitose com a combinação acima, pode constituir uma chamada primeira linha de tratamento, i.e., o tratamento de uma doença recentemente diagnosticada, sem qualquer quimioterapia ou outro tratamento anterior, ou pode constituir a chamada segunda linha de tratamento, i.e., o tratamento da doença após um tratamento anterior com imatrinib ou MIDOSTAURINA, dependendo da gravidade ou estádio da doença, assim como da condição geral do paciente, etc. 0 termo “alergia farmacológica ou alergia 13 ΡΕ1638574 alimentar", tal como aqui utilizado, refere-se a uma reacção alérgica produzida por um fármaco ou pela ingestão de antigenos, tais como, por exemplo, morangos, leite ou ovos. 0 termo "mastocitose", tal como aqui utilizado, relaciona-se com mastocitose sistémica, por exemplo, mastocitoma, e também com neoplasias de células mastóides caninas. A mastocitose é um distúrbio mieloproliferativo com opções limitadas de tratamento e geralmente um prognóstico pouco favorável. A patogénese da mastocitose tem sido atribuída à activação constitutiva do receptor tirosina quinase KIT. Numa grande maioria de pacientes com mastocitose, a actividade desregulada da tirosina quinase do KIT é devida a uma mutação no codão 816 da proteína (D816V), o que também lhe confere resistência, in vitro e in vivo, à imatibina ou ao mesilato de imatibina, este último sendo comercializado como Gleevec® nos Estados Unidos e como Glivec® no resto do mundo.

Os mastócitos têm um papel importante como células efectoras de primeira linha nos distúrbios alérgicos aqui mencionados. A desgranulação antigénio-específica mediada por IgE dos mastócitos conduz à subsequente libertação de mediadores químicos e múltiplas citoquinas e à síntese de leucotrieno. Adicionalmente, os mastócitos estão envolvidos na patogénese da esclerose múltipla. 14 ΡΕ1638574

As neoplasias dos mastócitos ocorrem tanto nos seres humanos como nos animais. Nos cães, as neoplasias dos mastócitos são chamadas mastocitomas, e a doença é vulgar, representado 7%-21% dos tumores caninos. Deve ser feita uma distinção entre a mastocitose humana, que é geralmente transitória ou indolente, e a neoplasia dos mastócitos caninos, que se comporta de forma imprevisível e é, com frequência, agressiva e metastática. Por exemplo, os mastocitomas humanos solitários não metastizam com frequência; em contraste, 50% dos mastocitomas caninos comportam-se de forma maligna, como estimado por Hottendorf & Nielsen (1969), depois de revisão de 49 relatórios publicados sobre tumores em 938 cães. 0 cancro, na população de cães, é uma doença espontânea. Os donos dos animais, motivados pelo prolongamento da qualidade de vida dos seus animais, procuram, com frequência, cuidados e tratamentos especializados de veterinários oncologistas, em hospitais veterinários privados e em hospitais veterinários escolares, em todo o país. As modalidades terapêuticas dos pacientes veterinários com cancro são semelhantes às humanas, incluindo cirurgia, quimioterapia, terapia com radiação e bioterapia. Estima-se que existam 42 milhões de cães e aproximadamente 20 milhões de gatos nos Estados Unidos. Utilizando estimativas grosseiras sobre a incidência de cancro, existem, grosso modo, 4 milhões de novos diagnósticos de cancro em cães e um número similar em gatos, efectuados cada ano. 15 ΡΕ1638574

Tumores dos mastócitos cutâneos em cães, são um problema vulgar. A maioria dos tumores dos mastócitos são benignos e curados por ablação simples; contudo, se recorrentes ou se metastizarem para locais distantes, as opções terapêuticas são limitadas. As opções de tratamento para lesões recorrentes podem incluir terapia externa com feixe de radiação. Para metástases distantes ou doença disseminada, a utilização de protocolos de quimioterapia contendo Lomustina® e vinblastina, demonstraram algum beneficio. Os locais para as metástases tumorais de mastócitos, incluem a pele, nódulos linfáticos regionais, baço, figado e medula óssea. 0 envolvimento do receptor KIT na patogénese da mastocitose é sugerido pela observação que têm sido detectadas diversas mutações que resultam na activação constitutiva do KIT em diversas linhas de mastócitos. Por exemplo, um ponto de mutação no c-KIT humano, que provoca a substituição de Vai por Asp816 no domínio fosfotransferase e no receptor de autoactivação, ocorre numa linha de células de leucemia de longo prazo de mastócitos humanos (HCM-1) e no correspondente codão em duas linhas de células de roedores. Contudo, esta mutação activante tem sido identificada in situ, em alguns casos de mastocitose humana. Duas outras mutações activantes foram encontradas na região justamembranar intracelulas do KIT, i.e., a substituição Val560Gly na linha de mastócitos HMC-1 humanos e uma ausência de sete amino ácidos (Thr573-His579) numa linha de mastócitos de roedores chamada FMA3. 16 PE1638574

Pode ser demonstrado por modelos de teste estabelecidos e especialmente pelos modelos de teste aqui descritos, que a MIDOSTAURINA ou, em cada caso, um seu sal farmaceuticamente aceitável, resulta numa prevenção eficaz ou, preferencialmente, tratamento de pelo menos uma das doenças aqui acima mencionadas. 0 técnico da matéria é perfeitamente capaz de seleccionar um modelo de teste relevante para provar as indicações terapêuticas aqui acima e abaixo indicadas e efeitos benéficos. A actividade farmacológica pode, por exemplo, ser demonstrada num estudo clinico ou num procedimento de teste como descrito, em essência, abaixo.

Exemplo 1

Este Exemplo demonstra os efeitos in vitro da MIDOSTAURINA sobre o desenvolvimento dependente de SCF de mastócitos humanos cultivados, gerados a partir de células CD34+ de sangue do cordão, utilizando o sistema de cultura descrito por Kinoshita, T., Sawai, N. et al., em Blood, 1999, 94, 496-508. Mais de 90% das células isoladas eram CD34 positivas, de acordo com a análise citométrica de fluxo.

Reagentes e anticorpos

Solubilizou-se a MIDOSTAURINA em DMSO, a uma concentração de 10~2 M e armazenou-se a -80°C. Dissolveu-se ácido All-trans retinóico (Sigma) em etanol a uma 17 PE1638574

concentração de 1CT2 M e armazenou-se a -80°C em frascos portegidos da luz. A mAb para triptase (MAB1222) pôde ser adquirida a Chemicon International Inc., CA. Para a análise citométrica de fluxo, a mAbs para as CD34 (8G12, FITC) e CDllb (Leu 15, PE) foram adquiridas a Becton Dickinson Immunocytometry Systems (Mountain View, CA) e a mAb para as CD41 (SZ22, FITC) a Immunotech S.A. (Marselha, França). A mAb para glicoforina A (GPA, JC159, FITC) pode ser obtida a Dako (Glostrup, Dinamarca). Para o Western blotting e imunoprecipitação, a mAbs para c-kit (NU-c-kit) e para a fosfotirosina (4G10) podem ser adquiridos a Nichirei e Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY) , respectivamente.

Culturas em suspensão

Efectuaram-se culturas liquidas sem soro em placas de cultura de 24 poços (#3047; Becton Dickinson). Cultivaram-se vinte mil células CD34+ em cada poço contendo 2 mL de meio a suplementado com 1% de BSA, 300 μg/mL de transferritina humana totalmente saturada com ferro (pureza de aproximadamente 98%,Sigma), 16 μg/mL de lecitina de soja (Sigma), 9,6 μg/mL de colesterol (Nakalai Chemicals, Japão) e 20 ng/mL de SCF, 10 ng/mL de GM-CFS, 2 U/mL de EPO, 10 ng/mL de TPO, diferentes concentrações de MI DOSTAURINA, só ou em combinação. De modo a examinarem-se os efeitos da MIDOSTAURINA sobre o desenvolvimento de células mastóides dependentes de SCF, utilizaram-se como células alvo, células cultivadas durante 10 semanas células sanguíneas 18 PE1638574 CD34+ do cordão com 20 ng/mL de SCF. Incubaram-se cinco a dez x 104 células cultivadas durante duas semanas em placas de cultura contendo 20 ng/mL de SCF, com várias concentrações de, ou sem MIDOSTAURINA. Incubaram-se as placas a 37°C, em atmosfera humidificada, composta por 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2. Após 4 semanas de cultura, metade do meio de cultura é substituído de duas em duas semanas com meio fresco contendo o(s) factor(es). O número de células viáveis é determinado pelo teste de exclusão com azul de tripano, utilizando um hemocitómetro.

Cultura de células clonais

Os ensaios de colónias de células mastoidais foram efectuados em placas de cultura em suspensão Lux de 35 mm (#171099; Nunc, IL) . A cultura consistiu em células cultivadas durante 10 semanas (4 000 células/mL) com 10 ng/mL de SCF, meio alfa, 0,9% de metilcelulose (Shinetsu Chemical, Japão), 1% de BSA, 300 μρ/mL de transferrina humana totalmente saturada com ferro, 16 μρ/ηίί de lecitina de soja, 9,6 pg/mL de colesterol e 100 ng/mL de SCF, com ou sem 10~6 M de MIDOSTAURINA. As placas foram incubadas a 37°C, em atmosfera humidificada, com uma mistura de 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2. Após 4 semanas, agregados consistindo em 30 ou mais células foram contados como colónias de células mastoidais, e as consistindo em agrupamentos de 10 a 29 células, como grupos de células mastoidais. Recolheram-se 30 colónias e grupos individuais e trataram-se com anti-triptase mAb ou com IgGl de rato, 19 ΡΕ1638574 utilizando a técnica da fosfatase alcalina-anti-fosfatase alcalina (APAAP). Quase todas as células constituintes foram positivas à triptase.

Colorações citoquímicas e imunoquímicas

Espalharam-se as células cultivadas em lâminas de vidro utilizando um Cytospin II. Realizou-se a reacção citoquímica com peroxidase (POX) segundo o método convencional. A reacção com mAb contra triptase foi detectada utilizando o método APAAP (Dako APAAP Kit System, Dako Corp., CA), como descrito por F. Ma, K. Koike et al., in Br. J. Haematol., 1998, 100, 427-35.

Imunoprecipitação e Western blotting

Realizaram-se a Imunoprecipitação e Western blotting, como descrito por T. Kamijo, K. Koike, et al., in Leuk. Res., 1997, 21, 1097-106.

Análise citométrica de fluxo

Para a análise de marcadores de superfície nas células cultivadas, recolheram-se 1-2 x 105 células para tubos de plástico e incubaram-se com a diluição apropriada de FITC- ou PE-mAb, como descrito por Kinoshita, T., Sawai, N. et al., in Blood, 1999, 94, 496-508 . Lavaram-se as células duas vezes, após o que os seus marcadores de superfície foram analisados com o citómetro de fluxo 20 PE1638574 FACScan. As células viáveis foram reunidas de acordo com as suas caracteristicas de dispersão de luz frontal e as caracteristicas de dispersão de luz lateral. A proporção de células positivas foi determinada por comparação com células marcadas com o isotipo FITC- ou Pe-conjugado de rato coincidente com Ig.

Detecção de apoptose celular A detecção da apotose celular foi efectuada por análise citométrica de fluxo, utilizando iodeto de propídio (PI, Sigma), de acordo com o procedimento descrito por N. Sawai, K. Koike, et al., in Stem Cells, 1999, 17, 45-53. De modo a reduzir as células em apoptose, necrose ou as já mortas, pode utilizar-se centrifugação em gradiente de percoll. Colocam-se as células cultivadas durante dez semanas numa camada de 27% de Percoll (Sigma) em meio a e 54% de Percoll em PBS. Após centrifugação, recolhem-se as células no interface das duas concentrações diferentes da solução de Percoll, lavam-se com PBS e tratam-se com 1 mL de Ortho PermeaFix™ durante 40 min., à temperatura ambiente. As células são depois incubadas com RNase sem DNase (Sigma) durante 15 min. a 37°C e coloram-se com PI durante 15 min. O teor de DNA de 2 x 104 células é monitorizado com um citómetro de fluxo. As células cultivadas durante 10 semanas (2 x 106) expostas a SCF ou SCF e MIDOSTAURINA são lisadas durante 10 min., sobre gelo, num tampão de lise hipotónico [10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM de EDTA, pH 8,0, 0,5% de Triton X-100]. Após centrifugação 21 ΡΕ1638574 durante 10 min. a 14 000 g, transfere-se o sobrenadante para um novo tubo e trata-se com 0,2 mg/mL de RNase A (Sigma) e 0,2 mg/mL de Proteinase K (Sigma). Precipita-se o DNA com 120 μΡ de isopropanol e 20 μΡ de NaCl, até ao dia seguinte, a -20°C. Após centrifugação a 14 000 g, seca-se o depósito, dissolve-se em 20 mL de Tris-EDTA e analisam-se as amostras por electroforese em gel com 2% de agarose e coloração com brometo de etidio.

Ensaio dos níveis de histamina, triptase e citoquina

As concentrações de histamina nos lisados celulares obtidos pelo tratamento de células cultivadas com 0,5% de Nonidet P-40 e no sobrenadante, são medidas com um kit RIA, Histamine Radioimmunoassay (Immunotech), como descrito em Kinoshita, T., Sawai, N. et al. in Blood, 1999, 94, 496-508.

Análise estatística

Todas as experiências devem ser realizadas pelo menos três vezes. Para determinar a significância das diferenças entre dois grupos independentes, pode ser utilizado o teste t não emparelhado ou o teste U de Mann-Whitney, quando os dados não são normalmente distribuídos.

Exemplo 2: Métodos 22 PE1638574

Reagentes: Novartis Pharma; Basileia, Suíça: PKC412 ou MIDOSTAURINA para utilização nestas experiências. Preparam-se soluções-mãe 10 mM de inibidor antes de cada experiência, dissolvendo o composto em 1 mL de DMSO (sulfóxido de dimetilo).

Anticorpos: utilizou-se um anticorpo policlonal de coelho anti-KIT (c-kit Ab-1) numa diluição de 1:500 (c-kit Ab-a; Oncogene, Cambridge, MA) . Utilizou-se um anticorpo anti-fosfotirosina (PY20) numa diluição de 1:1000 (PY20; Transduction Laboratories; Lexington, KY). Utilizou-se um anticorpo conjugado peroxidase cabra anti-rato numa diluição de 1:5000 e anticorpo de cabra anti-coelho numa diluição de 1: 10 000 (Pierce; Rockford, IL).

Linhas de células: adquiriram-se ao Dr. George Caughey (Universidade da Califórnia em S. Francisco, SãoFrancisco, CA) linhas de células BR e C2 de mastocitoma canino. Ambas as linhas de células foram mantidas em DMEM suplementado com 2% de vitelo, 1 mM de L-glutamina, 12,5 mM de HEPES (pH 7,5), 0,25 mg/mL de Histidina, 1% de Penicilina-Estreptomicina e 1% de fungizone. As células BR e C2 são derivadas de células mastócitas tumorais caninas e foram originalmente estabelecidas na cultura a longo termo após passagem inicial em murganho imunodeficientes (DeVinney, R. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1990; 3 (5) : 413-420; Lazarus, S.C. et al., Am. J. Physiol., 1986; 251(6 Pt 1) :C935-C944) . A linha de células BR possui um ponto de mutação (T1752C) resultando numa substituição de 23 ΡΕ1638574

Leucina por Prolina no amino ácido 575 (domínio justamembranar). A linha de células C2 possui uma duplicação de tandem interno (ITD) na região justamembranas KIT. A translação deste ITD resulta na reduplicação dos resíduos amino ácido no terminal 3' do exão 11 (London, C.A. et al., Exp. Hematol. 1999; 2 7 ( 4) : 6 89-6 9 7; Ma, Y. et al., J. Invest. Dermatol., 1999; 112(2):165-170).

Ensaios de proliferação: Colocaram-se as células em placas de 96 poços, a uma densidade de 40 000 células/Poço em meio de cultura normal e diversas concentrações de SAL I. A proliferação é medida às 48-72 horas utilizando um ensaio com base em XTT (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) (Heinrich, M.C. et al., Blood, 2000; 96(3):925-932).

Lisados de Proteínas: lavaram-se as células BR e C2 x2 em PBS e quiesceram em Optimem (Gibco-BRL) a 37°C durante aproximadamente 18 horas. Incubaram-se depois as células durante 90 minutos em presença de diversas concentrações de PKC412. Após esta incubação, as células são precipitadas e lisadas utilizando 100-250 μΕ de tampão de lise de proteínas (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,25% de deoxicolato, com adição dos inibidores aprotinina, leupeptina, pepstatina, PMSF e ortovanadato de sódio [Sigma]). Realizou-se a análise Western immunoblot como descrito anteriormente (Hoatlin, M.E. et al., Blood, 1998; 91(4): 1418-1425; Heinrich, M.C. et al., Blood, 2000; 96 (3) : 925-932) . ΡΕ1638574 - 24 -

Exemplo 3: o COMPOSTO 1 inibe a KIT quinase constitutivamante activada com células mastoidais de tumores caninos.

Para testar a eficácia do COMPOSTO I na inibição da actividade da quinase em formas mutantes de KIT canina, utilizaram-se duas linhas de células (BR e C2) que expressam duas isoformas constitutivamente activadas de KIT. As mutações da KIT nestas linhas de células estão ambas localizadas no domínio justamembranar e são homólogas de mutações observadas em Tumores do Estroma Gastrointestinal humano (GIST) (Lux, M.L. et al., Am. J. Pathol., 2000; 156 (3) :791-795; Rubin, B.P. et al., Câncer Res., 2001; 61(22):8118-8121). Os lisados preparados a partir de células BR e C2 são sondados com um anticorpo anti-P-Tyr e a activação do receptor KIT é avaliada medindo a autofosforilação. Como relatado anteriormente, observou-se a autofosforilação do KIT nestas células, na ausência de SLF (MA, Y. et al., J. Invest. Dermatol., 1999; 112(2):165-170; Ma, Y. et al., Journal of Investigative Dermatology, 2000; 114(2):392-394).A inibição da autofosforilação so KIT pela PKC412 é dependente da dose, observando-se inibição completa utilizando doses de 10 e 1,0 μΜ. Observa-se inibição quase completa utilizando uma dose de 0,1 μΜ. Observa-se autofosforilação limitada do c-KIT utilizando doses de 0,001-0,01 μΜ de PKC412. Assim, a PKC412 não inibe apenas a autofosforilação do receptor c-KIT mutado, nestas células, mas também é um inibidor mais potente deste receptor mutado, do que no tipo do receptor c-Kit selvagem 25 PE1638574 (IC50 10 0-2 Ο OnM) . Para determinar se a PKC412 modulava a expressão da proteína KIT, removeu-se a membrana e sondou-se com um anticorpo anti-c-kit. Não houve alteração na expressão da proteína c-kit em células tratadas com PKC412. Consequentemente, a PKC412 diminui a autofosforilação do polipéptido kit canino mutado por inibição da actividade da KIT quinase, em vez de por sub-regulação da expressão da proteína KIT.

Exemplo 4: O COMPOSTO I inibe a proliferação de linhas de células de tumores de mastócitos caninos

Para testar o efeito biológico da inibição da actividade da quinase de um receptor c-kit mutante, cultivaram-se células BR ou C2 durante 48-72 horas em presença de diversas concentrações de PKC412. Em concentrações de inibidor de 1-10 μΜ, a proliferação diminui em 90-95%, em comparação com células tratadas apenas com meio. Verifica-se inibição parcial da proliferação em doses de 0,001-0,01 μΜ de PKC412.

Consequentemente a PKC412 inibe a proliferação das células BR e C2, no mesmo intervalo dose-resposta, observado na inibição do receptor de autofosforilação. As observações morfológicas das células tratadas revelaram alterações consistentes com apoptose.

Exemplo 5: Exemplo de perspectiva de uma série de casos de cães de estimação com tumores cutâneos mensuráveis de mastócitos. 26 ΡΕ1638574

Os pacientes em estudo são cães de estimação com tumores de mastócitos, mensuráveis e histológicamente confirmados. Os casos foram limitados aos com lesões mensuráveis, amostráveis por biópsia

Os critérios de elegibilidade são: - tumores cutâneos de mastócitos, mensuráveis e histológicamente confirmados - os casos vão requerer uma série de biopsias com punção de Keyes de 2mm, antes e durante o tratamento - grau histológico (II - intermédio ou III pouco diferenciado estatuto de desempenho, 0 ou 1 (Kamofsky modificado - Tabela 1) consentimento do dono informado. (a) Os critérios de exclusão, são: - quimioterapia citotóxica concorrente - prednisona e fármacos anti-inflamatórios não esteroidais não se podem iniciar nos 30 dias que antecedem o estudo; se estiverem a ser administrados prednisona ou fármacos anti-inflamatórios não esteroidais há mais de 30 dias, podem ser continuados - Testes anormais de ácidos biliares no soro (função hepática) 27 PE1638574

Tabela 1: Estatuto de desempenho (Kamofsky modificado) Grau Descrição 0 Actividade normal 1 Actividade restrita; diminuição de actividade em relação as estatuto anterior à doença 2 Comprometido; ambulatório apenas para as actividades vitais; defeca e urina consistentemente em áreas aceitáveis 3 Incapaz; deve ser alimentado à força; incapaz de confinar as necessidades fisiológicas a áreas aceitáveis 4 Morto A avaliação pré-tratamento incluiu, em todos os casos, exame físico, contagem sanguínea completa, separação de leucócitos e plaquetas (buffy coat), bioquímica do soro, análise de urina, ácidos biliares no soro (em jejum e pós prandial), documentação sobre o tamanho dos nódulos linfáticos regionais, radiografias abdominais e ultrasons abdominais. 0 regime de tratamento foi de 25 mg/kg PO, QD x 60 dias de MIDOSTAURINA.

Continuou-se o tratamento, em todos os casos, durante 60 dias, a menos que se notasse progressão da doença. Nos casos que experimentaram resposta parcial ou resposta completa, considerou-se a continuação da terá+pia por mais 60 dias. Os casos que completaram com sucesso a 28 PE1638574 terapia, foram elegíveis para repetição de entrada para estudo.

Tabela 2; Plano de tratamento e de avaliaçao clínica

Acção Dia 0 Dia 7 Dia 14 Dia 28 ql4 dias Seriação clínica1 X X X Exame físico X X X X X Massa total do tumor2 X X X X X Início de MIDOSTAURINA, 25 mg/kg QD X Farmacocinética3 X Biopsia incisional4 X X Repetição da seriação X 1 Seriação inicial consiste em exame físico, CBC, separação de leucócito e plaquetas, bioquímica do soro, testes da função hepática (ácidos biliares no soro)análise de urina, radiografias abdominais e ultrasons abdominais. A reavaliação pode consistir apenas em exame físico e medida da massa tumoral ou na repetição da seriação clínica. 2 A massa total do tumor é medida nos dias 0, 7, 14, 28 e depois de 14 em 14 dias. A resposta ao tratamento será definida contra lesão(ões) cutânea mensurável e outras lesões identificadas dos estádios (CR, PR, SD, PD, 29 ΡΕ1638574 definidas abaixo). 3 A recolha de plasma dos primeiros 5 casos é efectuada 0, 0,5, 1, 2, 5, 8, 12, 16 e 24 horas após a primeira dose de MIDOSTAURINA. 4 A biopsia incisional em lesões definidas mensuráveis foi efectuada nos dias 0 e 28 em todos os casos. Efectuam-se biopsias adicionais no tempo de resposta parcial (PR) e após resposta objectiva completa (CR) . A eficácia da MIDOSTAURINA é avaliada contra células mastoidais cutâneas mensuráveis, utilizando sinais clínicos. Os sinais biológicos podem ser tomados a partir de uma série de biopsias recolhidas a partir dos tumores cutâneos e a partir de amostras de sangue disponibilizadas no decurso do tratamento.

Os sinais clínicos incluem ritmo de resposta de tumores mensuráveis, resposta objectiva contra tumores mensuráveis e período de tempo até à progressão de tumores mensuráveis. Todos os efeitos laterais adversos serão registados. "Respostas Objectivas de Tumores", como definido abaixo, são observadas sob tratamento com MIDOSTAURINA e indicam a eficácia do regime de tratamento.

Em particular, podem ser observadas Respostas Completas e Respostas Parciais ao tratamento com MIDOSTAURINA. Adicionalmente, pode ser observado que mais 30 PE1638574 animais sob tratamento exibem Doença Estável, enquanto que nemos animais tratados exibem Doença Progressiva. Também pode ser observado que menos animais em tratamento exibem Relapso da doença, em comparação com animais não tratados. O Período até à Progressão, a Duração da Remissão e a Sobrevivência podem aumentar em animais sob tratamento com MIDOSTAURINA. "Resposta Completa (CR)" é definida como o desaparecimento de todas as provas clínicas de cancro e de quaisquer sinais relacionados com o cancro. "Resposta Parcial (PR)" é definida como uma diminuição em 50% ou superior da soma dos produtos das medidas de lesões representativas, sem aumento de tamanho de quaisquer lesões ou aparecimento de qualquer nova lesão. "Doença Estável (SD)" é definida como sem resposta ou uma resposta inferior à definida para aresposta parcial ou doença progressiva, sem aparecimento de quaisquer novas lesões ou agravamento dos sinais clínicos. "Doença Progressiva (PD)" é definida como um aumento inequívoco de, pelo menos, 50% de tamanho de qualquer lesão mensurável ou aparecimento de novas lesões. "Relapso (R) " é definido como o aparecimento de novas lesões ou reaparecimento de antigas lesões em cães que tiveram uma resposta completa; em cães que tiveram 31 PE1638574 apenas uma resposta parcial, o relapso foi definido como um aumento de pelo menos 50% na soma dos produtos das medidas de lesões representativas, em comparação com as medidas obtidas aquando do máximo de resposta. "Tempo até à Progressão (TTP)" é relatado a partir do dia 0 do protocolo. O TTP será definido como o número de dias desde o inicio da terapia (a partir do dia 0) até ao relapso (R). "Duração da Remissão" é definida como o número de dias desde a resposta objectiva (PR ou CR) até ao relapso. "Sobrevivência" é definida como o número de dias a partir do início do tratamento com um DERIVADO DA STAUROSPORINA e até à morte. A causa da morte será anotada, mas pode incluir progressão da doença, toxicidade e outras.

Exemplo 6

Uma mulher de 48 anos de idade apresentava febre, púrpura, esplenomegalia, diarreia, anemia de pendente de transfusão e trombocitopenia. A contagem inicial de leucócitos totais era de 20 000 mm3, com imaturidade e displasia dos mielócitos e 8% de blastócitos. Uma biopsia da medula óssea revelou 5-10% de blatócitos, displasia trilineada e 30-50% de células mastóides. Os testes do sangue periférico revelaram heterozigosidade para a mutação D816V KIT e FLT-3 de tipo selvagem. Foi diagnosticada com 32 ΡΕ1638574 mastocitose sistémica associada com um síndroma misto mielodisplásico/mieloproliferativo. Dois meses após apresentação, a doença progrediu, com 30-40% de mastócitos circulantes. Foi suportada com transfusões de eritrócitos e de plaquetas, bloqueio anti-histamínico e cromolin sódico. Desenvolveu disfunção hepática progressiva, ascite grave e trombose da veia porta. O tratamento com PKC412 iniciou-se com uma dose oral de 100 mg, duas vezes por dia (ciclos de 28 dias) . No início da terapia, os níveis de histamina no soro variavam entre 6910-7336 ng/dL (normal: <100 ng/dL) e os de triptase no soro eram 200 ug/L (normal, <10,9 ug/L).

No fim do ciclo 1: resposta parcial (critérios de Valent et al., Leuk. Res., 2003; 27:635-641) - índice de Karnofsky melhorou de 20 para 70% - Melhoria na diarreia e redução acentuada da ascite; 1 trombose da veia porta recanalizada - Transfusão persistente, dependendo da anemia e trombocitopenia

Diminuição de bilirrubina total/directa de 4,8/2,8 para 2,1/1,1 mg/dL; diminuição do LDH de 769 para 239 UI/L

- Diminuição da histamina no soro de 7000 para 1000 ng/dL; triptase no soro permaneceu elevada, >200 ug/L

Sangue periférico: diminuição do número de células mastoidais de 40-50% para <10%; aumento da maturidade mielóide

Medula óssea: grupos de mastócitos sem 33 ΡΕ1638574 alteraçao, segundo IPOX; blastócitos diminuíram para <5%.

Após 1 mês de terapia com PKC412, o índice de Kamofsky da paciente aumentou de 20% para 70%, a função hepática e a ascite melhoraram de forma clara e a veia porta foi recanalizada. No dia 32 do tratamento, a paciente exibia uma contagem normal de leucócitos no sangue, <5% de células mastóides em circulação e quase completa resolução da imaturidade dos mielócitos. Nesta ocasião, uma biopsia à medula óssea mostrou redução de blastócitos para <5%, com persistência de células mastoidais e displasia. O nível de histamina no soro, baixou para 1031 ng/dL; contudo, a triptase sérica permaneceu elevada.

No fim do ciclo 2: Manutenção de resposta parcial - Manutenção da melhoria dos sintomas clínicos e do índice de Karnofsky

Independência transitória de transfusão de plaquetas durante 2-3 semanas (plaquetas em 20 000-25 000/mm3)

Nova melhoria da bilirrubina total/directa: diminuição de 2,1/1,1 para 1,3/0,7 mg/dL

- Histamina no soro permaneceu no intervalo 800-1200 ng/dL; a triptase no soro permaneceu elevada, >200 ug/L - Medula óssea: sem alterações significativas nos agrupamentos de grupos de células mastoidais; blastócitos em 10-15% 34 PE1638574 - Sangue periférico: números de células mastoidais permanece <10; aumento da imaturidade mielóide e blastócitos.

Após 2 meses de terapia com PKC412, permaneceu clinicamente estável com uma diminuição da necessidade de transfusões de plaquetas.

No fim do ciclo 3: progressão da doença

Inicio do declínio do índice de Kamofsky; hapatoesplenomegalia, ascite e bilirrubina aumentados - Dose de PKC412 aumentada para 75 mg po tid no dia 91 - PKC412 suspenso no dia 102, devido à pregressão da doença com agravamento de organomegalia bilirrubina (total, 14 mg/dL) e aumento de blastócitos no sangue periférico (provável progressão da leucemia de células mastoidais com doença de linhagem de cálulas clonais hematológicas não mastoidais)

Histamina no soro iniciou novo aumento até 2525 ng/dL; a paciente faleceu no dia 111. A PKC412 foi bem tolerada, sem quaisquer efeitos adversos significativos. A resposta parcial à PKC412 neste caso avançado de leucemia de células mastoidais, sugere que este composto é activo na mastocitose sistémica.

Lisboa, 7 de Julho de 2010

Claims

ΡΕ1638574 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de N-[(9S, 10R,11R,13R)- 2,3,10,11,12,13-hexahidro-l0-metoxi-9-meti1-1-oxo-9, 13-epoxi-ΙΗ,9H-diindo-lo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-jΙΕ 1 , 7 ] benzodiazonil-ll-il ] -N-metilbenzamida de fórmula (VII):

ou um seu sal, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento curativo, paliativo ou profilático de mastocitose.
2. N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexa-hidro-10-metoxi-9-metil-l-oxo-9,13-epoxi-lH,9H-diindolo-[ 1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-j] [l,7]benzodiazonil-ll-il]-N-metilbenzamida de fórmula (VII) para utilização no 2 PE1638574 tratamento de mastocitose.
3. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para o tratamento de mastocitose com resistência a imatinib.
4. Preparação farmacêutica para utilização em tratamento curativo, paliativo ou profilático de mastocitose, compreendendo uma N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexa-hidro-10-metoxi-9-metil-l-oxo-9, 13-epoxi-ΙΗ,9H-diindolo-[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3, 4- j][1,7]benzodiazonil-ll-il]-N-metilbenzamida de fórmula (VII).
5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexa-hidro-10-metoxi-9-meti1-1-oxo-9,13-epoxi-lH,9H-diindolo-[1,2,3— gh:3',2',l'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonil-ll-il]-N-metilbenzamida de fórmula (VII) é administrada um sujeito mamífero, 7 a 4 vezes por semana, ou em cerca de 100% a cerca de 50% dos dias no período de tempo, durante um período de uma a seis semanas, seguido por um período de uma a três semanas em que o agente não é administrado, e sendo este ciclo repetido de uma a diversas vezes.
6 . N-[(9S, 10R, 11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexa-hidro-10-metoxi-9-metil-l-oxo-9,13-epoxi-lH,9H-diindolo-[1,2,3-gh:3',2',l'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonil-11-il]-N-metilbenzamida de fórmula (VII) para utilização de 3 PE1638574 acordo com a reivindicação 2, em que a N-[ (9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexa-hidro-10-metoxi-9-metil-l-oxo-9, 13-epoxi-ΙΗ,9H-diindolo-[1,2,3-gh: 3',2',l'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonil-ll-il]-N-metilbenzamida de fórmula (VII) é administrada um sujeito mamífero, 7 a 4 vezes por semana, ou em cerca de 100% a cerca de 50% dos dias no período de tempo, durante um período de uma a seis semanas, seguido por um período de uma a três semanas em que o agente não é administrado, e sendo este ciclo repetido de uma a diversas vezes.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a dose diária eficaz de composto de fórmula VII, é de 100 a 300 mg por dia, preferencialmente 220 a 230 mg, mais preferencialmente, 225 mg por dia.
8. N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexa-hidro-10-metoxi-9-metil-l-oxo-9,13-epoxi-lH,9H-diindolo-[1,2,3-gh:3',2',l'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonil-ll-il ] -N-metilbenzamida de fórmula (VII) para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a dose diária eficaz de composto de fórmula VII, é de 100 a 300 mg por dia, preferencialmente 220 a 230 mg, mais preferencialmente, 225 mg por dia.
9. Utilização de um derivado de staurosporina de acordo com a reivindicação 1, em combinação com imatinib, em que cada um dos ingredientes activos, independentemente um do outro, podem estar presentes na 4 ΡΕ1638574 forma livre ou sob a forma de um sal f armaceut icamente aceitável, para o tratamento de mastocitose. Lisboa, 7 de Julho de 2010 1 PE1638574 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citada pelos subscritores destina-se apenas para conveniência do leitor. Não integra o documento de Patente Europeia. Apesar de se ter tomado muito cuidado na compilação das referências, não podem excluir-se erros e omissões, e a EPO declina qualquer responsabilidade a este respeito. Patentes citadas na descrição EP 0296110 A EP 0733372 A US 5093330 A EP 0711556 A JP 2708047 B EP 0711557 A EP 0657164 A Literatura citada na descrição Kurosowa et al., Armais of Allergy, Setembro de 1989, vol. 63(3), 231-234 [0002]. Amon., Pharmacology, 1993, vol. 47, 200-208 [0003] Tharp et al., Current Problems in Dermatology, 1998, vol.
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