ES2344700T3

ES2344700T3 - Nuevos usos farmaceuticos de derivados de estaurosporina.

Info

Publication number: ES2344700T3
Application number: ES04740016T
Authority: ES
Inventors: Steven Coutre
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2010-09-03
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: CY2017048I2; NL300917I1; LUC00055I2; PL1638574T3; CA2527703C; JP2006527727A; CA2527703A1; SI1638574T1; US20070299049A1; WO2004112794A2; AU2004248909B2; JP2012144572A; HUS000503I2; DK1638574T3; FR17C1063I1; CN100457111C; PT1638574E; MXPA05013722A; TW200512213A; US20130289018A1

Abstract

Uso de N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII): **(Ver fórmula)** o una sal del mismo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento curativo, paliativo o profiláctico de la mastocitosis.

Description

Nuevos usos farmacéuticos de derivados de estaurosporina.

La presente invención se relaciona con el uso del derivado de estaurosporina MIDOSTAURINA en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento curativo, paliativo o profiláctico de mastocitosis; y con el uso de MIDOSTAURINA para fabricar un medicamento para uso en un método de tratamiento de animales de sangre caliente, preferiblemente humanos en los que una dosis terapéuticamente efectiva de MIDOSTAURINA se administra a un animal de sangre caliente que sufre de la enfermedad o afección mencionada anteriormente.

Kurosowa et al. (Annals of Allergy, sep. 1989, Vol. 63, No. 3, páginas 231-234) describen que una estaurosporina (compuesto 48/80) inhibe la liberación de histamina de mastocitos serosos de rata.

Amon et al. (Pharmacology 1993, 47, 200-208) describen que el PKC412 inhibe la activación inmunológica (liberación de histamina) de mastocitos de piel humanos y basófilos humanos.

Tharp et al. (Current Problems in Dermatology, 1998, Vol. 10, No. 5, páginas 181-210) describen que la mastocitosis representa un espectro de trastornos clínicos que resultan de una acumulación anormal de mastocitos de tejido y que no existe cura para la mastocitosis.

Longley et al. (Hematology/Oncology Clinicis in North America, June 2000, Vol. 14, No. 3, páginas 689-695) describen que algunas formas de la mastocitosis se originan por mutaciones c-kit y que no existe terapia que se dirija específicamente a un origen de mastocitosis.

El DERIVADO DE ESTAUROSPORINA de acuerdo con la invención es N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro -10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H- diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-Im]pirrolo [3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII):

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o una sal del mismo, (aquí adelante: "Compuesto de la fórmula VI o MIDOSTAURINA").

También se conoce el compuesto de la fórmula VII como MIDOSTAURINA [Denominación Común Internacional] o PKC412.

La MIDOSTAURINA es un derivado de la estaurosporina alcaloide de ocurrencia natural, y se ha descrito específicamente en la Patente Europea No. 0 296 110 publicada en diciembre 21, 1988, así como también en la patente Estadounidense No. 5,093,330 publicada en marzo 3, 1992, y Patente Japonesa No. 2 708 047.

Se ha encontrado de forma sorprendente que la MIDOSTAURINA posee propiedades terapéuticas, que la hacen útil para el tratamiento de mastocitosis. Particularmente es sorprendente que la Midostaurina es también efectiva en la prevención o tratamiento de la enfermedad o afección mencionada aquí anteriormente que tiene resistencia desarrollada contra imatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La MIDOSTAURINA se identificó originalmente como el inhibidor de proteína cinasa C (PKC) (MeyerT, Regenass U, Fabbro D, et al: Int J Cancer 43: 851-856, 1989).

La presente invención se relaciona así con el uso de MIDOSTAURINA para la preparación de un fármaco para el tratamiento de mastocitosis. Adicionalmente, la presente invención se relaciona con el uso de MIDOSTAURINA para la preparación de un fármaco para el tratamiento mastocitosis con resistencia al imatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización, la actual invención se relaciona con un método para tratar mastocitosis, esta enfermedad o afección también con resistencia al imatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de una MIDOSTAURINA, una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de la misma.

La presente invención también se relaciona con un método en donde la cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la fórmula VII se administra a un sujeto mamífero 7 a 4 veces a la semana o aproximadamente 100% a aproximadamente 50% de los días en el periodo, durante un tiempo de unas seis semanas, seguido por un periodo de una a tres semanas, en donde no se administra el agente y este ciclo se repite durante uno a varios ciclos.

En otra realización, la presente invención se relaciona con el uso de MIDOSTAURINA para la preparación de una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la mastocitosis, más particularmente para tratar mastocitosis con resistencia al imatinib.

Se puede demostrar la actividad de la MIDOSTAURINA, in vivo, por ejemplo, en una única administración o hasta tres administraciones orales por día a los animales en dosis en el rango de 0.1 a 10 o 1 a 5 mg/kg de peso corporal por día.

La mastocitosis se puede tratar en algunos casos con el inhibidor de tirosina cinasa imatinib pero frecuentemente ocurre una recaída y se encuentra de forma sorprendente que la MIDOSTAURINA es todavía activa en estos casos.

La dosificación precisa de MIDOSTAURINA a ser empleada para tratar la enfermedad o afección mencionada anteriormente depende de varios factores que incluyen el anfitrión, la naturaleza y la severidad de la afección que se trata, el modo de administración. Sin embargo, en general, se logran resultados satisfactorios cuando la MIDOSTAURINA se administra parentéricamente, por ejemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intratumoralmente, o rectalmente, o entéricamente, por ejemplo, oralmente, preferiblemente intravenosamente o, preferiblemente oralmente, intravenosamente en una dosificación diaria de 0.1 a 10 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 1 a 5 mg/kg de peso corporal. En los ensayos humanos una dosis total de 225 mg/día es más presumiblemente la Dosis Tolerada Máxima (DMT). Una dosificación diaria intravenosa preferida es 0.1 a 10 mg/kg de peso corporal o, para los primates más grandes, una dosificación diaria de 200-300 mg. Una dosificación intravenosa típica es de 3 a 5 mg/kg, tres a cinco veces a la semana.

Más preferiblemente, la MIDOSTAURINA, se administra oralmente, mediante formas de dosificación tales como microemulsiones, geles blandos o dispersiones sólidas en dosificaciones hasta de aproximadamente 250 mg/día, en particular 225 mg/día, se administra una vez, dos veces o tres veces al día.

Usualmente, se administra una dosis pequeña inicialmente y la dosificación se incrementa gradualmente hasta que se determina la dosificación óptima para el anfitrión bajo tratamiento. El límite superior de la dosificación es aquel impuesto por los efectos colaterales y se puede determinar mediante ensayo para el anfitrión que se trata.

Se puede combinar la MIDOSTAURINA con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros adyuvantes farmacéuticos convencionales y se administra entéricamente, por ejemplo oralmente, en la forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos oblongos, etc. o parentéricamente, por ejemplo, intraperitonealmente o intravenosamente, en la forma de soluciones o suspensiones inyectables estériles. Las composiciones enterales y parenterales se pueden preparar mediante medios convencionales.

Las soluciones de infusión de acuerdo con la presente invención son preferiblemente estériles. Esto se puede lograr fácilmente, por ejemplo mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. La formación aséptica de cualquier composición en forma líquida, el llenado aséptico de los frascos y/o la combinación de una composición farmacéutica de la presente invención con un diluyente adecuado bajo condiciones asépticas se conocen bien en la técnica por el experto.

La MIDOSTAURINA se puede formular en composiciones farmacéuticas enterales y parenterales que contienen una cantidad de sustancia activa que es efectiva para tratar la enfermedad o afección mencionada aquí anteriormente, tales composiciones de dosificación en forma unitaria y tales composiciones comprenden un portador farmacéuticamente aceptable.

La MIDOSTAURINA se puede utilizar sola o combinada con por lo menos otro compuesto farmacéuticamente activo para uso en estas patologías. Estos compuestos activos se pueden combinar en la misma preparación farmacéutica o en la forma de preparaciones farmacéuticas del tipo "equipo de partes" en el sentido de que los patrones de combinación se pueden dosificar independientemente o mediante el uso de combinaciones fijas diferentes con cantidades diferenciadas de los patrones de combinación, es decir, de forma simultánea o en diferentes momentos. Las partes del "equipo de partes" pueden luego, por ejemplo, administrarse de forma simultánea o cronológicamente en etapas, esto es en diferentes momentos o diferentes intervalos de tiempo para cualquier parte del "equipo de partes". Ejemplos no limitantes de compuestos que se pueden citar para uso en combinación con la MIDOSTAURINA son los fármacos quimioterapéuticos citotóxicos, tales como citosina arabinosida, daunorubicina, doxorubicina, ciclofosfamida, VP-16, o imatinib etc. Adicionalmente, se puede combinar la MIDOSTAURINA con otros inhibidores de transducción de señal u otros fármacos dirigidos a oncogén con la expectativa de que resultaría sinergia significativa.

Ejemplos de composiciones útiles se describen en las Patentes Europeas No. 0 296 110, No. 0 657 164, No. 0 733 372, No. 0 711 556, No. 0 711 557.

Las composiciones preferidas se describen en la patente Europea No. 0 657 164 publicada en junio 14, 1995. Las composiciones farmacéuticas descritas comprenden una solución o dispersión de compuestos de la fórmula I tal como MIDOSTAURINA en un polialquilenglicol glicérido saturado, en el que el glicol glicérido es una mezcla de ésteres de glicerilo y polietilenglicol de uno o más ácidos grasos saturados C8-C18.

Se describen adelante dos procesos de fabricación de tales composiciones.

Composición A

Gelucire 44/14 (82 partes) se funde con calor a 60ºC. La MIDOSTAURINA en polvo (18 partes) se agrega al material fundido. La mezcla resultante se homogeniza y la dispersión obtenida se introduce en cápsulas de gelatina dura de diferente tamaño de tal manera que algunas contienen una dosificación de 25 mg y otras tienen una dosificación de 75 mg de la MIDOSTAURINA. Las cápsulas resultantes son adecuadas para administración oral.

Composición B

Gelucire 44/14 (86 partes) se funde con calor a 60ºC. La MIDOSTAURINA en polvo (14 partes) se agrega al material fundido. La mezcla se homogeniza y la dispersión obtenida se introduce en cápsulas de gelatina dura de diferente tamaño, de tal manera que algunas contienen una dosificación de 25 mg y otras una dosificación de 75 mg de la MIDOSTAURINA. Las cápsulas resultantes son adecuadas para administración oral.

El Gelucire 44/14 comercialmente disponible de Gattefossé; es una mezcla de ésteres de ácidos grasos saturados C8-C18 con glicerol y un polietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 1500, las especificaciones para la composición del componente de ácido graso es, en peso, 4-10% de ácido caprílico, 3-9% de ácido cáprico, 40-50% de ácido laúrico, 14-24% de ácido mirístico, 4-14% de ácido palmítico y 5-15% de ácido esteárico.

Un ejemplo preferido de la formulación de Gelucire consiste de:

Gelucire (44/14): 47 g

MIDOSTAURINA: 3.0 g cargados en un matraz de desenrosque de 60 mL

Un ejemplo preferido de gel blando contendrá la siguiente Microemulsión:

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Sin embargo, se debe entender claramente que es solo para propósitos de ilustración.

En una realización preferida esta invención se relaciona con el uso o método como se describe aquí, en donde la cantidad efectiva diaria del compuesto de la fórmula VII, es 100 a 300 mg, preferiblemente 125 mg a 250 mg más preferiblemente 220 a 230 mg, preferiblemente 225 mg.

Más preferiblemente el compuesto de la fórmula VII, se administra una vez, dos veces o tres veces al día, para una dosis total de 100 a 300 mg al día.

En una realización muy preferida el compuesto de la fórmula VII, se administra tres veces a día, para una dosis total de 220 a 230 preferiblemente 225 mg al día, y preferiblemente en una dosis por administración de 70 a 80 mg, preferiblemente 75 mg.

En todavía otra realización, esta invención se relaciona con un artículo de fabricación que comprende material de empaque, y N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro,10-metoxi-9-metil-1-oxo-9, 13-epoxi -1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-Im] pirrolo[3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il] -N-metilbenzamida de la fórmula (VII) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, contenidas dentro de dicho material de empaque, en donde dicho material de empaque comprende una etiqueta de instrucciones que indica que dicho compuesto de la fórmula (VII), o dicha sal farmacéuticamente aceptable, es para administrar a mamíferos que sufren de rinitis alérgica, dermatitis alérgica, alergia a fármaco o alergia a alimento, angioedema, urticaria, síndrome de muerte súbita del lactante, aspergilosis broncopulmonar, esclerosis múltiple, o mastocitosis, en una cantidad de 50 a 500 mg, preferiblemente 100 a 300 mg, preferiblemente 125 mg a 250 mg, más preferiblemente 220 a 230 mg, más preferiblemente 225 mg siguiendo un régimen de dosificación específica para inhibir el desarrollo de las enfermedades y afecciones mencionadas anteriormente aquí.

Preferiblemente la invención también se relaciona con un artículo de fabricación en donde el compuesto de la fórmula VII, se administra tres veces a día, para una dosis total de 220 a 230 mg, preferiblemente 225 mg al día, y preferiblemente una dosis de 70 a 80 mg, más preferiblemente 75 mg, por administración para el tratamiento del síndrome hipereosinófilo o síndrome hipereosinófilo con resistencia al imatinib. Una realización preferida se relaciona con un artículo de fabricación que comprende cápsulas de gelatina blanda que contienen 25 mg del compuesto de la fórmula VII.

La invención se refiere adicionalmente a la combinación de MIDOSTAURINA como se describió aquí anteriormente con imatinib para el tratamiento de las enfermedades y afecciones descritas aquí anteriormente. La administración de tal una combinación se puede efectuar al mismo tiempo, por ejemplo en la forma de una composición o preparación farmacéutica combinada, fija, o secuencialmente u cronológicamente en etapas. Se prefiere actualmente la administración de MIDOSTAURINA en una forma de dosificación como se describió aquí anteriormente y de imatinib en su forma etiquetada de GLEEVEC® en el US/GLIVEC® en Europa y con las dosificaciones previstas para estas formas de dosificación.

El tratamiento de la mastocitosis con la combinación anterior se puede denominar tratamiento de primario, es decir el tratamiento de una enfermedad diagnosticada recientemente sin ninguna quimioterapia anterior o similares, o también se puede denominar tratamiento secundario, es decir el tratamiento de la enfermedad después de un tratamiento precedente con imatinib o MIDOSTAURINA, dependiendo de la severidad o estado de la enfermedad así como también la condición total del paciente, etc.

El término "alergia a fármaco o alergia a alimento" como se utiliza aquí se refiere a una reacción alérgica producida por un fármaco o antígenos ingeridos, tales como, por ejemplo, fresas, leche o huevos.

El término "mastocitosis" como se utiliza aquí, se relaciona con mastocitosis sistémica, por ejemplo mastocitoma, y también con neoplasmas de mastocitos caninos. La mastocitosis es un trastorno mieloproliferativo con opciones de tratamiento limitadas y generalmente un pobre pronóstico. La patogenia de la mastocitosis se ha atribuido a la activación constitutiva del receptor de tirosina cinasa KIT. En una gran mayoría de pacientes con mastocitosis, la actividad de tirosina cinasa desregulada de KIT se debe a una mutación dentro del codón 816 de la proteína (D816V) que también confiere resistencia al imatinib o mesilato de imatinib, siendo este último comercializado como Gleevec® en los Estados Unidos o Glivec® en otra parte, in vitro e in vivo.

Los mastocitos cumplen una función importante como las células efectoras primarias en los trastornos alérgicos mencionados aquí. La desgranulación de mastocitos mediada por IgE específica a antígeno lleva a la liberación posterior de mediadores químicos y citocinas múltiples y a síntesis de leucotrieno. Adicionalmente, los mastocitos están involucrados en la patogenia de esclerosis múltiple.

Los neoplasmas de mastocitos ocurren en humanos y animales. En perros, los neoplasmas de mastocitos se denominan mastocitomas, y la enfermedad es común, representando 7%-21% de tumores caninos. Se debe redactar una distinción entre la mastocitosis humana, que es usualmente transitoria o indolora, y neoplasia de mastocito canina, que se comporta de manera imprevisible y es a menudo agresiva y metastásica. Por ejemplo, los mastocitomas solitarios humanos no hacen metástasis a menudo; en contraste, 50% de mastocitomas de caninos se comportan en una forma maligna, según se estima por Hottendorf & Nielsen (1969) después de la revisión de 46 informes publicados de tumores en 938 perros.

El cáncer en la población de mascotas es una enfermedad espontánea. Los propietarios de mascotas, motivados por la prolongación de la calidad de vida de sus animales, con frecuencia buscan el cuidado especializado y el tratamiento de los oncólogos veterinarios en los hospitales veterinarios de referencia privada, hospitales de enseñanza veterinaria en todo el país. Las modalidades terapéuticas de pacientes veterinarios con cáncer son similares a los humanos, incluyendo la cirugía, quimioterapia, radioterapia y bioterapia. Se ha estimado que hay 42 millones de perros y unos 20 millones de gatos en los Estados Unidos. Utilizando estimaciones crudas de la incidencia del cáncer, hay aproximadamente 4 millones de diagnósticos de cáncer nuevos realizados en perros y un número similar en los gatos hechos cada año.

Los tumores de mastocitos cutáneos en los perros son un problema común. La mayoría de los tumores de mastocitos son benignos y se curan con la resección simple, sin embargo, si son recurrentes o metastásicos a sitios distantes se limitan las opciones terapéuticas. Las opciones de tratamiento para las lesiones recurrentes pueden incluir la terapia de radiación por haz externa. Para la metástasis a distancia o enfermedad diseminada el uso de Lomustine® y vinblastina que contienen protocolos de quimioterapia ha demostrado algunos beneficios. Los sitios para las metástasis de los tumores de mastocitos incluyen la piel, ganglios linfáticos regionales, el bazo, el hígado y médula ósea.

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La participación del receptor de KIT en la patogenia de la mastocitosis se sugiere por la observación de que varias mutaciones que resultan de la activación constitutiva de KIT se han detectado en una serie de estirpes de mastocitos. Por ejemplo, una mutación puntual en c-KIT humano, origina la sustitución de Val por Asp816 en el dominio fosfotransferasa y la autoactivación del receptor, ocurre en una estirpe de mastocito de leucemia humana a largo plazo (HMC-1) y en el codón correspondiente en dos estirpes de mastocitos en roedores. Más aún, esta mutación de activación se ha identificado in situ en algunos casos de la mastocitosis humana. Se han encontrado dos otras mutaciones de activación en la región de yuxtamembrana intracelular de KIT, es decir. la sustitución Val560Gly en las estirpes de mastocitos HMC-1 humano, y una eliminación de siete aminoácidos (Thr573-His579) en una estirpe de mastocitos de roedor denominada FMA3.

Se puede mostrar mediante modelos de prueba establecidos y especialmente aquellos modelos de prueba que se describen aquí MIDOSTAURINA o en cada caso una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, que resultan en una prevención efectiva o, preferiblemente, el tratamiento de por lo menos una de las enfermedades mencionadas aquí. El experto en la técnica pertinente está plenamente habilitado para seleccionar un modelo de prueba relevante para probar las indicaciones terapéuticas y los efectos beneficiosos indicados anteriormente y adelante. La actividad farmacológica, por ejemplo, se puede demostrar en un estudio clínico o en el procedimiento de prueba como se describe esencialmente aquí adelante.

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Ejemplo 1

Este Ejemplo demuestra los efectos in vivo de MIDOSTAURINA en el desarrollo dependiente de SCF de crecimiento de mastocitos humanos cultivados generados de células sanguíneas del cordón CD34^{+} utilizando el sistema de cultivo descrito por Kinoshita T, Sawai N, et al in Blood 1999, 94, 496-508. Más de 90% de las células aisladas son positivas a CD34 de acuerdo con el análisis de citometría de flujo.

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Reactivos y anticuerpos

La MIDOSTAURINA se solubiliza en DMSO a una concentración de 10^{-2} M y se almacena a -80ºC. Todo el ácido trans retinoico (Sigma) se disuelve en etanol a una concentración de 10^{-2} M, y se almacena en frascos protegidos de la luz a -80ºC. El mAb purificado para triptasa (MAB1222) se puede comprar de Chemicon International Inc., CA. Para el análisis de citometría de flujo, los mAb para CD34 (8G12, FITC) y CD11b (Leu15, PE) se compran de Becton Dickinson Inmunocytometry Systems (Mountain View, CA), y el mAb para CD41 (SZ22, FITC) de Inmunotech S.A. (Marseilles, Francia). El mAb para glicoforina A (GPA, JC159, FITC) se puede obtener de Dako (Glostrup, Denmark). Para transferencia de Western e inmunoprecipitación, los mAb para c-kit (NU-c-kit) y para fosfotirosina (4G10) se puede comprar de Nichirei y Upstate Biotechnology, Inc (Lake Placid, NY), respectivamente.

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Cultivos de suspensión

Los cultivos líquidos privados de suero se llevan a cabo en placas de cultivo de 24 pozos (#3047; Becton Dickinson). Veinte mil células CD34^{+} se cultivan en cada pozo que contiene 2 mL de medio \alpha complementado con 1% de BSA, 300 \mug/mL de transferrina humana saturada con hierro completamente (aproximadamente 98% pura, Sigma), 16 \mug/mL lecitina de soya (Sigma), 9.6 \mug/mL de colesterol (Nakalai Chemicals Ltd., Japón) y 20 ng/mL de SCF, 10 ng/mL de GM-CSF, 2 U/mL de EPO, 10 ng/mL de TPO, concentraciones diferentes de MIDOSTAURINA, sola o en combinación. Con el fin de examinar los efectos de la MIDOSTAURINA en el desarrollo dependiente de SCF de mastocitos, células cultivadas por 10 semanas que crecen con 20 ng/mL de SCF de células sanguíneas de cordón CD34^{+} se utilizan como células objetivo. Cinco a diez x 10^{4} células cultivadas por 10 semanas se incuban durante 2 semanas en placas de cultivo de 24 pozos que contienen 20 ng/mL de SCF con o sin varias concentraciones de una MIDOSTAURINA. Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera humidificada enjuagada con una mezcla de 5% de CO_{2}, 5% de O_{2}, y 90% de N_{2}. Cuando el cultivo se continúa hasta 4 semanas, la mitad del medio de cultivo se reemplaza cada 2 semanas con medio fresco que contiene el factor(s). El número de células viables se determina mediante una prueba de exclusión con azul de triptano utilizando un hemocitómetro.

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Cultivos de células clónicas

El ensayo de colonia de mastocitos se lleva a cabo en placas de cultivo de suspensión Lux de 35-mm (#171099; Nunc, IL). El cultivo consiste de células cultivadas por 10 semanas (4,000 células/mL) que crecen con 10 ng/mL de SCF, medio \alpha, 0.9% de metilcelulosa (Shinetsu Chemical, Japón), 1% de BSA, 300 \mug/mL de transferrina humana saturada con hierro completamente, 16 \mug/mL de lecitina de soya, 9.6 \mug/mL de colesterol y 100 ng/mL de SCF con o sin 10^{-6} M de MIDOSTAURINA. Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera humidificada enjuagada con una mezcla de 5% de CO_{2}, 5% de O_{2}, y 90% de N_{2}. Después de 4 semanas, los cúmulos que consisten de 30 o más células se clasifican como colonias de mastocitos, y aquellos consisten de 10 a 29 células como grupos de mastocitos. Treinta colonias individuales y grupos se levantan, y se tiñen con el mAb anti-triptasa o IgG1 de ratón utilizando la técnica de fosfatase alcalina-fosfatasa anti-alcalina (APAAP). Casi todas las células constituyentes son positivas para triptasa.

Teñidos citoquímicos e inmunológicos

Las células cultivadas se extienden sobre portaobjetos de vidrio utilizando una Citospina II. La reacción citoquímica con peroxidasa (POX) se realiza mediante el método convencional. La reacción con mAb contra triptasa se detecta utilizando el método APAAP (Dako APAAP Kit System, Dako Corp., CA), como se describe por F. Ma, K. Koike, et al. en Br. J. Haematol. 1998, 100, 427-35.

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Inmunoprecipitación y transferencia Western

La inmunoprecipitación y transferencia de Western se realizan, como se describe por T. Kamijo, K. Koike, et al. en Leuk. Res. 1997, 21, 1097-106.

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Análisis de citometría de flujo

Para el análisis de los marcadores de superficie de las células cultivadas, 1-2 x 10^{5} células se recolectan en tubos plásticos y se incuban con FITC- o PE-mAb diluido apropiadamente, como se describe por Kinoshita T, Sawai N, et al in Blood 1999, 94, 496-508. Las células se lavan dos veces, después de lo cual se analizan sus marcadores de superficie con el citómetro de flujo FACScan. Las células viables se recolectan de acuerdo con sus características de dispersión de luz hacia adelante y características de dispersión de luz laterales. La relación de células positivas se determina mediante comparación con células teñidas con Ig emparejado de isotipo de ratón conjugado con FITC o
PE.

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Detección de apoptosis celular

El análisis de apoptosis celular se lleva a cabo mediante un análisis de citometría de flujo utilizando yoduro de propidio (PI, Sigma) de acuerdo con el procedimiento descrito por N. Sawai, K. Koike, et al in Stem Cells. 1999, 17,45-53. Con el fin de reducir las células que sufren apoptosis, necrosis o ya muertas, se puede utilizar centrifugación de gradiente percoll. Células de diez semanas de cultivo se colocan en capas en 27% de Percoll (Sigma) en medio \alpha y 54% de Percoll en PBS. Después de centrifugación, las células se recolectan de la interfaz de los dos concentraciones diferentes de solución de Percoll, se lavan con PBS y se tratan con 1 mL de Ortho PermeaFix^{TM} durante 40 min a temperatura ambiente. Las células luego se incuban con ARNsa libre de DNasa (Sigma) durante 15 min a 37ºC, y se tiñen con PI durante 15 min. El contenido de ADN de 2 x 10^{4} células se monitorea con un citómetro de flujo. Las células cultivadas por 10 semanas (2 x 10^{6}) expuestas a SCF o SCF y MIDOSTAURINA se lisan durante 10 min sobre hielo en 100 \muL de amortiguador de lisis hipotónico [10 mM de Tris (pH 7.5), 10 mM de EDTA, pH 8.0, 0.5% de Triton X-100]. Después de centrifugación durante 10 min a 14,000 g, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo, y se trata con 0.2 mg/mL de ARNsa a (Sigma) y 0.2 mg/mL de Proteinasa K (Sigma). El ADN se precipita con 120 \muL de isopropanol y 20 \muL de NaCl 5M durante la noche a -20ºC. Después de centrifugación a 14,000 g, los sedimentos se secan, se disuelven en 20 \muL de Tris-EDTA, y luego las muestras se analizan por electrofóresis de gel en 2% de agarosa y teñido de bromuro de etidio.

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Ensayo de niveles de histamina, triptasa y citocina

Las concentraciones de histamina en los lisatos celulares obtenidos por el tratamiento de las células cultivadas con 0.5% de Nonidet P-40 y en sobrenadante se miden por Equipo de Radioinmunoensayo de Histamina (RIA) (Inmunotech), como se describe en Kinoshita T, Sawai N, et al in Blood 1999, 94, 496-508.

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Análisis estadístico

Todos los experimentos se deben llevar a cabo por lo menos tres veces. Para determinar el significado de la diferencia entre dos grupos independientes, se puede utilizar la prueba t no pareada, o la prueba U de Mann-Whitney cuando los datos no se distribuyen normalmente.

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Ejemplo 2 Métodos

Reactivos: Novartis Pharma; Basel, Suiza: PKC412 o MIDOSTAURINA para uso in estos experimentos. Soluciones madre de 10 mM frescas del inhibidor se hacen antes de cada experimento al disolver el compuesto en 1 ml de DMSO (dimetil-sulfóxido).

Anticuerpos: se utiliza un anticuerpo anti-KIT de conejo policlonal (c-kit Ab-1) en una dilución de 1:500 (c-kit Ab-1; Oncogeno, Cambridge, MA). Un anticuerpo anti-fosfotirosina (PY20) se utiliza en una dilución de 1:1000 (PY20 Transduction Laboratories; Lexington, KY). El anticuerpo de antiratón de cabra conjugado con peroxidasa se utiliza en una dilución de 1:5000 y anticuerpo anti-conejo de cabra en una dilución de 1:10.000 (Pierce; Rockford,
IL).

Estirpes celulares: estirpes celulares de mastocitoma de canino BR y C2 se obtienen del Dr. George Caughey (Universidad de California en San Francisco, San Francisco, CA). Ambas estirpes celulares se mantienen en DMEM complementado con 2% de becerro bovino, 1 mM de L-glutamina, 12.5 mM de HEPES (pH 7.5), 0.25 mg/ml de Histidina, 1% de Penicilina-Estreptomicina y 1% de fungizona. Las células BR y C2 se derivan de tumores de mastocitos de canino y se establecen originalmente en cultivos a largo plazo después de pasaje inicial en ratones inmunodeficientes (DeVinney R et al., Am J Respir Cell Mol Biol 1990; 3(5):413-420; Lazarus SC et al., Am J Physiol 1986; 251(6 Pt 1):C935-C944). La estirpe celular BR tiene una mutación de punto (T1752C) que resulta en una sustitución de Leucina a Prolina en el aminoácido 575 (dominio de yuxtamembrana). La estirpe celular C2 tiene una duplicación tándem interna (ITD) de la región de yuxtamembrana KIT. La traducción de esta ITD resulta en la reduplicación de residuos de aminoácido en el extremo 3' del exón 11 (Londres CA et al., Exp Hematol 1999; 27(4):689-697; Ma Y et al., J Invest Dermatol 1999; 112(2):165-170).

Ensayos de Proliferación: Las células se agregan a placas de 96 pozos a una densidad de 40.000 células/pozo en medio de cultivo normal y se varían las concentraciones de SALT I. La proliferación se mide en 48-72 horas utilizando un ensayo basado en XTT (Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN). (Heinrich MC et al., Blood 2000; 96(3):925-932).

Lisatos de Proteína: las células BR y C2 se lavan x 2 en PBS y luego se inactivan en Optimem (Gibco-BRL) a 37ºC durante aproximadamente 18 horas. Las células luego se incuban durante 90 minutos en la presencia de varias concentraciones de PKC412. Luego de esta incubación, las células se sedimentan y se lisan utilizando 100-250 \mul de amortiguador de lisis de proteína (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0.25% de Desoxicolato, con adición de los inhibidores de aprotinina, leupeptina, pepstatina, PMSF, y ortovanadato de sodio [Sigma]). Se desarrolla el análisis de inmunotransferencia Western como se describió previamente (Hoatlin ME et al., Blood 1998; 91(4):1418-1425; Heinrich MC et al., Blood 2000; 96(3):925-932).

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Ejemplo 3 El COMPUESTO I inhibe la cinasa KIT activada constitutivamente asociada con tumores de mastocitos de canino

Para probar la eficacia del COMPUESTO I en la inhibición de la actividad de cinasa de las formas mutantes de KIT decanito se utiliza dos estirpes celulares (BR y C2) que expresan dos isoformas KIT activas constitutivamente. Las mutaciones KIT es estas estirpes celulares se localizan en el dominio de yuxtamembrana y son homólogas a las vistas en los Tumores Estromales Gastrointestinales humanos (GIST) (Lux ML et al., Am J Pathol 2000; 156(3):791-795; Rubin BP et al., Cancer Res 2001; 61(22): 8118-8121). Los lisatos preparados a partir de células BR o C2 se sondean con un anticuerpo anti-P-Tyr y la activación del receptor KIT se evalúa al medir la autofosforilación. Como se reportó previamente, la autofosforilación KIT en estas células se observa en la ausencia de SLF (Ma Y et al., J Invest Dermatol 1999; 112(2):165-170; Ma Y et al., JouARNl de Investigative Dermatology 2000; 114(2):392-394). La inhibición de la autofosforilación KIT por PKC412 es dependiente de dosis con inhibición completa observada utilizando 10 y 1.0 \muM de dosis. Se observa cerca de una inhibición completa utilizando una dosis de 0.1 \muM. Se observa autofosforilación limitada de c-kit utilizando dosis de 0.001-0.01 \muM de PKC412. Así, el PKC412 no solo inhibe la autofosforilación del receptor c-kit mutado en estas células, sino que también es un inhibidor más potente de este receptor mutado que es del receptor c-kit de tipo natural (IC_{50} 100-200 nM). Para determinar si el PKC412 modula la expresión de la proteína KIT, la membrana se pela y se resondea con un anticuerpo anti-c-kit. No hay cambio en la expresión de la proteína c-kit en células tratadas con PKC412. Por lo tanto, el PKC412 disminuye la autofosforilación de polipéptido KIT de canino mutante al inhibir la actividad de cinasa KIT a diferencia de por la expresión de regulación descendente de la proteína KIT.

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Ejemplo 4 El COMPUESTO I inhibe la proliferación de estirpes celulares de tumores de mastocitos de canino

Para probar el efecto biológico de la inhibición de la actividad de cinasa de un receptor c-kit mutante, las células BR o C2 células se cultivan durante 48-72 horas en la presencia de varias concentraciones de PKC412. En concentraciones de inhibidor de 0.1-10 \muM, la proliferación se reduce al 90-95% comparada con las células tratadas con solo medio. La inhibición de proliferación parcial se ve en dosis de PKC412 de 0.001-0.01 \muM. Por lo tanto, el PKC412 inhibe proliferación de las células BR y C2 con el mismo rango de respuesta de dosis como se ve para la inhibición de la autofosforilación del receptor. Las observaciones del las células tratadas con inhibidor revelan cambios consistentes con apoptosis.

Ejemplo 5 Ejemplo de una serie de casos prospectivos de perros de compañía con tumores de mastocitos cutáneos medibles

Los pacientes del estudio son perros de compañía con tumores de mastocitos medibles y confirmados histológicamente. Los casos se limitan a aquellas lesiones con lesiones apreciables susceptibles a biopsia.

Los criterios de elegibilidad son:

- tumores de mastocitos cutáneos apreciables confirmados histológicamente

- los casos requerirán biopsia en serie con sacabocados Keyes de 2 mm antes y durante la terapia

- el grado histológico (intermedio II o III diferenciado pobremente)

- estado de desempeño 0 o I (Kamofsky modificado - Tabla 1)

- autorización informado del dueño

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(a) Los criterios de exclusión son:

- quimioterapia citotóxica concurrente

- no se pueden iniciar administración de prednisona y fármacos antiinflamatorios no esteroides dentro de 30 días del estudio; si la prednisona o los fármacos antiinflamatorios no esteroides se han administrado durante más de 30 días ellos se pueden continuar

- prueba de ácido biliar suero anormal (función hepática)

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TABLA 1 Estado de Desempeño (Kamofsky Modificado)

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La evaluación de pretratamiento de todos los casos incluye examen físico, conteo completo de sangre, capa leucocitaria, bioquímica de suero, uroanálisis, ácidos biliares en suero (en ayunas y post-prandial), documentación de tamaño de nodo linfático regional, radiografías abdominales, y ultrasonido abdominal. El régimen de tratamiento es 25 mg/kg PO QD x 60 días de MIDOSTAURINA.

Se continua el tratamiento en todos los casos durante 60 días a menos que se observe progreso en la enfermedad. En los casos que experimentan respuesta parcial o respuesta completa de la terapia en curso durante unos 60 días adicionales. Los casos que completan la terapia exitosamente se pueden elegir para repetir la entrada al estudio.

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4

5

La eficacia de la MIDOSTAURINA se evalúa en contra los tumores de mastocitos cutáneos apreciables, utilizando criterios de valoración clínicos. Los criterios de valoración biológicos se pueden tomar de biopsias en serie recolectadas de los tumores cutáneos y de muestras de sangre disponibles a través del curso del tratamiento.

Los criterios de valoración clínicos incluyen el índice de respuesta de los tumores apreciables, de respuesta objetiva contra el tumor apreciable y el tiempo de progresión del tumor apreciable. Se registrarán todos los efectos colaterales adversos.

Las "Respuestas de Tumores Objetivos", como se define adelante, se observan bajo tratamiento con midostaurina y se indica la eficacia del régimen de tratamiento.

En particular, se pueden observar la Respuestas Completas y Respuestas Parciales al tratamiento con un midostaurina. Adicionalmente, se observa que animales que obtienen más tratamiento muestran Enfermedad Estable, mientras que animales menos tratados muestran Enfermedad Progresiva. También, se puede observar que animales que obtienen menos tratamiento muestran Recaída de la enfermedad cuando se compara con los animales no tratados. El Tiempo hasta la Progresión, Duración de Remisión y Supervivencia se puede incrementar en los animales bajo tratamiento con MIDOSTAURINA.

"Respuesta Completa (CR)" se define como la desaparición de todas las evidencias clínicas de cáncer y de cualesquier signos relacionados con el cáncer.

"Respuesta Parcial (PR)" se define como un 50% o más disminución en la suma de los productos de las mediciones para las lesiones representativas, sin un aumento en el tamaño de cualquier lesión o la aparición de cualquier lesión nueva.

"Enfermedad Estable (SD)" se define como ninguna respuesta o una respuesta inferior a aquella definida para la respuesta parcial o enfermedad progresiva, sin aparición de cualquier lesión nueva o el empeoramiento de los síntomas clínicos.

"Enfermedad Progresiva (EP)" se define como un aumento inequívoco de por lo menos el 50% en el tamaño de cualquier lesión apreciable o aparición de nuevas lesiones.

"Recaída (R)" se define como la aparición de nuevas lesiones o la reaparición de las lesiones viejas en los perros que habían tenido una respuesta completa; en perros que habían tenido sólo una respuesta parcial, la recaída se define como por lo menos un aumento del 50% en la suma de los productos de las mediciones de las lesiones representativas, en comparación con las mediciones obtenidas en el momento de máxima respuesta.

"El Tiempo hasta Progresión (TTP)" se reporta desde el día 0 del protocolo. El TTP se define como el número de días del inicio de la terapia (desde el día 0) hasta la recaída (R).

"Duración de la Remisión" se define como el número de días desde la respuesta objetivo (PR o CR) a la recaída.

"Supervivencia" se define como el número de días desde el inicio del tratamiento con un derivado de ESTAUROSPORINA hasta la muerte. Se notará la causa de la muerte, pero puede incluir el progreso de la enfermedad, la toxicidad, y otros.

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Ejemplo 6

Una mujer de 48 años de edad se presenta con fiebre, púrpura, esplenomegalia, diarrea y anemia dependiente de transfusión y trombocitopenia. El conteo inicial de glóbulos blancos es de 20.000/ mm^{3} con la inmadurez y la displasia mieloide, y 8% de blastos. Una biopsia de médula ósea muestra 5-10% de blastos, displasia trilinaje y 30-50% de mastocitos. La prueba de la sangre periférica, revelara la heterocigosidad para la mutación KITD816V y FLT-3 de tipo natural. Ella se diagnostica con mastocitosis sistémica con un síndrome mielodisplásico/mieloproliferativo mezclado asociado. Dos meses después de la presentación, su enfermedad progresa con 30-40% de mastocitos circulantes. Ella se apoya con transfusiones de glóbulos rojos y de plaquetas, bloqueo antihistamínico, y cromoglicato de sodio. Ella desarrolla la disfunción hepática progresiva, ascitis severa, y trombosis de la vena porta. El tratamiento con PKC412 se inicia con una dosis de 100 mg dos veces al día oralmente (ciclos de 28 días). Al inicio de la terapia, los niveles de histamina en el suero varían entre 6910-7336 ng/dL (normal <100 ng/dL) y la triptasa sérica es > 200 ug/L (normal <10,9 ug/L).

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Al final del ciclo 1: Respuesta Parcial (criterios de Valent et al LeukRes. 2003; 27:635-641)

- Estado de desarrollo Karnofsky mejorado del 20% al 70%

- Mejora en la diarrea y reducción marcada en la ascitis, 1 trombosis de la vena porta recanalizada

- anemia y trombocitopenia dependientes de transfusión peristent

- La bilirrubina total/directa disminuye de 4.8/2.8 a 2.1/1.1 mg/dL, el LDH disminuye de 769 239 UI/L

- La histamina en suero disminuye de 7000 a 1000 ng/dL; la triptasa en suero se mantiene elevada > 200 ug/L de

- Sangre periférica: Los números de los mastocitos se reducen de 40-50% a <10%; incrementando la madurez mieloide

- Médula ósea: no hay cambios en las agrupaciones de los mastocitos por IPOX; los blastos disminuyen a menos del 5%

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Después de 1 mes de terapia PKC412, el estado del desempeño de pacientes Kamofsky aumenta del 20% al 70%, la función hepática y la ascitis mejoran notablemente, y se recanaliza la vena porta. Durante el día 32 del tratamiento, el paciente exhibe un recuento normal de glóbulos blancos, < del 5% de mastocitos que circulan y la resolución casi completa de la inmadurez mieloide. Una biopsia de médula ósea en este tiempo muestra una reducción en blastos de <5% con mastocitos persistentes y displasia. El nivel de histamina en suero declina a 1031 ng/dL, sin embargo, la triptasa en suero se mantiene elevada.

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Al final del ciclo 2: Mantenimiento de respuesta parcial

- Mantenimiento de los síntomas clínicos mejorados y el estado de desempeño de Karnofsky

- Independencia de transfusión de plaquetas transitoria durante 2-3 semanas (20.000-25.000 plaquetas/mm^{3})

- Mejora adicional en la bilirrubina total/directa: disminución de 2.1/1.1 a 1.3/0,7 mg/dl

- La histamina en suero permanece en el rango de 800-1200 ng/dL; la triptasa en suero se mantiene elevada > 200 ug/L

- Médula ósea: no hay cambio significativo en las agrupaciones de grupos de mástocitos; blastos al 10-15%

- Sangre periférica: Los números de mastocitos permanecen a <10%, incrementando la inmadurez mieloide y los blastos

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Después de 2 meses de terapia PKC412, ella permanece clínicamente estable con un requerimiento de transfusión de plaquetas disminuido

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Al final del ciclo 3: progresión de la enfermedad

- El estado de desempeño de Kamofsky comienza a declinar, incrementando la hepatoesplenomegalia, ascitis, bilirrubina

- Las dosis de PKC412 se incrementan a 75 mg por vía oral tres veces en el día # 91

- El PKC412 se detiene en el día # 102, debido a una enfermedad progresiva con el empeoramiento de organomegalia

- La bilirrubina (total 14 mg/dL), y los blastos en sangre periférica incrementados (probable progreso de la leucemia de mastocitos con enfermedad de linaje sin mastocitos hematológica clónica asociado)

-La histamina en suero comienza a incrementar de nuevo, a 2525 ng/dl, el paciente expira en el día # 111.

El PKC412 es bien tolerado sin eventos adversos significativos. La respuesta parcial a PKC412 en este caso avanzado de la leucemia de mastocitos sugiere que este compuesto es activo en la mastocitosis sistémica.

Claims

1. Uso de N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII):

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o una sal del mismo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento curativo, paliativo o profiláctico de la mastocitosis.

2. N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo[1,2,3- gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-j] [1,7] benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII) para uso en el tratamiento de mastocitosis.

3. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 para el tratamiento de la mastocitosis con resistencia al imatinib.

4. Preparación farmacéutica para uso en el tratamiento curativo, paliativo o profiláctico de mastocitosis, que comprende una N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro- 10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm] pirrolo[3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII).

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo- 9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo[3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII) se administra a un sujeto mamífero 7 a 4 veces una semana o aproximadamente 100% a aproximadamente 50% de los días en el periodo de tiempo, durante un periodo de una a seis semanas, seguido por un periodo de una a tres semanas, en donde el agente no se administra y este ciclo se repite durante 1 a varios ciclos.

6. N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo [3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII) para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pirrolo [3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII) se administra a un sujeto mamífero 7 a 4 veces una semana o aproximadamente 100% a aproximadamente 50% de los días en el periodo de tiempo, durante un periodo de una a seis semanas, seguido por un periodo de una a tres semanas, en donde el agente no se administra y este ciclo se repite durante 1 a varios ciclos.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la cantidad efectiva diaria del compuesto de la fórmula VII, es 100 a 300 mg al día, preferiblemente 220 a 230 mg, más preferiblemente 225 mg al día.

8. N-[(9S,10R,11R,13R) -2,3,10,11,12,13-hexahidro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm] pirrolo[3,4-j] [1,7]benzodiazonin-11-il]-N-metilbenzamida de la fórmula (VII) para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la cantidad efectiva diaria del compuesto de la fórmula VII, es 100 a 300 mg al día, preferiblemente 220 a 230 mg, más preferiblemente 225 mg al día.

9. Uso de un derivado de estaurosporina de acuerdo con la reivindicación 1 en combinación con imatinib, en donde cada uno de los ingredientes activos, independientemente del otro, pueden estar presentes en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de mastocitosis.