MD3394084T2 - Noi peptide și combinații de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului glandei mamare și a altor cancere - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În mod special, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la epitopii peptidici ai celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componentele farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea în pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare

Description

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În mod special, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la epitopii peptidici ai celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componentele farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea în pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare.

Prezenta invenţie se referă la o secvenţă de peptide derivată din molecule HLA de clasă I ale celulelor tumorale umane care se pot folosi în formule de vaccin pentru inducerea de răspunsuri imunitare antitumorale sau drept ţinte pentru dezvoltarea de compuşi sau celule active din punct de vedere farmaceutic/imunologic.

FUNDAMENTELE INVENŢIEI

Cancerul mamar este de departe cel mai frecvent diagnosticat cancer şi cauza cea mai frecventă de deces prin cancer în rândul femeilor. S-au estimat 1,7 milioane de cazuri noi (25% din toate cazurile de cancer la femei) şi 0,5 milioane de decese cauzate de cancer (15% din toate decesele provocate de cancer la femei) în 2012. Incidenţa anuală în ţările industrializate este de 70-90 de cazuri noi per 100.000 de femei, ceea ce este de două ori mai mult comparativ cu ţările considerate ca având niveluri scăzute de dezvoltare.

Ratele de incidenţă standardizate în funcţie de vârstă sunt cele mai mari în Europa de Vest şi cele mai mici în Asia de Est. Ratele mortalităţii variază de aproximativ 2-5 ori la nivel mondial; rata mortalităţii este mai mică în ţările cu niveluri mai ridicate de dezvoltare umană. Aproximativ 43% dintre cazurile noi estimate şi 34% dintre decesele provocate de cancer au avut loc în Europa şi America de Nord.

În timp ce incidenţa a crescut în general în majoritatea zonelor lumii, aceasta a atins apogeul şi a scăzut în ultimul deceniu în mai multe ţări foarte dezvoltate. Ratele mortalităţii au scăzut într-o serie de ţări foarte dezvoltate de la sfârşitul anilor 1980 şi începutul anilor 1990 ca rezultat al unei combinaţii de detectare îmbunătăţită şi diagnostic mai timpuriu (prin screening bazat pe populaţie) şi al regimurilor de tratament mai eficiente (World Cancer Report, 2014).

Factorii de risc de cancer mamar bine caracterizaţi includ vârsta, istoricul familial, factorii reproductivi, inclusiv nuliparitatea, prima naştere după vârsta de 30 de ani, densitatea mamografică şi atipia într-o biopsie mamară benignă anterioară. Agenţii care cauzează cancer mamar includ consumul de alcool, utilizarea de contraceptive combinate estrogen-progestogen şi terapia menopauzei, expunerea la radiaţii X şi γ şi factori de stil de viaţă, cum ar fi dietele hipercalorice şi lipsa exerciţiilor fizice. Activitatea fizică a fost asociată cu o scădere cu 25%-30% a riscului de cancer mamar ca urmare a scăderii estrogenilor endogeni, a adipozităţii, a rezistenţei la insulină, a leptinei şi a inflamaţiei, care sunt toate asociate independent cu un risc crescut de cancer mamar (Winzer et al., 2011).

O mică proporţie a cancerelor mamare este cauzată de mutaţii moştenite în genele de susceptibilitate de cancer mamar cu penetranţă ridicată (BRCA1 şi BRCA2).

Mai multe gene cu penetranţă mai redusă au fost descoperite prin tehnologia de secvenţiere de generaţie următoare aplicată pentru examinarea genomurilor a 100 cancere mamare pentru modificări ale numărului de copii somatice şi mutaţii în exonii codificatori ai genelor care codifică proteinele (Stephens et al., 2012). Numărul mutaţiilor somatice a variat semnificativ între tumorile individuale. Au fost evidenţiate corelaţii puternice între numărul de mutaţii, vârsta la care a fost diagnosticat cancerul şi gradul histologic al cancerului şi s-au observat semnături mutaţionale multiple, inclusiv una, prezentă în aproximativ 10% dintre tumori, caracterizată prin numeroase mutaţii ale citozinei la dinucleotidele TpC. Mutaţii conductoare au fost identificate în mai multe gene noi ale cancerului, inclusiv AKT2, ARID1B, CASP8, CDKN1B, MAP3K1, MAP3K13, NCOR1, SMARCD1 şi TBX3. Printre cele 100 de tumori, au existat mutaţii conductoare în cel puţin 40 de gene ale cancerului şi 73 de combinaţii diferite de gene ale cancerului mutante. În ansamblu, una dintre cele mai puternice gene care contribuie la dezvoltarea cancerului mamar, TP53, este totuşi probabil implicată doar în 25% dintre tipurile de cancer, deşi rolul său în subseturile de tipuri de cancer mamar, cum ar fi triplu-negativ/basal-like, este mult mai mare . Un număr mare de gene par a fi implicate într-un procent mic de tumori şi acest lucru va furniza provocări suplimentare pentru realizarea visului unei intervenţii medicale specifice şi personalizate pentru pacient.

Cancerul mamar nu este o boală singulară şi este eterogen atât clinic, cât şi morfologic. Clasificarea OMS actuală a tumorilor mamare (ediţia a IV-a) recunoaşte mai mult de 20 de subtipuri diferite. Majoritatea cancerelor mamare provin din celule epiteliale (carcinoame); aceste tumori sunt subîmpărţite în leziuni in situ şi leziuni invazive. Carcinoamele in situ sunt leziuni preinvazive şi subîmpărţite în carcinom ductal in situ (DCIS) şi carcinom lobular in situ (LCIS). Distincţia dintre DCIS şi LCIS nu este rezultatul sitului de origine micro-anatomic (ducturi vs. lobuli), ci, mai degrabă, al unei diferenţe în caracteristicile arhitecturale şi citologice ale celulelor. DCIS şi LCIS diferă, de asemenea, prin distribuţia lor în sân, precum şi riscul de recurenţă şi progresie către cancer invaziv.

Carcinomul invaziv caracterizat ca „fără tip special», cunoscut şi sub denumirea de carcinom ductal fără tip special sau carcinom ductal invaziv, constituie cel mai mare subgrup de cancer mamar invaziv. Această denumire identifică un grup eterogen cuprinzând tumori care nu sunt uşor de clasificat în funcţie de caracteristici morfologice specifice care caracterizează „subtipurile speciale». Prin urmare, este un diagnostic implicit pentru toate acele tumori (aproximativ 70%) cărora nu li se poate atribui o denumire „subtip special». Cele mai frecvente dintre subtipurile speciale includ carcinomul lobular, carcinomul tubular, carcinomul mucinos, carcinomul cu caracteristici medulare şi apocrine, carcinoamele micropapilare şi papilare şi carcinoamele metaplastice.

Gradul histologic este o măsură a cât de mult seamănă o tumoare cu ţesutul său de origine şi este o parte integrantă a unui raport de patologie. Sistemul actual de clasificare evaluează cei trei parametri de diferenţiere arhitecturală, pleomorfismul nuclear şi proliferarea tumorii. Deşi această abordare semicantitativă calculează în medie eterogenitatea intratumorală existentă în multe tumori, rămâne un indicator puternic al prognosticului pacientului. Gradul histologic este, de asemenea, puternic asociat cu tipul histologic şi cu tiparele de modificări moleculare, cum ar fi exprimarea receptorului de estrogen (ER) şi a receptorului de progesteron (PR) şi supraexprimarea proteinei şi amplificarea genei receptorului factorului de creştere epidermică umană 2 (HER2).

Studii moleculare şi genetice recente au evidenţiat cancerul mamar drept un grup extrem de eterogen de boli care diferă în ceea ce priveşte prognosticul şi răspunsul la tratament. Înţelegerea îmbunătăţită a căilor moleculare şi a modificărilor genetice care stau la baza diferitelor subtipuri de cancer mamar duce la o abordare mai ţintită şi mai personalizată a tratamentului cancerului mamar.

Tratamentul standard pentru pacientele cu cancer mamar depinde de diferiţi parametri: stadiul tumorii, starea receptorilor hormonali şi modelul de exprimare a HER2. Standardul de îngrijire include rezecţia chirurgicală completă a tumorii, urmată de radioterapie. Chimioterapia mai ales cu antracicline şi taxani poate fi iniţiată înainte sau după rezecţie. În stadii avansate, chimioterapice suplimentare, cum ar fi agenţi alchilanţi, fluorpirimidine, analogi de platină etc. pot fi aplicate ca monoterapie sau terapie combinată. Pacienţii cu tumori HER2-pozitive primesc anticorpul anti-HER2 trastuzumap pe lângă chimioterapie. Inhibitorul factorului de creştere endotelial vascular (VEGF) bevacizumab sinergizează cu monoterapia cu paclitaxel sau capecitabină. Chimioterapia este, de obicei, mai puţin eficientă la pacientele cu tumori pozitive la receptorii de estrogen sau progesteron. Pentru aceste paciente, regimul de tratament standard cuprinde o terapie endocrină cu tamoxifen (prima linie) sau inhibitori de aromatază (a doua linie) după chimioterapia iniţială (S3-Leitlinie Mammakarzinom, 2012).

Timp de mai bine de un deceniu, a fost aplicată profilarea exprimării genelor pentru a se defini fenotipurile moleculare ale cancerului mamar şi au fost găsite subtipurile luminal A şi subtipuri de tip bazal (basal-like) drept cele două subtipuri principale ale celor cinci care au fost identificate. Acest tip de analiză nu doar a confirmat cele două mari subseturi de cancer mamar - ER-pozitiv şi ER-negativ -, dar a adus în primplan diferenţele în cadrul categoriilor ER.

Folosind aceste date de exprimare genică, este din ce în ce mai posibil să se clasifice cancerul mamar, să se dezvolte semnături pentru prognosticul „bun» versus „slab» şi să se identifice tumorile care pot sau nu să răspundă la o anumită terapie (van de Vijver et al., 2002). Evoluţia rapidă a cunoaşterii evenimentelor moleculare şi a căilor de semnalizare care stau la baza dezvoltării şi progresiei cancerului mamar a dus, de asemenea, la identificarea unui număr tot mai mare de noi ţinte terapeutice şi la dezvoltarea de medicamente împotriva acestor ţinte. Multe studii clinice sunt în curs de desfăşurare în întreaga lume pentru a se evalua rolul acestor noi terapii ţintite în tratarea pacientelor cu cancer mamar. Terapiile ţintite mai noi care au fost sau sunt evaluate, individual şi în combinaţie între ele şi cu agenţi citotoxici tradiţionali, includ inhibitori ai angiogenezei, inhibitori ai tirozin kinazei, inhibitori ai ţintei mamifere a rapamicinei (mTOR), inhibitori ai poli(ADP-riboză) polimerazei 1 (PARP1), inhibitori ai receptorului factorului de creştere asemănător insulinei 1 (IGF-1R), inhibitori ai proteazomilor, inhibitori ai fosfatidilinozitol 3-kinazei (PI3K) şi alţii (Perez and Spano, 2012). Scopul final al acestei cercetări este de a putea adapta tratamentul cancerului mamar pentru paciente individuale pe baza caracteristicilor moleculare particulare ale tumorii. Analizele moleculare sunt, de asemenea, relevante pentru supravieţuire. Un studiu a folosit modelarea ARN-ului mesager (ARNm), modificări ale numărului de copii, microARN-uri şi metilare (Kristensen et al., 2012). Pentru toate cazurile de cancer mamar, cel mai puternic predictor al rezultatului bun a fost achiziţionarea unei semnături genice care a favorizat un răspuns limfocitar T helper de tip 1 (Th1)/limfocitar T citotoxic ridicat în detrimentul imunităţii conduse de Th2.

Aceste date reflectă faptul că un cancer mamar este o entitate canceroasă imunogenică şi că diferite tipuri de celule imune care se infiltrează în tumorile primare prezintă o semnificaţie distinctă prognostică şi predictivă. A fost efectuate un număr mare de studii de imunoterapie în fază timpurie la paciente cu cancer mamar. Majoritatea studiilor de vaccinare finalizate au vizat HER2 şi antigeni carbohidraţi, cum ar fi MUC-1, şi au avut rezultate destul de dezamăgitoare. Apar date clinice privind efectele modulării punctului de control imun cu ipilimumab şi alţi anticorpi activatori ai celulelor T la paciente cu cancer mamar (Emens, 2012).

Având în vedere efectele secundare severe şi cheltuielile asociate cu tratarea cancerului, este necesară identificarea factorilor care pot fi utilizaţi în tratamentul cancerului în general şi al cancerului mamar în special. De asemenea, este necesară identificarea factorilor care reprezintă biomarkeri pentru cancer în general şi pentru cancerul mamar în special, conducând la îmbunătăţirea diagnosticării cancerului, a evaluării prognosticului şi a prezicerii succesului tratamentului.

Imunoterapia cancerului reprezintă o opţiune de ţintire specifică a celulelor canceroase concomitent cu minimizarea efectelor secundare. Imunoterapia cancerului foloseşte existenţa antigenilor asociaţi tumorii.

Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii (AAT) cuprinde următoarele grupuri principale:

a) Antigenii pentru cancer testicular: primele AAT identificate vreodată care se pot recunoaşte de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT) deoarece exprimarea membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, la nivelul ţesuturilor naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, în placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic specifice tumorii. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE şi NY-ESO-1.

b) Antigene de diferenţiere: Aceste TAA sunt comune tumorilor şi ţesutului normal din care provin tumorile. Majoritatea antigenilor de diferenţiere cunoscuţi sunt identificaţi în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine corelate cu linia melanocitară sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scară largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic.

c) TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu niveluri reduse de exprimare. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1.

d) Antigene specifice tumorilor: aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea (sau asocierea) cu tumoarea a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon din tumoare (asociat tumorii) în cazul izoformelor specifice tumorii (asociate tumorii).

e) TAA care apar prin modificări anormale posttranslaţie: aceste TAA apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supra-exprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii.

f) Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical.

Imunoterapia bazată pe celule T vizează epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumori, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T specifice tumorii, epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, reglate în sens crescător în celulele respectivei tumori.

Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC de clasă I sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2-microglobuline, molecule MHC de clasă II ale unui lanţ alfa şi ale unui lanţ beta. Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide.

Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribozomale defecte (DRIP) şi peptide mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimentele endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatură ca „prezentare încrucişată» (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC-uri, de exemplu în timpul endocitozei, şi care sunt procesate ulterior.

Complexele de peptidă şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de receptor de celule T (TCR) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR-ul adecvat. Este bine cunoscut faptul că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1.

Celulele T pozitive pentru CD4 joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice pozitive pentru CD8. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigene asociate tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imune antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu citokinic favorabil celulelor T (CTL-favorabil) (Mortara et al., 2006) şi atrag celulele efectoare, de exemplu CTL-uri, celule natural killer (NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007).

În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele profesioniste prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, celulele tumorale au fost identificate surprinzător că exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006).

Peptidele alungite (mai lungi) ale invenţiei pot acţiona ca epitopi activi ai MHC de clasă II.

Celulele T helper, activate de epitopii MHC de clasă II, joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singur sau asociat cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral.

S-a demonstrat pe modele animale (mamifere), de exemplu şoarece, că chiar şi în absenţa limfocitelor T CD8 pozitive, celulele T CD4-pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin sinteza de interferon gamma (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Există dovezi pentru celule T CD4 ca efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este, de obicei, limitată la celulele imune, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată anterior posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice un număr de epitopi MHC de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de celule T CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) este important în dezvoltarea de vaccinuri tumorale.

Pentru ca o peptidă MHC de clasă II să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie, de asemenea, să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu şanţul de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de incizura de legare.

În cazul reacţiile imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR).

Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T ca antigeni specifici tumorii sau asociaţi tumorii, şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat preponderent în celulele tumorale, şi deloc sau nici măcar în cantităţi mici în ţesuturile sănătoase. Într-o realizare preferată, peptida trebuie să fie supraprezentată de celulele tumorale comparativ cu ţesuturile sănătoase normale. Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorale datorită funcţiei lor, de exemplu, în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Aceste antigene asociate indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului pentru a se asigura faptul că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), fiind derivată dintr-un antigen asociat tumorii, duce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T.

În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule având TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop.

Prin urmare, TAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA sunt bazate, de obicei, pe utilizarea de celule T care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Într-o concretizare foarte preferată a invenţiei este, deci, important să se selecteze numai acele peptide prezentate peste sau selectiv împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efector („celule T efectoare»).

În cazul ţintirii peptidei-MHC de către TCR-uri specifice (de exemplu, TCR solubile) şi anticorpi sau alte molecule de legare (eşafodaje) în conformitate cu invenţia, imunogenitatea peptidelor subiacente este secundară. În aceste cazuri, prezentarea este factorul determinant.

WO 02/16939 A2 descrie că peptidele derivate din BCR4 stimulează o reacţie imună împotriva unei tumori şi sunt, astfel, utile pentru imunoterapia cancerului mamar. WO 02/16939 A2 descrie, de asemenea, acizi nucleici care codifică peptidele, celulele-gazdă recombinante, anticorpi, compoziţii farmaceutice, truse şi utilizarea pentru tratarea cancerului.

REZUMATUL INVENŢIEI

Într-un prim aspect, invenţia actuală se referă la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică SEQ ID NO: 42 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia.

Tabelele următoare prezintă peptidele descrise, valorile lor SEQ ID NO respective şi genele-sursă (subiacente) prospective pentru aceste peptide. Toate peptidele din Tabelul 1 şi Tabelul 2 se leagă la HLA-A*02. Peptidele din Tabelul 2 au fost descrise anterior în liste mari ca rezultate ale screeningurilor cu debit mare cu rate de eroare mari sau calculate folosindu-se algoritmi, dar nu au fost deloc asociate anterior cu cancerul. Peptidele din Tabelul 3 sunt peptide suplimentare care pot fi utile în combinaţie cu celelalte peptide descrise. Peptidele din Tabelul 4 sunt, de asemenea, utile în diagnosticul şi/sau tratamentul diferitelor alte malignităţi care implică o supraexprimare sau o supraprezentare a polipeptidei respective.

Tabelul 1: Peptide descrise.

J = fosfoserină, U = fosfotreonină

SEQ ID No. Secvenţă ID-uri gene Simboluri oficiale de gene 1 KMPEHISTV 8483 CILP 2 ALAGSSPQV 79935 CNTD2 3 ILLPPAHNJQ 54497 HEATR5B 4 SLVEGEAVHLA 339488,7020,7021,7022 TFAP2E, TFAP2A, TFAP2B, TFAP2C 5 ALNPVIYTV 1815 DRD4 6 ALTALQNYL 7021 TFAP2B 7 FIIPTVATA 85320 ABCC11 8 GLVQSLTSI 85320 ABCC11 9 FMSKLVPAI 285386 TPRG1 10 GLHSLPPEV 80131 LRRC8E 11 GLLPTSVSPRV 57758 SCUBE2 12 KAFPFYNTV 101060527,4671,653406,728519 NAIP 13 KLYEGIPVL 152110 NEK10 14 KQLELELEV 4588 MUC6 15 SLFPSLVVV 5339 PLEC 16 SMMGLLTNL 2099 ESR1 17 TIASSIEKA 285555 STPG2 18 YILLQSPQL 4588 MUC6 19 ALEEQLHQV 147183,162605,342574 KRT25, KRT28, KRT27 20 FSFPVSVGV 1846 DUSP4 21 SLLTEPALV 23158 TBC1D9 22 YIDGLESRV 148327 CREB3L4 23 SLADAVEKV 160857 CCDC122 24 GLLGFQAEA 9500 MAGED1 25 ILFDVVVFL 401152 C4orf3 26 SLAWDVPAA 2194 FASN 27 SLAEPRVSV 2194 FASN 28 SLFSVPFFL 10548 TM9SF1 29 ALEAUQLYL 120863 DEPDC4 30 FLSSEAANV 7127 TNFAIP2 31 GLSYIYNTV 57511 COG6 32 GLVATLQSL 2537 IFI6 33 ILTELPPGV 55628 ZNF407 34 SAFPEVRSL 63892 THADA 35 SLLSEIQAL 10142,5116 AKAP9, PCNT 36 TLLGLAVNV 56994 CHPT1 37 VLAHITADI 10765 KDM5B 38 LLMUVAGLKL 399909 PCNXL3

Tabelul 2: Peptide suplimentare descrise fără asociere cu cancer cunoscută anterior. SEQ ID NO: 42 este în conformitate cu prezenta invenţie. J - fosfoserină, U - fosfotreonină

Secvenţă ID-uri gene Simboluri oficiale de gene Secvenţă 39 KLLDMELEM 2184 FAH 40 SAAFPGASL 9802 DAZAP2 41 SLNDQGYLL 84515 MCM8 42 FLVEHVLTL 25800 SLC39A6 43 FLDEEVKLI 2512 FTL

Tabelul 3: Peptide utile pentru, de exemplu, terapii anticancer personalizate.

Secvenţă ID-uri gene Simboluri oficiale de gene Secvenţă 44 FLLDGSANV 1293 COL6A3 45 FLYDVVKSL 1293 COL6A3 46 FLFDGSANL 1293 COL6A3 47 FLIDSSEGV 1293 COL6A3 48 NLLDLDYEL 1293 COL6A3 49 GLTDNIHLV 25878 MXRA5 50 TLSSIKVEV 25878 MXRA5 51 SLYKGLLSV 25788 RAD54B 52 FLVDGSWSV 1303 COL12A1 53 SLAEEKLQASV 2194 FASN 54 SLFGQDVKAV 26036 ZNF451 55 FLVDGSWSI 57642 COL20A1 56 ILVDWLVQV 9133 CCNB2 57 TVAEVIQSV 55083 KIF26B 58 YVYQNNIYL 2191 FAP 59 KIVDFSYSV 701 BUB1B 60 ALPTVLVGV 5351 PLOD1 61 YLEPYLKEV 727947,7381 UQCRB 62 ALLEMDARL 54512 EXOSC4 63 ALVQDLAKA 891 CCNB1 64 FVFSFPVSV 1846 DUSP4 65 GLNEEIARV 10403 NDC80 66 ILFPDIIARA 64110 MAGEF1 67 LTDITKGV 1938 EEF2 68 NLAEVVERV 26263 FBXO22 69 RLDDLKMTV 3918 LAMC2 70 SISDVIAQV 56172 ANKH 71 SMMQTLLTV 10916 MAGED2

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, în general la peptidele în conformitate cu prezenta invenţie pentru utilizare în tratamentul bolilor proliferative, cum ar fi, de exemplu, leucemia mielogenă acută, cancerul de cale biliară, cancerul cerebral, leucemia limfocitară cronică, carcinomul colorectal, cancerul esofagian, cancerul de vezică biliară, cancerul gastric, cancerul hepatocelular, carcinomul cu celule Merkel, melanomul, limfomul non-Hodgkin, cancerul pulmonar non-microcelular, cancerul ovarian, cancerul pancreatic, cancerul de prostată, cancerul cu celule renale, cancerul pulmonar microcelular, cancerul de vezică urinară şi cancerul uterin.

Se furnizează peptida - singură sau în combinaţie - în conformitate cu prezenta invenţie conform SEQ ID NO: 42.

Aşa cum se arată în Tabelele 4A şi B de mai jos, multe dintre peptidele descrise se găsesc, de asemenea, pe alte tipuri de tumori şi, prin urmare, pot fi utilizate, de asemenea, în imunoterapia altor indicaţii. Consultaţi, de asemenea, Figura 1 şi Exemplul 1.

Tabelul 4A: Peptide descrise şi utilizările lor specifice în alte boli proliferative, în special în alte boli canceroase. Tabelul arată, pentru peptidele selectate pe care au fost găsite tipuri de tumori suplimentare, prezentând fie supraprezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate, fie prezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate cu un raport de medii geometrice tumoare vs. ţesuturi normale mai mare de trei. Supraprezentarea este definită ca prezentare mai mare pe proba tumorală în comparaţie cu proba normală cu prezentarea cea mai mare. Ţesuturile normale pe care fost testată supraprezentarea au fost: ţesut adipos, glandă suprarenală, celule sanguine, vas sanguin, măduvă osoasă, creier, cartilaj, esofag, ochi, vezică biliară, inimă, rinichi, intestin gros, ficat, plămân, ganglion limfatic, nerv, pancreas, glandă paratiroidiană, peritoneu, hipofiză, pleură, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, timus, glandă tiroidă, trahee, ureter şi vezică urinară.

SEQ ID NO: Secvenţă Alte organe/boli relevante 1 KMPEHISTV PC 2 ALAGSSPQV HCC 4 SLVEGEAVHLA Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 14 KQLELELEV PC 15 SLFPSLVVV NHL, melanom, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 18 YILLQSPQL HCC, PC, cancer esofagian 20 FSFPVSVGV NSCLC, SCLC, GC, NHL, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 21 SLLTEPALV HCC, CLL, NHL 22 YIDGLESRV PrC, AML, melanom, cancer esofagian, OC, cancer uterin 23 SLADAVEKV SCLC, NHL, melanom 24 GLLGFQAEA RCC, cancer cerebral, HCC, NHL, AML, melanom, cancer esofagian, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 25 ILFDVVVFL SCLC, NHL 26 SLAWDVPAA HCC, NHL, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară 27 SLAEPRVSV HCC , PrC, melanom, cancer de vezică urinară 28 SLFSVPFFL NSCLC, cancer cerebral, HCC, NHL, melanom, cancer de vezică urinară 30 FLSSEAANV SCLC, HCC, NHL, cancer de vezică urinară, cancer uterin 31 GLSYIYNTV CLL, NHL, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin 32 GLVATLQSL PC, AML, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 33 ILTELPPGV CLL, NHL 34 SAFPEVRSL HCC, CLL 35 SLLSEIQAL CRC, CLL 36 TLLGLAVNV SCLC 37 VLAHITADI SCLC, CLL, NHL, AML, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin 38 LLMUVAGLKL NSCLC, RCC, CRC, HCC, NHL, BRCA, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 39 KLLDMELEM RCC, HCC, NHL, melanom, OC, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 40 SAAFPGASL SCLC, CLL, AML, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 41 SLNDQGYLL NHL, melanom 42 FLVEHVLTL CLL, NHL, melanom, cancer de vezică urinară 43 FLDEEVKLI RCC, melanom, cancer de vezică urinară 44 FLLDGSANV NSCLC, SCLC, GC, CRC, HCC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 45 FLYDVVKSL NSCLC, SCLC, PC, NHL, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 46 FLFDGSANL NSCLC, SCLC, GC, CRC, PC, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 47 FLIDSSEGV NSCLC, SCLC, GC, CRC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 48 NLLDLDYEL NSCLC, SCLC, GC, CRC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 49 GLTDNIHLV NSCLC, SCLC, RCC, GC, CRC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 50 TLSSIKVEV NSCLC, RCC, GC, CRC, PC, PrC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 51 SLYKGLLSV NSCLC, SCLC, RCC, cancer cerebral, CRC, HCC, NHL, AML, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 52 FLVDGSWSV NSCLC, SCLC, GC, CRC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 53 SLAEEKLQASV HCC , PrC, cancer de vezică urinară 54 SLFGQDVKAV NSCLC, SCLC, RCC, cancer cerebral, CRC, HCC, CLL, NHL, MCC, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 56 ILVDWLVQV NSCLC, SCLC, RCC, cancer cerebral, CRC, HCC, NHL, AML, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 57 TVAEVIQSV NSCLC, PC, PrC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 58 YVYQNNIYL NSCLC, SCLC, GC, CRC, HCC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 59 KIVDFSYSV NSCLC, SCLC, cancer cerebral, CRC, NHL, MCC, melanom, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin 60 ALPTVLVGV NSCLC, RCC, cancer cerebral, GC, CRC, HCC, PC, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 61 YLEPYLKEV NSCLC, SCLC, cancer cerebral, CRC, HCC, NHL, AML, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 62 ALLEMDARL NSCLC, SCLC, RCC, cancer cerebral, CRC, HCC, NHL, AML, MCC, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 63 ALVQDLAKA NSCLC, SCLC, RCC, GC, CRC, HCC, PC, NHL, AML, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 64 FVFSFPVSV NSCLC, SCLC, GC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 65 GLNEEIARV NSCLC, SCLC, cancer cerebral, CRC, HCC, NHL, AML, MCC, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin 66 ILFPDIIARA NSCLC, SCLC, RCC, cancer cerebral, CLL, NHL, AML, melanom, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 67 LTDITKGV NHL 68 NLAEVVERV NSCLC, SCLC, cancer cerebral, HCC, PrC, CLL, NHL, MCC, melanom, OC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 69 RLDDLKMTV NSCLC, SCLC, RCC, GC, CRC, HCC, PC, NHL, melanom, cancer esofagian, OC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 70 SISDVIAQV cancer cerebral, CRC, HCC, PC, PrC, melanom, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 71 SMMQTLLTV Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară

NSCLC = cancer pulmonar non-microcelular, SCLC = cancer pulmonar microcelular, RCC = cancer renal, CRC = cancer de colon sau rect, GC = cancer de stomac, HCC = cancer hepatic, PC = cancer pancreatic, PrC = cancer de prostată, BRCA = cancer mamar, MCC = carcinom cu celule Merkel

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidei în conformitate cu prezenta invenţie conform SEQ ID NO: 42 pentru - într-o concretizare combinată preferată - tratarea NHL.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidei în conformitate cu prezenta invenţie conform SEQ ID NO: 42 pentru - într-o concretizare combinată preferată - tratarea melanomului.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidei în conformitate cu prezenta invenţie conform SEQ ID NO: 42 pentru - într-o concretizare combinată preferată - tratarea cancerului de vezică urinară.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidei în conformitate cu prezenta invenţie conform SEQ ID NO: 42 pentru - într-o concretizare combinată preferată - tratarea CLL.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidei în conformitate cu prezenta invenţie pentru - de preferinţă într-o concretizare combinată - tratarea unei boli proliferative selectate din grupul de cancer mamar, leucemie mielogenă acută, cancer de cale biliară, cancer cerebral, leucemie limfocitară cronică, carcinom colorectal, cancer esofagian, cancer de vezică biliară, cancer gastric, cancer hepatocelular, carcinom cu celule Merkel, melanom, limfom non-Hodgkin, cancer pulmonar microcelular, cancer ovarian, cancer de pancreas, cancer de prostată, cancer de celule renale, cancer pulmonar microcelular, cancer de vezică urinară şi cancer uterin.

Tabelul 1B: Peptide conform descrierii şi utilizările lor specifice în alte boli proliferative, în special în alte boli canceroase. Tabelul arată, ca Tabelul 4A, pentru peptidele selectate pe care au fost găsite tipuri de tumori suplimentare, prezentând supraprezentare (inclusiv prezentare specifică) pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate sau prezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate cu un raport de medii geometrice tumoare vs. ţesuturi normale mai mare de 3. Supraprezentarea este definită ca prezentare mai mare pe proba tumorală în comparaţie cu proba normală cu prezentarea cea mai mare. Ţesuturile normale pe care a fost testată supraprezentarea au fost: ţesut adipos, glandă suprarenală, celule sanguine, vas de sânge, măduvă osoasă, creier, esofag, ochi, vezică biliară, inimă, rinichi, intestin gros, ficat, plămân, ganglion limfatic, nerv, pancreas, glandă paratiroidă, peritoneu, hipofiză, pleură, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, glandă tiroidă, trahee, ureter, vezică urinară.

SEQ ID NO: Secvenţă Entităţi suplimentare 1 KMPEHISTV Melanom 4 SLVEGEAVHLA Melanom, cancer esofagian, HNSCC 10 GLHSLPPEV HNSCC 15 SLFPSLVVV Cancer de cale biliară, NHL, HNSCC 20 FSFPVSVGV OC, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 21 SLLTEPALV AML 22 YIDGLESRV SCLC, cancer uterin 23 SLADAVEKV Cancer uterin, HNSCC 24 GLLGFQAEA Melanom, cancer esofagian, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 26 SLAWDVPAA HNSCC 28 SLFSVPFFL PC, PrC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, HNSCC 30 FLSSEAANV OC 31 GLSYIYNTV CRC, HNSCC 32 GLVATLQSL Cancer uterin, cancer de cale biliară, HNSCC 33 ILTELPPGV AML, HNSCC 34 SAFPEVRSL AML 35 SLLSEIQAL AML, NHL 36 TLLGLAVNV Cancer cerebral 37 VLAHITADI CRC, cancer de vezică urinară, cancer uterin, HNSCC 39 KLLDMELEM Cancer esofagian 40 SAAFPGASL Melanom, cancer de cale biliară 41 SLNDQGYLL AML 42 FLVEHVLTL HNSCC

NSCLC = cancer pulmonar cu celule mici, SCLC = cancer pulmonar cu celule mici, RCC = cancer renal, CRC = cancer de colon sau rect, GC = cancer stomacal, HCC = cancer hepatic, PC = cancer pancreatic, PrC = cancer de prostată, leucemie, BRCA = cancer mamar, MCC = carcinom cu celule Merkel, OC = cancer ovarian, NHL = limfom non-Hodgkin, AML = leucemie mieloidă acută, CLL = leucemie limfocitară cronică.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidei în conformitate cu prezenta invenţie conform oricăreia dintre SEQ ID NO: 42 pentru - într-o concretizare combinată preferată - tratarea HNSCC.

Prezenta invenţie se referă, în plus, la peptidele descrise care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau - într-o formă alungită, cum ar fi o variantă de lungime - de clasă II.

Prezenta invenţie se referă şi la o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie în care peptidele menţionate constau dintr-o secvenţă aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 42.

Prezenta invenţie se referă în continuare la peptida descrisă în prezenta invenţie care respectiva peptidă include legături non-peptidice.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptidele conform prezentei invenţii. Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic conform prezentei invenţii, care este ADN, ADNc, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare care exprimă un acid nucleic conform prezentei invenţii.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în tratarea bolilor şi în medicină, în special în tratarea cancerului.

Prezenta invenţie se mai referă la anticorpi care sunt specifici împotriva complexelor de peptide în conformitate cu prezenta invenţie cu MHC şi metode de realizare a acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la receptori de celule T (TCR), în special TCR solubil (sTCR) şi TCR clonate transformate în celule T autologe sau alogene şi metode de realizare a acestora, precum şi celule NK sau alte celule care poartă respectivul TCR sau care reacţionează încrucişat cu TCR menţionate.

Anticorpii şi TCR sunt exemple de realizare suplimentare ale utilizării imunoterapeutice a peptidelor în conformitate cu invenţia la îndemână.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie sau un vector de exprimare aşa cum a fost descris mai înainte. Prezenta invenţie se referă în continuare la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda menţionată în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I sau de clasă II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 42.

Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celula T menţionată recunoaşte selectiv o celulă care exprimă o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie.

Este descrisă o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea unui număr eficace de celule T produse în conformitate cu prezenta invenţie la pacient.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, acidul nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, vectorul de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, celula în conformitate cu prezenta invenţie, limfocitul T activat, receptorul celulelor T sau anticorpul sau alte molecule de legare peptidică şi/sau peptidă-MHC în conformitate cu prezenta invenţie ca medicament sau la fabricarea unui medicament. De preferinţă, respectivul medicament este activ împotriva cancerului.

De preferinţă, respectivul medicament este o terapie celulară, un vaccin sau o proteină bazată pe un TCR sau anticorp solubil.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care celule canceroase menţionate sunt cancer mamar, leucemie mielogenă acută, cancer de cale biliară, cancer cerebral, leucemie limfocitară cronică, carcinom colorectal, cancer esofagian, cancer de vezică biliară, cancer gastric, cancer hepatocelular, carcinom cu celule Merkel, melanom, limfom non-Hodgkin, cancer pulmonar microcelular, cancer ovarian, cancer de pancreas, cancer de prostată, cancer de celule renale, cancer pulmonar microcelular, cancer de vezică urinară şi cancer uterin şi, de preferinţă, celule de cancer mamar.

Sunt descrişi biomarkeri bazaţi pe peptidele din prezenta invenţie, numite în prezentul document „ţinte», care pot fi utilizate în diagnosticarea cancerului, de preferinţă cancerul mamar. Markerul poate fi supraprezentarea peptidei (peptidelor) în sine sau supraexprimarea genei (genelor) corespunzătoare. Markerii pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a prezice probabilitatea de succes a unui tratament, de preferinţă o imunoterapie, şi, cel mai preferat, o imunoterapie care vizează aceeaşi ţintă identificată de biomarker. De exemplu, un anticorp sau un TCR solubil poate fi utilizat pentru colorarea secţiunilor tumorii pentru detectarea prezenţei unei peptide de interes în complex cu MHC.

Opţional, anticorpul poartă o funcţie efectoare suplimentară, cum ar fi un domeniu de stimulare imunitară sau o toxină.

Utilizările terapeutică şi diagnostică împotriva cancerelor suplimentare sunt prezentate în următoarea descriere mai detaliată a produselor de exprimare subiacente (polipeptide) ale peptidelor în conformitate cu invenţia.

S-a demonstrat că SLC39A6 joacă un rol crucial în metastaza cancerului mamar prin inactivarea GSK-3beta (glicogen sintază kinază 3beta) prin Akt, rezultând o activare a SNAIL (Hogstrand et al., 2013). În afară de cancerul mamar, SLC39A6 s-a dovedit a fi supraexprimat în melanom, carcinom esofagian cu celule scuamoase (ESCC), cancer de prostată, cancer ovarian, cancer de pancreas şi cancer uterin (Unno et al., 2014; Sussman et al., 2014; Cui et al., 2015). O reglare în sens descrescător indusă de SLC39A6 în carcinomul hepatocelular a dus la scăderea exprimării SLC39A6, ulterior exprimarea reglată în sens descrescător a SNAIL şi în sens crescător a E-caderinei (Shen et al., 2013; Lian et al., 2016).

Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei. Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent, imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de valorificare a ambelor componente, umorală şi celulară, ale sistemului imunitar.

Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).

Termenul „răspuns celular T» se referă la proliferarea şi activarea specifică a funcţiilor efectoare induse de o peptidă, in vitro sau in vivo. Pentru celule T citotoxice restricţionate la MHC de clasă I, funcţiile efectoare pot fi de liză a celulelor ţintă cu peptide pulsate, precursori de peptide pulsate sau care prezintă peptide naturale, de secreţie de citokine, preferabil interferon gamma, TNF-alfa sau IL-2 indusă de peptide, secreţie de molecule efectoare, preferabil granzime sau perforine induse de peptidă, sau degranulare.

Termenul „peptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Peptidele au, preferabil, o lungime de 9 aminoacizi, dar pot avea lungimea de 8 aminoacizi şi până la 10 sau 11 ori mai mulţi aminoacizi şi, în cazul peptidelor MHC de clasă II (variante alungite ale peptidelor din invenţie), pot avea o lungime de 12, 13, 14. 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 ori mai mulţi aminoacizi.

Mai mult, termenul „peptidă» va include săruri ale unei serii de resturi aminoacid conectate între ele, de obicei, prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. De preferinţă, sărurile sunt săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale peptidelor, cum ar fi, de exemplu, sărurile de clorură sau acetat (trifluoroacetat). Trebuie menţionat că sărurile peptidelor în conformitate cu prezenta invenţie diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele nu sunt săruri in vivo.

Termenul „peptidă» include, de asemenea, „oligopeptidă». Termenul „oligopeptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea oligopeptidei nu este critică pentru invenţie atât timp cât epitopul corect (sau epitopii corecţi) se includ în aceasta. Oligopeptidele au, de obicei, o lungime mai mică de 30 de aminoacizi, dar mai mare de 15 aminoacizi.

Termenul „polipeptidă» desemnează o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi -carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea polipeptidei nu este critică pentru invenţie atâta timp cât sau epitopii corecţi se păstrează. Spre deosebire de termenii „peptidă» sau „oligopeptidă», termenul „polipeptidă» se referă la molecule care conţin mai mult de circa 30 de resturi de aminoacid.

Termenul „polipeptidă de lungime completă» înseamnă o proteină completă (lanţ aminoacidic) sau o subunitate completă (lanţ aminoacidic) a unei proteine multimerice.

O peptidă, oligopeptidă, proteină sau polinucleotidă care codifică o astfel de moleculă este „imunogenă» (desemnată prin termenul „imunogen» în prezenta invenţie) dacă este capabilă să inducă un răspuns imunitar. În cazul prezentei invenţii, imunogenitatea este definită mai specific ca fiind abilitatea de a induce un răspuns mediat de celulele T. Astfel, o „imunogenă» este o moleculă capabilă să inducă un răspuns imunitar şi, în cazul prezentei invenţii, o moleculă capabilă să inducă un răspuns al celulelor T. Într-un alt aspect, imunogenul poate fi peptida, complexul peptidei cu MHC, oligopeptida şi/sau proteina care este utilizată pentru a ridica anticorpi sau TCR-uri specifice împotriva acesteia.

Un „epitop» al celulei T de clasă I necesită o peptidă scurtă care se leagă de receptorul MHC de clasă I formând un complex ternar (catenă alfa MCH de clasă I, beta-2-microglobulină şi peptidă) care poate fi recunoscut de o celulă T care poartă un receptor de celulă T corespunzător care se leagă de complexul MHC/peptidă cu afinitatea adecvată. Peptidele care se leagă de molecule MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-14 aminoacizi, cel mai frecvent având lungimea de 9 aminoacizi.

La om există trei loci genetici diferiţi care codifică moleculele MHC de clasă I (moleculele MHC ale omului sunt şi antigene leucocitare umane desemnate (HLA)): HLA-A, HLA-B şi HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, şi HLA-B*07 sunt exemple de diferite alele MHC de clasă I care pot fi exprimate din aceşti loci.

Tabelul 5: Frecvenţele de exprimare F pentru HLA*A02 şi HLA-A*24 şi cele mai frecvente serotipuri HLA-DR. Frecvenţele sunt deduse din frecvenţele haplotipurilor Gf din populaţia americană adaptate din Mori et al. (Mori et al., 1997) folosind formula Hardy-Weinberg: F = 1 - (1-Gf)І. Combinaţiile de A*02 sau A*24 cu anumite alele HLA-DR pot fi îmbogăţite sau mai puţin frecvente decât s-a estimat pe baza frecvenţelor singulare datorită unor dezechilibre de legare. Pentru detalii, vezi Chanock et al. (Chanock et al., 2004).

Alelă Populaţie Fenotip calculat din frecvenţa alelei A*02 Caucaziană (America de Nord) 49,1% A*02 Afro-americană (America de Nord) 34,1% A*02 Asiatic-americană (America de Nord) 43,2% A*02 Latino-americană (America de Nord) 48,3% DR1 Caucaziană (America de Nord) 19,4% DR2 Caucaziană (America de Nord) 28,2% DR3 Caucaziană (America de Nord) 20,6% DR4 Caucaziană (America de Nord) 30,7% DR5 Caucaziană (America de Nord) 23,3% DR6 Caucaziană (America de Nord) 26,7% DR7 Caucaziană (America de Nord) 24,8% DR8 Caucaziană (America de Nord) 5,7% DR9 Caucaziană (America de Nord) 2,1% DR1 Afro-(nord)-americană 13,20% DR2 Afro-(nord)-americană 29,80% DR3 Afro-(nord)-americană 24,80% DR4 Afro-(nord)-americană 11,10% DR5 Afro-(nord)-americană 31,10% DR6 Afro-(nord)-americană 33,70% DR7 Afro-(nord)-americană 19,20% DR8 Afro-(nord)-americană 12,10% DR9 Afro-(nord)-americană 5,80% DR1 Afro-(nord)-americană 6,80% DR2 Afro-(nord)-americană 33,80% DR3 Afro-(nord)-americană 9,20% DR4 Afro-(nord)-americană 28,60% DR5 Afro-(nord)-americană 30,00% DR6 Afro-(nord)-americană 25,10% DR7 Afro-(nord)-americană 13,40% DR8 Afro-(nord)-americană 12,70% DR9 Afro-(nord)-americană 18,60% DR1 Latino-(nord)-americană 15,30% DR2 Latino-(nord)-americană 21,20% DR3 Latino-(nord)-americană 15,20% DR4 Latino-(nord)-americană 36,80% DR5 Latino-(nord)-americană 20,00% DR6 Latino-(nord)-americană 31,10% DR7 Latino-(nord)-americană 20,20% DR8 Latino-(nord)-americană 18,60% DR9 Latino-(nord)-americană 2,10% A*24 Filipine 65% A*24 Neneţia, Rusia 61% A*24:02 Japonia 59% A*24 Malaysia 58% A*24:02 Filipine 54% A*24 India 47% A*24 Coreea de Sud 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*24:02 India 29% A*24 Australia de Vest 22% A*24 SUA 22% A*24 Samara, Rusia 20% A*24 America de Sud 20% A*24 Europa 18%

Peptida invenţiei, de preferinţă atunci când este inclusă într-un vaccin al invenţiei, aşa cum este descris în prezentul document, se leagă de A*02 . Un vaccin poate include, de asemenea, peptide MHC de clasă II. Prin urmare, vaccinul din invenţie poate fi utilizat pentru tratarea cancerului la pacienţi care sunt A*02 pozitivi, întrucât nu este necesară nicio selecţie pentru alotipurile MHC de clasă II din cauza pan-legării acestor peptide.

Dacă peptidele A*02 din invenţie sunt combinate cu peptide care se leagă la o altă alelă, de exemplu A*24, un procentaj mai mare din orice populaţie de pacienţi poate fi tratat comparativ cu abordarea oricărei alele de MHC de clasă I singulare. În timp ce în majoritatea populaţiilor, mai puţin de 50% dintre pacienţi pot fi abordaţi printr-o alelă singulară, un vaccin care conţine epitopi de HLA-A*24 şi HLA-A*02 poate trata cel puţin 60% dintre pacienţi din orice populaţie relevantă. În mod specific, următoarele procentaje de pacienţi vor fi pozitive pentru cel puţin una dintre aceste alele în diferite regiuni: SUA 61%, Europa de Vest 62%, China 75%, Coreea de Sud 77%, Japonia 86% (calcule de pe www.allelefrequencies.net).

Într-o concretizare preferată, termenul „secvenţă nucleotidică» se referă la un heteropolimer al dezoxiribonucleotidelor.

Secvenţa nucleotidică ce codifică o anumită peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi construită artificial. În general, segmentele de ADN care codifică peptidele, polipeptidele şi proteinele care fac subiectul acestei invenţii sunt asamblate pornind de la fragmente ADNc şi liganzi scurţi oligonucleotidici sau de la serii de oligonucleotide, care asigură o genă sintetică capabilă de a fi exprimată într-o unitate de transcriere recombinantă care conţine elemente regulatoare derivate dintr-un operon microbian sau viral.

Aşa cum se utilizează aici, termenul „o codificare (sau codare) cu nucleotide pentru o peptidă» se referă la o codificare cu o secvenţă de nucleotide pentru peptidă care include coduri de start şi stop artificiale (făcute de om) compatibile pentru sistemul biologic pentru care secvenţa urmează să fie exprimată, de exemplu, o celulă dendritică sau un alt sistem celular util pentru producerea de TCR.

Aşa cum este utilizată aici, referirea la o secvenţă de acid nucleic include atât acid nucleic monocatenar, cât şi acid nucleic dublu-catenar. Astfel, de exemplu pentru ADN, secvenţa specifică, dacă contextul nu indică altminteri, se referă la ADN-ul monocatenar al secvenţei respective, la duplexul respectivei secvenţe cu complementul acesteia (ADN dublu catenar) şi la complementul secvenţei respective.

Termenul „regiune de codare» se referă la acea porţiune a genei care codifică, fie în mod natural, fie în mod normal, produsul de exprimare al acelei gene în mediul său genomic natural, adică regiunea care codifică in vivo produsul de exprimare nativ al genei respective.

Regiunea de codificare poate fi derivată dintr-o genă non-mutantă („normală»), mutantă sau alterată ori poate fi derivată chiar dintr-o secvenţă ADN sau o genă sintetizată în întregime în laborator folosindu-se metode bine cunoscute profesioniştilor din domeniul sintezelor ADN.

Termenul „produs de exprimare» se referă la polipeptida sau proteina care reprezintă produsul natural de translaţie al genei şi orice echivalenţi de codificare a secvenţei de acid nucleic rezultaţi din degenerarea codului genetic care, astfel, codifică aceiaşi aminoacizi.

Termenul „fragment», atunci când se referă la o secvenţă de codificare, înseamnă o porţiune de ADN care conţine mai puţin decât regiunea completă de codificare, al cărei produs complet de exprimare reţine, în principal, aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi produsul de exprimare al întregii regiuni de codificare.

Termenul „segment ADN» se referă la un polimer ADN, sub forma unui fragment separat sau ca o componentă a unei construcţii ADN mai mari, care a fost obţinută din ADN izolat cel puţin o dată în formă substanţială pură, adică fără contaminanţi endogeni şi în cantităţi sau concentraţii care permit identificarea, manipularea şi recuperarea segmentului şi a secvenţelor nucleotidice componente prin metode biochimice standard, de exemplu prin utilizarea unui vector de clonare. Aceste segmente sunt furnizate sub forma unui cadru deschis de citire, neîntrerupt de secvenţe interne netraduse (sau introni) care sunt de obicei prezente în genele eucariote. Secvenţele de ADN netradus pot fi prezente în aval de cadrul de citire deschis, unde acestea nu interferă cu manipularea sau exprimarea regiunilor de codificare.

Termenul „amorsă» se referă la o secvenţă de acid nucleic scurtă care se poate împerechea cu o monocatenă ADN şi care asigură un capăt 3'-OH liber la nivelul căruia ADN polimeraza începe sinteza unei catene de dezoxiribonucleotide.

Termenul „promotor» se referă la o regiune ADN implicată în legarea ARN-polimerazei pentru a iniţia transcrierea.

Termenul „izolat» se referă la faptul că materialul este îndepărtat din mediul său original (de exemplu, mediul natural, dacă apare în mod natural). De exemplu, o polinucleotidă sau polipeptidă care apare natural într-un animal viu nu este izolată; dar aceeaşi polinucleotidă sau polipeptidă separată de una sau toate materialele coexistente din sistemul natural reprezintă un izolat. Aceste polinucleotide pot face parte dintr-un vector şi/sau aceste polinucleotide sau polipeptide pot face parte dintr-un compus, dar rămânând izolate deoarece vectorul sau compusul nu face parte din mediul natural.

Polinucleotidele şi polipeptidele recombinate sau imunogene, dezvăluite în conformitate cu prezenta invenţie, pot să fie în formă „purificată». Termenul „purificat» nu se referă la puritate absolută; mai degrabă este intenţionat ca definiţie relativă, şi poate include produse care sunt înalt purificate sau produse care sunt numai parţial purificate, deoarece aceşti termeni sunt înţeleşi de cei instruiţi în domeniul relevant. Pentru exemplificare, clonele individuale izolate dintr-o bibliotecă de ADNc au fost purificate în mod convenţional până la omogenitate electroforetică. Purificarea materialelor de început sau naturale până la cel puţin un ordin de mărime, preferabil la două sau trei ordine de mărime, şi ideal la patru sau cinci ordine de mărime este de dorit în special. Mai mult, este avută în vedere în mod special o polipeptidă revendicată care are o puritate de, preferabil, 99,999%, sau cel puţin 99,99% sau 99,9%; sau chiar şi 99% ca greutate sau mai mare.

Produsele de exprimare a acizilor nucleici şi polipeptidelor descrise conform prezentei invenţii, precum şi vectorii de exprimare care conţin aceşti acizi nucleici şi/sau aceste polipeptide pot fi în „formă îmbogăţită». În accepţiunea documentului, termenul „îmbogăţit» se referă la faptul că materialul respectiv este în concentraţie de cel puţin 2, 5, 10, 100 sau 1000 de ori mai mare decât concentraţia sa naturală (de exemplu), mai avantajos 0,01% masic, preferabil cel puţin 0,1% masic. Produsele îmbogăţite cu 0,5%, 1%, 5%, 10% şi 20% masic sunt de asemenea de interes. Secvenţele, compuşii, vectorii, clonele şi celelalte materiale care sunt cuprinse în prezentul brevet pot fi, în funcţie de interes, în formă îmbogăţită sau izolată. Termenul „fragment activ» se referă la un fragment, de obicei o peptidă, o polipeptidă sau o secvenţă de acid nucleic, care generează un răspuns imunitar (adică, are activitate imunogenă) la administrare, singur sau, opţional, alături de un adjuvant adecvat, unui animal, cum ar fi de exemplu un mamifer, ca de exemplu un iepure sau cobai, dar care include si un om, răspunsul imunitar putând lua forma unui răspuns de stimulare a celulelor T în cadrul animalului primitor, cum ar fi omul. Alternativ, termenul „fragment activ» se poate utiliza pentru inducerea unui răspuns celular T in vitro.

În accepţiunea prezentului document, termenii „porţiune», „segment» şi „fragment», atunci când sunt folosiţi în raport cu polipeptidele, se referă la o secvenţă continuă de resturi, cum ar fi resturi de aminoacid, care secvenţă formează un subset al unei secvenţe mai mari. De exemplu, dacă o polipeptidă este supusă unui tratament cu oricare dintre endopeptidazele uzuale, cum ar fi tripsina sau chimotripsina, oligopeptidele care rezultă din acest tratament reprezintă porţiuni, segmente sau fragmente ale polipeptidei iniţiale. Atunci când sunt folosiţi în raport cu polinucleotidele, aceşti termeni se referă la produse obţinute prin tratarea polinucleotidelor respective cu oricare dintre endonucleazele uzuale.

În accepţiunea prezentului brevet, termenul de „identitate procentuală» sau „procentaj identic», cu referire la o secvenţă, presupune că o secvenţă este comparată cu o secvenţă patentată sau descrisă după alinierea secvenţei care se compară („secvenţa comparată») cu secvenţa descrisă sau patentată („secvenţă de referinţă»). Identitatea procentuală se determină conform următoarei formule:

identitate procentuală = 100 [1-(C/R)]

unde C este numărul de diferenţe dintre secvenţa de referinţă şi secvenţa comparată pe lungimea aliniamentului dintre secvenţa de referinţă şi cea comparată, în care

(i) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată şi

(ii) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă şi

(iii) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă diferenţe;

(iiii) alinierea trebuie să înceapă la poziţia 1 a secvenţelor aliniate;

şi R este numărul de baze sau aminoacizi din secvenţa de referinţă pe lungimea alinierii cu secvenţa comparată, orice lipsă apărută în secvenţa de referinţă fiind de asemenea numărată ca bază sau aminoacid.

Dacă există un aliniament între secvenţa comparată şi secvenţa de referinţă pentru care identitatea procentuală calculată anterior este aproximativ egală cu, sau mai mare decât o identitate procentuală minimă specificată, atunci secvenţa comparată are o identitate procentuală minimă specificată cu secvenţa de referinţă, deşi pot exista aliniamente pentru care anterior-menţionata identitate procentuală să fie mai mică decât identitatea procentuală specificată.

După cum s-a menţionat mai sus, prezenta invenţie se referă, prin urmare, la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică SEQ ID NO: 42 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia. Peptida din invenţie are capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate umană (MHC) de clasă I.

În prezenta invenţie, termenul „omolog» se referă la gradul de identitate (consultaţi secţiunea „Identitate procentuală» de mai sus) dintre secvenţele a două secvenţe de aminoacizi, adică secvenţe peptidice sau polipeptidice. Anterior menţionata „omologie» se stabileşte prin compararea a două secvenţe aliniate in condiţii optime cu secvenţele care vor trebui comparate. O astfel de omologie a secvenţei se poate calcula prin crearea unei alinieri folosind, de exemplu, algoritmul ClustalW. Programe de analiză a secvenţei disponibile în mod obişnuit, mai specific Vector NTI, GENETYX sau alte instrumente sunt furnizate de baze de date publice.

Specialiştii în domeniu vor putea analiza dacă celulele T induse de o variantă a unei peptide specifice vor putea reacţiona încrucişat la peptida în sine (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Celulele T pot apoi reacţiona încrucişat cu celulele şi pot ucide celulele care exprimă o polipeptidă care conţine secvenţa naturală de aminoacizi a peptidei înrudite definite în descrierea invenţiei. După cum se poate deriva din literatura de specialitate şi baze de date (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), anumite poziţii ale peptidelor care leagă HLA sunt de obicei reziduuri ancoră care constituie o secvenţă centrală care corespunde tiparului de cuplare al incizurii de cuplare a receptorului HLA, care este definit de proprietăţile polare, electrofizice, hidrofobe şi spaţiale ale lanţului polipeptidei care constituie incizura de cuplare. Astfel, un expert în domeniu ar putea modifica secvenţele de aminoacizi stabilite în SEQ ID NO: 42, prin menţinerea resturilor-ancoră, şi vor putea stabili dacă aceste variante îşi menţin abilitatea de a se lega de moleculele MHC de clasă I sau II. Variantele descrise îşi păstrează abilitatea de a lega la TCR celule T activate, care, ulterior, pot reacţiona încrucişat cu celulele şi pot ucide celulele care exprimă polipeptida care conţine secvenţa naturală de aminoacizi a peptidei-cognat definite în descrierea invenţiei.

Peptidele originale (nemodificate) în conformitate cu descrierea din prezentul document se pot modifica prin substituirea unuia sau a mai multor resturi din diferite poziţii diferite, posibil selectate, din structura catenei peptidice, dacă nu s-a specificat altfel. Preferabil, aceste substituţii sunt localizate la capătul catenei de aminoacizi. Astfel de substituţii pot fi conservatoare, de exemplu, dacă un aminoacid este substituit cu un alt aminoacid cu structură şi caracteristici similare, astfel încât de exemplu un aminoacid hidrofob să fie înlocuit cu un alt aminoacid hidrofob. Mult mai conservatoare ar fi înlocuirea aminoacizilor cu unii de dimensiune şi natură chimică identică sau similară, cum ar fi în cazul în care leucina este înlocuită de izoleucină. În studiile variaţiilor de secvenţe la familii cu proteine omologe natural-survenite, anumite substituţii aminoacidice sunt mai frecvent tolerate decât altele, aceasta corelându-se cu similitudinile de dimensiune, sarcină, polaritate şi hidrofobicitate dintre aminoacidul natural şi cel care îl înlocuieşte, aceasta fiind baza de definire a „substituţiilor conservatoare».

Substituţiile conservatoare sunt în prezentul document definite ca schimburi în cadrul unuia dintre următoarele cinci grupuri: Grupul 1 - resturi mici, alifatice, nepolare sau uşor polare (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupul 2 - resturi polare, încărcate negativ şi amidele lor (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupul 3 - resturi polare, încărcate pozitiv (His, Arg, Lys); Grupul 4 - resturi mari, alifatice, nepolare (Met, Leu, Ile, Val, Cys); şi Grupul 5 - resturi mari, aromatice (Phe, Tyr, Trp).

Substituţiile mai puţin conservatoare pot implica schimbarea unui aminoacid cu un altul cu caracteristici similare dar oarecum diferit ca dimensiuni, cum ar fi de exemplu substituirea alaninei cu un rest de izoleucină. Substituţiile înalt non-conservatoare pot implica substituirea unui aminoacid acid cu unul care este polar sau chiar bazic. Astfel de substituţii „radicale» nu pot fi apreciate, totuşi, ca potenţial ineficiente deoarece efectele chimice nu sunt complet previzibile; astfel de substituţii radicale pot provoca efecte caracterizate de serendipitate, fiind impredictibile pe baza principiilor chimice elementare.

Desigur, aceste substituţii pot implica structuri diferite de L-aminoacizii uzuali. Astfel, D-aminoacizii se pot substitui cu L-aminoacizii identificaţi uzual în peptidele antigenice descrise. În plus, aminoacizii nestandard (adică alţii decât aminoacizii proteinogeni care se găsesc în mod natural) pot fi utilizaţi şi în scopuri de substituţie pentru a produce imunogeni şi polipeptide imunogene conform celor descrise.

Dacă substituţiile din mai mult de o poziţie se descoperă că pot conduce la o peptidă cu activitate antigenică substanţial echivalentă sau mai mare decât cea descrisă mai jos, atunci aceste substituţii se vor testa pentru a identifica dacă substituţiile combinate provoacă efecte cumulative sau sinergice ale antigenicităţii peptidei. În cel mai rău caz, nu se pot substitui simultan mai mult de 4 poziţii din cadrul peptidei.

O peptidă constând în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată aici poate avea unul sau doi aminoacizi neancoraţi (a se vedea mai jos în ceea ce priveşte motivul de ancoră) schimbaţi fără ca această capacitate de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată substanţial sau să fie afectată negativ în comparaţie cu peptida nemodificată. Într-o altă concretizare, într-o peptidă care constă în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată în prezentul document, unul sau doi aminoacizi pot fi schimbaţi cu partenerii lor de schimb conservatori (a se vedea aici mai jos), fără ca această capacitate de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată substanţial sau este afectată negativ în comparaţie cu peptida nemodificată.

Reziduurile aminoacidice care nu contribuie substanţial la interacţiunea cu receptorul celulelor T pot fi modificate prin substituirea cu alţi aminoacizi a căror încorporare nu modifică substanţial reactivitatea celulelor T şi care nu elimină cuplarea cu MHC relevant. Astfel, cu excepţia condiţiei explicate, peptida descrisă poate fi orice peptidă (termen în care includem şi oligopeptide, şi polipeptide) care include secvenţele de aminoacizi sau o porţiune sau variantă a acestora.

Peptida conformă cu prezenta invenţie va avea capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I. Legarea unei peptide sau a unei variante a complexului MHC se poate testa prin metode cunoscute în domeniu.

De preferat, atunci când celulele T specifice pentru o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie faţă de peptide substitute, concentraţia de peptide la care peptidele substituite ating jumătate din creşterea maximă a lizei comparativ cu fundalul este mai mică de 1mM, preferabil nu depăşeşte 1 μM, şi mai preferabil nu depăşeşte 1nM, cel mai preferabil nu depăşeşte 100 pM şi în mod ideal nu depăşeşte 10 pM. Este de asemenea de preferat ca peptida substituită să fie recunoscută de celule T provenind de la mai mulţi indivizi, preferabil doi, dar, şi mai preferabil, trei indivizi.

În plus, peptida sau varianta pot fi ulterior modificate pentru a îmbunătăţi stabilitatea şi/sau legarea de molecule MHC pentru a exercita un răspuns imun mai puternic. Metodele pentru această optimizare a secvenţei de peptidă este cunoscută în domeniu şi poate include, de exemplu, introducerea unor legături non-peptidice.

O legătură non-peptidică este, de exemplu, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, şi -CH2SO-. US 4,897,445 furnizează o metodă pentru sinteza în fază solidă a unor legături non-peptidice (-CH2-NH) în lanţuri de polipeptide care implică polipeptide sintetizate de procedurile standard şi legături non-peptidice sintetizate prin reacţia dintre o amino-aldehidă şi un aminoacid în prezenţa NaCNBH3.

O peptidă în care peptida include punţi nepeptidice este o realizare preferată a invenţiei.

O altă concretizare a prezentei invenţii se referă la o peptidă care nu apare în mod natural, în care respectiva peptidă constă dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 42 şi a fost produsă sintetic (de exemplu, sintetizată) ca o sare acceptabilă farmaceutic. Metodele de producere sintetică de peptide sunt bine cunoscute în domeniu. Sărurile peptidelor în conformitate cu prezenta invenţie diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele generate in vivo nu sunt săruri. Forma de sare non-naturală a peptidei mediază solubilitatea peptidei, în special în contextul compoziţiilor farmaceutice care cuprind peptidele, de exemplu vaccinurile peptidice descrise în prezentul document. Pentru a furniza în mod eficace peptidele subiectului care trebuie tratat, este necesară o solubilitate suficientă şi cel puţin substanţială a peptidei (peptidelor). De preferinţă, sărurile sunt săruri ale peptidei acceptabile farmaceutic. Aceste săruri în conformitate cu invenţia includ săruri alcaline şi alcalino-pământoase, cum ar fi sărurile din seria Hofmeister cuprinzând sub formă de anioni PO4 3-, SO4 2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN- şi sub formă de cationi NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ şi Ba2+. În special, sărurile sunt alese din (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2 şi Ba(SCN)2. De preferat sunt, în special, acetatul de NH, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl şi CaCl2, cum ar fi, de exemplu, sărurile cu clorură sau acetat (trifluoroacetat).

În general, peptidele şi variantele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile aminoacidice) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lu et al. (Lukas et al., 1981) şi referinţele citate în prezentul document. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacid sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosind proceduri care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic şi izotin-test. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (vezi, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004) şi referinţele citate în prezentul document).

Acidul trifluoroacetic este îndepărtat prin evaporare in vacuo, cu triturarea ulterioară cu dietileter, care duce la formarea peptidei brute. Toate substanţele de curăţare prezente sunt eliminate printr-o procedură simplă de extragere, care, după liofilizare în fază apoasă, conduce la peptida brută fără substanţe de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, de la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).

Purificarea poate fi realizată prin una sau mai multe tehnici, precum recristalizarea, cromatografia cu excludere dimensională, cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu interacţiune hidrofobă şi (de regulă) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, folosind, de exemplu, separare în gradient de acetonitril/apă.

Analiza peptidelor poate fi efectuată folosind cromatografie în strat subţire, electroforeză, în particular electroforeză capilară, extragere în fază solidă (CSPE), cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, analiză a aminoacizilor după hidroliza acidă şi prin analiză spectrometrică în masă la bombardarea rapidă cu atomi (FAB), dar şi analiză spectrometrică în masă de tip MALDI şi ESI-Q-TOF.

Pentru a selecta peptide supraprezentate, se calculează un profil de prezentare arătând prezentarea mediană a probei, precum şi variaţia replicării. Profilul juxtapune probe ale entităţii tumorale de interes pentru o linie de bază a probelor de ţesut normal. Fiecare dintre aceste profiluri poate fi apoi consolidat într-un scor de supraprezentare, calculându-se valoarea p a unui model liniar cu efecte combinate (Pinheiro et al., 2015), care se ajustează pentru testarea multiplă prin rata de descoperire falsă (Benjamini and Hochberg, 1995) (vezi Exemplul 1, Figura 1).

Pentru identificarea şi cuantificarea relativă a liganzilor HLA prin spectrometrie de masă, moleculele HLA din probele de ţesut îngheţat prin şoc au fost purificate şi peptidele asociate cu HLA au fost izolate. Peptidele izolate au fost separate şi secvenţele au fost identificate prin experimente online de nano-electropulverizare-ionizare (nanoESI) prin cromatografie de lichid-spectrometrie de masă (LC-MS). Secvenţele peptidice rezultate au fost verificate prin compararea modelului de fragmentare a peptidelor asociate tumorii (TUMAP) naturale înregistrate din probe de cancer mamar (N = 17 probe A*02-pozitive) cu modele de fragmentare ale peptidelor de referinţă sintetice corespunzătoare ale secvenţelor identice. Deoarece peptidele au fost identificate direct ca liganzi ai moleculelor HLA ale tumorilor primare, aceste rezultate furnizează dovezi directe pentru procesarea şi prezentarea naturale ale peptidelor identificate pe ţesutul canceros primar obţinut de la 17 paciente cu cancer mamar.

Pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.1 (vezi, de exemplu, US 2013-0096016, care este încorporat în mod specific aici prin referinţă în întregime) permite identificarea şi selectarea candidaţilor relevanţi pentru vaccinare cu peptide supraprezentate pe baza cuantificării relative directe a nivelurilor de peptide HLA-restricţionate pe ţesuturile canceroase comparativ cu mai multe ţesuturi şi organe necanceroase diferite. Acest lucru a fost realizat prin dezvoltarea unei cuantificări diferenţiale fără etichete utilizându-se datele LC-MS obţinute, procesate de un pipeline patentat de analiză a datelor, combinându-se algoritmi pentru identificarea secvenţelor, gruparea spectrală, numărarea ionilor, alinierea timpului de retenţie, deconvoluţia de stare a încărcării şi normalizarea.

Au fost stabilite nivelurile de prezentare, inclusiv estimările de eroare pentru fiecare peptidă şi probă. Au fost identificate peptide prezentate exclusiv pe ţesuturi tumorale şi peptide supraprezentate în tumoră faţă de ţesuturi şi organe necanceroase.

Complexele HLA-peptidă din probe de ţesut de cancer mamar au fost purificate şi peptidele HLA-asociate au fost izolate şi analizate prin LC-MS (vezi exemplele). Toate peptidele TUMAP conţinute în prezenta aplicaţie au fost identificate cu această abordare pe probe de cancer mamar primar, confirmându-se prezentarea acestora pe cancer mamar primar.

TUMAP-urile identificate pe mai multe ţesuturi de cancer mamar şi ţesuturi normale au fost cuantificate utilizându-se numărarea de ioni la datelor LC-MS fără marcaje. Metoda presupune că zonele de semnal LC-MS ale unei peptide se corelează cu abundenţa sa în probă. Toate semnalele cantitative ale unei peptide în diferite experimente LC-MS au fost normalizate pe baza tendinţei centrale, mediate per probă şi fuzionate într-o diagramă de bare, denumită profil de prezentare. Profilul de prezentare consolidează diferite metode de analiză, cum ar fi căutarea în baza de date cu proteine, gruparea spectrală, deconvoluţia de stare de încărcare (decompresie) şi alinierea şi normalizarea timpului de retenţie.

În afară de supraprezentarea peptidei, a fost testată exprimarea ARNm al genei de bază. Datele despre ARNm au fost obţinute prin analize RNASeq ale ţesuturilor normale şi ale ţesuturilor canceroase (cf. Exemplul 2, Figurile 2). O sursă suplimentară de date privind ţesuturile normale a fost o bază de date cu date de exprimare a ARN-ului disponibilă public din aproximativ 3000 de probe de ţesut normal (Lonsdale, 2013). Peptide care sunt derivate din proteine al căror ARNm de codificare este foarte exprimat în ţesutul canceros, dar foarte scăzut sau absent în ţesuturi normale vitale, au fost incluse de preferinţă în prezenta invenţie.

Prezenta invenţie furnizează peptide care sunt utile în tratamentul cancerelor/tumorilor, de preferinţă cancer mamar, care supraprezintă sau prezintă exclusiv peptidele invenţiei. Aceste peptide sunt ilustrate prin spectrometrie de masă pentru a fi prezentate în mod natural de către moleculele HLA pe probe de cancer mamar primar.

S-a constatat că multe dintre genele-/proteinele-sursă (denumite şi „proteine de lungime completă» sau „proteine subiacente») din care derivă peptidele sunt foarte supraexprimate în cancer comparativ cu ţesuturile normale - „ţesuturi normale», în raport cu această invenţie, înseamnă fie celule mamare sănătoase, fie alte celule de ţesut sănătos, care demonstrează un grad ridicat de asociere tumorală a genelor-sursă (vezi Exemplul 2). Mai mult, peptidele în sine sunt puternic supraprezentate pe ţesutul tumoral - „ţesut tumoral», în raport cu această invenţie, înseamnă o probă de la un pacient care suferă de cancer mamar, însă nu şi pe ţesuturi normale (vezi Exemplul 1).

Peptidele legate de HLA se pot recunoaşte de către sistemul imunitar, în special de limfocite T. Celulele T pot distruge celulele care prezintă complexul HLA-peptidă recunoscut, de exemplu celulele din cancerul mamar care prezintă peptidele derivate.

Peptidele din prezenta invenţie s-au dovedit a fi capabile să stimuleze răspunsurile celulelor T şi/sau sunt supraprezentate şi astfel pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, cum ar fi sTCR-uri solubile, conform prezentei descoperiri (vezi Exemplul 3 şi Exemplul 4). Mai mult, complexul format de peptide cu MHC-ul respectiv poate fi folosit şi pentru producţia de anticorpi specifici şi/sau TCR, în particular sTCR, în conformitate cu prezenta invenţie. Metodele respective sunt bine cunoscute de experţii în domeniu şi pot fi găsite şi în literatura de specialitate respectivă. Astfel, peptidele din prezenta invenţie sunt utile pentru generarea unui răspuns imunitar la un pacient, prin care celulele tumorale pot fi distruse. Răspunsul imun la pacient poate fi indus prin administrarea directă a peptidelor descrise sau a substanţelor precursoare adecvate (de exemplu peptide elongate, proteine sau acizi nucleici care codifică aceste peptide) la pacient, în mod ideal combinate cu un agent care creşte imunogenitatea (de exemplu un adjuvant). Răspunsul imunitar care are originea în astfel de vaccinare terapeutică se poate aştepta să fie foarte specific împotriva celulelor tumorale deoarece peptidele ţintă ale prezentei invenţii nu sunt prezente pe ţesuturi normale în numere de copii comparabile, fapt care previne riscul unor reacţii autoimune nedorite îndreptat împotriva celulelor normale ale pacientului.

Prezenta descoperire se referă şi la receptori de celule T (TCR-uri) care cuprind un lanţ alfa şi un lanţ beta („TCR-uri alfa/beta»). De asemenea, sunt furnizate peptide în conformitate cu invenţia capabile să se lege la TCR-uri şi anticorpi atunci când sunt prezentate de o moleculă MHC. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă pentru exprimarea TCR-urilor şi peptidelor din prezenta descoperire, precum şi la metodele de utilizare ale acestora.

Termenul „receptor de celule T» (prescurtat TCR) se referă la o moleculă heterodimerică cuprinzând un lanţ polipeptidic alfa (lanţ alfa) şi un lanţ polipeptidic beta (lanţ beta), în care receptorul heterodimeric este capabil să se lege cu un antigen peptidic prezentat de o moleculă HLA. Termenul include, de asemenea, aşa-numitele TCR-uri gamma/delta.

Într-una dintre concretizări, descoperirea oferă o metodă de producere a unui TCR aşa cum este descris aici, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă capabile să exprime TCR-ul în condiţii adecvate pentru promovarea exprimării TCR.

Descrierea într-un alt aspect se referă la metode în conformitate cu descrierea în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen sau antigenul este încărcat pe terameri MHC de clasă I prin tetramerizarea monomerilor complexului antigen/MHC de clasă I.

Lanţurile alfa şi beta ale TCR-urilor alfa/beta şi lanţurile gamma şi delta ale TCR-urilor gamma/delta sunt considerate, în general, ca având fiecare două „domenii», respectiv domenii variabile şi constante. Domeniul variabil constă într-o concatenare a regiunii variabile (V) şi a regiunii de unire (J). Domeniul variabil poate include, de asemenea, o regiune lider (L). Lanţurile beta şi delta pot include, de asemenea, o regiune de diversitate (D). Domeniile constante alfa şi beta pot include, de asemenea, domenii transmembranare C-terminale (TM) care ancorează lanţurile alfa şi beta la membrana celulară.

În ceea ce priveşte TCR-urile gamma/delta, termenul „domeniu variabil TCR gamma», aşa cum este utilizat aici, se referă la concatenarea regiunii TCR gamma V (TRGV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR gamma J (TRGJ), iar termenul „domeniu constant TCR gamma» se referă la regiunea TRGC extracelulară sau la o secvenţă TRGC trunchiată C-terminal. În mod similar, termenul „domeniu variabil TCR delta» se referă la concatenarea regiunii TCR delta V (TRDV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), iar termenul „domeniu constant TCR delta» se referă la regiunea TRDC extracelulară sau la o secvenţă TRDC trunchiată C-terminal.

TCR-urile din prezenta descoperire se leagă de preferinţă la un complex de molecule peptidice-HLA cu o afinitate de legare (KD) de aproximativ 100 µM sau mai puţin, de aproximativ 50 µM sau mai puţin, de aproximativ 25 µM sau mai puţin ori de aproximativ 10 µM sau mai puţin. Mai preferate sunt TCR-urile cu afinitate ridicată care au afinităţi de legare de aproximativ 1 µM sau mai puţin, de aproximativ 100 nM sau mai puţin, de aproximativ 50 nM sau mai puţin, de aproximativ 25 nM sau mai puţin. Exemple nelimitatoare de afinitate de legare preferate pentru TCR-urile prezentei invenţii includ: de la aproximativ 1 nM până la aproximativ 10 nM; de la aproximativ 10 nM până la aproximativ 20 nM; de la aproximativ 20 nM până la aproximativ 30 nM; de la aproximativ 30 nM până la aproximativ 40 nM; de la aproximativ 40 nM până la aproximativ 50 nM; de la aproximativ 50 nM până la aproximativ 60 nM; de la aproximativ 60 nM până la aproximativ 70 nM; de la aproximativ 70 nM până la aproximativ 80 nM; de la aproximativ 80 nM până la aproximativ 90 nM; şi de la aproximativ 90 nM până la aproximativ 100 nM.

Aşa cum este utilizat aici în legătură cu TCR-urile din prezenta descoperire, „legare specifică» şi variante gramaticale ale acestei sintagme sunt utilizate pentru a desemna un TCR care are o afinitate de legare (KD) pentru un complex molecular peptidă-HLA de 100 µM sau mai puţin.

TCR-uri alfa/beta heterodimerice din prezenta descoperire pot avea o legătură disulfurică introdusă între domeniile lor constante. TCR-urile preferate de acest tip le includ pe cele care au o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, cu excepţia faptului că Thr 48 din TRAC şi Ser 57 din TRBC1 sau TRBC2 sunt înlocuite cu reziduuri de cisteină, cisteinele menţionate formând o legătură disulfurică între secvenţa de domeniu constant TRAC şi secvenţa de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului.

Cu sau fără legătura între lanţuri introdusă menţionată mai sus, TCR-urile heterodimerice alfa/beta din prezenta descoperire pot avea o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, iar secvenţa de domeniu constant TRAC şi de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului poate fi legată de legătura disulfurică nativă dintre Cys4 din exonul 2 al TRAC şi Cys2 din exonul 2 al TRBC1 sau TRBC2.

TCR-urile din prezenta descoperire pot cuprinde o etichetă detectabilă aleasă din grupul constând dintr-un radionuclid, un fluorofor şi biotină. TCR-urile din prezenta descoperire pot fi conjugate cu un agent activ terapeutic, cum ar fi un radionuclid, un agent chimioterapeutic sau o toxină.

Într-una dintre concretizări, un TCR din prezenta descoperire care are cel puţin o mutaţie în lanţul alfa şi/sau cel puţin o mutaţie în lanţul beta a modificat glicozilarea în comparaţie cu TCR-ul fără mutaţie.

În altă concretizare, un TCR cuprinzând cel puţin o mutaţie în lanţul alfa TCR şi/sau lanţul beta TCR are o afinitate de legare pentru şi/sau o semiviaţă de legare pentru un complex de molecule peptidă-HLA care este cel puţin dublu faţă de un TCR cuprinzând lanţul alfa TCR fără mutaţie şi/sau lanţul beta TCR fără mutaţie. Creşterea afinităţii TCR-urilor specifice tumorii şi exploatarea acesteia se bazează pe existenţa unei ferestre pentru afinităţi optime ale TCR-urilor. Existenţa unei astfel de ferestre se bazează pe observaţii conform cărora TCR-urile specifice pentru agenţii patogeni cu HLA-A2-restricţionaţi au valori KD care sunt în general de aproximativ 10 ori mai mici în comparaţie cu TCR-uri specifice pentru autoantigenii asociaţi tumorii HLA-A2-restricţionate. Este cunoscut acum că, deşi antigenii tumorali au potenţialul de a fi imunogeni, deoarece tumorile apar din propriile celule ale individului, numai proteinele cu mutaţie sau proteinele cu procesare translaţională modificată vor fi văzute ca străine de către sistemul imunitar. Antigenii care sunt reglaţi în sens crescător sau supraexprimaţi (aşa-numiţii autoantigeni) nu vor induce neapărat un răspuns imun funcţional împotriva tumorii: Celulele T care exprimă TCR-uri foarte reactive la aceşti antigeni au fost selectate negativ în timus într-un proces cunoscut sub numele de toleranţă centrală, ceea ce înseamnă că rămân doar celulele T cu TCR-uri cu afinitate scăzută pentru autoantigeni. Prin urmare, afinitatea TCR-urilor sau a variantelor din prezenta descriere pentru peptide poate fi îmbunătăţită prin metode bine cunoscute în domeniu.

Prezenta descriere se mai referă la o metodă de identificare şi de izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, respectiva metodă cuprinzând incubarea de PBMC-uri de la donatori sănătoşi HLA-A*02-negativi cu monomeri peptidici/A2, incubarea PBMC-urilor cu tetramer-ficoeritrină (PE) şi izolarea celulelor T cu aviditate ridicată prin analiză cu sortare de celule activată prin - (FACS)-Calibur.

Prezenta descriere se mai referă la o metodă de identificare şi de izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, respectiva metodă cuprinzând obţinerea unui şoarece transgenic cu întregii loci a genei TCRαꞵ complet umani (1,1 şi 0,7 Mb) ale cărui celule T exprimă un repertoriu divers de TCR-uri umane, repertoriu care compensează deficienţa de TCR-uri de şoarece, imunizând şoarecele cu o peptidă, incubând PBMC-urile obţinute de la şoarecii transgenici cu tetramer-fitoceritrină (PE) şi izolând celulele T cu aviditate ridicată prin analiză cu sortare de celule activată prin fluorescenţă (FACS)-Calibur.

Într-unul dintre aspecte, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descoperire, acizii nucleici care codifică lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta din prezenta descoperire sunt clonaţi în vectori de exprimare, de exemplu gamma-retrovirus sau gamma-lentivirus. Virusurile recombinante sunt generate şi apoi testate pentru funcţionalitate, cum ar fi specificitatea antigenică şi aviditatea funcţională. O parte alicotă a produsului final este apoi utilizată pentru a transduce populaţia de celule T ţintă (în general purificată din PBMC-urile pacientului), care este extinsă înainte de perfuzare în pacient.

Într-un alt aspect, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descoperire, ARN-urile TCR-urilor sunt sintetizate prin tehnici cunoscute în domeniu, de exemplu, cu sisteme de transcripţie in vitro. ARN-urile de TCR sintetizate in vitro sunt apoi introduse în celulele T CD8 + primare obţinute de la donatori sănătoşi prin electroporare pentru a reexprima lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta specifice tumorii.

Pentru a creşte exprimarea, acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descoperire pot fi legaţi în mod operaţional cu promotori puternici, cum ar fi repetiţiile terminale lungi retrovirale (LTR-uri), citomegalovirusul (CMV), virusul celulelor stem murine (MSCV) U3, fosfogliceratul kinazic (PGK) , ꞵ-actina, ubiquitina şi un promotor compus de virus simian 40 (SV40)/CD43, factorul de alungire (EF)-1a şi promotorul de virus formator de focar splenic (SFFV). Într-o concretizare preferată, promotorul este heterolog cu acidul nucleic exprimat.

În afară de promotori puternici, casetele de exprimare a TCR-urilor din prezenta descoperire pot conţine elemente suplimentare care pot îmbunătăţi exprimarea transgenică, inclusiv un tract polipurinic central (cPPT), care promovează translocarea nucleară a construcţiilor lentivirale (Follenzi et al., 2000), şi elementul de reglare post-transcripţional al virusului hepatitei marmotei (wPRE), care creşte nivelul de exprimare transgenică prin creşterea stabilităţii ARN-ului (Zufferey et al., 1999).

Lanţurile alfa şi beta ale unui TCR din prezenta invenţie pot fi codificate de acizi nucleici localizaţi în vectori separaţi sau pot fi codificate de polinucleotide localizate în acelaşi vector.

Realizarea unei exprimări de suprafaţă de nivel ridicat a TCR-urilor necesită ca atât lanţurile TCR-alfa, cât şi lanţurile TCR-beta ale TCR-urilor introduse să fie transcrise la niveluri ridicate. Pentru a realiza acest lucru, lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta din prezenta descoperire pot fi clonate în construcţii bi-cistronice într-un singur vector, care s-a dovedit a fi capabil să depăşească acest obstacol. Utilizarea unui loc viral de intrare intra-ribozomal (IRES) între lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta are ca rezultat exprimarea coordonată a ambelor lanţuri, deoarece lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta sunt generate dintr-o singură transcriere care este scindată în două proteine în timpul translaţiei, asigurându-se producerea unui raport molar egal al lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta. (Schmitt et al. 2009).

Acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descoperire pot fi optimizaţi cu codoni pentru a creşte exprimarea de la o celulă-gazdă. Redundanţa în codul genetic permite codificarea unor aminoacizi de către mai mulţi codoni, însă anumiţi codoni sunt mai puţin „optimi» decât alţii din cauza disponibilităţii relative a ARNt-urilor corespondente, precum şi a altor factori (Gustafsson et al., 2004). Modificarea secvenţelor de gene TCR-alfa şi TCR-beta astfel încât fiecare aminoacid să fie codificat de codonul optim pentru exprimarea genelor de mamifere, precum şi eliminarea motivelor de instabilitate a ARNm-ului sau a locurilor de îmbinare criptice, s-a dovedit că îmbunătăţeşte semnificativ exprimarea genelor TCR-alfa şi TCR-beta (Scholten et al., 2006).

Mai mult, împerecherea greşită între lanţurile de TCR-uri introduse şi endogene poate cauza dobândirea de specificităţi care prezintă un risc semnificativ pentru autoimunitate. De exemplu, formarea de dimeri de TCR-uri mixte poate reduce numărul de molecule CD3 disponibile pentru formarea de complexe TCR împerecheate corespunzător şi, prin urmare, poate scădea semnificativ aviditatea funcţională a celulelor care exprimă TCR-ul introdus (Kuball et al., 2007).

Pentru a reduce împerecherea greşită, domeniul C-terminal al lanţurilor TCR introduse din prezenta descoperire poate fi modificat pentru promovarea afinităţii între lanţuri, reducând totodată capacitatea lanţurilor introduse de a se împerechea cu TCR-ul endogen. Aceste strategii pot include înlocuirea domeniilor TCR-alfa şi TCR-beta C-terminale umane cu omologii lor murini (domeniul C-terminal murinizat); generarea unei a doua legături de disulfură între lanţuri în domeniul C-terminal prin introducerea unui al doilea reziduu de cisteină atât în ​​lanţurile TCR-alfa, cât şi în lanţurile TCR-beta ale TCR-ului introdus (modificare a cisteinei); schimbarea între ele a reziduurilor care interacţionează în domeniile C-terminale ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta („buton în gaură»); şi fuzionarea domeniilor variabile ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta direct cu CD3ζ (fuziune CD3ζ). (Schmitt et al. 2009).

Într-una dintre concretizări, o celulă-gazdă este modificată pentru a exprima un TCR al prezentei descoperiri. În concretizările preferate, celula-gazdă este o celulă T umană sau un progenitor de celule T. În unele concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un pacient cu cancer. În alte concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un donator sănătos. Celulele-gazdă din prezenta descoperire pot fi alogene sau autologe în raport cu un pacient care urmează să fie tratat. Într-una dintre concretizări, gazda este o celulă T gamma/delta transformată pentru a exprima un TCR alfa/beta.

O „compoziţie farmaceutică» este compoziţie potrivită pentru administrarea la o fiinţă umană într-un cadru medical. De preferinţă, o compoziţie farmaceutică este sterilă şi produsă conform recomandărilor GMP.

Compoziţiile farmaceutice conţin peptidele fie în forma liberă fie sub forma unei săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic (a se vedea mai sus). În accepţiunea prezentului document, „sare acceptabilă (din punct de vedere) farmaceutic» se referă la un derivat al peptidei menţionate în care peptida este modificată prin formarea de săruri acide sau bazice ale agentului. De exemplu, sărurile acide sunt produse din baza liberă (de obicei în forma neutră medicamentul are o grupare -NH2 neutră) prin reacţia cu un acid adecvat. Acizii adecvaţi pentru pregătirea sărurilor acide includ atât acizi organici (de exemplu acid acetic, acid propionic, acid glicolic, acid piruvic, acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid succinic, acid maleic, acid fumaric, acid tartaric, acid citric, acid benzoic, acid cinamic, acid mandelic, acid metansulfonic, acid etansulfonic, acid p-toluensulfonic, acid salicilic şi alţii asemenea lor), cât şi acizi anorganici, cum ar fi acidul clorhidric, acidul bromhidric, acidul sulfuric, acidul azotic, acidul fosforic şi alţii asemenea lor. Dimpotrivă, preparatele sărurilor bazice ale grupărilor acide care pot face parte din peptidă sunt preparate folosind o bază acceptabilă farmaceutic, cum ar fi hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu, hidroxidul de amoniu, hidroxidul de calciu, trimetilamina sau altele asemenea.

Într-o concretizare preferată în mod special, compusul farmaceutic cuprinde peptidele sub forma unor săruri de acid acetic (acetaţi), trifluor-acetaţi sau săruri de acid clorhidric (cloruri).

Preferabil, medicamentul din prezenta invenţie este unul imunoterapeutic, de exemplu un vaccin. Acesta poate fi administrat direct pacientului, în organul afectat sau administrat pe cale sistemică, i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. sau aplicat ex vivo celulelor preluate de la pacient sau unei linii de celule umane care sunt apoi administrate pacientului sau utilizate in vitro pentru selectarea unei subpopulaţii de celule imune derivate de la pacient, care sunt apoi readministrate pacientului. Dacă acidul nucleic este administrat celulelor in vitro, poate fi util ca celulele să fie transfectate astfel încât să coexprime citokine imunostimulatoare, cum este interleukina 2. Peptida poate fi substanţial pură sau combinată cu un adjuvant stimulator imun (vezi mai jos) ori poate fi utilizată în combinaţie cu citokine imunostimulatoare sau poate fi administrată cu un sistem de livrare adecvat, de exemplu lipozomi. De asemenea, peptida poate fi conjugată cu un transportor adecvat, cum ar fi hemocianina melcului Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH) sau mannan (vezi WO 95/18145 şi (Longenecker et al., 1993)). Peptida poate fi, de asemenea, ţintită, o proteină de fuziune sau o moleculă hibridă. Se anticipează că peptidele a căror secvenţă este furnizată în prezenta invenţie vor stimula celule T CD4 sau CD8. Cu toate acestea, stimularea celulelor T CD8 este mai eficientă în prezenţa celulelor T helper CD4. În consecinţă, pentru epitopii MHC de clasă I care stimulează celulele T CD8, partenerul sau secţiunile de fuziune ale unei molecule hibride furnizează în mod adecvat epitopi care stimulează celule T CD4-pozitive. Epitopii care stimulează CD4 şi CD8 sunt bine-cunoscuţi în domeniu şi includ pe cei identificaţi în prezenta invenţie.

Într-unul dintre aspecte, vaccinul cuprinde cel puţin o peptidă care are secvenţa de aminoacizi prezentată SEQ ID NO. 42 şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă două până la 50, mai preferabil două până la 25, chiar mai preferabil două până la 20 şi cel mai preferabil două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece, paisprezece, cincisprezece, şaisprezece, şaptesprezece sau optsprezece peptide. Peptida(ele) poate (pot) fi preluată(e) din unul sau mai multe TAA specifice şi se pot lega de molecule MHC de clasă I.

Un alt aspect al invenţiei furnizează un acid nucleic (de exemplu o polinucleotidă) care codifică o peptidă sau o variantă de peptidă din invenţie. Polinucleotida poate fi, de exemplu, ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie a acestora, în helix simplu şi/sau dublu sau în forme native sau stabilizate de polinucleotide, cum ar fi, de exemplu, polinucleotidele cu bază de fosforotioat şi poate conţine sau nu introni, cu condiţia să codifice pentru peptidă. Desigur, numai peptidele care conţin resturi de aminoacid existente în mod natural şi unite prin legături peptidice care apar în mod natural sunt codificabile de o polinucleotidă. Un alt aspect al invenţiei constă în furnizarea unui vector de exprimare care exprimă o polipeptidă, conform invenţiei.

Au fost dezvoltate mai multe metode de legare a polinucleotidelor, în special a ADN-ului, de vectori, de exemplu, prin terminale coezive complementare. De exemplu segmentului ADN i se pot adăuga regiuni homopolimerice complementare care să fie introduse în ADN-ul vector. Vectorul şi segmentul ADN sunt apoi unite prin punţi de hidrogen între cozile complementare homopolimer pentru a forma molecule ADN recombinate.

Agenţii de legătură sintetici care conţin unul sau mai multe situri limitative oferă o modalitate alternativă de alăturare a segmentelor ADN la vectori. Agenţii de legare care conţin o varietate de situri de endonucleaze de restricţie sunt disponibili comercial de la mai multe surse, dintre care amintim pe International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SUA.

O metodă preferabilă de modificare a ADN-ului care codifică polipeptida invenţiei utilizează reacţia de polimerază în lanţ descrisă de Saiki RK et al. (Saiki et al., 1988) Această metodă poate fi utilizată pentru introducerea ADN-ului într-un vector potrivit, de exemplu prin implementarea în locaţii cu restricţii adecvate sau poate fi utilizată pentru modificarea ADN-ului în alte moduri, după cum este cunoscut în literatura de specialitate. În cazul utilizării unor vectori virali, sunt preferaţi vectorii virus variolic sau adenovirus.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) pot fi apoi exprimaţi într-o gazdă adecvată pentru a produce o polipeptidă compusă din peptidă sau varianta invenţiei. Prin urmare, ADN-ul care codifică peptida sau varianta din invenţie poate fi utilizat în conformitate cu tehnicile cunoscute, modificate corespunzător instrucţiunilor prezente, în vederea construirii unui vector de exprimare, care este apoi utilizat pentru transformarea unei celule-gazdă corespunzătoare pentru exprimarea şi producerea polipeptidei din invenţie. Astfel de tehnici includ cele descrise, de exemplu, în US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 şi 4,810,648.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) care codifică polipeptida care formează compusul invenţiei poate fi cuplat cu o mare varietate de alte secvenţe ADN pentru introducerea într-o gazdă adecvată. ADN-ul însoţitor va depinde de natura gazdei, modul de introducere a ADN-ului în gazdă şi dacă se doreşte integrarea sau întreţinerea episomală.

În general, ADN-ul este instrodus într-un vector de exprimare, cum ar fi o plasmidă, cu orientarea corectă şi intervalul potrivit de citire pentru exprimare. Dacă este necesar, ADN-ul poate fi corelat cu secvenţele de nucleotide de transcripţie şi translaţie corespunzătoare, recunoscute de gazda dorită, cu toate că astfel de controale sunt disponibile în general în vectorul de exprimare. Vectorul este apoi introdus în gazdă prin tehnicile standard. În general, nu toate gazdele vor fi transformate de vector. Prin urmare, va fi nevoie de selectarea unor celule-gazdă transformate. Una dintre tehnicile de selectare implică înglobarea în vectorul de exprimare a unei secvenţe ADN cu toate elementele de control necesare, care să codifice o trăsătură selectabilă din celula transformată, cum ar fi de exemplu rezistenţa la antibiotic.

Alternativ, gena unei asemenea trăsături selectabile poate fi pe un alt vector, care este folosit pentru a cotransforma celula-gazdă dorită.

Celulele-gazdă care au fost transformate de ADN-ul recombinant din cadrul invenţiei sunt apoi cultivate un timp suficient şi în condiţii corespunzătoare, cunoscute celor iniţiaţi, în conformitate cu îndrumările din acest document, pentru a permite exprimarea polipeptidei, care poate fi apoi recuperată.

Sunt cunoscute numeroase sisteme de exprimare, inclusiv bacterii (de exemplu, E. coli şi Bacillus subtilis), drojdii (de exemplu, Saccharomyces cerevisiae), fungi filamentoşi (de exemplu, Aspergillus spec.), celule vegetale, celule animale şi celule provenite de la insecte. Este de preferat ca sistemul să poată fi format din celule de mamifere, cum ar fi celulele CHO, disponibile din ATCC Cell Biology Collection.

O plasmidă vector tipică din celulă de mamifer pentru exprimarea constitutivă este compusă din protomerul CMV sau SV40 cu o coadă poli-A adecvată şi un marker de rezistenţă, cum ar fi neomicina. Un exemplu este pSVL, disponibil la Pharmacia, Piscataway, NJ, SUA. Un exemplu de vector de exprimare la mamifere inductibil este pMSG, disponibil tot de la Pharmacia. Plasmide-vector utile provenite din drojdii sunt pRS403-406 şi pRS413-416 şi sunt disponibile comercial de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SUA. Plasmidele pRS403, pRS404, pRS405 şi pRS406 sunt plasmide integrative din drojdii (Yeast Integrating plasmids, YIp) şi includ markerii selectabili din drojdii HIS3, TRP1, LEU2 şi URA3. Plasmidele pRS413-416 sunt plasmide centromer provenite din drojdii (Yeast Centromere plasmid, Ycp). Vectorii bazaţi pe stimulenţi CMV (de exemplu de la Sigma-Aldrich) furnizează o exprimare tranzitorie sau stabilă, o exprimare sau secreţie citoplasmică şi o marcare N-terminală sau C-terminală în diferite combinaţii de FLAG, 3xFLAG, c-myc sau MAT. Aceste proteine de fuziune permit detectarea, purificarea şi analiza proteinei recombinante. Fuziunile marcate dublu oferă flexibilitate la detectare.

Regiunea de reglare promotoare pentru citomegalovirusul uman puternic (CMV) determină creşterea nivelurilor exprimării de proteină constitutivă până la 1 mg/l în celulele COS. Pentru liniile de celule cu potenţial mai mic, nivelurile de proteină sunt în jurul valorii de ~0,1 mg/l. Prezenţa originii de replicare SV40 va conduce la niveluri ridicate de replicare a ADN-ului în celule COS permisive pentru replicarea SV40. Vectorii CMV, de exemplu, pot conţine originea pMB1 (derivată din pBR322) pentru replicare în celule bacteriene, gena b-lactamază pentru selecţia rezistenţei la ampicilină în bacterie, hGH polyA şi originea f1. Vectorii care conţin secvenţa de preprotripsină lider (PPT) pot direcţiona secreţia de proteine de fuziune FLAG în mediul de cultură pentru purificare cu ajutorul anticorpilor ANTI-FLAG, răşinilor şi plăcilor. Ceilalţi vectori şi celelalte sisteme de exprimare sunt bine cunoscute în domeniu pentru că sunt folosite cu o gamă variată de celule-gazdă.

Într-o altă realizare, două sau mai multe peptide descrise sunt codificate şi exprimate astfel în ordine succesivă (similar mărgelelor înşirate pe un fir). Procedând astfel, peptidele pot fi legate sau fuzionate împreună prin benzi de aminoacizi lianţi, cum ar fi de exemplu LLLLLL, sau pot fi legate fără alte peptide suplimentare între ele. Aceste construcţii pot fi utilizate, de asemenea, pentru terapia cancerului şi pot induce răspunsuri imunitare implicând MHC I şi MHC II.

Prezenta invenţie este legată şi de o serie de celule-gazdă transformate cu un vector polinucleotidic, creat în cadrul prezentei invenţii. Celula-gazdă poate fi procariotă sau eucariotă. Este posibil ca celulele bacteriene să fie celule-gazdă procariote preferate în anumite circumstanţe şi, de regulă, sunt o tulpină de E. coli, cum ar fi, de exemplu, tulpinile E. coli DH5, disponibile de la Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SUA, şi RR1, disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC) din Rockville, MD, SUA (No ATCC 31343). Printre celulele-gazdă eucariote se numără celulele de drojdie, insecte şi mamifere, de preferinţă celule de vertebrate precum cele de la şoarece, şobolan, maimuţă sau linii de celule fibroblastice sau de colon umane. Celulele-gazdă provenite din drojdii includ YPH499, YPH500 şi YPH501, care sunt disponibile în general de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, SUA. Celulele-gazdă preferate provenite de la mamifere includ celulele ovariene de hamster chinezesc, disponibile de la ATCC ca CCL61, celulele embrionare de cobai NIH elveţian, NIH/3T3 disponibile de la ATCC ca CRL 1658, celulele COS-1 derivate din rinichii de maimuţă disponibile de la ATCC ca CRL 1650 şi celulele 293 care sunt celule embrionare renale umane. Celulele preferate provenite de la insecte sunt celulele Sf9 care pot fi transfectate cu vectori de exprimare a baculovirusului. O prezentare generală a opţiunilor de celule-gazdă adecvate poate fi găsită, de exemplu, în manualul scris de Paulina Balbás şi Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Partea I, ediţia a doua, ISBN 978-1-58829-262-9 şi în alte lucrări cunoscute în domeniu.

Transformarea celulelor-gazdă adecvate cu un produs ADN obţinut pe baza acestui patent este realizată folosind metode bine cunoscute care depind de obicei de tipul de vector folosit. În ceea ce priveşte transformarea celulelor-gazdă procariote, vezi, de exemplu, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) şi (Green and Sambrook, 2012). Transformarea celulelor de drojdii este descrisă în Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metoda lui Beggs (Beggs, 1978) este, de asemenea, utilă. Referitor la celulele de la vertebrate, reactivii utili în transferul unor astfel de celule, de exemplu, formule pe bază de fosfat de calciu şi DEAE-dextran sau lipozom, sunt disponibili de la Stratagene Cloning Systems sau de la Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, SUA. Electro-permeabilizarea este de asemenea utilă pentru transformarea şi/sau transfectarea celulelor şi este o metodă bine cunoscută pentru transformarea celulelor provenite din drojdii, bacterii, insecte şi a celulelor vertebrate.

Celulele transformate cu succes, adică celulele care conţin o construcţie ADN din prezenta invenţie, pot fi identificate prin tehnici bine cunoscute, cum este PCR. Alternativ, prezenţa proteinei în stratul supranatant poate fi detectată folosind anticorpi.

Se va aprecia că anumite celule-gazdă din cadrul invenţiei sunt utile în pregătirea peptidelor din invenţie, de exemplu celule de bacterii, de drojdii şi de insecte. Totuşi, şi alte celule-gazdă pot fi utile pentru anumite metode terapeutice. De exemplu, celulele prezentatoare de antigen, cum ar fi celulele dendritice, pot fi şi ele utile pentru exprimarea peptidelor din acest brevet, astfel încât să fie încărcate în moleculele MHC adecvate. Prin urmare, această invenţie prezintă o celulă-gazdă, compusă dintr-un acid nucleic, sau un vector de exprimare, conform invenţiei.

Într-o concretizare preferată, celula-gazdă este o celulă prezentatoare de antigen, în particular o celulă dendritică sau o celulă prezentatoare de antigen. Celulele APC încărcate cu o proteină de fuziune recombinantă, care conţine fosfatază acidă prostatică (PAP), sunt în prezent în curs de investigare de către U.S. Food and Drug Administration (FDA) la data de 29 aprilie 2010 pentru tratamentul cancerului de prostată asimptomatic sau minim simptomatic (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Un alt aspect al invenţiei se referă la o metodă de producere a unei peptide, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

În altă concretizare, peptida, acidul nucleic sau vectorul de exprimare din invenţie este utilizat în medicină. De exemplu, peptida poate fi pregătită pentru injectare intravenoasă (i.v.), injectare subcutanată (s.c.), injectare intradermică (i.d.), injectare intraperitoneală (i.p.) sau injectare intramusculară (i.m.). Metodele preferate de administrare injectabilă pentru peptidă sunt s.c., i.d., i.p., i.m. şi i.v. Metodele preferate de administrare injectabilă pentru ADN sunt i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. Pot fi date doze de peptidă şi ADN cuprinse, de exemplu, între 50 µg şi 1,5 mg, preferabil între 125 µg şi 500 µg, şi vor depinde de peptida sau ADN-ul respectiv. Dozele din acest interval au fost utilizate cu succes în studii anterioare (Walter et al., 2012).

Polinucleotida utilizată pentru vaccinare activă poate fi substanţial pură sau poate fi conţinută de un vector sau de un sistem de livrare adecvat. Acidul nucleic poate fi ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie dintre acestea. Metodele pentru conceperea şi introducerea unui astfel de acid nucleic sunt bine cunoscute în domeniu. O prezentare generală este furnizată, de exemplu, de Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Vaccinurile polinucleotidice sunt uşor de preparat, însă modul de acţiune al acestor vectori în inducerea unui răspuns imunitar nu este pe deplin înţeles. Printre vectorii şi sistemele de livrare adecvate se numără ADN-ul şi/sau ARN-ul viral, cum ar fi sistemele bazate pe adenovirus, virusul vaccinia, retrovirusuri, adenovirusuri asociate sau hibrizi care conţin elemente din mai multe virusuri. Printre sistemele de livrare nevirale se numără lipide cationice şi polimeri cationici, bine cunoscuţi în domeniul livrării ADN-ului. Se poate folosi administrarea fizică, cum ar fi cea pe calea unui „pistol genic». Peptida sau peptidele codificată(e) de acidul nucleic poate (pot) fi o proteină de fuziune, de exemplu cu un epitop care stimulează celulele T pentru celula CDR opusă respectivă, după cum s-a observat mai sus.

Medicamentul din invenţie poate include şi unul sau mai mulţi adjuvanţi. Adjuvanţii sunt substanţe care ameliorează sau potenţează nespecific răspunsul imunitar (de exemplu, răspunsuri imunitare mediate de celule T CD8-pozitivr şi celule T helper (TH) la un antigen, şi care prin urmare poate fi considerat util în medicamentul din prezenta invenţie. Adjuvanţii adecvaţi includ, dar nu sunt limitaţi la 1018 ISS, săruri de aluminiu, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelină sau liganzi TLR5 derivaţi din flagelină, ligand FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleukine precum IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa sau beta sau derivaţi pegilaţi ai acestuia, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsii apă-în-ulei sau ulei-în-apă, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistem de vectori PepTel®, microparticule pe bază de poli(lactid co-glicolid) [PLG] şi dextran, talactoferină SRL172, virozomi şi alte particule similare virusurilor, YF-17D, capcană VEGF, R848, beta-glucan, Pam3Cys, stimulon Aquila's QS21, care este derivat din saponină, extracte microbacteriene şi imitatoare sintetice ale peretelui celular bacterian şi alţi adjuvanţi patentaţi, cum ar fi Ribi Detox, Quil sau Superfos. Adjuvanţii de tipul Freund sau GM-CSF sunt de preferat. Mai mulţi adjuvanţi imunologici (de exemplu, MF59) specifici pentru celulele dendritice şi prepararea lor au fost descrise anterior (Allison and Krummel, 1995). De asemenea, pot fi utilizate citokine. Mai multe citokine au fost legate direct de influenţarea migrării celulelor dendritice în ţesuturi limfoide (de exemplu, TNF-), accelerând maturarea celulelor dendritice în celule prezentatoare de antigen pentru limfocite T eficace (de exemplu, GM-CSF, IL-1 şi IL-4) (U.S. Pat. No. 5,849,589) şi acţionând ca imunoadjuvanţi (de exemplu, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

Oligonucleotidele imunostimulatoare CpG au fost raportate şi ca amelioratoare ale efectelor adjuvanţilor în formulele de vaccin. Fără a fi demonstrat teoretic, oligonucleotidele CpG acţionează prin activarea sistemului imunitar înnăscut (neadaptiv) prin receptori de tip Toll (TLR), în principal TLR9. Activarea TLR9 declanşată prin CpG ameliorează răspunsul umoral şi celular antigen-specific pentru o gamă variată de antigeni, inclusiv antigeni peptidici sau proteici, virus viu sau mort, vaccinuri cu celule dendritice, vaccinuri celulare autologe şi conjugate polizaharidice din vaccinuri profilactice şi terapeutice. Mai important, ameliorează maturizarea şi diferenţierea celulelor dendritice care duce la ameliorarea activării celulelor TH1 şi generarea de limfocite T citotoxice (CTL) puternice, chiar şi în absenţa ajutorului celulelor T CD4. Biasul TH1 indus prin stimularea TLR9 se menţine chiar şi în prezenţa unor adjuvanţi de vaccin cum ar fi alaunul sau adjuvantul Freund incomplet (IFA) care în mod normal promovează biasul TH2. Oligonucleotidele CpG prezintă o activitate adjuvantă chiar mai mare când este formulată sau coadministrată cu alţi adjuvanţi sau în formulări de tip microparticule, nanoparticule, emulsii lipidice sau alte formulări similare, care sunt necesare pentru a induce un răspuns puternic atunci când antigenul este relativ slab. Acestea accelerează şi răspunsul imun şi permit dozelor de antigen să fie reduse cu aproximativ două ordine de mărime, cu răspunsuri de tip anticorp comparabile cu vaccinul în doză completă fără CpG conform unor experimente (Krieg, 2006). US 6,406,705 B1 descrie utilizarea combinată de oligonucleotide CpG cu adjuvanţi non-acid nucleic şi un antigen pentru a induce un răspuns imunitar specific antigenului. Un antagonist TLR9 CpG este dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) de la Mologen (Berlin, Germania) care este o componentă preferată din compoziţia farmaceutică a prezentei invenţii. Se pot utiliza şi alte molecule care leagă TLR cum ar fi TLR7, TLR8 şi/sau TLR9 care leagă ARN.

Alte exemple de adjuvanţi utili includ, dar fără a se limita la, celule CpG modificate chimic (de exemplu, CpR, Idera), analogi de ARNdc, cum ar fi Poly(I:C) şi derivaţi ai acestora (de exemplu, AmpliGen®, Hiltonol®, poly-(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U), ADN sau ARN non-CpG bacterian, precum şi molecule mici şi anticorpi imunoactivi, precum ciclofosfamidă, sunitinib, Bevacizumab®, celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, alţi anticorpi care ţintesc structuri-cheie ale sistemului imunitar (de exemplu, receptorul anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalpha) şi SC58175, care poate acţiona terapeutic şi/sau ca adjuvant. Cantităţile şi concentraţiile adjuvanţilor şi aditivilor utili în contextul prezentei invenţii se pot determina direct de un profesionist fără a necesita experimente inutile.

Adjuvanţii preferaţi sunt anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamidă, sunitinib, bevacizumab, interferon alfa, oligonucleotide şi derivaţi de CpG, poli(I:C) şi derivaţi, ARN, sildenafil şi formulări sub formă de particule cu PLG sau virozomi.

Într-o formulare preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod, resiquimod şi interferon alfa.

În concretizarea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod şi resiquimod. Adjuvanţii şi mai preferaţi sunt Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) şi anti-CD40 mAB sau combinaţii ale acestora.

Această compoziţie este folosită pentru administrare parenterală, cum ar fi subcutanată, intradermică, intramusculară sau orală. Pentru aceasta, peptidele şi opţional alte molecule sunt dizolvate sau in suspensie într-un mediu de transport (transportor) farmacologic acceptabil, preferabil apos. În plus, compoziţia poate conţine excipienţi, cum ar fi tampoane, agenţi de legare, agenţi explozivi, diluanţi, arome, lubrifianţi etc. Peptidele pot fi, de asemenea, administrate împreună cu substanţe care stimulează imunitatea, cum ar fi citokinele. Lista exhaustivă de excipienţi care se pot folosi în această compoziţie poate, de exemplu, fi preluată din A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Compoziţia poate fi folosită pentru prevenirea, profilaxia şi/sau tratamentul bolilor adenomatoase sau canceroase. Exemple de formule pot fi găsite, de exemplu, în EP2113253.

Este important de înţeles că răspunsul imunitar declanşat de vaccin în conformitate cu invenţia atacă cancerul în diferite stadii celulare şi în diferite stadii de dezvoltare. Mai mult, sunt atacate diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Acesta este un avantaj faţă de vaccinurile care vizează doar una sau câteva ţinte, ceea ce poate determina adaptarea uşoară a tumorii la atac (evadare a tumorii). Mai mult, nu toate tumorile individuale exprimă acelaşi model de antigeni. Prin urmare, o combinaţie de mai multe peptide asociate tumorii asigură faptul că fiecare tumoare poartă cel puţin unele dintre ţinte. Compoziţia este concepută astfel încât fiecare tumoare este de aşteptat să exprime mai mulţi dintre antigeni şi să acopere mai multe căi independente necesare pentru creşterea şi menţinerea tumorii. Astfel, vaccinul poate fi „de uz general» pentru o populaţie mai mare de pacienţi. Acest lucru înseamnă că o preselectare a pacienţilor care urmează să fie trataţi cu vaccinul poate fi restricţionată la tiparea HLA, nu necesită evaluări suplimentare ale biomarkerului pentru exprimarea antigenului, dar este totuşi asigurat că mai multe ţinte sunt atacate simultan de răspunsul imunitar indus, ceea ce este important pentru eficacitate (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptida din prezenta invenţie se poate folosi pentru a genera şi a dezvolta anticorpi specifici contra complexelor MHC/peptidă. Acestea se pot folosi pentru tratament, direcţionarea toxinelor sau substanţelor radioactive către ţesutul bolnav. O altă utilizare a acestor anticorpi poate fi ţintirea radionuclizilor către ţesutul bolnav în scopuri imagistice, cum ar fi PET. Această utilizare poate ajuta la depistarea metastazelor mici sau pentru stabilirea dimensiunii şi localizării exacte a ţesutului bolnav.

Prin urmare, un alt aspect al invenţiei este furnizarea unei metode pentru producerea unui anticorp recombinant care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman care este complexat cu un antigen HLA-restricţionat, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă respectivul complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman cu o formă solubilă a moleculei MHC de clasă I complexată cu respectivul antigen HLA-restricţionat; izolarea moleculelor ARNm din celulele producătoare de anticorp ale respectivului mamifer non-uman; producerea unei biblioteci de prezentare a fagilor care prezintă molecule de proteină codificate de respectivele molecule ARNm; şi izolarea cel puţin a unui fag din respectiva bibliotecă de prezentare a fagilor, cel puţin un fag care prezintă anticorpul respectiv cu legare specifică la complexul major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman complexat cu antigenul HLA-restricţionat menţionat.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza un anticorp care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I, fiind complexat cu un antigen restricţionat HLA, în care anticorpul este, de preferinţă, un anticorp policlonal, un anticorp monoclonal, un anticorp bi-specific şi/sau un anticorp himeric.

Metodele respective pentru producerea unor astfel de anticorpi şi complexe majore de histocompatibilitate de clasă I cu catenă unică, precum şi alte instrumente pentru producerea acestor anticorpi sunt descrise în WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 şi în publicaţii (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003), care, în scopul prezentei invenţii, sunt toate încorporate în mod explicit prin referinţă în ansamblul lor.

Preferabil, anticorpul se leagă la complex cu o afinitate de legare mai mică de 20 nanomolari, preferabil sub 10 nanomolari, care este, de asemenea, considerată ca fiind „specifică» în contextul prezentei invenţii.

Prezenta invenţie se referă la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică a SEQ ID NO: 42 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia.

Prezenta invenţie se referă şi la peptida în conformitate cu invenţia care are capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la peptidele în conformitate cu invenţia în care respectivele peptide includ legături non-peptidice.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptidele în conformitate cu invenţia.

Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic în conformitate cu invenţia, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare care exprimă un acid nucleic conform prezentei invenţii.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în medicină, în special în tratarea cancerului mamar.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic conform invenţiei sau un vector conform invenţiei.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu invenţia în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO 42 sau varianta menţionată de secvenţă de aminoacizi.

Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celulele T menţionate recunosc selectiv o celulă care exprimă în mod aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie.

Este descrisă o metodă de ucidere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea pacientului unui număr eficace de celule T în conformitate cu prezenta invenţie.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, a unui vector de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, a unei celule în conformitate cu prezenta invenţie sau a unei limfocite T citotoxice activate în conformitate cu prezenta invenţie ca medicament sau în fabricarea unui medicament. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivul medicament este activ împotriva cancerului.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este un vaccin. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o utilizare în conformitate cu invenţia în care celule canceroase menţionate sunt celule de cancer mamar sau alte celule tumorale solide sau hematologice, cum ar fi leucemie mielogenă acută, cancer de cale biliară, cancer cerebral, leucemie limfocitară cronică, carcinom colorectal, cancer esofagian, cancer de vezică biliară, cancer gastric, cancer hepatocelular, carcinom cu celule Merkel, melanom, limfom non-Hodgkin, cancer pulmonar non-microcelular, cancer ovarian, cancer de pancreas, cancer de prostată, cancer de celule renale, cancer pulmonar microcelular, cancer de vezică urinară şi cancer uterin.

Termenul „anticorp» sau „anticorpi» este utilizat aici într-un sens larg şi include anticorpi atât policlonali, cât şi monoclonali. În plus faţă de moleculele de imunoglobulină intacte sau „complete», în termenul „anticorpi» sunt incluse, de asemenea, fragmente (de exemplu, fragmente de CDR, Fv, Fab şi Fc) sau polimeri ai acelor molecule de imunoglobulină şi versiunile umanizate ale moleculelor de imunoglobulină, atât timp cât acestea manifestă oricare dintre proprietăţile dorite (de exemplu, legarea specifică a unei (poli)peptide marker de cancer mamar, livrarea unei toxine într-o celulă de cancer mamar care exprimă o genă marker de cancer la un nivel crescut şi/sau inhibarea activităţii unei polipeptide marker de cancer mamar) în conformitate cu invenţia.

Ori de câte ori este posibil, anticorpii invenţiei pot fi achiziţionaţi din surse comerciale. Anticorpii conform invenţiei pot fi generaţi, de asemenea, folosindu-se metode bine cunoscute. Specialiştii în domeniu vor înţelege că, pentru generarea anticorpilor în conformitate cu invenţia, se pot folosi fie polipeptide markeri de cancer mamar de lungime completă, fie fragmente ale acestora. O polipeptidă de utilizat pentru generarea unui anticorp al invenţiei poate fi purificată parţial sau complet dintr-o sursă naturală sau poate fi produsă utilizându-se tehnici cu ADN recombinant.

De exemplu, un ADNc care codifică o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie, cum ar fi o peptidă în conformitate cu SEQ ID NO: 42, polipeptida poate fi exprimată în celule procariote (de exemplu, bacterii) sau celule eucariote (de exemplu, celule de drojdii, de insecte sau de mamifere), după care proteina recombinantă poate fi purificată şi utilizată pentru a genera un preparat de anticorpi monoclonali sau policlonali care leagă în mod specific polipeptida marker de cancer mamar utilizată conform invenţiei.

Un specialist în domeniu va realiza că generarea a două sau mai multe seturi diferite de anticorpi monoclonali sau policlonali maximizează probabilitatea obţinerii unui anticorp cu specificitatea şi afinitatea necesare utilizării sale preconizate (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imagistică in vivo, terapie cu imunotoxine). Anticorpii sunt testaţi pentru activitatea dorită prin metode cunoscute, în conformitate cu scopul pentru care anticorpii urmează să fie utilizaţi (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imunoterapie etc.), pentru îndrumări suplimentare privind generarea şi testarea anticorpilor (vezi, de exemplu, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). De exemplu, anticorpii pot fi testaţi în teste ELISA, imunoamprente (Western blots), colorare imunohistochimică a cancerelor fixate cu formalină sau secţiuni de ţesut îngheţat. După caracterizarea iniţială in vitro, anticorpii destinaţi utilizării diagnostice terapeutice sau in vivo sunt testaţi conform metodelor cunoscute de testare clinică.

Termenul „anticorp monoclonal», aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi, adică anticorpii individuali cuprinzând populaţia sunt identici, cu excepţia mutaţiilor posibile în mod natural care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali descrişi în mod specific includ anticorpi „himerici», în care o porţiune din catena grea şi/sau uşoară este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o specie particulară sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul catenei (catenelor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi de la o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atât timp cât aceştia prezintă activitatea antagonistă dorită (US 4,816,567).

Anticorpii monoclonali ai invenţiei pot fi generaţi folosindu-se metode de hibridom. Într-o metodă de hibridom, un şoarece sau alt animal-gazdă adecvat este, de obicei, imunizat cu un agent de imunizare pentru a obţine limfocite care produc sau sunt capabile să producă anticorpi care se vor lega în mod specific la agentul imunizant. Ca alternativă, limfocitele pot fi imunizate in vitro.

Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi, de asemenea, prin metode de ADN recombinant, cum ar fi cele descrise în US 4,816,567. ADN-ul care codifică anticorpii monoclonali ai invenţiei poate fi izolat uşor şi secvenţializat utilizându-se proceduri convenţionale (de exemplu, prin utilizarea probelor oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la genele codificatoare ale catenelor grele şi uşoare ale anticorpilor murinici).

Metodele in vitro sunt, de asemenea, adecvate pentru prepararea anticorpilor monovalenţi. Digestia anticorpilor pentru a produce fragmente ale acestora, în particular fragmente Fab, poate fi realizată folosindu-se tehnici de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, digestia poate fi efectuată folosindu-se papaină. Exemple de digestie cu papaină sunt descrise în WO 94/29348 şi US 4,342,566. Digestia cu papaină a anticorpilor produce, de obicei, două fragmente identice de legare la antigen, numite fragmente Fab, fiecare cu un singur situs de legare a antigenului şi un fragment Fc rezidual. Tratamentul pepsinei generează un fragment F(ab')2 şi un fragment pFc'.

Fragmentele de anticorpi, fie că sunt ataşate la alte secvenţe sau nu, pot include de asemenea inserţii, deleţii, substituţii sau alte modificări selectate ale unor regiuni particulare sau reziduuri specifice de aminoacizi, cu condiţia ca activitatea fragmentului să nu fie modificată sau degradată în mod semnificativ faţă de anticorpul nemodificat sau fragmentul de anticorp. Aceste modificări pot furniza unele proprietăţi suplimentare, cum ar fi eliminarea/adăugarea de aminoacizi capabili de legare la disulfuri, creşterea biolongevităţii, modificarea caracteristicilor secretoare etc. În orice caz, fragmentul de anticorp trebuie să posede o proprietate bioactivă, cum ar fi activitatea de legare, reglarea legării la domeniul de legare, etc. Regiunile funcţionale sau active ale anticorpului pot fi identificate prin mutageneza unei regiuni specifice a proteinei, urmată de exprimarea şi testarea polipeptidei exprimate. Astfel de metode sunt uşor de înţeles pentru un specialist în domeniu şi pot include mutageneza specifică situsului acidului nucleic care codifică fragmentul de anticorp.

Anticorpii conform invenţiei pot cuprinde suplimentar anticorpi umanizaţi sau anticorpi umani. Formele umanizate ale anticorpilor non-umani (de exemplu, murini) sunt imunoglobuline himerice, catene de imunoglobulină sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab 'sau alte subsecvente de legare la antigenului ale anticorpilor) care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulină non-umană. Anticorpii umanizaţi includ imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care resturile dintr-o regiune determinantă complementară (CDR) a recipientului sunt înlocuite cu resturi dintr-o CDR a unei specii non-umane (anticorp donor), de exemplu de şoarece, şobolan sau iepure cu specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, resturile de cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu resturi non-umane corespunzătoare. Anticorpii umanizaţi pot cuprinde, de asemenea, resturi care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în secvenţele de CDR sau de cadru importate. În general, anticorpul umanizat va cuprinde, practic, toate cel puţin unul şi, de obicei, două domenii variabile în care toate sau, practic, toate regiunile CDR corespund cu cele ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau, practic, toate regiunile FR sunt cele ale unei secvenţe de consens a imunoglobulinelor umane. Anticorpul umanizat optim va cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă de imunoglobulină (Fc), de obicei cea a unei imunoglobuline umane.

Metodele de umanizare a anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu. În general, un anticorp umanizat are unul sau mai multe resturi de aminoacid introduse în el dintr-o sursă non-umană. Aceste reziduuri de aminoacid non-umane sunt adesea denumite reziduuri de „import», care sunt, de obicei, luate dintr-un domeniu variabil de „import». Umanizarea poate fi realizată, practic, prin substituirea CDR-urilor sau a secvenţelor CDR de la rozătoare pentru secvenţele corespunzătoare unui anticorp uman. În consecinţă, astfel de anticorpi „umanizaţi» sunt anticorpi himerici (US 4,816,567), în care, practic, mai puţin de un domeniu variabil uman intact a fost substituit cu secvenţa corespunzătoare de la o specie non-umană. În practică, anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, anticorpi umani în care unele resturi CDR şi, posibil, unele resturi FR sunt substituite cu resturi din situsuri analoage în anticorpi de la rozătoare.

Pot fi folosite animale transgenice (de exemplu, şoareci), care sunt capabile, după imunizare, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producţiei de imunoglobulină endogenă. De exemplu, a fost descris că deleţia homozigotă a genei regiunii de legare a catenei grele de anticorp la şoareci mutanţi himeric şi de filiaţie germinală conduce la inhibarea completă a producţiei de anticorpi endogeni. Transferul seriei de gene de imunoglobulină cu filiaţie germinală umană în astfel de şoareci mutanţi cu filiaţie germinală va conduce la producerea de anticorpi umani după provocarea de către un antigen. Anticorpii umani pot fi, de asemenea, produşi în biblioteci de afişare a fagilor.

Anticorpii din invenţie sunt, preferabil, administraţi unui subiect într-un agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În mod obişnuit, o cantitate adecvată dintr-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este utilizată în formulă pentru a face formularea izotonică. Exemplele de agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic includ soluţia salină, soluţia Ringer şi soluţia de dextroză. pH-ul soluţiei este, preferabil, de la aproximativ 5 la aproximativ 8 şi, mai preferabil, de la aproximativ 7 până la aproximativ 7,5. Agenţii purtători suplimentari includ preparate cu eliberare prelungită, de exemplu matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi care conţin anticorpul, matricele fiind sub formă de articole formate, de exemplu, pelicule, lipozomi sau microparticule. Va fi evident pentru persoanele de specialitate din domeniu că anumiţi agenţi purtători pot fi mai preferabili în funcţie de, de exemplu, calea de administrare şi concentraţia anticorpului care este administrat.

Anticorpii pot fi administraţi subiectului, pacientului sau celulei prin injectare (de exemplu, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată, intramusculară) sau prin alte metode, cum ar fi perfuzia, care asigură eliberarea sa în sânge într-o formă eficace. De asemenea, anticorpii pot fi administraţi pe căi intratumorale sau peritumorale pentru a exercita efecte terapeutice locale, precum şi sistemice. Este preferabilă injectarea locală sau intravenoasă.

Dozele şi schemele eficace pentru administrarea anticorpilor pot fi determinate empiric şi realizarea unor astfel de determinări se află în domeniul de specialitate. Specialiştii în domeniu vor înţelege că doza de anticorpi care trebuie administrată va varia în funcţie de, de exemplu, subiectul care va primi anticorpul, calea de administrare, de tipul particular de anticorp utilizat şi alte medicamente administrate. O doză zilnică tipică de anticorp utilizat singur poate varia de la aproximativ 1 µg/kg până la 100 mg/kg de greutate corporală sau mai mult pe zi, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. După administrarea unui anticorp, preferabil pentru tratarea cancerului mamar, eficacitatea anticorpului terapeutic poate fi evaluată în diverse moduri bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. De exemplu, mărimea, numărul şi/sau distribuţia cancerului la un subiect care primeşte tratament pot fi monitorizate utilizându-se tehnici standard de imagistică tumorală. Un anticorp administrat terapeutic care opreşte creşterea tumorii, are ca rezultat contracţia tumorală şi/sau împiedică dezvoltarea de tumori noi în comparaţie cu evoluţia bolii care ar avea loc în absenţa administrării anticorpului este un anticorp eficace pentru tratamentul cancerului.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza o metodă pentru producerea unui receptor de celule T solubil (sTCR) care să recunoască un complex peptidă-MHC specific. Astfel de receptori de celule T solubili pot fi generaţi din clone de celule T specifice şi afinitatea lor poate fi crescută prin mutageneză care vizează regiunile determinante de complementaritate. În scopul selectării receptorilor de celule T, poate fi utilizat o afişare de fagi (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). În scopul stabilizării receptorilor celulelor T în timpul afişării fagilor şi în cazul utilizării practice ca medicament, catena alfa şi catena beta pot fi legate, de exemplu, prin legături disulfidice non-native, alte legături covalente (receptor de celulă T cu o singură catenă) sau prin domenii de dimerizare (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Receptorul de celule T poate fi legat de toxine, medicamente, citokine (a se vedea, de exemplu, US 2013/0115191), domenii care recrutează celule efectoare precum domeniul anti-CD3, etc. pentru a executa anumite funcţii asupra celulelor-ţintă. Mai mult, poate fi exprimată în celule T utilizate pentru transferul adoptiv. Informaţii suplimentare pot fi găsite în WO 2004/033685A1 şi WO 2004/074322A1. O combinaţie de sTCR-uri este descrisă în WO 2012/056407A1. Alte metode pentru producere sunt prezentate în WO 2013/057586A1.

În plus, peptidele şi/sau TCR ori anticorpii sau alte molecule de legare ale prezentei invenţii pot fi utilizate pentru a verifica diagnosticul de cancer de la un patolog pe baza unei probe biopsiate.

Anticorpii sau TCR-urile pot fi utilizate, de asemenea, pentru teste diagnostice in vivo. În general, anticorpii sunt etichetaţi printr-o radionucleotidă (cum ar fi 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32 P sau 35S), astfel încât tumora să poată fi localizată folosind imunoscintiografie. Într-una dintre realizări, anticorpii sau fragmentele acestora se leagă la domeniile extracelulare a două sau mai multe ţinte ale unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus, iar valoarea de afinitate (Kd) este mai mică de 1 x 10 µM.

Anticorpii pentru utilizare diagnostică pot fi etichetaţi cu sonde adecvate pentru detectarea prin diferite metode imagistice. Metodele pentru detectarea sondelor includ, dar nu se limitează la, fluorescenţă, lumină, microscopie confocală şi electronică; imagistică prin rezonanţă magnetică şi spectroscopie; fluoroscopie, tomografie computerizată şi tomografie cu emisie de pozitroni. Sondele adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, eozină şi alţi fluorofori, radioizotopi, aur, gadoliniu şi alte lantanide, fier paramagnetic, fluor-18 şi alţi radionuclizi cu emisie de pozitron. În plus, probele pot fi bi- sau multifuncţionale şi pot fi detectate folosind una sau mai multe dintre metodele prezentate aici. Aceşti anticorpi pot fi marcaţi direct sau indirect cu sondele menţionate. Ataşarea probelor la anticorpi implică ataşarea covalentă a probei, încorporarea probei în anticorp şi ataşarea covalentă a unui compus chelator pentru legarea probei, printre alte acţiuni bine cunoscute în domeniu. Pentru imunohistochimie, proba de ţesut bolnav poate fi proaspătă sau congelată ori poate fi încorporată în parafină şi fixată cu un conservant, cum ar fi formalina. Secţiunea fixată sau încorporată care conţine proba intră în contact cu un anticorp etichetat principal şi cu un anticorp secundar, anticorp folosit pentru a detecta exprimarea proteinelor in situ.

Un alt aspect al acestei invenţii include o metodă in vitro de producere a celulelor T activate, metoda constând în contactarea celulelor T in vitro cu molecule MHC umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate, pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T într-un mod specific antigenului, antigenul fiind o peptidă conform invenţiei. Este de preferat să se utilizeze o cantitate suficientă de antigen împreună cu celula prezentatoare a antigenului.

Este de preferat o celulă de mamifer, care are un nivel redus sau inexistent de funcţionare ca transportator de peptidă TAP. Printre celulele adecvate, care nu sunt transportatoare de peptidă TAP se numără celulele T2, RMA-S şi Drosophila. TAP este transportatorul asociat cu procesarea antigenului.

Linia de celule umane T2 deficiente în încărcarea peptidei este disponibilă de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, având Nr. de catalog CRL 1992; linia de celule Drosophila, linia Schneider 2 este disponibilă de la ATCC cu NR. de catalog CRL 19863; linia de celule RMA-S de şoarece este descrisă în Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).

De preferinţă, înainte de transfectare, celula-gazdă nu exprimă în mod substanţial nicio moleculă MHC de clasă I. Este, de asemenea, de preferat ca celula stimulatoare să exprime o moleculă importantă pentru furnizarea unui semnal de costimulare pentru celule T, cum ar fi oricare dintre B7.1, B7.2, ICAM-1 şi LFA3. Secvenţele de acid nucleic ale numeroase molecule de MHC de clasă I şi ale moleculelor de costimulator sunt disponibile public în bazele de date GenBank şi EMBL.

În cazul unui epitop MHC de clasă I utilizat ca antigen, celulele T sunt celule T CD8-pozitive.

Dacă o celulă care prezintă antigen este transfectată pentru a exprima un astfel de epitrop, este de preferat ca celula să conţină un vector care exprimă peptida care conţine SEQ. ID NO 42.

Se pot folosi o serie de alte metode pentru generarea celulelor T in vitro. De exemplu, în generarea CTL pot fi folosite limfocite cu infiltrare tumorală autologe. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) au utilizat limfocite autologe din sânge periferic (PLB) în pregătirea celulelor T. Mai mult, este posibilă producerea de celule T autolog prin pulsarea de celule dendritice cu peptidă sau polipeptidă sau prin infectare cu un virus recombinant. De asemenea, pot fi folosite celule B pentru producerea de celule T autologe. În plus, celule macrofage pulsate cu peptidă sau polipeptidă sau infectate cu virus recombinant pot fi utilizate pentru prepararea de celule T autologe. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descriu pregătirea in vitro a celulelor T prin utilizarea de celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPC), aceasta reprezentând, de asemenea, o modalitate potrivită de generare de celule T pentru peptida aleasă. În prezenta invenţie, celulele aAPC au fost generate prin cuplarea unor complexe de peptide MHC preformate pe suprafaţa unor particule de polistiren (microgranule) prin biochimie biotină:streptavidină. Acest sistem permite controlul exact al densităţii MHC pe celulele aAPC, fapt ce permite amplificarea selectivă a răspunsurilor de aviditate ridicată sau scăzută a celulei T specifice antigenului cu eficienţă crescută, din probele de sânge. Pe lângă complexele MHC:peptidă, celulele aAPC trebuie să poarte alte proteine cu activitate de costimulare, cum ar fi anticorpi anti-CD28 cuplaţi pe suprafeţele lor. Mai mult, astfel de sisteme bazate pe aAPC necesită adesea adăugarea unor factori solubili adecvaţi, de exemplu citokine precum interleukina-12.

Pentru pregătirea celulelor T se pot utiliza, de asemenea, celule alogene, iar o metodă este descrisă detaliat în WO 97/26328. De exemplu, pe lângă celulele de Drosophila şi celulele T2, se pot utiliza şi alte celule pentru prezentarea antigenilor, cum ar fi celule CHO, celule de insecte infectate cu bacilovirus, bacterii, drojdii, celule ţintă infectate cu vaccin. În plus, se pot utiliza virusuri din plante (a se vedea, de exemplu, Porta et al. (Porta et al., 1994), care descriu dezvoltarea virusului mozaicului din Vigna unguiculata, ca fiind un sistem cu productivitate ridicată pentru prezentarea de peptide străine).

Celulele T activate, care sunt orientate spre peptidele din invenţie, sunt utile în terapie. Astfel, un aspect suplimentar al invenţiei constă în descrierea celulelor T activate care se pot obţine prin metodele anterior menţionate în această invenţie.

Celulele T activate, care sunt produse prin metoda de mai sus, vor recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă ce conţine o secvenţă de aminoacizi cu SEQ ID NO: 42.

Este de preferat ca celula T să recunoască celula interacţionând prin TCR cu complexul HLA/peptidă (de exemplu, legare). Celulele T sunt utile într-o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, atunci când pacientului îi este administrat un număr eficient de celule T activate. Celulele T care sunt administrate pacientului pot fi preluate de la pacient şi activate conform descrierii de mai sus (adică sunt celule T autologe). Alternativ, celulele T nu sunt preluate de la pacient, ci de la alt individ. Desigur, este de preferat ca sursa să fie un individ sănătos. Prin „individ sănătos», inventatorii înţeleg că individul are o stare generală de sănătate bună, de preferat un sistem imunitar puternic şi, mai bine, nu suferă de nicio boală care să poată fi testată sau detectată.

In vivo, celulele ţintă pentru celulele T CD8-pozitive conform prezentei invenţii pot fi celule tumorale (care, uneori, exprimă MHC de clasă II) şi/sau celulele stromale care înconjură tumora (celule tumorale) (care, uneori, pot şi ele exprima MHC de clasă II; (Dengjel et al., 2006)).

Celulele T din prezenta invenţie pot fi utilizate ca ingrediente active ale unei compoziţii terapeutice. Astfel, invenţia furnizează, de asemenea, o metodă de ucidere a celulelor-ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, metoda constând în administrarea unui număr eficient de celule T pacientului, aşa cum s-a arătat mai sus.

Prin „exprimată aberant», inventatorii înţeleg, de asemenea, că polipeptida este supraexprimată în comparaţie cu nivelurile de exprimare în ţesuturi normale sau că gena este silenţioasă în ţesutul din care este derivă tumoarea, însă în tumoare este exprimată. Prin „supraexprimată», inventatorii înţeleg că polipeptida este prezentă la un nivel de cel puţin 1,2 ori mai mare decât în ţesutul normal; de preferat de cel puţin 2 ori şi, mai preferabil, de cel puţin 5 ori sau 10 ori mai mare decât nivelul prezent în ţesutul normal.

Celulele T pot fi obţinute prin metode cunoscute în domeniu, precum cele descrise mai sus. Protocoale pentru acest aşa-numit transfer adoptiv de celule T sunt bine cunoscute în domeniu. Recenzii pot fi găsite în: Gattioni et al. şi Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Este descrisă utilizarea peptidelor complexate cu MHC pentru generarea unui receptor de celule T al cărui acid nucleic este clonat şi introdus într-o celulă gazdă, de preferinţă o celulă T. Această celulă T modificată poate fi transferată unui pacient pentru terapia cancerului.

Toate moleculele din această invenţie, adică peptida, acidul nucleic, anticorpul, vectorul de exprimare, celula T activată, receptorul celulei T sau acidul nucleic care îl codifică sunt utile pentru tratamentul unor afecţiuni caracterizate de celule care evită un răspuns imunitar. În consecinţă, orice moleculă din prezenta invenţie poate fi utilizată ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. Molecula poate fi utilizată ca atare sau combinată cu altă(e) moleculă(e) din invenţie sau cu o moleculă/molecule cunoscută(e).

Prezenta invenţie mai include un kit care cuprinde:

(a) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform descoperirii de mai sus, în soluţie sau în formă liofilizată;

(b) opţional, un al doilea recipient care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi

(c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate.

Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (v) seringă. Recipientul este, preferabil, o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă, şi poate fi un recipient reutilizabil. Compusul farmacologic este, preferabil, liofilizat.

Trusele din prezentul brevet vor conţine, preferabil, formula liofilizată care face obiectul prezentului brevet într-un recipient adecvat şi instrucţiunile pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, fiole (de exemplu fiole dublu compartimentate), seringi (cum ar fi seringile dublu-compartimentate) şi eprubete. Recipientul poate fi construit dintr-o varietate de materiale, de exemplu sticlă sau plastic. Preferabil, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni privind (sau asociate cu) recipientul, care prezintă instrucţiunile de reconstituire şi/sau administrare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrarea subcutanată.

Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, 2-6 administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu).

La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi preferabil nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). În plus trusa poate include şi alte materiale necesare din punct de vedere comercial şi al utilizării, inclusiv alte soluţii tampon, alţi dizolvanţi, filtre, ace, seringi şi pliante cu instrucţiuni de utilizare.

Trusele din prezentul brevet pot prezenta un singur recipient care conţine formula compusului farmacologic conform cu prezentul brevet, cu sau fără alte componente (de exemplu alţi compuşi sau alte formule farmacologice ale acestor alţi compuşi) sau pot prezenta câte un recipient distinct pentru fiecare compus.

Preferabil, trusele din invenţie includ o formă de condiţionare care face obiectul brevetului ambalată pentru utilizarea în combinaţie cu coadministrarea cu un al doilea compus (cum ar fi adjuvanţii (de exemplu GM-CSF, agent chimioterapeutic, produs natural, hormon sau antagonist, agent antiangiogenetic sau inhibitor de angiogeneză, agent inductor de apoptoză sau chelator) sau cu un compus farmacologic al acestora. Componentele trusei pot fi pre-amestecate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat, distinct, înainte de administrarea către pacient. Componentele trusei se pot furniza în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil soluţii apoase, şi în mod ideal ca soluţii apoase sterile. Componentele trusei pot fi furnizate de asemenea şi în stare solidă, care se poate converti în stare lichidă prin adăugarea solvenţilor adecvaţi, care se vor furniza preferabil într-un recipient distinct.

Recipientul unei truse terapeutice poate fi fiolă, eprubetă, flacon, sticlă, seringă sau orice altă formă de depozitare a unui solid sau lichid. De obicei, dacă este vorba de mai mult de un singur component, trusa va include şi o a doua fiolă sau un alt recipient, care permite dozarea separată. Trusa poate include şi un alt recipient pentru un lichid farmacologic acceptabil. Preferabil, trusa terapeutică va include şi un sistem (de exemplu unul sau mai multe ace, seringi, picurătoare pentru ochi, pipete etc.) care permit administrarea agenţilor care fac obiectul invenţiei şi care intră în componenţa trusei.

Formula prezentă este una adecvată pentru administrarea peptidelor pe o cale de administrare acceptabilă, cum ar fi orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. Preferabil, administrarea va fi subcutanată şi, cel mai preferabil, intradermică. Administrarea se poate face prin injectomat.

Deoarece peptidele din invenţie au fost izolate din cancer mamar, medicamentul din invenţie este folosit, de preferinţă, pentru tratarea cancerului mamar.

TUMAP-urile pot fi identificate la pacient de novo şi apoi incluse în vaccin.

Ca un exemplu, TUMAP-urile candidate pot fi identificate la pacient prin (a1) compararea datelor de exprimare de la proba tumorală cu datele de exprimare dintr-o probă de ţesut normal corespunzător tipului de ţesut din proba tumorală pentru identificarea proteinelor exprimate excesiv sau exprimate în mod aberant în proba tumorală; şi (a2) corelarea datelor de exprimare cu secvenţe de liganzi MHC legaţi de molecule MHC de clasă I şi/sau clasă II din proba tumorală pentru identificarea liganzilor MHC derivaţi de proteine supraexprimate sau exprimate în mod aberant de tumoare.

Ca un alt exemplu, proteinele pot fi identificate ca fiind cele care conţin mutaţii unice pentru proba tumorală în raport cu ţesutul normal corespunzător de la pacientul individual, iar TUMAP-urile pot fi identificate ca fiind cele care vizează în mod specific mutaţia. De exemplu, genomul tumorii şi ţesutul normal corespunzător pot fi secvenţiate prin secvenţializarea întregului genom: Pentru descoperirea mutaţiilor nesinonime în regiunile codificatoare de proteine ale genelor, ADN-ul şi ARN-ul genomice sunt extrase din ţesuturile tumorale, iar ADN-ul genomic normal nemutant este extras din celule mononucleare (PBMC-uri) din sânge periferic. Abordarea NGS aplicată se limitează la resecvenţierea regiunilor de codificare a proteinelor (resecvenţiere a exomului). În acest scop, ADN-ul exonic din probe umane este capturat folosindu-se truse de îmbogăţire a ţintei de la furnizor, urmate de secvenţiere cu, de exemplu, un HiSeq2000 (Illumina). Adiţional, ARNm-ul tumoral este secvenţiat pentru cuantificarea directă a exprimării genelor şi validarea genelor mutante exprimate în tumorile pacienţilor. Milioanele de rezultate de citire a secvenţelor sunt procesate prin algoritmi software. Lista de ieşire conţine mutaţii şi exprimarea genică. Mutaţiile somatice specifice tumorii sunt determinate prin compararea cu variaţiile de linii germinale derivate de PBMC-uri şi sunt prioritizate. Peptidele identificate de novo pot fi apoi testate pentru imunogenitate aşa cum este descris mai sus pentru depozit, iar TUMAP-urile candidate care posedă imunogenitate adecvată sunt selectate pentru a fi incluse în vaccin.

Într-un exemplu de concretizare, peptidele incluse în vaccin sunt identificate prin: (a) identificarea peptidelor asociate tumorii (TUMAP-uri), prezentate de o probă tumorală de la pacientul individual prin metoda descrisă mai sus; (b) compararea peptidelor identificate la litera (a) cu un depozit de peptide care au fost preselectate pentru imunogenitate şi supraprezentare în tumori în comparaţie cu ţesutul normal corespunzător; (c) selectarea a cel puţin unei peptide din depozit care se corelează cu o peptidă asociată tumorii identificată la pacient; şi (d) opţional, selectarea a cel puţin unei peptide identificate de novo la litera (a) confirmând imunogenitatea acesteia.

Într-un exemplu de concretizare, peptidele incluse în vaccin sunt identificate prin: (a) identificarea peptidelor asociate tumorii (TUMAP-uri) prezentate de o probă tumorală de la pacientul individual; şi (b) selectarea a cel puţin unei peptide identificate de novo la litera (a) şi confirmarea imunogenităţii acesteia.

Odată selectate peptidele pentru un vaccin pe bază de peptide personalizat, vaccinul este produs. De preferinţă, vaccinul este o formulare lichidă care constă din peptidele individuale dizolvate între 20%-40% DMSO, de preferinţă aproximativ 30%-35% DMSO, de exemplu aproximativ 33% DMSO.

Fiecare peptidă care trebuie inclusă într-un produs este dizolvată în DMSO. Concentraţia soluţiilor peptidice unice trebuie aleasă în funcţie de numărul de peptide care trebuie incluse în produs. Soluţiile de peptidă-DMSO individuale se amestecă în părţi egale pentru a se obţine o soluţie care conţine toate peptidele care trebuie incluse în produs cu o concentraţie de ~2,5 mg/ml per peptidă. Soluţia amestecată este apoi diluată la 1:3 cu apă pentru injecţii pentru a se atinge o concentraţie de 0,826 mg/ml per peptidă în 33% DMSO. Soluţia diluată este filtrată folosindu-se un filtru steril de 0,22 µm. Se obţine soluţia vrac finală.

Soluţia vrac finală este introdusă în flacoane şi este depozitată la -20°C până în momentul utilizării. Un flacon conţine 700 µl de soluţie care conţine 0,578 mg din fiecare peptidă. Din această cantitate, 500 μl (aprox. 400 μg per peptidă) vor fi aplicaţi pentru injectare intradermală.

Prezenta invenţie va fi descrisă acum în următoarele exemple care arată concretizările preferate ale acesteia şi cu referinţă la figurile însoţitoare, fără a fi, totuşi, limitată la acestea.

FIGURI

Figurile 1-N arată supraprezentarea unor diverse peptide în ţesuturi normale (barele albe) şi în cancer mamar (barele negre). Figura 1A - CILP, Peptidă: KMPEHISTV (SEQ ID NO.: 1), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi adipoase, 3 glande suprarenale, 4 celule sanguine, 10 vase sanguine, 9 măduve osoase, 7 creiere, 6 glande mamare, 2 cartilaje, 2 ochi, 3 vezici biliare, 6 inimi, 14 rinichi, 19 intestine groase, 20 ficaţi, 45 plămâni , 8 ganglioni limfatici, 7 nervi, 3 ovare, 10 pancreasuri, 3 glande paratiroide, 1 peritoneu, 5 glande pituitare, 6 placente, 3 pleure, 3 prostate, 7 glande salivare, 5 muşchi scheletici, 6 piei, 4 intestine subţiri, 11 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 9 trahei, 3 uretere, 6 vezici urinare, 4 utere, 6 esofage 22 probe de cancer mamar Peptida a fost detectată suplimentar pe 1/19 cancere de pancreas şi 2/89 cancere pulmonarenon-microcelulare. Figura 1B - TFAP2B, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, Peptidă: SLVEGEAVHLA (SEQ ID NO: 4), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi adipoase, 3 glande suprarenale, 4 celule sanguine, 10 vase sanguine, 9 măduve osoase, 7 creiere, 6 glande mamare, 2 cartilaje, 2 ochi, 3 vezici biliare, 6 inimi, 14 rinichi, 19 intestine groase, 20 ficaţi, 45 plămâni , 8 ganglioni limfatici, 7 nervi, 3 ovare, 10 pancreasuri, 3 glande paratiroide, 1 peritoneu, 5 glande pituitare, 6 placente, 3 pleure, 3 prostate, 7 glande salivare, 5 muşchi scheletici, 6 piei, 4 intestine subţiri, 11 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 9 trahei, 3 uretere, 6 vezici urinare, 4 utere, 6 esofage 22 probe de cancer mamar Peptida a fost detectată suplimentar pe 1/6 cancere de vezică biliară şi de cale biliară, 1/20 cancere ovariene, 1/18 cancere esofagiene şi 1/89 cancere pulmonare non-microcelulare. Figura 1C - DUSP4, Peptidă: FSFPVSVGV (SEQ ID NO: 20), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi adipoase, 3 glande suprarenale, 4 celule sanguine, 10 vase sanguine, 9 măduve osoase, 7 creiere, 6 glande mamare, 2 cartilaje, 2 ochi, 3 vezici biliare, 6 inimi, 14 rinichi, 19 intestine groase, 20 ficaţi, 45 plămâni , 8 ganglioni limfatici, 7 nervi, 3 ovare, 10 pancreasuri, 3 glande paratiroide, 1 peritoneu, 5 glande pituitare, 6 placente, 3 pleure, 3 prostate, 7 glande salivare, 5 muşchi scheletici, 6 piei, 4 intestine subţiri, 11 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 9 trahei, 3 uretere, 6 vezici urinare, 4 utere, 6 esofage 22 probe de cancer mamar Peptida a fost detectată suplimentar pe 2/6 cancere de vezică biliară şi de cale biliară, 8/12 melanoame, 10/20 probe de limfom non-Hodgkin, 2/20 cancere ovariene, 2/19 cancere de pancreas, 7/47 cancere gastrice, 23/89 cancere pulmonare non-microcelulare, 2/18 cancere de celule renale, 2/17 cancere pulmonare microcelulare, 6/15 cancere de vezică urinară şi 2/15 cancere uterine. Figura 1D) - MAGED1, Peptidă: GLLGFQAEA (SEQ ID NO: 24), Ţesuturi de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi adipoase, 3 glande suprarenale, 4 celule sanguine, 10 vase sanguine, 9 măduve osoase, 7 creiere, 6 glande mamare, 2 cartilaje, 2 ochi, 3 vezici biliare, 6 inimi, 14 rinichi, 19 intestine groase, 20 ficaţi, 45 plămâni , 8 ganglioni limfatici, 7 nervi, 3 ovare, 10 pancreasuri, 3 glande paratiroide, 1 peritoneu, 5 glande pituitare, 6 placente, 3 pleure, 3 prostate, 7 glande salivare, 5 muşchi scheletici, 6 piei, 4 intestine subţiri, 11 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 9 trahei, 3 uretere, 6 vezici urinare, 4 utere, 6 esofage 22 probe de cancer mamar Peptida a fost detectată suplimentar pe 4/21 leucemii mieloide acute, 2/48 cancere de prostată, 1/17 leucemii limfocitare cronice, 2/27 cancere colorectal, 1/6 cancere de vezică biliară şi de cale biliară, 3/18 cancere hepatocelulare, 3/12 melanoame, 6/20 limfoame non-Hodgkin, 7/20 cancere ovariene, 3/18 cancere esofagiene, 1/19 cancere de pancreas, 6/31 cancere cerebrale, 3/47 cancere gastrice, 12/89 cancere pulmonare non-microcelulare, 2/18 cancere de celule renale şi 3/15 cancere uterine. Discrepanţele cu privire la lista tipurilor de tumori între Figura 1D şi Tabelul 4 s-ar putea datora criteriilor de selecţie mai stricte aplicate în Tabelul 4. (Pentru detalii, consultaţi Tabelul 4.) Figura 1E) Genă: CNTD2, Peptidă: ALAGSSPQV (SEQ ID NO: 2). Probe de la stânga la dreapta: 5 ţesuturi canceroase (3 cancere mamare, 1 cancer de colon, 1 cancer hepatic). Figura 1F) Genă: LRRC8E, Peptidă: GLHSLPPEV (SEQ ID NO: 10). Probe de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi canceroase (1 cancer mamar, 1 cancer de cap şi gât). Figura 1G) Genă: NAIP, Peptidă: KAFPFYNTV (SEQ ID NO: 12). Probe de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi canceroase (1 cancer mamar, 1 cancer de stomac). Figura 1H) Genă: MUC6, Peptidă: KQLELELEV (SEQ ID NO: 14). Probe de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi canceroase (1 cancer mamar, 1 cancer de pancreas). Figura 1I) Genă: PLEC, Peptidă: SLFPSLVVV (SEQ ID NO: 15). Probe de la stânga la dreapta: 8 ţesuturi canceroase (1 cancer de cale biliară, 1 cancer mamar, 1 cancer de colon, 1 cancer de vezică biliară, 1 cancer de cap şi gât, 1 cancer leucemic leucocitar, 1 cancer de ganglioni limfatici, 1 cancer de piele). Figura 1J) Genă: CREB3L4, Peptidă: YIDGLESRV (SEQ ID NO: 22). Probe de la stânga la dreapta: 1 cultură primară, 2 neoplasme benigne, 5 ţesuturi normale (2 colonuri, 1 splină, 1 stomac, 1 trahee), 47 ţesuturi canceroase (2 cancere de măduvă osoasă, 4 cancere mamare, 1 cancer esofagian, 1 cancer de vezică biliară, 8 cancere leucemice leucocitare, 4 cancere pulmonare, 3 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide, 2 cancere ovariene, 1 cancer de pancreas, 13 cancere de prostată, 2 cancere de rect, 1 cancer de stomac, 1 cancer de vezică urinară, 3 cancere uterine). Figura 1K) Genă: THADA, Peptidă: SAFPEVRSL (SEQ ID NO: 34). Probe de la stânga la dreapta: 6 linii celulare, 4 ţesuturi normale (1 probă de leucocite, 1 ganglion limfatic, 1 probă de limfocite, 1 placentă), 9 ţesuturi canceroase (3 cancere mamare, 1 cancer de vezică biliară, 2 cancere leucemice leucocitare, 1 cancer hepatic, 1 cancer ovarian, 1 cancer de piele). Figura 1L) Genă: KDM5B, Peptidă: VLAHITADI (SEQ ID NO: 37). Probe de la stânga la dreapta: 1 linie celulară, 1 cultură primară, 31 ţesuturi canceroase (3 cancere de măduvă osoasă, 1 cancer mamar, 2 cancere de colon, 2 cancere esofagiene, 1 cancer de cap şi gât, 5 cancere leucemice leucocitare, 5 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 2 cancere de celule mieloide, 1 cancer ovarian, 3 cancere de vezică urinară, 4 cancere uterine). Figura 1M) Genă: PCNXL3, Peptidă: LLMUVAGLKL (SEQ ID NO: 38). Probe de la stânga la dreapta: 2 linii celulare, 1 ţesut normal (1 ganglion limfatic), 16 ţesuturi canceroase (1 cancer de cale biliară, 2 cancere de colon, 1 cancer de cap şi gât, 5 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide, 1 cancer ovarian, 1 cancer de rect, 1 cancer de piele, 1 cancer de vezică urinară). Figura 1N) Genă: MCM8, Peptidă: SLNDQGYLL (SEQ ID NO: 41). Probe de la stânga la dreapta: 1 linie celulară, 1 ţesut normal (1 intestin subţire), 9 ţesuturi canceroase (1 cancer mamar, 1 cancer pulmonar, 4 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide, 1 cancer ovarian, 1 cancer de piele).

Figurile 2A-2C arată exemple de profiluri de exprimare ale genelor-sursă, astfel cum sunt descrise, care sunt foarte supraexprimate sau exprimate exclusiv în cancer mamar într-un panel de ţesuturi normale (bare albe) şi 10 probe de cancer mamar (bare negre). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 6 artere, 2 celule sanguine, 2 creiere, 2 inimi, 2 ficaţi, 3 plămâni, 2 vene, 1 ţesut adipos, 1 glandă suprarenală, 6 măduve osoase, 1 cartilaj, 1 colon, 1 esofag, 2 ochi, 2 vezici biliare, 1 rinichi, 6 ganglioni limfatici, 5 pancreasuri, 2 nervi periferici, 2 glande pituitare, 1 rect, 2 glande salivare, 2 muşchi scheletici, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 glandă tiroidă, 7 trahei, 1 vezică urinară, 1 sân, 5 ovare, 5 placente, 1 prostată, 1 testicul, 1 timus, 1 uter, 10 probe de cancer mamar. Figura 2A) Simbol genă: ESR1; Figura 2B) Simbol genă: ABCC11; Figura 2C) Simbol genă: SLC39A6.

Figurile de la 3A la 3D arată exemple de date de imunogenitate: rezultate ale citometriei în flux după colorarea multimerică specifică peptidelor. Sunt arătate exemple de rezultate ale răspunsurilor celulelor T CD8+ specifice peptidelor in vitro ale unui donator de HLA-A*02+ sănătos . Celulele T CD8+ au fost amorsate folosindu-se APC-uri artificiale acoperite cu mAb anti-CD28 şi HLA-A*02 în complex cu peptida SEQ ID NO: 1 (B, panoul din stânga), peptida SEQ ID NO: 22 (C, panoul din stânga) şi, respectiv, peptida SEQ ID NO: 24 (D, panoul din stânga). După trei cicluri de stimulare, detectarea celulelor reactive la peptide s-a efectuat prin colorare multimerică 2D cu A*02/SEQ ID NO: 1 (B) A*02/SEQ ID NO: 22 (C) sau A*02/SEQ ID NO: 24 (D). Panourile din dreapta (B, C şi D) arată colorarea de control a celulelor stimulate cu complexe A*02/peptidice irelevante. Celulele singlet viabile au fost selectate prin gating pentru limfocite CD8+. Porţile booleene au ajutat la excluderea evenimentelor fals pozitive detectate cu multimeri specifici pentru diferite peptide. Sunt indicate frecvenţele celulelor multimer+ specifice între limfocitele CD8+.

EXEMPLE

EXEMPLUL 1

Identificarea şi cuantificarea peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulară

Probe de ţesut

Ţesuturile tumorale de la pacienţi au fost obţinute de la: Asterand (Detroit, MI, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); BioServe (Beltsville, MD, SUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Regatul Unit); şi Spitalul Universitar din Heidelberg (Heidelberg, Germania).

Ţesuturile normale au fost obţinute de la Asterand (Detroit, MI, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); Bio-Options Inc. (Brea, CA, SUA); BioServe (Beltsville, MD, SUA); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA); Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto (KPUM) (Kyoto, Japonia); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Regatul Unit); Spitalul Universitar din Geneva (Geneva, Elveţia); Spitalul Universitar din Heidelberg (Heidelberg, Germania); Spitalul Universitar din München (München, Germania); şi Spitalul Universitar din Tübingen (Tübingen, Germania).

Consimţămintele informate scrise ale pacienţilor au fost obţinute înainte de intervenţiile chirurgicale sau autopsii. Ţesuturile au fost congelate rapid imediat după excizare şi stocate până la izolarea TUMAP la -70°C sau temperaturi mai joase.

Izolarea peptidelor HLA din probe de ţesut

Seturile de peptide HLA din probe de ţesut îngheţate prin şoc au fost obţinute prin precipitare imună din ţesuturi solide conform unui protocol uşor modificat (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) folosindu-se anticorpul HLA-A*02-specific BB7.2, anticorpul HLA-A, -B, -C-specific W6/32, sefaroză CNBr-activată, tratament cu acid şi ultrafiltrare.

Analize prin spectrometrie de masă

Seturile de peptide HLA obţinute au fost separate în funcţie de hidrofobie prin cromatografie în fază inversă (sistem nanoAcquity UPLC, Waters), iar peptidele eluate au fost analizate în spectrometre de masă hibride LTQ-velos şi cu fuziune (ThermoElectron) echipate cu o sursă ESI. Seturile de peptide au fost încărcate direct în coloana de analiză microcapilară cu siliciu infuzat (75 µm i.d. x 250 mm) prevăzută cu material în fază inversă C18, de 1,7 µm (Waters) cu aplicarea unui debit de 400 nl pe minut. Apoi, peptidele au fost separate cu ajutorul unui gradient binar de 180 minute în două trepte, de la 10% la 33% B la un debit de 300 nl pe minut. Gradientul a fost compus din solvent A (0,1% acid formic în apă) şi solvent B (0,1% acid formic în acetonitril). Un capilar din sticlă aurită (PicoTip, New Objective) a fost utilizat pentru introducerea în sursa nanoESI. Spectrometrele de masă LTQ-Orbitrap au fost operate în modul dependent de date folosindu-se o strategie TOP5. Pe scurt, un ciclu de scanare a fost iniţiat cu o scanare completă de mare precizie masică în orbitrap (R = 30.000), urmată de scanări MS/MS tot în orbitrap (R = 7500) pe cele mai abundenţi 5 ioni precursori cu excluderea dinamică a ionilor selectaţi anterior. Spectrul de masă tandem a fost interpretat de SEQUEST şi alte controale manuale. Secvenţa peptidică identificată a fost asigurată pin compararea modelului de fragmentare a peptidei naturale generat cu modelul de fragmentare a peptidei sintetice de referinţă, cu secvenţă identică.

Cuantificarea LC-MS relativă fără etichete a fost efectuată prin numărarea ionilor, adică prin extracţie şi analiză a caracteristicilor LC-MS (Mueller et al., 2007). Metoda presupune că zona de semnal LC-MS a peptidei se corelează cu abundenţa sa în probă. Caracteristicile extrase au fost prelucrate APOI prin deconvoluţia de stare a încărcării şi alinierea timpului de retenţie (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). În final, toate caracteristicile LC-MS au fost referenţiate încrucişat cu rezultatele identificării secvenţei pentru a combina datele cantitative ale diferitelor probe şi ţesuturi cu profilurile de prezentare ale peptidelor. Datele cantitative au fost normalizate pe două niveluri în funcţie de tendinţa centrală pentru a ţine cont de variaţiile în cadrul replicilor tehnice şi biologice. Astfel, fiecare peptidă identificată poate fi asociată cu date cantitative care permit cuantificarea relativă între probe şi ţesuturi. În plus, toate datele cantitative obţinute pentru candidaţii peptidici au fost inspectate manual pentru a se asigura consecvenţa datelor şi a se verifica acurateţea analizei automate. Pentru fiecare peptidă a fost calculat un profil de prezentare care arată prezentarea medie a probei, precum şi variaţiile replicilor. Profilurile juxtapun probe de cancer mamar cu o referinţă de probe de ţesut normal. Profilurile de prezentare ale peptidelor exemplificate supraprezentate sunt prezentate în Figura 1. Scorurile de prezentare pentru exemple de peptide sunt prezentate în Tabelul 8.

Tabelul 8: Scoruri de prezentare. Tabelul enumeră peptidele care sunt foarte supraprezentate pe tumori comparativ cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraprezentate pe tumori comparativ cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraprezentate pe tumori comparativ cu un panel de ţesuturi normale (+). Panelul de ţesuturi normale considerate relevante pentru comparaţie cu tumorile a constat din: ţesut adipos, glandă suprarenală, celule sanguine, vas de sânge, măduvă osoasă, creier, cartilaj, esofag, ochi, vezică biliară, inimă, rinichi, intestin gros, ficat, plămân, ganglion limfatic, nerv, pancreas, glandă paratiroidă, peritoneu, hipofiză, pleură, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, timus, glandă tiroidă, trahee, ureter şi vezica urinară.

SEQ ID NO: Secvenţă Prezentare a peptidei 1 KMPEHISTV +++ 2 ALAGSSPQV +++ 3 ILLPPAHNJQ +++ 4 SLVEGEAVHLA +++ 5 ALNPVIYTV +++ 6 ALTALQNYL +++ 7 FIIPTVATA +++ 8 GLVQSLTSI +++ 9 FMSKLVPAI +++ 10 GLHSLPPEV +++ 11 GLLPTSVSPRV +++ 12 KAFPFYNTV +++ 13 KLYEGIPVL +++ 14 KQLELELEV +++ 15 SLFPSLVVV +++ 16 SMMGLLTNL +++ 17 TIASSIEKA +++ 18 YILLQSPQL +++ 19 ALEEQLHQV +++ 21 SLLTEPALV ++ 22 YIDGLESRV ++ 23 SLADAVEKV ++ 26 SLAWDVPAA ++ 27 SLAEPRVSV + 30 FLSSEAANV +++ 31 GLSYIYNTV ++ 32 GLVATLQSL ++ 33 ILTELPPGV +++ 34 SAFPEVRSL + 35 SLLSEIQAL ++ 36 TLLGLAVNV ++ 37 VLAHITADI +++ 38 LLMUVAGLKL +++ 39 KLLDMELEM ++ 40 SAAFPGASL ++ 43 FLDEEVKLI +

EXEMPLUL 2

Profilarea exprimării genelor care codifică peptidele descrise

Supraprezentarea sau prezentarea specifică a unei peptide pe celule tumorale în comparaţie cu celule normale este suficientă pentru utilitatea sa în imunoterapie, iar unele peptide sunt specifice tumorii în pofida proteinei-sursă care apare şi în ţesuturile normale. Totuşi, profilarea exprimării ARNm adaugă un nivel suplimentar de siguranţă în selectarea ţintelor peptidice pentru imunoterapii. În special pentru opţiunile terapeutice cu riscuri mari de siguranţă, cum ar fi TCR-urile maturizate în funcţie de afinitate, peptida-ţintă ideală va fi derivată dintr-o proteină care este unică pentru tumoare şi care nu se găseşte pe ţesuturi normale.

Surse de ARN şi pregătirea acestora

Eşantioanele de ţesut prelevate chirurgical au fost furnizate aşa cum este indicat mai sus (a se vedea Exemplul 1) după obţinerea consimţământului informat scris de la fiecare pacient. Probele de ţesut tumoral au fost îngheţate instantaneu imediat după intervenţia chirurgicală şi au fost ulterior omogenizate cu mojar şi pistil sub azot lichid. ARN-ul total a fost preparat din aceste probe, utilizându-se reactiv TRI (Ambion, Darmstadt, Germania), urmat de o curăţare cu RNeasy (QIAGEN, Hilden, Germania); ambele metode au fost executate conform protocolului producătorului.

ARN-ul total din ţesuturi umane sănătoase pentru experimentele RNASeq a fost obţinut de la:

Asterand (Detroit, MI, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); BioCat GmbH (Heidelberg, Germania); BioServe (Beltsville, MD, SUA); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA); Istituto Nazionale Tumori „Pascale» (Napoli, Italia); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA); şi Spitalul Universitar din Heidelberg (Heidelberg, Germania).

ARN-ul total din ţesuturi tumorale pentru experimentele RNASeq a fost obţinut de la:

Asterand (Detroit, MI, USUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); BioServe (Beltsville, MD, SUA); şi Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Regatul Unit).

Calitatea şi cantitatea tuturor probelor de ARN au fost evaluate printr-un bioanalizor Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Germania) cu trusă RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimente RNAseq

Analiza exprimării genice a probelor de ARN tumoral şi de ţesut normal a fost realizată prin secvenţiere de generaţie următoare (RNAseq) de către CeGaT (Tübingen, Germania). Pe scurt, bibliotecile de secvenţiere sunt pregătite utilizându-se kitul de reactivi Illumina HiSeq v4 conform protocolului furnizorului (Illumina Inc, San Diego, CA, SUA), care include fragmentarea ARN-ului, conversia ADNc-ului şi adăugarea de adaptoare de secvenţiere. Bibliotecile obţinute din mai multe probe sunt amestecate echimolar şi secvenţiate pe secvenţiatorul Illumina HiSeq 2500 conform instrucţiunilor producătorului, generându-se citiri de capete singulare de 50 bp. Citirile procesate sunt cartografiate genomul uman (GRCh38) utilizându-se software-ul STAR. Datele de exprimare sunt furnizate la nivel de transcripţie sub formă de RPKM (citiri cartografiate Reads Per Kilobase per Million generate de software-ul Cufflinks) şi la nivel de exon (citiri totale generate de software-ul Bedtools), pe baza adnotărilor bazei de date de secvenţe ensembl (Ensembl77). Citirile la nivel de exon sunt normalizate pentru lungimea exonului şi dimensiunea alinierii pentru a se obţine valori RPKM.

Exemplele de profiluri de exprimare ale genelor-sursă din prezenta invenţie care sunt puternic supraexprimate sau exprimate exclusiv în cancer mamar sunt prezentate în Figura 2. Scorurile de exprimare pentru alte exemple de gene sunt prezentate în Tabelul 9.

Tabelul 9: Scoruri de exprimare. Tabelul enumeră peptide din gene care sunt extrem de supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+). Valoarea de referinţă pentru acest scor a fost calculată din măsurători ale următoarelor ţesuturi normale relevante: ţesut adipos, glandă suprarenală, arteră, celule sanguine, măduvă osoasă, creier, colon, esofag, ochi, vezică biliară, inimă, rinichi, ficat, plămân, ganglion limfatic, pancreas, nerv periferic, hipofiză, rect, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, tiroidă, glanda tiroidă, trahee, vezică urinară, venă. În cazul în care datele de exprimare pentru mai multe probe de acelaşi tip de ţesut au fost disponibile, pentru calcul a fost utilizată media aritmetică a tuturor probelor respective.

SEQ ID NO: Secvenţă Exprimare genă 2 ALAGSSPQV ++ 4 SLVEGEAVHLA +++ 6 ALTALQNYL +++ 7 FIIPTVATA +++ 8 GLVQSLTSI +++ 9 FMSKLVPAI ++ 10 GLHSLPPEV + 11 GLLPTSVSPRV +++ 16 SMMGLLTNL +++ 20 FSFPVSVGV ++ 21 SLLTEPALV + 22 YIDGLESRV ++ 32 GLVATLQSL ++ 42 FLVEHVLTL +++

EXEMPLUL 3

Imunogenitatea in vitro pentru peptide prezentate MHC de clasă I

Pentru a obţine informaţii cu privire la imunogenitatea TUMAP-urilor descrise, inventatorii au efectuat investigaţii utilizând un test in vitro de amorsare a celulelor T pe baza stimulărilor repetate de celule T CD8+ cu celule care prezintă un antigen artificial (aAPC) încărcate cu complexe de peptide/MHC şi anticorp anti-CD28. Astfel, inventatorii au putut arăta imunogenitatea pentru TUMAP-uri restricţionate de HLA-A*0201 în conformitate cu invenţia, demonstrând că aceste peptide sunt epitopi ai celulelor T împotriva cărora există celule T precursoare CD8+ la om (Tabelul 10).

Stimularea in vitro a celulelor T CD8+

Pentru a efectua stimulări in vitro de către celule prezentatoare de antigen artificiale încărcate cu complex peptidă-MHC (pMHC) şi anticorp anti-CD28, inventatorii au izolat mai întâi celule T CD8+ din produse de leucafereză HLA-A*02 proaspete prin selectare pozitivă utilizând microgranule CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germania) de la donatori sănătoşi, obţinute de la University Clinics Mannheim, Germania, după consimţământ informat.

PBMC-urile şi limfocitele CD8+ izolate au fost incubate până la utilizare în mediu de celule T (TCM) constând din RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Germania) suplimentat cu ser AB uman inactivat la căldură 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, 100 U/ml penicilină/100 µg/ml streptomicină (Cambrex, Köln, Germania), 1 mM piruvat de sodiu (CC Pro, Oberdorla, Germania), 20 µg/ml gentamicină (Cambrex). În această etapă s-au adăugat, de asemenea, la TCM 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germania) şi 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Germania).

Generarea granulelor acoperite cu pMHC/anti-CD28, stimularea celulelor T şi citirea au fost realizate într-un sistem in vitro înalt definit utilizându-se 4 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de stimulare şi 8 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de citire.

Anticorpul purificat costimulator 9.3 anti-uman IG2a CD28 de cobai (Jung et al., 1987) a fost biotinilat chimic folosind sulfo-N-hidroxisuccinimicobiotină în condiţiile recomandate de producător (Perbio, Bonn, Germania). Granulele utilizate au fost de particule de polistiren de 5,6 µm acoperite cu streptavidină (Bangs Laboratories, Illinois, SUA).

pMHC-ul utilizat pentru stimularea controalelor pozitiv şi negativ a fost A*0201/MLA-001 (peptidă ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 72) din Melan-A/MART-1) modificat şi, respectiv, A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI din DDX5, SEQ ID NO: 73).

800.000 de granule/200 µl au fost acoperite în plăci cu 96 de godeuri în prezenţa a 4x12,5 ng de biotină-pMHC diferite, au fost spălate şi apoi s-au adăugat 600 ng de biotină anti-CD28 într-un volum de 200 µl. Stimulările au fost iniţiate în plăci de 96 de godeuri prin coincubare cu 1x106 celule T CD8+ cu 2x105 perle tapetate spălate în 200 µl TCM suplimentat cu 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) pentru 3 zile la 37°C. Jumătate din mediu a fost apoi schimbat cu TCM proaspete suplimentate cu 80 U/ml IL-2, iar incubarea a fost continuată timp de 4 zile la 37°C. Acest ciclu de stimulare s-a efectuat în total de trei ori. Pentru citirea multimerului pMHC folosindu-se 8 molecule pMHC diferite per condiţie, a fost utilizată o abordare de codificare combinatorică bidimensională, aşa cum a fost descris anterior (Andersen et al., 2012), cu modificări minore care cuprind cuplarea la 5 fluorocromi diferiţi. În final, s-au efectuat analize multimerice prin colorarea celulelor cu colorant aproape IR viu/mort (Invitrogen, Karlsruhe, Germania), clonă de anticorp CD1-FITC SK1 (BD, Heidelberg, Germania) şi multimeri fluorescenţi pMHC. Pentru analiză a fost utilizat un citometru BD LSRII SORP echipat cu lasere şi filtre adecvate. Celulele specifice peptidei au fost calculate ca procentaje din totalul celulelor CD8+. Evaluarea analizei multimerice a fost efectuată utilizându-se software-ul FlowJo (Tree Star, Oregon, SUA). Amorsarea in vitro a limfocitelor multimer+ CD8+ specifice a fost detectată prin comparaţie cu stimulări de control negative. Imunogenitatea pentru un antigen dat a fost detectată dacă cel puţin un godeu evaluabil stimulat in vitro al unui donor sănătos a fost găsit conţinând o anumită linie de celule T CD8+ după stimulare in vitro (adică acest godeu conţine cel puţin 1% de multimer+ specific între celulele T CD8+ şi procentajul celulelor tetramer+ este de cel puţin 10 ori mediana stimulărilor negative).

Imunogenitatea in vitro pentru peptide de cancer mamar

Pentru peptidele HLA de clasă I testate, imunogenitatea in vitro se poate demonstra prin generarea de linii de celule T specifice peptidelor. Exemple de rezultate ale citometriei în flux după colorarea cu multimer TUMAP-specific pentru o peptidă din invenţie sunt prezentate în Figura 3 împreună cu controalele negative corespondente. Rezultatele pentru trei peptide din invenţie sunt rezumate în Tabelul 10A şi pentru peptide suplimentare în Tabelul 10B.

Tabelul 10A: Imunogenitatea in vitro a peptidelor HLA de clasă I descrise

Rezultatele exemplificative ale experimentelor de imunogenitate in vitro efectuate de către solicitant pentru peptidele descrise. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++

SEQ ID Secvenţă godeuri 66 ILFPDIIARA ++ 51 SLYKGLLSV ++ 50 TLSSIKVEV +

Tabelul 10B: Imunogenitatea in vitro a peptidelor HLA de clasă I descrise

Rezultatele exemplificative ale experimentelor de imunogenitate in vitro pentru peptidele restricţionate HLA-A*02 descrise. Sunt indicate rezultatele experimentelor de imunogenitate in vitro. Procentajele de godeuri şi donatori pozitivi (printre evaluabili) sunt rezumate după cum este indicat; <20% = +; 20% - 49% = ++; 50% - 69% = +++; >= 70% = ++++

SEQ ID NO: Secvenţă Godeuri pozitive [%] 1 KMPEHISTV "+" 2 ALAGSSPQV "++" 21 SLLTEPALV "++" 22 YIDGLESRV "+" 23 SLADAVEKV "+++" 24 GLLGFQAEA "++"

EXEMPLUL 4

Sinteza peptidelor

Toate peptidele au fost sintetizate utilizându-se sinteza standard şi bine stabilită de peptide în fază solidă utilizându-se strategia Fmoc. Identitatea şi puritatea fiecărei peptide individuale au fost determinate prin spectrometrie de masă şi RP-HPLC analitic. Peptidele au fost obţinute sub formă de liofilizaţi de culoare albă până la albă (sare de trifluoroacetat) cu purităţi >50%. Toate TUMAP-urile se administrează preferabil ca săruri de trifluoroacetat sau de acetat, fiind posibile şi alte săruri.

EXEMPLUL 5

Teste de legare la MHC

Peptidele candidate pentru terapii bazate pe celule T, aşa cum sunt descrise, au fost testate în continuare în privinţa capacităţii lor de legare la MHC (afinitate). Complexele peptidă-MHC individuali au fost produse prin schimb UV-ligand, unde o peptidă sensibilă la UV este scindată la iradiere UV şi schimbată cu peptida de interes, aşa cum a fost analizată. Doar candidaţii peptidici care se pot lega şi stabiliza în mod eficient moleculele de MHC receptive la peptide împiedică disocierea complexelor MHC. Pentru a determina randamentul reacţiei de schimb, a fost efectuat un ELISA bazat pe detectarea lanţului uşor (β2m) al complecşilor MHC stabilizaţi. Testul a fost efectuat aşa cum este descris cu caracter general în Rodenko et al. (Rodenko et al., 2006).

Plăci de 96 de godeuri MAXISorp (NUNC) au fost acoperite peste noapte cu 2 µg/ml streptavidină în PBS la temperatura camerei, au fost spălate de 4 ori şi au fost blocate pentru 1 oră la 37°C în 2% BSA care conţinea tamponul de blocare. Monomerii HLA-A*02:01/MLA-001 reasamblaţi au servit ca standarde, acoperind domeniul 15-500 ng/ml. Monomerii peptidă-MHC ai reacţiei de schimb UV au fost diluaţi de 100 de ori în tampon de blocare. Probele au fost incubate timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate de patru ori, au fost incubate cu 2 µg/ml anti-β2m HRP conjugat timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate din nou şi au fost detectate cu soluţia TMB stopată cu NH2SO4. Absorbţia a fost măsurată la 450 nm. Peptidele candidate care prezintă un randament de schimb mare (preferabil mai mare de 50%, cele mai preferabil mai mare de 75 %) sunt, în general, preferate pentru o generare şi producţie de anticorpi sau fragmente ale acestora şi/sau receptori de celule T sau fragmente ale acestora, deoarece arată suficientă aviditate la molecule de MHC şi împiedică disocierea complecşilor MHC.

Tabelul 11: Scoruri de legare MHC clasă I. Legarea peptidelor restricţionate HLA de clasă I la HLA-A*02:01 fost clasificată prin randamentul schimbului peptidic: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++

SEQ ID Secvenţă Schimb de peptide 1 KMPEHISTV "+++" 2 ALAGSSPQV "+++" 4 SLVEGEAVHLA "++" 5 ALNPVIYTV "++" 6 ALTALQNYL "+++" 7 FIIPTVATA "++++" 8 GLVQSLTSI "++++" 9 FMSKLVPAI "+++" 10 GLHSLPPEV "+++" 11 GLLPTSVSPRV "++" 12 KAFPFYNTV "++" 13 KLYEGIPVL "++" 14 KQLELELEV "+++" 15 SLFPSLVVV "+++" 16 SMMGLLTNL "++++" 17 TIASSIEKA "++" 18 YILLQSPQL "+++" 19 ALEEQLHQV "++" 20 FSFPVSVGV "+++" 21 SLLTEPALV "+++" 22 YIDGLESRV "+++" 23 SLADAVEKV "+++" 24 GLLGFQAEA "++++" 25 ILFDVVVFL "++" 26 SLAWDVPAA "+++" 27 SLAEPRVSV "+++" 28 SLFSVPFFL "++++" 29 ALEAUQLYL "+++" 30 FLSSEAANV "++" 31 GLSYIYNTV "++" 32 GLVATLQSL "+++" 33 ILTELPPGV "++" 35 SLLSEIQAL "++++" 36 TLLGLAVNV "++++" 38 LLMUVAGLKL "++++" 39 KLLDMELEM "++++" 41 SLNDQGYLL "+++" 42 FLVEHVLTL "++++" 43 FLDEEVKLI "+++"

Listă de referinţă

Akbari, M. E. et al., Breast Cancer (2015)

Albulescu, R., Biomark.Med. 7 (2013): 203

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Andres, S. A. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 326

Andres, S. A. et al., Breast 23 (2014): 226-233

Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Arafat, H. et al., Surgery 150 (2011): 306-315

Ariga, N. et al., Int J Cancer 95 (2001): 67-72

Aylon, Y. et al., Mol.Oncol 5 (2011): 315-323

Balko, J. M. et al., Nat Med 18 (2012): 1052-1059

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Band, A. M. et al., J Mammary.Gland.Biol Neoplasia. 16 (2011): 109-115

Bausch, D. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 302-309

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Berger, C. et al., Curr.Mol.Med. 13 (2013): 1229-1240

Bogush, T. A. et al., Antibiot.Khimioter. 54 (2009): 41-49

Borel, F. et al., Hepatology 55 (2012): 821-832

Bornstein, S. et al., BMC.Genomics 17 (2016): 38

Bouameur, J. E. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014): 885-894

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Buranrat, B. et al., Oncol Rep. 34 (2015): 2790-2796

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Chang, H. Y. et al., PLoS.One. 8 (2013): e54117

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223

Chekhun, V. F. et al., Int.J Oncol 43 (2013): 1481-1486

Chen, L. C. et al., Mod.Pathol. 24 (2011): 175-184

Cheng, I. et al., Gut 60 (2011): 1703-1711

Cheng, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015): 27

Cheriyath, V. et al., Oncogene 31 (2012): 2222-2236

Choi, J. et al., Cell Stress.Chaperones. 19 (2014): 439-446

Chung, F. Y. et al., J Surg.Oncol 102 (2010): 148-153

Ciruelos Gil, E. M., Cancer Treat.Rev 40 (2014): 862-871

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. J. et al., Pancreas 37 (2008): 154-158

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Cui, X. B. et al., J Transl.Med 13 (2015): 321

Delaval, B. et al., J Cell Biol. 188 (2010): 181-190

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Ding, K. et al., Med.Hypotheses 83 (2014): 359-364

Drazkowska, K. et al., Nucleic Acids Res 41 (2013): 3845-3858

Du, L. et al., Tumori 101 (2015): 384-389

Egloff, A. M. et al., Cancer Res 66 (2006): 6-9

Emens, L. A., Expert.Rev.Anticancer Ther. 12 (2012): 1597-1611

Fagin, J. A., Mol.Endocrinol. 16 (2002): 903-911

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fang, Y. et al., Cancer Biol Ther. 15 (2014): 1268-1279

Feng, Y. et al., J Biol.Chem. 289 (2014): 2072-2083

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Frasor, J. et al., Mol.Cell Endocrinol. 418 Pt 3 (2015): 235-239

Fry, A. M. et al., J Cell Sci. 125 (2012): 4423-4433

Fu, L. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 89

Fuqua, S. A. et al., Breast Cancer Res Treat. 144 (2014): 11-19

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Ganly, I. et al., J Clin Endocrinol.Metab 98 (2013): E962-E972

Gardina, P. J. et al., BMC.Genomics 7 (2006): 325

Garg, M. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014): E62-E72

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Gershenwald, J. E. et al., Oncogene 20 (2001): 3363-3375

Gilkes, D. M. et al., Mol Cancer Res 11 (2013): 456-466

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Grady, W. M., Cancer Metastasis Rev 23 (2004): 11-27

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)

Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Gumireddy, K. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1334-1343

Guo, Y. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 1762-1769

Harvey, H. et al., Int.J Cancer 136 (2015): 1579-1588

Hayashi, S. I. et al., Endocr.Relat Cancer 10 (2003): 193-202

Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hlavata, I. et al., Mutagenesis 27 (2012): 187-196

Hoei-Hansen, C. E. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 8521-8530

Hogstrand, C. et al., Biochem.J 455 (2013): 229-237

Honorat, M. et al., BMC.Struct.Biol 13 (2013): 7

Hu, P. et al., Biosci.Rep. 35 (2015a)

Hu, P. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015b): 2638-2648

Hu, Z. Y. et al., Biochim.Biophys.Acta 1862 (2016): 1172-1181

Huang, C. C. et al., PLoS.One. 8 (2013): e76421

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

Jacob, M. et al., Curr.Mol Med. 12 (2012): 1220-1243

Januchowski, R. et al., Biomed.Res Int 2014 (2014): 365867

Jezequel, P. et al., Int.J Cancer 131 (2012): 426-437

Jia, M. et al., Cancer Res (2016)

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615

Jung, H. J. et al., J Mol Med.(Berl) 91 (2013): 1117-1128

Kang, C. Y. et al., J Gastrointest.Surg. 18 (2014): 7-15

Karagiannis, G. S. et al., Oncotarget. 3 (2012): 267-285

Karess, R. E. et al., Int.Rev Cell Mol.Biol 306 (2013): 223-273

Karvonen, U. et al., J Mol Biol. 382 (2008): 585-600

Kashyap, M. K. et al., Cancer Biol.Ther 8 (2009): 36-46

Katada, K. et al., J Proteomics. 75 (2012): 1803-1815

Kevans, D. et al., Int J Surg.Pathol. 19 (2011): 751-760

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)

Kim, H. C. et al., Cell Mol.Life Sci. 67 (2010): 3499-3510

Kim, S. Z. et al., J Inherit.Metab Dis. 23 (2000): 791-804

Klinke, O. K. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0130149

Koppen, A. et al., Eur.J Cancer 43 (2007): 2413-2422

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Kristensen, V. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 2802-2807

Lai, Y. H. et al., Carcinogenesis 34 (2013): 1069-1080

Langnaese, K. et al., Cytogenet.Cell Genet. 94 (2001): 233-240

Lascorz, J. et al., BMC.Med.Genet. 13 (2012): 31

Lee, K. Y. et al., J Med. 35 (2004): 141-149

Leiszter, K. et al., PLoS.One. 8 (2013): e74140

Leivo, I. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 156 (2005): 104-113

Li, G. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 14 (2013a): 4943-4952

Li, H. et al., Neoplasia. 8 (2006): 568-577

Li, K. C. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 172

Li, M. et al., Int.J Oncol. 24 (2004): 305-312

Li, X. et al., Genes Chromosomes.Cancer 49 (2010): 819-830

Li, X. H. et al., J BUON. 20 (2015): 1223-1228

Li, Y. et al., PLoS.One. 8 (2013b): e84489

Li, Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 12 (2011): 2405-2409

Lian, J. et al., Oncotarget. 7 (2016): 2672-2683

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lin, C. S. et al., Cancer Lett. 368 (2015): 36-45

Lin, Y. C. et al., J Cell Sci. 127 (2014): 85-100

Liu, Q. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014): 8623-8629

Liu, Z. et al., Carcinogenesis 32 (2011): 1668-1674

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lu, X. et al., Mol.Cancer Ther. 3 (2004): 861-872

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795

Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)

Mahomed, F., Oral Oncol 47 (2011): 797-803

Malumbres, M. et al., Curr.Opin.Genet.Dev. 17 (2007): 60-65

Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res. 43 (2015): 3180-3196

Mehta, A. et al., Breast 23 (2014): 2-9

Mentlein, R. et al., Biol.Chem. 392 (2011): 199-207

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Milne, R. L. et al., Hum.Mol.Genet. 23 (2014): 6096-6111

Mitchell, D. C. et al., J Biol Chem 281 (2006): 51-58

Miyoshi, Y. et al., Med.Mol.Morphol. 43 (2010): 193-196

Mo, Q. Q. et al., Acta Pharmacol.Sin. 34 (2013): 541-548

Moniz, L. S. et al., Mol.Cell Biol 31 (2011): 30-42

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480

Mukhopadhyay, P. et al., Biochim.Biophys.Acta 1815 (2011): 224-240

Mulligan, A. M. et al., Breast Cancer Res 13 (2011): R110

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Na, C. H. et al., Mol.Cells 38 (2015): 624-629

Oji, Y. et al., Int.J Oncol 44 (2014): 1461-1469

Onken, M. D. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 2873-2884

Ono, A. et al., Hum.Pathol. 40 (2009): 41-49

Orentas, R. J. et al., Front Oncol 2 (2012): 194

Papageorgio, C. et al., Int.J Oncol. 31 (2007): 1205-1211

Park, S. H. et al., Clin Cancer Res. 13 (2007): 858-867

Park, S. J. et al., Oncology 88 (2015): 122-132

Parris, T. Z. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 324

Pei, L. et al., Mol.Med Rep. 4 (2011): 817-823

Perez, E. A. et al., Cancer 118 (2012): 3014-3025

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Pornour, M. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014): 10339-10343

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Qi, H. et al., Cancer Res 62 (2002): 721-733

Qu, Y. et al., J Gastroenterol. 49 (2014): 408-418

Quyun, C. et al., Recent Pat DNA Gene Seq. 4 (2010): 86-93

Rammensee, H. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Rao, C. V. et al., Carcinogenesis 30 (2009): 1469-1474

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Resende, C. et al., Helicobacter. 15 Suppl 1 (2010): 34-39

Resende, C. et al., Helicobacter. 16 Suppl 1 (2011): 38-44

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rippe, V. et al., Oncogene 22 (2003): 6111-6114

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Roth, U. et al., Proteomics. 10 (2010): 194-202

S3-Leitlinie Mammakarzinom, 032-045OL, (2012)

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Sakurai, Y. et al., Mol.Pharm. 11 (2014): 2713-2719

Saleem, M. et al., Chem Biol Drug Des 82 (2013): 243-251

Schmid, C. A. et al., J Exp.Med 212 (2015): 775-792

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Shen, R. et al., PLoS.One. 8 (2013): e56542

Shen, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 7133-7142

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Sherman-Baust, C. A. et al., Cancer Cell 3 (2003): 377-386

Shi, D. et al., Oncotarget. 6 (2015): 5005-5021

Shi, D. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 7 (2014): 266-277

Shi, Y. et al., Genomics Proteomics.Bioinformatics. 2 (2004): 47-54

Shi, Y. W. et al., Chin Med J (Engl.) 120 (2007): 1659-1665

Shimizu, D. et al., Oncol Lett. 11 (2016): 1847-1854

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195

Skandalis, S. S. et al., Matrix Biol 35 (2014): 182-193

Skrzypczak, M. et al., Gynecol.Endocrinol. 29 (2013): 1031-1035

Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094

Smith, M. J. et al., Br.J Cancer 100 (2009): 1452-1464

Song, Q. et al., Oncol Rep. 33 (2015): 1956-1964

Stefanska, B. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 3118-3132

Stephens, P. J. et al., Nature 486 (2012): 400-404

Stone, B. et al., Gene 267 (2001): 173-182

Strekalova, E. et al., Clin.Cancer Res. (2015)

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163

Sun, H. et al., J BUON. 20 (2015): 296-308

Sun, J. et al., Technol.Cancer Res Treat. 15 (2016): 285-295

Sussman, D. et al., Mol.Cancer Ther. 13 (2014): 2991-3000

Tahara E Jr et al., Cancer Immunol.Immunother. 54 (2005): 729-740

Takashima, S. et al., Tumour.Biol. 35 (2014): 4257-4265

Tan, M. K. et al., Mol Cell Biol. 31 (2011): 3687-3699

Tang, B. et al., Oncotarget. 6 (2015): 12723-12739

Tanguay, R. M. et al., Acta Biochim.Pol. 43 (1996): 209-216

Tasker, P. N. et al., Osteoporos.Int. 17 (2006): 1078-1085

Terabayashi, T. et al., PLoS.One. 7 (2012): e39714

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762

Thorsen, K. et al., Mol Cell Proteomics. 7 (2008): 1214-1224

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Trojani, A. et al., Cancer Biomark. 11 (2011): 15-28

Tsuchiya, T. et al., Chemotherapy 61 (2016): 77-86

Turner, B. C. et al., Cancer Res 58 (1998): 5466-5472

Uemura, T. et al., Cancer Sci. 101 (2010): 2404-2410

Unland, R. et al., J Neurooncol. 116 (2014): 237-249

Unno, J. et al., Scand.J Gastroenterol. 49 (2014): 215-221

van de Vijver, M. J. et al., N.Engl.J Med. 347 (2002): 1999-2009

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261

Wang, G. H. et al., Oncol Lett. 5 (2013a): 544-548

Wang, J. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015): 13

Wang, Q. et al., PLoS.One. 8 (2013b): e61640

Wang, X. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 196 (2010): 64-67

Wikberg, M. L. et al., Tumour.Biol. 34 (2013): 1013-1020

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Winzer, B. M. et al., Cancer Causes Control 22 (2011): 811-826

World Cancer Report, (2014)

Wu, F. L. et al., Cancer Lett. 363 (2015): 7-16

Wu, T. et al., PLoS.One. 11 (2016): e0149361

Wu, X. et al., Am.J Clin Exp.Urol. 2 (2014): 111-120

Xie, X. et al., Oncol Lett. 7 (2014): 1537-1543

Xiong, D. et al., Carcinogenesis 33 (2012): 1797-1805

Xu, L. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi. 14 (2011): 727-732

Xu, X. et al., Int.J Mol.Med 36 (2015): 1630-1638

Xu, Y. et al., PLoS.One. 8 (2013): e64973

Xue, H. et al., Autophagy. 12 (2016a): 1129-1152

Xue, H. et al., Int.J Oncol 49 (2016b): 519-528

Yakimchuk, K. et al., Mol.Cell Endocrinol. 375 (2013): 121-129

Yamada, A. et al., Breast Cancer Res Treat. 137 (2013): 773-782

Yang, Q. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1643-1651

Yang, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1772 (2007): 1033-1040

Ye, H. et al., BMC.Genomics 9 (2008): 69

Yu, J. et al., Gut 64 (2015): 636-645

Yuan, D. et al., J Surg.Oncol 108 (2013): 157-162

Zanaruddin, S. N. et al., Hum.Pathol. 44 (2013): 417-426

Zaravinos, A. et al., PLoS.One. 6 (2011): e18135

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zhang, G. et al., Tumour.Biol (2016)

Zhang, J. et al., PLoS.One. 9 (2014a): e109318

Zhang, Y. et al., Cancer Lett. 303 (2011): 47-55

Zhang, Z. M. et al., J Cancer Res Clin Oncol 140 (2014b): 2119-2127

Zhao, F. et al., Oncol Res Treat. 37 (2014): 106-110

Zhao, L. H. et al., Genet.Mol.Res 14 (2015): 5417-5426

Zhao, Y. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013): e532

Zhen, X. et al., Mol.Pharmacol. 60 (2001): 857-864

Zhou, H. et al., Tumour.Biol 37 (2016): 8741-8752

Zhu, H. et al., Cell Stress.Chaperones. (2014)

Zou, T. T. et al., Oncogene 21 (2002): 4855-4862

Claims (13)

1. O peptidă constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 42 sau o sare acceptabil farmaceutic a acesteia.

2. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1, în care respectiva peptidă include şi legături non-peptidice.

3. Un receptor de celule T (TCR), preferabil recombinant, solubil sau un receptor de celule T legat de membrană care este reactiv cu un ligand HLA, în care respectivul ligand are cel puţin 88% identitate cu o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu SEQ ID NO 42 şi, de preferinţă, constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO 42.

4. Un anticorp, în particular un anticorp solubil sau legat de membrană, care recunoaşte în mod specific peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, preferabil peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2 atunci când este legată de o moleculă MHC.

5. Un acid nucleic care codifică o peptidă în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2 or pentru un TCR în conformitate cu Revendicarea 3 sau un anticorp în conformitate cu Revendicarea 4, opţional legat la o secvenţă de promotori heterologi sau un vector de exprimare care exprimă respectivul acid nucleic.

6. O celulă-gazdă recombinantă care cuprinde peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2 ori acidul nucleic ori vectorul de exprimare conform Revendicării 5, în care respectiva celulă-gazdă este preferabil o celulă prezentatoare de antigen, cum ar fi o celulă dendritică, sau respectiva celulă-gazdă este, de preferinţă, o celulă T ori o celulă NK.

7. O metodă pentru producerea peptidei în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2 sau pentru producerea receptorului de celule T în conformitate cu Revendicarea 3 sau un anticorp în conformitate cu Revendicarea 4, metoda care cuprinde cultivarea unei celule-gazdă în conformitate cu Revendicarea 6 care prezintă peptida în conformitate cu Revendicările 1-3 sau exprimă acidul nucleic ori vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5 şi izolarea peptidei sau a TCR-ului ori a anticorpului din celula-gazdă sau mediul său de cultură.

8. O metodă in vitro pentru producerea de limfocite T activate, metoda cuprinzând contactarea in vitro a celulelor T cu molecule de MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau o construcţie artificială care imită o celulă prezentatoare de antigen pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa numitele celule T într-o manieră specifică antigenului, în care respectivul antigen este o peptidă în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2.

9. O limfocită T activată produs prin metoda conform Revendicării 8 care recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi dată în oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2.

10. O compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un ingredient activ selectat din grupul constând din peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula în conformitate cu Revendicarea 6, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 9 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 3 şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, excipienţi şi/sau stabilizatori acceptabili farmaceutic.

11. Peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula în conformitate cu Revendicarea 6, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 9 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 3 pentru utilizare în medicină, preferabil pentru utilizare în diagnosticarea şi/sau tratarea cancerului ori pentru utilizare la fabricarea unui medicament împotriva cancerului.

12. Peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula în conformitate cu Revendicarea 6, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 9 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 3 pentru utilizare în diagnosticarea şi/sau tratarea cancerului în conformitate cu Revendicarea 11, în care cancerul menţionat este selectat din grupul de cancer pulmonar, cancer cerebral, cancer gastric, cancer colorectal, cancer hepatic, cancer de pancreas, cancer de prostată, leucemie, cancer mamar, melanom, cancer ovarian şi cancer esofagian şi alte tumori care arată o supraexprimare a unei proteine din care este derivată o peptidă în conformitate cu SEQ ID NO: 42.

13. O trusă care conţine: a) un recipient cu o compoziţie farmaceutică care conţine peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 5, celula în conformitate cu Revendicarea 6, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 9 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 3, în soluţie sau sub formă liofilizată; b) opţional, un al doilea recipient conţinând un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; c) opţional, cel puţin încă o peptidă selectate din grupul constând din SEQ ID NO: 1-41 şi 43 şi d) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate şi e) conţinând, suplimentar, una sau mai multe dintre următoarele: (iii) o soluţie-tampon, (iv) un diluant, (v) un filtru, (vi) un ac sau (v) o seringă.