KR930001882B1

KR930001882B1 - 프럭토올리고당의 제조방법

Info

Publication number: KR930001882B1
Application number: KR1019900022036A
Authority: KR
Inventors: 양지영; 백운화; 이세원; 양창실
Original assignee: 두산곡산 주식회사; 안기영
Priority date: 1990-12-27
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1993-03-19
Also published as: KR920012451A

Abstract

내용 없음.

Description

프럭토올리고당의 제조방법

본 발명은 미생물이 생산하는 폴리머(polymer)의 일종인 프럭탄(fructans)으로부터 프럭탄을 가수분해하는 효소 또는 산을 처리하여 프럭토올리고당을 공업적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프럭토올리고당"은 프럭토오즈가 적어도 2개이상이 주로 베타2.6결합을 하고 가지결합으로 베타1.2결합을 통해 결합하여 형성한 올리고당을 의미한다.

올리고당은 일본을 중심으로 연구계발되어 왔으며 균주의 개발, 효소의 개발, 공업적 생산 연구, 응용연구등 오랜기간동안의 연구에 걸쳐 지금은 일부 올리고당이 상업화되었으며 아직도 많은 올리고당이 연구개발중에 있다.

지금까지 밝혀진 올리고당의 유용성을 살펴보면 Bifidus 중식인자, 충치방지효과, 전분의 노화방지, 저감미료, 저칼로리등 여러가지 생리기능을 갖는 기능성당으로서 인지되고 있다. 좀더 올리고당의 유용성을 살펴보면, 장내세균층, 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium)의 성장에 탁월한 효과가 있다. 즉, 섭취된 올리고당은 인간 또는 동물의 소화효소에 의해 분해되지 않고 대장까지 쉽게 도달하여 대장에서 유해세균을 이용하지 못하고 대표적인 유용세균군인 비피도박테리움(Bifidobacterium)에 의해 선택적으로 이용되어 비피도박테리움의 성장을 촉진시킨다. 장내에서 비피도박테리움의 수를 일정수준이상으로 유지시키는 것은 건강유지에 중요하다는 사실이 많은 연구발표에 의해 입증되었다. 실제로 플럭트올리고당의 섭취에 의해 증가되는 비피도박테리움은 변비 또는 설사를 완화시키며, 유해한 박테리아에 의해 발생되는 장내부패현상을 감소시키며 이로 인해 유해산물의 생성을 방지하고 암의 발생을 저하시킬 수 있다는 보고도 있다.

따라서 동물에 프럭토올리고당을 투여할 경우에는 동물의 설사방지, 성장촉진 및 사료효율의 증진에 기여한다는 연구결과도 많이 있다. 그외에도 프럭토올리고당의 투여는 지방혈증의 개선, 혈청내 콜레스테롤 농도의 감소, 혈압감소등과 같은 생리적 효과를 제공한다. 이들 효과는 장내세균총에 대한 작용에 기인하여 나타나는 것으로 믿어진다.

또한 프럭토올리고당은 거의 충치를 발생시키지 않는 것으로 보고되고 있다.

충치는 구강내의 유산균인 스트랩토코커스 뮤탄스(Streptococc us mutans)에 의해 발생한다. 충치발생의 기작을 살펴보면 스트랩토코커스 뮤탄스는 기질인 설탕에 작용하여 텍스트란(dextran)을 합성하는 텍스트란 합성효소를 분비한다. 텍스트란은 치아 표면에 부착하여 치이상에 치구(dental plaque)를 형성하고, 또한 스트랩토코커스 뮤탄스는 발효가능한 당류를 혐기적으로 발효시켜 유산(lactic acid)을 생성시켜 치아에나멜의 탈회(decalcification)을 야기시킨다. 프럭토올리고당은 스트랩토코커스 뮤탄스로부터 분비되는 텍스트란 합성효소에 기인한 텍스트란합성이나 또는 스트랩토코커스 뮤탄스의 혐기성 발효를 위한 기질로서 제공되지 않는다. 프럭토올리고당이 거의 충치를 일으키지 않는다는 사실은 동물실험을 통해 입증되었다.

그외에도 사회가 발달함에 따라 건강에 대한 관심이 증가함에 따라 저칼로리, 저감미료의 요구가 증가되는 추세이다. 이에 프럭토올리고당은 설탕보다 감미도가 낮아 저감미료로서도 가능하며 사람이나 동물이 섭취시 위를 통과하여 소장에서 흡수되지 않으므로 저칼로리로서의 감미료로서도 주목받고 있다.

현재까지 개발된 올리고당은 말토올리고당, 프럭토올리고당, 가락토올리고당, 사이크토렉스트린등이 있으며 그외에도 많은 종류의 올리고당이 연구 개발중에 있다. 그중 프럭토올리고당을 살펴보면 곰팡이가 생산하는 프럭토트랜스 퍼라제라는 효소를 사용하여 고농도의 설탕과 회분식 또는 고정화방법에 의하여 제조하거나 이눌린 또는 이눌린함유식물[예 : 뚱딴지(artichokes)(Helianthus tuberosusl), 치커스(chicory)등]에 엔도(endo)형 활성이 높은 이눌라제라는 효소처리를 하여 포도당 한분자에 적어도 2개 이상의 프럭토즈잔기가 베타1, 2결합을 하고 있는 5당류까지의 올리고당액을 제조하고 있다.

이에 본 발명자는 공업적으로 생산가능한 프럭토올리고당액을 제조할 수 있는 기술을 개발하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 이미 특허가 공고된 고농도 당배지에서 분리한 신규미생물 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)가 만들어낸 다당류로부터 효소 및 산가수분해에 의해 프럭토올리고당을 제조해 내는 방법을 제공하는데 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

설탕이 함유된 배지에서 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)를 배양하게 되면 설탕이 가수분해되어 과당이 종합된 프럭탄(fructan)이라는 다당류가 생성되고 그 부산물로 미생물 균체와 포도당이 배양액의 주성분이 된다. 트럭토올리고당을 제조하기 위해서는 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)의 배양액에서 균체를 제거한 후 그대로 또는 적절한 처리를 하여 배양액의 조성을 조절한 후, 프럭탄를 가수분해하는 효소 및 산가수분해처리에 의해 제조하거나, 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)에 의해 제조된 프럭탄을 50% 용액으로 제조한 후 프럭탄을 분해하는 효소 또는 산가수분해에 의해 프럭토올리고당을 제조할 수 있다. 프럭토올리고당의 조성은 효소 또는 산가수분해조건에 따라 과당과 과당이 2분자이상 결합된 프럭토올리고당의 함량을 적절한 농도로 조절할 수 있다. 또한, 순수한 프럭토올리고당을 제조하기 위해서는 박층크로마토그래피(Thin Later Chromatography), 고압력액제크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography), 젤 퍼미에이션 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography), 이온크로마토그래피(Ion Chromatography)등과 같은 크로마토그래피(Chromatography)방법을 이용하거나 단당류를 이용하는 미생물을 사용하여 단당류가 제거된 순수한 프럭토올리고당을 제조할 수도 있다. 그외에도 프럭탄을 제거하고 남은 부산물인 균체배양액에서 균체를 제거하고 남은 액의 주성분이 포도당으로서 이를 프럭토올리고당에 혼합함으로써 혼합프럭토올리고당을 제조할 수도 있다.

가수분해과정은 효소적인 방법 또는 산처리방법에 의해 실시될 수 있다. 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)가 생산하는 프럭탄을 가수분해하는 효소인 레바네이즈(lavanais)는 상업적으로 잘 알려진 효소로서 반응조건을 조절함으로서 미생물프럭탄을 과당 또는 올리고당으로 가수분해할 수 있는 효소이다. 효소가수분해의 이점은 반응조건이 약산 또는 중성부근에서 이루어짐으로서 산가수분해시 생길 수 있는 부산물의 생성을 피할 수 있다. 레바네이즈효소는 그대로 사용하거나 적당한 담체에 고정화하여 사용할 수 있다. 효소의 역가는 pH 6.5에서 50℃로 반응하여 프럭탄으로부터 분당 1마이크로몰의 과당을 생산할 수 있는 효소역가를 1유니트로 하며 반응에 사용되는 효소의 양은 기질인 프럭탄의 농도, 효소역가, 반응시간, 반응조건에 따라 결정된다. 일반적으로 처리할 프럭탄의 g당 10에서 100유니트의 효소를 사용하며 반응온도와 pH는 효소역가가 최적인 조건에서 실시한다.

반응 pH는 일반적으로 4.5에서 5.5사이에서 실시하며 바람직하게는 5.0에서 실시한다. 반응온도는 반응에 따라 다르나 효소가 불활성화되지 않는 온도범위가 포함된다. 대개 45℃에서 55℃의 범위에서 실시하며 바람직하게는 50℃에서 실시한다. 효소반응은 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)가 생산한 다당류인 프럭탄의 효소가 함유된 수용액상태에서 행하며 물은 프럭탄의 농도를 조절하기 위하여 첨가된다. 효소는 반응측에 첨가하거나 반응이 진행될때도 일부 첨가할 수 있다. 보통 효소반응은 효소를 그대로 사용할 경우에는 단일 교반방응기 또는 연속 교반반응기를 사용하거나 고정화효소를 사용할 경우에는 고정화탑을 이용하여 반응시키며 그외에 효소반응이 가능한 반응기에서 실시한다.

산가수분해과정은 적정농도로 조제된 산과 적당한 온도로 가열시킴으로서 가수분해가 이루어진다. 산가수분해에 사용되는 산은 황산, 인산, 염산, 질산, 옥살산등을 사용할 수 있다. 산가수분해과정은 급격히 진행되며 최종산물인 과당의 파괴가 이루어지지 않도록 조심한다.

일반적으로 첨가되는 산의 양은 기질인 트럭탄의 농도 및 반응조건에 따라 다르나 0.01M에서 0.05M의 범위에서 실시하며 바람직하게는 0.02M을 사용한다. 반응액의 가열조건은 50℃에서 100℃의 범위에서 처리하며 바람직하게는 85℃에서 95℃의 범위에서 실시한다. 회분식의 반응조를 이용할 때는 수율이 최적일때 반응을 중지시키며 연속식의 반응조로 사용될 수 있다.

산가수분해후 중화를 위해 암모니아수, 가성소다, 칼슘 또는 칼륨 하이드로사이드, 카보네이트염(소듐, 칼륨, 칼슘등) 또는 소다회등의 알카리성 물질을 사용한다.

프럭토올리고당을 제조하기 위하여 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)의 배양액을 원심분리 및 filtration 방법등에 의해 균체를 제거한 후 그대로 사용하거나 dialysis, reverse osmosis, ultrafiltration, hollow fiber filtration등의 방법이나 용매 및 염등을 사용한 분별침전법을 사용하여 농축한 후 효소 또는 산가수분해처리하여 제조할 수 있다. 또한 다른 방법으로는 설탕배지에서 바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)가 생산한 프럭탄을 50%까지의 농도로 용해한 후 그 용액에 효소 및 산을 처리하여 프럭토올리고당을 제조한다. 이렇게 제조된 프럭토올리고당의 조성을 조절하기 위하여 박층크로마토그래피(Thin Later Chromatography), 젤 퍼미에이션 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography), 이온크로마토그래피(Ion Chromatography)등 박층크로마토그래피, HPLC, GPC, 이온크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피(chromatography)방법을 사용하거나 과당이나 포도당등 단당류를 이용할 수 있으나 고당 다이머(fructrose dimer)이상의 프럭토올리고당을 이용할 수 없는 미생물을 이용하여 단당류가 제거된 순수 프럭토올리고당을 만들 수도 있으며, 바실러스속 두산3호의 배양액 성분중에서 프럭탄과 균체를 제거하면 포도당이 주성분인 부산물로 남게 되는데 이를 앞서 제조한 프럭토올리고당에 혼합하여 혼합프럭토올리고당을 제조할 수도 있다.

이상과 같이 제조된 프럭토올리고당은 활성탄처리, 이온교환처리와 농축처리를 통해 제품화하여 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)를 배양한 배양액의 균체를 원심분리에 의해 제거한 후 그 상등액을 진공농축하여 0.05M 인산완충액에 대해 하룻밤 투석하여 포도당 농도를 조절한 후 5M 인산을 사용하여 pH를 5.0으로 조절하고 레바네이즈(levanase)효소를 10유니트 첨가한 후 50℃ 반응온도에서 효소가수분해를 하여 과당이 12.12%, 포도당이 20.04%, 설탕과 과당다이머(fructose dimer)가 25.78%, 고당트리머(fructose trimer)가 22.37%, 과당테트라머(fructose tetramer)이상의 프럭토올리고당이 10.47% 함유한 프럭토올리고당액을 제조하였다. (제1도)

[실시예 2]

바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)로부터 제조한 프럭탄이 25% 함유된 용액의 pH를 5.0으로 조절하여 레바네이즈(levnase)효소를 10유니트 첨가한 후 50℃ 반응온도에서 효소가수분해를 하여 과당이 42.83%, 과당다이머(fructose tetramer)이상의 프럭토올리고당이 33.33% 함유한 프럭토올리고당액을 제조하였다. (제2도)

[실시예 3]

바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)로부터 제조한 프럭탄이 25% 함유된 용액에 황산을 0.02M이 되도록 첨가한 후 90℃에서 30분 중탕하였다. 산가수분해가 완료된 당액을 냉각한 후 가성소다를 사용하여 중화하여 과당이 20.68%, 고당다이머(fructose dimer)가 8.66%, 과당트리머(fructose trimer)가 10.09%, 과당테트라머(fructose tetramer)이상의 프럭토올리고당이 49.51% 함유한 프럭토올리고당액을 제조하였다. (제3도)

[실시예 4]

실시예 3에서 제조한 프럭토올리고당액의 농도를 조절하기 위하여 지름 4.5㎝ 길이41㎝의 컬럼(column)을 사용하여 이온크로마토그래피를 행하였다. 실시예 3에서 제조한 프럭토올리고당을 컬럼에 주입한 후 작업온도 60℃에서 적절한 유속으로 크로마토그래피를 행하여 프럭토올리고당의 조성을 변화시킬 수 있는 여러 분획을 얻었다. (제4도)

[실시예 5]

바실러스속 두산3호(Bacillus sp. Doosan 3)로부터 제조된 프럭탄이 30% 함유된 용액에 황산을 0.02M이 되도록 첨가한 후 85℃에서 30분 중탕하였다.

산가수분해가 완료된 당액을 냉각한 후 가성소다를 사용하여 중화시켜 과당 19.76%, 과당다이머(fructose dimer)가 6.10%, 과당트리머(fructose trimer)가 8.38%, 과당테트라머(fructose tetramer)이상의 프럭토올리고당이 63.81% 함유한 프럭토올리고당액을 제조하였다. (제5도)

[실시예 6]

실시예 5에서 제조한 프록토올리고당액의 농도를 조절하기 위하여 미생물을 이용하여 과당이 농도를 조절할 수 있었다. 실시예 5에서 제조한 프럭토올리고당을 micro filtration 처리를 한 후 빵효모(사카로마이세스 세레이지아)를 접종하여 30℃ 2일간 배양한 후 빵효모의 균체를 제거하여 과당의 농도를 조절한 프럭토올리고당액을 제조하였다. (제6도)

Claims

프럭토올리고당을 제조함에 있어서, 바실러스속 두산3호(한국종균협회 기탁번호 KFCC 10610)가 생산하는 폴리머 또는 그 배양액을 효소 또는 산을 가수분해하여 프럭토올리고당 또는 혼합 프럭토올리고당을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 혼합프럭토올리고당의 제조시, 포도당 농도를 조절하기 위하여 포도당시럽을 사용하거나 바실러스속 두산3호의 배양액을 이용하되 dialysis, reverse osmosis, ultrafiltration, hollow fiber filtration 중에서 단독 또는 혼합된 형태로 선택되는 여과방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 효소가 레바네이즈인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 산은 황산, 인산, 염산, 질산, 옥살산 중에서 선택하여 가수분해하되 반응온도를 50℃∼100℃이며 0.01M에서 0.05M로 산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 프럭토올리고당액 농도를 조절하기 위하여 크로마토그래피방법을 사용하되 박층크로마토그래피, 고압력액체크로마토그래피, 젤퍼미에이션크로마토그래피, 이온크로마토그래피 방법중 선택하여 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 포도당 농도를 조절하기 위하여 용매 및 염을 사용한 분별침전법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 프럭토올리고당액 농도를 조절하기 위하여 단당류를 이용하는 사카로마이세스 세레이지아를 이용함을 특징으로 하는 프럭토올리고당의 제조방법.
제3항에 있어서, 반응온도를 45℃에서 55℃로 반응 pH는 4.5∼5.5에서 효소반응시키는 방법.
제4항에 있어서, 암모니아수, 가성소다, 칼슘 또는 칼륨하이드로사이드, 카보네이트염(소듐, 칼륨, 칼슘) 또는 소다회중에서 선택하여 중화하는 방법.