KR870002162B1 - 항인체단백질 항체(抗人體蛋白質抗體)의 제조방법 - Google Patents

항인체단백질 항체(抗人體蛋白質抗體)의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

항인체단백질 항체(抗人體蛋白質抗體)의 제조방법
본 발명은 항인체단백질 항체의 제조방법에 관한 것이다. 종래, 항인체단백질 항체(이하 항체라고 약칭한다)는 인체유래(人體由來) 단백질(이하 인체단백질이라 약칭한다)을 사람 이외의 온혈동물에 주입하여 산생(産生)되는 항체를 그 동물의 혈청으로 부터 채취하여 제조하여 왔다.
그러나, 종래의 방법에서는 항체 산생을 하기위한 항원, 즉 인체단백질을 다량으로 필요로 하고, 또 인체단백질을 주입한 사람 이외의 온혈동물이 아나필락시성 쇼크(anaphylaxy-shock)를 일으키어 가끔 사망하기도 하고, 항체 산생량이 너무 적고, 한편 불순항체 밖에 산생하지 않는 등의 결점을 가지고 있어 고순도 항체의 대량 생산이 극히 곤란하였다.
본 발명자들은 이같은 결점을 해소하기 위해 예의 연구한 결과, 항원으로서 인체단백질에 당류(saccharide)를 공유결합시켜서 생성하는 단백질-당류 결합물을 사람 이외의 온혈동물에 주입해서 항체 산생능을 갖고 있는 세포 보다 높은 항체 산생을 유도시켜서 사용한 인체단백질과는 특이적으로 반응하는 고순도의 항체를 용이하게 다량으로 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성한 것이다.
즉, 본 발명에 의하면 항원으로서 인체단백질을 그대로 사용하여 항체를 유도하는 경우와 비교하여 항체의 산생량이 약 4-100배, 또는 그 이상으로 급격히 증가하고, 또한 이 항체 산생량의 증가는 면역글로불린 G의 산생이 현저하게 증가한 결과로서 아나필락시성 쇼-크의 원인이 되는 면역 글로불린 E의 산생량은 오히려 현저히 감소하거나 실질적으로 거의 없는 상태가 된다.
따라서, 본 발명에서는 사람 이외의 온혈동물에 항체 산생을 유도시킴에 있어서 알레르기 질환이나 아나필락시성 쇼-크를 야기시킬 염려도 없고 항체의 다량 생산에 지극히 편리한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 인체단백질은 사람 이외의 온혈동물에서 항원으로서 작용하여 항체 산생을 유도할 수 있는 인체조직 또는 체액에 있는 단백질, 단백질 유사 물질을 말하는 것으로 예컨데 인체내의 효소, 호르몬, 임파액, 면역글로불린, 혈청, 혈액성분, 악성종양조직성분, 뇨성분, 땀성분, 자궁내막성분, 태반성분, 정액성분 등으로, 통상 이들 단백질은 예컨데 여과, 세정, 원심분리, 염석, 흡탈착, 겔여과, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등의 정제방법을 적의 조합하여서 분리 정제시킨 후에 당류와의 공유결합반응에 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 당류라 함은 예컨데, 전분, 아밀로오스, 덱스트란, 폴리슈크로오스(상품명, 피콜), 플루란, 엘시난, 커드란, 아라비아검, 트라칸트검, 구아검, 크산틴검, 셀룰로오스, 글루코만난, 키토산 등의 각종 다당류 또는 이들 다당류의 부분가수분해물을 의미하며, 이들의 평균분자량은 통상 1,000-10,000,000 특히 10,000-1,000,000의 범위가 바람직하다.
이중에서도 중성단순다당류, 특히 말토트리오스를 반복단위로 하는 비이온성 플루란, 엘시난 또는 이들 다당류의 부분가수분해물은 인체단백질과 공유결합시키므로서 인체단백질과 특이적으로 반응하는 면역글로불린 G의 산생량을 현저히 증가시키고 반대로 면역 글로블린 E의 산생은 실질적으로 거의 없는 점에서 특히 우수한 당류이다.
본 발명에서 말하는 공유결합방법으로는 인체단백질과 당류 사이에 공유결합을 형성할 수 있는 각종 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 디아조법, 펩티드법, 알킬화법, 가교법, S-S결합법 등이 있다.
디아조법으로서는 예컨데 p-아미노벤질기, p-아미노벤조일기, m-아미노벤질기, m-아미노벤조일기, m-아미노아니솔기, m-아미노벤질옥시메틸기, 3-(p-아미노펜옥시)-2-히드록시프로피오닐기, 2-(p-아미노-m-메틸아닐리노)-5-클로로트리아진일기 등의 방향족 아미노기를 공지의 방법에 의하여 도입시킨 활성화 당류와 인체단백질을 반응시키는 것이 좋다.
펩티드법으로서는 예컨데 카르복실기를 가지는 당류, 예컨데 아지드, 산클로리드, 카르보디이미드, 이소시아네이트 등의 유도체로 된 당류 카르보네이트, 브롬시안 활성화 당류 등의 활성화 당류와 인체단백질을 반응시키는 것이 좋다.
알킬화법으로서는 예컨데 클로로아세틸기, 브로모아세틸기, 요오드아세틸기, 할로겐화 트리아진일기 등을 도입시킨 당류 할로겐화 알킬 유도체와 인체단백질을 반응시키는 것이 좋다.
가교법으로서는 인체단백질과 당류 공존하에서 예를 들면 글루타르알데히드, 글리옥살, 숙신디알데히드헥사메틸렌 디이소시아네이트, 톨루엔 2,4-디이소시아네이트, 비스-아조벤지딘 또는 N, N'-에틸렌-비스-말레이미드 등의 가교시약을 반응시키는 것이 좋다.
반응시의 인체단백질과 당류의 중량비는 통상은 1:1000-1000:1, 바람직하게는 1:100-100:1 범위에서 선정된다. 반응조건은 통상 온도 약 0-100℃, pH 약 3-12에서 약 0.1-50시간의 범위에서 선정된다.
이같이 해서 수득된 인체단백질-당류 결합물은 그대로 또는 필요한 경우에는 겔여과 등의 분자량 분획법을 사용하여 부분정제한 후 항체의 산생을 유도시키기 위해 사용된다.
본 발명의 사람 이외의 온혈동물에서 항체 산생을 유도시키는 방법은 예컨데 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 몰못트, 쥐, 누우드쥐, 햄스터, 마우스, 누우드 마우스 등의 사람 이외의 온혈동물의 예를 들어 정맥, 복강, 피하 등에 단백질-당류 결합물을 예컨데 수용액, 유화액, 현탁액 등으로 하여 주입시킨 후 3일 이상 사육하여 항체 산생을 유도하면 된다. 이 단백질-당류 결합물의 사람 이외의 온혈동물에 대한 주입을 1회 행하여도 좋으나 필요한 경우에는 약 3-30일 간격으로 2회 이상 주입하여도 좋다.
본 발명 항체는 전술한 바와 같이 보다 높은 항체 산생을 유도시킨 동물의 혈청으로부터 통상방법에 따라 분리 정제하여 채취하면 된다.
또 이와같이 하여 높은 항체 산생을 유도시킨 동물의 비장세포와 동종 또는 이종 동물 유래의 골수종(myeloma)세포를 예컨데 Kohler 동이 Nature, Vol.256, 495-497(1975년) 및 Eur. J. Immunol., Vol. 6, 511-519(1976년)에서 보고하고 있는 방법에 따라 융합시켜서 얻어지는 융합세포로 부터 목적하는 항체산생능을 갖는 융합세포를 클로우닝(cloning)하고, 이어 생체의 또는 생체내에서 배양하고, 이 배양물로 부터 다시 특이성이 높은 고순도 항체를 채취하는 것도 좋다. 이중에서 생체내의 배양은 생체외의 배양과 비교하여 고가인 혈청을 필요로 하지 않을뿐만 아니라 융합세포의 증식세포의 증식속도가 크고 또한 다량의 항체를 산생할 수 있어서 지극히 유리하다.
생체내에서 배양하는 경우에는 항체 산생을 유도시킨 동물과 동종의 온혈동물에 융합세포를 이식하고, 또는 확산챔버 내에서 접종하여 그 온혈동물의 체액공급을 받으면서 증식시킬 수 있는 복수, 혈청 등의 체액으로 부터 항체를 채취하거나 또는 생체내에서 증식시킨 융합세포를 다시 무혈청 배지중에서 약 1-5일간의 단기간 배양을 하여 이 배양물로 부터 항체를 채취하면 된다.
앞에서 기술한 바와 같이 해서 생성된 항체는 통상방법에 따라 예를 들면 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결건조 등을 행해줌으로서 용이하게 정제 분리하여 채취할 수가 있다.
또한 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는 예를 들면, 이온교환체에 흡착·용출, 겔여과, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등의 공지 방법을 다시 조합할 수도 있으며, 최고순도의 항체를 채취할 수도 있다.
이와같이 해서 수득된 항체는 사람 질병의 진단제, 예방제, 치료제 등으로서 또한 고정화하여 친화성크로마토그래피 용의 담체로서도 유리하게 사용할 수가 있다.
또 인체단백질과 특이적으로 반응하는 항체 산생량은 면역글로불린G의 경우는 Japan J. Med. Sci. Biol. Vol. 28, 127 (1975년)에 보고된 PHA반응에 의하여 면역 글로불린 E의 경우는 Life Science Vol.8, 813(1969년)에 보고된 PCA반응에 의하여 측정하였다.
다음에 2-3개의 실시예에 대하여 기술한다.
[실시예 1] 항인체 인타페론 항체의 제조
(1) 인체 인타페론의 제조
일본국 특허공개 소 54-98307호 공보에 기재된 방법에 준하여 본 실시예에서 사용되는 인체 인터페론을 제조하였다. 신생아 햄스터에 토끼로 부터 공지 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하고 햄스터의 면역반응을 약하게 한후 그 피하에 배양주화한 인체유래의 림프아세포 BALL-1 세포를 이식하고 통상의 방법으로 3주간 사육하였다.
피하에 생긴 약 30g의 종류(腫瘤)를 적출하여 세절한 후 트리프신 함유의 생리식염수에 현탁시켜 세포를 분산시켰다. 이 세포를 송아지 혈청 10v/v%를 함유하는 RPMI 배지에 107/m
Figure kpo00001
가 되도록 부유시키고, 여기에 인체 림프아세포 유래의 인터페론을 100국제단위/m
Figure kpo00002
의 비율로 가하고 채우고 다음에 센다이비루스를 500적혈구 응집가/m
Figure kpo00003
의 비율로 첨가해서 37℃에서 20시간 동안 보관한후 원심분리해서 상등액을 채취하였다.
이 상등액을 pH 2.0으로 유지한 센다이비루수를 불활성화하고 다음에 pH 4.0으로 하여 SP-Sephadex C-25(Pharmacia사 제품)에 흡착시킨 후 pH 8.0에서 용출하고 또한 Sephadex G-100(Pharmacia사 제품)을 사용해서 겔여과하여 인타페론 분획을 모아 투석시킨후 동결건조하고 재차 용해하여 SP-Sephadex C-25 크로마토그래피로서 분획하고 투석, 동결 건조하여 비활성 약 5×107/mg의 정제 인타페론을 수득하였다.
수득량은 햄스터 1마리당 약 0.8mg이었다.
(2) 인체 인타페론-풀루란 결합물의 제조
풀루란(평균 분자량 약 140,000) 5g을 물 400m
Figure kpo00004
에 용해하고, 1N-가성소오드액으로 pH를 10.7로 한후 이 pH를 유지하면서 브롬시안 3g을 서서히 가하고, 1시간 반응시켰다.
다음 1N-염산액으로 pH5.0으로 한후 이 pH를 유지하면서 냉수로 투석하여 활성화 풀루란액을 제조하였다. 이 활성화 풀루란액에(1)의 방법으로 제조한 인체 인타페론 50mg을 50m
Figure kpo00005
수용액으로 만들어 첨가하고 실온하에서 24시간 반응시킨후 반응액 3배량의 아세톤을 가하여 침전물을 채취하고 이것을 0.01M인산 완충액(pH 7.0)에 용해한후 원심분리하여 불용물을 제거하고 상충액을 겔여과하고 다시 정밀여과, 농축하여 인체 인타페론-풀루란 결합물을 채취하였다.
수율은 사용한 인타페론 단백질당 약 70%이었다.
(3) 항인체 인타페론 항체의 제조
(2)의 방법으로 수득한 인타페론 풀루란 결합물을 식염수로서 등장용액으로 만들고 이 용액 0.2ml(단백질로서 30㎍을 함유)를 햄스터에 정맥주사하고 7일 후에 다시 동일하게 주사하여 10일 후에 채혈하였다. 이 혈액을 원심분리하여 혈청을 수득하고 이것을 황산암모늄을 사용 염석시켜서 포화도 30-50%의 침전분획을 수집한 후 투석해서 수득된 용액을 (1)의 방법으로 수득한 정제 인타페론을 브롬시안 활성화 세파로오스와 실온하에서 반응시켜서 제조된 고정화 인타페론겔을 사용해서 통상방법에 따라 친화성 크로마토그래피를 행해줌으로서 항인체 인타페론 항체 분획을 수득하고 투석한후 동결 건조시켜서 항인체 인타페론 항체를 수득하였다.
또 대조용으로는 (1)의 방법으로 수득된 인타페론을 햄스터에 단백질로서 30㎍씩 동일하게 2회 정맥주사하고 10일 후에 채혈 하여서 수득된 혈청을 동일하게 정제하고 동결 건조하여 항인체 인타페론 항체를 수득하였다.
본 발명 항인체 인타페론 항체는 햄스터당 면역 글로불린G를 대조항체의 약 30배량 함유하며, 면역 글로불린E를 거의 포함하고 있지 않았다. 또 대조용 항체에는 면역 글로불린 G이외에 면역 글로불린 E가 다량 함유되어 있었다.
본 발명 항인체 인타페론 항체를 고정화하고 친화성 크로마토그래피용 담체로서 이용하면 고순도 인타페론의 대량생산이 극히 용이하다.
[실시예 2] 항인체 우로키나아제(urokinase) 항체의 제조
(1) 인체 우로키나아제의 제조
인체 유래의 우로키나아제(Sigma사 제품)를 실시예 1(1)에서의 인타페론의 경우와 동일하게 SP-Sephadex C-25에 의한 흡·탈착법 및 Sephadex G-100에 의한 겔여과법에 따라 정제하고 동결 건조해서 비활성 약 4단위/mg 프로테인의 정제된 인체 우로키아나제를 수득하였다.
(2) 인체 우로키나아제-엘시난(elsinan) 결합물의 제조
엘시난(평균 분자량 약 800,000) 8g을 열수 200m
Figure kpo00006
에 용해하여 실온으로 냉각한 후 다음에 이어 10중량/부피%에의 시아누릴클로라이드-디메틸포름아미드 용액 40ml을 첨가하고 1N-탄산나트륨 용액을 사용 pH를 7.0으로 유지하면서 실온하에서 2시간 반응시킨후, 그 pH를 유지하면서 4℃의 물로 1야 투석해서 활성화 엘시난 용액을 수득한다.
이 용액에 (1)의 방법으로 제조한 정제 우로키나아제 30mg을 40m
Figure kpo00007
수용액으로 만들어서 첨가하고 pH 9.0으로 하여 실온하에 교반하면서 2시간 동안 결합반응시킨후 실시예 1(2)와 동일하게 정제, 농축해서 우로키나아제 엘시난 결합물을 채취하였다.
수율은 사용한 우로키나아제의 단백질당 약 60%이었다.
(3) 항인체 우로키나아제 항체의 제조
(2)의 방법으로 수득된 우로키나아제-엘시난 결합물 용액을 완전 프러인드-아쥬반트(Freund's adjuvant) 유화액으로 만들어서, 이 유화액 0.3m
Figure kpo00008
(단백질 약 20μg를 함유함)를 쥐의 피하에 주사한후 실시예 1(3)의 경우와 동일하게 처리해서 혈청을 수득한다. 수득된 혈청을 모두 합쳐서 염석, 투석, 친화성 크로마토그래피, 투석 및 동결 건조의 순서로 처리해서 목적하는 항인체 우로키나아제 항체를 수득하였다. 대조용으로 (1)의 방법으로 수득한 우로키나아제를 쥐에 대하여도 동일하게 주사하고 수득된 혈청으로부터 항체를 채취하였다.
본 발명의 항 우로키나아제 항체는 쥐 마리당 면역 글로불린 G를 대조항체의 약 16배량 함유하며, 면역 글로불린 E를 거의 함유하고 있지않았다. 또한 대조용 항체에는 면역 글로불린 G 이외에 면역 글로불린 E가 다량 함유되어 있었다.
본 발명의 항인체 우로키나아제 항체를 고정화하고 친화성 크로마토그래피용 담체로서 이용하면 고순도 우로키나아제의 대량 생산이 지극히 용이하다.
[실시예 3] 항인체 림파구 항체의 제조
(1) 인체 림파구 단백질의 제조
인체혈청 5%를 함유하는 Eagle배지에서 배양하고, 원심분리하여 채취한 인체유래 림파아구 BALL-1세포를 초음파처리(20KHz, 10분간) 한후 원심분리(5,000×g, 20분간)하여 수득한 상층액을 황산암모늄으로 염석해서 포화도 25-80%의 침전분획을 수집하고, 이를 투석시킨후 농축, 동결 건조해서 인체 림파이구 단백질을 수득하였다.
(2) 인체 림파아구 단백질-부분가수분해 풀루란 결합물의 제조
부분가수분해 풀루란(평균 분자량 10,000) 5.2g을 디메틸포름아미드 110m
Figure kpo00009
에 가온하면서 용해한 다음 실온으로 냉각하고, 여기에 10m
Figure kpo00010
의 피리딘을 첨가한후 교반하면서 p-니트로벤조일클로라이드 1.0g을 첨가하고 실온하에서 17시간 보관한다. 여기에 2배 용량의 n-프로필알코올을 첨가해서 침전물을 채취한후 디메틸 포름아미드에 용해하였다.
이 조작을 3회 반복해서 수득한 침전을 5w/v% 히드로 설파이트나트륨 수용액 100m
Figure kpo00011
에 용해하여 80℃에서 30분간 보관한 후 활성탄으로 탈색하고 2배 용량의 n-프로필 알코올로 침전시킨 것을 물에 용해하여 1야 수도물로 투석하였다. 이 용액을 2℃이하로 냉각하고 교반하면서 염산을 최종농도 약 0.1N이 되도록 가하고 그후 30분간 반응시킨 다음 2℃이하의 증류수로서 2시간 투석해서 활성화 풀루탄 부분가수분해물 용액을 수득하였다. 이 활성화 풀루란 부분가수분해물 용액에 (1)의 방법으로 제조한 림파아구 단백질 2g을 70m
Figure kpo00012
수용액으로 만들어 첨가하고 탄산나트륨 수용액으로 pH 8.5, 온도 4℃로 유지하고, 교반하면서 2시간 결합반응시킨후 실시예 1(2)와 동일하게 정제, 농축하여서 인체 림파하구 단백질-부분가수분해 풀루란 결합물을 채취하였다.
수율은 사용한 단백질에 대해 약 40%이었다.
(3) 항인체 림파아구 항체의 제조
(2)의 방법으로 수득한 인체 림파아구 단백질-부분가수분해 풀루란 결합물 용액을 완전 프러인드-아쥬반트 유화액으로 만들고, 이 유화액 0.2m
Figure kpo00013
(단백질로서 20μg를 함유함)를 마우스 피하에 주사한 후, 실시예 1(3)과 동일하게 처리해서 수득된 혈청을 염석, 투석, 친화성 크로마토그래피, 투석 및 동결 건조해서 항인체 림파아구 항체를 제조하였다.
대조용으로 (1)에서 수득한 인체 림파아구 단백질을 마우스에 대하여 동일하게 주사해서 수득된 혈청으로 부터 항인체 림파아구 항체를 채취하였다.
본 발명의 항인체 림파아구 항체는 마우스당 면역 글로불린 G를 대조항체의 약 24배량 함유하고 면역 글로불린 E를 거의 함유하고 있지 않았다. 또 대조 항체로는 면역 글로불린 G 이외에 면역 글로불린 E가 다량으로 함유되어 있었다.
본 발명의 항인체 림파아구 항체는 인체유래의 림파아구 뿐만 아니라 인체 말초혈 림파아구 까지도 같은 정도로 면역 반응을 나타내기 때문에 인체의 장기이식, 피부이식 등을 함에 있어서 면역억제제로서 유리하게 사용될 수가 있다.
[실시예 4] 항인체 융모성성선(絨毛性性腺) 자극 호르몬 항체의 제조
(1) 인체 융모성성선 자극 호르몬의 제조
사용한 인체 융모성성선 자극 호르몬(이하 HCG 라고 약칭한다. Calbiochem사 제품)은 비(比)활성 약 11,500 국제단위/mg를 갖고 있다.
(2) HCG -엘시난 결합물의 제조
엘시난(평균 분자량 약 200,000) 10g을 200m
Figure kpo00014
증류수 중에 가온하면서 용해한 다음에 실온까지 냉각하고 여기에 헥사메틸렌디아민 5g을 첨가한후 1N-수산화나트륨 용액으로 pH를 11.0으로 하였다. 이를 얼음욕 중에서 20℃이하로 유지함과 동시에 pH를 유지하여 브롬시안 5g을 첨가하고 교반하면서 30분간 활성화 반응시키며 계속하여 4℃의 증류수로 1시간 동안 투석해서 활성화 엘시난 용액으로 수득하였다.
이 활성화 엘시난 용액에 25w/v%글루타르알데히드 ; 수용액 2m
Figure kpo00015
와 (1)에서 언급한 HCG 10mg을 첨가해서 전체 용량을 20m
Figure kpo00016
로 하고 여기에 다시 1M 아세테이트 완충액(pH 5.0)을 10m
Figure kpo00017
첨가하고 4℃에서 24시간 교반하면서 결합반응시킨 다음 글리신을 농도가 1M가 되도록 첨가하고 실온에서 24시간 보관한후 다시 원심분리하여 상층액을 실시예 1 (2)와 동일하게 정제, 농축하므로서 HCG-엘시난 결합물을 채취하였다.
수율은 사용한 단백질당 약 60%이었다.
(3) 항인체 HCG 항체의 제조
(2)의 방법으로 수득한 HCG-엘시난 결합물 용액을 식염수를 사용 등장용액으로 만들고, 이 용액 0.2m
Figure kpo00018
(단백질 20μg 함유)을 마우스 정맥에 주사하여 실시예 1(3)과 동일하게 처리하고, 수득된 혈청을 염석 투석, 친화성 크로마토그래피, 투석, 동결 건조의 순으로 처리해서 항인체 HCG항체를 채취하였다. 대조용으로 (1)에서 기술된 HCG를 마우스에 대해 동일하게 주사하고 수득된 혈청으로 부터 항인체 HCG항체를 채취하였다.
본 발명의 항인체 HCG항체는 마우스당 면역 글로불린 G를 대조항체의 약 20배량 함유하고 면역 글로불린 E는 거의 함유하고 있지 않았다. 또 대조용 항체에는 면역 글로불린 G 이외에 면역 글로불린 E가 다량으로 함유하고 있었다.
본 발명 항인체 HCG 항체는 뇨중 HCG함량 측정용 임상시약으로서 아주 바람직하다.
[실시예 5] 항인체 인타페론 항체의 제조
(1) 인체 인타페론의 제조
인체 인타페론은 실시예 1(1)의 방법으로 제조한 것을 사용하였다.
(2) 인체 인타페론-텍스트란 결합물의 제조
풀루란을 테스트란(평균 분자량 약 70,000)으로 바꾼 것 이외에는 실시예 1 (2)에서와 동일하게 결합반응시키고, 이를 정제하여 인체 인타페론-텍스트란 결합물을 채취하였다.
수율은 사용한 단백질에 대해 약 40%이었다.
(3) 항인체 인타페론 항체의 제조
(2)의 방법으로 수득한 인체 인타페론-텍스트란 결합물 용액을 식염수를 사용 등장용액으로 만들고 이 용액을 실시예 4(3)과 동일하게 마우스에 주사한 후 수득된 혈청으로부터 항인체 인타페론 항체를 채취하였다. 대조용으로 (1)의 인타페론을 마우스에 동일하게 주사하고 수득된 혈청으로 부터 항인체 인타페론 항체를 채취하였다.
본 발명의 항인체 인타페론 항체는 마우스당 면역 글로불린 G를 대조용 항체의 약 12배량 함유하고 면역 글로불린 E는 거의 함유하고 있지 않았다. 또 대조용 항체에는 면역 글로불린 G 이외에, 면역 글로불린 E가 다량 함유하고 있었다.
본 발명의 항인체 인타페론 항체는 친화성 크로마토그래피의 담체 재료용으로서 바람직하게 사용된다.
[실시예 6] 항인체 림파아구 항체의 제조
실시예 3에 기재하는 방법에서 림파아구 단백질-부분가수분해 풀루란 결합물을 사용하여 마우스의 항체 산생능을 갖고 있는 세포의 높은 항인체 림파아구 항체를 유도시켜서 이 마우스로 부터 비장을 끄집어내 세절 분산시켜서 얻은 비장세포와 마우스 골수종세포 MPC-11(ATCC CCL-167)을 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM KCl, 1mM NaH2PO4, 2mM CaCl2를 함유하는 염류용액에 각각 104/m
Figure kpo00019
가 되도록 부유시키고 여기에 미리 자외선으로 불활성시킨 센다이비루스를 함유하는 전술한 염류용액을 빙냉하에 혼합하고 약 5분 후에 37℃항온수조로 옮겨서 약 30분간 서서히 교반하여 세포융합을 진행시켰다.
이 융합세포를 마우스 복강내에 1마리당 약 106개씩 이식하여 2주간 사육한 후 이것을 도살해서 수득된 복수, 혈액등의 체액을 수집해서 실시예 3(3)의 방법에 따라 정제하고 동결 건조하여 항인체 림파아구 항체를 채취하였다. 대조용으로 실시예 3의 대조용의 경우와 동일하게 림파아구 단백질을 사용해서 림파아구 항체를 유도시키고 그 마우스로 부터 전술한 바와 같이 비장세포를 조제하여 융합세포를 수득하고, 이 융합세포를 이식하여 수득되는 체액으로 부터 항인체 림파아구 항체를 채취하였다.
본 발명의 항인체 림파아구 항체는 마우스당 면역 글로불린 G를 대조용 항체와 약 570배를 함유하고 면역 글로불린 E는 전혀 함유하고 있지 않았다. 또 대조용 항체에는 면역 글로불린 G 이외에도 면역 글로불린 E를 다량 함유하고 있었다.
[실시예 7] 항인체 HCG 항체의 제조
실시예 4에 기재하는 방법으로, HCG-엘시난 결합물을 사용하여 마우스의 항체 산생능을 갖는 세포에 높은 HCG항체를 유도시키고 그 마우스로 부터 비장을 끄집어내어 세절 분산시켜서 수득되는 비장세포와 마우스 골수종세포 P3-X63-Ag8(Flow Laboratories사 제품)을 혈청 무함유 Eagle의 최소 기본배지로서 조정한 50w/v% 폭리에틸렌글리콜-1000용액(pH7.2, 온도 4℃)에 각각 104/m
Figure kpo00020
가 되도록 부유시켜서 5분간 보관시킨후 전술한 기본배지로서 20배 희석하고 또 이어 Davison 등이 Somatic Cell Genetics Vol. 2, 175-176(1976년)에 보고하고 있는 방법에 준하여 하이포크산틴(Hypoxanthine)-아미노푸레틴(Aminopterin)-티미딘(Thymidine) 배양액으로 증식할 수 있는 융합세포를 선택하였다.
이 융합세포를 마우스의 피하에 이식하고 실시예 6과 동일하게 사육하여 도달시킨 후 그 체액을 채취하고 실시예 4(3)의 방법으로 정제한후 동결 건조해서 항인체 HCG항체를 채취하였다. 대조용으로 실시예 4의 대조용의 경우와 동일하게 HCG를 사용해서 항인체 HCG 항체를 유도시켜서 그 마우스로 부터 전술한 바와 같이 비장세포를 조정해서 융합세포를 수득하고 이 융합세포를 이식해서 수득되는 체액으로 부터 항인체 HCG 항체를 채취하였다.
본 발명의 항인체 HCG 항체는 마우스당 면역 글로불린 G를 대조용 항체의 약 440배를 포함하고 면역 글로불린 E는 전혀 함유하고 있지 않았다. 또 대조용 항체에는 면역 글로불린 G 이외에 면역 글로불린 E가 다량으로 함유되어 있었다.
[실시예 8] 항인체 인타페론 항체의 제조
실시예 5에 기재하는 방법으로 인타페론-텍스트란 결합물을 사용해서 마우스의 항체 산생능을 갖는 세포에 높은 항 인타페론 항체를 유도시켜서 그 마우스로 부터 비장을 끄집어내어 세절 분산시켜서 수득된 비장세포와 마우스 다발성 골수종(multiple myeloma) 세포 MOPC-31-C(ATCC CCL-130)를 실시예 7에 기재하는 방법으로 융합시켰다.
이 융합세포를 마우스의 복강내에 1마리당 5×105개 이식하고 2주간 사육해서 증식세포를 복강내로 부터 채취하고 이것을 Eagle의 최소기본배지(pH 7.2 온도 37℃)에 5×106/m
Figure kpo00021
가 되도록 부유시켜 5v/v% 탄산가스 부화기 중에서 2일간 배양하여 원심분리하고 수득된 상층액을 황산암모늄을 사용해서 염석하여 포화도 30-50%의 침전분획을 수집한후 투석, 정밀여과한 다음 동결 건조하여 항인체 인타페론 항체를 채취하였다.
본 발명의 항인체 인타페론 항체는 마우스당 면역 글로불린 G를 대조용 항체의 약 160배를 함유하고 면역글로불린 E는 전혀 함유하고 있지 않았다. 또 대조용 항체에는 면역 글로불린 G 이외엔 면역 글로불린 E가 대량 함유되어 있었다.

Claims (7)

  1. 인체 단백질과 당류를 공유결합시켜 생성되는 인체 단백질-당류 결합물을 사람이외의 온혈동물에 주입해서 항체 산생능을 갖고 있는 세포에 항인체 단백질 항체산생을 유도시키고 수득된 항인체 단백질항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 항인체 단백질 항체의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서 당류를 텍스트란, 플루란, 엘시난 및 이들의 부분가수분해물로 구성되는 군으로 부터 선정하는 항인체 단백질항체의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 당류의 평균분자량의 범위가 1,000-10,000,000인 항인체 단백질 항체의 제조방법
  4. 제 1 항에 있어서, 항인체 단백질 항체가 항인체 인타페론 항체, 항인체 우로키나아제 항체, 항인체 림파아구 항체 또는 항인체 융모성성선 자극호르몬 항체인 항인체 단백질 항체의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 인간 이외의 온혈동물이 쥐, 햄스터 또는 마우스인 항인체 단백질 항체의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 항체 산생능을 갖고 있는 인간 이외의 온혈동물세포가 인간이외의 온혈동물인 마우스 비장세포와 마우스 골수종세포를 세포융합시켜 수득되는 융합세포인 항인체 단백질 항체의 제조방법.
  7. 제 7 항에 있어서, 마우스 골수종세포가 MPC-11, R3-X63-Ag8 또는 MOPC-31-C 인 항인체 단백질항체의 제조방법.
KR8200111A 1981-02-06 1982-01-13 항인체단백질 항체(抗人體蛋白質抗體)의 제조방법 KR870002162B1 (ko)

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