KR20240125077A - 헥소스의 효소적 제조 - Google Patents

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다니엘 조셉 위첼렉키
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Abstract

본 명세서는 효소적 방법을 통해서 사카라이드로부터 헥소스를 제조하는 방법을 개시한다. 방법은 프룩토스 6-포스페이트 및 이를 헥소스로 전환시키기 위한 적어도 하나의 효소적 단계를 이용한다.

Description

헥소스의 효소적 제조{ENZYMATIC PRODUCTION OF HEXOSES}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2017년 3월 13일 출원된 미국 가출원 제62/470,605호, 2017년 3월 13일 출원된 미국 가출원 제62/470,620호, 2017년 4월 5일 출원된 미국 가출원 제62/482,148호, 및 2017년 4월 3일 출원된 미국 가출원 제62/480,798호에 대한 우선권을 청구하고, 이들은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 헥소스 모노사카라이드의 제조에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 프룩토스 6-포스페이트를 하나 이상의 효소적 단계를 통해 헥소스로 전환시키는 단계를 포함하는 사카라이드 (예를 들어, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드, 수크로스, D-글루코스, 및 D-프룩토스)로부터 D-헥소스 (또는 헥소스)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
헥소스는 6개 탄소 원자를 갖는 모노사카라이드이다. 헥소스는 작용기에 의해서, 위치 1에 알데히드를 갖는 알도헥소스, 및 위치 2에 케톤을 갖는 케토헥소스로 분류될 수 있다. 알도헥소스 (또는 알도스)는 알로스, 알트로스, 글루코스, 굴로스, 갈락토스, 이도스, 탈로스, 및 만노스를 포함한다. 케토헥소스 (또는 케토스)는 프시코스 (알룰로스), 프룩토스, 타가토스, 및 솔보스를 포함한다. 이들 알도헥소스 및 케토헥소스의 다양한 측면은 하기의 단락에서 언급된다.
예를 들어, D-알로스 (이하 알로스)는 저칼로리의 천연 감미제로서, ∼80% 수크로스 감미제를 가지는 무칼로리 감미제 및 증량제로서 기술된다. 오직 소량으로 특별한 관목 및 조류에 존재하는 것이 천연 발생 모노사카라이드 헥소스이다. 알로스는 한랭보호성, 항산화성, 항고혈압성, 면역억제성, 항염증성, 항종양성, 및 항암성 활성을 포함한 몇몇 잠재적인 의학적 및 농업적 이득을 갖고있다. 또한 식품 및 음료에서 수크로스와 유사한 기능성을 갖는다. 이와 같이, 알로스는 분명하게 식품 및 음료 산업에서 다양한 용도를 갖는다. 그러나, 알로스의 높은 판매 가격으로 인해, 감미제로서 이의 사용은 제한적이었다.
현재 알로스는 D-프시코스의 효소적 이성질체화를 통해서 주로 생산된다 (WO 2014069537). 전체적으로, 이 방법은 높은 원료 비용, D-프시코스로부터 알로스 분리의 높은 비용, 및 비교적 낮은 생성물 수율 (∼23%)로 인해 손해를 겪는다.
알트로스는 다른 비천연 알도헥소스이고 만노스의 C-3 에피머이다. D-알트로스 ((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타히드록시헥사날)는 알도스 이소머라제 예컨대 칼디셀룰로시럽토르 사카롤리티커스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래 L-푸코스 이소머라제 및 바실러스 팔리더스 (Bacillus pallidus) (비. 팔리더스 (B. pallidus)) 및 클렙시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae) 유래 d-아라비노스 이소머라제 (d-AI)를 동정하고, 구별하고 특징규명하기 위한 기질로서 사용될 수 있다. 최근에, 당 사슬 예컨대 생리적활성 물질로서 유용한 기능을 수행하는, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드는 정밀 화학품 예컨대 의약 및 농업 화학물 분야에서 주의를 끌고 있다. 현재, 당 사슬에 대한 연구 대상은 D-글루코스, D-만노스 및 D-갈락토스와 같이, 연구자들이 쉽게 입수가능하고 대량으로 자연에 존재하는 모노사카라이드로 이루어진 것들에 국한된다. 그러나, 자연계에 존재하는 것 이외에 다양한 모노사카라이드가 보다 유용한 기능을 수행하는 당 사슬의 합성에 대한 향후 연구에서 필요하게 될 것으로 기대된다. 이러한 상황 하에서, 수득이 어려운 희귀 당인 D-알트로스를 처리 단계 수를 감소시키면서, 고수율로, 제조할 수 있는 방법을 개발하는 것이 매우 중요하고 필수적이다. 미국 특허 제5,410,038호.
D-굴로스는 예를 들어, 부형제, 킬레이트화제, 약학 중간체, 유리 및 금속용 세정제, 식품 첨가제, 및 세제용 첨가제로서 유용하다. 미국 특허 제5,215,591호.
D-갈락토스 (이하 갈락토스)는 ∼33%의 수크로스 단맛을 갖는 천연 감미제이고 영양성 감미제로서 기술된다. 이것은 유제품, 콩류, 곡물, 견과류, 덩이줄기 및 채소류에 존재하는 천연 발생 모노사카라이드 헥소스이다. 갈락토스는 식품의 산미 및 산도를 제한하기 위해 제빵 산업에서 사용된다. 또한, 운동 보충제 산업에서 지구력을 증가시키기 위한 에너지원으로서 사용된다. 제약 산업에서, 몇몇 의약의 중간체이고 또한 단백질 치료제 생물생산의 최적화에서 세포 물질대사 조절인자로서 사용된다. 추가적으로, 갈락토스는 일정 식물 병원체, 예컨대 오이, 당근, 감자 및 토마토에 영향을 미치는 것들에 대한 방지제로서 유효한 것으로 확인되었다. 식이 문제 (예를 들어, 완전 채식주의) 및 건강 문제 (예를 들어, BSE 질환)로 인하여, 갈락토스의 비동물 공급원이 산업계에서는 관심이 있다. 이와 같이, 갈락토스는 분명하게 식품, 음료, 운동, 농업 및 제약 산업에서 다양한 용도를 갖는다. 그러나, 갈락토스의 높은 판매 가격으로 인하여, 이의 사용이 제한적이다.
갈락토스는 락토스의 가수분해를 통해서 주로 생산된다 (WO 2005039299A3). 이 방법은 보다 값비싼 공급 원료 및 갈락토스로부터 글루코스의 값비싼 분리로 인해 덜 바람직하다. 대안적으로, 갈락토스는 식물-기반 생물량의 가수분해를 통해 생산될 수 있다 (WO 2005001145A1). 이 방법은 생물량 가수분해 동안 방출되는 다수의 다른 당류 (예를 들어, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 글루코스, 및 람노스)로부터 갈락토스의 값비싼 분리 및 저수율 (일반적인 생물량 공급원의 건조 질량의 ∼4.6%가 갈락토스임)로 인해 손해를 보고 있다.
이도스는 자연계에 존재하지 않지만, 이의 우론산, 이두론산이 중요하다. 이것은 글리코사미노글리칸인, 헤파란 술페이트 및 더마탄 술페이트의 성분이다. (https://en.wikipedia.org/wiki/idose - accessed 3/7/18).
탈로스는 물에 가용성이고 메탄올에서는 약하게 가용성인 비천연 알도헥소스이다. 이것은 갈락토스의 C-2 에피머 및 만노스의 C-4 에피머이다. 탈로스는 클로스트리디아 (Clostridia)의 리보스-5-포스페이트 이소머라제(들)를 동정하고, 구별하며 특징규명하기 위한 기질로서 사용될 수 있다.
D-만노스 (이하 만노스)는 많은 과일, 채소류, 식물 재료, 및 심지어 인체에 존재하는 약한 단맛의, 천연 발생 모노사카라이드이다. 만노스는 다수의 건강 이득 및 제약 용도를 갖는다. 예를 들어, 만노스는 1b형 탄수화물-결핍 당단백질 증후군, 및 보다 통상적으로 요로 감염증을 치료하는데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 만노스는 검증된 프리바이오틱이고, 혈당 수준을 상승시키지 않고, 항염증성 특성을 보인다. 추가적으로, 돼지의 시체 수득률을 증강시키는 것으로 확인되었고 피부-관리 제품의 보조 보습제로서 광범위하게 사용된다. 이와 같이, 만노스는 제약, 화장품, 음료, 식료품, 낙농, 과자류, 및 가축 산업에서 광범위한 용도를 갖는다. 그러나, 만노스의 높은 판매 가격으로 인해, 일상적인 제품에서 그 사용은 제한적이었다.
만노스는 주로 식물로부터 추출을 통해서 생산된다. 일반적인 방법은 산 가수분해, 열 가수분해, 효소적 가수분해, 미생물 발효 가수분해, 및 이의 혼합물을 포함한다. 덜 일반적인 방법은 화학적 및 생물학적 형질전환을 포함한다. 전체적으로, 이들 방법은 혹독한 조건, 높은 자본 지출, 높은 원료 비용, 이성질체화 반응으로부터 만노스의 값비싼 분리, 및 비교적 낮은 생성물 수율 (15-35%)로 인해 문제가 있다.
D-알룰로스 (D-프시코스로도 알려짐) (이하 프시코스)는 70%의 수크로스 단맛을 갖지만, 오직 10%의 칼로리만을 갖는 저칼로리, 천연 감미제이다. 이것은 오직 소량으로 밀 및 다른 식물에 존재하는 천연 발생 모노사카라이드 헥소스이다. 프시코스는 2012년에 미국 식약청 (FDA)에 의해 식품 첨가제로서 승인되었고, GRAS (generally recognized as safe) (일반적으로 안전하다고 인식)로 표기된다. 그러나, 프시코스의 높은 판매 가격으로 인해, 이의 감미제로서의 사용은 제한적이었다. 프시코스는 수많은 건강 이득을 갖는데, 이것은 저칼로리 (수크로스의 10%)이고, 1의 매우 낮은 당지수를 가지며, 소장에서 완전하게 흡수되지만 대사되지 않고 대신 소변 및 대변으로 분비되고, 알파-아밀라제, 수크라제 및 말타제를 억제하여 혈당을 조절하는데 도움을 주며, 수크로스와 유사한 식품 및 음료에서의 기능성을 갖는다. 이와 같이, 프시코스는 분명하게 식품 및 음료 산업에서 다양한 용도를 갖는다.
현재 프시코스느 프룩토스의 효소적 이성질체화를 통해 주로 생산된다 (WO 2014049373). 전체적으로, 이 방법은 높은 원료 비용, 프룩토스로부터 프시코스의 값비싼 분리, 및 비교적 낮은 생성물 수율을 나타낸다.
프룩토스는 많은 식물에 존재하는 단순 케톤성 모노사카라이드이고, 종종 글루코스와 결합되어 디사카라이드, 수크로스를 형성한다. 상업적으로, 프룩토스는 사탕수수, 사탕무, 및 옥수수로부터 유래된다. 이의 낮은 비용이외에도, 프룩토스가 식품 및 음료에서 상업적으로 사용되는 주된 이유는 이의 상대적으로 높은 단맛이다. 이것은 모든 천연 발생 탄수화물 중 가장 달다. 프룩토스는 또한 글루코스를 프룩토스로 전환시키는 효소로 옥수수 시럽을 처리하여 생성되는, 제조 감미제, 고-프룩토스 옥수수 시럽 (HFCS)에도 존재한다. (https://en.wikipedia.org/wiki/fructose#Physical_and_functional_properties-- accessed 3/7/18).
D-타가토스 (이하 타가토스)는 수크로스의 92% 단맛을 갖지만, 오직 38%의 칼로리만을 갖는 저칼로리, 천연 감미제이다. 이것은 오직 소량으로 과일, 카카오, 및 유제품에 존재하는 천연 발생 모노사카라이드 헥소스이다. 타가토스는 2003년에 미국 식약청 (FDA)에서 식품 첨가제로서 승인되었고 GRAS로 표기된다. 그러나, 타가토스의 높은 판매 가격으로 인해, 이의 감미제로서의 사용은 제한적이었다. 타가토스는 수많은 건강 이득을 갖는데, 이것은 무칼로리원성이고, 저칼로리이며, 3의 매우 낮은 당지수를 갖고, 20%까지 글루코스의 당지수를 약화시키며, 평균 혈당 수준을 저하시킬 수 있고, 고밀도 지단백질 (HDL) 콜레스테롤을 상승시켜 심혈관 질환, 졸중, 및 다른 혈관 질환을 예방하는데 도움을 주는, 검증된 프리바이오틱 및 항산화제이다. Lu et al., Tagatose, a New Antidiabetic and Obesity Control Drug, Diabetes Obes. Metab. 10(2): 109-34 (2008). 이와 같이, 타가토스는 분명하게, 제약, 생물공학, 아카데미, 식품, 음료, 식이 보충재, 및 식료품 산업에서 다양한 용도를 갖는다.
타가토스는 D-글루코스 및 D-갈락토스를 형성하기 위해 산 가수분해 또는 락타제에 의한 락토스의 가수분해를 통해 주로 생산된다 (WO 2011150556, CN 103025894, US 5002612, US 6057135, 및 US 8802843). 그 이후에, D-갈락토스는 알칼리 조건 하에서 수산화칼슘에 의해 화학적으로 또는 pH 중성 조건 하에서 L-아라비노스 이소머라제에 의해 효소적으로 D-타가토스로 이성질체화된다. 최종 생성물은 여과 및 이온 교환 크로마토그래피의 조합에 의해 단리된다. 이러한 과정은 몇몇 탱크 또는 생물반응기에서 수행된다. 전체적으로, 이 방법은 다른 당류(예를 들어, D-글루코스, D-갈락토스, 및 비가수분해된 락토스)의 값비싼 분리 및 낮은 생성물 수율 때문에 불리하다. 미생물 세포 발효를 통한 몇몇 방법이 개발 중에 있지만, 값비싼 공급원료 (예를 들어, 갈락티톨 및 D-프시코스)에 대한 그들의 의존성, 낮은 생성물 수율, 및 값비싼 분리로 인하여 어떠한 것도 실용적인 대안으로서 입증되지 못하였다.
솔보스 ((3R,4S,5R)-1,3,4,5,6-펜타히드록시헥산-2-온)는 수크로스 (설탕)와 균등한 단맛을 갖는 케토헥소스이고, 소량으로 포도에 천연적으로 존재하는 것으로 확인된 식물 대사산물이다. D-솔보스는 슈도모나스 시린지에 pv. 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) 및 랄스토니아 솔라나세아럼 (Ralstonia solanacearum)에 의해 야기되는 식물 질환의 방지제로서 유효한 것으로 확인되었다. 미국 공개 특허 출원 제2016/0037768호.
방법의 적어도 한 단계가 에너지적으로 유리한 화학 반응을 포함하는 상기 기술된 헥소스 예컨대 알도헥소스 및 알도케토스의 고수율 생산을 위한 비용-효율적인 합성 경로를 개발하는 것이 필요하다. 뿐만 아니라, 방법의 단계들이 하나의 탱크 또는 생물반응기에서 수행될 수 있고/있거나 값비싼 분리 단계를 피하거나 또는 제거시킨 제조 방법에 대한 요구가 존재한다. 또한 포스페이트가 재활용될 수 있고/있거나, 그 방법이 포스페이트의 추가 공급원으로서 아데노신 트리포스페이트 (ATP)를 요구하지 않는, 비교적 저농도의 포스페이트에서 수행할 수 있는 헥소스 제조 방법에 대한 요구가 존재한다. 또한 임의의 반응 단계들에서 값비싼 니코틴아미드 아데노신 디뉴클레오티드 (NAD(P)(H)) 조효소의 사용을 요구하지 않는 헥소스 제조 경로에 대한 요구가 존재한다.
본 명세서에 기술된 발명은 일반적으로 효소적 전환에 의해서 사카라이드로부터 헥소스를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 방법으로 제조된 헥소스에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 사카라이드로부터, 알로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 알트로스, 탈로스, 솔보스, 굴로스 및 이도스로부터 선택된 헥소스를 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 이소머라제, 에피머라제, 및 헥소스-특이적 포스파타제 및 이의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 헥소스로 전환시키는 단계를 포함한다.
알로스를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 프시코스 6-포스페이트 3-에피머라제 (P6PE)에 의해 촉매되는 F6P를 프시코스 6-포스페이트 (P6P)로 전환시키는 단계; 알로스 6-포스페이트 이소머라제 (A6PI)에 의해 촉매되는 P6P를 알로스 6-포스페이트 (A6P)로 전환시키는 단계; 및 알로스 6-포스페이트 포스파타제 (A6PP)에 의해 촉매되는 A6P를 알로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
만노스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 만노스 6-포스페이트 이소머라제 (M6PI) 또는 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제 (PGPMI)에 의해 촉매되는 F6P를 만노스 6-포스페이트 (M6P)로 전환시키는 단계; 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제 (M6PP)에 의해 촉매되는 M6P를 만노스로 전환시키는 단계를 포함한다.
갈락토스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE)에 의해 촉매되는 F6P를 타가오스 6-포스페이트 (T6P)로 전환시키는 단계; 갈락토스 6-포스페이트 이소머라제 (Gal6PI)에 의해 촉매되는 T6P를 갈락토스 6-포스페이트 (Gal6P)로 전환시키는 단계; 및 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제 (Gal6PP)에 의해 촉매되는 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
프룩토스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제 (F6PP)에 의해 촉매되는 F6P를 프룩토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
알트로스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; 알트로스 6-포스페이트 이소머라제 (Alt6PI)에 의해 촉매되는 P6P를 알트로스 6-포스페이트 (Alt6P)로 전환시키는 단계; 및 알트로스 6-포스페이트 포스파타제 (Alt6PP)에 의해 촉매되는 생성된 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
탈로스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 탈로스 6-포스페이트 이소머라제 (Tal6PI)에 의해 촉매되는 T6P를 탈로스 6-포스페이트 (Tal6P)로 전환시키는 단계; 및 탈로스 6-포스페이트 포스파타제 (Tal6PP)에 의해 촉매되는 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
솔보스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 솔보스 6-포스페이트 에피머라제 (S6PE)에 의해 촉매되는 T6P를 솔보스 6-포스페이트 (S6P)로 전환시키는 단계; 및 솔보스 6-포스페이트 포스파타제 (S6PP)에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계를 포함한다.
굴로스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 굴로스 6-포스페이트 이소머라제 (Gul6PI)에 의해 촉매되는 S6P를 굴로스 6-포스페이트 (Gul6P)로 전환시키는 단계; 및 굴로스 6-포스페이트 포스파타제 (Gul6PP)에 의해 촉매되는 Gul6P를 굴로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
굴로스의 제조를 위한 본 발명의 방법은 F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 솔보스 6-포스페이트 에피머라제 (S6PE)에 의해 촉매되는 T6P를 솔보스 6-포스페이트 (S6P)로 전환시키는 단계; 이도스 6-포스페이트 이소머라제 (I6PI)에 의해 촉매되는 S6P를 이도스 6-포스페이트 (I6P)로 전환시키는 단계; 및 이도스 6-포스페이트 포스파타제 (I6PP)에 의해 촉매되는 I6P를 이도스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 헥소스의 제조 방법은 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 전환시키는 단계를 포함할 수 있고, 이 단계는 포스포글루코스 이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 이 방법은 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 또한 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 추가로, 본 발명에 따른 방법은 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있고, 이 단계는 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되고, 사카라이드는 전분 또는 이의 유도체, 셀룰로스 또는 이의 유도체, 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법에서 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계에서 사용되는 효소 또는 효소들은 알파-글루칸 포스포릴라제 (αGP), 말토스 포스포릴라제, 수크로스 포스포릴라제, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 셀로비오스 포스포릴라제, 및/또는 셀룰로스 포스포릴라제, 및 이의 혼합물일 수 있다. 사카라이드가 전분 또는 전분 유도체일 때, 유도체는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 및 글루코스, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 일부 방법은 전분을 전분 유도체로 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 전분 유도체는 전분의 효소적 가수분해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 제조된다. 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)가 방법에 첨가될 수 있다. 4GT는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스 및 말토트리오스를 재활용하여 헥소수 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
방법이 전분 유도체를 사용하는 경우에, 전분 유도체는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 알파-아밀라제, 또는 그들 조합에 의해 촉매되는 전분의 효소적 가수분해에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계로서, 이 단계는 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 것인 단계, 및 임의로, 수크로스를 프룩토스로 전환시키는 단계로서, 이 단계는 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 것인 단계를 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따라서 헥소스를 제조하는 방법은 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계로서, 이 단계는 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 것인 단계, 및 임의로, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 수크로스를 글루코스로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 각각의 헥소스 합성 방법의 단계들은 약 40℃ 내지 약 90℃ 범위의 온도 및 약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH에서 수행될 수 있다. 그들은 약 8시간 내지 약 48시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계들은 단일 반응생물기에서 수행될 수 있다. 또한 단계들은 직렬로 배열된 다수의 생물반응기에서 수행될 수 있다.
본 발명의 효소적 방법 단계들은 ATP-무함유 및/또는 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 단계들은 약 0.1 mM 내지 약 150 mM 범위의 포스페이트 농도에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 인산화 및 탈인산화 단계에서 사용되는 포스페이트는 재활용될 수 있다. 방법의 적어도 하나의 단계는 에너지적으로 유리한 화학 반응을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이들 방법으로 생산된 알로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 알트로스, 탈로스, 솔보스, 굴로스 및 이도스에 관한 것이다.
도 1은 전분 또는 이의 유도 생성물을 알로스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; P6PE, 프시코스 6-포스페이트 3-에피머라제; A6PI, 알로스 6-포스페이트 이소머라제; A6PP, 알로스 6-포스페이트 포스파타제.
도 2는 전분 또는 이의 유도 생성물을 만노스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; PGPMI, 이기능성 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제; M6PI, 만노스 6-포스페이트 이소머라제; M6PP, 만노스 6-포스페이트 포스파타제.
도 3은 전분 또는 이의 유도 생성물을 갈락토스로 전환시키는 효소 경로를 도시하는 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프룩토스 6-포스페이트 이소머라제; Gal6PI, 갈락토스 6-포스페이트 이소머라제; Gal6PP, 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 4는 전분 또는 이의 유도 생성물을 갈락토스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PP, 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 5는 수크로스를 프룩토스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: SP, 수크로스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PP, 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 6은 전분 또는 이의 유도 생성물을 알트로스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; P6PE, 프시코스 6-포스페이트 에피머라제; Alt6PI, 알트로스 6-포스페이트 이소머라제; Alt6PP, 알트로스 6-포스페이트 포스파타제.
도 7은 전분 또는 이의 유도 생성물을 탈로스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프룩토스 6-포스페이트 에피머라제; Tal6PI, 탈로스 6-포스페이트 이소머라제; Tal6PP, 탈로스 6-포스페이트 포스파타제.
도 8은 전분 또는 이의 유도 생성물을 솔보스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프룩토스 6-포스페이트 에피머라제; S6PE, 솔보스 6-포스페이트 에피머라제; S6PP, 솔보스 6-포스페이트 포스파타제.
도 9는 전분 또는 이의 유도 생성물을 굴로스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프룩토스 6-포스페이트 에피머라제; S6PE, 솔보스 6-포스페이트 에피머라제; Gul6PI, 굴로스 6-포스페이트 이소머라제; Gul6PP, 굴로스 6-포스페이트 포스파타제.
도 10은 전분 또는 이의 유도 생성물을 이도스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한 계통도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀룰라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; MP, 말토스 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프룩토스 6-포스페이트 에피머라제; S6PE, 솔보스 6-포스페이트 에피머라제; l6PI, 이도스 6-포스페이트 이소머라제; l6PP, 이도스 6-포스페이트 포스파타제.
도 11은 글루코스 1-포스페이트에서 다른 헥소스로의 전환을 위한 형성 깁스 에너지를 기반으로 중간체 사이의 반응 깁스 에너지를 도시한다.
본 명세서에 기술된 발명은 생성물 분리 비용 및 헥소스 생성 비용을 상당히 감소시키면서, 높은 생성물 수율로 헥소스를 합성하기 위한 효소적 경로, 또는 방법을 제공한다. 또한 본 명세서는 이들 방법으로 제조된 헥소스를 기술한다.
사카라이드로부터 헥소스를 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 헥소스로 전환시키는 단계를 포함하고, 여기서 헥소스는 알로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 알트로스, 탈로스, 솔보스, 굴로스 및 이도스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 효소는 이소머라제, 에피머라제, 및 헥소스-특이적 포스파타제, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계는 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
탈인산화 단계 동안 생성된 포스페이트 이온이 이후에 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계, 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하여서, 반응 포스페이트 농도가 낮게 유지되게 한다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 헥소스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 각 방법에서 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 각 방법에서 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
낮은 포스페이트 농도는 그 결과로 낮은 총 포스페이트 덕분에 제조 비용을 감소시키고 그에 따라 포스페이트 제거 비용이 절감된다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 포스파타제의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 각각의 방법은 포스페이트의 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉, ATP-무함유로 수행될 수 있다. 각각의 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 헥소스를 제조하기 위한 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 화학 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
사카라이드를 G1P로 전환시키는데 사용되는 효소의 예는 알파-글루칸 포스포릴라제 (αGP, EC 2.4.1.1), 말토스 포스포릴라제 (MP, EC 2.4.1.8), 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP, EC 2.4.1.49), 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP, EC 2.4.1.20), 셀룰로스 포스포릴라제, 수크로스 포스포릴라제 (SP, EC 2.4.1.7), 및 이의 조합을 포함한다. 효소 또는 효소 조합의 선택은 방법에서 사용되는 사카라이드에 따라 좌우된다.
G1P를 발생시키는데 사용되는 사카라이드는 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 및/또는 디사카라이드일 수 있다. 예를 들어, 사카라이드는 전분, 전분의 하나 이상의 유도체, 셀룰로스, 셀룰로스의 하나 이상의 유도체, 수크로스, 수크로스의 하나 이상의 유도체, 또는 이의 조합일 수 있다.
전분은 자연계에서 가장 널리 사용되는 에너지 저장 화합물이고 주로 식물 종자에 저장된다. 천연 전분은 선형 아밀로스 및 분지형 아밀로펙틴을 함유한다. 전분 유도체의 예는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 프룩토스, 및 글루코스를 포함한다. 셀룰로스 유도체의 예는 전처리 생물량, 재생 비정질 셀룰로스, 셀로덱스트린, 셀로비오스, 프룩토스, 및 글루코스를 포함한다. 수크로스 유도체는 프룩토스 및 글루코스를 포함한다.
전분 및 이의 유도체, 셀룰로스 및 이의 유도체, 및 수크로스 및 이의 유도체로부터 F6P를 제조하는 방법은 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2017/059278에서 확인할 수 있다.
전분의 유도체는 전분의 효소적 가수분해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 특히, 전분의 효소적 가수분해는 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 이소아밀라제 (IA, EC. 3.2.1.68); α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 풀룰라나제 (PA, EC. 3.2.1.41); 짧은 말토올리고사카라이드의 트랜스글리코실화를 촉매하여 보다 긴 말토올리고사카라이드를 생성하는 4-α-글루카노트랜스퍼라제 (4GT, EC. 2.4.1.25); α-1,4-글리코시드 결합을 절단하는 또는 알파-아밀라제 (EC 3.2.1.1)에 의해 촉매될 수 있거나 또는 증강될 수 있다.
뿐만 아니라, 셀룰로스의 유도체는 셀룰라제 혼합물, 산, 또는 생물량의 전처리에 의해 촉매되는 셀룰로스의 효소적 가수분해에 의해 제조될 수 있다.
사카라이드를 G1P로 전환시키는 효소는 αGP를 함유할 수 있다. 이러한 단계에서, 사카라이드가 전분을 포함하는 경우에, G1P는 αGP에 의해 전분으로부터 발생되고; 사카라이드가 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 또는 말토덱스트린을 함유하는 경우에, G1P는 αGP에 의해 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 또는 말토덱스트린으로부터 생성된다.
사카라이드는 말토스를 포함하고 효소는 말토스 포스포릴라제를 함유하며, G1P는 말토스 포스포릴라제에 의해 말토스로부터 발생된다. 사카라이드가 수크로스를 포함하고, 효소가 수크로스 포스포릴라제를 포함하면, G1P는 수크로스 포스포릴라제에 의해 수크로스로부터 발생된다.
사카라이드가 셀로비오스를 포함하고, 효소가 셀로비오스 포스포릴라제를 함유하는 경우에, G1P는 셀로비오스 포스포릴라제에 의해 셀로비오스로부터 생성될 수 있다.
사카라이드가 셀로덱스트린를 함유하고 효소가 셀로덱스트린 포스포릴라제를 포함하는 경우에, G1P는 셀로덱스트린 포스포릴라제에 의해 셀로덱스트린으로부터 발생될 수 있다.
사카라이드를 G1P로 전환시키는 경우에, 사카라이드가 셀룰로스를 포함하고 효소는 셀룰로스 포스포릴라제를 함유할 때, G1P는 셀룰로스 포스포릴라제에 의해 셀룰로스로부터 발생될 수 있다.
본 발명에 따라서, 또한 헥소스는 프룩토스로부터 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
헥소스는 수크로스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 하기의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 포스파타제는 헥소스에 특이적이다. 예를 들어, 알로스 6-포스페이트는 알로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 알로스로 전환되고; 만노스 6-포스페이트는 만노스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 만노스로 전환되고; 갈락토스 6-포스페이트는 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 갈락토스로 전환되고; 프룩토스 6-포스페이트는 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 프룩토스로 전환되고; 알트로스 6-포스페이트는 알트로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 알트로스로 전환되고; 탈로스 6-포스페이트는 탈로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 탈로스로 전환되고; 솔보스 6-포스페이트는 솔보스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 솔보스로 전환되고; 굴로스 6-포스페이트는 굴로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 굴로스로 전환되고; 이도스 6-포스페이트는 이도스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 이도스로 전환된다. 본 명세서에서 사용되는, 특이적은 다른 헥소스에 비해서 표시된 헥소스에 대해 더 높은 비활성을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 알로스 6-포스페이트 포스파타제는 예를 들어 솔보스 6-포스페이트 또는 탈로스 6-포스페이트 보다 알로스 6-포스페이트에 대해 더 높은 비활성을 갖는다.
헥소스 탈인산화 단계 동안 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성하여 헥소스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
헥소스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 G6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다. G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성될 수 있다.
본 발명은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 헥소스로 전환시키기 위한 방법을 제공한다. 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로가 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 헥소스로 전환시키기 위해 제공될 수 있다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소는 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜서, 선형 아밀로덱스트린을 산출시키는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 그 결과로 최종 생성물에서 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 그리하여 알파-아밀라제는 헥소스로 보다 신속한 전환을 위한 단편으로 전분을 분해시키고 가용성을 증강시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 헥소스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단되어 G1P를 산출할 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용하여 헥소스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
추가적으로, 셀룰로스는 가장 풍부한 생물 자원이고 식물 세포벽의 주요 성분이다. 비식품 리그노셀룰로식 생물량은 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 및 리그닌을 비롯하여 다른 소수 성분을 함유한다. 아비셀 (미세결정질 셀룰로스), 재생 비정질 셀룰로스, 박테리아 셀룰로스, 필터지 등을 포함하는 순수 셀룰로스는 일련의 처리를 통해서 제조될 수 있다. 부분 가수분패된 셀룰로식 기질은 그 중합도가 7을 초과하는 수-불용성 셀로덱스트린, 중합도가 3-6인 수용성 셀로덱스트린, 셀로비오스, 글루코스, 및 프룩토스를 포함한다.
셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 헥소스로 전환될 수 있다. 방법은 하기 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 포함한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
몇몇 효소는 고형 셀룰로스를 수용성 셀로덱스트린 및 셀로비오스로 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제를 포함하지만, 베타-글루코시다제 (셀로비아제)는 포함하지 않는다.
셀룰로스 가수분해 및 G1P 발생 전에, 셀룰로스 및 생물량은 그들의 반응성을 증가시키고 셀룰로스 사슬의 중합도를 감소시키기 위해 전처리될 수 있다. 셀룰로스 및 생물량 전처리 방법은 희석 산 전처리, 셀룰로스 용매-기반 리그노셀룰로스 분획화, 암모니아 섬유 팽창, 암모니아 수성 함침, 이온성 액체 처리를 포함하고, 염산, 황산, 인산 및 그들 조합을 포함하는 농축 산을 사용하여 부분 가수분해된다.
폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)는 본 발명에 따른 방법에 첨가될 수 있고, 그리하여 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 헥소스의 수율을 증가시킬 수 있다.
헥소스는 글로코스로부터 발생될 수 있다. 헥소스 제조를 위한 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계 및 PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다.
당분야에 공지된 임의의 적합한 생물학적 상용성 완충제, 예컨대 HEPES, PBS, BIS-TRIS, MOPS, DIPSO, 트리즈마 등이 본 발명의 각 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법을 위한 반응 완충액은 5.0-8.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 보다 바람직하게, 반응 완충액 pH는 약 6.0 내지 약 7.3 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 완충액 pH는 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 또는 7.3일 수 있다.
반응 완충액은 또한 금속 양이온을 함유할 수 있다. 금속 이온의 예는 Mg2+ 및 Zn2+ 를 포함한다. 당분야에 공지된 바와 같이, 적합한 염이 바람직한 금속 양이온을 도입시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 각 방법에서, 방법의 단계들이 수행되는 반응 온도는 37-95℃ 범위일 수 있다. 보다 바람직하게, 단계들은 약 40℃ 내지 약 90℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 온도는 예를 들어 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 또는 약 90℃일 수 있다. 바람직하게, 반응 온도는 약 50℃이다.
각각의 개시된 방법의 반응 시간은 필요에 따라 조정될 수 있고, 약 8시간 내지 약 48시간 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 시간은 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간, 또는 약 48시간일 수 있다. 보다 바람직하게, 반응 시간은 약 24시간이다.
전형적으로, 개시된 각 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1 내지 1:1:1:1:1 이다 (방법의 촉매 단계 수에 따름). 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 그 결과로 하류 반응의 활성이 증가될 것이다. 반대로, 1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 그 결과로 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 야기시킬 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 기술된 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 헥소스 생성의 효율을 증가시키기 위해 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 각각의 방법은 전체 반응에 대한 매우 유리한 평형 상수에 기인하여 높은 수율을 획득할 수 있다. 예를 들어, 도 11은 글루코스 1-포스페이트의 헥소스로의 전환에 대한 형성 깁스 에너지를 기반으로 중간체 간 반응 깁스 에너지를 도시한다. 반응 깁스 에너지는 http://equilibrator.weizmann.ac.il/를 사용하여 발생되었다. 이론적으로, 출발 재료가 완전하게 중간체로 전환되면 최대 99%의 수율을 획득할 수 있다.
본 발명의 방법은 저비용의 출발 재료를 사용하고 원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 헥소스가 락토스로부터 생성될 때, 글루코스 및 다른 헥소스(들)는 크로마토그래피를 통해서 분리되며, 이것은 높은 제조 비용을 초래한다.
또한, 본 발명에 따른 포스파타제에 의한 헥소스 탈인산화 단계는 공급원료와 무관하게, 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 헥소스는 후속 생성물 분리 비용을 효율적으로 최소화시키면서 매우 높은 수율로 생성된다.
본 발명의 일부 양상에서, A6P, M6P, F6P, 또는 Gal6P를 그들의 개별 비인산화 형태로 전환시키기 위한 포스파타제는 2가 금속 보조인자, 바람직하게 마그네슘을 이용한다. 본 발명의 추가 양상에서, 포스파타제는 제한없이 촉매작용을 위한 로스만유사 폴드 (Rossmanoid fold) 도메인을 함유하고; 추가적으로 제한없이 기질 특이성을 위한 C1 또는 C2 캡핑 도메인을 함유하고; 추가적으로 제한없이 제2 Asp가 일반적인 산/염기 촉매인 경우에 마그네슘 배위를 위한 로스만유사 폴드의 제1 β-가닥 내 DxD 서명을 함유하고; 추가적으로 제한없이 반응 중간체의 안정성을 보조하는 로스만유사 폴드의 제2 β-가닥의 말단에 Thr 또는 Ser을 함유하고; 추가적으로 제한없이 반응 중간체의 안정성을 보조하는 로스만유사 폴드의 제3 β-가닥의 C-말단 α-헬릭스의 N-말단에 Lys을 함유하고; 추가적으로 제한없이 마그네슘 배위를 위해 로스만유사 폴드의 제4 β-가닥의 말단에 GDxxxD, GDxxxxD, DD, 또는 ED 서명을 함유한다. 이들 특성은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Burroughs et al., Evolutionary Genomics of the HAD Superfamily: Understanding the Structural Adaptations and Catalytic Diversity in a Superfamily of Phosphoesterases and Allied Enzymes. J. Mol. Biol. 2006; 361; 1003-1034]을 참조한다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 헥소스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 종종 세포 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 지연시키는, 세포막의 제거 덕분에 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
알로스
본 발명의 일 실시형태에서, 프시코스 6-포스페이트 3-에피머라제 (P6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 프시코스 6-포스페이트 (P6P)로 전환시키는 단계, 알로스 6-포스페이트 이소머라제 (A6PI)에 의해 촉매되는 P6P를 알로스 6-포스페이트 (A6P)로 전환시키는 단계, 및 알로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 촉매되는 생성된 A6P를 알로스로 전환시키는 단계를 포함하는 알로스를 제조하기 위한 방법이다.
P6PE의 예는 Uniprot ID 번호로 식별되는, 하기 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: D9TQJ4, A0A090IXZ8, 및 P32719. 이들 중에서, Uniprot ID D9TQJ4 및 Uniprot ID A0A090IXZ8은 호열성 유기체로부터 수득된다. Uniprot ID P32719는 중온성 유기체로부터 수득된다. Uniprot ID P32719는 Uniprot ID A0A090IXZ8과 53%가 동일하고 D9TQJ4와 55%가 동일하며, 각각의 단백질은 F6P의 A6P로의 에피머화를 촉매한다. 뿐만 아니라, Uniprot ID A0A090IXZ8은 D9TQJ4와 45%가 동일하다. 반대로, 45% 이하의 Uniprot ID D9TQJ4와의 동일성 정도를 갖는, Uniprot ID 번호: A0A101D823, R1AXD6, A0A150LBU8, A0A023CQG9, 및 H1XWY2로 식별되는 다른 에피머라제 단백질은 F6P의 A6P로의 에피머화를 촉매하지 않는다. P6PE의 예는 또한 상기 언급된 Uniprot ID 중 어느 하나와 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
A6PI의 실시예는 제한없이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID W4V2C8; 및 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID Q67LX4를 포함한다. Uniprot ID W4V2C8 및 Q67LX4 둘 모두는 A6PI 반응을 촉매하고 56%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, 또한 A6PI의 예는 상기 언급된 Uniprot ID 중 어느 하나와 적어도 55%, 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
P6P를 A6P로 전환시키는 방법에서 사용에 적합한 A6PI는 로스만유사 폴드를 함유한다. 당분야에 기술된 중온성 A6PI (Mowbray et al., D-Ribose-5-Phosphate Isomerase B from Escherichia coli is Also a Functional D-Allose-6-Phosphate Isomerase, While the Mycobacterium tuberculosis Enzyme is Not. J. Mol. Biol. 2008; 382; 667-679)는 본 명세서에 개시된 호열성 A6PI와 보존성 잔기를 공유한다. 본 발명의 일부 양상에서, 이소머라제는 제한없이 로스만유사 폴드의 제1 β-가닥의 C-말단에 His (중온성 잔기 10)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 역시 포스페이트 결합을 위해 로스만유사 폴드의 제5 β-가닥의 C-말단 α-헬릭스의 C-말단에 Arg (중온성 잔기 133)을 함유하고; 추가적으로 제한없이 락톤의 고리를 열기 위해 활성 부위 내에 His (중온성 잔기 99)을 함유하고; 추가적으로 제한없이 촉매적 염기로서 작용하도록 활성 부위 내에 Cys (중온성 잔기 66)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 촉매적 산으로서 작용하도록 활성 부위 내에 Thr (중온성 잔기 68)을 함유하고; 추가적으로 제한없이 고에너지 중간체를 안정화시키기 위해 활성 부위 근처에 GTG-소수성-G 모티프 (중온성 잔기 67-71)를 함유하고, 추가적으로 제한없이 역시 고에너지 중간체를 안정화시키기 위해 활성 부위 근처에 Asn (중온성 잔기 100)을 함유한다. 바람직하게, A6PI는 모든 이들 보존성 잔기를 함유한다.
A6PP의 예는 제한없이, 하기의 단백질을 포함한다: 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID S9SDA3; 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID Q9X0Y1; 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID I3VT81; 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID A0A132NF06; 및 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID D1C7G9. Uniprot ID S9SDA3 및 I3VT81은 둘 모두가 A6PP 반응을 촉매하고 30%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, A6PP의 예는 또한 임의의 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 30%, 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
바람직하게, A6P를 알로스로 전환시키기 위한 A6PP는 촉매작용을 위한 로스만유사 폴드 도메인, C1 캡핑 도메인, 로스만유사 폴드의 제1 β-가닥 내에 DxD 서명, 로스만유사 폴드의 제2 β-가닥의 말단에 Thr 또는 Ser, 로스만유사 폴드의 제3 β-가닥의 C-말단 α-헬릭스의 N-말단에 Lys, 및 로스만유사 폴드의 제4 β-가닥의 말단에 ED 서명을 함유한다.
본 발명에 따라 알로스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 알로스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 알로스의 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라서 알로스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어, 하기의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) P6PE를 통해 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; (v) A6PI를 통해 P6P를 A6P로 전환시키는 단계; 및 (vi) A6PP를 통해 A6P를 알로스로 전환시키는 단계. 사카라이드가 전분인 경우의 효소적 방법의 예가 도 1에 도시되어 있다.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:P6PE:A6PI:A6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하기 위해 사용될 수 있고, 그 결과로, 하류 반응의 활성이 증가될 것이다. 반대로, 1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 그 결과로 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단이 일어나게 될 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 알로스 생성 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
A6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계들이 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하여, 반응 포스페이트 농도가 낮게 유지된다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 알로스 제조 방법의 전체 효율을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트에 기인하여 제조 비용을 절감시키고 따라서 포스페이트 제거 비용을 절감시킨다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 A6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트 공급원으로 첨가되는 ATP 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 알로스를 제조하기 위한 개시된 방법의 적어도 하나의 단계는 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
알로스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; A6PI에 의해 촉매되는 P6P를 A6P로 전환시키는 단계, 및 A6PP에 의해 촉매되는 A6P를 알로스로 전환시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 프룩토스는 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
알로스는 또한 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 하기의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; A6PI에 의해 촉매되는 P6P를 A6P로 전환시키는 단계; 및 A6PP에 의해 촉매되는 A6P를 알로스로 전환시키는 단계.
A6P가 알로스로 전환될 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜서 알로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일정한 실시형태에서, 알로스를 제조하기 위한 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
몇몇 효소는 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜, 선형 아밀로덱스트린을 산출시키는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리된 전분은 최종 생성물에서 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단시키며, 그러므로 알파-아밀라제는 알로스로의 보다 빠른 전환 및 증가된 가용성을 위해 전분을 단편으로 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 알로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용함으로써 알로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 알로스로 전환될 수 있다. 방법은 하기 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; A6PI에 의해 촉매되는 P6P를 A6P로 전환시키는 단계; 및 A6PP에 의해 촉매되는 A6P를 알로스로 전환시키는 단계. 이 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
몇몇 효소는 고형 셀룰로스를 수용성 셀로덱스트린 및 셀로비오스로 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제를 포함하지만, 베타-글루코시다제 (셀로비아제)는 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 그에 따라 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 알로스의 수율을 증가시킬 수 있다.
알로스는 글루코스로부터 생성될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; A6PI에 의해 촉매되는 P6P를 A6P로 전환시키는 단계; 및 A6PP에 의해 촉매되는 A6P를 알로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
알로스를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 저비용의 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 프룩토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 알로스가 프시오스로부터 생성될 때, 수율이 본 발명에서 보다 낮아서, 알로스는 크로마토그래피를 통해 프시코스로부터 분리되어야만 하고, 더 높은 제조 비용을 초래하게 된다.
또한, 본 발명에 따라서 A6P를 알로스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 알로스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서, 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 알로스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 종종 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 지연시키는, 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한, 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 알로스를 제조하기 위해 본 명세서에 기술된 방법에 의해 생성된 알로스이다.
알로스가 수크로스와 유사한 기능성이므로, 본 발명의 방법으로 제조된 알로스는 바람직한 단맛을 생성하도록 임의의 음료 또는 식품에 첨가될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법으로 제조된 알로스는 또한 강력한 감미제의 효과를 상승시키는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 강력한 감미제와 조합했을 때, 알로스는 감미된 제품의 감각 특징 예컨대 구강촉감, 풍미 및 뒷맛의 개선을 야기시킬 수 있다. 다양한 식료품에서 강력한 감미제와 같은, 저칼로리 감미제의 사용은 식품 및 음료 배합물에서 일반적이다. 그러나, 많은 소비자들의 경우, 인공적으로 감미된 제품의 다이어트 또는 가벼운 버전으로서 판매되는 제품은 바람직하지 않다. 소량의 탄수화물의 첨가를 통해서 이들 다이어트 또는 가벼운 버전의 맛 전달을 개선시키기 위한 시도가 수년간 이루어지고 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조되는 알로스는 식품 및 음료 배합물, 특히 다이어트/가벼운 음료의 품질을 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이의 사용은 강력한 감미제와 상승적일 수 있어서, 이의 측정된 단맛 한계치 보다 충분히 적은 농도로 첨가한 경우에도, 상당한 양의 강력한 감미제를 대체할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법으로 제조된 알로스는 아이스크림과 같은 식품의 저칼로리 버전의 제조를 위해 다른 감미제, 예컨대 스테비아 레바우디아나 베르토니 (Stevia rebaudiana Bertoni) 유래 추출물과 배합될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법으로 제조된 알로스는 D 알로스가 프로스팅으로서, 부분적으로 또는 전체적으로 수크로스 또는 다른 통용되는 당류를 대체하는, 사전 감미된 조리 완료 상태 (ready to eat: RTE) 아침 시리얼 및 다른 식품에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법으로 제조된 알로스는 당알콜, 예컨대 에리쓰리톨, 및 상당한 칼로리 함량의 영양 감미제, 예컨대 프룩토스, 수크로스, 덱스트로스, 말토스, 트레할로스, 람노스, 옥수수 시럽 및 프룩토-올리고사카라이드와 조합하여 식품 및 음료용 감미제의 일부로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법으로 제조된 알로스는 또한 식물 병해 방제를 증강시키는 조성물의 일부로서 사용될 수 있다.
만노스
본 발명의 일 실시형태는 만노스 6-포스페이트 이소머라제 (M6PI)에 의해 촉매되는 F6P를 만노스 6-포스페이트 (M6P)로 전환시키는 단계; 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제 (M6PP)에 의해 촉매되는 M6P를 만노스로 전환시키는 단계를 포함하는 만노스를 제조하기 위한 방법이다.
M6PI의 예는 제한없이, 하기 단백질을 포함한다: 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는, Uniprot ID A0A1M6TLY7; 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID H1XQS6; 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID G2Q982; 및 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID F8F1Z8. Uniprot ID G2Q982 및 F8F1Z8은 둘 모두가 M6PI 반응을 수행하고 28%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, M6PI의 예는 또한 임의의 상기에 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 바람직하게 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
F6P를 M6P로 전환시키는 방법에서 사용에 적합한 M6PI는 쿠핀 폴드 (cupin 폴드)를 닮은 역평행 β-가닥의 코어를 갖는 2개 도메인 및 오직 α-헬릭스로만 이루어진 제3 도메인을 함유한다. M6PI은 당분야에서 구조적으로 특징규명되었고 (Sagurthi et al. Structures of Mannose-6-phosphate isomerase from Salmonella typhimurium bound to metal atoms and substrate: implications for catalytic mechanism. Acta Cryst. 2009; D65; 724-732) 본 명세서에 기술된 호열성 M6PI와 보존성 잔기를 공유한다. 본 발명의 일부 양상에서, 이소머라제는 제한없이 2가 금속 양이온, 바람직하게 Mg2+ 또는 Zn2+ 를 함유하고; 추가적으로 제한없이 금속 결합에서 사용이 제안된 Glu 및 2개의 His 잔기 (각각 PDB 3H1M 잔기 134, 99, 및 255)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 산/염기 촉매작용에 제안된 Asp 및 Lys 잔기 (각각 PDB 3H1M 잔기 270 및 132)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 포스페이트 결합에 제안된 Lys, Pro, 및 Ala 잔기 (각각 PDB 3H1M 잔기 132, 133, 및 267)를 함유한다. M6PI는 바람직하게 모든 이들 보존성 잔기를 함유한다.
M6PP의 예는 제한없이 하기 단백질을 포함한다: 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID A0A1A6DSI3; 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID A0A1M4UN08; 및 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID A0A1N6FCW3. Uniprot ID A0A1A6DSI3 및 A0A1N6FCW3 둘 모두는 M6PP 반응을 촉매하고 35%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, M6PP의 예는 또한 임의의 상기에 언급된 Uniprot ID와 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
바람직하게, M6P를 만노스로 전환시키기 위한 M6PP는 촉매작용을 위한 로스만유사 폴드 도메인, C1 캡핑 도메인, 로스만유사 폴드의 제1 β-가닥 내에 DxD 서명, 로스만유사 폴드의 제2 β-가닥의 말단에 Thr 또는 Ser, 로스만유사 폴드의 제3 β-가닥의 C-말단 α-헬릭스의 N-말단에 Lys, 및 로스만유사 폴드의 제4 β-가닥의 말단에 GDxxxD 서명을 함유한다.
본 발명에 따라 만노스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 만노스를 제조 하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 여기서 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 추가 실시형태에서, 만노스를 제조하기 위한 방법은 G6P를 F6P로 M6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 이기능성 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제 (PGPMI)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 만노스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
만노스를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 G6P 또는 F6P를 M6P로 전환시키는 PGPMI를 사용한다. PGPMI의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID D7CPH7; 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID A0A085L170; 및 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID M1E6Z3. Uniprot ID A0A085L170 및 M1E6Z3 둘 모두는 PGPMI 반응을 촉매하고 28%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, PGPMI의 예는 또한 임의의 상기에 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 바람직하게 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
G6P 또는 F6P를 M6P로 전환시키는 방법에서 사용에 적합한 PGPMI는 2개의 로스만유사 폴드를 함유한다. PGPMI는 당분야에서 구조적으로 특징규명되었고 (Swan et al. A Novel Phosphoglucose Isomerase (PGI)/Phosphomannose Isomerase from the Crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum Is a Member of the PGI Superfamily. J. Biol. Chem. 2004: 279; 39838-39845), 본 발명에 기술된 호열성 PGPMI와 보존성 잔기를 공유한다. 본 발명의 일부 양상에서, 이소머라제는 제한없이 Gly 잔기가 기질 결합을 보조하고 Ser 잔기는 포스페이트가 결합하는 GGS 모티프 (PDB 1TZB 잔기 46-48)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 포스페이트가 결합하는 SYSG-X-T-X-ET-소수성 모티프 (PDB 1TZB 잔기 87-96)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 촉매작용 동안 고에너지 중간체를 안정화시키는 Arg 잔기 (PDB 1TZB 잔기 135)를 함유하고; 추가적으로 제한없이 Glu가 활성-부위 염기 양성자 이동에 필수적인 EN 서명 (PDB 1TZB 잔기 203-204)을 함유하고; 추가적으로 제한없이 His가 촉매작용 동안 기질의 고리 열림/닫힘에 중요한 HN 서명 (PDB 1TZB 잔기 219-220)을 함유하고; 추가적으로 제한없이 촉매작용 동안 기질의 고리 열림/닫힘에 중요한 보존성 Lys 잔기 (PDB 1TZB 잔기 298)를 함유한다. 보존성 잔기의 기능은 개별 출판물에서 검증되었다 (Hansen et al. Bifunctional Phosphoglucose/Phosphomannose Isomerases from the Archaea Aeropyrum pernix and Thermoplasma acidophilum Constitute a Novel Enzyme Family within the Phosphoglucose Isomerase Superfamily. J Biol. Chem. 2004; 279; 2262-2272). PGPMI는 바람직하게 모든 이들 보존성 잔기를 함유한다.
그러므로, 본 발명에 따라 만노스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어, 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) 만노스 6-포스페이트 이소머라제 (M6PI, EC 5.3.1.8)를 통해 F6P를 M6P로 전환시키는 단계; (v) 이기능성 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제 (PGPMI, EC 5.3.1.8 및 5.3.1.9)를 통해 G6P를 M6P로 전환시키는 단계; 및 (vi) M6PP를 통해 M6P를 만노스로 전환시키는 단계. 사카라이드가 전분인 방법의 예가 도 2에 도시되어 있다.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:M6PI:M6PP) 또는 1:1:1:1 (αGP:PGM:PGPMI:M6PP)이다. 생성물 수율을 최적화시키기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최적화하는데 사용될 수 있고, 그 결과로 하류 반응의 활성이 증가될 것이다. 반대로, 1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강건한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 그 결과로 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단이 일어나게 될 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함한, 효소 비율은 만노스 생성 효율을 증가시키기 위해 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계들이 단일 반응생성기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계들은 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
M6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양으로 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고, 만노스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트에 기인하여 제조 비용을 절감시키고 따라서 포스페이트 제거 비용을 절감시킨다. 또한 유리 포스페이트의 높은 농도로 인한 M6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트의 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉, ATP-무함유로 수행될 수 있다. 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉, NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 만도스를 제조 하기 위해 개시된 방법의 적어도 하나의 단계는 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
만노스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; M6PI에 의해 촉매되는 F6P를 M6P로 전환시키는 단계; 및 M6PP에 의해 촉매되는 M6P를 만노스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환을 통해 생성될 수 있다.
만노스는 또한 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 하기의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; M6PI에 의해 촉매되는 F6P를 M6P로 전환시키는 단계; 및 M6PP에 의해 촉매되는 M6P를 만노스로 전환시키는 단계. 상기 단계들에서, G6P의 F6P로 M6P로의 전환은 대안적으로 PGPMI에 의해 촉매될 수 있다.
M6P가 만노스로 전환될 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 만노스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 만노스를 제조하기 위한 방법은 하기의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 만노스로 전환시키기 위한 방법을 제공한다. 일정한 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로는 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 만노스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소는 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해하는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 함유한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜 선형 아밀로덱스트린을 산출하는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단시켜서, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 따라서, 알파-아밀라제는 만노스로의 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 만노스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는, 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용하여 만노스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 만노스로 전환될 수 있다. 방법은 하기 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; M6PI에 의해 촉매되는 F6P를 M6P로 전환시키는 단계; 및 M6PP에 의해 촉매되는 M6P를 만노스로 전환시키는 단계. 대안적으로, 이전 경로에서, G6P의 F6P로 M6P로의 전환은 PGPMI에 의해 전환될 수 있다. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 만노스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 만노스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; M6PI에 의해 촉매되는 F6P를 M6P로 전환시키는 단계; 및 M6PP에 의해 촉매되는 M6P를 만노스로 전환시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, G6P의 F6P로 M6P로의 전환은 PGPMI에 의해 촉매될 수 있다.
본 발명의 방법은 저비용의 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감시킨다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 프룩토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 만노스가 프룩토스로부터 생성될 때, 수율은 본 발명보다 낮고, 만노스가 크로마토그래피를 통해 프룩토스로부터 분리되어야만 하므로, 더 높은 제조 비용을 초래한다.
또한, 본 발명에 따라 M6P를 만노스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게, 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 만노스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 만노스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는, 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정 실시형태는 만노스를 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 방법으로 생성된 만노스이다.
본 명세서에 기술된 방법으로 제조된 만노스는 상기에 논의된 바와 같이, 제약, 화장품, 음료, 식료품, 유제품, 과자류 및 가축 산업에서 다양한 용도로 사용될 수 있다.
추가적으로, 본 명세서에 개시된 방법으로 생성된 만노스는 수소첨가를 통해서 만니톨로 전환될 수 있다. 만노스의 촉매적 수소첨가는 화학양론적 수율로 발생되고 만니톨을 제공한다. 미국 특허 제5,466,795호. 만니톨은 무설탕 츄잉검, 스위츠 및 약학 부형제의 제조에서 광범위하게 사용된다. 그러나, 고순도 만노스의 생성은 획득하기가 극도로 어렵고 비싸다. 위와 동일하게, 따라서, 상기 언급된 방법으로 제조된 만노스는 촉매적 수소첨가를 통해서 만니톨로 전환될 수 있다.
갈락토스
본 발명의 일 실시형태는 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 타가토스 6-포스페이트 (T6P)로 전환시키는 단계, 갈락토스 6-포스페이트 이소머라제 (Gal6PI)에 의해 촉매되는 T6P를 갈락토스 6-포스페이트 (Gal6P)로 전환시키는 단계, 및 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제 (Gal6PP)에 의해 생성된 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계를 포함하는 갈락토스를 제조하기 위한 방법이다.
F6PE의 예는 제한없이, 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID E8N0N6, E4SEH3, I0I507, H1XRG1, 및 B5YBD7. Uniprot ID E8N0N6 및 I0I507은 둘 모두가 F6PE 반응을 촉매하고 27%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, F6PE의 예는 또한 상기 언급된 임의의 Uniprot ID와 적어도 25%, 바람직하게 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
Gal6PI는 2개 서브유닛 LacA 및 LacB의 다량체로서 존재한다. Gal6PI의 예는 제한없이 다음의 단백질 (LacA/LacB) 서브유닛 쌍을 포함한다: 서열번호 18/서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID P23494/P23495. Gal6PI의 예는 또한 LacA 서브유닛에 대한 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 바람직하게 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체, 및 LacB 서브유닛에 대해 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 동족체를 포함한다.
T6P를 Gal6P로 전환시키는 방법에서 사용에 적합한 Gal6PI는 로스만-유사 αβα 샌드위치 폴드를 갖는 서브유닛으로 이루어진 이종이량체 ('A' 및 'B')를 함유한다. 보존성 잔기는 당분야에 공지되어 있다 (Jung et al. Crystal Structure and Substrate Specificity of D-Galactose-6-Phosphate IsomeraseComplexed with Substrates. PLOS ONE. 2013; 8; e72902). 본 발명의 일부 양상에서, 이소머라제 이종이량체는 제한없이 기질의 포스페이트 기에 결합하기 위해 'A' 내에 Arg130 및 Arg134 및 'B' 내에 His9 및 Arg39를 함유하고; 추가적으로 제한없이 기질의 고리 열림을 위해 'A' 내에 His96을 함유하고; 추가적으로 제한없이 고에너지 중간체를 안정화시키기 위해 'A' 내에 Asn97을 함유하고; 추가적으로 제한없이 양성자 이동에 참여하기 위해 'B'에 Cys65 및 Thr67을 함유한다.
Gal6PP의 예는 제한없이 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID Q8A2F3을 포함한다. Gal6PP의 예는 또한 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
바람직하게, Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 Gal6PP는 촉매작용을 위한 로스만유사 폴드 도메인, C2 캡핑 도메인, 로스만유사 폴드의 제1 β-가닥 내에 DxD 서명, 로스만유사 폴드의 제2 β-가닥의 말단에 Thr 또는 Ser, 및 로스만유사 폴드의 제4 β-가닥의 말단에 GDxxxD 서명을 함유한다.
본 발명에 따라서 갈락토스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 갈락토스를 제조 하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가 실시형태에서, 갈락토스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라 갈락토스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어, 다음의 단계들을 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) F6PE를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; (v) Gal6PI (EC 5.3.1.26)를 사용하여 T6P를 Gal6P로 전환시키는 단계; 및 (vi) Gal6PP를 통해 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계. 사카라이드가 전분인 방법의 예가 도 3에 도시되어 있다.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소의 비율은 1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PE:Gal6PI:Gal6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 그 결과로 하류 반응의 활성이 증가될 수 있다. 반대로, 1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강력한 공급을 유지하는데 사용될 수 있고, 그 결과로 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 야기시킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 갈락토스 생성의 효율성을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계들은 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
Gal6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에, 특히 모든 반응의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하여, 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 갈락토스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 전체 포스페이트에 기인하여 제조 비용을 감소시키고 따라서 포스페이트 제거 비용을 절감시킨다. 또한 유리 포스페이트의 높은 농도에 의한 Gal6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 또한 방법은 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 갈락토스를 제조하기 위해 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
갈락토스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Gal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Gal6P로 전환시키는 단계; 및 Gal6PP에 의해 촉매되는 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
갈락토스는 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Gal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Gal6P로 전환시키는 단계; 및 Gal6PP에 의해 촉매되는 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계.
Gal6P가 갈락토스로 전환될 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 갈락토스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 갈락토스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트에 의해 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 갈락토스로 전환시키는 방법을 제공한다. 일정 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로는 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 갈락토스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소는 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜, 선형 아밀로덱스트린을 산출하는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단시키고, 그러므로 알파-아밀라제는 갈락토스의 보다 빠른 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 갈락토스를 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는, 더 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스 및 말토트리오스를 재활용하여 갈락토스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 갈락토스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Gal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Gal6P로 전환시키는 단계, 및 Gal6PP에 의해 촉매되는 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계. 이 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 갈락토스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 갈락토스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴 리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Gal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Gal6P로 전환시키는 단계; 및 Gal6PP에 의해 촉매되는 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 갈락토스가 생물량 또는 락토스로부터 생성되는 경우에, 수율이 본 발명에서 보다 낮고, 갈락토스는 크로마토그래피를 통해 다른 당으로부터 분리되어야만 하므로, 더 높은 제조 비용이 초래된다. 뿐만 아니라, 우리의 방법은 동물을 사용하지 않는다.
본 발명에 따라서 Gal6P를 갈락토스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 갈락토스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 갈락토스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는, 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 갈락토스를 생성시키기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 생성된 갈락토스이다.
프룩토스
본 발명의 일 실시형태는 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제 (F6PP)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 프룩토스로 전환시키는 단계를 포함하는 프룩토스를 제조하기 위한 방법이다.
F6PP의 비제한적인 예는 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID B8CWV3이다. F6PP의 예는 또한 상기 기술된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 45%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
바람직하게, F6P를 프룩토스로 전환시키기 위한 F6PP는 촉매작용을 위한 로스만유사 폴드 도메인, C1 캡핑 도메인, 로스만유사 폴드의 제1 β-가닥 내에 DxD 서명, 로스만유사 폴드의 제2 β-가닥의 말단에 Thr 또는 Ser, 로스만유사 폴드의 제3 β-가닥의 C-말단 α-헬릭스의 N-말단에 Lys, 및 로스만유사 폴드의 제4 β-가닥의 말단에 ED 서명을 함유한다.
본 발명에 따라 프룩토스를 제조 하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 방법은 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 프룩토스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가 실시형태에서, 프룩토스 제조 방법은 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라서 프룩토스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어, 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) F6PP를 사용하여 F6P를 프룩토스로 전환시키는 단계.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소의 비율은 1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시키게 된다. 반대로, 1:1:1:3의 비율은 αGP에 대해 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단이 야기될 것이다. 예를 들어, 3:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 프룩토스 생성의 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 공정의 단계들이 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계는 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
F6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만 개별 효소의 활성을 제한하지 않고, 프룩토스를 제조하는 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트에 기인하여 제조 비용을 감소시키게 되고 따라서 포스페이트 제거의 비용이 절감된다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 F6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트의 공급원으로서 ATP를 첨가하지 않고, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 프룩토스를 제조 하기 위한 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
프룩토스는 또한 F6P 중간체를 통해서 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PP에 의해 촉매되는 F6P를 프룩토스로 전환시키는 단계. 예시적인 효소적 경로는 도 5에 제공되어 있다.
F6P를 프룩토스로 전환시킬 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 프룩토스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 프룩토스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해서 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 프룩토스로 전환시키기 위한 방법을 제공한다. 일정 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로 가 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 프룩토스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소가 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜서, 선형 아밀로덱스트린을 산출하도록 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물에 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단시켜서, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단시키고, 그러므로 알파-아밀라제는 프룩토스의 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 프룩토스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용하여 프룩토스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 프룩토스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PP에 의해 촉매되는 F6P를 프룩토스로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 프룩토스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 프룩토스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PP에 의해 촉매되는 F6P를 프룩토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어, 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 프룩토스는 생물량 또는 락토스로부터 생성될 때, 수율이 본 발명에서 보다 낮고, 프룩토스는 크로마토그래피를 통해 다른 당으로부터 분리되어야만 하므로, 더 높은 제조 비용을 초래한다. 뿐만 아니라, 우리의 방법은 동물을 사용하지 않는다.
본 발명에 따라서 F6P를 프룩토스를 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 프룩토스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화시키면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 프룩토스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는, 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 프룩토스를 제조하기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 생성된 프룩토스이다.
알트로스
본 발명이 일 실시형태는 프시코스 6-포스페이트 3-에피머라제 (P6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 프시코스 6-포스페이트 (P6P)로 전환시키는 단계, 알트로스 6-포스페이트 이소머라제 (Alt6PI)에 의해 촉매되는 P6P를 알트로스 6-포스페이트 (Alt6P)로 전환시키는 단계, 및 알트로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 촉매되는 생성된 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계를 포함하는 알트로스를 제조하기 위한 방법이다.
본 발명에 따라 알트로스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 알트로스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로, 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 알트로스 제조는 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따른 알트로스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 다음의 단계들을 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) P6PE를 통해 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; (v) Alt6PI를 통해 P6P를 Alt6P로 전환시키는 단계; 및 (vi) Alt6PP를 통해 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계. 사카라이드가 전분인 효소적 방법의 예는 도 1에 도시되어 있다.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소의 비율은 1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:P6PE:Alt6PI:Alt6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시킬 것이다. 반대로, 1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 일으킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 알트로스 생성의 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
Alt6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고, 알트로스를 제조하는 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도 can be 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트 덕분에 제조 비용을 감소시키고 따라서 포스페이트 제거의 비용을 절감시킨다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 Alt6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트로서 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 알트로스를 제조하기 위해 개시된 방법의 적어도 하나의 단계는 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
알트로스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; Alt6PI에 의해 촉매되는 P6P를 Alt6P로 전환시키는 단계, 및 Alt6PP에 의해 촉매되는 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
알트로스는 또한 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; Alt6PI에 의해 촉매되는 P6P를 Alt6P로 전환시키는 단계; 및 Alt6PP에 의해 촉매되는 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계.
Alt6P가 알트로스로 전환될 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의해 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 알트로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 알트로스를 제조하기 위한 방법은 다음 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
몇몇 효소는 G1P 수율을 증가시키도록 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜, 선형 아밀로덱스트린을 산출시키는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중에 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단시키고, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단시키고, 그러므로 알파-아밀라제는 알트로스로 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 G1P 및 글루코스로 분해 생성물 말토스를 가인산분해적으로 절단시켜 알트로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용하여 알트로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 알트로스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; Alt6PI에 의해 촉매되는 P6P를 Alt6P로 전환시키는 단계; 및 Alt6PP에 의해 촉매되는 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
몇몇 효소가 고형 셀룰로스를 수용성 셀로덱스트린 및 셀로비오스로 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제를 포함하지만, 베타-글루코시다제 (셀로비아제)는 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 알트로스의 수율을 증가시킬 수 있다.
알트로스는 글루코스로부터 생성될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; A6PI에 의해 촉매되는 P6P를 Alt6P로 전환시키는 단계; 및 Alt6PP에 의해 촉매되는 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
알트로스를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 프룩토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 알트로스가 프시오스로부터 생성될 때, 수율은 본 발명에서 보다 낮고, 알트로스는 크로마토그래피를 통해서 프시코스로부터 분리되어야 하므로, 더 높은 제조 비용을 초래한다.
또한, 본 발명에 따라 Alt6P를 알트로스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게, 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 알트로스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 알트로스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 알트로스를 제조하기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 생성된 알트로스이다.
탈로스
본 발명의 일 실시형태는 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 타가토스 6-포스페이트 (T6P)로 전환시키는 단계, 탈로스 6-포스페이트 이소머라제 (Tal6PI)에 의해 촉매되는 T6P를 탈로스 6-포스페이트 (Tal6P)로 전환시키는 단계, 및 탈로스 6-포스페이트 포스파타제 (Tal6PP)에 의해 촉매되는 생성된 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계를 포함하는 탈로스를 제조하기 위한 방법이다.
F6PE의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID E8N0N6, E4SEH3, I0I507, H1XRG1, 및 B5YBD7. Uniprot ID E8N0N6 및 I0I507은 둘 모두 F6PE 반응을 촉매하고 27%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, F6PE의 예는 또한 임의의 상기에 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
본 발명에 따라 탈로스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 탈로스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로, 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 탈로스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라 탈로스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 다음의 단계들을 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) F6PE를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; (v) Tal6PI (EC 5.3.1.26)를 통해 T6P를 Tal6P로 전환시키는 단계; 및 (vi) Tal6PP를 통해 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계. 사카라이드가 전분인 방법의 예는 도 3에 도시되어 있다.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PE:Tal6PI:Tal6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시킬 것이다. 반대로, 1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 야기시킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 탈로스 생성의 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계들을 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행할 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계는 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
Tal6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 탈소스를 제조하는 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트에 기인하여 제조 바용을 감소시키고 따라서 포스페이트 제거의 비용을 절감한다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 Tal6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트의 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 또한, 방법은 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 탈로스를 제조하기 위한 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
탈로스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Tal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Tal6P로 전환시키는 단계; 및 Tal6PP에 의해 촉매되는 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
탈로스는 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Tal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Tal6P로 전환시키는 단계; 및 Tal6PP에 의해 촉매되는 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계.
Tal6P를 탈로스로 전환시킬 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단으로 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 탈로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 탈로스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 탈로스로 전환시키기 위한 방법을 제공한다. 일정한 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로는 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 탈로스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소가 G1P 수율을 증가시키도록 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜 선형 아밀로덱스트린을 산출하는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중에 더 높은 F6P 농도를 생성시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 그러므로 알파-아밀라제는 탈로스로의 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단시켜 탈로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는, 더 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스로 재활용하여 탈로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해 탈로스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Tal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Tal6P로 전환시키는 단계; 및 Tal6PP에 의해 촉매되는 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)는 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 탈로스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 탈로스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; Tal6PI에 의해 촉매되는 T6P를 Tal6P로 전환시키는 단계; 및 Tal6PP에 의해 촉매되는 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 탈로스가 생물량 또는 락토스로부터 생성될 때, 수율은 본 발명보다 낮고, 탈로스는 크로마토그래피를 통해서 다른 당으로부터 분리되어야만하므로, 더 높은 제조 비용을 초래한다. 뿐만 아니라, 우리의 방법은 동물을 사용하지 않는다.
본 발명에 따라 Tal6P를 탈로스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 탈로스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 탈로스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 탈로스를 제조하기 위해 본 명세서에 기술된 방법에 의해 생성되는 탈로스이다.
솔보스
본 발명의 일 실시형태는 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 타가토스 6-포스페이트 (T6P)로 전환시키는 단계, 솔보스 6-포스페이트 에피머라제 (S6PE)에 의해 촉매되는 T6P를 솔보스 6-포스페이트 (S6P)로 전환시키는 단계, 및 솔보스 6-포스페이트 포스파타제 (S6PP)에 의해 촉매되는 생성된 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계를 포함하는 솔보스를 제조하기 위한 방법이다.
F6PE의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID E8N0N6, E4SEH3, I0I507, H1XRG1, 및 B5YBD7. Uniprot ID E8N0N6 및 I0I507 둘 모두는 F6PE 반응을 촉매하고 27%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, F6PE의 예는 또한 임의 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
본 발명에 따라서 솔보스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 방법은 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 솔보스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 솔보스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라 솔보스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) F6PE를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; (v) S6PE (EC 5.3.1.26)를 통해서 T6P를 S6P로 전환시키는 단계, 및 (vi) S6PP를 통해 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계. 사카라이드가 전분인 방법의 예는 도 3에 도시되어 있다.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소의 비율은 1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PE:S6PE:S6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최적화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시킬 것이다. 반대로, 1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키도록 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 일으킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여 효소 비율은 솔보스 생성의 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계는 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
S6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성에 영향을 미치지 않고 솔보스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 전체 포스페이트에 기인하여 제조 비용을 감소시키게 되고 따라서 포스페이트 제거의 비용을 절감시킨다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 S6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트의 공급원으로서 첨가되는 ATP없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 솔보스를 제조하기 위해 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
솔보스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; 및 S6PP에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
솔보스는 수크로스에 의해 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; 및 S6PP에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계.
S6P가 솔보스로 전환될 때 발생되는 포스페이트 이온은 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생된 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 솔보스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 솔보스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 솔보스로 전환시키는 방법을 제공한다. 일정한 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로는 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 솔보스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소가 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지하여, 선형 아밀로덱스트린을 산출시키는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중에 더 높은 F6P 농도를 생성시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단시키고, 그러므로 알파-아밀라제는 솔보스로의 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 솔보스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용하여 솔보스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 솔보스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계 및 S6PP에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계. 이 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 솔보스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 솔보스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; 및 S6PP에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 솔보스가 생물량 또는 락토스로부터 생성될 때, 수율은 본 발명에서 보다 낮고, 솔보스는 크로마토그래피를 통해서 다른 당으로부터 분리되어야만 하므로, 더 높은 제조 비용을 초래한다. 뿐만 아니라, 우리의 방법은 동물을 사용하지 않는다.
본 발명에 따라 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 솔보스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화시키면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 솔보스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 솔보스를 제조하기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 생성된 솔보스이다.
굴로스
본 발명의 일 실시형태는 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 타가토스 6-포스페이트 (T6P)로 전환시키는 단계, 솔보스 6-포스페이트 에피머라제 (S6PE)에 의해 촉매되는 T6P를 솔보스 6-포스페이트 (S6P)를 전환시키는 단계, 굴로스 6-포스페이트 이소머라제에 의해 촉매되는 생성된 S6P를 굴로스 6-포스페이트 (Gul6P)로 전환시키는 단계 및 굴로스 6-포스페이트 포스파타제 (Gul6PP)에 의해 Gul6P를 굴로스로 전환시키는 단계를 포함하는 굴로스를 제조하기 위한 방법이다.
F6PE의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID E8N0N6, E4SEH3, I0I507, H1XRG1, 및 B5YBD7. Uniprot ID E8N0N6 및 I0I507을 둘 모두가 F6PE 반응을 촉매하고 27%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, F6PE의 예는 임의의 상기에 언급된 Uniport ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
본 발명에 따라 굴로스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 굴로스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로, 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 굴로스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라서 굴로스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어, 다음의 단계들을 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) F6PE를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; (v) S6PE (EC 5.3.1.26)를 통해 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; (vi) Gul6PI를 통해 S6P를 Gul6P로 전환시키는 단계; 및 (vii) Gul6PP를 통해 GulP를 굴로스로 전환시키는 단계.
전형적으로, 개시된 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PE:S6PE:Gul6PI:GulPP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1:1의 비율은 인산화되는 중간체의 농도를 최적화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시킬 것이다. 반대로, 1:1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트이 강력한 공급을 유지하는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 일으킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키도록 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의된 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 굴로스 생성의 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계들이 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계는 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
S6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계들이 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고, 굴로스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 전체 포스페이트에 기인하여 제조 비용을 감소시키게 되고 따라서 포스페이트 제거의 비용을 절감한다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 S6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트의 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 또한 방법은 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 굴로스를 제조하기 위해 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
굴로스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계, Gul6PI에 의해 S6P를 Gul6P로 전환시키는 단계, 및 Gul6PP에 의해 Gul6P를 굴로스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 에를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
굴로스는 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계, Gul6PI에 의해 촉매되는 S6P를 Gul6P로 전환시키는 단계, 및 Gul6PP에 의해 촉매되는 Gul6P를 굴로스로 전환시키는 단계.
S6P를 솔보스로 전환시킬 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의해 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 굴로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 굴로스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 굴로스로 전환시키기 위한 방법을 제공한다. 일정한 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소적 경로는 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 굴로스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 몇몇 효소가 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜서 선형 아밀로덱스트린을 산출시키는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중에 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 그러므로 알파-아밀라제는 굴로스로의 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 굴로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출하도록 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는, 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스, 및 말토트리오스를 재활용하여 굴로스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물는 일련의 단계를 통해서 굴로스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계, 및 S6PP에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)가 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 굴로스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 굴로스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; Gul6PI에 의해 S6P를 Gul6P로 전환시키는 단계, 및 Gul6PP에 의해 Gul6P를 굴로스로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 굴로스가 생물량 또는 락토스로부터 생성될 때, 수율은 본 발명에서 보다 낮고, 굴로스는 크로마토그래피를 통해 다른 당과 분리되어야만 하므로 더 높은 제조 비용을 초래한다. 뿐만 아니라, 우리의 방법은 동물을 사용하지 않는다.
본 발명에 따라 S6P를 굴로스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 굴로스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 굴로스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는 세포막의 제거로 인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 굴로스를 제조하기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 생성되는 굴로스이다.
이도스
본 발명의 일 실시형태는 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)라 타가토스 6-포스페이트 (T6P)로 전환시키는 단계, 솔보스 6-포스페이트 에피머라제 (S6PE)에 의해 촉매되는 T6P를 솔보스 6-포스페이트 (S6P)로 전환시키는 단계, 이도스 6-포스페이트 이소머라제에 의해 생성된 S6P를 이도스 6-포스페이트 (I6P)로 전환시키는 단계, 및 이도스 6-포스페이트 포스파타제 (I6PP)에 의해 I6P를 이도스로 전환시키는 단계를 포함하는 이도스를 제조하기 위한 방법이다.
F6PE의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID E8N0N6, E4SEH3, I0I507, H1XRG1, 및 B5YBD7. Uniprot ID E8N0N6 및 I0I507 둘 모두는 F6PE 반응을 촉매하고 27%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, F6PE의 예는 또한 임의의 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 동족체를 포함한다.
본 발명에 따라서 이도스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 실시형태에서, 이도스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로, 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 역시 추가의 실시형태에서, 이도스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 본 발명에 따라서 이도스를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용해 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) F6PE를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계, (v) S6PE (EC 5.3.1.26)를 통해서 T6P를 S6PE로 전환시키는 단계, (vi) I6PI를 통해 S6P를 I6P로 전환시키는 단계, 및 (vii) I6PP를 통해서 I6P를 이도스로 전환시키는 단계.
전형적으로, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PE:S6PE:I6PI:I6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1:1의 비율이 인산화된 중간체의 농도를 최대화하기 위해 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시킬 것이다. 반대로, 1:1:1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대해 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 더 효율적인 가인산분해적 절단을 야기시킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 이도스 생성의 효율을 증가시키기 위해 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
방법의 중요한 장점 중 하나는 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이다. 대안적으로, 단계는 또한 직렬로 배열된 다수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.
S6P의 탈인산화에 의해 생성되는 포스페이트 이온은 이후에 특히 모든 방법의 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 방법의 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 포스페이트를 사용할 수 있게 하고, 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이것은 방법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 미치지만, 개별 효소의 활성은 제한하지 않고, 이도스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 보다 바람직하게 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM 일 수 있다.
그러므로, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트로 인해 제조 비용이 감소되고 따라서 포스페이트 제거의 비용을 절감한다. 또한 높은 농도의 유리 포스페이트에 의한 S6PP의 억제를 방지하고 포스페이트 오염에 대한 잠재성을 감소시킨다.
뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 방법은 포스페이트 공급원으로서 첨가되는 ATP 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 장점은 또한 이도스를 제조하기 위해 개시된 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지적으로 유리한 반응을 포함한다는 사실을 포함한다.
이도스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; I6PI에 의해 S6P를 I6P로 전환시키는 단계; 및 I6PP에 의해 I6P를 이도스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
이도스는 수크로스로부터 생성된다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P 발생; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계, I6PI에 의해 S6P를 I6P로 전환시키는 단계 및 I6PP에 의해 I6P를 이도스로 전환시키는 단계.
S6P가 솔보스로 전환될 때 발생되는 포스페이트 이온은 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단으로 발생된 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 이도스 수율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이도스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계를 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 F6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
다른 실시형태에서, G6P는 폴리포스페이트 글루코키나제에 의해 글루코스 및 나트륨 폴리포스페이트로부터 생성된다.
본 개시 내용은 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 그들의 유도 생성물 중 사카라이드, 예컨대 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 이도스로 전환시키기 위한 방법을 제공한다. 일정한 실시형태에서, 인공 (비천연) ATP-무함유 효소 경로는 세포-무함유 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 및 그들의 유도 생성물을 이도스로 전환시키기 위해 제공된다.
상기에 표시된 바와 같이, 몇몇 효소가 G1P 수율을 증가시키기 위해 전분을 가수분해시키는데 사용될 수 있다. 이러한 효소는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 및 알파-아밀라제를 포함한다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 저해하는 많은 분지를 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지시켜 선형 아밀로덱스트린을 산출하는데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리 전분은 최종 생성물 중 더 높은 F6P 농도를 야기시킬 수 있다. 이소아밀라제 및 풀룰라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여, 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 그러므로 알파-아밀라제는 인도스의 보다 신속한 전환 및 증가된 가용성을 위해 단편으로 전분을 분해시키는데 사용된다.
말토스 포스포릴라제 (MP)는 분해 생성물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해적으로 절단하여 이도스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 G1P를 산출시키기 위해 αGP에 의해 가인산분해적으로 절단될 수 있는 보다 긴 말토올리고사카라이드로 분해 생성물 글루코스, 말토스 및 말토트리오스를 재활용하여 이도스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일정한 실시형태에서, 셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 이도스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계, 및 S6PP에 의해 촉매되는 S6P를 솔보스로 전환시키는 단계. 이 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)는 방법에 첨가될 수 있고, 따라서 분해 생성물 글루코스를 G6P로 인산화시켜 이도스의 수율을 증가시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 이도스는 글로코스로부터 생성될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; S6PE에 의해 촉매되는 T6P를 S6P로 전환시키는 단계; I6PI에 의해 S6P를 I6P로 전환시키는 단계, 및 I6PP에 의해 I6P를 이도스로 전환시키는 단계.
본 발명의 방법은 저비용 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 연관된 비용을 감소시켜 제조 비용을 절감한다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 일부 그들의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 이도스가 생물량 또는 락토스로부터 생성될 때, 수율은 본 발명보다 더 낮고, 이도스는 크로마토그래피를 통해 다른 당으로부터 분리되어야 하므로 더 높은 제조 비용을 초래한다. 뿐만 아니라, 우리의 방법은 동물을 사용하지 않는다.
본 발명에 따라 S6P를 이도스로 전환시키는 단계는 공급원료와 무관하게 비가역적 포스파타제 반응이다. 그러므로, 이도스는 후속 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 매우 높은 수율로 생성된다.
세포-기반 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 이도스의 세포-무함유 제조를 포함하고, 세포의 내부 및 외부로 기질/생성물의 수송을 종종 지연시키는 세포막의 제거에 기인하여 비교적 높은 반응 속도를 갖는다. 또한 영양분-풍부 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다.
본 발명의 특정한 실시형태는 이도스를 생성하기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 생성된 이도스이다.
타가토스
타가토스를 제조하기 위한 방법은 에피머라제에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 포스파타제에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
F6P를 T6P로 전환시키기 위한 방법에서 사용에 적합한 에피머라제는 F6PE를 포함한다. F6PE의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID E8N0N6, E4SEH3, I0I507, H1XRG1, 및 B5YBD7. Uniprot ID E8N0N6 및 I0I507은 둘 모두 F6PE 반응을 촉매하고 27%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, F6PE의 예는 또한 임의의 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
T6P를 타가토스 (D-타가토스)로 전환시키는 포스파타제, T6PP가 방법에서 사용될 수 있다. T6PP의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID O29805, D2RHV2 및 F2KMK2. Uniprot ID O29805 및 F2KMK2 둘 모두는 F6PE 반응을 촉매하고 67%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, T6PP의 예는 또한 임의의 상기 언급된 Uniport ID와 적어도 65%, 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
타가토스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코스 이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 타가토스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 뿐만 아니라, 타가토스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 타가토스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) 프룩토스 6-포스페이트 에피머라제 (F6PE)를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계, 및 (v) 타가토스 6-포스페이트 포스파타제 (T6PP)를 통해 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계.
전형적으로, 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:F6PE:T6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시키게 된다. 반대로, 1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 야기시킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여 효소 비율은 타가토스 생성의 효율을 증가시키도록 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
타가토스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어, 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
타가토스는 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계.
T6P를 타가토스로 전환시킬 때 발생되는 포스페이트 이온은 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 타가토스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
타가토스를 제조하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 G6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 타가토스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
타가토스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 이 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P를 T6P로 전환시키는 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함한다.
프시코스
프시코스를 제조하기 위한 방법은 에피머라제 (예를 들어 , 프시코스 6-포스페이트 3-에피머라제, P6PE)에 의해 촉매되는 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 프시코스 6-포스페이트 (P6P)로 전환시키는 단계 및 포스파타제 (예를 들어, 프시코스 6-포스페이트 포스파타제, P6PP)에 의해 촉매되는 생성된 P6P를 프시코스로 전환시키는 단계를 포함한다.
P6PE의 예는 제한없이 UNIPROT ID 번호로 식별되는 다음의 단백질을 포함한다: D9TQJ4, A0A090IXZ8, 및 P32719. Uniprot ID A0A090IXZ8 및 D9TQJ4 둘 모두는 P6PE 반응을 촉매하고 45%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, P6PE의 예는 임의의 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 45%, 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100%를 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
P6PP의 예는 제한없이 다음의 단백질을 포함한다: Uniprot ID. A3DC21, Q5LGR4, 및 Q89ZR1. Uniprot ID A3DC21 및 Q89ZR1은 둘 모두가 P6PP 반응을 촉매하고 45%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, P6PP의 예는 또한 임의의 상기 언급된 Uniprot ID와 적어도 45%, 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 더 바람직하게 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100% 를 갖는 임의의 동족체를 포함한다.
프시코스를 제조하기 위한 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코스 이소머라제 (PGI)에 의해 촉매된다. 프시코스를 제조하기 위한 방법은 추가적으로 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 포함하고, 이 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매된다. 뿐만 아니라, 프시코스 제조 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 포함한다.
그러므로, 프시코스를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어, 다음의 단계들을 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 사카라이드를 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제 (PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) 프시코스 6-포스페이트 에피머라제 (P6PE)를 통해 F6P를 P6P로 전환시키는 단계, 및 (v) 프시코스 6-포스페이트 포스파타제 (P6PP)를 통해 P6P를 프시코스로 전환시키는 단계.
전형적으로, 방법에서 사용되는 효소 유닛의 비율은 1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:P6PE:P6PP)이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해서, 이들 비율은 임의 수의 조합으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 3:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 사용될 수 있고, 하류 반응의 활성을 증가시키게 될 것이다. 반대로, 1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대해 포스페이트의 강력한 공급을 유지시키는데 사용될 수 있고, 알파-1,4-글리코시드 결합의 보다 효율적인 가인산분해적 절단을 야기시킬 것이다. 예를 들어, 3:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 하기에 논의되는 다른 선택 효소를 포함하여, 효소 비율은 타가토스 생성의 효율을 증가시키기 위해 가변적일 수 있다. 예를 들어, 특정한 효소는 다른 효소의 양에 비해서, 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.
프시코스는 또한 프룩토스로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 방법은 예를 들어, 폴리포스페이트 프룩토키나제 (PPFK)에 의해 촉매되는 프룩토스 및 폴리포스페이트로부터 F6P를 발생시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; 및 P6PP에 의해 촉매되는 P6P를 프시코스로 전환시키는 단계를 포함한다. 프룩토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.
프시코스는 수크로스로부터 생성될 수 있다. 방법은 다음의 효소적 단계들을 포함한다: 수크로스 포스포릴라제 (SP)에 의해 촉매되는 수크로스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; 및 P6PP에 의해 촉매되는 P6P를 프시코스로 전환시키는 단계.
P6P를 프시코스로 전환시킬 때 발생되는 포스페이트 이온은 이후에 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해적 절단에 의해 발생되는 프룩토스로부터 F6P를 생성시켜 프시코스 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
프시코스를 제조 하기 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 글루코스를 발생시키는 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 글루코스를 G6P로 전환시키는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드로부터 프룩토스를 발생시키는 단계, 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프룩토스를 G6P로 전환시키는 단계. 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 예는 상기에 열거되어 있다.
셀룰로스 및 이의 유도 생성물은 일련의 단계를 통해서 프시코스로 전환될 수 있다. 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 각각 셀로덱스트린 포스포릴라제 (CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제 (CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 G1P를 발생시키는 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; 및 P6PP에 의해 촉매되는 P6P를 프시코스로 전환시키는 단계. 이러한 방법에서, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.
프시코스는 글루코스로부터 발생될 수 있다. 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제 (PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터 G6P를 발생시키는 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P를 P6P로 전환시키는 단계; 및 P6PP에 의해 촉매되는 P6P를 프시코스로 전환시키는 단계를 포함한다.
실시예
재료 및 방법
화학물
옥수수 전분, 가용성 전분, 말토덱스트린, 글루코스, 필터지를 포함하는 모든 화학물은 시약 등급 이상이었고 달리 언급하지 않으면 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 또는 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)에서 구매하였다.제한 효소, T4 리가제, 및 Phusion DNA 중합효소는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)에서 구매하였다. 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) 또는 Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL, USA)에서 합성하였다. 효소 정제에 사용되는 재생 비정질 셀룰로스는 [Ye et al., Fusion of a family 9 Cellulose-binding module improves catalytic potential of Clostridium thermocellum Cellodextrinn phosphorylase on insoluble cellulose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92:551-560]에 기술된 바와 같이, 이의 용해 및 재생을 통해서, Avicel PH105 (FMC BioPolymer, Philadelphia, PA, USA)로부터 제조되었다. 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) Sig10 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 DNA 조작용 숙주 세포로서 사용되었고 이. 콜라이 BL21 (DE3) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 사용되었다. 100 mg L-1 암피실린 또는 50 mg L-1 카나마이신을 포함하는 ZYM-5052 배지는 이. 콜라이 세포 성장 및 재조합 단백질 발현에 사용되었다. 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei) 유래 셀룰라제 (카탈로그 번호: C2730) 및 풀룰라나제 (카탈로그 번호: P1067)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였고 Novozymes (Franklinton, NC, USA)을 통해 제조하였다. 말토스 포스포릴라제 (카탈로그 번호: M8284)는 Sigma-Aldrich에서 구매하였다.
재조합 효소의 생성 및 제조
단백질 발현 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 BL21 (DE3) 균주는 100 mg L-1 암피실린 또는 50 mg L-1 카나마이신을 함유하는 100 mL의 ZYM-5052 배지가 있는 1-L 엘렌메이어 플라스크에서 인큐베이션시켰다. 세포는 37℃에서 220 rpm의 회전 진탕으로 16시간 내지 24시간 동안 성장시켰다. 세포는 12℃에서 원심분리를 통해 회수하였고 50 mM NaCl 및 5 mM MgCl2 (열 침전 및 셀룰로스-결합 모듈)을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충 염수 (pH 7.5) 또는 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸 (Ni 정제)을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충 염수 (pH 7.5)로 1회 세척하였다. 세포 펠렛을 동일한 완충액에 재현탁시켰고 초음파 처리로 용해시켰다 (Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 500; 5초 펄스 처리 및 10초 휴식, 50% 진폭에서 총 21분). 원심분리 이후에, 상등액 중 표적 단백질을 정제하였다.
3가지 접근법을 사용하여 다양한 재조합 단백질을 정제하였다. His-태그된 단백질은 Ni 세파로스 6 패스트 플로우 레진 (GE Life Sciences, Marlborough, MA, USA)를 통해 정제하였다. 셀룰로스-결합 모듈 (CBM) 및 자기-절단 인테인을 함유하는 융합 단백질은 거대 표면적 재생 비정질 셀룰로스 상에서 고친화성 흡착을 통해 정제되었다. 5 내지 30분 동안 70 내지 95℃에서 열 침전을 사용해 초열안정성 효소를 정제하였다. 재조합 단백질의 순도는 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)을 통해 조사하였다.
사용된 효소 및 그들의 활성 어세이
써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 유래의 알파-글루칸 포스포릴라제 (αGP) (Uniprot ID G4FEH8)가 사용되었다. 활성은 1 mM MgCl2, 및 30 mM 말토덱스트린을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 어세이되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO) (Vivaproducts, Inc., Littleton, MA, USA)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 글루코스 1-포스페이트 (G1P)는 25 U/mL 포스포글루코뮤타제가 보충된 글루코스 헥소키나제/G6PDH 어세이 키트 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 GAHK20-1KT)를 사용해 측정하였다. 단위 (U)는 μmol/분으로서 기술된다.
써모코커스 코다카라엔시스 (Thermococcus kodakaraensis) 유래 포스포글루코뮤타제 (PGM) (Uniprot ID Q68BJ6)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2 및 5 mM G1P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물 글루코스 6-포스페이트 (G6P)는 헥소키나제/G6PDH 어세이 키트 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 GAHK20-1KT)를 사용해 결정하였다.
포스포글루코이소머라제 (PGI)의 2종의 상이한 공급원은 클로스트리듐 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) (Uniprot ID A3DBX9) 및 써머서 써모필러스 (Thermus thermophilus) (Uniprot ID Q5SLL6)로부터 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2 및 10 mM G6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중단시켰다. 생성물, 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)는 340 nm에서의 흡광도 감소가 F6P의 생성을 의미하는 프룩토스 6-포스페이트 키나제 (F6PK)/피루베이트 디히드로게나제 (PK)/락테이트 디히드로게나제 (LD) 커플링된 효소 어세이를 사용하여 결정하였다. 이러한 200 μL 반응은 50 mM HEPES (pH 7.2), 5 mM MgCl2, 10 mM G6P, 1.5 mM ATP, 1.5 mM 포스포에놀 피루베이트, 200 μM NADH, 0.1 U PGI, 5 U PK, 및 5 U LD를 함유하였다.
씨. 써모셀럼 유래의 재조합 셀로덱스트린 포스포릴라제 및 셀로비오스 포스포릴라제는 [Ye et al.Spontaneous high-yield production of hydrogen from cellulosic materials and water catalyzed by enzyme cocktails. ChemSusChem 2009; 2:149-152]에 기술되어 있다. 그들 활성의 기술된 바와 같이 어세이되었다.
써모비피다 푸스카 (Thermobifida fusca) YX 유래 재조합폴리포스페이트 글루코키나제는 [Liao et al., One-step purification and immobilization of thermophilic polyphosphate glucokinase from Thermobifida fusca YX: glucose-6-phosphate generation without ATP. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 93:1109-1117]에 기술되어 있다. 이의 활성은 기술된 대로 어세이되었다.
설폴로버스 토코다이 (Sulfolobus tokodaii) 유래 재조합 이소아밀라제는 [Cheng et al., Doubling power output of Starch biobattery treated by the most thermostable isoamylase from an archaeon Sulfolobus tokodaii. Scientific Reports 2015; 5:13184]에 기술되어 있다. 이의 활성은 기술된 대로 어세이되었다.
써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) 유래 재조합 4-알파-글루카놀트랜스퍼라제는 [Jeon et al. 4-α-Glucanotransferase from the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus Litoralis. Eur. J. Biochem. 1997; 248:171-178]에 기술되어 있다. 이의 활성은 기술된 대로 측정되었다.
써모언애로박테리움 서모사카롤리티컴 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래 수크로스 포스포릴라제 (Uniprot ID D9TT09)가 사용되었다 (Verhaeghe et al. The quest for a thermostable sucrose phosphorylase reveals sucrose 6'-phosphate phosphorylase as a novel specificity. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Aug;98(16):7027-37). 이의 활성은 10 mM 수크로스 및 12 mM 유기 포스페이트를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.5)에서 측정하였다. 글루코스 1-포스페이트 (G1P)는 알파-글루칸 포스포릴라제로서 25 U/mL 포스포글루코뮤타제가 보충된 글루코스 헥소키나제/G6PDH 어세이 키트를 사용해 측정되었다.
써모언애로박테리움 써모사칼롤리티컴 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래 프시코스 6-포스페이트 3-에피머라제 (P6PE) (Uniprot ID D9TQJ4)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 1 U/mL P6PP, 및 10 mM F6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지되었다. 생성물, 프시코스 6-포스페이트 (P6P)는 프시코스 6-포스페이트 포스파타제를 사용하고 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정되었다. 유리 포스페이트 방출을 검출하기 위해서, 0.1 M 아연 아세테이트 및 2 mM 암모늄 몰리브데이트 (pH 5)를 함유하는 500 μL의 용액을 50 μL의 반응물에 첨가하였다. 이것을 혼합하였고 이후에 125 μL의 5% 아스코르브산 (pH 5)을 혼합하였다. 용액을 혼합하고 나서 20분 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 850 nm에서의 흡광도를 판독하여 유리 포스페이트 방출을 결정하였다. 다음으로 프시코스는 Agilent Hi-Plex H-컬럼을 사용하여 HPLC를 통해 검증하였다 (샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝시킴)
서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 클로스트리듐 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 유래 알로스 6-포스페이트 이소머라제 (A6PI) (Uniprot ID W4V2C8)를 사용하였다. 활성은 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 1 U/mL P6PE, 1 U/mL A6PP, 및 10 mM F6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 알로스 6-포스페이트 (P6P)는 알로스 6-포스페이트 포스파타제를 사용하고 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정되었다. 알로스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증하였다. 다른 A6PI, 예컨대 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 심비오박테리움 써모필럼 (Symbiobacterium thermophilum) 유래 A6PI (Uniprot ID Q67LX4)가 사용될 수 있다.
서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 루벨리미크로비움 써모필럼 (Rubellimicrobium thermophilum) 유래 알로스 6-포스페이트 포스파타제 (A6PP) (Uniprot ID S9SDA3)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 1 U/mL P6PE, 1 U/mL A6PI, 및 10 mM F6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 알로스는 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정되었다. 알로스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증되었다. 다른 A6PP, 예컨대 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 유래 A6PP (Uniprot ID Q9X0Y1), 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 써모언애로박테리움 사카롤리티커 (Thermoanaerobacterium saccharolyticum) 유래 A6PP (Uniprot ID I3VT81), 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 스트렙토마이세스 써모오토트로피커스 (Streptomyces thermoautotrophicus) 유래 A6PP (Uniprot ID A0A132NF06), 및 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 스파에로박터 써모필러스 (Sphaerobacter thermophilus) 유래 A6PP (Uniprot ID D1C7G9)가 사용될 수 있다.
서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 슈도노카르디아 써모필라 (Pseudonocardia thermophila) 유래 만노스 6-포스페이트 이소머라제 (M6PI) (Uniprot ID A0A1M6TLY7)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 1 U/mL PGI, 1 U/mL M6PP, 및 10 mM F6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 만노스 6-포스페이트 (M6P)는 만노스 6-포스페이트 포스파타제 (M6PP)를 사용하여 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정하였다. 만노스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증하였다. 다른 M6PI 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 칼디트릭스 아비시 (Caldithrix abyssi) 유래 예컨대 M6PI (Uniprot ID H1XQS6), 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 미셀리오프쏘라 써모필라 (Myceliophthora thermophila) 유래 M6PI (Uniprot ID G2Q982) 및 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트레포네마 칼다리움 (Treponema caldarium) 유래 M6PI (Uniprot ID F8F1Z8)가 사용될 수 있다.
서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 테피디모나스 폰티칼디 (Tepidimonas fonticaldi) 유래 만노스 6-포스페이트 포스파타제 (M6PP) (Uniprot ID A0A1A6DSI3)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 및 10 mM 만노스 6-포스페이트를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 만노스는P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정하였다. 만노스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증되었다. 다른 M6PP 예컨대 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 써모모나스 히드로써말리스 (Thermomonas hydrothermalis) 유래 M6PP (Uniprot ID A0A1M4UN08) 및 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 설퍼리비르가 칼디큐랄리 (Sulfurivirga caldicuralii) 유래 M6PP (Uniprot ID A0A1N6FCW3)를 사용할 수 있다.
서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 신트로포써머스 리포칼리더스 (Syntrophothermus lipocalidus) 유래 이기능성 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제 (PGPMI) (Uniprot ID D7CPH7)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 1 U/mL M6PP, 및 10 mM G6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, M6P는 M6PP를 사용하고 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정하였다. 만노스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증하였다. 다른 PGPMI 예컨대 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 슬레이페리아 써모필라 (Schleiferia thermophila) 유래 PGPMI (Uniprot ID A0A085L170) 및 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 써모디술포비움 나루젠스 (Thermodesulfobium narugense) 유래 PGPMI (Uniprot ID M1E6Z3)를 사용할 수 있다.
락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 유래 갈락토스 6-포스페이트 이소머라제 (Gal6PI) (절대 이량체; 각각 서열번호 18 및 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Uniprot ID P23494 및 P23495)가 사용된다 (van Rooijen et al. Molecular Cloning, Characterization, and Nucleotide Sequence of the Tagatose 6-Phosphate Pathway Gene Cluster of the Lactose Operon of Lactococcus Zactis. J. Biol. Chem. 1991;266:7176-7181). 활성은 5 mM MgCl2, 1 U/mL 프룩토스 6-포스페이트 4-에피머라제 (F6PE), 1 U/mL 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제 (Gal6PP), 및 10 mM 프룩토스 6-포스페이트를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 37℃에서 측정한다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 생성물, 갈락토스 6-포스페이트 (gal6P)는 Gal6PP를 사용하고 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정된다. 갈락토스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증하였다.
서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 박테로이데스 써타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 유래 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제 (Gal6PP) (Uniprot ID Q8A2F3)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 및 10 mM 갈락토스 6-포스페이트를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지되었다. 생성물, 갈락토스는 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정되었다. 갈락토스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증하였다.
서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 할로써모트릭스 오레니 (Halothermothrix orenii) 유래 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제 (F6PP) (Uniprot ID B8CWV3)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 및 10 mM 프룩토스 6-포스페이트를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 프룩토스는 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정하였다. 프룩토스는 프시코스와 동일한 HPLC를 통해 검증하였다.
알카에오글로버스 푸지디스 (Archaeoglobus fugidis) 유래 타가토스 6-포스페이트 포스파타제 (T6PP) (Uniprot ID A0A075WB87)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2 및 10 mM T6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지되었다. 타가토스 생성은 F6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출을 검출하여 결정하였다.
클로스트리듐 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 유래 프시코스 6-포스페이트 포스파타제 (P6PP) (UNIPROT ID A3DC21)가 사용되었다. 활성은 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 1 U/mL P6PE, 및 10 mM F6P를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 50℃에서 측정하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 프시코스는 P6PE에 대해 기술된 바와 같이 유리 포스페이트 방출의 검출을 통해 결정되었다.
하기 각각의 실시예에서 사용된 효소 유닛은 바람직하다면 반응 시간을 조정하여 증가될 수 있거나 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 24시간 대신 8시간 동안 실시예 9를 수행하기를 원한다면, 효소의 유닛은 약 3-배 증가된다. 반대로, 24시간 대신 48시간 동안 실시예 9를 수행하고자 하면, 효소 유닛은 약 2-배 감소될 수 있다. 이들 실시예는 일정한 생산성을 유지하면서 반응 시간을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 얼마의 효소 유닛의 양을 사용할 수 있는지를 예시한다.
전체 생성물
실시예 1
전분으로부터 프룩토스 6-포스페이트의 효소적 생합성의 기술적 실현가능성을 검증하기 위해서, 3종의 효소를 재조합으로 발현시켰다: 티. 마리티마 유래 알파-글루칸 포스포릴라제 (Uniprot ID G4FEH8), 써모코커스 코다카라엔시스 유래 포스포글루코뮤타제 (Uniprot ID Q68BJ6), 및 클로스트리듐 써모셀럼 유래 포스포글루코이소머라제 (Uniprot ID A3DBX9). 재조합 단백질은 이. 콜라이 BL21 (DE3)에서 과발현되었고 상기 기술된 바와 같이 정제되었다.
10 g/L 가용성 전분, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.5 mM ZnCl2, 0.01 U의 αGP, 0.01 U PGM, 및 0.01 U PGI를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)는 340 nm에서의 흡광도 감소가 상기 기술된 바와 같이 F6P의 생성을 의미하는 프룩토스 6-포스페이트 키나제 (F6PK)/피루베이트 디히드로게나제 (PK)/락테이트 디히드로게나제 (LD) 커플링된 효소 어세이를 사용하여 결정하였다. 24시간 이후에 F6P의 최종 농도는 3.6 g/L였다.
실시예 2
(반응 온도 이외의) 실시예 1과 동일한 시험을 40 내지 80℃에서 수행하였다. 10 g/L 가용성 전분은 40시간 반응 이후에 40℃에서 0.9 g/L F6P 및 80℃에서 3.6 g/L F6P를 생성시켰음을 확인했다. 이들 결과는 이러한 효소 세트의 경우 높은 반응 온도가 F6P 수율을 증가시켰지만, 너무 높은 온도는 일부 효소 활성을 손상시킬 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3
80℃에서 대략 1:1:1의 αGP: PGM: PGI의 효소 비율은 빠른 F6P 생성을 일으켰다는 것을 확인하였다. 효소 비율은 반응 시간이 충분히 길지 않으면 최종 F6P 농도에 상당히 영향을 미치지 않는 것을 주목한다. 그러나, 효소 비율은 시스템에서 사용된 효소의 총 비용 및 반응 속도에 영향을 미친다.
실시예 4
10 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.5 mM ZnCl2, 0.01 U의 αGP, 0.01 U PGM, 및 0.01 U PGI를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 생성물, 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)는 340 nm에서 흡광도의 감소가 상기 기술된 바와 같이 F6P의 생성을 의미하는 프룩토스 6-포스페이트 키나제 (F6PK)/피루베이트 디히드로게나제 (PK)/락테이트 디히드로게나제 (LD) 커플링된 효소 어세이를 사용하여 결정하였다. 24시간 후 F6P의 최종 농도는 3.6 g/L였다.
실시예 5
Avicel로부터 F6P 생성에 대해 시험하기 위해서, Sigma 셀룰로스를 사용하여 50℃에서 셀룰로스를 가수분해시켰다. 상업적 셀룰라제로부터 베타-글루코시다제를 제거하기 위해서, 셀룰로스의 10 필터지 유닛/mL을 10분 동안 얼음-수조에서 10 g/L Avicel에 혼합하였다. 4℃에서 원심분리 후, 베타-글루코시다제를 함유하는 상등액은 폐기시켰다. 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제를 함유하는 셀룰로스와 결합된 Avicel은 3일 동안 50℃에서 가수분해를 위해 시트레이트 완충액 (pH 4.8)에 재현탁시켰다. 셀룰로스 가수분해물은 5 U/mL 셀로덱스트린 포스포릴라제, 5 U/L 셀로비오스 포스포릴라제, 5 U/mL의 αGP, 5 U/mL PGM, 및 5 U/mL PGI와 10 mM 포스페이트, 5 mM MgCl2 및 0.5 mM ZnCl2 를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중에 혼합하였다. 반응은 60℃에서 72시간 동안 수행하였고 고농도의 F6P가 확인되었다 (소량의 글루코스과 셀로비오스는 없음). F6P는 상기 기술된 커플링된 효소 어세이를 사용하여 검출하였다. 글루코스는 상기 기술된 바와 같이 헥소키나제/G6PDH 어세이 키트를 사용하여 검출하였다.
실시예 6
Avicel로부터 F6P 수율을 증가시키기 위해서, Avicel은 [Zhang et al. A transition from cellulose swelling to cellulose dissolution by o-phosphoric acid: evidence from enzymatic hydrolysis and supramolecular structure. Biomacromolecules 2006; 7:644-648]에 기술된 바와 같이 농축 인산으로 전처리하여 비정질 셀룰로스 (RAC)를 생성시켰다. 상업적 셀룰라제로부터 베타-글루코시다제를 제거하기 위해서, 10 필터지 유닛/mL의 셀룰로스를 5분 동안 얼음-수조에서 10 g/L RAC과 혼합하였다. 4℃에서 원심분리 후, 베타-글루코시다제를 함유하는 상등액은 폐기하였다. 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제를 함유하는 셀룰라제와 결합된 RAC는 12시간 동안 50℃에서 가수분해를 위해서 시트레이트 완충액 (pH 4.8)에 재현탁시켰다. RAC 가수분해물은 10 mM 포스페이트, 5 mM MgCl2 및 0.5 mM ZnCl2 를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 5 U/mL 셀로덱스트린 포스포릴라제, 5 U/mL 셀로비오스 포스포릴라제, 5 U/mL의 αGP, 5 U/mL PGM, 및 5 U/mL PGI와 혼합하였다. 반응은 60℃에서 72시간 동안 수행하였다. 고농도의 F6P 및 글루코스를 회수하였는데 글루코스를 F6P로 전환시키기 위해 효소가 첨가되지 않았기 때문이다. F6P는 상기 기술된 커플링된 효소 어세이를 사용하여 검출하였다. 글루코스는 상기 기술된 바와 같이 헥소키나제/G6PDH 어세이 키트를 사용하여 검출하였다.
실시예 7
RAC로부터 F6P 수율을 더 증가시키기 위해서, 폴리포스페이트 글루코키나제 및 폴리포스페이트를 첨가하였다. 상업적 셀룰라제로부터 베타-글루코시다제를 제거하기 위해서, 10 필터지 유닛/mL의 셀룰라제를 5분 동안 얼음-수조에서 10 g/L RAC와 혼합하였다. 4℃에서 원심분리 후, 베타-글루코시다제를 함유하는 상등액은 폐기하였다. 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제를 함유하는 셀룰라제와 결합된 RAC는 50℃에서 가수분해를 위해 시트레이트 완충액 (pH 4.8)에 재현탁시켰고 12시간 동안 50℃에서 가수분해를 위해 시트레이트 완충액 (pH 4.8)에서 인큐베이션시켰다. RAC 가수분해물은 50 mM 폴리포스페이트, 10 mM 포스페이트, 5 mM MgCl2 및 0.5 mM ZnCl2 를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 5 U/mL 폴리포스페이트 글루코키나제, 5 U/mL 셀로덱스트린 포스포릴라제, 5 U/mL 셀로비오스 포스포릴라제, 5 U/mL의 αGP, 5 U/mL PGM, 및 5 U/mL PGI와 혼합하였다. 반응은 50℃에서 72시간 동안 수행하였다. F6P가 고농도로 존재하였고 이제 오직 소량의 글루코스만 존재하였다. F6P는 상기 기술된 바와 같이 커플링된 효소 어세이를 사용하여 검출하였다. 글루코스는 상기 기술된 바와 같이 헥소키나제/G6PDH 어세이 키트를 사용하여 검출하였다.
실시예 8
포스페이트 완충 염수 (PBS)의 농도 범위를 결정하기 위해서, 50 g/L 말토덱스트린; 6.25 mM, 12.5 mM, 25 mM, 37.5 mM, 또는 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2; 5 mM MgCl2; 0.1 U의 αGP; 0.1 U PGM; 및 0.1 U PGI를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 짧은 지속기간은 완료에 도달하지 않는 것을 보장하고, 그러므로 효율의 차이를 분명하게 확인할 수 있다. F6P의 생성은 340 nm에서의 흡광도 감소가 F6P의 생성을 의미하는 프룩토스 6-포스페이트 키나제 (F6PK)/피루베이트 디히드로게나제 (PK)/락테이트 디히드로게나제 (LD) 커플링된 효소 어세이를 사용하여 정량하였다. 개별적으로, 4.5 g/L, 5.1 g/L, 5.6 g/L, 4.8 g/L, 또는 4.9 g/L의 F6P 수율이 6.25 mM, 12.5 mM, 25 mM, 37.5 mM, 또는 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2를 함유하는 반응물의 경우에 수득되었다 (표 1). 이들 결과는 25 mM 농도의 PBS, pH 7.2가 이들 특정 반응 조건에 이상적이었다는 것을 의미한다. pH 7.2에서 6.25 mM PBS의 사용도 포스페이트 재활용에 기인하여 상당한 턴오버를 야기시킨다는 것을 언급하는 것은 중요하다. 이것은 개시된 포스페이트 재활용 방법이 산업적 수준이 부피 생산성 (예를 들어, 200-300 g/L 말토덱스트린)에서도 포스페이트 수준을 낮게 유지시킬 수 있다는 것을 보여준다.
PBS의 농도, pH 7.2 (mM) F6P의 g/L
6.25 4.5
12.5 5.1
25 5.6
37.5 4.8
50 4.9
실시예 9
캐스캐이드 반응의 pH 범위를 결정하기 위해서, 50 g/L 말토덱스트린; 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0 7.2, 또는 7.3; 5 mM MgCl2; 0.02 U의 αGP; 0.02 U PGM; 및 0.02 U PGI를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 유닛은 완료에 도달하지 않는 것을 보장하도록 낮추었고, 따라서 효율의 차이를 분명하게 확인할 수 있었다. F6P의 생성은 실시예 12에서와 같이 정량하였다. 개별적으로, 4.0 g/L, 4.1 g/L 4.2 g/L, 4.1 g/L, 4.4 g/L, 4.1 g/L, 3.8 g/L 또는 4.0 g/L의 F6P 수율이 pH 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 또는 7.3에서 50 mM 포스페이트 완충 염수를 함유하는 반응물에 대해 수득되었다 (표 2). 이들 비율은 6.8의 pH가 이들 특정한 반응 조건에 이상적이었다는 것을 의미하지만, 시스템은 광범위 pH 범위에서 작동된다.
PBS의 pH F6P의 g/L
6.0 4.0
6.2 4.1
6.4 4.2
6.6 4.1
6.8 4.4
7.0 4.1
7.2 3.8
7.3 4.0
알로스
실시예 10
F6P로부터 알로스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L의 F6P를 5 mM MgCl2 및 500 μM CoCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL P6PE, 1 U/mL A6PI 및 1 U/mL A6PP와 혼합하였다. 반응물은 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션되었다. F6P의 알로스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인하였다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 에서 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝되었다.
실시예 11
말토덱스트린으로부터 알로스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U A6PI 및 0.05 U A6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 알로스는 실시예 10에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해 검증되었다.
실시예 12
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U A6PI, 및 0.05 U A6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키는데 사용되었고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 알로스의 생성은 실시예 10처럼 검증하였다.
실시예 13
말토덱스트린으로부터 알로스 수율을 더 증가시키기 위해, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)가 실시예 11에 기술된 반응물에 첨가되었다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 12 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U A6PI, 0.05 U A6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 알로스의 생성은 실시예 10에서 처럼 검증하였다.
실시예 14
말토덱스트린으로부터 알로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제가 실시예 11에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 15
말토덱스트린으로부터 알로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트가 실시예 11에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 16
프룩토스로부터 알로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U P6PE, 0.05 A6PI, 및 0.05 U A6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 알로스의 생성은 실시예 10에서 처럼 정량하였다.
실시예 17
글루코스로부터 알로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 A6PI, 및 0.05 U A6PP를 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 알로스의 생성은 실시예 10에서 처럼 정량한다.
실시예 18
수크로스로부터 알로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 500 μM CoCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 A6PI, 및 0.05 U A6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 알로스의 생성은 실시예 10에서 처럼 정량한다.
실시예 19
수크로스로부터 알로스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제가 실시예 18의 반응 혼합물에 첨가된다. 알로스의 생성은 실시예 10에서 처럼 정량된다.
만노스
실시예 20
F6P로부터 만노스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P를 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL M6PI/PGPMI, 및 1 U/mL M6PP와 혼합하였다. 반응물은 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. F6P의 만노스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용한 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 사용하여 확인하였다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝하였다.
실시예 21
말토덱스트린으로부터 만노스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U M6PI/PGPMI (PGPMI 경우 PGI가 필요하지 않음), 및 0.05 U M6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 만노스는 실시예 20에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해 검증하였다.
실시예 22
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물은 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이것을 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U M6PI/PGPMI (PGPMI 경우에 PGI가 필요하지 않음), 및 0.05 U M6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키는데 사용되었고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 만노스의 생성은 실시예 20에서 처럼 검증하였다.
실시예 23
말토덱스트린으로부터 만노스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 21에 기술된 반응물에 첨가하였다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 22 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U M6PI/PGPMI (PGPMI 경우 PGI가 필요하지 않음), 0.05 U M6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 만노스의 생성은 실시예 20에서 처럼 검증되었다.
실시예 24
말토덱스트린으로부터 만노스 수율을 더 증가시키기 위해, 0.05 U 말토스 포스포릴라제를 실시예 21에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 25
말토덱스트린으로부터 만노스 수율을 더 증가시키기 위해, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 21에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 26
프룩토스로부터 만노스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U M6PI/PGPMI (PGPMI 경우 PGI가 필요하지 않음), 및 0.05 U M6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 만노스의 생성은 실시예 20에서 처럼 정량된다.
실시예 27
글루코스로부터 만노스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U M6PI/PGPMI (PGPMI 경우 PGI가 필요하지 않음), 및 0.05 U M6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 만노스의 생성은 실시예 20에서 처럼 정량된다.
실시예 28
수크로스로부터 만노스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U M6PI/PGPMI (PGPMI 경우 PGI가 필요하지 않음), 및 0.05 U M6PP를 포함하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 만노스의 생성은 실시예 20에서 처럼 정량된다.
실시예 29
수크로스로부터 만노스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 28의 반응 혼합물에 첨가한다. 만노스의 생성은 실시예 20에서 처럼 정량된다.
갈락토스
실시예 30
F6P로부터 갈락토스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P는 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL Gal6PI, 및 1 U/mL Gal6PP와 혼합된다. 반응물을 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다. F6P의 갈락토스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하는 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인된다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝된다.
실시예 31
말토덱스트린으로부터 갈락토스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U Gal6PI, 및 0.05 U Gal6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 갈락토스는 실시예 30에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해 검증된다.
실시예 32
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물은 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 이것은 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U Gal6PI, 및 0.05 U Gal6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키는데 사용되고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 갈락토스의 생성은 실시예 30에서 처럼 검증된다.
실시예 33
말토덱스트린으로부터 갈락토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)가 실시예 21에 기술된 반응물에 첨가된다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 12 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U Gal6PI, 0.05 U Gal6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 갈락토스의 생성물은 실시예 30에서 처럼 검증된다.
실시예 34
말토덱스트린으로부터 갈락토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제가 실시예 31에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 35
말토덱스트린으로부터 갈락토스 수율을 더 증가시키기 위해, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 31에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 36
프룩토스로부터 갈락토스를 생성시키기 이해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U Gal6PI, 및 0.05 U Gal6PP를 함유하는 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 갈락토스의 생성은 실시예 30에서 처럼 정량된다.
실시예 37
글루코스로부터 갈락토스를 생성시키기 위해, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U Gal6PI, 및 0.05 U Gal6PP를 함유하는 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 갈락토스의 생성은 실시예 30에서 처럼 정량된다.
실시예 38
수크로스로부터 갈락토스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U Gal6PI, 및 0.05 U Gal6PP를 함유하는 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 갈락토스의 생성은 실시예 30에서 처럼 정량된다.
실시예 39
수크로스로부터 갈락토스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 38의 반응 혼합물에 첨가한다. 갈락토스의 생성은 실시예 30에서 처럼 정량된다.
실시예 40
Gal6P로부터 갈락토스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L Gal6P는 5 mM MgCl2를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL Gal6PP와 첨가하였다. 반응물은 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. Gal6P의 갈락토스로의 전환은 유리 포스페이트 검출에서 확인된다. 유리 포스페이트 방출을 검출하기 위해서, 0.1 M 아연 아세테이트 및 2 mM 암모늄 몰리브데이트 (pH 5)를 함유하는 500 μL의 용액을 50 μL의 반응물에 첨가하였다. 이것을 혼합하였고 그 다음으로 125 μL의 5% 아스코르브산 (pH 5)을 혼합하였다. 이 용액을 혼합하고 나서 30℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 850 nm에서의 흡광도를 판독하여 유리 포스페이트 방출을 결정하였다.
프룩토스
실시예 41
F6P로부터 프룩토스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P는 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL F6PP와 혼합하였다. 반응물은 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. F6P의 프룩토스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인하였다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝하였다.
실시예 42
말토덱스트린으로부터 프룩토스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 및 0.05 U F6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시켰다. 프룩토스는 실시예 41에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해 검증하였다.
실시예 43
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 및 0.05 U F6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시켰고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 프룩토스의 생성은 실시예 41에서 처럼 검증하였다.
실시예 44
말토덱스트린으로부터 프룩토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 실시예 42에 기술된 반응물에 첨가하였다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 12 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 프룩토스의 생성은 실시예 41에서 처럼 검증되었다.
실시예 45
말토덱스트린으로부터 프룩토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제를 실시예 42에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 46
말토덱스트린로부터 프룩토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 42에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 47
글루코스로부터 프룩토스를 생성시키기 위해, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 및 0.05 U F6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 프룩토스의 생성은 실시예 41에서 처럼 정량된다.
실시예 48
수크로스로부터 프룩토스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 및 0.05 U F6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 프룩토스의 생성은 실시예 41에서 처럼 정량하였다.
알트로스
실시예 49
F6P로부터 알트로스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P는 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL P6PE, 1 U/mL 알트로스 6-포스페이트 이소머라제 (Alt6PI), 및 1 U/mL 알트로스 6-포스페이트 포스파타제 (Alt6PP)와 혼합하였다. 반응물을 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. F6P의 알트로스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하는 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인한다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝시킨다.
실시예 50
말토덱스트린으로부터 알트로스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U Alt6PI, 및 0.05 U Alt6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용해 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 알트로스는 실시예 49에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해 검증된다.
실시예 51
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물은 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U Alt6PI, 및 0.05 U Alt6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 알트로스의 생성은 실시예 49에서 처럼 검증한다.
실시예 52
말토덱스트린로부터 알트로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 50에 기술된 반응물에 첨가한다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 50 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U Alt6PI, 0.05 U Alt6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 알트로스의 생성은 실시예 49에서 처럼 검증된다.
실시예 53
말토덱스트린으로부터 알트로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제가 실시예 50에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 54
말토덱스트린으로부터 알트로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 50에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 55
프룩토스로부터 알트로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U P6PE, 0.05 U Alt6PI, 및 0.05 U Alt6PP를 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 알트로스의 생성은 실시예 49에서 처럼 정량된다.
실시예 56
글루코스로부터 알트로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U Alt6PI, 및 0.05 U Alt6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 알트로스의 생성은 실시예 49에서 처럼 검증한다.
실시예 57
수크로스로부터 알트로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U Alt6PI, 및 0.05 U Alt6PP를 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 알트로스의 생성은 실시예 49에서 처럼 정량된다.
실시예 58
수크로스로부터 알트로스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 56의 반응 혼합물에 첨가한다. 알트로스의 생성은 실시예 49에서 처럼 정량된다.
탈로스
실시예 59
F6P로부터 탈로스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P를 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL F6PE, 1 U/mL 탈로스 6-포스페이트 이소머라제 (Tal6PI), 및 1 U/mL 탈로스 6-포스페이트 포스파타제 (Tal6PP)와 혼합한다. 반응물을 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시킨다. F6P의 탈로스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용한 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인한다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝시킨다.
실시예 60
말토덱스트린으로부터 탈로스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U Tal6PI, 및 0.05 U Tal6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 탈로스는 실시예 59에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해 검증된다.
실시예 61
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U Tal6PI, 및 0.05 U Tal6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 탈로스의 생성은 실시예 59에서 처럼 검증된다.
실시예 62
말토덱스트린으로부터 탈로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 60에 기술된 반응물에 첨가한다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 60 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U Tal6PI, 0.05 U Tal6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 탈로스의 생성은 실시예 59에서 처럼 검증된다.
실시예 63
말토덱스트린로부터 탈로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제가 실시예 59에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 64
말토덱스트린으로부터 탈로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 60에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 65
프룩토스로부터 탈로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U F6PE, 0.05 U Tal6PI, 및 0.05 U Tal6PP를 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 탈로스의 생성은 실시예 59에서 처럼 정량된다.
실시예 66
글루코스로부터 탈로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U Tal6PI, 및 0.05 U Tal6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 탈로스의 생성은 실시예 59에서 처럼 정량된다.
실시예 67
수크로스로부터 탈로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U Tal6PI, 및 0.05 U Tal6PP를 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 탈로스의 생성은 실시예 59에서 처럼 정량된다.
실시예 68
수크로스로부터 탈로스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 66의 반응 혼합물에 첨가한다. 탈로스의 생성은 실시예 59에서 처럼 정량된다.
솔보스
실시예 69
F6P로부터 솔보스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P를 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL F6PE, 1 U/mL 솔보스 6-포스페이트 3-에피머라제 (S6PE), 및 1 U/mL 솔보스 6-포스페이트 포스파타제 (S6PP)와 혼합하였다. 반응물을 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. F6P의 솔보스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하는 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인한다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝된다.
실시예 70
말토덱스트린으로부터 솔보스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 및 0.05 U S6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 솔보스는 실시예 68에 기술된 바와 같이 HPLC를 통해서 검증된다.
실시예 71
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 및 0.05 U S6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 솔보스의 생성은 실시예 69에서 처럼 검증된다.
실시예 72
말토덱스트린으로부터 솔보스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 70에 기술된 반응물에 첨가한다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 70 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U S6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 솔보스의 생성은 실시예 69에서 처럼 검증된다.
실시예 73
말토덱스트린으로부터 솔보스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제를 실시예 70에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 74
말토덱스트린으로부터 솔보스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 69에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 75
프룩토스로부터 솔보스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 및 0.05 U S6PP를 함유하는 반응 혼합물50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 솔보스의 생성은 실시예 69에서 처럼 정량된다.
실시예 76
글루코스로부터 솔보스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 및 0.05 U S6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 솔보스의 생성은 실시예 69에서 처럼 정량된다.
실시예 77
수크로스로부터 솔보스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 및 0.05 U S6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 솔보스의 생성은 실시예 69에서 처럼 정량된다.
실시예 78
수크로스로부터 솔보스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 76의 반응 혼합물에 첨가한다. 솔보스의 생성은 실시예 69에서 처럼 정량된다.
굴로스
실시예 79
F6P로부터 굴로스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P를 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL F6PE, 1 U/mL S6PE, 1 U/mL 굴로스 6-포스페이트 이소머라제 (Gul6PI), 및 1 U/mL 굴로스 6-포스페이트 포스파타제 (Gul6PP)와 혼합한다. 반응물을 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시킨다. F6P의 굴로스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용한 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인한다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝된다.
실시예 80
말토덱스트린으로부터 굴로스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U Gul6PI, 및 0.05 U Gul6PP를 함유하는 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 굴로스는 실시예 79에 기술된 바와 같은 HPLC를 통해 검증된다.
실시예 81
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물은 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U Gul6PI, 및 0.05 U Gul6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 굴로스의 생성은 실시예 79에서 처럼 검증된다.
실시예 82
말토덱스트린으로부터 굴로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 80에 기술된 반응물에 첨가한다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 80 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U Gul6PI, 0.05 U Gul6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 굴로스의 생성은 실시예 79에서 처럼 검증된다.
실시예 83
말토덱스트린으로부터 굴소스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제를 실시예 80에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 84
말토덱스트린으로부터 굴로스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트가 실시예 80에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 85
프룩토스로부터 굴로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U Gul6PI, 및 0.05 U Gul6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 굴로스의 생성은 실시예 79에서 처럼 정량된다.
실시예 86
글루코스로부터 굴로스를 생성하기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U Gul6PI, 및 0.05 U Gul6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 굴로스의 생성은 실시예 79에서 처럼 정량된다
실시예 87
수크로스로부터 굴로스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U Gul6PI, 및 0.05 U Gul6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 굴로스의 생성은 실시예 79에서 처럼 정량된다
실시예 88
수크로스로부터 굴로스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제가 실시예 86의 반응 혼합물에 첨가된다. 굴로스의 생성은 실시예 79에서 처럼 정량된다
이도스
실시예 89
F6P로부터 이도스 생성을 검증하기 위해서, 10 g/L F6P는 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/mL F6PE, 1 U/mL S6PE, 1 U/mL 이도스 6-포스페이트 이소머라제 (I6PI), 및 1 U/mL 이도스 6-포스페이트 포스파타제 (I6PP)와 혼합된다. 반응물은 3시간 동안 50℃에서 인큐베이션시킨다. F6P의 이도스로의 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용한 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인된다. 샘플 및 대조군은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분 및 65℃에서 러닝시킨다.
실시예 90
말토덱스트린으로부터 이도스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U I6PI, 및 0.05 U I6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)의 사용으로 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 이도스는 실시예 89에 기술된 바와 같은 HPLC를 통해 검증한다.
실시예 91
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U I6PI, 및 0.05 U I6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이도스의 생성은 실시예 89에서 처럼 검증된다
실시예 92
말토덱스트린으로부터 이도스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 90에 기술된 반응물에 첨가한다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 90 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U I6PI, 0.05 U I6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이도스의 생성은 실시예 89에서 처럼 검증된다
실시예 93
말토덱스트린으로부터 이도스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제를 실시예 90에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 94
말토덱스트린으로부터 이도스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 90에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 95
프룩토스로부터 이도스를 생성하기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U I6PI, 및 0.05 U I6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이도스의 생성은 실시예 89에서 처럼 정량된다.
실시예 96
글루코스로부터 이도스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U I6PI, 및 0.05 U I6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이도스의 생성은 실시예 89에서 처럼 정량된다.
실시예 97
수크로스로부터 이도스를 생성하기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U S6PE, 0.05 U I6PI, 및 0.05 U I6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이도스의 생성은 실시예 89에서 처럼 정량된다.
실시예 98
수크로스로부터 이도스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 96의 반응 혼합물에 첨가한다. 이도스의 생성은 실시예 89에서 처럼 정량된다.
타가토스
실시예 99
F6P로부터 타가토스 생성을 검증하기 위해서, 2 g/L F6P를 5 mM MgCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/ml 프룩토스 6-포스페이트 에피머라제 (F6PE) 및 1 U/ml 타가토스 6-포스페이트 포스파타제 (T6PP)와 혼합하였다. 반응물을 16시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. F6P의 타가토스로의 100% 전환은 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하는 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 확인한다. 샘플은 5 mM H2SO4 중에 0.6 mL/분으로 러니닝시킨다.
실시예 100
말토덱스트린으로부터 타가토스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 aGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 및 0.05 U T6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 타가토스는 굴절률 검출기 및 Agilent Hi-Plex H-컬럼이 구비된 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 사용해 검출 및 정량하였다.++ 이동상은 5 mM H2SO4였고, 0.6 mL/분으로 러닝시켰다. 9.2 g/L 타가토스의 수율이 얻어졌다. 이것은 효소 예컨대 이소아밀라제 또는 4-글루칸 트랜스퍼라제없이 말토덱스트린 분해의 한계체에 기인한 이론적 수율의 92%와 동일하다. 타가토스의 다양한 농도의 표준물을 사용하여 우리 수율을 정량하였다.
실시예 101
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물을 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 aGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 및 0.05 U T6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 타가토스의 생성은 실시예 99에서 처럼 정량하였다. 타가토스의 수율은 이소아밀라제에 의한 말토덱스트린의 전처리로 16 g/L 까지 증가되었다. 이것은 이론적 수율의 80% 와 동일하다.
실시예 102
말토덱스트린으로부터 타가토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 실시예 100에 기술된 반응물에 첨가하였다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 9 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 0.05 U T6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 타가토스의 생성물은 실시예 9에서 처럼 정량하였다. 타가토스의 수율은 IA-처리된 말토덱스트린에 4GT의 첨가로 17.7 g/L 까지 증가되었다. 이것은 이론적 수율의 88.5% 와 같다.
실시예 103
규모 확장을 검토하기 위해서, 50 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 99 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 10 U의 αGP, 10 U PGM, 10 U PGI, 10 U F6PE, 및 10 U T6PP를 함유하는 20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 타가토스의 생성은 실시예 8에서 처럼 정량되었다. 타가토스의 수율은 20 mL 규모에서 37.6 g/L 및 50 g/L 말토덱스트린이었다. 이것은 이론적 수율의 75%와 같다. 이들 결과는 보다 큰 반응 부피로의 규모 확장이 수율의 유의한 손실을 초래하지 않을 것임을 의미한다.
실시예 104
말토덱스트린으로부터 타가토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제를 실시예 100에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 105
말토덱스트린으로부터 타가토스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트를 실시예 99에 기술된 반응물에 첨가한다.
실시예 106
프룩토스로부터 타가토스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U F6PE, 및 0.05 U T6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 타가토스의 생성은 실시예 100에서 처럼 정량된다.
실시예 107
글루코스로부터 타가토스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 및 0.05 U T6PP를 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 타가토스의 생성은 실시예 100에서 처럼 정량된다.
실시예 108
수크로스로부터 타가토스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U F6PE, 및 0.05 U T6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 타가토스의 생성은 실시예 100에서 처럼 정량된다.
실시예 109
수크로스로부터 타가토스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 15의 반응 혼합물에 첨가한다. 타가토스의 생성은 실시예 100에서 처럼 정량된다.
프시코스
실시예 110
F6P로부터 프시코스 생성을 검증하기 위해서, 2 g/L F6P를 5 mM MgCl2 및 80 μM CoCl2 를 함유하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2) 중 1 U/ml P6PE 및 1 U/ml P6PP와 혼합하였다. 반응물을 6시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켰다. F6P의 프시코스로의 99% 전환이 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하는 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해서 확인되었다. 샘플은 5 mM H2SO4 중에서 0.6 mL/분으로 러닝되었다.
실시예 111
말토덱스트린로부터 프시코스의 생성을 검증하기 위해서, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE 및 0.05 U P6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)를 사용한 효소의 여과를 통해 중지시킨다. 프시코스는 굴절률 검출기 및 Agilent Hi-Plex H-컬럼을 구비한 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 사용해 검출되고 정량된다. 이동상은 5 mM H2SO4 이고, 0.6 mL/분으로 러닝된다. 다양한 농도의 프시코스의 표준물을 사용하여 우리의 수율을 정량한다.
실시예 112
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 및 0.1 g/L 이소아밀라제를 함유하는 반응 혼합물은 80℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 이것을 사용하여 20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 U의 aGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 및 0.05 U P6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성은 실시예 111에서 처럼 정량된다.
실시예 113
200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 4.5), 5 mM MgCl2, 및 Novozymes D6 풀룰라나제의 1:200 희석물을 함유하는 반응 혼합물은 50℃에서 4시간 동안 인큐베이션된다. 이것을 사용하여 20 g/L 풀룰라나제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 0.05 U의 aGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 및 0.05 U P6PP를 함유하는 다른 반응 혼합물을 생성시키고 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성은 실시예 111에서 처럼 정량된다.
실시예 114
말토덱스트린으로부터 프시코스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)가 실시예 111에 기술된 반응물에 첨가된다.
20 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 9 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 0.05 U P6PP, 및 0.05 U 4GT를 함유하는 0.2 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성은 실시예 111에서 처럼 정량된다.
실시예 115
규모 확장을 검토하기 위해서, 50 g/L 이소아밀라제 처리된 말토덱스트린 (실시예 10 참조), 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 10 U의 αGP, 10 U PGM, 10 U PGI, 10 U P6PE, 및 10 U P6PP를 함유하는 20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성은 실시예 111에서 처럼 정량된다.
실시예 116
말토덱스트린으로부터 프시코스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 말토스 포스포릴라제가 실시예 110에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 117
말토덱스트린으로부터 프시코스 수율을 더 증가시키기 위해서, 0.05 U 폴리포스페이트 글루코키나제 및 75 mM 폴리포스페이트가 실시예 111에 기술된 반응물에 첨가된다.
실시예 118
프룩토스로부터 프시코스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 프룩토스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 0.05 U 프룩토스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U P6PE, 및 0.05 U P6PP를 함유하는 반응 생성물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성은 실시예 111에서 처럼 정량된다.
실시예 119
글루코스로부터 프시코스를 생성시키기 위해서, 10 g/L 글루코스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리포스페이트, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 0.05 U 글루코스 폴리포스페이트 키나제, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 및 0.05 U P6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성은 실시예 111에서 처럼 정량된다.
실시예 120
수크로스로부터 프시코스를 생성하기 위해서, 10 g/L 수크로스, 50 mM 포스페이트 완충 염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl2, 0.05 U 수크로스 포스포릴라제, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U P6PE, 및 0.05 U P6PP를 함유하는 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 프시코스의 생성물은 실시예 111에서 처럼 정량한다.
실시예 121
수크로스로부터 프시코스의 수율을 더 증가시키기 위해서, 75 mM 폴리포스페이트 및 0.05 폴리포스페이트 프룩토키나제를 실시예 20의 반응 혼합물에 첨가한다. 프시코스의 생성은 실시예 11에서 처럼 정량된다.
본 발명은 실시예 및 도면을 참조하고 실질적으로 전술한 바와 같은 모든 실시형태 및 변이를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시형태가 본 명세서에 개시되어 있지만, 당업자의 통상의 일반 지식에 따라서 본 발명의 범주 내에서 개조 및 변형이 만들어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Bonumose LLC <120> Enzymatic Production of Hexoses <130> 146.0004-WO00 <150> 62/470,605 <151> 2017-03-13 <150> 62/470,620 <151> 2017-03-13 <150> 62/482,148 <151> 2017-04-05 <150> 62/480,798 <151> 2017-04-03 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 149 <212> PRT <213> Clostridium thermocellum <400> 1 Met Lys Ile Gly Ile Gly Ser Asp His Gly Gly Tyr Asn Leu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Ile Ile Asp Phe Leu Lys Lys Arg Glu Tyr Glu Val Ile Asp Phe 20 25 30 Gly Thr Tyr Gly Thr Asp Ser Val Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Leu Lys 35 40 45 Val Ala Glu Ala Val Lys Gly Gly Glu Cys Asp Arg Gly Ile Val Val 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Val Gly Ile Ser Ile Ser Ala Asn Lys Val Pro Gly 65 70 75 80 Ile Arg Ala Ala Val Cys Thr Asn Ser Tyr Met Ala Arg Met Ser Arg 85 90 95 Glu His Asn Asp Ala Asn Ile Leu Ala Leu Gly Glu Arg Val Val Gly 100 105 110 Leu Asp Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp Thr Trp Leu Lys Ala Glu Phe 115 120 125 Gln Gly Gly Arg His Ser Ala Arg Val Gly Lys Ile Gly Glu Ile Glu 130 135 140 Glu Lys Tyr Ser Lys 145 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Symbiobacterium thermophilum <400> 2 Met Arg Ile Ala Ile Gly Asn Asp His Val Gly Thr Glu Met Lys Arg 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ala His Leu Glu Ser Leu Gly His Glu Val Val Asn Phe 20 25 30 Gly Thr Asp Ser Thr Glu Arg Thr Asp Tyr Pro Ile Tyr Gly Glu Arg 35 40 45 Val Ala Arg Ala Val Ala Ala Gly Glu Val Asp Cys Gly Ile Leu Ile 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Val Gly Ile Ser Leu Ala Ala Asn Lys Val Arg Gly 65 70 75 80 Ile Arg Ala Val Val Cys Ser Glu Pro Tyr Thr Ala Arg Leu Ser Lys 85 90 95 Gln His Asn Asn Thr Asn Ile Leu Ala Phe Gly Ala Arg Val Val Gly 100 105 110 Val Asp Leu Ala Lys Met Ile Val Asp Glu Trp Leu Asn Ala Ser Phe 115 120 125 Glu Gly Gly Arg His Gln Arg Arg Val Asp Met Ile Ala Asp Ile Glu 130 135 140 Arg Arg Glu Glu Cys Gly Pro Glu Gly Cys 145 150 <210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Rubellimicrobium thermophilum <400> 3 Met Thr Ser Arg Tyr Asp Ala Val Val Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ile Asp Thr Glu Ser Leu Cys Asn Ala Ala Gly Val Glu Ala Cys Ala 20 25 30 Ala Leu Gly Leu Pro Val Ser Gly Glu Phe Phe Glu Ser Leu Ala Gly 35 40 45 Ile Asp Asp Arg Thr Arg Val Gln Leu Ile Gly Glu His Val Gly Thr 50 55 60 Ala Val Asp Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ala Trp Asp Arg Leu Cys Ile 65 70 75 80 Glu Arg Phe Ala Gln Gly Ile Pro Leu Lys Pro Gly Ala Ile Glu Leu 85 90 95 Leu Glu Gln Ile Ala Ala Ala Gly Ile Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ser 100 105 110 Ser Arg Arg Gly Pro Ala Glu Asp Lys Leu Arg Met Ala Gly Leu Ala 115 120 125 Arg His Phe Arg Thr Val Val Thr Phe Asp Asp Val Ala Ala Pro Lys 130 135 140 Pro Ala Pro Asp Ala Tyr Leu Leu Ala Val Asp Arg Leu Gly Val Pro 145 150 155 160 Pro Ala Arg Ala Leu Ala Phe Glu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Arg Ala 165 170 175 Ala His Ala Ala Gly Leu Thr Val Val Gln Val Pro Asp Leu His Pro 180 185 190 Thr Gln Gly Ala His Ala His His Val Ala Ser Ser Leu Leu Glu Gly 195 200 205 Ala Ala Met Ala Gly Leu Leu Pro Val 210 215 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 4 Met Glu Ala Val Ile Phe 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5 <211> 218 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium saccharolyticum <400> 5 Met Phe Glu Ala Val Ile Leu Asp Met Asp Gly Val Leu Ile Asp Ser 1 5 10 15 Glu Pro Leu His Ile Gln Leu Glu Glu Glu Ile Phe Lys Glu Ile Gly 20 25 30 Ala Asp Ile Ser Leu Glu Glu His Ile Ser Phe Val Gly Thr Thr Ser 35 40 45 His Tyr Met Trp Glu Tyr Val Lys Asn Lys Cys Asn Val Ser Phe Thr 50 55 60 Val Glu Glu Leu Val Glu Met Asp Arg Lys Arg Tyr Phe Asp Tyr Ile 65 70 75 80 Ser Lys His Asp Gly Ala Val Lys Pro Ile Glu Gly Val Asp Glu Leu 85 90 95 Val Lys Glu Leu Tyr Ser Arg Glu Val Arg Leu Ala Val Ala Ser Ser 100 105 110 Ser Pro Ile Asp Val Ile Glu Leu Val Val Lys Lys Leu His Leu Asn 115 120 125 Asp Tyr Phe Cys Glu Leu Val Ser Gly Asp Phe Val Lys Arg Ser Lys 130 135 140 Pro Tyr Pro Asp Ile Phe Leu Tyr Ala Ala Glu Lys Leu Gly Val Ser 145 150 155 160 Pro Glu Arg Cys Leu Val Val Glu Asp Ser Asn Lys Gly Val Leu Ala 165 170 175 Ala Lys Ser Ala Gly Met Lys Val Ile Gly Phe Ile Asn Pro Asn Ser 180 185 190 Gly Asp Gln Asp Ile Ser Met Ala Asp Met Val Ile Arg Ser Phe Ser 195 200 205 Glu Leu Asn Tyr Glu Lys Leu Gln Asn Ile 210 215 <210> 6 <211> 220 <212> PRT <213> Streptomyces thermoautotrophicus <400> 6 Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Leu Gln Ala Val Phe Phe Asp Met Asp 1 5 10 15 Gly Leu Leu Val Asp Thr Glu Pro Thr Trp His Glu Val Glu Ala Glu 20 25 30 Val Met Ala Glu Tyr Gly Tyr Ala Trp Thr Pro Glu Asp Arg Leu Ala 35 40 45 Cys Leu Gly Gly Pro Met Glu Arg Thr Cys Arg Tyr Met Ile Glu Arg 50 55 60 Cys Gly Ala Asp Ile Thr Val Glu Ala Leu Gly Ala Thr Leu Val Glu 65 70 75 80 Arg Met Ala Leu Arg Val Arg Glu Glu Val Ala Val Gln Pro Gly Ala 85 90 95 Lys Glu Leu Leu Ser Glu Leu Ile Glu Ala Gly Val Pro Arg Ala Leu 100 105 110 Val Ser Ser Ser Phe Arg Val Leu Val Asp Ala Val Leu Asp Ala Val 115 120 125 Gly His Asp Leu Phe Val Val Thr Val Ala Gly Asp Glu Val Ala Arg 130 135 140 Ala Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Arg Leu Gly 145 150 155 160 Val Asp Pro Ala Arg Cys Val Val Leu Glu Asp Ser Pro Pro Gly Val 165 170 175 Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Cys Leu Val Val Ala Val Pro Ser Val 180 185 190 Ala Pro Leu Glu Pro Ala Pro Arg Arg Leu Val Val Arg Ser Leu Thr 195 200 205 Glu Leu Ser Leu Asp Arg Leu Arg Ala Leu Ile Ala 210 215 220 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Sphaerobacter thermophilus <400> 7 Met Ser Gln Gly Val Arg Gly Val Val Phe Asp Leu Asp Gly Leu Leu 1 5 10 15 Val Glu Ser Glu Glu Tyr Trp Glu Gln Ala Arg Arg Glu Phe Val Ser 20 25 30 Arg Tyr Gly Gly Thr Trp Gly Asp Asp Ala Gln Gln Ala Val Met Gly 35 40 45 Ala Asn Thr Arg Gln Trp Ser Arg Tyr Ile Arg Glu Ala Phe Asp Ile 50 55 60 Pro Leu Thr Glu Glu Glu Ile Ala Ala Ala Val Ile Ala Arg Met Gln 65 70 75 80 Glu Leu Tyr His Asp His Leu Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Pro Ala 85 90 95 Val Arg Ala Leu Ala Asp Arg Tyr Pro Leu Ala Val Ala Ser Ser Ser 100 105 110 Pro Pro Val Leu Ile Arg Phe Val Leu Ala Glu Met Gly Val Ala Glu 115 120 125 Cys Phe Gln Ser Val Thr Ser Ser Asp Glu Val Ala His Gly Lys Pro 130 135 140 Ala Pro Asp Val Tyr His Leu Ala Cys Glu Arg Leu 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Gly Glu Val Pro Ala Glu Met Val Arg Glu Phe Leu Asp Ile 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Val Leu Gly Gln His Gly Ala Pro Phe Asp Gly Val Val 85 90 95 Glu Leu Leu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ser Arg Trp Gly Ile Val 100 105 110 Thr Asn Lys Pro Glu Ser Leu Ala Arg Gln Leu Leu Pro Gly Leu Gly 115 120 125 Trp Asp Ala Arg Cys Ala Ile Leu Val Gly Gly Asp Ser Leu Pro Glu 130 135 140 Arg Lys Pro His Pro Leu Pro Leu Leu His Ala Ala Gly Gln Leu Gly 145 150 155 160 Val Ser Cys Gln Asp Cys Ala Tyr Val Gly Asp Asp Arg Arg Asp Ile 165 170 175 Glu Ala Ala Arg Ala Ala Gly Met Arg Ser Val Val Ala Leu Trp Gly 180 185 190 Tyr Arg Leu Pro Asp Glu Asn Pro Gln Asp Trp Gly Gly Asp Ala Leu 195 200 205 Ser Pro Thr Pro Gln Ala Leu Leu Asp Trp Pro Leu Pro 210 215 220 <210> 14 <211> 221 <212> PRT <213> Sulfurivirga caldicuralii <400> 14 Met Arg Glu Phe Asp Cys Val Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu 1 5 10 15 Asp Thr Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Ala Leu Asn Thr Leu Gln Lys Gln 20 25 30 Glu Ser Val Pro Leu Thr Pro Tyr Trp Arg Ile Arg Gln Thr Ile Ser 35 40 45 Ser Gly Gly Arg Ala Val Val Lys Leu Gly Phe Pro Asp Ala Asp Asp 50 55 60 Ala Thr Ile Glu Ala Leu Arg Glu Arg Phe Leu Ala Leu Tyr His Glu 65 70 75 80 Asn Ile Ser Val His Thr Asp Leu Phe Pro Gly Leu Glu Lys Val Leu 85 90 95 Thr His Leu Gln Glu Lys Ala Val Pro Trp Gly Ile Val Thr Asn Lys 100 105 110 Pro Ala Trp Leu Thr Asp Lys Leu Leu Gly Glu Leu Asp Leu Pro Ala 115 120 125 Gln Pro Gln Thr Val Val Ser Gly Asp Thr Leu Ala Val Arg Lys Pro 130 135 140 His Pro Glu Pro Met Trp Leu Ala Ala Glu Gln Cys Gly Val Ala Pro 145 150 155 160 Glu Arg Cys Leu Tyr Ile Gly Asp His Pro Arg Asp Ile Glu Ala Pro 165 170 175 Arg Asn Ala Gly Met Gln Ser Ala Ala Ala Leu Tyr Gly Phe Leu Pro 180 185 190 Leu Asp Ala Glu Pro Asp Ser Trp Pro Ala Asp Tyr Arg Tyr His Ala 195 200 205 Pro Ala Asp Ile Leu His His Met Gln Lys Val Phe Pro 210 215 220 <210> 15 <211> 344 <212> PRT <213> Syntrophothermus lipocalidus <400> 15 Met Ala Val Glu Met Gly Pro Glu Met Met Phe Glu Phe Leu Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Pro Ala Gln Phe Glu Gly Cys Leu Lys Met Asp Phe Ser Lys Ala 20 25 30 Ser Gly Leu Lys Lys Glu Tyr Ala Asn Ile Val Val Thr Gly Leu Gly 35 40 45 Gly Ser Ala Ile Gly Gly Asp Ile Leu Arg Cys Tyr Cys Gln Ser Arg 50 55 60 Leu Pro Ile Pro Val Val Val Asn Arg Asp Tyr Met Leu Pro Arg Phe 65 70 75 80 Val Gly Pro Asp Ser Leu Val Leu Ala Val Ser Tyr Ser Gly Asn Thr 85 90 95 Glu Glu Thr Leu Ser Ala Tyr Glu Asp Ala Arg Glu Lys Gly Ala Ser 100 105 110 Ile Ile Ala Phe Thr Thr Gly Gly Lys Leu Ala Glu Met Ala Ala Leu 115 120 125 Asp Gly Asn Pro Val Ile Thr Ile Thr Gly Gly Leu Val Pro Arg Ala 130 135 140 Ala Thr Gly Tyr Leu Phe Ala Pro Leu Val Leu Val Leu Glu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Leu Val Ser Gly Ala Ser Glu Asp Val Lys Glu Thr Val Thr Val 165 170 175 Leu Thr Gln Leu Arg Glu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Glu Glu Asp Ser 180 185 190 Asn Arg Ala Arg Phe Ile Ala Gly Gln Leu Tyr Gln Arg Ile Pro Val 195 200 205 Ile Trp Gly Cys Ser Ser Thr Ser Glu Val Ala Ala Met Arg Trp Lys 210 215 220 Gly Gln Ile Asn Glu Asn Ala Lys Ala Pro Ala Tyr Phe Asn Val Phe 225 230 235 240 Pro Glu Leu Asn His Asn Glu Ile Val Gly Phe Glu Val Pro Glu Asp 245 250 255 Leu Val Lys Lys Leu Ala Val Ile Ile Leu Arg Asp Pro Asp Asp His 260 265 270 Gly Arg Ile Thr Lys Arg Ile Glu Ile Thr Lys Asp Ile Leu Gln Gly 275 280 285 Lys Val Ser Ser Val Ala Glu Val Glu Ala Arg Gly Asn Ser Phe Leu 290 295 300 Ala Lys Thr Tyr Ser Leu Ile Tyr Val Gly Asp Tyr Ala Ser Val Tyr 305 310 315 320 Leu Ala Glu Leu Tyr Gly Ile Asn Pro Thr Pro Val Gln Val Ile Asp 325 330 335 Tyr Leu Lys Ala Arg Met Ala Glu 340 <210> 16 <211> 328 <212> PRT <213> Schleiferia thermophila <400> 16 Met Leu Thr Leu Ile Glu Asn Phe Pro Lys His Leu Val Asp Ala Met 1 5 10 15 Ile Thr Ala Lys Lys Ala Ser Phe Lys Gln Ser Asn Arg Ala Ile Lys 20 25 30 Asn Val Ile Ile Thr Gly Leu Gly Gly Ser Gly Ile Gly Ala Ser Met 35 40 45 Val Gln Asp Leu Leu Ser Pro His Ala Glu Ile Pro Ile Ile Val Asn 50 55 60 Lys Asp Tyr His Leu Pro Ala Phe Ala Asp Glu Asn Thr Leu Val Ile 65 70 75 80 Ala Cys Ser Tyr Ser Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Ala Ala Leu Ala 85 90 95 Glu Ala Glu Glu His Ser Cys Glu Ile Ala Ile Ile Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Thr Leu Leu Gln Met Ala Lys Ser Lys Asn Tyr Asn Tyr Leu Gln Met 115 120 125 Pro Glu Gly Asn Pro Pro Arg Ser Met Ile Gly Tyr Ser Leu Val Tyr 130 135 140 Gln Leu Tyr Met Leu Ala Tyr Tyr Gly Ile Ser Arg Leu Ala Leu Asp 145 150 155 160 Asn Asp Ile Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Leu Glu Phe Arg Glu Lys 165 170 175 Ile Gln Ser Gln Ala Arg Tyr Ile Ala Val Arg Leu His Lys Lys Ile 180 185 190 Pro Ala Val Tyr Ala Cys Ser Gly Phe Gly Ser Leu Ala Glu Arg Phe 195 200 205 Arg Gln Gln Leu Asn Glu Asn Ser Lys Met Leu Ala Trp Asn Gly Thr 210 215 220 Val Pro Glu Met Asn His Asn Glu Leu Val Gly Trp Lys Gly Gly Asp 225 230 235 240 Glu His Phe Ala Ala Ile Phe Ile His Thr Pro Phe Asp Asp Asn Arg 245 250 255 Asn Ala Lys Arg Thr Glu Ile Ser Ser Asn Ile Ile Gln Asn Phe Thr 260 265 270 Ser Gly Val Phe His Ile His Ser Glu Gly Glu Thr Pro Leu Arg Ala 275 280 285 Phe Phe Tyr Leu Ile His Ile Thr Asp Trp Ile Ser Tyr Tyr Leu Ser 290 295 300 Glu Leu Asn Gly Val Asp Val Met Asp Ile Ser Ala Ile Asn Gln Leu 305 310 315 320 Lys Gly Glu Leu Ala Asn Phe Asn 325 <210> 17 <211> 349 <212> PRT <213> Thermodesulfobium narugense <400> 17 Met Asp Lys Asn Val Met Asn Ser Tyr Val Ser Asp Ile Ala Tyr His 1 5 10 15 Met Lys Asp Phe Tyr Lys Asp Leu Thr Phe Tyr Lys Asp Gly Lys Ile 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Ile Glu Asn Leu Ile Phe Leu Gly Ile Gly Gly Ser 35 40 45 Ala Ile Ser Pro Lys Ile Phe Thr Glu Ile Met Asn Ile Asn Lys Lys 50 55 60 Val Tyr Phe Phe Ser Thr Leu Asn Gly Phe Glu Ala Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Ser Thr Ser Phe Val Ile Ala Phe Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Val Glu 85 90 95 Thr Leu Arg Ser Ile Glu Leu Ile Ala Lys Asp Arg Phe Arg Gly Ile 100 105 110 Gly Ile Ser Ser Gly Gly Lys Ile Val Asp Leu Cys Lys Ser Leu Asn 115 120 125 Trp Gln His Ile Ala Val Pro Lys Gly Arg Ala Pro Arg Ala Ala Met 130 135 140 Pro Phe Thr Leu Ser Ile Leu Phe Lys Leu Ala Leu Ser Lys Gly Trp 145 150 155 160 Thr Glu Tyr Asn Glu Asp Asp Phe Trp Asn Asp Ile Ile Glu Leu Ser 165 170 175 Asn Ser Lys Asn Asn Phe Leu Pro Glu Val Asp Phe Glu Asp Asn Val 180 185 190 Ser Lys Arg Ile Ala Tyr Lys Leu Ala Thr Lys Lys Asn Val Ile Ile 195 200 205 Trp Gly Val Glu Ser Ile Ser Lys Asn Ile Ala Tyr Arg Phe Lys Ser 210 215 220 Gln Leu Glu Glu Asn Ala Lys Gln Leu Ser Tyr Tyr Ser Tyr Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ser His Asn Gln Ile Val Pro Ile Ser Leu Val Asp Asn Lys 245 250 255 Glu Glu Tyr Ile Val Leu Ile Phe Arg Ile Pro Gln Leu Glu Ser Val 260 265 270 Leu Val Ser Asn Ile Ile Ser Thr Val Lys Thr Phe Leu Asn Ser Glu 275 280 285 Gly Ile Glu Val Leu Glu Val Phe Gly Ser Gly Lys Asn His Val Leu 290 295 300 Ala Gly Leu Asp Leu Ile Tyr Ser Thr Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Leu 305 310 315 320 Ala Leu Leu Lys Gly Ile Glu Pro Glu Pro Ile Glu Pro Ile Ser Arg 325 330 335 Met Lys Val Ile Leu Asn Asp Asn Leu Arg Lys Ala Leu 340 345 <210> 18 <211> 141 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 18 Met Ala Ile Val Val Gly Ala Asp Leu Lys Gly Thr Arg Leu Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu Gly Phe Glu Val Ile Asp Val 20 25 30 Thr Lys Asp Gly Gln Asp Phe Val Asp Val Thr Leu Ala Val Ala Ser 35 40 45 Glu Val Asn Lys Asp Glu Gln Asn Leu Gly Ile Val Ile Asp Ala Tyr 50 55 60 Gly Ala Gly Pro Phe Met Val Ala Thr Lys Ile Lys Gly Met Val Ala 65 70 75 80 Ala Glu Val Ser Asp Glu Arg Ser Ala Tyr Met Thr Arg Gly His Asn 85 90 95 Asn Ala Arg Met Ile Thr Val Gly Ala Glu Ile Val Gly Asp Glu Leu 100 105 110 Ala Lys Asn Ile Ala Lys Ala Phe Val Asn Gly Lys Tyr Asp Gly Gly 115 120 125 Arg His Gln Val Arg Val Asp Met Leu Asn Lys Met Cys 130 135 140 <210> 19 <211> 312 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 19 Met Arg Ile Ala Ile Gly Cys Asp His Ile Val Thr Asp Val Lys Met 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Phe Leu Lys Ser Lys Gly Tyr Glu Val Leu Asp Phe 20 25 30 Gly Thr Tyr Asp His Val Arg Thr His Tyr Pro Ile Tyr Gly Lys Lys 35 40 45 Val Gly Glu Ala Val Val Ser Gly Gln Ala Asp Leu Gly Val Cys Ile 50 55 60 Cys Gly Thr 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Ile Val Gly Asp Glu Leu Ala Lys Asn Ile Ala 275 280 285 Lys Ala Phe Val Asn Gly Lys Tyr Asp Gly Gly Arg His Gln Val Arg 290 295 300 Val Asp Met Leu Asn Lys Met Cys 305 310 <210> 20 <211> 270 <212> PRT <213> Bacteroides thetaiotaomicron <400> 20 Met Lys Tyr Lys Leu Ile Val Leu Asp Leu Asp Gly Thr Leu Thr Asn 1 5 10 15 Ser Lys Lys Glu Ile Ser Ser Arg Asn Arg Glu Thr Leu Ile Arg Ile 20 25 30 Gln Glu Gln Gly Ile Arg Leu Val Leu Ala Ser Gly Arg Pro Thr Tyr 35 40 45 Gly Ile Val Pro Leu Ala Asn Glu Leu Arg Met Asn Glu Phe Gly Gly 50 55 60 Phe Ile Leu Ser Tyr Asn Gly Gly Glu Ile Ile Asn Trp Glu Ser Lys 65 70 75 80 Glu Met Met Tyr Glu Asn Val Leu Pro Asn Glu Val Val Pro Val Leu 85 90 95 Tyr Glu Cys Ala Arg Thr Asn His Leu Ser Ile Leu Thr Tyr Asp Gly 100 105 110 Ala Glu Ile Val Thr Glu Asn Ser Leu Asp Pro Tyr Val Gln Lys Glu 115 120 125 Ala Phe Leu Asn Lys Met Ala Ile Arg Glu Thr Asn Asp Phe Leu Thr 130 135 140 Asp Ile Thr Leu Pro Val Ala Lys Cys Leu Ile Val Gly Asp Ala Gly 145 150 155 160 Lys 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Val Lys Pro Leu Leu Asp 85 90 95 Glu Leu Ser Glu Lys Gln Ile Thr Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ser Pro 100 105 110 Glu Ile Tyr Ile Glu Thr Val Leu Glu Glu Leu Gly Leu Lys Ser Tyr 115 120 125 Phe Lys Val Thr Val Ser Gly Glu Thr Val Ala Arg Gly Lys Pro Glu 130 135 140 Pro Asp Ile Phe Glu Lys Ala Ala Arg Ile Leu Gly Val Glu Pro Pro 145 150 155 160 His Cys Val Val Ile Glu Asp Ser Lys Asn Gly Val Asn Ala Ala Lys 165 170 175 Ala Ala Gly Met Ile Cys Ile Gly Tyr Arg Asn Glu Glu Ser Gly Asp 180 185 190 Gln Asp Leu Ser Ala Ala Asp Val Val Val Asp Ser Leu Glu Lys Val 195 200 205 Asn Tyr Gln Phe Ile Lys Asp Leu Ile 210 215

Claims (16)

  1. 사카라이드로부터 만노스를 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
    프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 만노스 6-포스페이트 (M6P)로 효소적으로 전환시키는 단계로, F6P의 M6P로의 전환을 촉매하는 효소는 만노스 6-포스페이트 이소머라제 (M6PI) 또는 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제 (PGPMI)로 이루어진 것인 단계; 및
    M6P를 만노스로 효소적으로 전환시키는 단계로, M6P의 만노스로의 전환을 촉매하는 효소는 만노스 6-포스페이트 포스파타제 (M6PP)로 이루어진 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 F6P로 전환시키는 단계를 더 포함하고, 단계는 포스포글루코이소머라제 (PGI)에 의해 촉매되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 더 포함하고, 단계는 포스포글루코뮤타제 (PGM)에 의해 촉매되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계를 더 포함하고, 단계는 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되고, 사카라이드는 전분 또는 이의 유도체, 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 사카라이드를 G1P로 전환시키는 단계에서 적어도 하나의 효소는 알파-글루칸 포스포릴라제 (αGP), 말토스 포스포릴라제, 및 수크로스 포스포릴라제, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 사카라이드는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 및 글루코스, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 전분 또는 이의 유도체인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 전분을 전분 유도체로 전환시키는 단계를 더 포함하고, 전분 유도체는 전분의 효소적 가수분해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 제조되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 4-글루칸 트랜스퍼라제 (4GT)가 방법에 첨가되는 것인 방법.
  9. 제4항에 있어서, 전분 유도체는 이소아밀라제, 풀룰라나제, 알파-아밀라제, 또는 이의 조합에 의해 촉매되는 전분의 효소적 가수분해에 의해 제조되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, M6PI는 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나와 적어도 25%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 M6PI는 F6P의 M6P로의 전환을 촉매하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, PGPMI는 서열번호 15 내지 17 중 어느 하나와 적어도 25%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 PGPMI는 F6P의 M6P로의 전환을 촉매하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, M6PP는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나와 적어도 30%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 M6PP는 M6P의 만노스로의 전환을 촉매하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, PGPMI에 의해 촉매되는 G6P의 F6P로의 전환 단계를 더 포함하고, F6P는 PGPMI에 의해 M6P로 전환되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계들은 약 37℃내지 약 95℃범위의 온도, 약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH, 및/또는 약 8시간 내지 약 48시간 동안 수행되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계들은 단일 생물반응기에서 수행되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계들은 ATP-무함유, NAD(P)(H)-무함유로, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도에서 수행되고, 포스페이트는 재활용되고/되거나, 방법의 적어도 하나의 단계는 에너지적으로 유리한 화학 반응을 포함하는 것인 방법.
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