KR20240104874A

KR20240104874A - 복합 천연자생식물 추출물을 유효성분을 함유하는 혈행 개선 및 혈전 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20240104874A
Application number: KR1020220187530A
Authority: KR
Inventors: 이영익; 이희진; 표수진; 조진숙
Original assignee: (주)리즈바이오텍
Priority date: 2022-12-28
Filing date: 2022-12-28
Publication date: 2024-07-05

Abstract

본 발명은 산딸기(Rubus crataegifolius), 산사(Crataegus pinnatifida), 하고초(Prunella vulgaris), 커피생두(Coffea green bean/Coffea arabica)의 2종 또는 3종 추출물의 유효성분을 함유하는 혈행 개선 및 혈전질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 2종 또는 3종 혼합물은 피브린 형성에 관여하는 트롬빈(thrombin)활성을 억제하며, 프로트롬빈(prothrombin) 시간을 연장하는 혈액 응고 억제 효과를 나타내고, 우수한 혈소판 활성 억제능을 나타냄을 증명하였다. 또한 mouse tail bleeding 실험에서 in vivo, 혈행 개선(bleeding time, bleeding volume, bleeding index) 효능을 입증하였으며, 폐색전증(pulmonary thromboembolism/PTE) 모델을 이용하여 ADP+epinephrine injection에 의한 platelet activation(Cox-1, Cox-2, TXA2) 및 endothelial dysfunction(eNOS/NO) 억제 효능 및 조직학적(폐, 대동맥) 정상화 효능을 증명하였다. 따라서 상기 4종의 천연물 중 2종 또는 3종의 천연물의 유효성분을 혈행 개선용 조성물 또는 혈전질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

복합 천연자생식물 추출물을 유효성분을 함유하는 혈행 개선 및 혈전 예방 또는 치료용 조성물{Pharmaceutical composition for improving blood circulation and preventing or treating blood clots containing plant extracts as active ingredients}

본 발명은 복합 천연자생식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈전 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 산딸기, 산사, 하고초 및 커피 생두 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 혈전질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

혈전(thrombus)은 혈관 속에서 피가 굳어진 덩어리를 말한다. 우리 몸은 여러 가지 혈전형성인자와 조절인자가 균형을 이루고 있어서, 정상인에서는 과도한 혈전이 만들어지지 않는다. 그러나 혈전형성억제에 관여하는 인자들의 균형이 깨지게 되면 혈전이 형성될 수 있다.

혈전질환(thrombus disease) 은 혈전에 의해 발생되는 질환을 말하는 것으로, 동맥경화증, 뇌출혈, 고혈압, 폐색전증, 심장병 뇌졸중, 뇌경색 등이 이에 속한다. 혈전질환의 발명 원인으로는 혈류의 느림, 혈소판 증가, 동맥 손상 등이 있으며, 이들 원인이 단독 혹은 복합적으로 작용하여 혈전질환의 직접적인 원인이 된다.

혈액은 혈장 및 혈구세포로 구성되어 신체 각 조직으로 산소와 영양분을 공급하고 노폐물을 제거함으로써 각 조직의 평형상태를 유지하는 주요한 역할을 담당한다. 또한, 혈장은 혈액 응고와 관련된 응고 인자도 있고 혈소판, 적혈구들과 상호작용을 하고 있다.

지혈은 원래의 형태가 파괴된 혈관으로부터 출혈을 막기 위한 기전으로 혈소판의 활성화 과정, 혈소판과 혈관성분과의 부착, 그에 수반된 혈액응고인자들의 복잡한 상호작용을 거쳐 이루어지며 손상된 혈관을 복원한다[Harlan and Harker, Med. Clin. North. Am., 65:855, 1981]. 한편, 혈소판은 혈관 손상시 콜라겐(collagen), 아라키도닉산(arachidonic acid) 및 ADP(adenosine diphosphate) 등과 같은 각종 응집유도체(agonist)의 자극에 의해 활성화되어 접착 반응(adhesion), 방출 반응(secretion) 및 응집 반응(aggregation)을 일으킨다. 이러한 반응들은 지혈(haemostasis)에 관련되어 있으며, 혈전증(thrombosis)을 포함하는 순환계 질환의 발병에도 관여된다고 알려져 있다.

혈소판은 휴지기(resting) 상태에서 특징적인 원형(discoid) 형태를 가지지만 활성화되면 고유의 모양을 상실하고 허족을 가진 불규칙한 모양을 띄는 모양 변형을 거치게 되며, 세포골격(cytoskeleton)류의 중합(polymerization), 포스포릴레이션(phosphorylation) 및 이에 따른 상호작용의 결과를 나타낸다[Nachmiasetal., Nature, 313:70, 1985]. 혈행 개선의 평가에는 여러 방법이 있으나 주로 사용법이 혈액 응고 억제 평가법과 혈소판 응집 억제 평가법을 사용한다. 혈액응고에서는 혈액 내의 응집인자(coagulation factor)들이 연속적으로 활성화되어 마지막으로 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 변화시킴으로써 혈전(blood clot) 현상을 이루게 되는데 이러한 혈액응고는 접촉시스템(contactsystem)이라 불리는 내인성 경로(intrinsic pathway)와 조직인자(tissue factor)에 의해 활성화를 시작하는 외인성 경로(extrinsic factor)가 존재하며 혈액응고를 유발하게 된다.

색전(embolus)은 혈전이 혈관을 타고 이동하여 몸의 다른 혈관을 막아 일으키는 병적인 상태이다. 주로 다리 근육 속에 생긴 심부정맥의 혈전으로부터 떨어져 나온 색전이 혈관을 따라 이동하다가 심장을 통해 폐로 가는 폐동맥을 막은 상태를 폐색전증이라고 한다. 폐혈관이 막히는 경우, 기계적 도움을 받아야 하는 폐부전(lung failure)으로 이어지고 폐색전(pulmonary thromboembolism)이나 폐혈관 혈전증을 유발하게 된다. 폐동맥이 막히게 되면 산소 교환이 안 되어 숨이 차게 된다. 이러한 동맥 혈전증은 폐색전증 외에 심근경색, 뇌졸증의 현상을 초래하기도 한다.

폐색전증의 증상은 갑작스런 호흡곤란이 가장 흔한 증상이며 호흡곤란을 포함하여 실신, 기침 및 객혈 나타내는 모호하고 특이 하지 않은 초기 증상에 인해 진단이 매우 어려워져, 미국에서는 매년 최소 500,000건이 발생하는 세 번째로 큰 사망의 원인으로 꼽히고 있다.

이러한 폐색전증의 병리 상태는 다음과 같다. 외상, 수술, 움직임 제한, 임신, 유전성 혈전증, 암, 분만 후와 같이 혈액이 지나치게 쉽게 굳어지는 혈류정체와 과응고 상태가 폐색전증의 가장 흔한 원인임이 밝혀지고 있다. 폐색전증의 95%는 다리에서 발생한 심부정맥 혈전증에 의해 유발된다. 심부정맥 혈전에서 떨어져 나온 색전이 폐동맥을 막으면 그 이하 부위의 산소와 이산화탄소의 가스교환에 장애를 초래하여 저산소증을 일으킨다. 색전이 폐동맥을 광범위하게 막은 경우에는 폐동맥으로 혈액을 내보내는데 심장에 과도한 부하가 걸리게 되므로 심장의 기능 저하를 초래하여 저혈압과 쇼크를 유발할 수도 있다.

국내 30세 이상 남녀의 3명중 1명이 대사증후군을 가지고 있다. 이러한 사실은 국내 30세 이상의 남녀들이 많은 비율이 복부비만이거나, 혈압이 높거나, 중성지방이 높거나 좋은 콜레스테롤(HDL)수치가 낮게 나타난다. 또한, 혈당상승으로 인한 당뇨병 환자의 증가도 하고 있다. 이러한 대사증후군의 주된 원인으로, 혈행, 혈전질환에 의한 동맥경화증, 뇌출혈, 고혈압, 폐색전증, 뇌졸증, 뇌경맥 및 비알코올성 지방간에 의한 혈전에 의한 심혈관 질환 등이 있다.

또한, 최근 비알코올성 지방간 질환이 혈전질환의 주원인이 심혈관 질환 발생과 깊은 연관성이 있음이 밝혀지고 있다. 비알코올성 지방간의 조직적인 중증도가 심화될수록 심혈관 질환이 급증한다는 결과가 밝혀지고 있다. 즉, 비알코올성 지방간 질환 환자에서 지방간염 또는 간섬유화로, 질환이 심화될수록 혈전에 의한 심혈관 질환 발생 위험이 급증함이 밝혀지고 있다.

전체적으로 혈관이 손상을 입으면 혈관내피세포의 손상과 혈소판의 활성화가 일어난다. 트롬복산 A2(Thromboxane A2: TXA2), 엔도텔린(endothelin) 및 트롬빈(thrombin)과 같은 혈관 수축 인자들이 분비되어 혈관 평활근 세포의 수축을 유발하여 혈관이 수축된다. 또한, 내피세포 손상으로 산화질소(nitric oxide:NO)의 분비가 줄게 되면 혈관 수축과 혈소판 응집이 일어나게 된다. 폐색전증은 이러한 요인들로 인한 혈관 손상으로 혈전이 생성되어 정맥 혈전에 쌓이게 된다. 이들 혈전이 떨어져 나가 폐동맥을 폐색시킴으로서 색전증으로 인한 질병, 사망이 발생하게 되는 것이다. 이러한 폐색전증은 CT, 초음파, 혈액검사 및 혈관 간염 검사를 통한 진단을 하게 된다.

한편, 몸의 각 기관에 피를 공급하는 역할을 하는 것은 혈관, 이 혈관을 통해 혈액이 이동하는 것을 혈행이라고 하는데, 피가 제대로 순환하지 않으면 몸은 정상적인 기능을 하지 못한다. 혈행이 원활해야 산소와 영양분이 각 기관에 공급되고, 세포의 노폐물이 제거되고, 호르몬이 운반되며, 외부 유해물질이 차단되며, 체온이 유지된다.

혈행개선에는 혈액을 구성하는 혈장 및 혈구세포가 주로 관여한다. 이들 조직은 혈류의 항상성을 유지해 혈관의 손상된 부위나 염증 부위에서 정상적인 지혈과 보호 작용을 유지하고 인체를 정상적으로 가동한다.

그러나 혈장의 지나친 활성화, 혈소판 응집 촉진은 혈류의 항상성을 파괴해 동맥경화, 뇌졸중 등 심혈관계 질환을 야기한다. 또 과도한 지혈작용 및 혈괴의 생성은 혈액의 흐름을 방해해 혈행 이상을 초래하고, 혈전과 같은 병변을 유발한다.

산딸기(Rubus crataegifolius)는 장미과(Rosaceae) 산딸기속(Rubus)에 속하는 낙엽활엽관목으로 우리나라를 비롯하여 중국, 러시아 및 일본에 분포한다. 잎은 난형 또는 타원형이며 흔히 3~5개로 갈라져 있다. 꽃은 흰색 양성화로 6월에 피며, 열매는 집합과로서 둥글고 7~8월에 짙은 붉은빛으로 익는다. 예로부터 열매를 수확하여 식용이나 약용으로 활용하여 왔으며, 황산화 효과와 면역증진 효과가 보고되었다. 산딸기에는 플라보노이드(flavonoid), 탄닌(tannin), 페놀산(phenolic acid)와 같은 폐놀성 화합물과 수용성 색소인 안토시아닌(anthocyanin) 성분이 다량 함유되어 있으며, 각종 약리 작용을 하는 트리테르펜(triterpen)류가 존재하는 것으로 알려져 있다.

산사(Crataegus pinnatifida)는 아가위라고도 불리며 장미과(Rosaceae)에 속하는 붉은색의 산사나무 열매이다. 생김새는 둥글고 붉으며, 회색의 반점이 있다. 산사는 퀘르세틴(quercetin), 히리세틴(hyricetin), 겐티스산(gentisic acid), 카페인산(caffeid acid), 카테킨(catechin), 클로로젠산(chlorogenic acid) 등의 페놀성 물질과 플로로글루시놀(phloroglucinol), 프로토카테큐산(protocatechuic acid), 피로갈롤(pyrogallol) 등의 항산화성 물질, 글루타민산(glutamic acid), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline) 등의 아미노산 및 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등의 무기질을 함유하고 있다. 예로부터 약용 및 식용으로 널리 이용되어 왔으며, 항균활성, 항산화, 지방 전구 세포의 분화억제, 체내 지질 농도 개선, 항고지혈증, 혈관이완효능, 간 손상 예방 등의 생리활성 작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

하고초(Prunella Vulgaris)는 유럽, 아시아, 북서아프리카, 북아메리카의 온대지역 및 열대 산역에 널리 분포되어 있다. 이중 중국에서는 4개의 자생종과 3개의 변형종이 존재한다. 하고초는 카페익산(caffeic acid), 로즈마리닉산(rosmarinic acid), 루틴(rutin), 퀘르세틴(quercetin) 등을 포함하고 있으며, 이러한 항산화 활성 성분으로 예로부터 약용 및 식용으로 널리 사용되어 왔으며, 항산화, 항암, 소염작용, 혈압강화, 이뇨작용 등의 생리활성 작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

커피생두는 green coffee bean이라고 불리우며, 꼭두서니과(Familia Rubiaceae)의 커피속(Genus Coffea)에 속한다. 경제적으로 중요한 커피나무는 2종으로 arabica와 robusta가 있다. 전 세계에 생산되는 커피 중 75-80%가 아라비카이고, 20%가 로브스타이다. 아라비카는 0.8-1.4%, 로브스타는 1.7-4.0%의 카페인을 함유한다. 커피는 다양한 생리활성 물질을 많이 함유하고 있어 산화방지 항고혈암 및 항균 활성이 있으며, 적당한 양의 커피 섭취는 혈중 LDL-콜레스테롤과 malondialdehyde(MDA)의 농도를 낮추고 관상심장질환 예방에 효과적이다.

커피의 생리활성성분은 각성 작용을 나타내는 카페인이 대표적이며, 이외 카테킨(catechin), 안토사이아닌(anthocyanin) 등의 플라보노이드와 다양한 종류의 폴리페놀 화합물이 있다. 카페인은 커피콩의 중요한 알칼로이로 그 함량은 품종에 따라 1-4% 정도 함유되어 있다. 카페인은 중추신경계를 활성화하고 혈액순환을 증가시켜 각성효과를 나타내고 이뇨작용을 유발하며, 위장과 운동성을 증가시키고 떨림, 운동성 감소 등과 같은 파킨슨 증상의 완화에도 효과적이다. 뿐만 아니라 카페인의 함량은 그 쓴맛으로 커피의 품질에도 크게 영향을 미친다. 커피콩에는 다량의 폴리페놀 화합물 함유되어 있으며, 그 중 클로로젠산(chlorogenic acid)이 전 고형분의 약 12%를 차지하며, 탄닌(tannin)과 리그난(lignan) 안토사이아닌이 소량 함유되어 있다. 커피 중 클로로젠산은 산화방지활성을 비롯하여 간 보호 활성, 혈당강하 및 항비러스와 같은 생리기능성이 있는 것으로 보고되고 있다.

상기 천연물의 혈행 개선 또는 혈관 질환 치료 용도에 대한 선행기술로는 일본등록특허 JP 3660833호 "혈행 촉진제"에 장미과산딸기속에 속하는 식물 추출물을 유효성분으로 하는 혈행촉진제가 개시되어 있고, 한국등록특허 KR 10-2117896호 "산사나무 추출물을 포함하는 항혈전용 조성물"에 산사나무 추출물을 포함하는 조성물의 항혈소판 및 항혈전 활성이 개시되어 있으며, 일본공개특허 JP 2004-155700호 "뇌혈관장해 개선제"에는 커피생두에서 추출한 카페이르키나산류의 뇌혈관장해 개선 효과가 개시되어 있다.

상기와 같이, 산딸기, 산사, 하고초 및 커피 생두의 혈행 개선 또는 항혈전 효과에 관한 선행기술은 보고되어 있지만, 이들을 혼합한 복합물의 항혈전 효과에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다.

본 발명자들은 복합 천연물 활용, 혈행 개선 및 혈전질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 연구하던 중 산딸기, 산사, 하고초 및 커피생두의 2종 또는 3종의 혼합물이 이들의 단독 추출물에 비하여 더욱 우수한 혈액 응고 억제 효과, 혈소판 활성 억제효과를 보이며, tail bleeding 실험 및 PTE 실험에서도 현저한 효과가 있음을 확인하였고, 상기 천연복합 추출물의 혈행개선 및 혈전질환의 예방·치료 효능을 증명함으로써, 본 발명의 조성물이 대사증후군 및 비알코올성 지방간에 의한 혈행 개선 및 혈전질환의 예방·치료 효능에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산딸기, 산사, 하고초 및 커피 생두 추출물의 복합물의 혈행 개선 및 혈전질환에 의한 동맥경화증, 뇌출혈, 고혈압, 폐색전증, 뇌졸증, 뇌경색 및 비알코올성 지방간에 의한 혈전에 의한 심혈관 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은, 산딸기 추출물과 산사 추출물과 하고초 추출물 및 커피생두 추출물 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈행 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산딸기 추출물과 산사 추출물과 하고초 추출물 및 커피생두 추출물 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산딸기 추출물과 산사 추출물과 하고초 추출물 및 커피생두 추출물 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈전질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 산딸기 추출물, 산사 추출물과 하고초 추출물 및 커피생두 추출물 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물은 피브린 형성에 관여하는 트롬빈 활성을 억제하며, 프로트롬빈시간을 연장하는 혈액 응고를 억제하고, 우수한 혈소판 활성 억제를 통해 혈행을 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 혈소판 활성화를 억제하고, 내피기능장애를 완화시키며 폐, 대동맥 조직을 정상화시켜 혈행을 개선시키며 심혈관 질환, 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색, 색전증 및 비알코올성 지방간에 의한 심혈관 질환 등 혈전질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도1은 Tail bleeding 실험 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, (a) 체중변화, (b) 출혈시간(Bleeding time:min), (c) 출혈량(Bleeding volume:㎕), (d) 출혈지수(Bleeding index:㎖·min)를 나타낸 그래프이다.
도2는 폐색전증 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 폐 조직의 병리학적 변화를 나타낸 그림이다.
도3은 폐색전증 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 동맥의 두께 변화를 나타낸 그림이다.
도4는 폐색전증 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 동맥 조직에서 COX-1(a), COX-2(b) 발현의 변화를 나타낸 그래프이다.
도5는 폐색전증 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 혈액에서 TXB2(a), PGE2(b) 발현의 변화를 나타낸 그래프이다.
도6은 폐색전증 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 동맥 조직에서 p-eNOS/eNOS 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도7은 마우스를 이용한 Tail bleeding 실험 스케쥴을 보여주는 그림이다.
도8은 마우스를 이용한 색전증 실험 스케쥴을 보여주는 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 산딸기 추출물과 산사 추출물과 하고초 추출물 및 커피생두 추출물 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈행 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명 조성물의 유효성분인 산딸기(Rubus crataegifolius)는 예로부터 열매를 수확하여 식용이나 약용으로 활용되어 왔으며, 황산화 효과와 면역증진 효과가 보고되었다. 산딸기에는 플라보노이드(flavonoid), 탄닌(tannin), 페놀산(phenolic acid)와 같은 폐놀성 화합물과 수용성 색소인 안토시아닌(anthocyanin) 성분이 다량 함유되어 있으며, 각종 약리 작용을 하는 트리테르펜(triterpen)류가 존재하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 산딸기는 장미과 산딸기 속 Rubus crataefolius, R.pungens, R.parvifolius, R.coreanus를 포함한다.

본 발명 조성물의 유효성분인 산사(Crataegus pinnatifida)는 퀘르세틴(quercetin), 히리세틴(hyricetin), 겐티스산(gentisic acid), 카페인산(caffeid acid), 카테킨(catechin), 클로로젠산(chlorogenic acid) 등의 페놀성 물질과 플로로글루시놀(phloroglucinol), 프로토카테큐산(protocatechuic acid), 피로갈롤(pyrogallol) 등의 항산화성 물질, 글루타민산(glutamic acid), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline) 등의 아미노산 및 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등의 무기질을 함유하고 있다. 예로부터 약용 및 식용으로 널리 이용되어 왔으며, 항균활성, 항산화, 지방 전구 세포의 분화억제, 체내 지질 농도 개선, 항고지혈증, 혈관이완효능, 간 손상 예방 등의 생리활성 작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

본 발명의 산사는 산사나무 속 Crataegus pinnatifida, c.macrosperma를 포함한다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 하고초(Prunella Vulgaris)는 다양한 생리활성 물질을 많이 함유하고 있으며, 카페익산(caffeic acid), 로즈마리닉산(rosmarinic acid), 루틴(rutin), 퀘르세틴(quercetin) 등의 산화방지 성분이 많이 함유되어 있다. 예로부터 약용 및 식용으로 널리 이용되어 왔다. 항산화, 항암, 소염작용, 혈압강화 작용이 있는 것으로 보고되고 있다.

본 발명의 하고초는 하고초 속 Prunella vulgaris, P.asiatia Nakai, P.linnaeus, P.hispida을 포함한다.

본 발명 조성물의 유효성분인 커피생두(green coffee bean)는 다양한 생리활성 물질을 많이 함유하고 있어 산화방지 항고혈암 및 항균 활성이 있으며, 적당한 양의 커피 섭취는 혈중 LDL-콜레스테롤과 malondialdehyde(MDA)의 농도를 낮추고 관상심장질환 예방에 효과적이다. 커피의 생리활성성분은 각성 작용을 나타내는 카페인이 대표적이며, 이외 카테킨(catechin), 안토사이아닌(anthocyanin) 등의 플라보노이드와 다양한 종류의 폴리페놀 화합물이 있다.

본 발명의 커피생두는 커피 속 Coffea arabica, C.robusta, C.liberia를 포함한다.

카페인은 커피콩의 중요한 알칼로이로 그 함량은 품종에 따라 1-4% 정도 함유되어 있다. 카페인은 중추신경계를 활성화하고 혈액순환을 증가시켜 각성효과를 나타내고 이뇨작용을 유발하며, 위장과 운동성을 증가시키고 떨림, 운동성 감소 등과 같은 파킨슨 증상의 완화에도 효과적이다. 뿐만 아니라 카페인의 함량은 그 쓴맛으로 커피의 품질에도 크게 영향을 미친다. 커피콩에는 다량의 폴리페놀 화합물 함유되어 있으며, 그 중 클로로젠산(chlorogenic acid)이 전 고형분의 약 12%를 차지하며, 탄닌(tannin)과 리그난(lignan) 안토사이아닌이 소량 함유되어 있다. 커피 중 클로로젠산은 산화방지활성을 비롯하여 간 보호 활성, 혈당강하 및 항비러스와 같은 생리기능성이 있는 것으로 보고되고 있다.

본 발명의 추출물은 하기 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

1) 원료에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

상기 원료는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다.

상기 산딸기는 미숙과일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C2의 저급 알코올일 수 있고, 구체적으로 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

상기 단계 1)의 추출 방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 온도는 40 내지 80℃일 수 있고, 구체적으로 50 내지 70℃일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 추출 용매는 10 % ~ 90 %의 에탄올, 20 % ~ 80 %의 에탄올, 또는 30 % ~ 70 %의 에탄올 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 추출 용매는 추출에 사용되는 원료의 중량에 1 내지 20 배 첨가될 수 있고, 1 내지 10배일 수 있고, 또는 5 내지 15 배 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 추출 시간은 2 내지 10 시간, 3 내지 9 시간, 4 내지 8 시간, 또는 5 내지 7 시간일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회일 수 있고, 3 내지 5회일 수 있고, 예를 들어 2회 반복 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 온도, 추출 시간 또는 추출 횟수의 조건을 벗어난 범위에서는 추출이 충분히 이루어지지 않아 추출물 내에 유효성분의 함량이 미미할 수 있다. 또는 더 이상 추출 수율이 증가하지 않아 추출 작업의 효율이 떨어질 수 있다.

상기 단계 3)의 감압 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 상기 감압 농축 온도는 40 내지 80℃일 수 있고, 구체적으로 50 내지 70℃일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 바람직하게 분무건조 또는 동결건조할 수 있다.

상기 건조는 농축액에 덱스트린을 배합하여 진행될 수 있다.

상기 덱스트린은 10 내지 40%일 수 있고, 구체적으로 20% 내지 30%일 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매의 분획물일 수 있다. 상기 유기 용매는 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로메탄 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 조성물은 산딸기 추출물, 산사 추출물, 하고초 추출물 및 커피 생두 추출물로 이루어진 군 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물이다.

구체적으로 산딸기 추출물과 산사 추출물을 3~5 : 1의 비율로 혼합한 복합물일 수 있고, 산딸기 추출물과 커피생두 추출물을 6~10 : 1의 비율로 혼합한 복합물일 수 있고, 산사 추출물과 커피생두 추출물을 2~3 : 5~7의 비율로 혼합한 복합물일 수 있고, 산딸기 추출물, 산사 추출물 및 커피생두 추출물을 8~10 : 1~3 : 4~6의 비율로 혼합한 복합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 산딸기 추출물과 하고초 또는 하고초 추출물과 커피생두 추출물이 일정비율로 혼합되는 복합물일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 혈전 생성 억제 활성을 나타낸다.

본 발명의 조성물은 혈액 응고 억제 활성 및 혈소판 응집 억제 활성을 나타낸다.

혈액 응고는 혈액이 액체 상태에서 젤라틴 같은 덩어리로 변하는 복잡한 연쇄반응과정이다. 이 과정을 통해 프로트롬빈(prothrombin)이라는 응고인자는 트롬빈(thrombin)으로 전환된다. 트롬빈(thrombin)은 섬유소원인 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 바꾸어 주고, 피브린은 혈소판 마개를 둘러싸는 '그물막'을 형성하게 된다. 적혈구가 이 그물막에 걸리면서 혈병(clot)이 만들어 지고 손상된 혈관을 막게 된다.

혈소판(platelet)은 피가 나오지 못하도록 섬유소를 묶어서 그물 같은 응혈을 만들어서 혈액 응고에 중요한 역할을 하는 고형 성분의 하나이다. 출혈이 생기는 경우 노출된 혈관내피세포의 콜라겐 단백질에 부착(platelet adhesion)되고 '혈소판 마개(platelet plug)'가 형성되기 시작한다. 부착된 혈소판들은 상처 주변으로 여러 종류의 물질들을 방출하여 혈관 수축, 혈소판 응집, 혈액 응고의 지혈 과정을 더욱 촉진시킨다.

상기 혈전질환은 심혈관 질환, 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색, 색전증 및 비알코올성 지방간에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 색전증은 혈전색전증일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 혈전색전증은 폐색전증을 포함한다.

상기 혈전색전증은 혈전에 의해 혈관이 막혀 발생하는 질환으로, 혈관 내피의 손상이나 염증, 동맥경화 등에 의한 혈액의 정체, 응고성이 높아진 경우 발생할 수 있다. 혈전이 발생하면 발생한 부분의 혈관을 좁히거나 혈류를 가로막아 혈액의 흐름을 멈추기도 하며, 하류의 혈관을 막아, 막힌 부분에 장애를 일으키기도 한다.

심장 동맥에 혈전이 생기면 심근경색, 뇌에 혈전이 생기면 뇌졸중이 발생할 수 있고, 혈전이 몸 속을 떠돌아다니다 폐에 자리잡으면 폐색전증을 일으키게 된다.

상기 폐색전증은 심부정맥혈전이라고도 하며, 신체의 다리 깊은 곳에 위치한 정맥에서 생성된 혈전이 정맥 벽에서 떨어져, 혈관을 타고 우심방, 우심실을 경유하여 폐의 혈관으로 이동하여 폐의 혈관을 막아 발생한다. 혈관이 손상을 입으면 혈관내피세포의 손상과 혈소판의 활성화가 일어나고, 트롬복산 (Thromboxane, TXA), 엔도텔린(endothelin) 및 트롬빈(thrombin)과 같은 혈관 수축 인자들이 분비되어 혈관 평활근 세포의 수축을 유발하여 혈관이 수축된다. 또한, 내피세포 손상으로 산화질소(nitric oxide, NO)의 분비가 줄게 되면 혈관 수축과 혈소판 응집이 일어나게 된다. 폐색전증은 이러한 요인들로 인한 혈관손상으로 혈전이 생성되어 정맥 혈전이 쌓이게 된다. 이들 혈전이 떨어져 나가 폐동맥을 폐색시킴으로서 폐색전증으로 인한 질병, 사망이 발생하게 되는 것이다.

본 발명의 조성물은 혈전 활성에 의한 마비 증상을 완화시킬 수 있고, 혈전 형성에 의한 간질성 폐조직을 감소시킬 수 있으며, 동맥 두께 증가를 완화시킬 수 있다.

상기 간질성 폐조직은 폐포와 혈관 사이에 있는 벽인 간질 조직에 염증반응이 일어나면서 생기는 것으로, 폐 간질 조직이 두꺼워지고, 염증 및 섬유화가 진행된 상태인 것을 의미한다.

또한 본 발명의 조성물은 Cycloxygenase(COX)-1, COX-2, Thromboxane B2 (TXB2), Prostaglandin E2(PGE2)의 발현을 감소시킬 수 있으며, endothelial nitric oxide synthase(eNOS)의 인산화를 증가시켜 p-eNOS/eNOS의 비율을 증가시킬 수 있다.

상기 COX(cyclooxygenase)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 변화시키는 효소로서 아라키돈산에 의해 생성되는 물질은 혈관 확장, 발열, 통증, 세포의 증식, 조직세포의 활성화 등 여러 생체 기작에 작용하며, COX-1, COX-2 두 종류가 있다.

COX-1은 대부분 조직에 존재하며, 프로스타글란딘을 생성함으로써 인체의 항상성을 유지하며 혈류 유지, 세포 분화, 점액 생성 등에 관여한다. COX-1을 억제하면 혈소판 응집인자인 TXA2를 막아 항혈소판 작용이 나타나며, COX-2는 주로 염증부위에서 프로스타글란딘 생성과 관련되어 있다. COX-2는 염증이 있을 때 사이토카은으로 유도되며, 특히 PGE2는 염증과 통증의 매개물질로 이용된다.

혈관 내피세포(endothelial cell) 유래 일산화질소(Nitric oxide, NO)는 혈관을 확장시키고 혈관 평활로 세포(Vascular smooth muscle cell)의 증식과 분열을 억제한다고 알려지고 있다. 이러한 NO는 arginine으로부터 eNOS에 의해 생성되는데, eNOS-Ser116의 인산화가 G2/M기 혈관 내피세포의 숫자를 증가시킴으로써 이것이 혈관 내피세포의 증식으로 이어지고 이와 동시에 혈관 내피세포의 이동을 증가시켜 혈관 신생과정을 촉진시킨다.

eNOS-Ser116 인산화와 이에 따른 NO 생산이 혈관 내피세포의 세포주기 조절기전에 중요하며 eNOS-Ser116의 인산화가 G2/M기 혈관 내피세포 숫자를 증가시켜 이에 혈관 내피세포의 증식 이동, 혈관 신생을 촉진시킨다.

본 발명의 용어 "유효성분으로 함유하는"은 산딸기, 산사, 하고초, 커피 생두 추출물의 복합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 상기 복합물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성, 환자의 골 손실 정도와 같은 요인들에 따라 다르며, 당 업자에 의하여 적절하게 선택될 수 있고, 구체적으로 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 갑셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 "투여 대상"은 인간, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 고양이, 개, 마우스, 토끼 등을 포함하지만, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명은 산딸기 추출물과 산사 추출물과 하고초 추출물 및 커피생두 추출물 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈전질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "건강기능식품" 이란, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 또는 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조하는 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리 기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에 공지된 다양한 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 추출물을 첨가하여 제조 가능하다.

본 발명의 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액체 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 혈전질환의 예방 또는 개선 효능을 가지므로 혈전질환의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 상기 혈전질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 혈전질환을 개선시킬 수 있다.

상기 건강기능식품은 혈전질환의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비 인간동물, 조류, 또는 어류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.

구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 산딸기 추출물, 산사 추출물, 하고초 추출물 및 커피생두 추출물의 2종 또는 3종 복합물이 외인계 응고인자(PT), 내인계 응고인자(aPTT), 공통 최종 응고인자(TT)를 억제하여 혈액 응고 억제 효과를 보임을 확인하였고(표1), 혈소판 응집 촉진 물질인 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제하였다(표2). 이는 혈소판을 덩어리로 단단하게 만드는 역할을 하는 단백질(혈액응고인자)과 혈소판의 활성을 억제하여 혈전 생성을 저해하는 것을 의미한다.

또한 Tail bleeding 실험 모델에 본 발명의 복합물을 투여한 경우, 체중감소가 완화되고, 출혈시간, 출혈량 및 출혈지수가 증가함을 확인하였다(도1). 아울러, 폐색전증 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간질성 폐조직이 개선되고(도2), 동맥 두께 증가가 완화되며(도3), 동맥 조직에서 COX-1, COX-2 발현이 감소하고(도4), 혈액에서 TXB2, PGE2 발현이 감소하며(도5), 동맥 조직에서 eNOS의 인산화가 증가하여 p-eNOS/eNOS 비율이 증가함(도6)을 확인하였다. COX-1을 억제하면 혈소판 응집인자인 TXA2를 막아 항혈소판 작용이 나타나며, COX-2 억제는 염증과 통증을 유발하는 PGE2의 생성이 억제된다. 또한 eNOS의 활성 저하는 혈관 내피세포의 기능장애의 원인이 된다. 따라서 본 발명의 산딸기, 산사 및 커피생두 추출물의 복합물이 COX-1, COX-2, TXB2, PGE2의 발현을 감소시키고, eNOS 인산화를 증가시킴으로써 혈전질환의 치료에 활용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<비교예1> 산딸기 추출물의 제조

건조된 산딸기 미숙과에 8배(wt/v) 부피의 50% 주정을 첨가하여 60℃에서 8, 6시간씩 2회 환류 추출하여 각각의 추출액을 얻고, 상기 추출액을 40 mesh, 45㎛ 필터로 여과한 뒤 여액을 rotary evaporator를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 이 농축액에 20% 덱스트린을 배합하고 분무 건조하여 산딸기 추출물을 제조하였다.

<비교예2> 산사추출물의 분획물 제조

건조된 산사에 10배(wt/v) 부피의 70% 주정을 첨가하여 60℃에서 8, 6시간씩 2회 환류 추출하여 각각의 추출액을 얻고, 상기 추출액을 40 mesh, 45㎛ 필터로 여과한 뒤 여액을 rotary evaporator를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 당(Sugar)제거를 위해서 이 농축액에 H₂O를 첨가하여 10 brix로 희석한 후에 비극성 대공극 레진(D101)을 이용하여 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. D101 레진을 95% 에탄올로 활성화시키고 물로 평형화시킨 뒤, 상기 희석액을 컬럼에 로딩하고, H₂O로 2회 수세하여 당(Sugar)을 제거하고, 45% 주정으로 2회 용출시켜 결과물로서 진한 갈색의 분획을 얻었다. 상기 분획물을 rotary evaporator를 사용하여 60℃에서 감압 농축한 후, 농축액에 40% 덱스트린을 배합하고 분무 건조하여 산사 추출물의 분획물을 제조하였다.

<비교예3> 하고초 추출물의 제조

건조된 하고초에 8배의(w/v) 50% 주정을 첨가, 60℃에서 8, 6시간씩 환류 추출하여 각각의 추출액을 얻고, 상기 추출액을 40 mash, 45㎛ 필터로 여과한 뒤, 여액을 감압 농축하였다. 이 농축액에 20% 덱스트린을 배압하고 분무건조하여 하고초 추출물을 제조하였다.

<비교예4> 커피생두(Coffee Arabica) 추출물의 제조

건조된 커피생두(에티오피아;KOCHERE)에 10배(wt/v) 부피의 50% 주정을 첨가하여 60℃에서 8, 6시간씩 2회 환류 추출하여 각각의 추출액을 얻고, 상기 추출액을 40 mesh, 45㎛ 필터로 여과한 뒤 여액을 rotary evaporator를 사용하여 60℃에서 감압 농축하였다. 이 농축액에 20% 덱스트린을 배합하고 분무 건조하여 커피생두 추출물을 제조하였다.

<실시예1>

상기 비교예의 산딸기 추출물과 산사 추출물을 4 : 1의 비율로 혼합하여 실시예 1을 제조하였고, 상기 복합물을 Rc+Cp라 하였다.

<실시예2>

상기 비교예의 산딸기 추출물과 커피생두 추출물을 8 : 7의 비율로 혼합하여 실시예 2를 제조하였고, 상기 복합물을 Rc+GCB라 하였다.

<실시예3>

상기 비교예의 산딸기 추출물과 하고초 추출물을 9 : 6의 비율로 혼합하여 실시예 3를 제조하였고, 상기 복합물을 Rc+Pv라 하였다.

<실시예4>

상기 비교예의 산딸기 추출물, 산사 추출물 및 커피 생두 추출물을 9:2:5의 비율로 혼합하여 제조하였고, 상기 복합물을 Rc+Cp+GCB라 하였다.

<실시예5>

상기 비교예의 산딸기 추출물, 하고초 추출물 및 커피생두 추출물을 8:6:4의 비율로 혼합하여 실시예 5를 제조하였고, 상기 복합물을 Rc+Pv+GCB라 하였다.

<실험예1> 항응고 활성 측정

사람 혈액 채취

실험예 1의 항응고 활성 및 실험예 2의 혈소판응집 억제능을 조사하기 위하여. 혈장은 최근 1개월 동안 약물 투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4℃에서 5,000g로 5분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신성동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 본 발명의 상기 실시예 1 내지 5의 복합물의 항응고 활성을 조사하기 위하여, 에이피티티 타임(activated Partial Thromboplastin Time, aPTT), 프로트롬빈 타임(Prothrombin time, PT) 및 트롬빈 타임(Thrombin Time, TT)를 측정하였다. 항응고 활성은 Amelung coagulometer KC-1A(일본)를 이용하여 혈액 응고 시간을 측정하여 평가하였으며, TT, aPTT 및 내인성 혈액 응고 시간 PT 외인성 혈액 응고 시간을 측정하였다.

프로트롬빈 타임(Prothrombin Time, PT), 트롬빈 타임(Thrombin Time, TT) 및 에이피티 타임(activated Partial Thrombin Time, aPTT)을 이용하여 어떠한 물질 또는 천연물이 응고 캐스케이드(cascade)의 내인성 경로에 영향을 주는지는 평가할 수 있다.

<1-1> 트롬빈 타임(Thrombin Time, TT) 측정

트롬빈 타임(Thrombin Time, TT)은 37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A(일본)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 ㎕를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. 상기의 방법으로 항응고 활성 정도를 여러 가지 농도에서 TT를 측정하여 확인하였고, 그 결과 복합물이 항응고 활성을 보임을 확인하였다(표1).

<1-2> 에이피티티 타임(activated Partial Thromboplastin Time, aPTT) 측정

에이피티티 타임(activated Partial Thromboplastin Time, aPTT)은 혈장 100 ㎕와 다양한 농도의 시료 추출액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A(일본)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50㎕ CaCl₂ (35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료대신 DMSO를 사용하였다. 그 결과 본 발명의 복합물이 혈액응고를 억제함을 확인하였다(표1).

<1-3> 프로트롬빈 타임(Prothrombin time, PT) 측정

프로트롬빈 타임을 표준 혈장(MD pacific Co.,china)으로 70 ㎕와 다양한 농도의 시료액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A(일본)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130 ㎕의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co.,USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. 본 발명의 복합천연물의 항응고 활성 정도를 추출물의 여러 가지 농도에서 TT, PT, aPTT를 측정해본 결과, 본 발명의 복합물이 항응고 활성을 가진다는 것을 확인하였다(표1).

Treatment	Dose (mg/ml)	TT	PT	aPTT
DMSO	-	1.00±0.01	1.00±0.00	1.00±0.02
Aspirin	5	>15	>15	>15
Aspirin	2.5	4.58±0.07	1.62±0.06	1.43±0.05
실시예1 (R+Cp)	5	>15	>15	>15
	2.5	>15	>15	3.01±0.14
	1.25	1.01±0.03	1.19±0.00	1.74±0.05
실시예2 (R+CGB)	5	>15	>15	6.70±0.14
실시예2 (R+CGB)	2.5	1.42±0.06	1.64±0.03	2.50±0.18
실시예3 (R+PV)	5	>15	>15	>15
	2.5	>15	>15	>15
	1.25	1.43±0.04	1.27±0.06	2.1±0.19
실시예4 (R+Cp+CGB)	5	>15	>15	11.09±0.14
	2.5	>15	1.70±0.00	2.13±0.02
	1.25	1.05±0.03	1.03±0.00	1.64±0.09
실시예5 (R+Pv+CGB)	5	>15	>15	>15
	2.5	>15	>15	>15
	1.25	2.63±0.19	2.53±0.06	2.16±0.07

_{프로트롬빈 타임(Prothrombin Time, PT), 트롬빈 타임(Thrombin Time, TT), 에이피티 타임(activated Partial Thrombin Time, aPTT)}

표1에서 나타난 바와 같이 실시예1 및 실시예2,3,4,5 모두 외인계 응고인자(PT), 내인계 응고인자(aPTT), 공통 최종 응고인자(TT)를 억제하여 우수한 혈액응고 억제효과를 보였다.

<실험예2> 혈소판 응집억제 저해 활성 측정

콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제하는 복합추출물의 혈소판 응집 억제 저해 활성 측정하였다. 혈소판은 응집유도체(트롬빈(thrombin), ADP, 콜라겐(collagen) 및 리스토세틴(Ristocetin)에 의해 자극되면 응집이 일어난다. 실험관 내(in vitro)에서 이러한 반응을 측정하고자 할 때에는 응집 검출계(aggregometer)를 이용하여 광투과(Light transmission)를 측정한다. 구체적으로 혈소판을 분리하여 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma PRP) 또는 WP(washed platelet)를 조제한 후 사용한다. PRP 및 WP의 광투과를 0%, PPP(platelet poor plasma), 서스펜션 버퍼(suspension buffer)의 광투과를 100%로 해서 혈소판 응고 억제에 관한 실험을 할 수 있다.

혈소판 응집저해 활성(Platelet aggregation inhibition activity)을 확인하기 위하여 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% 시트르산 나트륨 용액과 1:9의 비율로 혼합하였다. 채취한 혈액을 원심 분리기를 이용하여 PPP(3,000 × 15분) & PRP(1,000 × 10분) 혈장을 얻었다. Chrono-Log 응집검출계을 이용하여 PRP 450 ㎕은 스틸 바를 넣은 후, 이를 플라스틱 큐벳에 넣어 37℃에서 5분간 반응시켰다. 그런 다음 혈소판응집 촉진 물질인 콜라겐(2 ㎕/㎖)과 복합추출물을 여러 가지 농도별로 넣고 교반하면서 37℃에서 5분간 측정하였다. 반응 종료 후 응집제를 삽입한 시점과 종료시간을 설정하여 앰플리튜드(%)를 구하였다. 혈소판이 모두 다 응집했을 EO의 빛 투과율은 100%이고, 혈소판이 응집하지 않았을 때의 빛 투과율은 0%였다. 그 결과 본 발명의 복합추출물이 혈소판 응집 촉진 물질인 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제하였다(표2).

Treatment	Conc. (μg/ml)	inhibition of Aggregation(%)
collagen	5	0.0±0.0
Aspirin	250	89.6±1.8
Aspirin	125	86.4±0.9
Aspirin	62.5	85.1±0.9
실시예1 (R+Cp)	250	93.5±0.0
실시예1 (R+Cp)	125	85.1±2.8
실시예2 (R+CGB)	250	94.8±1.8
실시예2 (R+CGB)	125	69.5±2.8
실시예3 (R+Pv)	250	95.2±0.9
실시예3 (R+Pv)	125	88.6±1.7
실시예4 (R+Cp+CGB)	250	96.1±0.0
실시예4 (R+Cp+CGB)	125	68.2±2.8
실시예5 (R+PV+CGB)	250	97.7±1.7
실시예5 (R+PV+CGB)	125	85.3±1.4

표2에서 나타난 바와 같이 산딸기+산사, 산딸기+커피생두, 산딸기+하고초, 추출물은 강력한 혈소판 응집억제 저해 효능을 보였다.

또한 산딸기+산사+커피생두 및 산딸기+하고초+커피생두 추출물도 강력한 혈소판 응집억제 저해 효능을 보였다.

<실험예3> 혈액 순환 억제 개선 효과

혈관 색전증(vascular thrombosis)은 혈관(blood vessel)내에 혈액 응집(blood clot)이 생기는 것을 나타내며, 이러한 혈액 응집은 뇌졸중이나 심장 마비등의 원인이 된다. 이러한 현상으로 항응고제(anti-coagulant) 및 항 혈소판제(anti-platelet)의 처리가 중요하며 Coagulation cascade를 억제하여, 뇌졸중 및 심혈관 질환의 발생을 억제할 수 있다. 이러한 심혈관 및 뇌졸중을 억제시키는 항응고 및 항 혈소판 효능의 동물모델에서의 검증은 여러 모델에서 활용될 수 있으며, 이중 bleeding time 분석 실험이 행하여진다. 이러한 실험 model은 체내에 혈행의 응고·응집(coagulation aggregation cascade) 현상을 밝혀주며, 본 연구에서 활용되는 복합물의 anti-thrombosis/anti-coagulation 역량을 측정하는 동물모델로 활용될 수 있다.

Bleeding assay는 일반적으로 동물을 활용하여 in vivo 하게 platelet의 haemostatic(지혈)작용을 측정하는 방법으로 anti-platelet drug 처리후에 물질의 혈액 순환 효능을 검증하기 위하여 실행하는 실험이다. 보통 mouse의 꼬리(tail)를 절단하여 출혈이 일어나게 한 다음 출혈이 자연히 멈출 때까지의 시간을 측정하는 것이다. 출현의 정지는 haemostatic plug 형성을 의미하며 적절한 혈소판 수, 혈소판의 혈관 내벽에의 부착, 혈소판 응집능, 모세혈관의 적절한 기능에 달려 있다. 혈소판 수, 기능(혈소판 접착, 응집력, 방출력), 모세관 혈관벽의 수축성과 저합성 및 분포 상태에 좌우되므로 in vivo하게 실시하는 혈소판 검사의 screening test 할 수 있다.

Tail bleeding 실험은 tail 끝에 작은 절개를 내어 피가 멈출 때까지의 시간을 측정하는 것으로 피부절개가 나면, 혈소판의 상처부위의 기저막(basement membrane)과 조직의 collagen에 부착하고, 그 위에 또 다른 혈소판의 응집이 되어 혈소판이 점점 쌓이게 됨으로써, 지혈(hemostatic) plug가 만들어져 지혈이 된다. 고로 출혈시간은 주로 혈소판 수와 기능에 관련된 in vivo 혈액순환의 DATA라 할 수 있다.

본 발명의 복합물의 혈행 개선에 의한 혈전질환 예방 및 치료의 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물의 유효성을 평가하기 위하여, mouse를 이용한 tail bleeding 실험을 실시하였다. 실험동물(mouse, rat)에서의 채혈 한계량은 순환 혈액량의 10% 이내이어야 하며, mouse 및 rat에서의 순환한계량은 각각 63-80ml/kg, 58-70ml/kg이다. 또한 한번 채취가 가능한 최대 채혈량은 순환혈액량의 10%미만이다. Tail bleeding 실험에서는 1-3mm 미만의 꼬리를 절단하며, 전신마취를 활용한다. 본 실험에서는 rat 및 mouse 활용 방법은 tail cut는 꼬리의 0.5~1.0mm 한정 하는 것이 좋으나, 최대 5mm까지 절단이 가능하다. 본 실험에서는 mouse를 활용하여 tail bleeding 실험을 실시하였다. 꼬리의 절단으로 반복 채혈도 가능하나, 본 연구에서는 복합 천연물에 의해 최대 순환 혈액량(bleeding vol.) 및 최대 순환 혈액 time을 결정하기 위하여 단일 절단 방법을 활용하였다.

실험은 도7과 같은 실험 스케쥴로 실시하였다.

구체적으로, 5주 된 mouse를 8마리씩 8그룹으로 나누어 실험을 실시하였으며, 각 그룹의 투여량은 다음과 같다.

G1(Normal), G2(Aspirin : 16.7 ㎎/㎏),

Test group : 단일, 복합 천연물 추출물 투여

비교예1(Rubus : 155 ㎎/㎏), 비교예2(Crataegus : 155 ㎎/㎏), 비교예3(Coffee green bean : 155 ㎎/㎏), 비교예4(Prurella vularis : 155 ㎎/㎏), 실시예1(Rc+Cp/4:1 ; 124+31 ㎎/㎏), 실시예2(Rc+GCB/8:7 ; 80+70 ㎎/㎏), 실시예3(R+Pv/9:6 ; 90+60 ㎎/㎏), 실시예4(Rc+Cp+GCB/9:2:5 ; 90+20+50 ㎎/㎏), 실시예5(R+Pv+GCB/8:6:4 ; 80+60+40㎎/㎏)를 14일간 경구 투여하였다.

mouse의 체중(body weight)은 g 단위로 측정하였으며, 14시간 절식시킨 후 다시 경구 투여하였다. 2시간 후 모든 mouse의 마취를 실시하였다. 0.2㎖의 avertin( 60 ㎎/㎖ stock solution ; 2,2,2-tribromo -ethanol) intraperitoneal injection으로 실시하였다. 10분 후에 각 mouse의 체중 측정하며, bleeding time을 측정하였다. 꼬리부분을 10mm 절제 한 후에 15㎖ conical tube(37℃ isotonic saline이 들어있는)에 넣어 bleeding time을 측정하였다. 꼬리 절제 20분 후에 각 실험동물의 체중을 측정(tail 포함) 하였으며, 실험 시간 중의 blood loss는 체중감소로 측정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 복합물은 체중감소를 완화시키고, 출혈시간, 출혈량 및 출혈지수를 증가시켰으며, 이는 본 발명의 복합물이 혈액 순환을 증가시킴을 의미한다(도1).

<실험예4> 색전증(thromboembolism) 치료 효과

<4-1> 폐색전증 동물모델

실험동물은 생후 5주령의 sprague-Dawley종 수컷 흰쥐 72마리를 대상으로 하였다. 8마리씩 9그룹으로 나누었다. 도8과 같은 schedule로 PTE 실험을 진행하였다. 구체적으로,

① 시험물질 투여(1일 1회 경구투여로 7일간 진행)

② 12시간 절식시키고

③ 시험물질 경구투여(R+C)

④ 1시간 후 Collagen(150㎍)+epinephrine(3㎍)을 꼬리 점막에 주사

⑤ 15분간 폐동맥 경색에 의한 마비의 지속 또는 마비로부터의 회복 여부 관찰 및 시험물질의 폐색전증(pulmonary thromboembolism)에 대한 효과 확인

<4-2> 폐색전증으로 인한 마비증상 보호 효능 검증

PTE mouse 제작 후 시험물질 처리는 다음과 같이 하였다.

비교예1(Rubus : 155 ㎎/㎏), 비교예2(Crataegus : 155 ㎎/㎏), 비교예3(Coffee green bean : 155 ㎎/㎏), 비교예4(Prurella vulgaris : 155 ㎎/㎏), 실시예1(Rc+Cp/ 4:1 ; 124+31 ㎎/㎏), 실시예2(Rc+GCB/ 8:7 ; 80+70 ㎎/㎏), 실시예3(Rc+Pv/9:6 ; 90+60 ㎎/㎏), 실시예4(Rc+Cp+GCB/9:2:5 ; 90+20+50 ㎎/㎏), 실시예5(Rc+Pv+GCB/ 8:6:4 ; 80+60+40 ㎎/㎏) 농도로 처리하였다.

구체적으로 mouse에 collagen+epinephrine 혼합용액을 주사하면, 혈전 형성에 의하여, 급성 폐경색이 발생하며, 전신마비를 거쳐 15분 이상 마비가 진행된다. 본 발명의 조성물을 투여하여 마비 증상 보호 효과를 관찰하였다.

그 결과, 정상 대조군에 비해 collagen+epinephrine에 의해 PTE가 유도된 대조군에서는 8마리 중 7마리가 마비증상을 나타내어 12.5%의 보호 효과만 나타냈다. aspirin 군에서는 8마리 중 2마리만 마비증상을 나타내어 75%의 보호효과를 나타내었다. 비교예1 내지 4 처리군은 각각 37.5, 50, 50, 37.5%의 보호효과를 보였다. 반면, 실시예1, 2, 3, 4 처리군에서는 각각 75% 의 보호효과를 보였다. 또한, 실시예5 처리군에서는 87.5%의 높은 보호효과를 보였다.

본 발명에서는 정상군에 비해 ADP+epinephrine 처리군에서 마비증상이 높게 나타나지만(no. of paralyzer;7/8), 추출물 처리시 폐색전증에 의한 마비의 보호효과가 있음을 확인하였다. 특히, 실시예5 처리시 마비 보호효과가 현저함을 확인하였다(표3).

Group			Dosage (mg/kg)	No of paralyzer	protection (%)
Ⅰ	Normal	vehicle	-	0/8	100
Ⅱ	PTE(ADP+epinephrine injection)	vehicle	-	7/8	12.5
Ⅲ	PTE(ADP+epinephrine injection)	Aspirin	10.35	2/8	75.0
Ⅳ	PTE(ADP+epinephrine injection)	비교예1 (RF)	155	3/8	37.5
Ⅴ	PTE(ADP+epinephrine injection)	비교예2 (Cp)	155	4/8	50.0
Ⅵ	PTE(ADP+epinephrine injection)	비교예3 (Vp)	155	4/8	50.0
Ⅶ	PTE(ADP+epinephrine injection)	비교예4 (GCB)	155	3/8	37.5
Ⅷ	PTE(ADP+epinephrine injection)	실시예1 (R+C)	124+31	2/8	75.0
Ⅸ	PTE(ADP+epinephrine injection)	실시예2 (R+GCB)	80+70	2/8	75.0
Ⅹ	PTE(ADP+epinephrine injection)	실시예3 (R+Vp)	90+60	2/8	75.0
XI	PTE(ADP+epinephrine injection)	실시예4 (R+Cp+GCB)	90+20+50	2/8	75.0
XII	PTE (ADP+epinephrine injection)	실시예5 (R+Vp+GCB)	80+60+40	1/8	87.5

<4-3> 폐 조직학적 변화 확인

실험동물의 폐 조직학적 변화를 확인하기 위하여 폐 조직을 떼어내어 10% 포르말린에 24시간 이상 고정시킨 후 파라핀 블록을 만들어서 5㎛로 절단하여 슬라이드를 만들었다. 폐 조직 슬라이드들을 헤마톡시린(hematoxylin)과 에오진(eosin)을 이용하여 헤마톡시린-에오진 염색(H&E staining)을 하여 광학 현미경을 이용하여 병리학적 검사를 하였다. (*자동화기기를 사용조직에 paraffin을 침투시켰다. 침투가 완료된 조직은 embedding center에서 paraffin block을 제작하였다.)

폐병변(혈관 내 혈전 생성이 많이 될수록 폐포 크기가 작아지게 된다)에 대한 혼합추출물의 효과를 확인한 결과, 도2에 나타낸 바와 같이 콜라겐과 에피네프린을 투여하여 폐병변을 유발시킨 군(대조군)에서는 정상 대조군에 비해 심한 간질성 폐조직(간질이 두꺼워지고 염증 및 섬유화가 진행되는 상태)을 보이며, 혈관 내 혈전이 관찰되었다(N, PTE). 반면, 아스피린군에서는 폐병변이 대조군에 비하여 실질 증가 및 혈전 형성이 눈에 띄게 감소하였다(ASP).

비교예1 내지 4 처리군(Rc, Cp, GCB, Pv)에서도 간질성 폐조직 감소현상을 보였으며, 실시예1 내지 3 처리군에서 강한 간질성 폐조직 감소 현상을 보였다(R+C, R+Pv, R+CGB). 특히, 실시예4 및 5 처리군(R+C+CGB, R+Pv+GCB)에서 Aspirin 보다 강력한 간질성 폐조직 감소 혈전 감소 현상을 보였다.

<4-4> 동맥조직학적 두께 변화 확인

상기 폐색전증 유도동물에서 준비한 실험동물의 조직학적 두께변화를 확인하기 위하여 동맥을 분리하여 -70℃에서 얼려 block을 만든 후 freeze cuter(동결절단기)를 활용하여 cutting을 하였다. 이렇게 제조된 동맥 조직 slide는 H&E staining을 하여 광학현미경을 이용, 동맥 두께를 확인하였다.

동맥 두께 변화에 대한 비교예 및 실시예의 효과를 확인 결과, 도3에서 나타난 바와 같이 collagen+epinephrine 투여하여 폐병변을 유발시킨 대조군에서는 정상군에 비해 혈관 내 탄력섬유 간격이 많이 벌어져 있어 혈관 벽이 두꺼워짐을 확인하였다(도3, PTE). 한편 비교예 및 실시예 투여군에서는 정상 대조군과 유사하게 두께가 감소되는 효과를 보였다. 비교예1~4, 실시예1~3에서 혈관벽 두께가 감소함을 보였으며, 실시예1~5에서도 혈관벽 두께 감소를 보였으며, 특히, 실시예4 및 5 처리군에서 동맥 두께의 뚜렷한 감소현상을 보였다.

<실험예5> 폐색전증(PTE) 모델 동물에서의 platelet activation, endothelial dysfunction 억제 효능 확인

본 발명자는 collagen+epinephrine으로 색전증을 유도했을 때, 동맥에서 COX-1, COX-2의 단백질 발현 정도와 이에 따른 혈장에서의 TXA2, PGE2 생성 정도를 확인하였다. 동물의 동맥으로부터 단백질 추출을 위하여, 아래 과정을 수행하였다.

1)Tissue extract buffer에 protease inhibitor(100X)와 phosphate inhibitor(100X)를 첨가한 후 이 buffer를 이용하여, 동맥에서 protein을 추출한다.

2)PMSF(Phenyl methyl sulfony fluoride, protease inhibitor)는 isopropanol에 100 mM로 제조하고, 사용 직전에 1 mM이 되도록 희석하여 사용한다.

3)Tissue extract는 tissue 1 g 당 buffer 10 ml을 사용한다.

4) 동맥 lysate는 BCA Protein assay로 단백질 정량을 실시한다.

5) 각 sample이 10 ug-protein이 되도록 만들고 sample buffer(5X)를 1X가 되도록 넣어준 후 90 ℃에서 protein denaturation 시킨다.

<5-1> Cycloxygenase-1, 2(COX-1. 2) 측정

PTE 동물 모델에서 aorta를 채취한 후 aorta에서 protein을 추출하여 Western blot을 진행하였다. endogenous proteases로부터 protein이 파괴되는 것을 방지하기 위해 inhibitor cocktail을 첨가하였다. Membrane에 COX-1 rabbit monoclonal antibody (Primary antibody)를 처리하고, 이후 anti-rabbit HRP conjugate IgG (Secondary antibody)를 처리한 후 ECL solution으로 밴드를 가시화 한 후 정량분석 하였다. 웨스턴블롯으로 분석하여 COX-1, COX-2 발현 정도를 측정하여 도4에 나타내어 정량화하여 그래프로 나타내었다(COX-1;A, COX-2;B).

그 결과 도4A에 나타난바와 같이 COX-1 발현은 정상군(N)에 비해 PTE 유도 대조군에서 발현이 4.9배 증가하였으며, Aspirin 처리군에서는 2.7배 증가하였다(PTE 처리군에 비하여, Aspirin 처리군이 55.1% 감소하였다). 비교예1 내지 4 처리군에서는 각각 3.6배, 3.9배, 3.2배 및 3.0배 증가하여 정상대조군과 비교하여 통계적으로 낮은 유의성을 가지고 감소하였으나, 실시예1 내지 5 처리군에서는 각각 2.2배, 2.5배, 2.0배, 2.0배 및 1.8배 증가로 PTE 처리군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였음을 알 수 있다.

또한, 도4B에 나타난바와 같이 COX-2 발현은 정상군에 비해 PTE 유도 대조군에서 발현이 6.2배 증가하였으며, Aspirin 처리군에서 2.5배 증가하였다(PTE 처리군에 비해 Aspirin 처리군이 60% 감소하였다). 비교예1 내지 4 처리군에서는 정상군에 비해 각각 4.7배, 5.0배, 4.0배 및 3.8배 COX-2 발현이 증가하였으나, 실시예1 내지 5 처리군에서는 각각 3.4배, 3.8배, 3.6배, 3.2배 및 2.9배로 실시예 처리군이 PTE에 의한 COX-2 발현을 유의적으로 감소함을 확인하였다.

<5-2> Thromboxane B2 (TXB2), Prostaglandin E2(PGE2) 생성 측정

PTE 동물 모델에서 채혈 후 분리한 plasma에 indomethacin (prostaglandin synthetase inhibitor)을 첨가한 후 -80℃에 보관하였다. TXA2는 불안정한 상태이므로 TXA2의 안정적인 대사산물인 TXB2를 측정하였다. Thromboxane B2 ELISA kit (Cat# ab133022)를 이용하여 TXB2 정량을 실시하였다. 검출범위는 13.7 pg/ml - 10000 pg/ml으로, rat plasma sample은 20배 희석하여 진행하였다.

Prostaglandin E2 ELISA kit (Cat# ab287802)를 이용하여 PGE2 정량을 실시하였다. 31.25 pg/ml - 2000 pg/ml, rat plasma sample은 10-15배 희석하여 진행하였다.

확인 결과, 도5A, B의 폐색전증을 유도한 대조군에서 COX-1, COX-2의 증가로 인해 혈전 생성물질인 TXA2(TXB2) 및 PGE2를 많이 만들어 내는 것을 확인할 수 있었다. 또한 비교예 및 실시예 처리시 TXB2 및 PGE-2 합성이 줄어드는 것을 확인하였다.

상기 결과는 collagen+epinephrine에 의해 유도된 PTE 현상이 비교예 및 실시예 처리시 유의하게 감소함을 의미하며, 본 발명 복합물의 항혈전 효능을 보여주는 것이다.

<5-3> Endothelial dysfunction 측정

Endothelial dysfunction을 확인하기 위하여, eNOS 및 p-eNOS 발현양을 Western Blotting으로 측정한 후에, p-eNOS/eNOS ratio를 측정하였다.

구체적으로, Tissue extract buffer에 protease inhibitor(100X)와 phosphate inhibitor(100X)를 첨가한 후 이 buffer를 이용하여, 동맥에서 protein을 추출하였다. PMSF(Phenyl methyl sulfony fluoride, protease inhibitor)는 Isopropanol에 100 mM로 제조하고, 사용 직전에 1 mM이 되도록 희석하여 사용하였다. Tissue extract는 tissue 1 g 당 buffer 10 ml을 사용하였다.

동맥 lysate는 BCA Protein assay로 단백질 정량을 실시하였다. 각 sample이 10 ug-protein이 되도록 만들고 sample buffer(5X)를 1X가 되도록 넣어준 후 90 ℃에서 protein denaturation 시켰다.

Denaturation 시킨 sample은 SDS-PAGE (8%)를 이용해 분리하고, PVDF membrane으로 이동시켰다. membrane에 total eNOS rabbit monoclonal IgG(eNOS 측정), 또는 ⓟeNOS rabbit monoclonal IgG(ⓟeNOS 측정)를 상온에서 2시간 처리한 뒤 ECL solution으로 밴드를 가시화하였다.

그 결과, 도6에서와 같이, 비교예1 내지 4 처리군은 ⓟ-eNOS/eNOS ratio가 PTE group보다 효능이 유의하게 높지 않으나, 실시예1 내지 5 처리군에서는 ⓟ-eNOS/eNOS ratio가 2배 이상이었고, 이는 eNOS의 인산화가 높게 일어남을 의미한다.

상기 결과는 본 발명 실시예의 복합물이 NO 생산량을 증가시키고, 혈관을 확장시키며, 혈관 내피 세포 숫자를 증가시켜 신혈관 생성을 촉진시키는 효능을 나타냄을 의미한다.

Claims

산딸기(Rubus cratagegifolius ; Rc) 추출물, 산사(Crataegus pinnatifida ; Cp) 추출물, 하고초(Prunella vulgaris ; Pv) 추출물, 커피생두(Coffea arabica/Coffee green bean ; GCB) 추출물로 이루어진 군 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈행 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 2종 복합물은 산딸기 추출물 및 산사 추출물을 혼합한 복합물; 산딸기 추출물 및 커피생두 추출물을 혼합한 복합물; 또는 산딸기 추출물 및 하고초 추출물을 혼합한 복합물인 것을 특징으로 하는, 혈행 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 3종 복합물은 산딸기 추출물, 커피생두 추출물 및 산사 추출물을 혼합한 복합물; 또는 산딸기 추출물, 커피생두 추출물 및 하고초 추출물을 혼합한 복합물인 것을 특징으로 하는, 혈행 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 혈행 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 추출물의 분획물인 것을 특징으로 하는, 혈행 개선용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 분획물은 n-핵산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 에틸아세테이트, 디클로메탄, 부타놀로군으로부터 선택된 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매의 분획물인 것을 특징으로 하는, 혈행 개선용 약학적 조성물.
산딸기(Rubus cratagegifolius, Rc) 추출물, 산사(Crataegus pinnatifida, Cp) 추출물, 하고초(Prunella vulgaris) 및 커피생두(Coffee green bean, GCB;Coffea arabica) 추출물로 이루어진 군 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈행 개선용 건강기능식품 조성물.
산딸기 추출물, 산사 추출물, 하고초 및 커피생두 추출물로 이루어진 군 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 혈전질환은 심혈관 질환, 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색, 색전증 및 비알코올성 지방간에 의한 심혈관 질환으로 이루어진 군 중 어느 하나 인 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 색전증은 폐색전증을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈전 생성 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈소판 응집(platelet aggregation) 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈액 응고(blood coagulation) 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈전 혈성에 의한 마비 증상을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈전 형성에 의한 간질성 폐조직을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈전 형성에 의한 동맥 두께 증가를 완화시키는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 Cycloxygenase(COX)-1, COX-2, Thromboxane B2 (TXB2), Prostaglandin E2(PGE2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 혈전질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
산딸기 추출물, 산사 추출물, 하고초 추출물 및 커피생두 추출물로 이루어진 군 중 2종 또는 3종을 혼합한 복합물을 유효성분으로 함유하는 혈전질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.