KR20240062035A - 화상병 저항성 사과대목 기내 대량증식 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사과 왜성대목 품종인 G.11 및 G.30의 액아(Axillary bud)로부터 채취한 생잠점 배양으로부터, 신초 형성 유도, 유식물체 분화 유도, 발근 유도하는 단계에서 우수한 생육 특성을 갖는 최적의 배지 조성을 제공하고, 배양묘를 기외순화하여 정상적인 생육특성을 나타내는 과수 화상병 저항성 사과대목의 대량 배양 증식 방법에 관한 것으로, 본 발명의 생산방법은 각 배양 단계에 적합한 배지 및 배양 조건을 이용함으로써, 기본 배지에서 배양하는 경우보다 신초형성률, 신초 생장, 발근율이 우수하고 낮은 갈변율을 보이므로, 본 발명의 사과대목 대량증식 방법은 과수 화상병 저항성 사과대목의 대량 증식에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 화상병 저항성 사과대목으로 육성한 G대목(G.11, G.30)의 대량증식 배양 방법에 관한 것으로, 과수 화상병 저항성 사과대목의 생장점 배양으로부터 신초 형성 유도, 유식물체 분화 유도, 발근 유도하는 단계에서 우수한 생육 특성을 갖는 최적의 배지 조성을 제공하고, 유식물체를 기외순화하여 정상적인 생육특성을 나타내는 화상병 저항성 사과대목 대량증식 배양 방법에 관한 것이다.
사과목(Malus pumila Miller)은 주요 과수원예작물 중 하나로 전체 과실생산액의 23%를 차지하고 있으며, 최근 사과 가격의 호조, 신규 과원 조성시 지자체의 지원 등으로 재배면적이 증가하고 있다. 이와 더불어 우량 사과묘목의 필요성 또한 증대되고 있으며, 사과묘목의 생산은 농업분야의 고부가가치 산업으로 인식되고 있다. 그러나 사과를 포함한 영년생 과수묘목은 2~3년간 번식 및 육묘하여 종묘가 보급되고 있으나 기지현상에 의해 연작이 어렵고, 산업화 및 도시화로 이동해야 할 대규모 육묘장 확보가 매우 어려워 묘목산업이 대규모화 되지 못하고 영세하다. 또한, 국내 대부분의 과수 묘목 재배 방식은 시설이 아닌 일반 노지에서 재배하는 방식이므로 환경의 영향을 상당히 많이 받는다. 또한 사과 묘목은 접목을 이용하여 번식시키므로 대목과 접수가 필요하며 사과 대목은 삽목이 어렵기 때문에 증식을 위해 취목(휘묻이)을 이용하게 되는데, 이 경우 균일한 대목의 확보가 어렵다.
과수화상병(Fire blight disease)은 식물병원세균 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) (Burrill 1882)에 의해 발생하는 과수병해로, 사과, 배, 살구, 자두, 라즈베리 등 장미과에 속하는 과수나무들을 기주로 하여 매우 큰 손실을 초래하는 대표적 식물병원세균 병해이다. 에르위니아 아밀로보라는 배나무 또는 사과나무 등의 과수에서 화상병을 야기하는 그람 음성(Gram-negative) 식물병원균으로, 에르위니아 아밀로보라의 대표적인 증상으로 잎은 시들고 흑색으로 변하여 마르며, 줄기나 열매도 처음에는 수침상의 병반이 생기고 움푹 들어가며 열매가 시들어가며 화상을 입은 것처럼 검게 변한다. 에르위니아 아밀로보라는 곤충이나 비바람에 의해 전염되어 꽃, 꿀샘, 기공, 피목, 상처 등을 통해 기주체로 침입하기 때문에 전염성이 높고, 대목의 흡지를 통해서 감염이 되어 대목을 통해서 지상부의 접수 품종으로 전염되고, 배나무, 사과나무, 살구나무 등 70여종의 식물을 침해할 수 있다는 특징이 있어 세계적으로 화상병에 대한 피해가 발생하고 있다.
화상병의 발생은 1780년 미국 동부 지역에서 최초로 보고된 이래, 지중해 연안 나라들을 포함한 다수의 유럽국가에서 발생하였으며, 최근에는 중국과 경계지역인 중앙아시아 카자흐스탄과 키르키스탄에서도 발생된 것으로 최종 확인되었다. 국내의 경우 2015년 처음 보고된 이래로 2020년 전국적으로 면적 394.4 ha, 15개 시·군에서 발생되었으며, 사과 주산지인 경북 안동, 충남 예산과 당진 등까지 신규 발생하여 전국적으로 확산되는 추세이다.
과수는 영양계 번식을 주로 하는 작물이며, 주요 과수가 대목을 이용한 접목 묘목을 양성하고 있어 대목 증식 중 과수화상병균 등 세균의 오염에 의한 과원의 피해가 발생할 우려가 매우 높다. 화상병은 당해의 수확을 망칠 뿐만 아니라, 장기간의 타격도 줄 수 있다. 꽃의 감염은 과일을 말려 죽여, 당해의 수확을 감소시키고 어린 가지의 화상은 다음해의 과수가 열릴 가능성을 감소시킨다. 많은 과수 품종의 뿌리와 줄기에 있어서 화상은 큰 가지나 나무 전체 마저도 파괴할 수 있다. 과수 수확에 대한 화상병의 잠재적인 영향을 감안해 봤을 때, 이 질병에 대한 해결책이 절실한 상황이다.
종래의 선행기술로서 대한민국 등록특허 제10-2200064호는 본 발명자에 의한 것으로 사과 왜성대목 품종 M.9 또는 M.26의 액아로부터 채취한 생장점 배양 방법을 이용하여 사과 왜성대목 품종 무독묘 대량 증식 방법을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1641301호는 생장점 유래 식물체를 배양하여 정상 식물체를 유도하기 위한 배지를 제공하고, 사과목 생산기간을 단축할 수 있는 사과목 대량 증식 방법을 개시하고 있다.
과수 화상병은 뚜렷한 방제재가 없는 실정으로 국내에서는 개화 전·후 항생제를 이용한 예방, 겨울철 궤양 증상의 사전 제거와 같은 방법으로 방제하고 있으며, 국내 대부분의 사과 재배 농가에서 이용되는 M.9, M.26 등 왜성대목은 과수 화상병에 매우 취약한 고도 감수성 품종으로 과수 화상병 저항성 품종으로 대체할 필요가 있다.
식물체는 여러 종류의 기관 즉 뿌리, 줄기, 잎, 화기 등으로 구성되어 있는데 모든 기관이 분화능(을 가지고 있으나, 기관의 종류에 따라 분화능력에 차이가 있기 때문에 적절한 배양기관의 선정은 대단히 중요한데, 대부분 경정부(정단부, Shoot tip), 액아(곁눈, Axillary bud), 잎 절편(엽편, Leaf segment)등을 이용하여 배양한다. 식물이 가지고 있는 고유의 분화능력을 전형성능(全形成能, Totipotency,)이라 하는데, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만 세포 조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양 환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 나므로, 식물의 종류 또는 품종의 종류에 따른 배양 조건의 최적화가 필요하다.
특히 식물의 조직이나 기관이 기내(器內, 배양 시험관이나 유리병과 같은 배양용기 상태)라는 특수한 환경에서 생장 증식하기 위해서는 여러 영양분이 필요한데, 영양분의 요구되는 식물의 종류에 따라 또는 배양조직이나 기관의 종류에 따라서 차이가 나므로 배양하고자 하는 식물이나 조직의 특성에 맞는 배지를 개발하여야 한다. 본격적으로 식물 조직배양을 위한 배지가 제조되고 개발된 것은 Murashige와 Skoog(1962)에 의해서 인데, MS 배지라고 불리는 이 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형 있게 배합한 배지로써 식물 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되고 있다. 이러한 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 최적의 배지조성을 선택하여 배양하여야 하며, 이 때 기본배지 이외에도 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 식물생장조절제 등을 첨가하거나 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 사용하는 것이 필요하다.
이에 따라 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 및 어린 식물체 생산을 위해서 배양단계별 G.11 및 G.30대목에 적합한 조직배양 최적 배지 조성을 연구하였다.
이에 따라 본 연구는 사과 왜성대목의 안정적인 생산 및 공급을 위해 과수 화상병에 저항성이 있으면서 내한성 및 조기 수확성 등 품질이 우수한 대목인 G.11 및 G.30대의 우량 건전묘 생산기술 개발 및 과수화상병 저항성 대목의 무병화묘 모수 양성 연구를 한 결과, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 및 유식물체 생산을 위해서 배양단계별 G.11 및 G.30대목에 적합한 조직배양 최적 배지 조성 및 배양 조건을 개발하였고, 상기 본 발명의 각 단계별 배지에서 조직배양을 하면 신초 형성률, 엽수, 신초 생존율, 유식물체 생존율, 유식물체의 신초수, 뿌리 형성율, 뿌리 수, 뿌리길이에서 모두 우수한 생육특성을 나타내는 것을 확인하였고, 더하여 기외 순화에 최적의 환경과 토양종류를 선발하였고 과수 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법을 완성하였다.
본 발명의 목적은 과수 화상병 저항성 사과대목의 생장점 배양으로부터 신초 형성 유도, 유식물체 분화 유도, 발근 유도하는 단계에서 우수한 생육특성을 갖는 최적의 배지 조성을 제공하고, 배양묘의 기외 순화의 적정 토양에 의한 대량 증식 배양 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
화상병 저항성 사과대목의 액아(Axillary bud)로부터 생장점을 채취하고, 채취한 생장점을 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), BAP (6-benzylamino purine), NAA(naphthalene acetid acid), PPM(Plant Preservative Mixture), 수크로스(sucrose), 한천(agar), 젤라이트(gelrite)를 포함하는 제1 MS배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
상기 생육된 신초를 아스코르브산, 미오이노시톨, 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP, 제아틴(zeatin), IBA(Indole-3-Butyric Acid), GA3(Gibberellic acid), PPM, 수크로스, 한천, 젤라이트를 포함하는 제2 MS배지에 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
상기 유식물체를 아스코르브산, IBA, IAA(indolacetic acid), PPM, 수크로스, 한천, 젤라이트를 포함하는 제3 MS배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
상기 발근이 유도된 배양묘를 기외순화시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 화상병에 저항성이 있는 G.11 및 G.30 품종의 생장점 배양을 이용한 기내 대량 증식 방법이며, 각 배양 단계에 적합한 배지 및 배양 조건을 이용함으로써, 기본 배지에서 배양하는 경우보다 생존율, 신초 형성률, 신초 생장, 발근율이 우수하고 낮은 갈변율을 보이므로, 본 발명의 무병묘 생산 방법은 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 액아의 생장점을 치상한 사진이다.
도 2는 본 발명에 의한 생장점으로부터 신초 형성이 된 사진이다.
도 3는 본 발명에 의한 유식물체 분화된 사진이다.
도 4은 본 발명에 의한 발근 배양이 된 사진이다.
도 5는 본 발명에 의한 기외 순화가 된 사진이다.
도 6은 본 발명에 의한 화상병 저항성 사과대목의 조직 배양 단계를 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 의한 생장점으로부터 신초 형성이 된 사진이다.
도 3는 본 발명에 의한 유식물체 분화된 사진이다.
도 4은 본 발명에 의한 발근 배양이 된 사진이다.
도 5는 본 발명에 의한 기외 순화가 된 사진이다.
도 6은 본 발명에 의한 화상병 저항성 사과대목의 조직 배양 단계를 나타낸 순서도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은
화상병 저항성 사과대목의 액아(Axillary bud)로부터 생장점을 채취하고, 채취한 생장점을 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), BAP (6-benzylamino purine), NAA(naphthalene acetid acid), PPM(Plant Preservative Mixture), 수크로스(sucrose), 한천(agar), 젤라이트(gelrite)를 포함하는 제1 MS배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
상기 생육된 신초를 아스코르브산, 미오이노시톨, 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP, 제아틴(zeatin), IBA(Indole-3-Butyric Acid), GA3(Gibberellic acid), PPM, 수크로스, 한천, 젤라이트를 포함하는 제2 MS배지에 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
상기 유식물체를 아스코르브산, IBA, IAA(indolacetic acid), PPM, 수크로스, 한천, 젤라이트를 포함하는 제3 MS배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
상기 발근이 유도된 배양묘를 기외순화시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법을 제공한다.
상기 사과대목은 G.11 대목 또는 G.30 대목을 사용할 수 있다.
대목은 과원을 개원할 경우를 제외하고는 교체할 수 없는 고정된 것이므로 과수재배에 있어서 품종의 선정 못지 않게 중요한 결정을 내려야 하는 것이 대목의 선정이다. 대목에 따라 사과나무는 다양한 크기로 자라기 때문에 대목종류에 따라 심어야 할 나무숫자가 다르고 정지전정 방법이 달라지며 결실관리, 토양관리 방법 등이 달라진다. 따라서 대목을 선택하기 전에 그 특성을 잘 알아야 한다. 특히 고려해야 할 중요한 특성은 나무의 왜화도, 불량환경적응성, 병해충저항성, 조기결실성과 생산성, 과실품질, 지지력, 번식성 등이다.
접목에 이용되는 대목에는 일반대목과 왜성대목이 있는데, 보통재배에서 사용하는 일반대목의 종류에는 환엽해당, 삼엽해당, 야광나무(매주나무), 사과실생 등이 있고, 왜성대목에는 M 계통, MM 계통, MAC 계통, CG 계통, G 계통, 마크계통, O 계통, V 계통, P 계통, BUD 계통, JM 계통 등이 있다.
왜성대목은 유전적으로 키가 작은 성질을 지닌 대목이다. 사과나무 재배 시 일반적으로 관리가 편하고 나무를 많이 심기 위해 왜성대목에 재배를 원하는 품종의 나뭇가지(접수)를 붙여 나무 크기를 작게 자라도록 한다. 1970년대 후반부터 사과의 왜화재배가 장려, 보급됨에 따라 왜성대목의 수요가 급격히 늘어나고 있다. 국내에 유통되는 대목은 대부분 국외에서 도입된 M.9와 M.26이며, 이들 대목은 잦은 기상 이변에서는 환경에 잘 적응하지 못하는 문제가 있고, 과수 화상병에 매우 취약한 품종이다.
대목에 따라 역병이나 화상병 등 병발생에 차이가 있다. M.9 는 역병에 거의 걸리지 않으나 M.26이나 MM.106은 약하다. 특히 배수 불량지에 발생이 많으며 우리나라에서는 흰날개무늬병과 함께 주요한 토양병해이다. 미국에서 매우 심각한 병의 하나인 화상병은 대목의 흡지를 통해서 감염이 되어 대목를 통해서 지상부의 접수품종으로 전염된다고 한다. M.9, M.26, Mark 대목은 이병에 매우 약하며 M.27이나 M.7은 중간정도의 저항이다.
생장점(growing point)은 새로운 줄기와 잎을 만드는 부분으로, 보통 식물 줄기의 끝부분에 있고, 뿌리의 끝부분에도 있으며, 아직 가지로서 자라지 않은 겨드랑이눈 등의 눈 끝에도 생장점이 존재한다. 즉, 생장점은 슈트 중의 가장 어린 부분으로서, 아직 줄기와 잎으로 분화하지 않은 곳인데, 여기에 식물의 정단 분열 조직이 있다.
생장점은 보통 '돔형'이라고 하는 산 모양으로서, 그 곁에서 잎이 발생한다. 그러나 생장점의 모양은 매우 다양하여, 높은 돔형(속새)으로부터 보통 볼 수 있는 낮은 돔형, 또한 평탄한 형에서 역으로 다소 움푹 팬 모양에 이르기까지 여러 가지 형태가 있다. 따라서, 생장점의 높이나 넓이도 매우 다양하다. 이와 같은 높이와 넓이의 기준은 명확히 밝혀져 있지는 않지만, 일반적으로 생장점의 높이는 가장 어린 잎이 붙어 있는 부분의 윗부분 높이를 말하며, 넓이는 그 붙어 있는 부분에서의 지름을 가리킨다.
본 발명에서 사용된 배지는 MS(Murashige and Skoog) 배지를 기본으로 사용할 수 있다.
상기 MS 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형 있게 배합한 배지로써 식물 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되는 배지이다. 상기 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 최적의 배지조성을 선택할 수 있다. 이때 첨가 및 함량이 변화되는 구성물은 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제가 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 MS 배지에 첨가되는 여러 형태의 당류는 탄수화물 합성 능력이 없는 배양 조직의 에너지원으로 작용하며, 조직배양 시 사용되는 당의 종류에는 수크로오스(Sucrose), 글루코오스(Glucose), 프럭토오스 (Fructose), 말토오스(Maltose) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 중 수크로오스(Sucrose)는 물에 용해되고 고압 멸균되는 과정에서 단당류인 글루코오스와 프럭토오스로 분해되며, 배양체의 세포막에서 방출되는 인버테이즈(Invertase, 역전효소; 이당류인 수크로오스를 단당류인 프럭토오스와 글루코오스로 가수분해하는 효소)나 세포외효소(Eextracellular enzyme)에 의해 가수분해 되면서 배양체가 흡수하기 용이한 형태로 바뀌기 때문에 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 배양단계 및 배지 조성에 따라 기본배지에 첨가되는 수크로오스의 농도가 달라야 하며, 또한 배지 내 삼투압 조절과도 관련이 있으므로 정확한 첨가 농도의 확인이 필요하다.
본 발명의 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법에 있어서, 상기 제1 MS배지는,
4 내지 5 g/L 농도의 MS 배지에, 아스코르브산 0.05 내지 0.15 g/L, 미오이노시톨 0.05 내지 0.15 g/L, BAP 1.5 내지 2.5 mg/L, NAA 0.01 내지 0.1 mg/L, PPM 0.05 내지 0.15 mg/L, 수크로스 25.0 내지 35.0 g/L, 한천 5.0 내지 10.0 g/L, 젤라이트 0.1 내지 0.5 g/L를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법에 있어서,
상기 제2 MS배지는,
4 내지 5 g/L 농도의 MS 배지에, 아스코르브산 0.05 내지 0.15 g/L, 미오이노시톨 0.05 내지 0.15 g/L, 티아민 HCl 0.1 내지 1.0 mg/L, BAP 0.1 내지 1.0 mg/L, 제아틴 0.1 내지 1.0 mg/L, IBA 0.1 내지 0.5 mg/L, GA3 0.05 내지 0.15 mg/L, PPM 0.05 내지 0.15 mg/L, 수크로스 25.0 내지 35.0 g/L, 한천 5.0 내지 10.0 g/L, 젤라이트 0.1 내지 0.5 g/L를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법에 있어서,
상기 제3 MS배지는,
0.5 내지 2.0 g/L 농도의 MS 배지에, 아스코르브산 0.05 내지 0.15 g/L, IAA 1.0 내지 3.0 mg/L, IBA 0.1 내지 0.5 mg/L, PPM 0.05 내지 0.15 mg/L, 수크로스 25.0 내지 35.0 g/L, 한천 5.0 내지 10.0 g/L, 젤라이트 0.1 내지 0.5 g/L를 첨가하여 제조할 수 있다.
식물생장조절제(植物生長調節, Plant growth regulators)는 식물생장에 관여하는 식물호르몬을 총칭하는데, 옥신류(Auxin)류, 시토키닌(Cytokinin)류, 지베렐린(Gibberellin)류, 앱시스산(Abscisic acid) 등이 포함된다. 식물 조직배양 시에도 적정한 종류와 농도의 생장조절제가 배지에 첨가되어야만 배양의 목적에 맞게 배양체가 생육 및 분화할 수 있다.
상기 옥신(Auxin)류는 고등식물의 줄기와 뿌리에서 세포분열에 주로 관여하는 필수적인 호르몬으로 직접적인 세포분열 제어능력은 시토키닌류 보다 약하므로 배양체의 활발한 생육 및 증식을 유도하기 위해서는 시토키닌류와 혼용하여 사용하는 것이 일반적이며, 조직배양시 주로 뿌리 형성을 유도하기 위하여 일차적으로 사용될 수 있다. 옥신의 종류에는 나프탈렌아세트산(Naphthaleneacetic acid; NAA), 인돌아세트산(indolacetic acid, IAA), 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 및 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
시토키닌(Cytokinin)류는 핵산(Nucleic acid)을 구성하는 퓨린 염기(Purin base) 중 하나인 아데닌(Adenine)의 유도체로 주로 세포분열을 자극하고 촉진하는데, 식물의 종류 및 세포의 분화상태에 따라 다르게 작용한다. 사용할 수 있는 시토키닌은 키네틴(kinetin), 제아틴(zeatin), 벤질아데닌(benzyladenine, BA), 6-벤질아미노퓨린(6-benzylamino purine; 6-BAP 또는 BAP) 및 디페닐우레아(diphenyl urea)등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히 본 발명에서 사용된 사이토키닌 종류 중 하나인 키네틴은 세포분열시 DNA 합성을 증진시키며, BAP 또한 세포분열을 촉진한다. 특히 시토키닌 종류 중 하나인 키네틴은 세포분열 시 DNA 합성을 증진시키는 역할을 하며, 벤질아미노푸린(Benzylaminopurine, BAP) 또한 세포분열을 촉진하는 기능을 한다.
상기 시토키닌과 옥신 외에도 식물체의 조직배양에 필요한 비타민으로는 티아민 HCl(Thiamine HCI), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 리보플라빈 (Riboflabin), 미오이노시톨(Myo-Inositol) 등 비타민 B 복합체가 있으며, 이는 기내 배양체의 생장을 촉진시킨다. 특히 티아민은 당류 대사작용(Carbohydrate metabolism)과 아미노산 생합성(Amino acid biosynthesis) 작용에 관여하고, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl)은 세포의 생장을 촉진시키고, 노화를 방지해주는 작용을 하며, 니코틴산(Nicotinic acid)은 캘러스의 갈색 변화를 방지하는데 효과가 있으므로 장기간 계대배양을 할 때 넣어주면 효과적이다.
배지에 첨가되는 미오이노시톨(Myo-Inositol)은 비타민 B복합체의 구성성분인 이노시톨형 성분으로 생체의 막 구성 성분이기도 하여 세포벽 생합성이나 다당류의 생합성에 사용되는 성분이며, 식물 조직배양에서는 생장촉진물질로써 사용되고 있어 식물의 캘러스 배양뿐만 아니라 배배양, 생장점배양 등에서도 활용되고 있다. 이노시톨(inositol)은 헥시톨(hexitol)의 일종으로 세포분열과 생장을 촉진하는 효과가 있고, 비교적 높은 농도에서도 독성이 거의 없다. 일반적으로 사용하는 적정 농도는 100mg/L이며, 미오이노시톨(Myo-Inositol)은 이노시톨의 9가지 입체상 중 생물학적 활성일 가장 큰 것으로 비타민 B 복합체이다. 어떤 식물에서는 생장에 필수적인 요소로 알려져 있다.
아스코르브산(Ascorbic acid)은 비타민 C로써 식물 조직배양 기본 배지에 첨가하여 사용하는 경우 배양체에서 생기는 페놀 화합물(Phenolic compound)의 작용을 억제하여 배양 식물체의 갈변(Browning) 또는 흑변(Blackening)현상을 감소시키고 건전한 배양묘의 생산 효율을 높일 수 있다. 식물 조직배양 과정 중 발생할 수 있는 갈변 또는 흑변 현상은 배양체에서 생기는 페놀 화합물이 배지에 집적되면서 배지의 산도를 급격히 떨어뜨리고 배양체로 이동되는 배지의 영양분 흡수력이 떨어지면서 발생할 수 있으며, 이에 계대 배양(배양체를 새로운 배지로 바꾸어 다시 배양하는 것)을 자주 하거나 아스코르브산 등의 첨가물을 배지에 추가하여 상기 문제점을 해결할 수 있다.
배양과정 중 식물체의 보호를 위해 항균제를 첨가할 수 있다. 상기 항균제는 메틸클로로이소티아졸론(Methylchloroisothiazolone), 메틸이소티아졸론(Methylisothiazolinone), 크롤로메틸이소티아졸론(Chloromethylisothiazolone), 벤츠이소티아졸론(Benzisothiazolone), 옥틸이소티아졸론(Octylisothiazolone), 디클로로옥틸이소티아졸론(Dichlorooctylisothiazolone), 부틸벤츠이소티아졸론(Butylbenzisothiazolone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항균제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 다양한 병원균의 효소 활성을 저해하는 것으로 알려진 PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社)을 이용하였다.
상기 PPM은 산업적으로 널리 활용되고 있는 이소티아졸론(Isothiazolone) 계의 항균제이다. 미생물의 호흡 기질 내 크렙스 회로(Krebs cycle) 및 전자전달계와 특이적으로 반응하여 항균 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 특히 열에 안정적이므로 고압멸균이 가능하여 현재 다양한 식물의 산업적 배양 과정에서 사용되고 있다. 표 1의 배지에서도 1.0 ㎖/L의 PPM을 배지에 첨가하여 사용함으로써 배양 중인 식물체에는 약해(Phytotoxicity)가 나타나지 않으면서 공중 부유균이나 낙하균 등의 미생물에 의한 오염 발생빈도는 현저히 감소시킬 수 있었다.
지베렐린(Gibberellin)류의 사용빈도는 식물의 조직배양 시 다른 생장조절제에 비하여 낮은 편이며, 줄기를 신장시키는 특성을 가지고 있다. 이 효과는 특히 유전적으로 왜성인 것과 총생인 것, 그리고 적색광에서는 난쟁이로 자라는 식물에 처리하였을 때 크게 나타난다. 줄기 신장은 다만 이미 존재하는 절간의 신장에 의해 이루어지는 것이며, 새로운 마디나 절간이 형성되는 것은 아니다. 지금까지 발견된 90여종의 지베렐린 중에서 GA3(Gibberellic acid), GA1, GA4, GA7 등이 많이 이용되며, 식물세포에 흡수되면 포합화가 일어난다.
본원 발명의 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법에 있어서,
상기 제1, 제2 및 제3 MS 배지는, 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(myo-inositol), PPM(Plant Preservative Mixture), 수크로스(sucrose), 한천(agar), 젤라이트(gelrite)를 더 포함할 수 있다.
본원 발명의 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 MS배지의 pH는 4 내지 7일 수 있으며, 바람직하게는 pH는 5 내지 6일 수 있다.
본원 발명의 상기 대량 증식 배양 방법은 유식물체의 갈변현상이 거의 나타나지 않는다.
상기 기외순화는 펄라이트를 포함하는 토양에서 기외순화할 수 있고, 펄라이트 33.3%: 질석 33.3%: 모래 33.3%에 배양묘를 옮겨심을 수 있으나, 바람직하게는 펄라이트 33.3%: 질석 33.3%: 피트모스 33.3%에 배양묘를 옮겨심을 수 있고, 더 바람직하게는 펄라이트 100%에 배양묘를 옮겨 심어 기외순화하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 펄라이트에서 기외순화된 배양묘는 신초길이 4-6 cm, 엽수 6 - 7 개/주, 뿌리수 6-7개/주, 생존율 70- 80%인 정상적인 생육 특성을 나타낸다.
또한, 본원 발명은 본원 발명의 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법에 의해 생산된 사과대목을 제공할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 화상병 저항성 사과대목 G.11 및 G.30 대목의 액아의 생장점을 채취하여 기본 배양배지에 치상하여 배양하였다(실시예 1 및 2). 신초형성을 유도하기 위해서 기본 MS배지 4.4g/L에 추가로 미오이노시톨 0.1 g/L를 첨가하고, 아스코르브산, BAP, NAA, 수크로스, 한천, 젤라이트(표 1), PPM을 첨가한 신초 형성 유도용 배지는 G.11대목과 G.30대목의 신초형성률이 95% 이상, 신초길이 6 내지 9, 신초수 1개/주, 엽수 3 내지 6 개/주, 생존율 100%로 우수한 생육특성을 보였다(도 2 및 표 2). 신장된 신초를 유식물체로 분화시키기 위한 유식물체 분화 유도용 배지는 기본 MS배지 4.4g/L에 추가로 미오이노시톨 0.1g/L, 티아민 HCl 0.5g/L를 첨가하고, 아스코르브산, BAP, 제아틴, IBA, GA3, 수크로스, 한천, 젤라이트, PPM을 첨가한 것으로(표 3), G.11 대목과 G.30 대목의 생존율 100%, 신초수 3 내지 6 개/주, 신초길이 1 내지 3cm, 총 엽수 25 내지 40개/주를 나타내어, 식물생장조절제를 처리하지 않은 대조군과 다른 배지 구성에 비해서 가장 우수한 생육 특성을 보였다. 또한, 본 발명의 유식물체 분화 유도용 배지로 배양하였을 때 갈변현상이 거의 나타나지 않았다(도 3및 표 4).
상기 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 발근 유도용 배지를 제작하였으며, 발근 유도용 배지는 1/4MS 배지 1.1g/L에 아스코르브산, IBA, IAA, 수크로스, 한천, 젤라이트, PPM을 첨가한 것으로(표 5), G.11대목과 G.30 대목은 뿌리형성률 75 내지 100%, 뿌리수 2 내지 3.5개/주, 뿌리길이 2.5 내지 3cm로 무처리 대조구 및 다른 배지 구성에서 배양하였을 때보다 생육 특성이 우수하였다(도 4 및 표 6). 마지막으로, 발근이 유도된 배양묘를 펄라이트 100%에서 기외순화하였을 때, 신초길이 5.4 cm, 엽수 6.6 개/주, 뿌리수 6.5 개/주, 뿌리길이 7.8cm 및 생존율 75%로 가장 우수한 생육특성을 보였다. 이에, 본 발명자들은 본원 발명에 의한 화상병 저항성 사과대목의 대량증식 배양 방법을 완성하였다(도 6).
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 화상병 저항성 사과대목의 액아 기부의 세척 및 소독
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 충청북도농업기술원 시험포장에 재식된 화상병 저항성 사과대목 3년생 G.11 및 G.30대목을 재료로 사용하였다. 액아(Axiliary bud, 당년에 잎으로 분화하는 곁눈)를 채취하되, 액아 기부(가지 줄기에 붙어있는 액아 아래 밑둥치 부분)에 5㎜ 정도의 목질부가 붙어있도록 조심스럽게 떼어낸 후 실험실에서 흐르는 물에 2분간 표면 세척하였다. 그런 다음, 클린벤치(무균작업대)에서 70% 에탄올 150㎖이 담긴 멸균 유리병(외경 81㎜, 높이 132㎜)에 30초간 침지하여 액아 표면을 소독하고 3% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액 150㎖이 담긴 멸균 유리병에서 15분 동안 침지하여 1회 소독한 후 꺼내어서 멸균된 증류수 150㎖이 담긴 유리병에서 5분씩 3회 세척하였다.
<실시예 2> 화상병 저항성 사과대목 액아의 생장점 채취 및 배양
세척 및 소독이 완료된 액아의 생장점을 무균 채취하기 위하여 클린벤치(무균작업대)에서 실체 현미경(Stemi 2000, Carl Zeiss)을 이용하여 작업하였으며, 액아 내 생장점(직경 2㎜ 내외, 높이 2~3㎜ 정도)을 엽원기(Leaf primordium, 잎의 근원이 되거나 원 잎을 생성하는 세포의 일군)가 1매 정도 붙어있는 상태로 채취하여 기본배지에 치상하여 배양하였다. 초기 생장점 배양배지가 들어있는 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 생장점(0.1∼0.3mm)을 하나씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40 μmol·m-2)에서 2∼3주간 배양하였다. 2~3주 배양기간 동안 배지 또는 생장점 배양체가 갈색 또는 흑색으로 변하는 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening) 현상이 발생하는 경우 즉시 새로운 배지로 생장점을 다시 옮겨주어 6∼8주 동안 배양하였다.
<실시예 3> 화상병 저항성 사과대목 생장점의 신초형성 유도
신초 형성 유도용 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형있게 배합한 배지로서 식물조직 배양시 기본배지로 널리 사용되는 MS배지(Murashige & Skoog Medium) 4.4 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid, A4118, MBcell) 0.1 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.1 g/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 2.0 mg/L, NAA(naphthalene acetid acid) 0.05 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 mg/L, 수크로스(Sucrose) 30.0 g/L, 한천(Agar) 7.7 g/L, 젤라이트(Gelrite) 0.3 g/L을 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.7로 조정하였다. 그런 다음 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 10~15㎖씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm-2pressure, 15분) 하여 제조하였다(표 1). 액아 내 생장점(0.1∼0.3mm 크기)을 엽원기(Leaf primordium, 잎의 근원이 되거나 원 잎을 생성하는 세포의 일군)가 1매 정도 붙어있는 상태로 채취하여 신초 형성 유도용 배양배지에 치상하여 배양하였다.
| 성 분 명 | 함 량 | 비 고 |
| NH4NO3 | 1650.00 ㎎/L | |
| MgSO4 | 180.54 ㎎/L | |
| KNO3 | 1900.00 ㎎/L | |
| KH2PO4 | 170.00 ㎎/L | |
| CaCl2 | 332.02 ㎎/L | |
| CoCl26H2O | 0.025 ㎎/L | |
| ZnSO47H2O | 8.60 ㎎/L | |
| Na2MoO42H2O | 0.25 ㎎/L | |
| MnSO4H2O | 16.90 ㎎/L | |
| H3BO3 | 6.20 ㎎/L | |
| KI | 0.83 ㎎/L | |
| FeNaEDTA | 36.70 ㎎/L | |
| CuSO45H2O | 0.025 ㎎/L | |
| Glycine | 2.00 ㎎/L | |
| Myo-Inositol | 200.00 ㎎/L | (MS 배지내 100.00 + 추가 100.00) ㎎/L |
| Thiamine HCl | 0.10 ㎎/L | |
| Nicotinic acid | 0.50 ㎎/L | |
| Pyridoxine HCl | 0.50 ㎎/L | |
| Ascorbic acid | 100.00 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| BAP | 2.00 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| NAA | 0.05 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| Sucrose | 30.00 g/L | MS 배지에 추가 |
| Agar | 7.70 g/L | MS 배지에 추가 |
| Gelrite | 0.30 g/L | MS 배지에 추가 |
| PPM | 1.00 ㎎/L | 항균제, MS 배지에 추가 |
| 배지의 pH | 5.7 |
상기 신초 형성 유도용 배지에서 8주간 배양한 후 신초 형성율을 조사하였고, 상기 4주간의 2회 계대 배양 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스(sucrose), 한천(Agar), 젤라이트(Gelrite)만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
그 결과, 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP 뿐만 아니라 아스코르브산, 미오이노시톨을 추가로 첨가한 본 발명의 신초 형성 유도용 배지에서 배양하는 경우 무처리 배지에서 신초 형성률 53.8%, 신초길이 1.5mm, 신초수 0.5개/주, 엽수 2.3개/주, 생존율 88.2%인 반면, G.11대목은 신초 형성률 95.9%, 신초길이 6.1 mm, 신초수 1.0개/주, 엽수 3.8개/주 및 생존율 100%였으며 G.30대목은 신초형성률 95.8%, 신초길이 8.4 mm, 신초수 1.0개/주, 엽수 5.4 개/주 및 생존율 100%로 우수한 생육특성을 보였다(도 2 및 표 2).
| 과수화상병 저항성 사과대목(G.11) 초기 생육특성(배양 8주차) | ||||||||||||
| 식물생장조절제 (mg/L) | 신초형성률 (%) |
신초길이 (mm) |
신초수 (개/주) |
엽수 (개/주) |
생존율 (%) |
|||||||
| MS배지 | BAP | IBA | NAA | |||||||||
| 4.4(대조군) | - | - | - | 53.8 bz | 1.5 b | 0.5b | 2.3 b | 88.2 b | ||||
| 4.4 | 1 | 0.2 | 91.7 a | 6.9 a | 1.0 a | 3.3 a | 100.0 a | |||||
| 1 | 0.1 | 87.0 a | 6.7 a | 1.0 a | 2.9 ab | 100.0 a | ||||||
| 2 | 0.05 | 95.9 a | 6.1 a | 1.0 a | 3.8 a | 100.0 a | ||||||
| 과수화상병 저항성 사과대목(G30) 초기 생육특성(배양 8주차) | ||||||||||||
| 식물생장조절제 (mg/L) | 신초형성률 (%) |
신초길이 (mm) |
신초수 (개/주) |
엽수 (개/주) |
생존율 (%) |
|||||||
| MS배지 | BAP | IBA | NAA | |||||||||
| 4.4(대조군) | - | - | - | 91.1 az | 2.1 b | 0.3 b | 1.9 b | 100.0 a | ||||
| 4.4 | 1 | 0.2 | 90.0 a | 6.7 a | 1.0 a | 4.9 a | 100.0 a | |||||
| 1 | 0.1 | 95.6 a | 7.4 a | 1.0 a | 4.7 a | 100.0 a | ||||||
| 2 | 0.05 | 95.8 a | 8.4 a | 1.0 a | 5.4 a | 100.0 a | ||||||
zMean separation by Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05
<실시예 4> 화상병 저항성 사과대목의 유식물체 분화 유도
배양으로부터 형성된 신초의 생육을 유도하는 배양과정을 거친 다음에는 신초를 신장시키고 생장속도를 빠르게 하여 어린 식물체(유식물체)로 분화시키는 배양단계가 필요하다. 유식물체로 분화시키기 위해 유식물체 분화 유도용 배지로 신초를 옮겨 치상하여 4주간 배양하였으며(표 3), 4주 후 새로운 배지로 옮겨 주어 완전한 식물체의 형성을 유도하였다.
유식물체 분화 유도용 배지는 MS(Murashige & Skoog Medium)배지 4.4g/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.1 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.1 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.5 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.5 mg/L, 제아틴(Zeatin)(6-(4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylamino)-purine) 0.5 mg/L, IBA(Indole-3-Butyric Acid) 0.2 mg/L, GA3(Gibberellic acid) 0.3 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 mg/L, 수크로스(Sucrose) 30.0 g/L, 한천(Agar) 7.7 g/L, 젤라이트(Gelrite) 0.3 g/L를 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.7로 조정하였다(표 3). 그런 다음 식물 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121, 1.2 kgf·cm-2 pressure, 15분)하여 사용하였다. 유식물체를 배양병 4개씩 치상하여 명상태(23±2℃, 16/8h 명암주기, 40μmol·m-2)에서 4주간 배양하였으며, 4주 후 다시 새로운 유식물체 분화 유도용 배지가 들어있는 배양용 유리병에 옮겨 주어 8주 동안 배양함으로써 완전한 유식물체의 형성을 유도하였다.
| 성 분 명 | 함 량 | 비 고 |
| NH4NO3 | 1650.00 ㎎/L | |
| MgSO4 | 180.54 ㎎/L | |
| KNO3 | 1900.00 ㎎/L | |
| KH2PO4 | 170.00 ㎎/L | |
| CaCl2 | 332.02 ㎎/L | |
| CoCl26H2O | 0.025 ㎎/L | |
| ZnSO47H2O | 8.60 ㎎/L | |
| Na2MoO42H2O | 0.25 ㎎/L | |
| MnSO4H2O | 16.90 ㎎/L | |
| H3BO3 | 6.20 ㎎/L | |
| KI | 0.83 ㎎/L | |
| FeNaEDTA | 36.70 ㎎/L | |
| CuSO45H2O | 0.025 ㎎/L | |
| Glycine | 2.00 ㎎/L | |
| Myo-Inositol | 200.00 ㎎/L | (MS 배지내 100.00 + 추가 100.00) ㎎/L |
| Thiamine HCl | 600.00 ㎎/L | (MS 배지내 100.00 + 추가 500.00) ㎎/L |
| Nicotinic acid | 0.50 ㎎/L | |
| Pyridoxine HCl | 0.50 ㎎/L | |
| Ascorbic acid | 100.00 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| BAP | 0.50 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| Zeatin | 0.50 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| IBA | 0.20 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| GA3 | 0.10 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| Sucrose | 30.00 g/L | MS 배지에 추가 |
| Agar | 7.70 g/L | MS 배지에 추가 |
| Gelrite | 0.30 g/L | MS 배지에 추가 |
| PPM | 1.00 ㎎/L | MS 배지에 추가, 항균제 |
| 배지의 pH | 5.7 |
상기 8주간의 2회 계대 배양 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스(sucrose), 한천(Agar), 젤라이트(Gelrite)만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
그 결과, 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 IBA와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP(6-Benzylaminopurine), 제아틴(Zeatin)과 지베렐린 GA3를 첨가하여 신초로부터 유식물체로의 분화 과정을 빠르게 촉진시켰을 뿐만 아니라 아스코르브산, 티아민 HCl, 미오이노시톨 추가로 첨가하여 유식물체 8주후 생육특성에서는 G.11대목은 유식물체 생존율 100%, 신초길이 1.7cm, 신초수 6.0 개/주, 총 엽수 39.1 개/주였으며, G30대목은 유식물체 생존율 100%, 신초길이 2.6cm, 신초수 3.8 개/주, 총 엽수 26.0 개/주로 무처리 대조군의 신초수 1.1 개/주에 비해 유식물체 분화율이 높았고, 무처리 대조군의 신초길이 1.9cm, 총엽수 10.6개/주에 비해 우수한 생육특성을 나타냈다(도 3 및 표 3). 기내 식물체가 갈색 또는 흑색으로 변하는 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening) 현상이 발생하는 갈변율은 DKW배지에서는 많이 나타났으나, MS배지는 갈변율 현상은 거의 나타나지 않았다(도 3 및 표 3). 본 발명의 유식물체 분화 유도용 배지로 배양한 유식물체는 갈변율이 0%로 갈변현상이 거의 발생하지 않았으나, 무처리 대조군은 G.11 대목이 16.7 %, G.30 대목이 8.3 %을 나타내어, 상기 생장조절물질로 유식물체의 건강하고 왕성한 생육을 유도함으로써 사과대목의 생장점 배양한 신초로부터 유식물체의 분화 및 생육을 증진시킴을 확인하였다(표 4).
| 화상병 저항성 사과대목(G.11) 유식물체 분화 생육특성(배양 16주차) | |||||||||||
| 식물생장조절제 (mg/L) | 신초길이 (cm) |
신초수 (개/주) |
총엽수 (개/주) |
갈변율 (%) |
유식물체 생존율 (%) |
||||||
| 배지 | BAP | 2ip | kinetin | zeatin | IBA | GA3 | |||||
| 대조군 | - | - | - | - | - | - | 1.2 dz | 1.0 e | 7.4 c | 16.7 b | 100.0 a |
| MS 4.4 |
1 | 0.2 | 0.5 | 1.6 ab | 3.3 cd | 24.2 b | 0.0 c | 100.0 a | |||
| 0.5 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 1.7 a | 6.0 a | 39.1 a | 0.0 c | 100.0 a | |||
| 1.5 | 0.5 | 1.5 abc | 3.7 bcd | 27.7 b | 0.0 c | 100.0 a | |||||
| 1 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 1.4 abcd | 3.3 cd | 22.8 b | 0.0 c | 100.0 a | |||
| 1 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 1.4 abcd | 3.2 cd | 22.9 b | 0.0 c | 100.0 a | |||
| DKW 2.8 |
- | - | - | 1.2 d | 3.5 cd | 24.0 b | 100.0 a | 100.0 a | |||
| 1 | 0.2 | 0.5 | 1.7 a | 2.6 d | 18.9 b | 100.0 a | 100.0 a | ||||
| 0.5 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 1.3 cd | 4.5 abc | 28.7 b | 100.0 a | 100.0 a | |||
| 1.5 | 0.5 | 1.6 ab | 5.4 ab | 39.8 a | 100.0 a | 100.0 a | |||||
| 1 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 1.4 bcd | 4.1 bcd | 27.9 b | 100.0 a | 100.0 a | |||
| 화상병 저항성 사과대목(G30) 유식물체 분화 생육특성(배양 16주차) | |||||||||||
| 식물생장조절제 (mg/L) | 신초길이 (cm) |
신초수 (개/주) |
총엽수 (개/주) |
갈변율 (%) |
유식물체 생존율 (%) |
||||||
| 배지 | BAP | 2ip | kinetin | zeatin | IBA | GA3 | |||||
| 대조군 | - | - | - | - | - | - | 1.9 abz | 1.1 b | 10.6 b | 8.3 a | 100.0 a |
| MS 4.4 |
1 | 0.2 | 0.5 | 2.5 a | 2.5 ab | 19.9 a | 0.0 a | 97.9 b | |||
| 0.5 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 2.6 a | 3.8 a | 26.0 a | 0.0 a | 100.0 a | |||
| 1.5 | 0.5 | 2.6 a | 3.6 a | 28.3 a | 8.3 a | 100.0 a | |||||
| 1 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 2.3 a | 3.2 a | 22.3 a | 0.0 a | 100.0 a | |||
| 1 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 2.1 ab | 2.9 a | 21.9 a | 0.0 a | 100.0 a | |||
| DKW 2.8 |
- | - | - | 1.9 ab | 3.0 a | 24.4 a | 8.3 a | 100.0 a | |||
| 1 | 0.2 | 0.5 | 1.9 ab | 2.6 a | 20.5 a | 16.6 a | 100.0 a | ||||
| 0.5 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 1.5 b | 3.8 a | 23.0 a | 0.0 a | 100.0 a | |||
| 1.5 | 0.5 | 1.5 b | 3.1 a | 22.4 a | 0.0 a | 100.0 a | |||||
| 1 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 1.6 b | 2.7 a | 21.1 a | 0.0 a | 100.0 a | |||
zMean separation by Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05
<실시예 4> 화상병 저항성 사과대목의 유식물체 발근 유도
상기 유식물체 배지에서 4주 간격 계대 배양한 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 발근 유도용 배지를 사용하여 배양하였다. 발근 유도용 배지는 MS배지(Murashige & Skoog Medium) 1.1 g/L에, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.1 g/L, IBA(Indole-3-Butyric Acid) 0.2 mg/L, IAA(indolacetic acid) 2.0 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 mg/L, 수크로스(Sucrose) 30.0 g/L, 한천(Agar) 7.7 g/L, 젤라이트(Gelrite) 0.3 g/L을 혼합 첨가하여 혼합 제조한 후, 배지의 pH를 5.7로 조정하였다(표 5).
| 성 분 명 | 함 량 | 비 고 |
| NH4NO3 | 412.50 ㎎/L | |
| MgSO4 | 45.14 ㎎/L | |
| KNO3 | 475.00 ㎎/L | |
| KH2PO4 | 42.50 ㎎/L | |
| CaCl2 | 83.00 ㎎/L | |
| CoCl26H2O | 0.00625 ㎎/L | |
| ZnSO47H2O | 2.15 ㎎/L | |
| Na2MoO42H2O | 0.0625 ㎎/L | |
| MnSO4H2O | 4.23 ㎎/L | |
| H3BO3 | 1.55 ㎎/L | |
| KI | 0.21 ㎎/L | |
| FeNaEDTA | 9.18 ㎎/L | |
| CuSO45H2O | 0.00625 ㎎/L | |
| Glycine | 0.55 ㎎/L | |
| Myo-Inositol | 25.00 ㎎/L | |
| Thiamine HCl | 0.025 ㎎/L | |
| Nicotinic acid | 0.125 ㎎/L | |
| Pyridoxine HCl | 0.125 ㎎/L | |
| Ascorbic acid | 100.00 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| IBA | 0.20 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| IAA | 2.00 ㎎/L | MS 배지에 추가 |
| Sucrose | 30.00 g/L | MS 배지에 추가 |
| Agar | 7.70 g/L | MS 배지에 추가 |
| Gelrite | 0.30 g/L | MS 배지에 추가 |
| PPM | 1.00 ㎎/L | MS 배지에 추가, 항균제 |
| 배지의 pH | 5.7 |
| 과수화상병 저항성 사과대목(G.11) 발근배지 생육특성(배양 20주차) | ||||||||||||
| 식물생장조절제 (mg/L) | 신초길이 (cm) |
총엽수 (개/주) |
뿌리수 (개/주) |
뿌리길이 (cm) |
뿌리 형성률 (%) |
|||||||
| MS배지 | IBA | IAA | GA3 | |||||||||
| 4.4(대조군) | - | - | - | 1.6 a | 8.9 a | 0.0 b | 0.0 c | 0.0 c | ||||
| 1.1 | 0.2 | 2.0 | 1.6 a | 8.8 a | 3.1 a | 2.5 ab | 100.0 a | |||||
| 0.5 | 2 | 0.3 | 1.4 ab | 8.4 a | 2.9 ab | 2.7 a | 75.0 a | |||||
| 2.2 | 0.5 | 1.3 b | 9.5 a | 1.9 ab | 1.5 ab | 83.3 a | ||||||
| 1.0 | 1.0 | 0.3 | 1.4 ab | 8.9 a | 2.7 ab | 1.2 bc | 50.0 b | |||||
| 과수화상병 저항성 사과대목(G30) 발근배지 생육특성(배양 20주차) | ||||||||||||
| 식물생장조절제 (mg/L) | 신초길이 (cm) |
총엽수 (개/주) |
뿌리수 (개/주) |
뿌리길이 (cm) |
뿌리 형성률 (%) |
|||||||
| MS배지 | IBA | IAA | GA3 | |||||||||
| 4.4(대조군) | - | - | - | 2.6 az | 10.8 a | 0.0 b | 0.0 c | 0.0 b | ||||
| 1.1 | 0.2 | 2.0 | 2.0 a | 9.4 a | 2.0 a | 2.8 a | 75.0 a | |||||
| 0.5 | 2 | 0.3 | 2.3 a | 11.2 a | 2.2 a | 1.6 ab | 66.7 a | |||||
| 2.2 | 0.5 | 2.1 a | 10.3 a | 0.1 b | 0.3 bc | 8.3 b | ||||||
| 1.0 | 1.0 | 0.3 | 2.4 a | 13.4 a | 0.9 ab | 1.2 bc | 50.0 a | |||||
zMean separation by Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05
그런 다음 식물 배양용 유리병(Plant culture vessel, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm-2pressure,15분)하여 사용하였다. 유식물체 발근 배지가 들어있는 배양용 유리병(Plant culture vessel, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 유식물체를 4개씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40 μmol·m-2)에서 4주간 배양하였다. 4주 후 기내 식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스(sucrose), 한천(Agar), 젤라이트(Gelrite)만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
그 결과, 식물생장조절제를 처리하지 않는 대조군에서는 뿌리가 형성되지 않았으나, 1/4MS 배지에 식물의 뿌리 형성을 유도하는 IBA 및 IAA를 첨가한 배지를 사용하여 배양한 경우, G.11대목은 뿌리 형성률 100%, 뿌리수 3.1 개/주 및 뿌리길이 2.5cm였으며, G30 대목은 뿌리 형성률 75.0%, 뿌리수 2.0 개/주 및 뿌리길이 2.8cm로 무처리 대조구 및 다른 배지 구성보다 생육 특성이 우수하였다(도 4, 표 5 및 표 6).
발근 배지 내 집적된 페놀 화합물을 흡수하고 식물체 고유의 특성을 회복시켜 기외 순화(배양 식물체를 외부 환경에 적응시키는 것) 시 배양 식물체의 적응력을 높여주는 역할을 하는 아스코르브산(Ascorbic acid)을 부가적으로 첨가함으로써 사과대목의 유식물체의 뿌리 형성을 촉진하는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 화상병 저항성 사과대목의 유식물체의 기외 순화
뿌리가 완전히 형성되어 배양용 유리병에서 배양 중인 유식물체는 배양 용기에서 꺼내어 외부환경으로 적응하는 기외 순화 과정을 거쳐야만 완전한 식물체의 형태를 갖출 수 있다. 따라서 기외 순화를 위하여 배양용 유리병에서 뿌리가 형성된 사과대목의 유식물체를 꺼낸 다음 유식물체의 뿌리에 배양 배지가 남아있지 않도록 부드럽게 깨끗이 물로 씻어낸 후, 펄라이트 100%, 펄라이트 50% : 질석 50%, 펄라이트 33.3% : 질석 33.3% : 피트모스 33.3%, 펄라이트 33.3% : 질석 33.3% : 모래 33.3%로 혼합하여 각각 육묘 트레이(32구, 가로 540 mm, 세로 280 mm, 높이 48 mm)에 옮겨 심었다. 육묘트레이에 심은 유식물체는 배양실과 유사한 환경(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40~50 μmol·m-2, 공증습도 60±5%)의 순화실에서 1~2주 키운 다음, 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 유리 온실 또는 비닐하우스에서 공중습도를 서서히 낮춰주면서 1∼2주 정도 경화시켜 가면서 키웠다. 기외 순화 1개월 후부터는 유식물체의 상태를 확인하면서 공중습도를 천천히 낮춰주면서 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
그 결과, 유식물체가 기외 순화되는 것을 확인했으며, 기외순화 토양 종류 중에서 펄라이트 100% 조건에서 신초길이 5.4 cm, 엽수 6.6 개/주, 뿌리수 6.5 개/주, 뿌리길이 7.8cm 및 생존율 75.0%로 정상적인 생육특성을 보였다(도 5 및 표 7). 생장점 배양으로부터 배양한 상기 유식물체는 정상적인 어린 묘로 자라는 것을 확인하였다(도 5). 이에, 본 발명자는 본원 발명에 의한 화상병 저항성 사과대목의 대량증식 배양 방법은 유식물체의 우수한 생육특성, 생존율 및 갈변율을 나타낸 바를 확인하였으며, 본 발명의 대량증식 배양 방법을 나타낸 순서도를 나타내었다(도 6).
| 화상병 저항성 사과대목(G30) 배양묘 기외순화 토양 종류별 생육 특성 | ||||||
| 토양 종류 (%) |
신초길이 (cm) |
엽수 (개/주) |
줄기두께 (mm) |
뿌리수 (개/주) |
뿌리길이 (cm) |
생존율 (%) |
| 펄라이트 100 | 5.4 az | 6.6 a | 1.7 a | 6.5 a | 7.8 a | 75.0 a |
| 펄라이트 50 : 질석 50 | 2.1 b | 2.0 b | 0.5 b | 1.1 b | 1.2 c | 25.0 b |
| 펄라이트 33.3 : 질석 33.3 : 피트모스 33.3 | 5.7 a | 6.5 a | 1.1 a | 4.9 a | 4.4 b | 62.5 a |
| 펄라이트 33.3 : 질석 33.3 : 모래 33.3 | 6.2 a | 6.3 a | 1.3 a | 7.2 a | 5.5 ab | 75.0 a |
Claims (11)
- 화상병 저항성 사과대목의 액아(Axillary bud)로부터 생장점을 채취하고, 채취한 생장점을 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), BAP (6-benzylamino purine), NAA(naphthalene acetid acid), PPM(Plant Preservative Mixture), 수크로스(sucrose), 한천(agar), 젤라이트(gelrite)를 포함하는 제1 MS배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
상기 생육된 신초를 아스코르브산, 미오이노시톨, 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP, 제아틴(zeatin), IBA(Indole-3-Butyric Acid), GA3(Gibberellic acid), PPM, 수크로스, 한천, 젤라이트를 포함하는 제2 MS배지에 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
상기 유식물체를 아스코르브산, IBA, IAA(indolacetic acid), PPM, 수크로스, 한천, 젤라이트를 포함하는 제3 MS배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
상기 발근이 유도된 배양묘를 기외순화시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량 증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 사과대목은 G.11 대목 또는 G.30 대목인 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제1 MS배지는,
4 내지 5 g/L 농도의 MS 배지에, 아스코르브산 0.05 내지 0.15 g/L, 미오이노시톨 0.05 내지 0.15 g/L, BAP 1.5 내지 2.5 mg/L, NAA 0.01 내지 0.1 mg/L, PPM 0.05 내지 0.15 mg/L, 수크로스 25.0 내지 35.0 g/L, 한천 5.0 내지 10.0 g/L, 젤라이트 0.1 내지 0.5 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제2 MS배지는,
4 내지 5 g/L 농도의 MS 배지에, 아스코르브산 0.05 내지 0.15 g/L, 미오이노시톨 0.05 내지 0.15 g/L, 티아민 HCl 0.1 내지 1.0 mg/L, BAP 0.1 내지 1.0 mg/L, 제아틴 0.1 내지 1.0 mg/L, IBA 0.1 내지 0.5 mg/L, GA3 0.05 내지 0.15 mg/L, PPM 0.05 내지 0.15 mg/L, 수크로스 25.0 내지 35.0 g/L, 한천 5.0 내지 10.0 g/L, 젤라이트 0.1 내지 0.5 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제3 MS배지는,
0.5 내지 2 g/L 농도의 MS 배지에, 아스코르브산 0.05 내지 0.15 g/L, IAA 1.0 내지 3.0 mg/L, IBA 0.1 내지 0.5 mg/L, PPM 0.05 내지 0.15 mg/L, 수크로스 25.0 내지 35.0 g/L, 한천 5.0 내지 10.0 g/L, 젤라이트 0.1 내지 0.5 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1, 제2 및 제3 MS 배지는, 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(myo-inositol), PPM(Plant Preservative Mixture), 수크로스(sucrose), 한천(agar), 젤라이트(gelrite)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 MS 배지의 pH는 5 내지 6인 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 대량증식 배양 방법은 유식물체의 갈변현상이 거의 나타나지 않는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 기외순화는 펄라이트에 배양묘를 옮겨 심는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 배양묘는 신초길이 4-6 cm, 엽수 6-7 개/주, 뿌리수 6-7개/주, 생존율 70-80%인 생육 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 화상병 저항성 사과대목의 기내 대량증식 배양 방법.
- 제 1항의 기내 대량증식 배양 방법에 의해 생산된 사과대목.
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| KR1020220144049A KR20240062035A (ko) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 화상병 저항성 사과대목 기내 대량증식 배양 방법 |
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-
2022
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