KR20240052849A - 피르미쿠테스에서의 접합 적격성의 개선 - Google Patents
피르미쿠테스에서의 접합 적격성의 개선 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유전자 적격성을 개선시키는 미생물, 유전자, 물질 및 방법과 관련된다. 특히, 본 발명은 피르미쿠테스에서의 접합 적격성을 개선시키는 개별 유전자/단백질 및 이들의 조합을 제공하고, 또한 이러한 유전자, 단백질 및 각각의 조합을 수반하는 방법 및 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 유전자 적격성을 개선시키는 미생물, 유전자, 물질 및 방법과 관련된다. 특히, 본 발명은 피르미쿠테스(Firmicutes)에서의 접합 적격성을 개선시키는 개별 유전자/단백질 및 이들의 조합을 제공하고, 또한 이러한 유전자, 단백질 및 각각의 조합을 수반하는 방법 및 용도를 제공한다.
피르미쿠테스 미생물은 산업 발효 공정에서 중요한 미생물이다. 따라서, 이러한 미생물에서 핵산을 조작할, 예를 들어 이들로 하여금 관심 물질을 생산할 수 있게 할 또는 발효 동안 원치 않는 물질의 생산을 방지하거나 또는 감소시킬 일반적인 필요가 있다. 그러나, 하기 핵산의 도입은 악명 높게 어렵다. 핵산 전달의 3개의 주요 메커니즘이 지금까지 적용되어 왔다: 네이키드 DNA를 미생물 내로, 예를 들어 전기천공에 의해 직접적으로 도입하는 것을 시도하는 형질전환 기술; (2) 박테리오파지를 통한 형질도입; (3) 박테리아를 통한 접합. 전기천공과 같은 직접적인 형질전환 기술은 피르미쿠테스에서 일관되게 고효율을 생산하지 않았고, 파에니바실루스(Paenibacillus)와 같은 여러 속은, 예를 들어, 심지어 일반적으로 통상적인 기술에 의해 비-형질전환가능한 것으로 간주된다. 박테리오파지를 통한 형질도입은 비교적 다루기 힘들고 제한된 박테리오파지 캡슐 부피 및 박테리오파지 전달 기구에 의한 전달에 요구된 핵산 요소의 첨가 요구로 인해 핵산의 전달의 크기가 제한된다. 따라서, 접합이 철저한 돌연변이유발에 의해 개별적으로 형질전환 적격으로 제조되지 않은, 이들 미생물에 대해 선택되는 전달 방법인 것으로 간주된다. 접합에서, 표적 핵산은 제2 미생물 ("표적 미생물")로의 전달을 위해 제1 미생물 ("공여자 미생물")에 제공되며, 여기서 공여자 미생물은 표적 미생물보다 유전자 조작에 더 다루기 쉽다. 공여자 및 표적 미생물의 혼합 후, 원형질 다리가 공여자와 표적 미생물 사이에 형성되며 이는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및/또는 염색체 박테리아 DNA의 전달을 허용한다. 비록 접합 기술이 형질전환 기술의 때때로 극복할 수 없는 장애 중 다수를 극복하지만, 전달 효율이 일반적으로 낮다. 따라서, 접합은 상이한 표적 미생물의 수집의 효율적인 형질전환을 허용하지 않는다. 이는, 그러나, 예를 들어 대량신속처리 환경에서, 예를 들어 장래의 생산 숙주의 라이브러리의 조작 및 후속 분석에 요구될 것이다. 특히, 파에니바실루스 속의 미생물이 이들의 낮은 접합 효율에 대해 공지되어 있다.
따라서 피르미쿠테스 미생물의, 바람직하게는 파에니바실루스 속의 형질전환성을 개선시키는 물질 및 방법, 특히 유전자, 핵산 및 단백질을 제공하는 것이 본 발명의 목적이었다.
본 발명은
a) 돌연변이체 degS 유전자 및 임의로 돌연변이체 degU 유전자, 또는
b) 돌연변이체 spo0A 유전자
를 포함하는 미생물을 제공하며,
여기서 미생물은 상응하는 야생형 균주에 비해 증가된 접합 적격성을 나타낸다.
본 발명은 또한 미생물에, 하기를 제공하는 단계를 포함하는, 미생물의 접합 적격성을 증가시키는 방법을 제공한다:
a) 돌연변이체 degS 유전자이며, 여기서
- degS 유전자는 기능적 단일 결합 도메인, 기능적 포스포억셉터 도메인 및/또는 기능적 ATPase 도메인이 결여된 DegS 단백질을 코딩하고/거나
- degS 유전자는 DegS 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는 L99F, L99C, L99D, L99E, L99G, L99H, L99K, L99N, L99P, L99Q, L99R, L99S, L99W 또는 L99Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 degS 유전자,
및 임의로 돌연변이체 degU 유전자이며, 여기서
- degU 유전자는 감소된 DNA 결합 활성을 갖는 DegU 단백질을 코딩하고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여되고/거나,
- degU 유전자는 DegU 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는, 각각의 대안 aa) 및 ab)에 대해 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 중 1개 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 degU 유전자:
aa) Q218*, Q218K, Q218N, Q218D, Q218R
ab) D223*, D223*+M220N, D223*+M220N+E221G, D223*+M220N+V222G, D223*+M220N+E221G+V222G, D223*+M220D, D223*+M220E, D223*+M220H, D223*+M220F, D223*+M220W, D223*+M220S, D223*+M220A
또는
b) 돌연변이체 spo0A 유전자이며, 여기서
ba) 돌연변이는 DNA 결합 또는 수신자 도메인에 위치하고 Spo0A 단백질의 인산화의 감소 또는 제거 및/또는 이량체화의 감소 또는 제거를 발생시키고/거나,
bb) 돌연변이는 하기 중 임의의 것으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 것인 돌연변이체 spo0A 유전자:
- A257V, 보다 바람직하게는 A257S,
- I161R, 보다 바람직하게는 I161L,
- 선호도가 감소하는 순서대로: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R.
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 2종의 미생물 사이에 유전 물질을 전달하는 방법을 제공하며:
1) 제1 미생물에, 하기를 제공하는 단계:
a) 돌연변이체 DegS 단백질이며, 여기서
- DegS 단백질은 기능적 단일 결합 도메인, 기능적 포스포억셉터 도메인 및/또는 기능적 ATPase 도메인이 결여되고/거나
- 돌연변이는 L99F, L99C, L99D, L99E, L99G, L99H, L99K, L99N, L99P, L99Q, L99R, L99S, L99W 또는 L99Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 DegS 단백질,
및 임의로 돌연변이체 DegU 단백질이며
- 감소된 DNA 결합 활성을 갖고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여되고/거나,
- 여기서 돌연변이는, 각각의 대안 aa) 및 ab)에 대해 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 중 1개 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 DegU 단백질:
aa) Q218*, Q218K, Q218N, Q218D, Q218R
ab) D223*, D223*+M220N, D223*+M220N+E221G, D223*+M220N+V222G, D223*+M220N+E221G+V222G, D223*+M220D, D223*+M220E, D223*+M220H, D223*+M220F, D223*+M220W, D223*+M220S, D223*+M220A;
또는
b) 돌연변이체 Spo0A 단백질이며, 여기서
ba) 돌연변이는 DNA 결합 또는 수신자 도메인에 위치하고 Spo0A 단백질의 인산화의 감소 또는 제거 및/또는 이량체화의 감소 또는 제거를 발생시키고/거나,
bb) 돌연변이는 하기 중 임의의 것으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 것인 돌연변이체 Spo0A 단백질:
- A257V, 보다 바람직하게는 A257S,
- I161R, 보다 바람직하게는 I161L,
- 선호도가 감소하는 순서대로: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R,
및
2) 제1 미생물을 접합 적격 제2 미생물과 접합시키는 단계,
여기서 제1 미생물은, 단계 2 전에, 전달될 유전 물질을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 반대선택가능한 마커, 및 하기의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다:
a) 돌연변이체 degS 유전자이며, 여기서
- degS 유전자는 기능적 단일 결합 도메인, 기능적 포스포억셉터 도메인 및/또는 기능적 ATPase 도메인이 결여된 DegS 단백질을 코딩하고/거나
- degS 유전자는 DegS 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는 L99F, L99C, L99D, L99E, L99G, L99H, L99K, L99N, L99P, L99Q, L99R, L99S, L99W 또는 L99Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 degS 유전자,
및 임의로 돌연변이체 degU 유전자이며, 여기서
- degU 유전자는 감소된 DNA 결합 활성을 갖는 DegU 단백질을 코딩하고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여되고/거나,
- degU 유전자는 DegU 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는, 각각의 대안 aa) 및 ab)에 대해 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 중 1개 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 degU 유전자:
aa) Q218*, Q218K, Q218N, Q218D, Q218R
ab) D223*, D223*+M220N, D223*+M220N+E221G, D223*+M220N+V222G, D223*+M220N+E221G+V222G, D223*+M220D, D223*+M220E, D223*+M220H, D223*+M220F, D223*+M220W, D223*+M220S, D223*+M220A,
또는
b) 돌연변이체 spo0A 유전자이며, 여기서
ba) 돌연변이는 DNA 결합 또는 수신자 도메인에 위치하고 Spo0A 단백질의 인산화의 감소 또는 제거 및/또는 이량체화의 감소 또는 제거를 발생시키고/거나,
bb) 돌연변이는 하기 중 임의의 것으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 것인 돌연변이체 spo0A 유전자:
- A257V, 보다 바람직하게는 A257S,
- I161R, 보다 바람직하게는 I161L,
- 선호도가 감소하는 순서대로: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R.
그리고 본 발명은
a) 돌연변이체 degS 유전자이며, 여기서
- degS 유전자는 기능적 단일 결합 도메인, 기능적 포스포억셉터 도메인 및/또는 기능적 ATPase 도메인이 결여된 DegS 단백질을 코딩하고/거나
- degS 유전자는 DegS 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는 L99F, L99C, L99D, L99E, L99G, L99H, L99K, L99N, L99P, L99Q, L99R, L99S, L99W 또는 L99Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 degS 유전자,
및 임의로 돌연변이체 degU 유전자이며, 여기서
- degU 유전자는 감소된 DNA 결합 활성을 갖는 DegU 단백질을 코딩하고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여되고/거나,
- degU 유전자는 DegU 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는, 각각의 대안 aa) 및 ab)에 대해 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 중 1개 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 돌연변이체 degU 유전자:
aa) Q218*, Q218K, Q218N, Q218D, Q218R
ab) D223*, D223*+M220N, D223*+M220N+E221G, D223*+M220N+V222G, D223*+M220N+E221G+V222G, D223*+M220D, D223*+M220E, D223*+M220H, D223*+M220F, D223*+M220W, D223*+M220S, D223*+M220A,
또는
b) 돌연변이체 spo0A 유전자이며, 여기서
ba) 돌연변이는 DNA 결합 또는 수신자 도메인에 위치하고 Spo0A 단백질의 인산화의 감소 또는 제거 및/또는 이량체화의 감소 또는 제거를 발생시키고/거나,
bb) 돌연변이는 하기 중 임의의 것으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 것인 돌연변이체 spo0A 유전자:
- A257V, 보다 바람직하게는 A257S,
- I161R, 보다 바람직하게는 I161L,
- 선호도가 감소하는 순서대로: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R
의, 하기의 분류학적 계급 중 임의의 것으로부터 선택된 미생물의 접합 적격성을 증가시키기 위한 용도를 제공한다:
- 피르미쿠테스 문, 바실리(Bacilli), 클로스트리디아(Clostridia) 또는 네가티비쿠테스(Negativicutes) 강,
- 보다 바람직하게는 바실랄레스(Bacillales), 클로스트리디알레스(Clostridiales), 써모아나에로박테랄레스(Thermoanaerobacterales), 써모세디미니박테랄레스(Thermosediminibacterales) 또는 셀레노모나달레스(Selenomonadales) 목,
- 보다 바람직하게는 바실라세아에(Bacillaceae), 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae), 파스토리아세아에(Pasteuriaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 펩토코카세아에(Peptococcaceae), 헬리오박테리아세아에(Heliobacteriaceae), 신트로포모나다세아에(Syntrophomonadaceae), 써모아나에로박테라세아에(Thermoanaerobacteraceae), 테피다나에로박테라세아에(Tepidanaerobacteraceae) 또는 스포로무사세아에(Sporomusaceae) 과,
- 보다 바람직하게는 알칼리바실루스(Alkalibacillus), 바실루스(Bacillus), 게오바실루스(Geobacillus), 할로바실루스(Halobacillus), 리시니바실루스(Lysinibacillus), 피스키바실루스(Piscibacillus), 테리바실루스(Terribacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 파에니바실루스, 써모바실루스(Thermobacillus), 파스토리아(Pasteuria), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 헬리오박테리움(Heliobacterium), 펠로스포라(Pelospora), 펠로토마쿨룸(Pelotomaculum), 칼다나에로박터(Caldanaerobacter), 무렐라(Moorella), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 테피다나에로박터(Tepidanaerobacter), 프로피오니스포라(Propionispora) 또는 스포로무사(Sporomusa) 속,
- 보다 바람직하게는 바실루스, 파에니바실루스 또는 클로스트리디움 속.
도 1은 파에니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) 균주의 유전자 적격성의 평가를 제시한다. 상이한 변이체의 유전자 적격성은 큐어링된 균주를 공여자 균주로서의 문헌 [Ruetering et al. 2017] (실시예 1 참조) pCasPP 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이(E. coli) S17-1과 접합시킴으로써 평가되었다. 플라스미드는 게오바실루스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)로부터의 구성적 sgsE 프로모터의 제어 하에 발현된 SpCas9 유전자를 함유하고 어떠한 피. 폴리믹사 게놈을 표적화하는 gRNA도 함유하지 않는다. 계수가능한 콜로니를 수득하기 위해, 연속 희석액이 접합된 균주를 항생제를 갖는 선택 LB 플레이트 상으로 플레이팅하기 전에 제조되었다. 각각의 균주로부터의 콜로니 형성 단위는 이어서 접합에 사용된 그의 각각의 OD600에 대해 정규화된다. 마지막으로, 적격성 배수의 수는 야생형에 대해 계산된다.
(DegS 단백질에 관한) 도 2는 서열식별번호(SEQ ID NO): 2 및 유니프롯(Uniprot) 항목 A0A074LBY4_PAEPO에 따른 서열의 서열 정렬을 제시한다. 번호는 유니프롯 항목 A0A074LBY4_PAEPO 서열의 위치에 따라 제공된다. A0A074LBY4_PAEPO 서열의 각각의 아미노산 위 별표의 수는 보존의 정도를 나타내며, 여기서 별의 보다 높은 수는 보다 강한 보존을 나타낸다. 서열식별번호: 2의 각각의 아미노산 아래 제공된 아미노산은 각각의 위치에서 허용가능한 잠재적인 치환을 나타내며, 여기서 "-"는 갭 (A0A074LBY4_PAEPO 서열에 비해 결실)을 나타낸다. 가능한 치환은 이들의 각각의 선호도의 순서대로 열거되며, 여기서 보다 바람직한 치환은 서열식별번호: 2에서의 각각의 위치에 보다 가깝게 표시된다.
(DegU 단백질에 관한) 도 3은 서열식별번호: 1 및 유니프롯 항목 E3EBP5_PAEPS에 따른 서열의 서열 정렬을 제시한다. 번호는 유니프롯 항목 E3EBP5_PAEPS 서열의 위치에 따라 제공된다. E3EBP5_PAEPS 서열의 각각의 아미노산 위 별표의 수는 보존의 정도를 나타내며, 여기서 별의 보다 높은 수는 보다 강한 보존을 나타낸다. 서열식별번호: 1의 각각의 아미노산 아래 제공된 아미노산은 각각의 위치에서 허용가능한 잠재적인 치환을 나타내며, 여기서 "-"는 갭 (E3EBP5_PAEPS 서열에 비해 결실)을 나타낸다. 가능한 치환은 이들의 각각의 선호도의 순서대로 열거되며, 여기서 보다 바람직한 치환은 서열식별번호: 1에서의 각각의 위치에 보다 가깝게 표시된다.
(Spo0A 단백질에 관한) 도 4는 서열식별번호: 3 및 유니프롯 항목 A0A074LZY6_PAEPO에 따른 서열의 서열 정렬을 제시한다. 번호는 유니프롯 항목 A0A074LZY6_PAEPO 서열의 위치에 따라 제공된다. A0A074LZY6_PAEPO 서열의 각각의 아미노산 위 별표의 수는 보존의 정도를 나타내며, 여기서 별의 보다 높은 수는 보다 강한 보존을 나타낸다. 서열식별번호: 3의 각각의 아미노산 아래 제공된 아미노산은 각각의 위치에서 허용가능한 잠재적인 치환을 나타내며, 여기서 "-"는 갭 (A0A074LZY6_PAEPO 서열에 비해 결실)을 나타낸다. 가능한 치환은 이들의 각각의 선호도의 순서대로 열거되며, 여기서 보다 바람직한 치환은 서열식별번호: 3에서의 각각의 위치에 보다 가깝게 표시된다.
서열의 간단한 설명
(DegS 단백질에 관한) 도 2는 서열식별번호(SEQ ID NO): 2 및 유니프롯(Uniprot) 항목 A0A074LBY4_PAEPO에 따른 서열의 서열 정렬을 제시한다. 번호는 유니프롯 항목 A0A074LBY4_PAEPO 서열의 위치에 따라 제공된다. A0A074LBY4_PAEPO 서열의 각각의 아미노산 위 별표의 수는 보존의 정도를 나타내며, 여기서 별의 보다 높은 수는 보다 강한 보존을 나타낸다. 서열식별번호: 2의 각각의 아미노산 아래 제공된 아미노산은 각각의 위치에서 허용가능한 잠재적인 치환을 나타내며, 여기서 "-"는 갭 (A0A074LBY4_PAEPO 서열에 비해 결실)을 나타낸다. 가능한 치환은 이들의 각각의 선호도의 순서대로 열거되며, 여기서 보다 바람직한 치환은 서열식별번호: 2에서의 각각의 위치에 보다 가깝게 표시된다.
(DegU 단백질에 관한) 도 3은 서열식별번호: 1 및 유니프롯 항목 E3EBP5_PAEPS에 따른 서열의 서열 정렬을 제시한다. 번호는 유니프롯 항목 E3EBP5_PAEPS 서열의 위치에 따라 제공된다. E3EBP5_PAEPS 서열의 각각의 아미노산 위 별표의 수는 보존의 정도를 나타내며, 여기서 별의 보다 높은 수는 보다 강한 보존을 나타낸다. 서열식별번호: 1의 각각의 아미노산 아래 제공된 아미노산은 각각의 위치에서 허용가능한 잠재적인 치환을 나타내며, 여기서 "-"는 갭 (E3EBP5_PAEPS 서열에 비해 결실)을 나타낸다. 가능한 치환은 이들의 각각의 선호도의 순서대로 열거되며, 여기서 보다 바람직한 치환은 서열식별번호: 1에서의 각각의 위치에 보다 가깝게 표시된다.
(Spo0A 단백질에 관한) 도 4는 서열식별번호: 3 및 유니프롯 항목 A0A074LZY6_PAEPO에 따른 서열의 서열 정렬을 제시한다. 번호는 유니프롯 항목 A0A074LZY6_PAEPO 서열의 위치에 따라 제공된다. A0A074LZY6_PAEPO 서열의 각각의 아미노산 위 별표의 수는 보존의 정도를 나타내며, 여기서 별의 보다 높은 수는 보다 강한 보존을 나타낸다. 서열식별번호: 3의 각각의 아미노산 아래 제공된 아미노산은 각각의 위치에서 허용가능한 잠재적인 치환을 나타내며, 여기서 "-"는 갭 (A0A074LZY6_PAEPO 서열에 비해 결실)을 나타낸다. 가능한 치환은 이들의 각각의 선호도의 순서대로 열거되며, 여기서 보다 바람직한 치환은 서열식별번호: 3에서의 각각의 위치에 보다 가깝게 표시된다.
서열의 간단한 설명
본 발명의 기술적 교시는 언어 수단을 사용하여, 특히 과학 및 기술 용어의 사용에 의해 본원에서 표현된다. 그러나, 통상의 기술자는 언어 수단이, 이들이 상세하고 정확할 수 있는 바와 같이, 교시를 표현하는 다수의 방식이 있기 때문에 각각의 표현이 반드시 끝나야 하므로, 각각이 반드시 모든 개념적 연결을 완전히 표현하는 데 실패한 경우에만, 오직 기술적 교시의 전체 내용에 접근할 수 있다는 것을 이해한다. 이를 염두에 두고, 통상의 기술자는 본 발명의 대상이 서면 설명의 본질적 제약에 의해, 반드시 전체를 대표하는 일부 방식으로, 본원에서 의미되거나 또는 표현된 개별적인 기술적 개념의 합이라는 것을 이해한다. 특히, 통상의 기술자는 개별적인 기술적 개념의 의미가 예를 들어 3개의 개념 또는 실시양태 A, B 및 C의 개시내용이 개념 A+B, A+C, B+C, A+B+C의 약칭 표기이도록, 기술적으로 합리적인 한 개념의 각각의 가능한 조합의 철자를 말하는 약어로서 본원에서 수행된다는 것을 이해할 것이다. 특히, 특색에 대한 폴백 위치는 수렴 대안 또는 예시화의 목록의 측면에서 본원에 기재된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명은 이러한 대안의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 목록으로부터의 다소 바람직한 요소의 선택은 본 발명의 일부이고 최소 정도의 이점의 실현 또는 각각의 특색에 의해 전달된 이점에 대한 통상의 기술자의 선호도로 인한 것이다. 이러한 다수의 조합된 예시화는 본 발명의 충분히 바람직한 형태(들)를 나타낸다.
본원에서 데이터베이스 항목, 예를 들어, 유니프롯 항목을 참조하는 한, 항목은 2021-05-01 10:00 CET에 공개된 바와 같은 것이다. 이는 또한 상응하는 데이터베이스 항목 식별자 하에 공개된 서열에 적용된다.
핵산 및 아미노산은 이들의 표준 1- 또는 3-문자 약어를 사용하여 축약된다. 결실은 "-"에 의해 표시되고, 말단절단은 "*"에 의해 표시된다. 아미노산의 변경은 각각의 모 서열에서의 변경의 위치에 의해 명시된다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수 및 단수 형태의 용어는 내용상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "핵산"의 사용은, 실용적인 방식으로, 해당 핵산 분자의 많은 카피를 임의로 포함하고; 유사하게, 용어 "프로브"는 많은 유사하거나 또는 동일한 프로브 분자를 임의로 (및 전형적으로) 포함한다. 또한 본원에 사용된 바와 같은, 단어 "포함하는" 또는 변이 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하나, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 함축하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안적으로 해석되는 경우 조합의 결여 ("또는")를 지칭하고 포함한다. 용어 "포함하는"은 또한 용어 "이루어진"을 포함한다.
용어 "약"은, 측정가능한 값, 예를 들어 질량, 용량, 시간, 온도, 서열 동일성 등의 양과 관련하여 사용될 때, 명시된 값의 ± 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 또는 심지어 20%의 변이뿐만 아니라 명시된 값을 지칭한다. 따라서, 제공된 조성물이 "약 50% X"를 포함하는 것으로 기재되는 경우에, 일부 실시양태에서, 조성물이 50% X를 포함하지만 다른 실시양태에서 이는 40% 내지 60% X (즉, 50% ± 10%)의 임의의 곳을 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"는, 핵산에서 구체화될 때, 유전자 산물, 즉, 추가 핵산, 바람직하게는 RNA로 전사될 수 있고, 바람직하게는 또한 펩티드 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 생화학적 정보를 지칭한다. 용어는 따라서 또한 상기 정보와 닮은 핵산의 절편 및 이러한 핵산의 서열 (본원에서 또한 "유전자 서열"로 불림)을 나타내는 데 사용된다.
또한 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대립유전자"는 다른 서열 차이의 존재와 상관없이, 야생형 유전자 서열과 비교하여 유전자 서열에서의 하나 이상의 특정 차이를 특징으로 하는 유전자의 변이를 지칭한다. 본 발명의 대립유전자 또는 뉴클레오티드 서열 변이체는 야생형 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도, 선호도가 증가하는 순서대로, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%-84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 뉴클레오티드 "서열 동일성"을 갖는다. 상응하게, "대립유전자"가 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하기 위한 생화학적 정보를 지칭하는 경우에, 대립유전자의 각각의 핵산 서열은 각각의 야생형 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 적어도, 선호도가 증가하는 순서대로, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%-84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 "서열 동일성"을 갖는다.
아미노 또는 핵산 서열의 돌연변이 또는 변경은 치환, 결실 또는 삽입 중 임의의 것일 수 있고; 용어 "돌연변이" 또는 "변경"은 또한 이들의 임의의 조합을 포함한다. 이하, 모든 3개의 특정 돌연변이 방식이 아미노산 서열 돌연변이에 대한 참조에 의해 보다 상세하게 기재되고; 상응하는 교시가 "아미노산"이 "뉴클레오티드"에 의해 대체되도록 핵산 서열에 적용된다. 돌연변이는 무작위 또는 지정 돌연변이유발 기술에 의해 유전자의 뉴클레오티드 서열 내로 도입될 수 있다. 무작위 돌연변이유발 기술은 예를 들어 UV 조사 및 화학물질, 예를 들어 EMS에 대한 노출을 포함한다. 지정 돌연변이유발 기술은 프라이머 연장, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 및 CRISPR-유형 주형 지정 돌연변이유발을 포함한다.
"치환"은 원래의 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 위치의 번호, 이어서 치환된 아미노산을 제공함으로써 기재된다. 예를 들어, 알라닌으로의 위치 120에서의 히스티딘의 치환은 "His120Ala" 또는 "H120A"로서 지정된다.
"결실"은 원래의 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 위치의 번호, 이어서 "-"를 제공함으로써 기재된다. 따라서, 위치 150에서의 글리신의 결실은 ""Gly150-" 또는 "G150-"로서 지정된다. 대안적으로, 결실은 예를 들어 "D183 및 G184"의 결실에 의해 표시된다.
"종결"은 원래의 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 위치의 번호, 이어서 "*"를 제공함으로써 기재된다. 따라서, 이 위치에서의 글리신 대신에 위치 150에서의 아미노산 쇄 종결은 "G150*"의 "Gly150*"로서 지정된다.
"삽입"은 원래의 아미노산에 이어 아미노산 서열 내 위치의 번호, 이어서 원래의 아미노산 및 추가적인 아미노산을 제공함으로써 기재된다. 예를 들어, 위치 180에서의 글리신 다음에 리신의 삽입은 "Gly180GlyLys" 또는 "G180GK"로서 지정될 것이다. 1개 초과의 아미노산 잔기가 삽입될 때, 예컨대 예를 들어 Gly180 뒤에 Lys 및 Ala는 하기로서 표시될 수 있다: Gly180GlyLysAla 또는 G180GKA. 치환 및 삽입이 동일한 위치에서 발생하는 경우에, 이는 S99SD+S99A 또는 요컨대 S99AD로서 표시될 수 있다. 기존 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기가 삽입되는 경우에, 명명법에서의 축중성이 발생한다는 것이 명백하다. 예를 들어 글리신이 상기 예에서 글리신 뒤에 삽입되는 경우에 이는 G180GG에 의해 표시될 것이다.
다중 변경을 포함하는 변이체는 "+"에 의해 분리되며, 예를 들어, "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 각각 티로신 및 글루탐산으로의 위치 170 및 195에서의 아르기닌 및 글리신의 치환을 나타낸다. 대안적으로, 다중 변경은 스페이스 또는 콤마에 의해 분리될 수 있으며, 예를 들어, 각각 R170Y G195E 또는 R170Y, G195E이다.
상이한 변경이 한 위치에 도입될 수 있는 경우에, 상이한 변경은 콤마에 의해 분리되며, 예를 들어, "Arg170Tyr, Glu"는 티로신 또는 글루탐산으로의 위치 170에서의 아르기닌의 치환을 나타낸다. 대안적으로, 상이한 변경 또는 임의적인 치환은 괄호에 표시될 수 있으며 예를 들어 Arg170[Tyr, Gly] 또는 Arg170{Tyr, Gly} 또는 요컨대 R170[Y,G] 또는 R170{Y, G}이다.
아미노산 치환에 관한 특별한 측면은 종종 모 펩티드 또는 폴리펩티드의 펩티드 또는 폴리펩티드 특성과 비교하여 각각의 펩티드 또는 폴리펩티드 변이체의 실질적으로 유지된 펩티드 또는 폴리펩티드 특성을 발생시키는 단백질 폴딩에 대한 최소 효과를 갖는 것으로 보이는 보존적 돌연변이이다. 보존적 돌연변이는 1개의 아미노산이 유사한 아미노산으로 교환되는 것이다. %-유사성의 결정을 위해 하기가 적용되며, 이는 또한 데이터베이스 검색 및 서열 정렬을 위한 가장 많이 사용된 아미노산 유사성 매트릭스 중 하나인 BLOSUM62 매트릭스에 따른다:
아미노산 A는 아미노산 S와 유사하다
아미노산 D는 아미노산 E, N과 유사하다
아미노산 E는 아미노산 D, K 및 Q와 유사하다
아미노산 F는 아미노산 W, Y와 유사하다
아미노산 H는 아미노산 N, Y와 유사하다
아미노산 I는 아미노산 L, M 및 V와 유사하다
아미노산 K는 아미노산 E, Q 및 R과 유사하다
아미노산 L은 아미노산 I, M 및 V와 유사하다
아미노산 M은 아미노산 I, L 및 V와 유사하다
아미노산 N은 아미노산 D, H 및 S와 유사하다
아미노산 Q는 아미노산 E, K 및 R과 유사하다
아미노산 R은 아미노산 K 및 Q와 유사하다
아미노산 S는 아미노산 A, N 및 T와 유사하다
아미노산 T는 아미노산 S와 유사하다
아미노산 V는 아미노산 I, L 및 M과 유사하다
아미노산 W는 아미노산 F 및 Y와 유사하다
아미노산 Y는 아미노산 F, H 및 W와 유사하다
보존적 아미노산 치환은 기능적 단백질 예컨대 펩티드 또는 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열의 전장 서열에 걸쳐 발생할 수 있다. 바람직하게는 이러한 돌연변이는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 도메인과 관련되지 않는다.
단백질 또는 핵산 변이체는 모 단백질 또는 핵산과 비교될 때 이들의 서열 동일성에 의해 정의될 수 있다. 서열 동일성은 통상적으로 "% 서열 동일성" 또는 "% 동일성"으로서 제공된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트-동일성을 결정하기 위해 제1 단계에서 쌍별 서열 정렬이 이들 2개의 서열 사이에 생성되며, 여기서 2개의 서열은 이들의 완전한 길이에 걸쳐 정렬된다 (즉, 쌍별 전체 정렬). 정렬은 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 알고리즘을 실행하는 프로그램으로 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453), 바람직하게는 프로그램 디폴트 파라미터 (갭 개방=10.0, 갭 연장=0.5 및 매트릭스=EBLOSUM62)를 사용한 프로그램 "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))를 사용함으로써 생성된다. 본 발명의 목적을 위한 바람직한 정렬은 가장 높은 서열 동일성이 결정될 수 있는, 해당 정렬이다.
하기 예는 2개의 뉴클레오티드 서열을 예시하는 것으로 의도되나, 동일한 계산이 단백질 서열에 적용된다:
Seq A: AAGATACTG 길이: 9개의 염기
Seq B: GATCTGA 길이: 7개의 염기
그러므로, 보다 짧은 서열은 서열 B이다.
이들의 완전한 길이에 걸쳐 두 서열을 나타내고 있는 쌍별 전체 정렬을 생산하면 다음과 같다:
정렬에서 "I" 기호는 동일한 잔기를 나타낸다 (이는 DNA의 경우 염기 또는 단백질의 경우 아미노산을 의미함). 동일한 잔기의 수는 6개이다.
정렬에서 "-" 기호는 갭을 나타낸다. 서열 B 내 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 1개이다. 서열 B의 경계에서 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 2개이고, 서열 A의 경계에서는 1개이다.
이들의 완전한 길이에 걸쳐 정렬된 서열을 나타내는 정렬 길이는 10개이다.
본 발명에 따른 그의 완전한 길이에 걸쳐 보다 짧은 서열을 나타내고 있는 쌍별 정렬을 생산하면 결과적으로 다음과 같다:
본 발명에 따른 그의 완전한 길이에 걸쳐 서열 A를 나타내고 있는 쌍별 정렬을 생산하면 결과적으로 다음과 같다:
본 발명에 따른 그의 완전한 길이에 걸쳐 서열 B를 나타내고 있는 쌍별 정렬을 생산하면 결과적으로 다음과 같다:
그의 완전한 길이에 걸쳐 보다 짧은 서열을 나타내는 정렬 길이는 8개이다 (보다 짧은 서열의 정렬 길이에 고려되는 1개의 갭이 존재함).
따라서, 그의 완전한 길이에 걸쳐 서열 A를 나타내는 정렬 길이는 9개일 것이고 (서열 A가 본 발명의 서열임을 의미함), 그의 완전한 길이에 걸쳐 서열 B를 나타내는 정렬 길이는 8개일 것이다 (서열 B가 본 발명의 서열임을 의미함).
2개의 서열을 정렬한 후, 제2 단계에서, 동일성 값이 정렬로부터 결정될 것이다. 그러므로, 본 명세서에 따라 퍼센트-동일성의 하기 계산이 적용된다:
%-동일성 = (동일한 잔기 / 그의 완전한 길이에 걸쳐 본 발명의 각각의 서열을 나타내고 있는 정렬 영역의 길이) *100. 따라서, 본 발명에 따른 2개의 아미노산 서열의 비교와 관련하여 서열 동일성은 동일한 잔기의 수를 그의 완전한 길이에 걸쳐 본 발명의 각각의 서열을 나타내고 있는 정렬 영역의 길이로 나눔으로써 계산된다. 이 값에 100을 곱하여 "%-동일성"을 제공한다. 상기 제공된 예에 따라, %-동일성은 하기와 같다: 서열 A가 본 발명의 서열인 경우 (6 / 9) * 100 = 66.7 %; 서열 B가 본 발명의 서열인 경우 (6 / 8) * 100 =75%.
용어 "발현 카세트"는 발현될 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 그의 발현 (즉 전사 및 / 또는 번역)을 가능하게 하거나 또는 조절하는 적어도 1개의 유전자 제어 요소에 작동가능하게 연결되는 이들 구축물을 의미한다. 발현은, 예를 들어, 안정하거나 또는 일시적인, 구성적 또는 유도성일 수 있다. 발현 카세트는 또한 2개 이상의 폴리펩티드에 대한 코딩 영역을 포함하고 폴리시스트론 RNA의 전사를 야기할 수 있다.
용어 "발현한다", "발현하는", "발현된" 및 "발현"은 코딩된 이 단백질의 생성된 효소 활성, 또는 그가 지칭하는 경로 또는 반응이 이 유전자/경로가 발현되는 유기체에서의 이 경로 또는 반응을 통한 대사 유동을 허용하는 수준에서의 유전자 산물 (예를 들어, 이 출원에 정의되고 기재된 경로 또는 반응의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 지칭한다. 발현은 출발 유기체로서 사용되는 미생물의 유전자 변경에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미생물은 출발 미생물에 의해 생산된 것 또는 변경되지 않은 비교할 만한 미생물에 비해 증가된 수준에서 유전자 산물을 발현하도록 유전자 변경될 (예를 들어, 유전자 조작될) 수 있다. 유전자 변경은 (예를 들어 강한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 첨가함으로써 또는 발현이 구성적이도록 조절 서열을 제거함으로써) 특정한 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위를 변경하거나 또는 변형시키는 것, 특정한 유전자의 염색체 위치를 변형시키는 것, 특정한 유전자에 인접한 핵산 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자를 변경하는 것, 특정한 유전자의 카피 수를 증가시키는 것, 특정한 유전자의 전사 및/또는 특정한 유전자 산물의 번역에 수반된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제인자, 인핸서, 전사 활성인자 등)을 변형시키는 것, 또는 관련 기술분야에서 일상적인 것을 사용하여 (예를 들어, 억제인자 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 특정한 유전자의 발현을 탈조절하는 임의의 다른 종래의 수단을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "과다발현한다", "과다발현하는", "과다발현된" 및 "과다발현"은 유전자 산물의 발현, 특히 출발 미생물의 유전자 변경 전에 존재하는 것 보다 더 큰 수준으로 유전자 산물의 발현을 증진시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 출발 미생물에 의해 생산된 것에 비해 증가된 수준에서 유전자 산물을 발현하도록 유전자 변경될 (예를 들어, 유전자 조작될) 수 있다. 유전자 변경은 (예를 들어, 강한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 첨가함으로써 또는 발현이 구성적이도록 조절 서열을 제거함으로써) 특정한 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위를 변경하거나 또는 변형시키는 것, 특정한 유전자의 염색체 위치를 변형시키는 것, 특정한 유전자에 인접한 핵산 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자를 변경하는 것, 특정한 유전자의 카피 수를 증가시키는 것, 특정한 유전자의 전사 및/또는 특정한 유전자 산물의 번역에 수반된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제인자, 인핸서, 전사 활성인자 등)을 변형시키는 것, 또는 관련 기술분야에서 일상적인 것을 사용하여 (예를 들어, 억제인자 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 특정한 유전자의 발현을 탈조절하는 임의의 다른 종래의 수단을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유전자 산물을 과다발현하는 또 다른 방식은 유전자 산물의 안정성을 증진시켜 그의 수명을 증가시키는 것이다. 용어 "과다발현한다", "과다발현하는", "과다발현된" 및 "과다발현"은 또한 유전자 활성이, 예를 들어 1개 이상의 카피 중 재조합체 유전자, 예를 들어 이종성 유전자를 바람직하게는 유전자 조작에 의해 미생물 내로 도입함으로써, 미생물 내로 도입되며, 여기서 각각의 유전자 활성은 이전에 관측되지 않았다는 것을 의미할 수 있다.
본 발명은 상응하는 야생형 균주에 비해 증가된 접합 적격성을 나타내는 미생물을 제공한다. 이는 본 발명의 미생물이 (a) 돌연변이체 degS 유전자 및 바람직하게는 돌연변이체 degU 유전자를 포함하나 돌연변이체 spo0A 유전자는 포함하지 않거나, 또는 (b) 돌연변이체 degS 유전자를 포함하지 않으면서 및 바람직하게는 또한 돌연변이체 degU 유전자를 포함하지 않으면서 돌연변이체 spo0A 유전자를 포함하기 때문에 달성된다. 이는 degS-degU 오페론의 불활성화가 유전자 적격성을 감소시켰고, degS의 다양한 불활성화가 적격성으로 하여금 영향을 받지 않게 하였다는 것을 기재하는, 문헌 [Hamoen et al., The pleiotropic response regulator DegU functions as a priming protein in competence development in Bacillus subtilis, PNAS 2000, 9246-9251]에 의한 공개문헌의 관점에서 놀라웠다. 더욱이, 문헌 [Verhamme et al. , DegU co-ordinates multicellular behaviour exhibited by Bacillus subtilis, Molecular Microbiology, 2007, 554-568]은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유전자 적격성 발생이 DegS와 독립적이라는 것을 기재한다. 더욱이, Spo0A는 AbrB 유전자 발현을 하향-조절하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 결과적으로 comK 발현의 억제인자이며, 이는 결과적으로 바실루스 서브틸리스에서 적격성 발생의 핵심 인자이다. 따라서, degS 및 바람직하게는 또한 degU 유전자 또는 spo0A 유전자의 변형이 기껏 적격성으로 하여금 영향을 받지 않게 할 것이거나 또는 심지어 적격성을 감소시킬 것임이 예상되어야 했다. 특히 파에니바실루스 속의 다른 미생물은 심지어 바실루스 서브틸리스의 comK 유전자의 상동체를 포함하지 않고; 유전자 적격성의 조절은 따라서 예견할 수 없었다. 마지막으로, 공개문헌 WO2019221988은 실시예 3에서, 접합을 통해, 접합 효율에 대한 어떠한 명백한 효과도 없이 DegS 및/또는 DegU 돌연변이체를 포함하는 파에니바실루스 균주를 표적화하는 것을 기재한다. 따라서 접합 적격성이 DegS, DegU 및 Spo0A를 코딩하는 유전자를 돌연변이시킴으로써 증가될 수 있다는 것, 및 이 증가가 오직 Spo0A를 코딩하는 유전자 또는 DegS 또는 DegU를 코딩하는 유전자가 돌연변이될 때만 드러난다는 것이 놀라웠다.
본 발명은 따라서 돌연변이체 degS 유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 돌연변이체 degS 유전자는, 미생물에서 발현될 때, 돌연변이체 DegS 단백질의 생산을 발생시키고, degS 유전자는 DegS 단백질을 코딩한다. 본 발명에 따라 야생형 DegS 단백질은 DegS 유형 신호 전달 히스티딘 키나제 패밀리의 구성원이고 (인터프로(InterPro) ID IPR016381) 인터프로 표기법을 사용하여, 센서 DegS 도메인 (IPR008595) 및 히스티딘 키나제 도메인 (IPR005467)을 포함한다. Pfam 명명법에 따라 야생형 DegS 단백질은 센서 단백질 DegS 도메인 (PF05384), HisKA_3 히스티딘 키나제 도메인 (PF07730) 및 HATPase_c GHKL 도메인 (PF02518)을 포함한다. 바람직하게는 야생형 degS 유전자는 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 2에 대해 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 43%, 보다 바람직하게는 적어도 46%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 58%, 보다 바람직하게는 적어도 64%, 보다 바람직하게는 적어도 79%, 보다 바람직하게는 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 DegS 단백질을 코딩하며, 여기서 바람직하게는 서열식별번호: 2에 대한 서열 동일성은 최대 95%, 보다 바람직하게는 최대 91%이다. 특히 바람직한 야생형 DegS 단백질은 서열식별번호: 2에 대해 50-95%, 보다 바람직하게는 58-89% 서열 동일성을 갖는다. 서열식별번호: 2가 아미노산 서열 스크리닝 및 어닐링 목적을 위한 주형으로서 특이적으로 구축된 인공 아미노산 서열이라는 것이 이해되어야 한다. 서열은 따라서 서열식별번호: 2의 폴리펩티드의 어떠한 DegS 활성도 본원에 제시되지 않는다는 사실과 관계없이 degS 유전자의 확인에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 또는 식물에서 야생형 degS 유전자로서 특히 바람직한 것은 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 유니프롯 식별자에 의해 정의된 아미노산 서열 중 임의의 것이다: A0A074LBY4_PAEPO, E3EBP6_PAEPS, A0A4R6MVR0_9BACL, A0A069DLG2_9BACL, A0A268SAI9_9BACL, A0A1X7GB86_9BACL, A0A0M2VLZ1_9BACL, A0A1R1EED0_9BACL, A0A0B0HR83_9BACL, A0A4P8XRM7_9BACL, W7YPT3_9BACL, A0A433XGY7_9BACL, D3EMG1_GEOS4, V9GK22_9BACL, A0A269W177_9BACL, A0A3Q8SA22_9BACL, A0A1E3L2X6_9BACL, A0A369BCF2_9BACL, A0A2S0UEJ3_9BACL, A0A090XSK7_PAEMA, A0A3S1DMQ5_9BACL, A0A1B1N3X4_9BACL, C6J2I3_9BACL, A0A172ZLS7_9BACL, A0A1G7PLD1_9BACL, A0A2Z2KM36_9BACL, A0A3Q9IDP6_9BACL, A0A0D3VFE7_9BACL, A0A168QEJ2_9BACL, A0A1B8VU57_9BACI, W4EHN2_9BACL, A0A0E4CZI9_9BACL, A0A089L4Y0_9BACL, A0A098MEC1_9BACL, A0A089IPW0_9BACL, A0A167D837_9BACL, A0A089NAN3_9BACL, X4ZSE0_9BACL, A0A2W1M2J1_9BACL, A0A1I0JTZ3_9BACL, A0A4Q2LW12_9BACL, A0A1I3PZ40_9BACL, A0A401I4T4_9BACL, A0A1B8UU84_9BACL, A0A1T2X709_9BACL, A0A2N5NDJ2_9BACL, A0A0F5RAF5_9BACL, A0A3G9IYB3_9BACL, A0A1H1WM07_9BACL, H3S9W1_9BACL, A0A1I6WIJ5_9BACL, A0A0D5NQK3_9BACL, A0A015KKW1_9BACL, A0A3D9SD21_9BACL, A0A1B8VZZ2_9BACI, M9LFD8_PAEPP, A0A2V4WBE9_9BACL, A0A0U2WI25_9BACL, A0A1R1DAI7_9BACL, A0A368VS81_9BACL, E0IEE5_9BACL, A0A371P0S2_9BACL, A0A4P6EY40_9BACL, L0EJK6_THECK, A0A3D9I772_9BACL, A0A1X7KY93_9BACL, A0A231R9F5_9BACL, A0A3A1UXN0_9BACL, A0A494XFI9_9BACL, A0A1Y5KD15_9BACL, A0A398CI63_9BACL, A0A3T1DDD1_9BACL, A0A0Q4RDM1_9BACL, C6D5A2_PAESJ, A0A2V2Z262_9BACL, A0A3G3K194_9BACL, A0A3D9KBV6_9BACL, A0A1A5YD71_9BACL, A0A433R8L8_9BACL, A0A172TIT6_9BACL, A0A1I1BCS1_9BACL, A0A081P3I5_9BACL, A0A4R5KGY1_9BACL, A0A229USJ3_9BACL, A0A2V5JWK3_9BACL, A0A329MCI0_9BACL, A0A0U2INE8_9BACL, A0A1K1QX93_9BACL, A0A2W1NWZ0_9BACL, A0A1I4LCQ8_9BACL, A0A329L6X4_9BACL, A0A0C2V9A2_9BACL, A0A4Q9DIC7_9BACL, H6NT63_9BACL, A0A1H4RQL7_9BACL, A0A3B0C2F8_9BACL, V9VZ78_9BACL, A0A1H0L1L7_9BACL, A0A430JA16_9BACL, F5LST9_9BACL, A0A4R4EAF4_9BACL, A0A0Q7JRA6_9BACL, A0A1V4HGJ0_9BACL, A0A1C0ZYJ1_9BACL, A0A4R3KJJ5_9BACI, M8DFK7_9BACL, A0A1U9KAR4_9BACL, A0A3M8DWV1_9BACL, A0A1A5XKA3_9BACL, A0A1E5LA89_9BACL, A0A074LTT3_9BACL, A0A1I4CE81_9BACL, C0Z731_BREBN, V6MBX1_9BACL, A0A1Y0IJ16_9BACL, A0A3M8BE71_9BACL, A0A4Q1STZ5_9BACL, A0A1E5G3N9_9BACL, A0A075RB77_BRELA, A0A419SF93_9BACL, A0A1Z5HTH4_9THEO, F5L9B1_CALTT, A0A3S9T1P5_9FIRM, A0A2N5M9N1_9BACI, A0A235FGA1_9BACI, A0A0M2U6G0_9FIRM, A0A4R6TU87_9BACI, A0A1E5LDM8_9BACI, A0A498RIM9_9FIRM, A0A120HRZ3_9BACL, A0A4Q0VV23_9BACI, A0A1I2EJ29_9BACI, A0A1U7MGK1_9FIRM, E6TSA5_BACCJ, A0A3E2JMS2_9BACI, A0A1I4L1V6_9BACI, A0A2P8HQR2_9BACI, Q9K6U6_BACHD, A0A402BS91_9FIRM, A0A4R3MVB0_9BACI, X0RMB4_9BACI, A0A4R2RM72_9FIRM, A0A1H4AT83_9BACI, A0A292YC86_9BACL, C5D873_GEOSW, Q5KV50_GEOKA, A0A1W2BFW9_9FIRM, A0A285CZH1_9BACI 및 A0A1G9QKZ2_9FIRM. 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 유니프롯 식별자 A0A074LBY4_PAEPO에 의해 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 46%, 보다 바람직하게는 적어도 58% 및 더욱 더 바람직하게는 80-100% 서열 동일성을 갖는 야생형 DegS 단백질 서열 및 그를 코딩하는 상응하는 degS 유전자이다. 본 발명에 따라 기재된 DegS 단백질 서열에 대한 특정 돌연변이를 고려하지 않을 때, 돌연변이체 DegS 단백질은 바람직하게는 유니프롯 식별자 A0A074LBY4_PAEPO에 의해 제공된 아미노산 서열과 0-40개의 아미노산, 보다 바람직하게는 0-20개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 0-10개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 1-5개의 아미노산만큼 상이하며, 여기서 이들 차이는 바람직하게는 도 2에 따른 제약에 따른다. 돌연변이체 DegS 서열이, 유니프롯 식별자 A0A074LBY4_PAEPO에 따른 서열에 대해 정렬될 때, 상기 서열보다 더 긴 경우에, 각각의 C- 또는 N-말단 연장부는 바람직하게는 10개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 0-5개의 아미노산이다.
본 발명은 더욱이 돌연변이체 degS 유전자에 더하여 돌연변이체 degU 유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 돌연변이체 degU 유전자는, 미생물에서 발현될 때, 돌연변이체 DegU 단백질의 생산을 발생시키고, degU 유전자는 DegU 단백질을 코딩한다. 본 발명에 따라 야생형 DegU 단백질은 CheY-유사 슈퍼패밀리의 구성원이고 (인터프로 ID IPR011006) 인터프로 표기법을 사용하여, 신호 전달 반응 조절인자 (수신자 도메인) (IPR001789) 및 전사 조절인자 LuxR 도메인 (C-말단) (IPR000792)을 포함한다. Pfam 명명법에 따라 야생형 DegU 단백질은 반응 조절인자 수신자 도메인 (PF00072, Pao et al., J Mol Evol 1995, 136-154 Response regulators of bacterial signal transduction systems: selective domain shuffling during evolution), 및 LuxR-유형 DNA-결합 HTH 도메인 (PF00196)을 포함한다. 바람직하게는 야생형 degU 유전자는 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 대해 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 43%, 보다 바람직하게는 적어도 45%, 보다 바람직하게는 적어도 53%, 보다 바람직하게는 적어도 57%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 77%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 DegU 단백질을 코딩하며, 여기서 바람직하게는 서열식별번호: 1에 대한 서열 동일성은 최대 95%, 보다 바람직하게는 최대 92%이다. 특히 바람직한 야생형 DegU 단백질은 서열식별번호: 1에 대해 50-95%, 보다 바람직하게는 77-91% 서열 동일성을 갖는다. 서열식별번호: 1이 아미노산 서열 스크리닝 및 어닐링 목적을 위한 주형으로서 특이적으로 구축된 인공 아미노산 서열이라는 것이 이해되어야 한다. 서열은 따라서 서열식별번호: 1의 폴리펩티드의 어떠한 DegU 활성도 본원에 제시되지 않는다는 사실과 관계없이 degU 유전자의 확인에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 또는 식물에서 야생형 DegU 유전자로서 특히 바람직한 것은 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 유니프롯 식별자에 의해 정의된 아미노산 서열 중 임의의 것이다: E3EBP5_PAEPS, A0A4R6MUX9_9BACL, A0A268SA79_9BACL, A0A069DEZ2_9BACL, A0A0B0HVN5_9BACL, W4EI28_9BACL, A0A1X7GB62_9BACL, A0A089MEU3_9BACL, A0A0E4HEC8_9BACL, A0A4P8XUS1_9BACL, A0A0M2VKR6_9BACL, A0A089M364_9BACL, V9GIW8_9BACL, W7YTM0_9BACL, A0A098MFT1_9BACL, D3EMG0_GEOS4, A0A1B8VU54_9BACI, A0A2Z2KSF3_9BACL, A0A269W3P3_9BACL, A0A1R1EEL5_9BACL, X5A6E5_9BACL, A0A089IT67_9BACL, A0A1I0JV80_9BACL, A0A168QEL2_9BACL, A0A0D3VFM7_9BACL, A0A172ZLN3_9BACL, A0A167D848_9BACL, A0A1E3L0K1_9BACL, A0A2W1LCB1_9BACL, A0A0U2N3N5_9BACL, L0EHW2_THECK, A0A1T2X729_9BACL, A0A1B8UUC0_9BACL, H3S9W0_9BACL, A0A3D9SC72_9BACL, A0A401I4R6_9BACL, A0A1I6WHZ6_9BACL, A0A015NM30_9BACL, A0A0F5R725_9BACL, A0A2N5NDN0_9BACL, M9LLL0_PAEPP, A0A0D5NRR7_9BACL, A0A2S0UEL3_9BACL, A0A4Q2M1I7_9BACL, A0A1H1WMP7_9BACL, A0A3A1US45_9BACL, A0A3G9JII4_9BACL, C6D5A1_PAESJ, A0A433XGQ7_9BACL, A0A1I3PZK5_9BACL, A0A1R1DAD8_9BACL, A0A4P6F1N4_9BACL, A0A0Q4R517_9BACL, A0A172TIH8_9BACL, A0A2V4X724_9BACL, A0A1Y5KD60_9BACL, A0A368VSS2_9BACL, A0A1B8VZY5_9BACI, A0A371P0X4_9BACL, A0A231RB89_9BACL, A0A369BC27_9BACL, E0IEE4_9BACL, A0A2V2YZQ8_9BACL, A0A1G7PNR5_9BACL, A0A3S1BJF8_9BACL, A0A1A5YDL9_9BACL, A0A0U2WGN9_9BACL, A0A494X986_9BACL, A0A3D9KD00_9BACL, C6J2I4_9BACL, A0A3Q9IF25_9BACL, A0A3G3K2Z7_9BACL, A0A090XUD0_PAEMA, A0A3D9I787_9BACL, A0A398CFS8_9BACL, A0A1B1N3Y9_9BACL, A0A081P3I6_9BACL, A0A3T1DDG1_9BACL, A0A1K1QXK1_9BACL, A0A3Q8SA76_9BACL, A0A1X7KWC6_9BACL, A0A229USY4_9BACL, A0A4Q9DKY4_9BACL, A0A4R5KE70_9BACL, A0A329L4V8_9BACL, A0A2W1N4T3_9BACL, A0A1I1BB61_9BACL, H6NT64_9BACL, A0A1I4LD00_9BACL, A0A329MBB6_9BACL, A0A3S1AKF3_9BACL, F5LST8_9BACL, A0A1V4HGJ1_9BACL, A0A1H0L0T9_9BACL, A0A0Q7JPS4_9BACL, A0A1H4RQ86_9BACL, A0A3S0BTA6_9BACL, A0A1C0ZYC4_9BACL, A0A0C2RFX7_9BACL, V9W4A0_9BACL, A0A2V5KBB6_9BACL, A0A3B0C3G8_9BACL, A0A4R4EFH3_9BACL, A0A1U9KAL0_9BACL, A0A4R3KIF8_9BACI, A0A292YJB9_9BACL, A0A075RHH4_BRELA, A0A0D1XDF4_ANEMI, A0A1A5XJS0_9BACL, V6M9Z2_9BACL, A0A120HRZ5_9BACL, A0A419V950_9BACL, A0A3R9QNM1_9BACI, A0A1I4L117_9BACI, A0A1H0J2F9_9BACI, A0A3M8DYQ5_9BACL, A0A1I2EIB9_9BACI, A0A428N9S8_9BACI, A0A2P6MHC1_9BACI, A0A1I4CG56_9BACL, C0Z730_BREBN, M8DFP6_9BACL, A0A345BZD8_9BACI, A0A419SF78_9BACL, A0A3M8BE38_9BACL, A0A1H9W953_9BACI, A0A4Q1ST01_9BACL, F5L9B2_CALTT, A0A1G8AEE7_9BACI, D6Y0E8_BACIE, A0A4Q0VW28_9BACI, A0A2T4U7P0_9BACI, A0A061NX68_9BACL, A0A061P3R3_9BACL, A0A098EIU7_9BACL, A0A3M8P3C8_9BACL, A0A1H2UAM2_9BACI, A0A3A9KCQ9_9BACI, A0A1Y0IJ22_9BACL, A0A1G8E1Q8_9BACI, A0A1S2M8P6_9BACI, Q9K6U7_BACHD, A0A4R3N1F6_9BACI, A0A437KCI7_9BACI, A0A2P8GCB9_9BACL, A0A1X9MFG9_9BACI, A0A1H9TTG1_9BACI, A0A327YHU2_9BACI 및 A0A368Y3Q5_9BACI. 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 유니프롯 식별자 E3EBP5_PAEPS에 의해 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 45%, 보다 바람직하게는 적어도 51%, 보다 바람직하게는 적어도 54% 및 더욱 더 바람직하게는 73-100% 서열 동일성을 갖는 야생형 DegU 단백질 서열 및 그를 코딩하는 상응하는 degU 유전자이다. 본 발명에 따라 기재된 DegU 단백질 서열에 대한 특정 돌연변이를 고려하지 않을 때, 돌연변이체 DegU 단백질은 바람직하게는 유니프롯 식별자 E3EBP5_PAEPS에 의해 제공된 아미노산 서열과 0-20개의 아미노산, 보다 바람직하게는 0-15개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 0-10개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 1-5개의 아미노산만큼 상이하며, 여기서 이들 차이는 바람직하게는 도 3에 따른 제약에 따른다. 돌연변이체 DegU 서열이, 유니프롯 식별자 E3EBP5_PAEPS에 따른 서열에 대해 정렬될 때, 상기 서열보다 더 긴 경우에, 각각의 C- 또는 N-말단 연장부는 바람직하게는 10개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 0-5개의 아미노산이다.
본 발명에 따라, 미생물은 돌연변이체 spo0A 유전자를 포함할 수 있다. 돌연변이체 spo0A 유전자는, 미생물에서 발현될 때, 돌연변이체 Spo0A 단백질의 생산을 발생시키고, spo0A 유전자는 Spo0A 단백질을 코딩한다. 본 발명에 따라 야생형 Spo0A 단백질은 포자형성 전사 인자 Spo0A의 구성원이고 (IPR012052) 인터프로 표기법을 사용하여, 신호 전달 반응 조절인자 수신자 도메인 (IPR001789) 및 포자형성 개시 인자 Spo0A C-말단 도메인 (IPR014879)을 포함하며, 이는 날개달린 나선-유사 DNA-결합 도메인 슈퍼패밀리 (IPR036388)의 일부이다. Pfam 명명법에 따라 야생형 Spo0A 단백질은 반응 조절인자 수신자 도메인 (PF00072) 및 포자형성 개시 인자 Spo0A C 말단 도메인 (PF08769)을 포함한다. 바람직하게는 야생형 spo0A 유전자는 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3에 대해 적어도 45%, 보다 바람직하게는 적어도 56%, 보다 바람직하게는 적어도 69%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 67%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 73%, 보다 바람직하게는 적어도 74%, 보다 바람직하게는 75% 서열 동일성을 갖는 Spo0A 단백질을 코딩하며, 여기서 바람직하게는 서열식별번호: 3에 대한 서열 동일성은 최대 85%, 보다 바람직하게는 최대 11%이다. 특히 바람직한 야생형 Spo0A 단백질은 서열식별번호: 3에 대해 50-85%, 보다 바람직하게는 76-84% 서열 동일성을 갖는다. 서열식별번호: 3이 아미노산 서열 스크리닝 및 어닐링 목적을 위한 주형으로서 특이적으로 구축된 인공 아미노산 서열이라는 것이 이해되어야 한다. 서열은 따라서 서열식별번호: 3의 폴리펩티드의 어떠한 Spo0A 활성도 본원에 제시되지 않는다는 사실과 관계없이 Spo0A 유전자의 확인에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 또는 식물에서 야생형 Spo0A 유전자로서 특히 바람직한 것은 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 유니프롯 식별자에 의해 정의된 아미노산 서열 중 임의의 것이다: A0A074LZY6_PAEPO, E0RDX7_PAEP6, H6CM41_9BACL, A0A0D7WZ78_9BACL, A0A167DI09_9BACL, W7YKB3_9BACL, A0A168BRF7_9BACL, A0A1G5JWJ2_9BACL, A0A168P4Q5_9BACL, A0A168M3D7_9BACL, A0A1R1EUX4_9BACL, A0A2W6PE29_9BACL, A0A2V4WTN3_PAEBA, A0A328WGM0_PAELA, D3E6N2_GEOS4, G4HF05_9BACL, A0A1R0XBX0_9BACL, A0A098M8U8_9BACL, A0A3Q8SBT8_9BACL, A0A0M1P3N3_9BACL, R9LQX4_9BACL, A0A2Z2KRN4_9BACL, A0A1B8WQN2_9BACI, A0A089MEU2_9BACL, A0A089LZP7_9BACL, A0A0F7FA95_PAEDU, A0A0E4HDK7_9BACL, A0A1G7R7Q0_9BACL, A0A1H8N6P6_9BACL, X4ZFA8_9BACL, A0A3G9IQE6_9BACL, A0A369BNP1_9BACL, A0A1B1N0I3_9BACL, A0A015KRJ2_9BACL, A0A2N5N5F6_9BACL, A0A1T2XNU8_9BACL, A0A090ZFJ2_PAEMA, A0A3D9QX06_9BACL, E0ICH6_9BACL, A0A1G9E5Z0_9BACL, A0A3S1DUM5_9BACL, A0A0D5NPL4_9BACL, A0A368WCL4_9BACL, A0A4Q2LM98_9BACL, A0A328U1G0_9BACL, A0A172TM01_9BACL, A0A1I2EKA8_9BACL, A0A1A5YCA7_9BACL, A0A371PM84_9BACL, A0A3A6PB13_9BACL, A0A2V2YXM7_9BACL, L0EEN3_THECK, A0A3A1UXY9_9BACL, A0A3B0CH88_9BACL, A0A1V4HR00_9BACL, A0A1V0UWJ6_9BACL, H3SFG5_9BACL, A0A1X7JKH5_9BACL, A0A1I2FDS6_9BACL, A0A3D9IJB3_9BACL, A0A398CE46_9BACL, M9LB51_PAEPP, A0A3D9KSR7_9BACL, A0A081NWT7_9BACL, H6NL94_9BACL, A0A1C0ZWF8_9BACL, A0A4Y8M823_9BACL, A0A1X7HJ70_9BACL, A0A329MFB7_9BACL, A0A1G4P4T7_9BACL, A0A229UXF4_9BACL, A0A0U2WBQ5_9BACL, A0A3S0BM74_9BACL, K4ZP76_PAEA2, A0A2W1NBK6_9BACL, A0A172ZK56_9BACL, A0A3M8CIR1_9BACL, M8EE17_9BACL, A0A0Q3T5E2_BRECH, A0A0K9YRB7_9BACL, A0A1I3U483_9BACL, V6MCA1_9BACL, C0ZC17_BREBN, A0A4R3KM88_9BACI, A0A3M8B6E4_9BACL, A0A2N3LN87_9BACI, A0A419SMW9_9BACL, A0A3M8D088_9BACL, A0A075R4A3_BRELA, U1X7N0_ANEAE, A0A1H2UFN8_9BACL, A0A0D1VW72_ANEMI, A0A0X8D3E6_9BACL, A0A0U5AZK5_9BACL, A0A4R3L002_9BACL, A0A0Q3WXA1_9BACI, A0A0B0IAE5_9BACI, A0A223KSV6_9BACI, W4PXN5_9BACI, A0A235BCM6_9BACL, A0A235FAK4_9BACI, A0A2T4Z9J8_9BACL, A0A1S2MEZ1_9BACI, Q9K977_BACHD, A0A1S2LUZ3_9BACI, A0A1U9KC16_9BACL, A7Z6J0_BACVZ, Q65HJ7_BACLD, W4QWX1_BACA3, A0A1I6TUX2_9BACL, A0A1I2L3I1_9BACL, A0A0H3E179_BACA1, SP0A_BACSU, A8FF06_BACP2, A0A0J6EVC7_9BACI, A0A417YV34_9BACI, D5DS62_BACMQ, A0A4Q0VQU7_9BACI, A0A1H9PKN5_9BACI, A0A1I3QAI8_9BACL, A0A1G6Q9T8_9BACL, W1SHY1_9BACI, A0A364K8M0_9BACL, A0A150F6K4_9BACI, M5PEN8_9BACI, A0A1S2M754_9BACI, A0A0A8X8S8_9BACI, A0A1R1RU53_9BACI, A0A1S2LYV1_9BACI, A0A1B3XQX6_9BACI, A0A1H8EQX3_9BACL, A0A2N5GRE3_9BACI, A0A4R1B005_9BACI, A0A4R1QFH8_9BACI, A0A1B1Z5W5_9BACI, K6BXH2_9BACI, A0A160F753_9BACI, U5LDF9_9BACI, A0A0M0KYT7_9BACI, A0A061NL57_9BACL, A0A3A1QZJ5_9BACI, A0A2N5H854_9BACI, A0A160ISE8_9BACI, A0A2I7SRN1_LACSH, A0A1M4TLQ2_9BACL, A0A4R2QSJ5_9BACL, A0A3L7K5H6_9BACI, A0A2N5M452_9BACI, W4QKM5_9BACI, A0A4R2PAA5_9BACL, A0A0J1IMN1_BACCI, R9C857_9BACI, A0A0M4FX23_9BACI, A0A165XSR5_9BACI, A0A179SV99_9BACI, A0A1Y0IS88_9BACL, A0A248TLE9_9BACI, A0A1H0WI33_9BACI, A0A0H4PIL5_9BACI, I8AMT2_9BACI, A0A0D6ZAA3_9BACI, A0A3T0I1Q1_9BACI, A0A1I0SQQ4_9BACI, I3EAA8_BACMM, A0A0M0GB29_SPOGL, A0A1L8ZLZ8_9BACI, A0A370GBM9_9BACI, A0A433H928_9BACI, A0A4R6U795_9BACI, A0A060LXS4_9BACI, A0A074LME5_9BACL, A0A0K9GWU6_9BACI, A0A150KM63_9BACI, K6CV08_BACAZ, A0A323TXM3_9BACI, A0A2N0Z9Q2_9BACI, J8AK67_BACCE, A0A073KUP4_9BACI, A0A292YQZ8_9BACL, A0A226QLR6_9BACI, A0A160FBJ9_9BACI, C3BPR4_9BACI, E6TXR1_BACCJ, A0A1L3MQ53_9BACI, A0A0C2YCQ6_BACBA, Q8EQ49_OCEIH, A0A316D8M3_9BACL, A0A0J6FU61_9BACI, A0A1H8C0C3_9BACI, A0A084J373_BACMY, A0A1I4JPZ3_9BACI, A0A0M2SG37_9BACI, A0A150MMS1_9BACI, A0A1J6WGW3_9BACI, A0A0P6W2Q8_9BACI, A0A1I0SZE6_9BACI, A7GSJ0_BACCN, A0A2C9Z3P6_BACHU, A0A398BG15_9BACI, A0A0V8JFI7_9BACI, A0A1I5NPW8_9BACI, A0A4R2B866_9BACI, A0A023DE04_9BACI, A0A023CLR0_9BACI, A0A327YN47_9BACI, A0A0Q9XV74_9BACI, A0A147K7R5_9BACI, A0A443J408_9BACI, A0A498DDK1_9BACI, A0A0K6GMP9_9BACI, A0A429XD58_9BACI, A0A1I1ZLD5_9BACI, A4IQR2_GEOTN, A0A073K3V0_9BACI, A0A1X7D063_9BACI, Q5WF68_BACSK, A0A3S4RLT9_9BACI, A0A150JT68_BACCO, F5L3H6_CALTT, A0A0M0GPU2_9BACI, S5Z7C0_BACPJ, A0A1Z2V3H9_9BACI, A0A3A9KGU4_9BACI, A0A285CLU9_9BACI, A0A366XYH1_9BACI, A0A0D8BRF6_GEOKU, A0A265NFG5_9BACI, A0A428N868_9BACI, A0A2P8HAG1_9BACI, A0A1H0B3U0_9BACI, A0A150M7C5_9BACI, A0A1G8D1C3_9BACI, A0A1G8BRD8_9BACI, A0A4Q4IIH6_9BACL, A0A4Y9AEG4_9BACI, A0A1I0FQG9_9BACI, A0A0F5HWK7_9BACI, A0A1H1BJ69_9BACI, W9A8X3_9BACI, A0A1H9LW77_9BACI, A0A494Z0K1_9BACI, A0A1M5CXL0_9BACI, A0A1G8JJN9_9BACI, A0A1G6IGH8_9BACI, A0A4Y7S8L6_9FIRM, A0A1X9MFG7_9BACI, A0A0A2UZF1_9BACI, A0A1H9ZLP9_9BACI, A0A1M4XLK4_9CLOT, A0A0A5GIF6_9BACI, A0A0C2VIM1_9BACL, A0A2A2IDA3_9BACI, A0A366EJ45_9BACI, A0A317KZA9_9BACI, A0A0A5GEQ9_9BACI, A0A1E5LK88_9BACI, A0A2S5GEL8_9BACL, A0A1G9LM94_9BACI, A0A1N6PFX1_9BACI, A0A1E7DMX2_9BACI, N4WSS3_9BACI, A0A1I1T1Z9_9BACI, A0A0A1MZ98_9BACI, A0A4R3N0Q4_9BACI, A0A4Y8KST9_9BACL, A0A2U1K6N5_9BACI, A0A075LLD7_9BACI, A0A1I0V6R2_9BACI, A0A0U1KL95_9BACI, A0A2P6MK99_9BACI, C8WXF8_ALIAD, A0A1M6KIQ3_9CLOT, A0A1L8CTW3_9THEO, A0A1V2A9Q9_9BACI, A0A2T4UAN8_9BACI, A0A4Z0GKV9_9BACL, A0A1M6I6U1_9FIRM, A0A1I2VPT9_9BACL, A0A1M6S6D3_9BACL, A0A1N7KMH0_9BACL, A0A140L8E0_9CLOT, A0A090J299_9BACI, V6IWU0_9BACL, A0A024P5H3_9BACI, A0A285NM88_9BACI, A0A143MRA0_9BACI, A0A0A5GCA3_9BACI, A0A0U1QSI9_9BACL, A0A0B5AS70_9BACL, A0A1M6C4X1_9CLOT, A0A2I0QX97_9BACI, A0A0P9EJT7_9BACL, A0A1U7MLA0_9FIRM, A0A2T0BRS8_9CLOT, A0A1H2T3C9_9BACL, A0A1H9A7M5_9BACI, A0A084JIX0_9CLOT, D9SLV6_CLOC7, A0A4R2RWP5_9FIRM, U2CLF1_9FIRM 및 A0A1G8VG90_9BACI. 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 유니프롯 식별자 A0A074LZY6_PAEPO에 의해 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 62%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 80-100% 및 더욱 더 바람직하게는 95-100% 서열 동일성을 갖는 야생형 Spo0A 단백질 서열 및 그를 코딩하는 상응하는 spo0A 유전자이다. 본 발명에 따라 기재된 Spo0A 단백질 서열에 대한 특정 돌연변이를 고려하지 않을 때, 돌연변이체 Spo0A 단백질은 바람직하게는 유니프롯 식별자 A0A074LZY6_PAEPO에 의해 제공된 아미노산 서열과 0-20개의 아미노산, 보다 바람직하게는 0-15개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 0-10개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 1-5개의 아미노산만큼 상이하며, 여기서 이들 차이는 바람직하게는 도 4에 따른 제약에 따른다. 돌연변이체 Spo0A 서열이, 유니프롯 식별자 A0A074LZY6_PAEPO에 따른 서열에 대해 정렬될 때, 상기 서열보다 더 긴 경우에, 각각의 C- 또는 N-말단 연장부는 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 0-10개의 아미노산이다.
본 발명이 피르미쿠테스 미생물에서 편재하여 발견된 1 또는 2개의 유전자의 돌연변이에 의해 접합 적격성을 증가시키는 것을 허용한다는 것이 본 발명의 특별한 이점이다. 따라서, 본 발명의 교시는 하기 예에 제시된 바와 같은 파에니바실루스 속의 미생물에 적용가능할 뿐만 아니라, 다른 피르미쿠테스에 대한 접합 효율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 미생물은 하기 기재된다.
본 발명의 DegS, DegU 및 DegS+DegU 돌연변이체가 미생물의 포자형성 능력을 제거하거나 또는 유의하게 감소시키지 않는다는 것이 추가 이점이다. 이는 포자 형성 식물 건강 조성물 또는 포자 형성에 의존하는 다른 적용에 대한 특별한 이점이다.
DegS 단백질은 바람직하게는 기능적 단일 결합 도메인, 기능적 포스포억셉터 도메인 및/또는 기능적 ATPase 도메인이 결여된다. 이들 형질의 존재는 본 발명의, 바람직하게는 파에니바실루스 속의 미생물에서, 상응하는 야생형 균주와 비교하여 접합 적격성에서의 증가를 관측함으로써 용이하게 확인될 수 있고, 예를 들어 센서 DegS 도메인 (IPR008595)에 돌연변이를 도입함으로써 용이하게 달성될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 야생형 DegS 단백질은 센서 DegS 도메인을 포함하고; 이 도메인은, 유니프롯 식별자 A0A074LBY4_PAEPO를 갖는 단백질 서열의 넘버링에 따라, 아미노산 위치 10에서 165까지 이른다. DNA 결합 도메인에 대한 추가 정보는 상응하는 Pfam 및 인터프로 데이터베이스로부터 입수가능하다. 예를 들어, 가장 바람직한 야생형 DegS 단백질 서열 A0A074LBY4_PAEPO의 경우 DNA-결합 도메인은 위치 5-81 및 84-186에 걸친, 2개의 알파-나선 도메인을 포함하는 것으로 예측되며, 여기서 위치 175-186의 아미노산은 이미 히스티딘 키나제 도메인과 중첩된다. 전체 알파-나선 구조가 히스티딘 키나제 도메인의 폴딩에 의한 간섭을 방지하기 위해 여전히 무손상이도록 DegS 단백질 DNA-결합 도메인이 돌연변이되는 경우가 바람직하다.
바람직하게는, 돌연변이체 DegS 단백질은 상응하는 야생형 서열과, 선호도가 감소하는 순서대로, L99F, L99C, L99D, L99E, L99G, L99H, L99K, L99N, L99P, L99Q, L99R, L99S, L99W 또는 L99Y로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이만큼 상이하다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 언급된 넘버링은 유니프롯 식별자 A0A074LBY4_PAEPO의 야생형 DegS 단백질 서열에 대한 것이다. 상기 표시된 바와 같이, 돌연변이체 DegS 단백질이, 상기 언급된 구체적으로 열거된 돌연변이를 무시할 때, 유니프롯 식별자 A0A074LBY4_PAEPO에 의해 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 46%, 보다 바람직하게는 적어도 58% 및 더욱 더 바람직하게는 80-100% 서열 동일성을 갖는다는 것을 유의하여야 한다.
상기 언급된 특정 돌연변이는 DegS 센서 도메인의 제2 예측된 알파 나선에 속한다. 예에 제시된 바와 같이, 이러한 돌연변이는 모두 접합 적격성에서의 증가를 초래한다.
DegS 돌연변이체 단백질에 대한 돌연변이된 아미노산은 DegS 단백질의 천연 상동체에서의 이들의 각각의 빈도가 증가하는 순서대로 상기 열거된다. 본 발명이 야생형과 비교하여 DegS 단백질의 변경된 특성을 갖는 미생물을 제공하는 데 관심이 있는 바와 같이, 가장 드문 변경이 가장 바람직한 것이고, 선호도는 각각의 위치에서의 각각의 아미노산의 빈도가 증가함에 따라 감소한다.
본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 돌연변이체 degU 유전자를 포함하며, 여기서 degU 유전자는 감소된 DNA 결합 활성을 갖는 DegU 단백질을 코딩하고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여된다. 이는 바람직하게는 돌연변이체 DegU 단백질을 코딩하는 돌연변이체 degU 유전자를 제공함으로써 달성되며, 여기서 돌연변이는 LuxR-유형 DNA-결합 HTH 도메인 (PF00196)에 영향을 미친다. 하기 예에 제시된 바와 같이, 단지 돌연변이체 degU 유전자의 제공만으로도 이미 접합 적격성을 개선시키기에 충분하다.
DegU 단백질은 바람직하게는 감소된 DNA 결합 활성을 갖고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여된다. 이들 형질의 존재는 본 발명의, 바람직하게는 파에니바실루스 속의 미생물에서, 상응하는 야생형 균주와 비교하여 접합 적격성에서의 증가를 관측함으로써 용이하게 확인될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 야생형 DegU 단백질은 DNA-결합 HTH (나선-회전-나선) 도메인을 포함하고; 이 도메인은, 유니프롯 식별자 E3EBP5를 갖는 단백질 서열의 넘버링에 따라, 아미노산 위치 171에서 서열의 단부까지 이른다. DNA 결합 도메인에 대한 추가 정보는 상응하는 Pfam 및 인터프로 데이터베이스로부터 입수가능하다. 예를 들어, 가장 바람직한 야생형 DegU 단백질 서열 E3EBP5의 경우 DNA-결합 도메인은 위치 180-191, 195-202, 206-221 및 225-235에 걸친, 4개의 알파-나선 도메인을 포함하는 것으로 예측된다. DegU 단백질 DNA-결합 도메인이 제3 또는 제4, 가장 바람직하게는 제3 알파 나선 도메인에서 돌연변이되는 경우가 바람직하다. 여기서, 단백질 서열에서의 돌연변이는 일반적으로 DegU 단백질의 나머지의 정확한 폴딩 및 기능에 영향을 미치지 않을 것이다.
바람직하게는, DegU 단백질 돌연변이는, 각각의 대안 a) 및 b)에 대해 선호도가 감소하는 순서대로, 하기 중 1개 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진다:
a) Q218*, Q218K, Q218N, Q218D, Q218R
b) D223*, D223*+M220N, D223*+M220N+E221G, D223*+M220N+V222G, D223*+M220N+E221G+V222G, D223*+M220D, D223*+M220E, D223*+M220H, D223*+M220F, D223*+M220W, D223*+M220S, D223*+M220A.
본 발명의 목적을 위해, 상기 언급된 넘버링은 유니프롯 식별자 E3EBP5의 야생형 DegU 단백질 서열에 대한 것이다. 상기 표시된 바와 같이, 돌연변이체 DegU 단백질이, 상기 언급된 구체적으로 열거된 돌연변이를 무시할 때, 유니프롯 식별자 E3EBP5_PAEPS에 의해 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 45%, 보다 바람직하게는 적어도 51%, 보다 바람직하게는 적어도 54% 및 더욱 더 바람직하게는 73-100% 서열 동일성을 갖는다는 것을 유의하여야 한다.
돌연변이 a) 및 b) 둘 다는 동시에 DNA 결합 도메인의 제3 예측된 알파 나선에 속한다. 예에 제시된 바와 같이, 유형 a) 및 b)의 돌연변이 둘 다는 접합 적격성의 증가를 초래한다.
대안 a) 및 b)에 따른 돌연변이된 아미노산은, 각각, DegU 단백질의 천연 상동체에서의 이들의 각각의 빈도가 증가하는 순서대로 상기 열거된다. 본 발명이 야생형과 비교하여 DegU 단백질의 변경된 특성을 갖는 미생물을 제공하는 데 관심이 있는 바와 같이, 가장 드문 변경이 가장 바람직한 것이고, 선호도는 각각의 위치에서의 각각의 아미노산의 빈도가 증가함에 따라 감소한다.
돌연변이 Q218*를 제외하고는 상기 언급된 DegU 단백질 돌연변이는 또한 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 돌연변이체 DegU 단백질을 코딩하는 돌연변이체 degU 유전자를 포함하는 미생물과 관련되며, 여기서 돌연변이는 유니프롯 식별자 E3EBP5에 따른 서열의 넘버링으로, Q218K+D223*, Q218K+M220N+D223*, Q218K+M220N+E221G+D223*, Q218K+M220N+V222G+D223*, Q218K+M220N+E221G+V222G+D223*, Q218K+M220D+D223*, Q218K+M220E+D223*, Q218K+M220H+D223*, Q218K+M220F+D223*, Q218K+M220W+D223*, Q218K+M220S+D223*, Q218K+M220A+D223*, Q218N+D223*, Q218N+M220N+D223*, Q218N+M220N+E221G+D223*, Q218N+M220N+V222G+D223*, Q218N+M220N+E221G+V222G+D223*, Q218N+M220D+D223*, Q218N+M220E+D223*, Q218N+M220H+D223*, Q218N+M220F+D223*, Q218N+M220W+D223*, Q218N+M220S+D223*, Q218N+M220A+D223*, Q218D+D223*, Q218D+M220N+D223*, Q218D+M220N+E221G+D223*, Q218D+M220N+V222G+D223*, Q218D+M220N+E221G+V222G+D223*, Q218D+M220D+D223*, Q218D+M220E+D223*, Q218D+M220H+D223*, Q218D+M220F+D223*, Q218D+M220W+D223*, Q218D+M220S+D223*, Q218D+M220A+D223*, Q218R+D223*, Q218R+M220N+D223*, Q218R+M220N+E221G+D223*, Q218R+M220N+V222G+D223*, Q218R+M220N+E221G+V222G+D223*, Q218R+M220D+D223*, Q218R+M220E+D223*, Q218R+M220H+D223*, Q218R+M220F+D223*, Q218R+M220W+D223*, Q218R+M220S+D223*, Q218R+M220A+D223* 중 임의의 것을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 돌연변이체 Spo0A 유전자를 포함하며, 여기서 돌연변이는 DNA 결합 또는 수신자 도메인에 위치하고 Spo0A 단백질의 인산화의 감소 또는 제거를 초래한다. 하기 예에 제시된 바와 같이, 단지 돌연변이체 Spo0A 유전자의 제공만으로도 이미 접합 적격성을 개선시키기에 충분하다.
돌연변이체 Spo0A 단백질은 바람직하게는 기능적 DNA 결합 또는 수신자 도메인이 결여된다. 이들 형질의 존재는 본 발명의, 바람직하게는 파에니바실루스 속의 미생물에서, 상응하는 야생형 균주와 비교하여 접합 적격성에서의 증가를 관측함으로써 용이하게 확인될 수 있고, 예를 들어 Spo0A C-말단 도메인 (IPR014879)에 돌연변이를 도입함으로써 용이하게 달성될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 야생형 Spo0A 단백질은 포자형성 개시 인자 Spo0A C 말단 도메인을 포함하고; 이 도메인은, 유니프롯 식별자 A0A074LZY6_PAEPO를 갖는 단백질 서열의 넘버링에 따라, 아미노산 위치 158에서 261까지 이른다. Spo0A C-말단 도메인에 대한 추가 정보는 상기 언급된 상응하는 Pfam 및 인터프로 데이터베이스로부터 입수가능하다.
바람직하게는, 돌연변이체 Spo0A 단백질의 돌연변이는 하기 중 임의의 것으로 이루어지거나 또는 이를 포함한다:
- A257V, 보다 바람직하게는 A257S,
- I161R, 보다 바람직하게는 I161L,
- 선호도가 감소하는 순서대로: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R.
본 발명의 목적을 위해, 상기 언급된 넘버링은 유니프롯 식별자 A0A074LZY6_PAEPO의 야생형 Spo0A 단백질 서열에 대한 것이다. 상기 표시된 바와 같이, 돌연변이체 Spo0A 단백질이, 상기 언급된 구체적으로 열거된 돌연변이를 무시할 때, 유니프롯 식별자 A0A074LZY6_PAEPO에 의해 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 55%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 62%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 80-100% 및 더욱 더 바람직하게는 95-100% 서열 동일성을 갖는다는 것을 유의하여야 한다.
바람직하게는, 돌연변이체 Spo0A 단백질은 위치 257에서의 2개의 상기 언급된 돌연변이 중 1개, 즉 A257V 또는, 보다 바람직하게는, A257S를 포함한다. 이 위치는 Spo0A C-말단 도메인의 마지막 예측된 알파 나선에 속한다. 또한 바람직하게는 돌연변이체 Spo0A 단백질은 위치 161에서의 2개의 상기 언급된 돌연변이 중 1개, 즉 I161R 또는, 보다 바람직하게는 I161L을 포함한다. 이 위치는 Spo0A C-말단 도메인의 제1 예측된 알파 나선에 속한다. 추가로 바람직하게는 돌연변이체 Spo0A 단백질은 상기 언급된 위치 각각에서의 상기 언급된 각각의 돌연변이 중 임의의 것, 즉 선호도가 감소하는 순서대로 하기를 포함한다: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R. 이중 돌연변이체의 돌연변이된 아미노산은 Spo0A 단백질의 천연 상동체에서의 이들의 각각의 빈도가 증가하는 순서대로 열거된다. 본 발명이 야생형과 비교하여 Spo0A 단백질의 변경된 특성을 갖는 미생물을 제공하는 데 관심이 있는 바와 같이, 가장 드문 변경이 가장 바람직한 것이고, 선호도는 각각의 위치에서의 각각의 아미노산의 빈도가 증가함에 따라 감소한다.
본 발명은 바람직하게는 미생물을 제공하며, 여기서
- 야생형 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현은 돌연변이체 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현보다 적거나 또는 이와 동일하거나, 또는
- 야생형 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현은 돌연변이체 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현 동안 억제되거나 또는 제거된다.
이들의 상응하는 야생형 등가물에 비해, 돌연변이체 degS, degU 및 spo0A 유전자의 이러한 상대적인 과다발현은, 각각, 제1 및 바람직한 대안에서 각각 야생형 DegU, DegS 및 Spo0A 단백질을 코딩하는 각각의 유전자가 불활성화되었고 각각의 돌연변이체 단백질을 코딩하는 유전자(들)가 도입된 미생물에 의해 달성될 수 있다. 이러한 대안에서, 미생물은 바람직하게는 하기를 포함한다:
a) 본 발명에 따른 돌연변이체 degU 및 돌연변이체 degS 유전자, 및 야생형 degU 및 degS 유전자가 기능적으로 불활성화되거나, 제거되거나 또는 돌연변이체 유전자에 의해 대체된 것, 또는
b) 본 발명에 따른 돌연변이체 spo0A 유전자, 및 야생형 spo0A 유전자가 기능적으로 불활성화되거나, 제거되거나 또는 돌연변이체 유전자에 의해 대체된 것.
제2 대안에서, 각각의 야생형 유전자(들)는 여전히 본 발명의 미생물에 존재한다. 이러한 미생물은 특히 야생형 또는 돌연변이체 유전자 또는 유전자들이 조절가능한 프로모터의 제어 하에 야기될 때 야생형과 돌연변이체 거동 사이를 전환시키는 것을 허용함으로써 유익하다. 이 방식으로 적격성은 의도된 핵산 전달의 공정 동안 선택적으로 증가될 수 있는 반면에, 야생형 낮은 접합 적격성은 모든 다른 단계에서 유지되어, 이로써 예를 들어 발효 공정 동안 수평 유전자 전달을 유익하게 제한할 수 있다. 상응하여, 본 발명에 따른 미생물이 제공되며 여기서
바람직하게는 돌연변이체 degU 및 degS 유전자 또는 돌연변이체 spo0A 유전자의 발현이, 각각, 상응하는 야생형 유전자의 발현에 비해 증가되거나 또는 감소될 될 수 있도록
- 돌연변이체 degU 및 degS 유전자 또는 돌연변이체 spo0A 유전자는, 각각, 유도성 또는 억제성 프로모터에 작동가능하게 연결되고/거나,
- 야생형 degU 및 degS 유전자 또는 돌연변이체 spo0A 유전자는, 각각, 억제성 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
바람직하게는 돌연변이체 degU 및 degS 또는 spo0A 유전자는, 각각, 염색체외 핵산 상에 위치한 각각의 발현 카세트에 제공되고, 여기서 염색체외 핵산은 반대선택가능한 마커를 추가로 포함한다. 하기 기재된 바와 같이, 이러한 염색체외 핵산은 선택된 기간 동안 미생물에게 증가된 적격성을 부여하는 것을 허용한다. 특히, 이러한 염색체외 핵산은 유리하게 접합 이벤트 후에, 예를 들어 접합에 의해 수득된 생산 균주의 세포 은행 샘플의 생성 전에 미생물로부터 제거될 수 있다. 반대선택가능한 마커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, WO2021061694에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 하기의 분류학적 계급으로부터 선택된다:
- 피르미쿠테스 문, 바실리, 클로스트리디아 또는 네가티비쿠테스 강,
- 보다 바람직하게는 바실랄레스, 클로스트리디알레스, 써모아나에로박테랄레스, 써모세디미니박테랄레스 또는 셀레노모나달레스 목,
- 보다 바람직하게는 바실라세아에, 파에니바실라세아에, 파스토리아세아에, 클로스트리디아세아에, 펩토코카세아에, 헬리오박테리아세아에, 신트로포모나다세아에, 써모아나에로박테라세아에, 테피다나에로박테라세아에 또는 스포로무사세아에 과,
- 보다 바람직하게는 알칼리바실루스, 바실루스, 게오바실루스, 할로바실루스, 리시니바실루스, 피스키바실루스, 테리바실루스, 브레비바실루스, 파에니바실루스, 써모바실루스, 파스토리아, 클로스트리디움, 데술포토마쿨룸, 헬리오박테리움, 펠로스포라, 펠로토마쿨룸, 칼다나에로박터, 무렐라, 써모아나에로박터, 테피다나에로박터, 프로피오니스포라 또는 스포로무사 속,
- 보다 바람직하게는 바실루스, 파에니바실루스 또는 클로스트리디움 속.
특히 바실라세아에 및 파에니바실라세아에 과의 미생물은 산업 발효 공정에서 중요한 미생물이다. 더욱이, 이러한 속의 미생물 중에서 포자 생산자로 공지되어 있다.
농업에서, 박테리아 포자는 식물병원성 진균 또는 박테리아성 질환을 감소시키거나 또는 예방하는 식물 해충 방제 조성물에 사용되었다. 포자 생물학적 제제는 또한 생물 및 무생물 스트레스에 대한 식물 저항성을 개선시키고, 식물의 성장을 가속화시키고 식물, 과실 또는 콩과식물 수확 동안 수확율을 증가시키는 데 적용된다. 포자 제품은 잎, 순, 과실, 뿌리 또는 식물 번식 물질뿐만 아니라 식물이 성장할 기재에 적용되었다 (Toyota K. Bacillus-related Spore Formers: Attractive Agents for Plant Growth Promotion. Microbes Environ. 2015;30(3):205-207. doi:10.1264/jsme2.me3003rh). (Bochow, H., et al. "Use of Bacillus Subtilis as Biocontrol Agent. IV. Salt-Stress Tolerance Induction by Bacillus Subtilis FZB24 Seed Treatment in Tropical Vegetable Field Crops, and Its Mode of Action / Die Verwendung von Bacillus Subtilis zur biologischen Bekampfung. IV. Induktion einer Salzstress-Toleranz durch Applikation von Bacillus subtilis FZB24 bei tropischem Feldgemuse und sein Wirkungsmechanismus." Zeitschrift fur Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz / Journal of Plant Diseases and Protection, vol. 108, no. 1, 2001, pp. 21-30. JSTOR, www.jstor.org/stable/43215378. Accessed 14 Dec. 2020). (Hashem, Abeer & Tabassum, B. & Abd_Allah, Elsayed. (2019). Bacillus subtilis: A plant-growth promoting rhizobacterium that also impacts biotic stress. Saudi Journal of Biological Sciences. 26. 10.1016/j.sjbs.2019.05.004).
더욱이, 박테리아 포자는 나노생명공학 및 건축 화학의 영역에서, 예컨대 자기-치유 콘크리트 (크랙 치유), 모르타르 안정성 및 감소된 물 투과성을 위해 적용되었다 [J.Y. Wang, H. Soens, W. Verstraete, N. De Belie, Self-healing concrete by use of microencapsulated bacterial spores, Cement and Concrete Research, Volume 56, 2014, 139-152, ISSN 0008-8846, https://doi.org/10.1016/j.cemconres.2013.11.009] [Ricca E, Cutting SM. Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology. J Nanobiotechnology. 2003;1(1):6. Published 2003 Dec 15. doi:10.1186/1477-3155-1-6].
추가적으로, 박테리아 포자는 세정 제품의 영역에서, 예컨대 임상 및 가정 설정에서의 세탁물, 단단한 표면의 세정, 위생 및 냄새 제어를 위해 적용되었다 (Caselli E. Hygiene: microbial strategies to reduce pathogens and drug resistance in clinical settings. Microb Biotechnol. 2017 Sep;10(5):1079-1083. doi: 10.1111/1751-7915.12755. Epub 2017 Jul 5). 예로서, 포자는 화장품 조성물, 예컨대 피부 세정 제품 (US20070048244), 식기세척제 (WO2014/107111), 파이프 디그리서 (DE19850012), 세탁물의 악취 제어 (WO2017/157778 및 EP3430113) 또는 알레르겐 제거 (US20020182184)에 사용되었다. 포자는 또한 후속 매트릭스 분해를 촉매하기 위해 비-생물기원 매트릭스로 삽입될 수 있다.
또한, 박테리아 포자는 인간 및 동물 영양 및 건강의 영역에 적용되었다. 예로서 상이한 박테리아 균주가 항생제 대체 전략의 일부로서 브로일러에 적용되었다 (Neveling, D.P., Dicks, L.M. Probiotics: an Antibiotic Replacement Strategy for Healthy Broilers and Productive Rearing. Probiotics & Antimicro. Prot. 13, 1-11 (2021). https://doi.org/10.1007/s12602-020-09640-z). 다른 예는 양식, 돼지 등을 포함한다 (Nayak, S.K. (2021), Multifaceted applications of probiotic Bacillus species in aquaculture with special reference to Bacillus subtilis. Rev. Aquacult., 13: 862-906. https://doi.org/10.1111/raq.12503). 인간 건강을 위한 박테리아 포자의 적용은 또한 널리 기재되어 있다 (예를 들어 US 20180289752; Lee, NK., Kim, WS. & Paik, HD. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol 28, 1297-1305 (2019). https://doi.org/10.1007/s10068-019-00691-9).
특히 하기 종 중 1종의 미생물이 바람직하다:
파에니바실루스 종: 피. 아베카와엔시스(P. abekawaensis), 피. 아비씨(P. abyssi), 피. 아세리스(P. aceris), 피. 아세티(P. aceti), 피. 아에스투아리이(P. aestuarii), 피. 아가렉세덴스(P. agarexedens), 피. 아가리데보란스(P. agaridevorans), 피. 알바(P. alba), 피. 알비두스(P. albidus), 피. 알부스(P. albus), 피. 알기노리티쿠스(P. alginolyticus), 피. 알고리폰티콜라(P. algorifonticola), 피. 알칼리테르라에(P. alkaliterrae), 피. 알베이(P. alvei), 피. 아밀로리티쿠스(P. amylolyticus), 피. 아나에리카누스(P. anaericanus), 피. 안타르크티쿠스(P. antarcticus), 피. 안티바이오티코필라(P. antibioticophila), 피. 안트리(P. antri), 피. 아피아리에스(P. apiaries), 피. 아피아리우스(P. apiarius), 피. 아피스(P. apis), 피. 아퀴스타그니(P. aquistagni), 피. 아라키디스(P. arachidis), 피. 아르크티쿠스(P. arcticus), 피. 아사멘시스(P. assamensis), 피. 아우란티아쿠스(P. aurantiacus), 피. 아조레두센스(P. azoreducens), 피. 아조티피겐스(P. azotifigens), 피. 바에크로크다미솔리(P. baekrokdamisoli), 피. 바르시노넨시스(P. barcinonensis), 피. 바렌골트지이(P. barengoltzii), 피. 베이진겐시스(P. beijingensis), 피. 보레알리스(P. borealis), 피. 보우쉐스두르호넨시스(P. bouchesdurhonensis), 피. 보비스(P. bovis), 피. 브라실렌시스(P. brasilensis), 피. 브라시카에(P. brassicae), 피. 브리오필룸(P. bryophyllum), 피. 카에스피티스(P. caespitis), 피. 카멜리아에(P. camelliae), 피. 카메로우넨시스(P. camerounensis), 피. 캄피나센시스(P. campinasensis), 피. 카스타네아에(P. castaneae), 피. 카탈파에(P. catalpae), 피. 카토르미이(P. cathormii), 피. 카베르나에(P. cavernae), 피. 셀룰로시리티쿠스(P. cellulosilyticus), 피. 셀룰로시트로피쿠스(P. cellulositrophicus), 피. 카르타리우스(P. chartarius), 피. 키벤시스(P. chibensis), 피. 키넨시스(P. chinensis), 피. 친주엔시스(P. chinjuensis), 피. 키티노리티쿠스(P. chitinolyticus), 피. 콘드로이티누스(P. chondroitinus), 피. 중앙겐시스(P. chungangensis), 피. 시네리스(P. cineris), 피. 시솔로켄시스(P. cisolokensis), 피. 콘타미난스(P. contaminans), 피. 쿠키이(P. cookii), 피. 크라쏘스트레아에(P. crassostreae), 피. 쿠쿠미스(P. cucumis), 피. 쿠르드라노리티쿠스(P. curdlanolyticus), 피. 대전엔시스(P. daejeonensis), 피. 다카렌시스(P. dakarensis), 피. 다랑쉬엔시스(P. darangshiensis), 피. 다르위니아누스(P. darwinianus), 피. 다우시(P. dauci), 피. 덴드리티포르미스(P. dendritiformis), 피. 동도넨시스(P. dongdonensis), 피. 동해엔시스(P. donghaensis), 피. 두사넨시스(P. doosanensis), 피. 두루스(P. durus), 피. 에다피쿠스(P. edaphicus), 피. 에히멘시스(P. ehimensis), 피. 엘기이(P. elgii), 피. 엘리미(P. elymi), 피. 엔도피티쿠스(P. endophyticus), 피. 엔쉬디스(P. enshidis), 피. 에스테리솔벤스(P. esterisolvens), 피. 에테리(P. etheri), 피. 유콤미아에(P. eucommiae), 피. 파에시스(P. faecis), 피. 파비스포루스(P. favisporus), 피. 페라리우스(P. ferrarius), 피. 필리시스(P. filicis), 피. 플라겔라투스(P. flagellatus), 피. 폰티콜라(P. fonticola), 피. 포르시티아에(P. forsythiae), 피. 프리고리레시스텐스(P. frigoriresistens), 피. 푸지엔시스(P. fujiensis), 피. 푸쿠이넨시스(P. fukuinensis), 피. 간수엔시스(P. gansuensis), 피. 겔라티니리티쿠스(P. gelatinilyticus), 피. 진센가그리(P. ginsengagri), 피. 진센가르비(P. ginsengarvi), 피. 진센기후미(P. ginsengihumi), 피. 진센기테르라에(P. ginsengiterrae), 피. 글라시알리스(P. glacialis), 피. 글레바에(P. glebae), 피. 글루카노리티쿠스(P. glucanolyticus), 피. 글리카니리티쿠스(P. glycanilyticus), 피. 고릴라에(P. gorillae), 피. 그라미니스(P. graminis), 피. 그라니보란스(P. granivorans), 피. 구앙조우엔시스(P. guangzhouensis), 피. 하레나에(P. harenae), 피. 헬리안티(P. helianthi), 피. 헤메로칼리콜라(P. hemerocallicola), 피. 헤르베르티(P. herberti), 피. 히스파니쿠스(P. hispanicus), 피. 호도가엔시스(P. hodogayensis), 피. 호르데이(P. hordei), 피. 호르티(P. horti), 피. 후미쿠스(P. humicus), 피. 후나넨시스(P. hunanensis), 피. 이베타에(P. ihbetae), 피. 이후아에(P. ihuae), 피. 이후미(P. ihumii), 피. 일리노이센시스(P. illinoisensis), 피. 인술라에(P. insulae), 피. 인테스티니(P. intestini), 피. 자밀라에(P. jamilae), 피. 질룬리이(P. jilunlii), 피. 코벤시스(P. kobensis), 피. 콜레오보란스(P. koleovorans), 피. 콘쿠켄시스(P. konkukensis), 피. 콘시덴시스(P. konsidensis), 피. 코레엔시스(P. koreensis), 피. 크립벤시스(P. kribbensis), 피. 경헤엔시스(P. kyungheensis), 피. 락티스(P. lactis), 피. 라쿠스(P. lacus), 피. 라르바에(P. larvae), 피. 라우투스(P. lautus), 피. 렘나에(P. lemnae), 피. 렌티모르부스(P. lentimorbus), 피. 렌투스(P. lentus), 피. 리아오니겐시스(P. liaoningensis), 피. 리미콜라(P. limicola), 피. 루피니(P. lupini), 피. 루테우스(P. luteus), 피. 루티미네랄리스(P. lutimineralis), 피. 마세란스(P. macerans), 피. 막쿠아리엔시스(P. macquariensis), 피. 마르칸티오피토룸(P. marchantiophytorum), 피. 마리니세디미니스(P. marinisediminis), 피. 마리눔(P. marinum), 피. 마실리엔시스(P. massiliensis), 피. 마이시엔시스(P. maysiensis), 피. 메디카기니스(P. medicaginis), 피. 멘델리이(P. mendelii), 피. 메소필루스(P. mesophilus), 피. 메타놀리쿠스(P. methanolicus), 피. 모빌리스(P. mobilis), 피. 몬타니솔리(P. montanisoli), 피. 몬타니테르라에(P. montaniterrae), 피. 모토부엔시스(P. motobuensis), 피. 무실라기노수스(P. mucilaginosus), 피. 나넨시스(P. nanensis), 피. 나프탈레노보란스(P. naphthalenovorans), 피. 나수티테르미티스(P. nasutitermitis), 피. 네브라스켄시스(P. nebraskensis), 피. 네마토필루스(P. nematophilus), 피. 니코티아나에(P. nicotianae), 피. 누루키(P. nuruki), 피. 오세아니세디미니스(P. oceanisediminis), 피. 오도리페르(P. odorifer), 피. 오에노테라에(P. oenotherae), 피. 오랄리스(P. oralis), 피. 오리자에(P. oryzae), 피. 오리지솔리(P. oryzisoli), 피. 오토위이(P. ottowii), 피. 오우로피넨시스(P. ourofinensis), 피. 파불리(P. pabuli), 피. 파에오니아에(P. paeoniae), 피. 파나키후미(P. panacihumi), 피. 파나키솔리(P. panacisoli), 피. 파나시테라에(P. panaciterrae), 피. 파리디스(P. paridis), 피. 파사데넨시스(P. pasadenensis), 피. 펙티니리티쿠스(P. pectinilyticus), 피. 페오리아에(P. peoriae), 피. 페리안드라에(P. periandrae), 피. 포카엔시스(P. phocaensis), 피. 포에니시스(P. phoenicis), 피. 필로스파에라에(P. phyllosphaerae), 피. 피스코미트렐라에(P. physcomitrellae), 피. 피니(P. pini), 피. 피니후미(P. pinihumi), 피. 피니솔리(P. pinisoli), 피. 피니스트라멘티(P. pinistramenti), 피. 포케오넨시스(P. pocheonensis), 피. 폴리믹사, 피. 폴리사카로리티쿠스(P. polysaccharolyticus), 피. 포필리아에(P. popilliae), 피. 포풀리(P. populi), 피. 프로푼두스(P. profundus), 피. 프로소피디스(P. prosopidis), 피. 프로타에티아에(P. protaetiae), 피. 프로벤센시스(P. provencensis), 피. 사이크로레시스텐스(P. psychroresistens), 피. 푸에리(P. pueri), 피. 푸에르네세(P. puernese), 피. 풀데운겐시스(P. puldeungensis), 피. 푸리스파티이(P. purispatii), 피. 킹스헨기이(P. qingshengii), 피. 킨린겐시스(P. qinlingensis), 피. 퀘르쿠스(P. quercus), 피. 라디시스(P. radicis), 피. 렐릭티세사미(P. relictisesami), 피. 레시두이(P. residui), 피. 리조플라나에(P. rhizoplanae), 피. 리조리자에(P. rhizoryzae), 피. 리조스파에라에(P. rhizosphaerae), 피. 리구이(P. rigui), 피. 리파에(P. ripae), 피. 루빈판티스(P. rubinfantis), 피. 루미노콜라(P. ruminocola), 피. 사비나에(P. sabinae), 피. 사케오넨시스(P. sacheonensis), 피. 살리니카에니(P. salinicaeni), 피. 산구이니스(P. sanguinis), 피. 세디미니스(P. sediminis), 피. 세게티스(P. segetis), 피. 셀레니이(P. selenii), 피. 셀레니티레두센스(P. selenitireducens), 피. 세네갈렌시스(P. senegalensis), 피. 세네갈리마실리엔시스(P. senegalimassiliensis), 피. 세오도넨시스(P. seodonensis), 피. 셉텐트리오날리스(P. septentrionalis), 피. 세풀크리(P. sepulcri), 피. 세니안겐시스(P. shenyangensis), 피. 시라카미엔시스(P. shirakamiensis), 피. 순펜기이(P. shunpengii), 피. 시아멘시스(P. siamensis), 피. 실라게이(P. silagei), 피. 실바에(P. silvae), 피. 시노포도필리(P. sinopodophylli), 피. 솔라나세아룸(P. solanacearum), 피. 솔라니(P. solani), 피. 솔리(P. soli), 피. 손키(P. sonchi) 군, 피. 소포라에(P. sophorae), 피. 스피리투스(P. spiritus), 피. 스푸티(P. sputi), 피. 스텔리페르(P. stellifer), 피. 수손겐시스(P. susongensis), 피. 스우엔시스(P. swuensis), 피. 타이춘겐시스(P. taichungensis), 피. 타이후엔시스(P. taihuensis), 피. 타이와넨시스(P. taiwanensis), 피. 타오후아샤넨세(P. taohuashanense), 피. 타리멘시스(P. tarimensis), 피. 텔루리스(P. telluris), 피. 테피디필루스(P. tepidiphilus), 피. 테르라에(P. terrae), 피. 테르레우스(P. terreus), 피. 테리게나(P. terrigena), 피. 테즈푸렌시스(P. tezpurensis), 피. 타일란덴시스(P. thailandensis), 피. 써모아에로필루스(P. thermoaerophilus), 피. 써모필루스(P. thermophilus), 피. 티아미노리티쿠스(P. thiaminolyticus), 피. 티안무엔시스(P. tianmuensis), 피. 티베텐시스(P. tibetensis), 피. 티모넨시스(P. timonensis), 피. 트란스루센스(P. translucens), 피. 트리티시(P. tritici), 피. 트리티시솔리(P. triticisoli), 피. 투아레기(P. tuaregi), 피. 툼바에(P. tumbae), 피. 툰드라에(P. tundrae), 피. 투리센시스(P. turicensis), 피. 틸로필리(P. tylopili), 피. 티파에(P. typhae), 피. 티르피스(P. tyrfis), 피. 울리기니스(P. uliginis), 피. 우리날리스(P. urinalis), 피. 발리두스(P. validus), 피. 벨라에이(P. velaei), 피. 비니(P. vini), 피. 보르텍스(P. vortex), 피. 보르티칼리스(P. vorticalis), 피. 불네리스(P. vulneris), 피. 웬시니아에(P. wenxiniae), 피. 위트소니아에(P. whitsoniae), 피. 우포넨시스(P. wooponensis), 피. 우손겐시스(P. woosongensis), 피. 울루무키엔시스(P. wulumuqiensis), 피. 윈니이(P. wynnii), 피. 크산타니리티쿠스(P. xanthanilyticus), 피. 크산티니리티쿠스(P. xanthinilyticus), 피. 크세로테르모두란스(P. xerothermodurans), 피. 크신지안겐시스(P. xinjiangensis), 피. 크실라넥세덴스(P. xylanexedens), 피. 크실라니클라스티쿠스(P. xylaniclasticus), 피. 크실라니리티쿠스(P. xylanilyticus), 피. 크실라니솔벤스(P. xylanisolvens), 피. 얀첸겐시스(P. yanchengensis), 피. 욘기넨시스(P. yonginensis), 피. 윤나넨시스(P. yunnanensis), 피. 잔톡실리(P. zanthoxyli), 피. 제아에(P. zeae),
바람직하게는 피. 아가렉세덴스, 피. 아가리데보란스, 피. 알기노리티쿠스, 피. 알칼리테르라에, 피. 알베이, 피. 아밀로리티쿠스, 피. 아나에리카누스, 피. 안타르크티쿠스, 피. 아사멘시스, 피. 아조레두센스, 피. 바르시노넨시스, 피. 보레알리스, 피. 브라시카에, 피. 캄피나센시스, 피. 친주엔시스, 피. 키티노리티쿠스, 피. 콘드로이티누스, 피. 시네리스, 피. 쿠르드라노리티쿠스, 피. 대전엔시스, 피. 덴드리티포르미스, 피. 에히멘시스, 피. 엘기이, 피. 파비스포루스, 피. 글루카노리티쿠스, 피. 글리카니리티쿠스, 피. 그라미니스, 피. 그라니보란스, 피. 호도가엔시스, 피. 일리노이센시스, 피. 자밀라에, 피. 코벤시스, 피. 콜레오보란스, 피. 코레엔시스, 피. 크립벤시스, 피. 락티스, 피. 라르바에, 피. 라우투스, 피. 렌티모르부스, 피. 마세란스, 피. 막쿠아리엔시스, 피. 마실리엔시스, 피. 멘델리이, 피. 모토부엔시스, 피. 나프탈레노보란스, 피. 네마토필루스, 피. 오도리페르, 피. 파불리, 피. 페오리아에, 피. 포에니시스, 피. 필로스파에라에, 피. 폴리믹사, 피. 포필리아에, 피. 리조스파에라에, 피. 산구이니스, 피. 스텔리페르, 피. 타이춘겐시스, 피. 테르라에, 피. 티아미노리티쿠스, 피. 티모넨시스, 피. 틸로필리, 피. 투리센시스, 피. 발리두스, 피. 보르텍스, 피. 불네리스, 피. 윈니이, 피. 크실라니리티쿠스,
특히 바람직하게는 파에니바실루스 코레엔시스, 파에니바실루스 리조스파에라에, 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 아밀로리티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸(plantarum), 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스(epiphyticus), 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 알베이,
보다 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸, 파에니바실루스 신규 종 에피피티쿠스, 파에니바실루스 테르라에, 파에니바실루스 마세란스, 파에니바실루스 알베이,
더욱 더 바람직하게는 파에니바실루스 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 폴리믹사, 파에니바실루스 폴리믹사 플란타룸 및 파에니바실루스 테르라에.
바실루스 종: 비. 아비살리스(B. abyssalis), 비. 아칸티(B. acanthi), 비. 아시디셀레르(B. acidiceler), 비. 아시디콜라(B. acidicola), 비. 아시디프로두센스(B. acidiproducens), 비. 아시디톨레란스(B. aciditolerans), 비. 아시도풀룰리티쿠스(B. acidopullulyticus), 비. 아시도보란스(B. acidovorans), 비. 아에올리우스(B. aeolius), 비. 아에쿠오로리스(B. aequororis), 비. 아에리스(B. aeris), 비. 아에리우스(B. aerius), 비. 아에로라크티쿠스(B. aerolacticus), 비. 아에스투아리이, 비. 아이딘겐시스(B. aidingensis), 비. 아키바이(B. akibai), 비. 알칼리이눌리누스(B. alcaliinulinus), 비. 알칼로필루스(B. alcalophilus), 비. 알기콜라(B. algicola), 비. 알칼리콜라(B. alkalicola), 비. 알칼리라쿠스(B. alkalilacus), 비. 알칼리니트릴리쿠스(B. alkalinitrilicus), 비. 알칼리세디미니스(B. alkalisediminis), 비. 알칼리텔루리스(B. alkalitelluris), 비. 알칼리톨레란스(B. alkalitolerans), 비. 알칼로가야(B. alkalogaya), 비. 알티투디니스(B. altitudinis), 비. 알베아유엔시스(B. alveayuensis), 비. 아밀리엔시스(B. amiliensis), 비. 안드레에세니이(B. andreesenii), 비. 안드레라오울티이(B. andreraoultii), 비. 아포르로에우스(B. aporrhoeus), 비. 아퀴마리스(B. aquimaris), 비. 아르부티니보란스(B. arbutinivorans), 비. 아리아브하타이(B. aryabhattai), 비. 아사히이(B. asahii), 비. 아우란티아쿠스, 비. 아우스트랄리마리스(B. australimaris), 비. 아조토포르만스(B. azotoformans), 비. 박테리움(B. bacterium), 비. 바디우스(B. badius), 비. 바에크륜겐시스(B. baekryungensis), 비. 바타비엔시스(B. bataviensis), 비. 벤조에보란스(B. benzoevorans), 비. 베린겐시스(B. beringensis), 비. 베르켈레이이(B. berkeleyi), 비. 베베리드게이(B. beveridgei), 비. 빙마욘겐시스(B. bingmayongensis), 비. 보고리엔시스(B. bogoriensis), 비. 보르보리(B. borbori), 비. 보로니필루스(B. boroniphilus), 비. 부타놀리보란스(B. butanolivorans), 비. 카브리알레시이(B. cabrialesii), 비. 카카에(B. caccae), 비. 카멜리아에, 비. 캄피살리스(B. campisalis), 비. 카나베랄리우스(B. canaveralius), 비. 카파리디스(B. capparidis), 비. 카르보니필루스(B. carboniphilus), 비. 카사만센시스(B. casamancensis), 비. 카세이니리티쿠스(B. caseinilyticus), 비. 카테눌라투스(B. catenulatus), 비. 카베르나에, 비. 세셈벤시스(B. cecembensis), 비. 셀룰로시리티쿠스, 비. 카간노렌시스(B. chagannorensis), 비. 칸디가렌시스(B. chandigarhensis), 비. 케오나넨시스(B. cheonanensis), 비. 중앙겐시스, 비. 시센시스(B. ciccensis), 비. 시후엔시스(B. cihuensis), 비. 시르쿨란스(B. circulans), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 코아후일렌시스(B. coahuilensis), 비. 코흐니이(B. cohnii), 비. 콤포스티(B. composti), 비. 코니페룸(B. coniferum), 비. 코레아엔시스(B. coreaensis), 비. 크라쏘스트레아에, 비. 크레센스(B. crescens), 비. 쿠쿠미스, 비. 다카렌시스, 비. 달리엔시스(B. daliensis), 비. 다난겐시스(B. danangensis), 비. 다킨겐시스(B. daqingensis), 비. 데시시프론디스(B. decisifrondis), 비. 데콜로라티오니스(B. decolorationis), 비. 데프레스수스(B. depressus), 비. 데라미피칸스(B. deramificans), 비. 데세르티(B. deserti), 비. 디엘모엔시스(B. dielmoensis), 비. 드지벨로렌시스(B. djibelorensis), 비. 드렌텐시스(B. drentensis), 비. 엑토이니포르만스(B. ectoiniformans), 비. 에이세니아에(B. eiseniae), 비. 엔클렌시스(B. enclensis), 비. 엔돌리티쿠스(B. endolithicus), 비. 엔도피티쿠스, 비. 엔도라디시스(B. endoradicis), 비. 엔도잔톡실리쿠스(B. endozanthoxylicus), 비. 파라기니스(B. farraginis), 비. 파스티디오수스(B. fastidiosus), 비. 펭키우엔시스(B. fengqiuensis), 비. 페르멘티(B. fermenti), 비. 페라리아룸(B. ferrariarum), 비. 필라멘토수스(B. filamentosus), 비. 피르미스(B. firmis), 비. 피르무스(B. firmus), 비. 플라보칼다리우스(B. flavocaldarius), 비. 플렉수스(B. flexus), 비. 포라미니스(B. foraminis), 비. 포르디이(B. fordii), 비. 포르모센시스(B. formosensis), 비. 포르티스(B. fortis), 비. 프레우덴레이키이(B. freudenreichii), 비. 푸코시보란스(B. fucosivorans), 비. 푸마리올리(B. fumarioli), 비. 푸니쿨루스(B. funiculus), 비. 갈락토시디리티쿠스(B. galactosidilyticus), 비. 갈리시엔시스(B. galliciensis), 비. 기브소니이(B. gibsonii), 비. 진셍기솔리(B. ginsenggisoli), 비. 진센기후미, 비. 진센기솔리(B. ginsengisoli), 비. 글렌니이(B. glennii), 비. 글리시니페르멘탄스(B. glycinifermentans), 비. 고비엔시스(B. gobiensis), 비. 고시피이(B. gossypii), 비. 고트테일리이(B. gottheilii), 비. 그라미니스, 비. 그라나덴시스(B. granadensis), 비. 하켄사키이(B. hackensackii), 비. 하이코우엔시스(B. haikouensis), 비. 할마팔루스(B. halmapalus), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 할로사카로보란스(B. halosaccharovorans), 비. 하이네시이(B. haynesii), 비. 헤미셀룰로시리티쿠스(B. hemicellulosilyticus), 비. 헤미센트로티(B. hemicentroti), 비. 헤르베르스테이넨시스(B. herbersteinensis), 비. 히사쉬이(B. hisashii), 비. 호리코쉬이(B. horikoshii), 비. 호르네키아에(B. horneckiae), 비. 호르티, 비. 후이조우엔시스(B. huizhouensis), 비. 후미(B. humi), 비. 후나넨시스, 비. 화진포엔시스(B. hwajinpoensis), 비. 이드리엔시스(B. idriensis), 비. 인디쿠스(B. indicus), 비. 인판티스(B. infantis), 비. 인페르누스(B. infernus), 비. 인테르메디우스(B. intermedius), 비. 인테스티날리스(B. intestinalis), 비. 이오카사에(B. iocasae), 비. 이사벨리아에(B. isabeliae), 비. 이스라엘리(B. israeli), 비. 제다헨시스(B. jeddahensis), 비. 제오트갈리(B. jeotgali), 비. 켁수에아에(B. kexueae), 비. 키스쿤사겐시스(B. kiskunsagensis), 비. 코키이(B. kochii), 비. 코케쉬이포르미스(B. kokeshiiformis), 비. 코레엔시스, 비. 코르렌시스(B. korlensis), 비. 크립벤시스, 비. 크룰위키아에(B. krulwichiae), 비. 콰시오르코리(B. kwashiorkori), 비. 경기엔시스(B. kyonggiensis), 비. 라시살시(B. lacisalsi), 비. 라쿠스, 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 렌투스, 비. 리그니니필루스(B. ligniniphilus), 비. 린디아넨시스(B. lindianensis), 비. 리토랄리스(B. litoralis), 비. 로이셀레우리아에(B. loiseleuriae), 비. 로나렌시스(B. lonarensis), 비. 롱기쿠아에시툼(B. longiquaesitum), 비. 롱기스포루스(B. longisporus), 비. 루시페렌시스(B. luciferensis), 비. 루테오루스(B. luteolus), 비. 루테우스, 비. 리코페르시시(B. lycopersici), 비. 마가테리움(B. magaterium), 비. 말리키이(B. malikii), 비. 만그로벤시스(B. mangrovensis), 비. 만그로비(B. mangrovi), 비. 만나니리티쿠스(B. mannanilyticus), 비. 마누센시스(B. manusensis), 비. 마라스미(B. marasmi), 비. 마르코레스틴크툼(B. marcorestinctum), 비. 마리니세디멘토룸(B. marinisedimentorum), 비. 마리스플라비(B. marisflavi), 비. 마리티무스(B. maritimus), 비. 마르마렌시스(B. marmarensis), 비. 마실리글라시에이(B. massiliglaciei), 비. 마실리오아노렉시우스(B. massilioanorexius), 비. 마실리오가보넨시스(B. massiliogabonensis), 비. 마실리오고릴라에(B. massiliogorillae), 비. 마실리오니게리엔시스(B. massilionigeriensis), 비. 마실리오세네갈렌시스(B. massiliosenegalensis), 비. 메디테르라네엔시스(B. mediterraneensis), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 메소나에(B. mesonae), 비. 메소필룸(B. mesophilum), 비. 메소필루스, 비. 메타놀리쿠스, 비. 미스칸티(B. miscanthi), 비. 무랄리스(B. muralis), 비. 무리마르티니(B. murimartini), 비. 나카무라이(B. nakamurai), 비. 난하이이세디미니스(B. nanhaiisediminis), 비. 나트로노필루스(B. natronophilus), 비. 엔디오피쿠스(B. ndiopicus), 비. 네알소니이(B. nealsonii), 비. 네마토시다(B. nematocida), 비. 니아벤시스(B. niabensis), 비. 니아시니(B. niacini), 비. 니아메이엔시스(B. niameyensis), 비. 니트리토필루스(B. nitritophilus), 비. 노토진센기솔리(B. notoginsengisoli), 비. 노발리스(B. novalis), 비. 오브스트룩티부스(B. obstructivus), 비. 오세아니(B. oceani), 비. 오세아니세디미니스, 비. 오벤시스(B. ohbensis), 비. 오크헨시스(B. okhensis), 비. 오쿠히덴시스(B. okuhidensis), 비. 올레이보란스(B. oleivorans), 비. 올레로니우스(B. oleronius), 비. 올리바에(B. olivae), 비. 오누벤시스(B. onubensis), 비. 오리자에, 비. 오리자에코르티시스(B. oryzaecorticis), 비. 오리지솔리, 비. 오리지테르라에(B. oryziterrae), 비. 오쉬멘시스(B. oshimensis), 비. 파키스타넨시스(B. pakistanensis), 비. 파나키솔리, 비. 파나시테라에, 비. 파라플렉수스(B. paraflexus), 비. 파타고니엔시스(B. patagoniensis), 비. 페르시쿠스(B. persicus), 비. 페르바구스(B. pervagus), 비. 포카에엔시스(B. phocaeensis), 비. 피키노티이(B. pichinotyi), 비. 피스키콜라(B. piscicola), 비. 피스키스(B. piscis), 비. 플라코르티디스(B. plakortidis), 비. 포케오넨시스, 비. 폴리고니(B. polygoni), 비. 폴리마쿠스(B. polymachus), 비. 포풀리, 비. 프라에디이(B. praedii), 비. 슈달칼리필루스(B. pseudalcaliphilus), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 슈도플렉수스(B. pseudoflexus), 비. 슈도메가테리움(B. pseudomegaterium), 비. 사이크로사카로리티쿠스(B. psychrosaccharolyticus), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 푸르가티오니레시스텐(B. purgationiresistens), 비. 킹스헨기이, 비. 라세밀락티쿠스(B. racemilacticus), 비. 리조스파에라에, 비. 리길리프로푼디(B. rigiliprofundi), 비. 루비인판티스(B. rubiinfantis), 비. 루리스(B. ruris), 비. 사펜시스(B. safensis), 비. 사가니이(B. saganii), 비. 살라세티스(B. salacetis), 비. 살라리우스(B. salarius), 비. 살리두란스(B. salidurans), 비. 살리스(B. salis), 비. 살리톨레란스(B. salitolerans), 비. 살말라야(B. salmalaya), 비. 살수스(B. salsus), 비. 세디미니스, 비. 셀레나타르세나티스(B. selenatarsenatis), 비. 세네갈렌시스, 비. 세오하에아넨시스(B. seohaeanensis), 비. 샤케엔시스(B. shacheensis), 비. 샤크클레토니이(B. shackletonii), 비. 샨돈겐시스(B. shandongensis), 비. 쉬바지이(B. shivajii), 비. 시밀리스(B. similis), 비. 심플렉스(B. simplex), 비. 시네살로우멘시스(B. sinesaloumensis), 비. 시랄리스(B. siralis), 비. 스미티이(B. smithii), 비. 솔라니, 비. 솔리, 비. 솔리만그로비(B. solimangrovi), 비. 솔리실바에(B. solisilvae), 비. 송클렌시스(B. songklensis), 비. 스폰기아에(B. spongiae), 비. 스포로써모두란스(B. sporothermodurans), 비. 스탐시이(B. stamsii), 비. 서브테르라네우스(B. subterraneus), 비. 스웨제이이(B. swezeyi), 비. 타에아넨시스(B. taeanensis), 비. 타이와넨시스, 비. 타마리시스(B. tamaricis), 비. 탁시(B. taxi), 비. 테르라에, 비. 테스티스(B. testis), 비. 타온히엔시스(B. thaonhiensis), 비. 써모알칼로필루스(B. thermoalkalophilus), 비. 써모아밀로리퀘파시엔스(B. thermoamyloliquefaciens), 비. 써모아밀로보란스(B. thermoamylovorans), 비. 써모코프리아에(B. thermocopriae), 비. 써모락티스(B. thermolactis), 비. 써모필루스, 비. 써모프로테오리티쿠스(B. thermoproteolyticus), 비. 써모테레스트리스(B. thermoterrestris), 비. 써모제아마이제(B. thermozeamaize), 비. 티오파란스(B. thioparans), 비. 티안무엔시스, 비. 티안쉐니이(B. tianshenii), 비. 티모넨시스, 비. 티프키랄리스(B. tipchiralis), 비. 트립옥실리콜라(B. trypoxylicola), 비. 투아레기, 비. 우룸키엔시스(B. urumqiensis), 비. 비에트나멘시스(B. vietnamensis), 비. 비니, 비. 비레티(B. vireti), 비. 비스코수스(B. viscosus), 비. 비텔리누스(B. vitellinus), 비. 와코엔시스(B. wakoensis), 비. 웨이하이엔시스(B. weihaiensis), 비. 우달리안키엔시스(B. wudalianchiensis), 비. 우이샤넨시스(B. wuyishanensis), 비. 크시아메넨시스(B. xiamenensis), 비. 시아옥시엔시스(B. xiaoxiensis), 비. 잔톡실리, 비. 제아에, 비. 장조우엔시스(B. zhangzhouensis), 비. 잔지안겐시스(B. zhanjiangensis),
바람직하게는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 비. 메가테리움, 비. 서브틸리스, 비. 푸밀루스, 비. 피르무스, 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis), 비. 벨레젠시스(B. velezensis), 비. 리넨스(B. linens), 비. 아트로파에우스(B. atrophaeus), 비. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 아리아브하타이, 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아쿠아틸리스(B. aquatilis), 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 스파에리쿠스(B. sphaericus), 비. 티아미노리티쿠스, 비. 모자벤시스(B. mojavensis), 비. 발리스모르티스(B. vallismortis), 비. 코아굴란스, 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스, 비. 포케오넨시스, 비. 기브소니이, 비. 아시디셀레르, 비. 플렉수스, 비. 후나넨시스, 비. 슈도미코이데스(B. pseudomycoides), 비. 심플렉스, 비. 사펜시스, 비. 미코이데스(B. mycoides),
특히 바람직하게는 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 투린기엔시스, 비. 벨레젠시스, 비. 서브틸리스 및 비. 메가테리움,
더욱 더 바람직하게는 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 투린기엔시스, 비. 벨레젠시스 및 비. 메가테리움.
클로스트리디움 종: 씨. 아우토에타노게눔(C. autoethanogenum), 씨. 베이제린크키이(C. beijerinckii), 씨. 부티리쿰(C. butyricum), 씨. 카르복시디보란스(C. carboxidivorans), 씨. 디스포리쿰(C. disporicum), 씨. 드라케이(C. drakei), 씨. 륭달리이(C. ljungdahlii), 씨. 클루이베리(C. kluyveri), 씨. 파스토리아눔(C. pasteurianum), 씨. 프로피오니쿰(C. propionicum), 씨. 사카로부티리쿰(C. saccharobutylicum), 씨. 사카로페르부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스카톨로게네스(C. scatologenes), 씨. 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 바람직하게는 씨. 부티리쿰, 씨. 파스토리아눔 및/또는 씨. 티로부티리쿰, 씨. 아에로톨레란스(C. aerotolerans), 씨. 아미노필룸(C. aminophilum), 씨. 아민발레리쿰(C. aminvalericum), 씨. 셀레레크레센스(C. celerecrescens), 씨. 아스파라그포르메(C. asparagforme), 씨. 볼테아에(C. bolteae), 씨. 클로스트리디오포르메(C. clostridioforme), 씨. 글리시르리지니리티쿰(C. glycyrrhizinilyticum), 씨. (훈가텔라) 하테와이(C. (Hungatela) hathewayi), 씨. 히스토리티쿰(C. histolyticum), 씨. 인돌리스(C. indolis), 씨. 렙툼(C. leptum), 씨. (티즈제렐라) 넥실레(C. (Tyzzerella) nexile), 씨. 페르프린겐스(C. perfringens), 씨.(에리시펠라토클로스트리디움) 라모숨(C.(Erysipelatoclostridium) ramosum), 씨. 신덴스(C. scindens), 씨. 심바이오숨(C. symbiosum), 클로스트리디움 사카로구미아(Clostridium saccharogumia), 클로스트리디움 소르델리(Clostridium sordelli), 클로스트리디움 클로스트리디오포르메, 씨. 메틸펜토숨(C. methylpentosum), 씨. 아일랜디쿰(C. islandicum) 및 클로스트리디아 클러스터 IV, XIVa, 및 XVIII의 모든 구성원, 특히 바람직하게는 씨. 부티리쿰.
일부 적합한 바실루스 및 파에니바실루스 균주는 하기 국제 특허 출원에 기재되고 기탁되어 있다; 이러한 미생물의 포자 또는 그의 임의의 것의 살충 활성 변이체는 본 발명에 따른 조성물의 포자로서 포함될 수 있다: WO2020200959: NRRL 수탁 번호 B-21661 하에 기탁된 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 QST713 또는 그의 살진균 돌연변이체. 바실루스 서브틸리스 QST713, 그의 돌연변이체, 그의 상청액, 및 그의 지질펩티드 대사물, 및 식물 병원체 및 곤충을 방제하는 이들의 사용 방법은 미국 특허 번호 6060051, 6103228, 6291426, 6417163 및 6638910에 완전히 기재되어 있다. 이들 특허에서, 균주는 AQ713으로 지칭되며, 이는 QST713과 동의어이다; WO2020102592: 바실루스 투린기엔시스 균주 NRRL B-67685, NRRL B-67687, 및 NRRL B-67688; WO2019135972: 기탁 수탁 번호 NRRL B-67533 또는 NRRL B-67534를 갖는 바실루스 메가테리움(Bacillus megatherium); WO2019035881: 파에니바실루스 종 NRRL B-50972, 파에니바실루스 종 NRRL B-67129, 수탁 번호 NRRL B-50421 하에 기탁된 바실루스 서브틸리스 균주 QST30002, 및 바실루스 서브틸리스 균주 NRRL B-50455; WO2018081543: ATCC 수탁 번호 PT A-123720 또는 PT A-124246 하에 기탁된 바실루스 사이크로사카로리티쿠스 균주; WO2017151742: 수탁 번호 NRRL B-21661로 지정된 바실루스 서브틸리스; WO2016106063: 바실루스 푸밀루스 NRLL B-30087; WO2013152353: CNMC 1-1582로서 기탁된 바실루스 종; WO2013016361: NRRL B-50760으로서 기탁된 바실루스 종 균주 SGI-015-F03, NRRL B-50761로서 기탁된 바실루스 종 균주 SGI-015-H06; WO2020181053: 파에니바실루스 종 NRRL B-67721, 파에니바실루스 종 NRRL B-67723, 파에니바실루스 종 NRRL B-67724, 파에니바실루스 종 NRRL B-50374.
본 발명은 또한 미생물에, 하기를 제공하는 단계를 포함하는, 미생물의 접합 적격성을 증가시키는 방법을 제공하며:
a) 본 발명에 따른 돌연변이체 DegS 단백질 및 바람직하게는 돌연변이체 DegU 단백질, 또는
b) 본 발명에 따른 돌연변이체 Spo0A 단백질.
본원에 기재된 바와 같이, 이러한 돌연변이체 단백질의 선택적 제공은 미생물의 접합 적격성을 유리하게 개선시킨다.
상응하여 본 발명은 또한 하기를 포함하는, 2종의 미생물 사이에 유전 물질을 전달하는 방법을 제공한다:
1) 제1 미생물에, 하기를 제공하는 단계:
a) 본 발명에 따른 돌연변이체 DegS 단백질 및 바람직하게는 본 발명에 따른 돌연변이체 DegU 단백질, 또는
b) 본 발명에 따른 돌연변이체 Spo0A 단백질, 및
2) 제1 미생물을 접합 적격 제2 미생물과 접합시키는 단계,
여기서 제1 미생물은, 단계 2 전에, 전달될 유전 물질을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, (a) 바람직하게는 돌연변이체 DegU 단백질과 함께 및 임의의 경우에 돌연변이체 Spo0A 단백질 없이, 돌연변이체 DegS 단백질 또는 (b) 돌연변이체 DegS 및 임의로 DegU 단백질 없이 돌연변이체 Spo0A 단백질의 제공은 제1 미생물 ("표적 미생물")의 증가된 접합 적격성을 초래한다. 이 표적 미생물이 전달될 핵산을 운반하는 접합 적격 제2 미생물 ("공여자 미생물")과 접촉될 때, 상기 핵산은 고효율로 접합적으로 전달된다.
본 발명의 전달 방법에서, 바람직하게는 돌연변이체 degU 및 degS 또는 spo0A 유전자는, 각각, 표적 미생물에서 염색체외 핵산 상에 위치한 각각의 발현 카세트에 제공되고, 여기서 염색체외 핵산은 반대선택가능한 마커를 추가로 포함하고 전달 방법은 반대선택가능한 마커에 대해 반대선택하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 반대선택가능한 마커를 사용함으로써 접합 적격성을 부여하는 염색체외 핵산은 제거되어, 이로써 접합적으로 전달된 핵산의 흡수 후 미생물의 안정성을 증가시키고 추가 수평 유전자 전달을 방지하거나 또는 제한할 수 있다.
상응하여 본 발명은 또한 반대선택가능한 마커, 및 하기의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다:
a) 본 발명에 따른 돌연변이체 degS 유전자 및 바람직하게는 본 발명에 따른 돌연변이체 degU 유전자, 또는
b) 본 발명에 따른 돌연변이체 spo0A 유전자.
이러한 발현 벡터는 유리하게 이종성 핵산의 수용자로서 의도된 표적 미생물에서의 발현을 위한 각각의 돌연변이체 유전자 또는 유전자들을 제공하는 것을 돕는다.
본 발명은 또한
a) 본 발명에 따른 돌연변이체 degS 유전자 및 바람직하게는 본 발명에 따른 돌연변이체 degU 유전자 또는
b) 본 발명에 따른 돌연변이체 spo0A 유전자
의, 본원에 열거된 바람직한 미생물의 분류학적 계급 중 임의의 것으로부터 선택된 미생물의 접합 적격성을 증가시키기 위한 용도를 제공한다.
각각의 유전자 또는 유전자들을 사용함으로써, 또는 상응하는 돌연변이체 단백질을 사용함으로써, 미생물의 접합 적격성은 유리하게 개선될 수 있다.
본 발명의 측면은 이하 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1: 돌연변이체 생성
균주 및 배양 조건
피. 폴리믹사에서의 CRISPR Cas9에 의한 점 돌연변이의 표적화된 통합에 사용된 균주의 목록은 표 1에 제시된다. 야생형 균주 피. 폴리믹사 DSM365에서의 표적화된 점 돌연변이는 문헌 [Rutering et al. (Rutering et al., Tailor-made exopolysaccharides-CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synth Biol (Oxf). 2017 Dec 21;2(1):ysx007. doi: 10.1093/synbio/ysx007)]에 기재된 CRISPR Cas9 절차에 따라 통합되었다. DSM 365는 독일 브라운슈바이크 소재의 저먼 컬렉션 오브 마이크로오가니즘 앤드 셀 컬쳐(German Collection of Microorganisms and Cell Culture) (DSMZ)로부터 수득되었다. 플라스미드 클로닝 및 증식은 NEB (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국)로부터의 이. 콜라이 DH5α 또는 터보에서 수행되었다. 피. 폴리믹사의 형질전환은 이. 콜라이 S17-1 (DSMZ)에 의해 매개된 접합에 의해 수행되었다. 균주는 LB 배지 (10 g/L 트립톤 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl) 중에 성장되었다. 플레이트 배지의 경우, 1.5 % 아가가 사용되었다. 필요할 때마다, 배지는 양성 형질전환체의 반대선택을 위해 및 접합 절차 후 이. 콜라이를 제거하기 위해 50 μg/ml 네오마이신 및/또는 20 μg/mL 폴리믹신으로 보충되었다. 달리 명시되지 않는 한, 피. 폴리믹사는 30 ℃ 및 250 rpm에서 이. 콜라이는 37 ℃ 및 250 rpm에서 성장되었다. 균주는 24 % 글리세롤과 함께 동결 배양물로서 저장되고 보다 긴 저장 동안 -80 ℃에서 유지되었다.
표 1 피. 폴리믹사 DSM365에서의 표적화된 점-돌연변이의 CRISPR Cas9 매개된 구축에 사용된 균주의 목록
접합
접합은 문헌 [Rutering et al. 2017 (Rutering M, Cress BF, Schilling M, Ruhmann B, Koffas MAG, Sieber V, Schmid J. Tailor-made exopolysaccharides-CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synth Biol (Oxf). 2017 Dec 21;2(1):ysx007. doi: 10.1093/synbio/ysx007. PMID: 32995508; PMCID: PMC7445874)]에 기재된 CRISPR Cas9 절차에 따라 피. 폴리믹사 (수용자 균주)와 관심 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 S17-1 (공여자 균주) 사이에 수행되었다. 정확한 접합체의 확인은 DNA 단편의 콜로니 PCR 및 시퀀싱에 의해 수행되었다. 플라스미드 큐어링은 37 ℃에서 LB 액체 배지 중 양성 돌연변이체의 1:100 계대배양함에 의해 수행되었다.
플라스미드 구축
표적화된 점 돌연변이는 CRISPR-Cas9 매개된 시스템에 의해 달성되었다. 선택된 gRNA 서열은 degU, degS, 또는 spo0A 유전자 내 표적화된 위치에 대해 이들의 가장 가까운 근접성에 기반하여 선택되었다. 플라스미드는 등온 깁슨 조립에 의해 조립되었다. 목적하는 점 돌연변이는 상동성 플랭크의 PCR에 사용된 프라이머로부터 도입되었다. degS 및 spo0A에 대해, 여러 침묵 돌연변이가 또한 시스템의 효율을 개선시키기 위해 프라이머에 도입되었다. 상동성 플랭크는 표적화된 뉴클레오티드의 약 1 kbp 상류 및 하류에서, 피. 폴리믹사 게놈 DNA의 PCR에 의해 수득되었다. 이. 콜라이 DH5α 또는 터보는 깁슨 조립 혼합물로 형질전환되고 50 μg/ml 네오마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅되었다. 양성 콜로니의 스크리닝은 콜로니 PCR에 의해 수행되었다. 플라스미드는 미니프렙에 의해 단리되고 추가 확인을 위한 시퀀싱에 의해 확인되었다. 정확한 플라스미드가 이. 콜라이 S17-1을 형질전환시키는 데 사용되었으며 이는 이어서 피. 폴리믹사로의 형질전환을 매개할 것이다.
pCasPP 벡터 시스템 및 표적화된 점 돌연변이 영역을 플랭킹하는 주변 게놈 서열 각각 1000bp를 운반하는 상동성 플랭크를 사용하여, 하기 돌연변이가 생성되었다 (표 2):
표 2 돌연변이체 균주 및 CRISPR Cas9에 의한 게놈 편집에 사용된 연관된 스페이서 서열의 목록. SNP = 단일 뉴클레오티드 다형성, nt = 뉴클레오티드.
실시예 2: 유전자 적격성 평가
상이한 변이체의 유전자 적격성은 상기 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라, 큐어링된 균주를 공여자 균주로서의 pCasPP 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 S17-1과 접합시킴으로써 평가되었다. 플라스미드는 게오바실루스 스테아로써모필루스로부터의 구성적 sgsE 프로모터의 제어 하에 발현된 SpCas9 유전자를 함유하고 어떠한 피. 폴리믹사 게놈을 표적화하는 gRNA도 함유하지 않는다. 계수가능한 콜로니를 수득하기 위해, 연속 희석액이 접합된 균주를 항생제를 갖는 선택 LB 플레이트 상으로 플레이팅하기 전에 제조되었다. 각각의 균주로부터의 콜로니 형성 단위는 이어서 접합에 사용된 그의 각각의 OD600에 대해 정규화되었다. 적격성에서의 증가는 야생형 균주와 비교하여, 접합 후 CFU의 수에 기반하여 계산된다.
Claims (13)
- a) 돌연변이체 degS 유전자 및 임의로 돌연변이체 degU 유전자, 또는
b) 돌연변이체 spo0A 유전자
를 포함하며, 상응하는 야생형 균주에 비해 증가된 접합 적격성을 나타내는 미생물. - 제1항에 있어서, 돌연변이체 degS 유전자를 포함하며, 여기서
- degS 유전자는 기능적 단일 결합 도메인, 기능적 포스포억셉터 도메인 및/또는 기능적 ATPase 도메인이 결여된 DegS 단백질을 코딩하고/거나
- degS 유전자는 DegS 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는 L99F, L99C, L99D, L99E, L99G, L99H, L99K, L99N, L99P, L99Q, L99R, L99S, L99W 또는 L99Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 미생물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 돌연변이체 degU 유전자를 포함하며, 여기서
- degU 유전자는 감소된 DNA 결합 활성을 갖는 DegU 단백질을 코딩하고/거나 기능적 DNA 결합 도메인이 결여되고/거나,
- degU 유전자는 DegU 단백질을 코딩하며, 여기서 돌연변이는, 각각의 대안 a) 및 b)에 대해 선호도가 감소하는 순서대로,
a) Q218*, Q218K, Q218N, Q218D, Q218R
b) D223*, D223*+M220N, D223*+M220N+E221G, D223*+M220N+V222G, D223*+M220N+E221G+V222G, D223*+M220D, D223*+M220E, D223*+M220H, D223*+M220F, D223*+M220W, D223*+M220S, D223*+M220A
중 1개 이상을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 미생물. - 제1항에 있어서, 돌연변이체 spo0A 유전자를 포함하며, 여기서
a) 돌연변이는 DNA 결합 또는 수신자 도메인에 위치하고 Spo0A 단백질의 인산화의 감소 또는 제거 및/또는 이량체화의 감소 또는 제거를 발생시키고/거나,
b) 돌연변이는
- A257V, 보다 바람직하게는 A257S,
- I161R, 보다 바람직하게는 I161L,
- 선호도가 감소하는 순서대로: A257S+I161I, A257A+I161L, A257V+I161I, A257S+I161F 또는 A257A+I161R
중 임의의 것으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 것인 미생물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
- 야생형 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현이 돌연변이체 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현보다 적거나, 또는
- 야생형 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현이 돌연변이체 (a) degU 및 degS 유전자 또는, 각각 (b) spo0A 유전자의 발현 동안 억제되거나 또는 제거되는 것인 미생물. - 제5항에 있어서, 하기를 포함하는 미생물:
a) 바람직하게는 제2항 또는 제3항에 따른, 돌연변이체 degU 및 돌연변이체 degS 유전자, 및 야생형 degU 및 degS 유전자가 기능적으로 불활성화되거나, 제거되거나 또는 돌연변이체 유전자에 의해 대체된 것, 또는
b) 바람직하게는 제4항에 따른, 돌연변이체 spo0A 유전자, 및 야생형 spo0A 유전자가 기능적으로 불활성화되거나, 제거되거나 또는 돌연변이체 유전자에 의해 대체된 것. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 degU 및 degS 또는 spo0A 유전자가, 각각, 염색체외 핵산 상에 위치한 각각의 발현 카세트에 제공되고, 여기서 염색체외 핵산은 반대선택가능한 마커를 추가로 포함하는 것인 미생물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 분류학적 계급으로부터 선택되는 미생물:
- 피르미쿠테스(Firmicutes) 문, 바실리(Bacilli), 클로스트리디아(Clostridia) 또는 네가티비쿠테스(Negativicutes) 강,
- 보다 바람직하게는 바실랄레스(Bacillales), 클로스트리디알레스(Clostridiales), 써모아나에로박테랄레스(Thermoanaerobacterales), 써모세디미니박테랄레스(Thermosediminibacterales) 또는 셀레노모나달레스(Selenomonadales) 목,
- 보다 바람직하게는 바실라세아에(Bacillaceae), 파에니바실라세아에(Paenibacillaceae), 파스토리아세아에(Pasteuriaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 펩토코카세아에(Peptococcaceae), 헬리오박테리아세아에(Heliobacteriaceae), 신트로포모나다세아에(Syntrophomonadaceae), 써모아나에로박테라세아에(Thermoanaerobacteraceae), 테피다나에로박테라세아에(Tepidanaerobacteraceae) 또는 스포로무사세아에(Sporomusaceae) 과,
- 보다 바람직하게는 알칼리바실루스(Alkalibacillus), 바실루스(Bacillus), 게오바실루스(Geobacillus), 할로바실루스(Halobacillus), 리시니바실루스(Lysinibacillus), 피스키바실루스(Piscibacillus), 테리바실루스(Terribacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 써모바실루스(Thermobacillus), 파스토리아(Pasteuria), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 헬리오박테리움(Heliobacterium), 펠로스포라(Pelospora), 펠로토마쿨룸(Pelotomaculum), 칼다나에로박터(Caldanaerobacter), 무렐라(Moorella), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 테피다나에로박터(Tepidanaerobacter), 프로피오니스포라(Propionispora) 또는 스포로무사(Sporomusa) 속,
- 보다 바람직하게는 바실루스(Bacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus) 또는 클로스트리디움(Clostridium) 속. - a) 제2항 또는 제3항에 따른 돌연변이체 DegS 단백질 및 임의로 돌연변이체 DegU 단백질, 또는
b) 제4항에 따른 돌연변이체 Spo0A 단백질
을 미생물에 제공하는 단계를 포함하는, 미생물의 접합 적격성을 증가시키는 방법. - 2종의 미생물 사이에 유전 물질을 전달하는 방법으로서,
1) 제1 미생물에
a) 제2항에 따른 돌연변이체 DegS 단백질 및 임의로 제3항에 따른 돌연변이체 DegU 단백질, 또는
b) 제4항에 따른 돌연변이체 Spo0A 단백질
를 제공하는 단계, 및
2) 제1 미생물을 접합 적격 제2 미생물과 접합시키는 단계
를 포함하고, 여기서 제1 미생물은, 단계 2 전에, 전달될 유전 물질을 포함하는 것인 방법. - 제10항에 있어서, 제1 미생물이 제7항에 따른 미생물이고, 전달 방법이 반대선택가능한 마커에 대해 반대선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 전달 방법.
- 반대선택가능한 마커, 및 하기의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는, 발현 벡터:
a) 제2항에 따른 돌연변이체 degS 유전자 및, 임의로, 제3항에 따른 돌연변이체 degU 유전자, 또는
b) 제4항에 따른 돌연변이체 spo0A 유전자. - a) 제2항에 따른 돌연변이체 degS 유전자 및 임의로 제3항에 따른 돌연변이체 degU 유전자 또는
b) 제4항에 따른 돌연변이체 spo0A 유전자
의, 제8항의 분류학적 계급 중 임의의 것으로부터 선택된 미생물의 접합 적격성을 증가시키기 위한 용도.
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