CN101978056A - 质粒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种质粒载体以及提供使用该质粒的转化体，其中该质粒载体具有高生产效率，可将其用于工业上有价值和有用的蛋白质的大规模生产。该质粒载体具有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基分别被(a)丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，(b)甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，(c)天冬酰胺和(d)谷氨酸所取代。

Description

质粒载体
技术领域
本发明涉及一种质粒载体，所述质粒载体包含编码复制蛋白的基因，对于制造外源蛋白有用。
背景技术
近年来，积极开展了基因工程研究，报道了很多使用重组微生物大规模生产有用蛋白质的技术。作为一个大量生产蛋白质的例子，可以提及具有高生产率的质粒载体的发展。例如，一种包括涉及胞外酶生成例如淀粉酶、蛋白酶或果聚糖蔗糖酶的各种基因启动子区，以及包括编码涉及这些蛋白质胞外分泌的信号肽区的表达和分泌载体(专利文献1和2)；一种复制区被改动以增加其拷贝数的载体(专利文献3和4)等。
然而，按照通常使用的、基于宿主载体系统制造蛋白质的方法，蛋白质的产量仍不足。另外，也限制了可以大量生产的蛋白质的种类。
专利文献1：JP-A-01-273591
专利文献2：JP-A-2000-287687
专利文献3：JP-A-06-327480
专利文献4：JP-A-2003-9863
发明内容
本发明针对下列1)～11)。
1)一种质粒载体，含有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，
所述复制蛋白包括选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸。
2)一种质粒载体，含有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，
所述复制蛋白包括与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸。
3)上述1)或2)的质粒载体进一步包含基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列，其中，所述基因编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶。
4)上述3)的质粒载体，其中，编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶的基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列是：
具有由用序列识别号13表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～659号碱基的核苷酸序列；具有由用序列识别号14表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～696号碱基的核苷酸序列；与前述任意一个核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；或前述核苷酸序列中部分被删除的核苷酸序列。
5)一种转化体，其含有上述4)的质粒载体。
6)上述5)的转化体，其中，载体的宿主是微生物。
7)一种制备多肽的方法，其包括如下步骤：
构建质粒载体，所述质粒载体包含编码目标多肽的DNA和编码质粒复制蛋白的DNA，
所述复制蛋白包括选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸；
用质粒载体转化宿主微生物；以及
培养宿主微生物，并收集由此生成的目标多肽。
8)一种制备多肽的方法，其包括如下步骤：
构建质粒载体，所述质粒载体包含编码目标多肽的DNA和编码质粒复制蛋白的DNA，
其中，所述复制蛋白包括与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸；
用质粒载体转化宿主微生物；以及
培养宿主微生物，并收集由此生成的目标多肽。
9)上述7)或8)的方法，其中，所述质粒载体进一步包含基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列，其中，所述基因编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶。
10)上述9)的方法，其中，编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶的基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列是：
具有由用序列识别号13表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～659号碱基的核苷酸序列；具有由用序列识别号14表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～696号碱基的核苷酸序列；与前述任意一个核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；或前述核苷酸序列中部分被删除的核苷酸序列。
11)一种多肽，其按照上述7)或8)的方法制备而成。
附图说明
图1表示构建本发明质粒载体的一个例子。
具体实施方式
本发明提供一种质粒载体以及利用该质粒载体的转化体，其中，该质粒载体对于在工业上有价值和有用的蛋白质的大规模生产具有高生产效率。
本发明者们研究通过质粒改性来大规模生产蛋白质，发现通过在pAMα1的复制蛋白中引入某个突变，其通常被用作质粒的复制起始区域(Rep)，从而质粒中包括的目标蛋白结构基因所产生的蛋白质胞外分泌量增加，这样的质粒对于蛋白质大规模生产是有用的。
根据本发明质粒载体，质粒中包括的目标蛋白结构基因所产生的目标蛋白质的胞外分泌量增加。从而通过使用本发明的质粒载体，可以高效地制造目标蛋白质。
在本发明质粒载体中包括并编码质粒复制蛋白的DNA编码下列蛋白质(i)或(ii)。
(i)蛋白质，包含用下列(a)～(d)的氨基酸残基取代选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸。
(ii)蛋白质，包含用下列(a)～(d)的氨基酸残基取代与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，其中，所述一个或多个氨基酸残基选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸。
至于具有用序列识别号2表示的氨基酸序列的蛋白质，可以提及粪肠球菌的质粒pAMα1的复制蛋白。
至于由与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸残基组成的质粒复制蛋白，可以提及其所具有的氨基酸序列不同于用序列识别号2表示的氨基酸序列的蛋白质，其中，该氨基酸序列与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、特别优选至少98％的同一性。
质粒复制蛋白的例子包括那些相对于用序列识别号2表示的氨基酸序列，一个或多个氨基酸被删除、取代或添加的质粒复制蛋白。具体例子包括来自腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)的复制蛋白。其中，优选那些具有自身克隆能力的质粒复制蛋白，例如用序列识别号2表示的氨基酸序列组成的质粒复制蛋白。
本发明质粒复制蛋白是具有用序列识别号2表示的氨基酸序列的蛋白质，或与其有至少80％同一性的氨基酸序列的蛋白质，其中选自(a)位置48或对应位置、(b)位置262或对应位置、(c)位置149或对应位置，和(d)位置198或对应位置的一个或多个氨基酸残基，可以用其它氨基酸残基取代。本发明质粒复制蛋白可以是天然型、或其自然变异体或人为突变变异体。
另外，氨基酸的序列同一性是基于Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算得到。具体说，通过使用基因信息处理软件GenetyxWin(版本5.1.1，Software Development，Co.，Ltd.)的同源性检索程序，ktup(比较的单元大小)设定为2，进行计算分析。
因而，本发明质粒复制蛋白包括：具有氨基酸序列的蛋白质，其中用序列识别号2表示的氨基酸序列的位置48(赖氨酸残基)的氨基酸残基被丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺残基取代，位置262(天冬氨酸残基)的氨基酸残基被甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸取代，位置149(赖氨酸残基)的氨基酸残基被天冬酰胺残基取代，或位置198(赖氨酸残基)的氨基酸残基被谷氨酸残基取代；以及具有与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的蛋白质，其中与用序列识别号2表示的氨基酸序列的位置48相对应的氨基酸残基被丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺残基取代，与位置262相对应的氨基酸残基被甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸取代，与位置149相对应的氨基酸残基被天冬酰胺残基取代，或与位置198相对应的氨基酸残基被谷氨酸残基取代。
另外，至于(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198，可以进行单个或多个氨基酸取代。
这里，关于识别“与(某个)位置相对应的氨基酸残基”的方法，用例如Lipman-Pearson法的公知算法将氨基酸序列进行比对，，然后通过给出对于每个质粒复制蛋白的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基的最高同源性，从而可以进行识别。另外，对于按照该方法对质粒复制蛋白中所包含的氨基酸序列进行排列，无论在氨基酸序列中进行插入或删除，都可以根据每个质粒复制蛋白的序列来确定具有同一性的每个氨基酸残基的位置。确信同源性位置存在于三维结构的相同位点上，并且根据质粒复制蛋白的特定功能推测具有类似的效果。
基于通常所用的定点突变，通过在编码质粒复制蛋白的DNA中引入突变，可以构建本发明质粒载体。更具体地说，可以通过使用定点突变系统的Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara Bio Inc.)等进行。另外，通过使用重组聚合酶链反应(聚合酶链反应，聚合酶链反应方法，Academic Press，New York，1990)，基因中的任意序列可以用其它基因中与该任意序列相对应的序列来取代。
随着拼接DNA片段，其中，所述DNA片段所述包括DNA复制起始区、抗生素抗性基因、DNA区域(包括复制区、用于启动转录的启动子区、和分泌信号区)、和将外源基因的目标产物编码到编码本发明的质粒复制蛋白的DNA上的基因，从而可以构建重组质粒，该重组质粒可用于大规模生产目标基因产物，例如蛋白质、多肽等。
“外源基因”包括编码酶的基因和编码生理活性肽的基因，其中，酶可以列举出淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、支链淀粉酶、过氧化物酶、加氧酶、过氧化氢酶等；生理活性肽可以列举出胰岛素、人生长激素、干扰素、降钙素、白细胞介素等，但不限于此。
“用于启动转录的启动子区、和分泌信号区”是调控区的核苷酸序列，其涉及外源基因转录、翻译和分泌。“用于启动转录的启动子区”的例子包括：包含启动和转录区域的转录起始调控区、核糖体结合位点、包括起始密码子的翻译起始区、及其组合。“分泌信号区”的例子包括分泌信号肽区域。
在本发明的质粒载体中，目标外源基因与涉及转录、翻译和分泌的调控区通过手术相互拼接(例如，调控区被置于外源基因的上游区域)。调控区优选含有三个区域，包括：转录起始调控区、翻译起始调控区和分泌信号区。更优选分泌信号区来源于微生物芽孢杆菌的纤维素酶基因，转录起始区和翻译起始区为相应的纤维素酶基因的上游0.6～1kb。特别优选调控区是来源于均属于芽孢杆菌的菌株KSM-S237(FERM BP-7875)或菌株KSM-64(FERM BP-2886)纤维素酶基因的转录起始调控区、翻译起始区和分泌信号肽区。特别更优选调控区是：序列识别号13表示的核苷酸序列的1～659号碱基的核苷酸序列，序列识别号14表示的核苷酸序列的1～696号碱基的核苷酸序列，与相应的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、特别优选至少95％、特别更优选至少98％的同一性的核苷酸序列，或删除上述核苷酸序列任意部分的核苷酸序列。关于删除上述核苷酸序列任意部分的核苷酸序列，是指序列缺少上述核苷酸序列的部分，但仍保留涉及基因转录、翻译和分泌的功能。
以下，描述从芽孢杆菌菌株KSM-KP43构建用于生产KP43蛋白酶的本发明的质粒载体的一个例子(如图1)。
来源于芽孢杆菌菌株KSM-KP43的KP43蛋白酶基因被拼接到芽孢杆菌菌株KSM-64(FERM BP-2886)纤维素酶的启动子区和分泌信号区的下游区域。另外，作为复制区的pAMα1和作为抗生素抗性基因的四环素抗性基因也被拼接在其上。在这样构建的重组质粒载体中，制备正反方向上的引物，从而在两者之间出现一个位于KP43基因下游区(例如，图1中引物a和d)的限制性酶切位点(Xba Ⅰ)。另外，制备正反方向上的其它引物，从而在Ori-pAMα1基因下游区(例如，图1中引物b和c)形成一个新的限制性酶切位点(Nhe Ⅰ)。加入由PCR所得到的两个片段(即，包括Tc和KP43的区域，和包括pAMα1的区域)，以便在Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ消化后将其拼接。在图1中，对于通过引物b和d扩增的包括pAMα1的区域，通过促进扩增过程中错误的发生，可以构建复制蛋白区域中具有随机突变的质粒载体。
通过用上述方法获得的质粒载体转化宿主微生物，可以生产本发明的重组微生物。进一步，通过培养该重组微生物并从培养物中收集目标蛋白质或多肽，可以大规模生产目标蛋白质或多肽。关于用于转化的宿主微生物，可以列举出葡萄球菌、肠球菌、李斯特氏菌、芽孢杆菌等。其中，优选芽孢杆菌。
用于培养重组微生物的培养基的类型没有特别限定，只要重组微生物可以生长，并可以从中生产出酶即可。另外，对于培养基，以适当浓度混合氮源和碳源，并加入适当浓度的无机盐、金属盐等。培养基的pH值和温度没有特别限制，只要重组微生物可以在其中生长即可。
另外，可以按照一般方法分离所产生的目标蛋白质或多肽。如果需要，也可以进行纯化、结晶和造粒。
实施例
实施例1 Rep48位置的突变效应
基于具有提高的分泌特性或特定活性的突变蛋白酶的生产效率，该突变蛋白酶来源于JP-A-2002-218989、JP-A-2002-306176或JP-A-2004-122所述芽孢杆菌菌株KSM-KP43的碱性蛋白酶(碱性蛋白酶具有序列识别号3或序列识别号4的核苷酸序列，其中位置46的苯丙氨酸被亮氨酸取代，位置65的苏氨酸被脯氨酸取代，位置195的酪氨酸被组氨酸取代，位置273的缬氨酸被异亮氨酸取代，位置359的苏氨酸被丝氨酸取代，位置369的天冬氨酸被天冬酰胺取代，位置387的丝氨酸被丙氨酸取代。以下称为“KP43H2”)，测定Rep48位置的突变效应。
Rep的突变通过使用pHA64-KP43H2作为模板在Takara热循环仪480型中进行聚合酶链反应而引入。pHA64-KP43H2是质粒载体，其中KP43H2的结构基因和终止子被拼接在表达载体pHA64的BamH Ⅰ和Xba Ⅰ位置；表达载体pHA64是质粒载体，包括质粒pAMα1或pUB110的复制区域、复制蛋白(Rep)和抗生素抗性基因(JP-A-03-259086)，还具有芽孢杆菌菌株KSM-64的碱性纤维素酶K-64的启动子区和分泌信号区(JP-A-2000-287687)。具体说，向0.1～0.5ng的作为模板的环型质粒中，加入20pmol的每个引入突变的引物对(例如，序列识别号5和序列识别号9，或序列识别号7和序列识别号10)、20nmol的每个dNTPs、5μLTakara Pyrobest DNA聚合酶的缓冲液和2U Pyrobest DNA聚合酶，来制备反应溶液(50μL)。作为聚合酶链反应条件，94℃下变性1分钟后，以94℃下1分钟、55℃下1分钟、72℃下4分钟的周期，重复30次(即，30个周期)。作为最后的反应，混合物在72℃下孵育10分钟。
所得到的聚合酶链反应产物用高纯聚合酶链反应产物纯化试剂盒(Roche)纯化，用100μL无菌水洗，单个片段用引物(序列识别号5和序列识别号7)扩增，每个引物位于单个片段的尾端。具体说，将第一次聚合酶链反应所得到的两个片段的每一个100倍稀释、混合，然后用上述相同条件进行聚合酶链反应。扩增的DNA片段用电泳法鉴定，用Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化。再通过使用DNA拼接试剂盒第2版(Takara Bio Inc.)，拼接到Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化得到的片段上。该片段是通过用pHA64-KP43H2作为模板，按照上述方法用序列识别号6和序列识别号8的引物扩增后用Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化所得到的，其中包括四环素抗性基因和KP43H2基因。。
所得到的反应溶液用高纯聚合酶链反应产物纯化试剂盒(Roche)纯化，用100μL无菌水洗。基于电穿孔法，使用基因脉冲试管(Biorad)将得到的DNA溶液用于芽孢杆菌菌株KSM-KP43的转化。在包含脱脂牛奶的碱性琼脂培养基[1％(w/v)脱脂牛奶(Difco)、1％细菌用胰蛋白胨(Difco)、0.5％酵母提取物(Difco)、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、0.05％无水碳酸钠、15ppm四环素]中培养转化的细胞。再通过观察脱脂牛奶裂解标志的形成，来测定细胞中蛋白酶基因的出现或消失。选择包含质粒的转化体，该质粒具有插入pHA64的蛋白酶基因，将该转化体用于进一步培养。
对于每个转化体，确定单个菌落形成和晕形成。之后，在含5mL起子培养基试管中[6.0％(w/v)多聚蛋白胨S(Nihon Seiyaku)、0.1％酵母提取物、1.0％麦芽糖、0.02％七水硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、0.3％无水碳酸钠、30ppm四环素]中培养转化体，30℃下过夜，320rpm下离心。在含有20mL主要介质[8％(w/v)多聚蛋白胨S、0.3％酵母提取物、10％麦芽糖、0.04％七水硫酸镁、0.2％磷酸二氢钾、1.5％无水碳酸钠、30ppm四环素]的500mLSakaguchi烧瓶中培养(1％(v/v))得到的起始培养溶液，30℃下培养3天，121rpm下离心。离心得到的培养物，上清液用于测定蛋白酶活性。用酪蛋白法测定蛋白酶活性。通过使用蛋白质定量检测试剂盒(Wako Pure Chemicals)测定蛋白质浓度。结果发现：相比于对照物(在相同条件下培养的pHA64-KP43H2转化体)，用具有突变Rep基因的质粒产生的碱性蛋白酶KP43H2的活性提高了8～12％的量(见表1)。另外，在培养物上清液中蛋白质的量几乎与蛋白酶活性同比例增加，表明所得到的突变体含有提高蛋白质的分泌所需的突变。另外，从选择的转化体中提取质粒，通过测序来测定其核苷酸序列。结果证实，生成的质粒与所想要突变体相符。
表1：
  Rep48位置   KP43H2活性
  赖氨酸(天然)   100
  丙氨酸   112
  甘氨酸   111
  苏氨酸   109
  精氨酸   109
  谷氨酸   111
  天冬酰胺   108
  谷氨酰胺   110
除了在转化体中酶分泌得到提高，由上述突变得到的碱性蛋白酶仍然保留了亲代碱性蛋白酶的性质，例如氧化剂抗性和通过高浓度脂肪酸(由聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为43,000±2,000)抑制酪蛋白降解活性抗性，以及在碱性条件下的活性。
实施例2 Rep262位置的突变效应
与实施例1相似的方法，基于来源于芽孢杆菌菌株KSM-KP43的突变碱性蛋白酶的生产效率，测定Rep262位置的突变效应。
具体说，通过使用0.1～0.5ng的pHA64-KP43H2作为模板，用引物对进行聚合酶链反应，引入突变(例如，序列识别号5和序列识别号11，或序列识别号7和序列识别号12)，用实施例1相似的方法得到两个扩增的片段。两个片段在作为单个片段用引物(例如，序列识别号5和序列识别号7)扩增，每个引物位于单个片段的尾端。获得的DNA片段用电泳法鉴定，用Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化。再通过使用DNA拼接试剂盒第2版(Takara Bio Inc.)，将DNA片段拼接到Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化得到的片段上。该片段是通过用pHA64-KP43H2作为模板，按照上述方法用序列识别号6和序列识别号8的引物扩增后用Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化所得到的，其中包括四环素抗性基因和KP43H2基因。接着，进行转化。
通过观察从培养在包含脱脂牛奶的碱性琼脂介质的转化体中产生的脱脂牛奶裂解标志的形成(实施例1)，来测定细胞中蛋白酶基因的出现或消失。质粒具有插入pHA64的蛋白酶基因，选择含有该质粒的转化体，以实施例1相似的方法，再将其用于进一步培养。
结果发现：相比于对照物(在相同条件下培养的pHA64-KP43H2转化体)，用具有突变Rep基因的质粒产生的碱性蛋白酶KP43H2的活性增加了3～13％的量(见表2)。另外，在培养物上清液中蛋白质的量几乎与蛋白酶活性同比例增加，可以说明所得到的突变体含有提高蛋白质的分泌所需的突变。另外，从选择的转化体中提取质粒，通过测序来测定其核苷酸序列。结果证实，生成的质粒与所想要突变体相符。
表2：
  Rep262位置   KP43H2活性
  天冬氨酸(天然)   100
  甘氨酸   103
  丝氨酸   109
  苏氨酸   107
  半胱氨酸   113
  缬氨酸   109
实施例3 Rep上随机突变的效应
基于具有提高的分泌特性或特定活性的突变蛋白酶的生产效率，该突变蛋白酶来源于JP-A-2002-218989、JP-A-2002-306176或JP-A-2004-122或JP-A-2004-305176所述的芽孢杆菌菌株KSM-KP43的碱性蛋白酶(碱性蛋白酶具有序列识别号3或序列识别号4的核苷酸序列，其中在位置15的丝氨酸被组氨酸取代，位置16的丝氨酸被谷氨酰胺取代，位置46的苯丙氨酸被亮氨酸取代，位置65的苏氨酸被脯氨酸，位置166的天冬酰胺被甘氨酸取代，位置167的甘氨酸被缬氨酸取代，位置187的天冬酰胺被丝氨酸取代，位置195的酪氨酸被谷氨酰胺取代，位置273的缬氨酸被异亮氨酸取代，位置346的赖氨酸被精氨酸取代，位置359的苏氨酸被丝氨酸取代，位置369的天冬氨酸被天冬酰胺取代，位置387的丝氨酸被丙氨酸取代，位置405的天冬酰胺被天冬氨酸取代。以下称为“KP43H3”)，测定Rep48位置的突变效应。
使用pHA64-KP43H3作为模板，其中的KP43H3被引入pHA64的BamH Ⅰ和Xba Ⅰ位置，通过在Takara热循环仪480型中由聚合酶链反应在Rep引入随机突变。具体说，向0.1～0.5ng的作为模板的环型质粒中，加入20pmol的每个引入突变的引物对(例如，序列识别号5和序列识别号7)、20nmol的每个dNTPs、5μLTakara Pyrobest DNA聚合酶的缓冲液和2U Pyrobest DNA聚合酶，来制备反应溶液(50μL)。作为聚合酶链反应条件，94℃下变性1分钟后，以94℃下1分钟、55℃下1分钟、72℃下4分钟的周期，重复30次(即，30个周期)。作为最后的反应，混合物在72℃下孵育10分钟。
所得到的聚合酶链反应产物用高纯聚合酶链反应产物纯化试剂盒(Roche)纯化，用100μL无菌水洗，再用电泳法鉴定扩增的DNA片段。用Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化后，通过使用DNA拼接试剂盒第2版(Takara Bio Inc.)，将DNA片段拼接到片段Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化得到的片段上。该片段是通过用pHA64-KP43H2作为模板，按照上述方法用序列识别号6和序列识别号8的引物扩增后用Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ消化所得到的，其中包括四环素抗性基因和KP43H2基因。
用与实施例1相似的方法进行转化。通过观察从培养在包含脱脂牛奶的碱性琼脂介质的转化体中产生的脱脂牛奶裂解标志的形成，来测定细胞中蛋白酶基因的出现或消失。质粒具有插入pHA64的蛋白酶基因，选择含有该质粒的转化体，再将其用于进一步培养。
结果发现，相比于参照物(在相同条件下培养的pHA64-KP43H3转化体)，用具有突变Rep基因的质粒产生的碱性蛋白酶KP43H3中，Lys149Asn和Lys198Glu的活性增加了7％的量(见表3)。另外，在培养物上清液中蛋白质的量几乎与蛋白酶活性同比例增加，可以说明所得到的突变体含有提高蛋白质的分泌所需的突变。另外，从选择的转化体中提取质粒和用测序测定其核苷酸序列。结果证实，生成的质粒与所想要突变体相符。
表3：
  Rep突变位置   KP43H3活性
  天然   100
  Lys149Asn   107
  Lys198Glu   107
Figure IPA00001229198600011
Figure IPA00001229198600021
Figure IPA00001229198600031
Figure IPA00001229198600051
Figure IPA00001229198600061
Figure IPA00001229198600071
Figure IPA00001229198600081
Figure IPA00001229198600091
Figure IPA00001229198600101
Figure IPA00001229198600111
Figure IPA00001229198600121
Figure IPA00001229198600141
Figure IPA00001229198600151
Figure IPA00001229198600161
Figure IPA00001229198600171
Figure IPA00001229198600181
Figure IPA00001229198600191
Figure IPA00001229198600201
Figure IPA00001229198600211
Figure IPA00001229198600221
Figure IPA00001229198600231
Figure IPA00001229198600241
Figure IPA00001229198600251
Figure IPA00001229198600261

Claims (11)

1.一种质粒载体，含有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，
所述复制蛋白包括选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸。
2.一种质粒载体，含有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，
所述复制蛋白包括与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸。
3.如权利要求1或2所述的质粒载体，其中，
所述质粒载体进一步包含基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列，其中，所述基因编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶。
4.如权利要求3所述的质粒载体，其中，
编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶的基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列是：
具有由用序列识别号13表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～659号碱基的核苷酸序列；具有由用序列识别号14表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～696号碱基的核苷酸序列；与前述任意一个核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；或前述核苷酸序列中部分被删除的核苷酸序列。
5.一种转化体，其含有权利要求3或4所述的质粒载体。
6.如权利要求5所述的转化体，其中，
所述质粒载体的宿主是微生物。
7.一种制备多肽的方法，其包括如下步骤：
构建质粒载体，所述质粒载体包含编码目标多肽的DNA和编码质粒复制蛋白的DNA，
其中，所述复制蛋白包括选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸；
用质粒载体转化宿主微生物；以及
培养宿主微生物，并收集由此生成的目标多肽。
8.一种制备多肽的方法，其包括如下步骤：
构建质粒载体，所述质粒载体包含编码目标多肽的DNA和编码质粒复制蛋白的DNA，
其中，所述复制蛋白包括与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，
(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，
(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
(c)位置：天冬酰胺，
(d)位置：谷氨酸；
用质粒载体转化宿主微生物；以及
培养宿主微生物，并收集由此生成的目标多肽。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，
所述质粒载体进一步包含基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列，其中，所述基因编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶。
10.如权利要求9所述的方法，其中，
编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶的基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列是：
具有由用序列识别号13表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～659号碱基的核苷酸序列；具有由用序列识别号14表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～696号碱基的核苷酸序列；与前述任意一个核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；或前述核苷酸序列中部分被删除的核苷酸序列。
11.一种多肽，其按照权利要求7或8所述的方法制备而成。
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