KR20190098392A

KR20190098392A - 라카아제를 대량으로 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20190098392A
Application number: KR1020180018289A
Authority: KR
Inventors: 조양래
Original assignee: 주식회사 프록스엔렘
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-08-22

Abstract

본 발명은 특정 유전자가 불활성화된 알터나리아 브라시시콜라 균주에 관한 것으로, 이를 이용하면 적은 비용으로 고순도의 라카아제를 제조할 수 있다. 따라서, 산업적으로 필요한 라카아제 등을 대량으로 생산할 수 있으므로, 산업 활용 가능성이 높다.

Description

라카아제를 대량으로 생산하는 방법{METHOD FOR THE MASS PRODUCTION OF LACCASE}

본 발명은 라카아제를 대량으로 생산하는 방법에 대한 것이다.

진균은 그 종류가 매우 많으며, 다양한 환경 조건 아래서 생존에 필요한 대사작용에 따라 다양한 효소를 분비할 수 있다. 진균이 분비하는 효소들 중에는 산업적 가치가 높은 효소들이 존재하며, 앞으로 진균을 더 연구할수록 새로운 효소를 발견할 수 있을 것으로 기대된다.

다만, 이러한 효소 또는 이를 생산하는 진균을 찾았다고 하더라도, 이를 산업적으로 활용할 수 있도록 대량생산을 하는 것은 쉽지 않다. 일반적으로 직면하는 문제는 진균이 대량 배양이 잘 안되거나, 배양을 하더라도 효소 단백질의 생산량이 매우 적은 경우 등이 있다. 예를 들어, 표고버섯은 산업적 가치가 높은 라카아제를 생산할 수 있으나, 이 버섯은 배양이 어렵고 여기서 생산되는 효소의 양이 매우 적어 산업적으로 생산하기는 어렵다

따라서, 이러한 효소 단백질을 대량으로 생산하기 위한 다양한 방법이 시도되고 있으며, 이중 하나가 진균의 유전자를 조작하는 방법이다. 예를 들어, 효소를 생산하는데 방해가 되는 유전자들은 제거하고 유용한 유전자들은 강화시켜서 생산하고자 하는 효소를 많이 생산할 수 있도록 여러 개의 유전자들을 조작한다.

실제로 진균 중 Aspergillus, Trichoderma, Penicillum, Rhizopus 속의 단백질을 효과적으로 많이 분비하는 스트레인들이 개발되어 산업적으로 사용되고 있다.

본 발명의 목적은 라카아제를 대량 생산할 수 있는 알터나리아　브라시시콜라(Alternaria brassicicola) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 알터나리아 브라시시콜라 균주를 배양하여 라카아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은, 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자들 중 적어도 하나가 불활성화되고, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 라카아제를 코딩하는 유전자가 도입된 알터나리아　브라시시콜라를 제공한다.

상기 알터나리아　브라시시콜라는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 키모트립신 유전자가 결실될 수 있다.

상기 알터나리아　브라시시콜라는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자가 불활성화될 수 있다.

상기 알터나리아　브라시시콜라는 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 6종의 펩티다아제를 코딩하는 각각의 유전자가 모두 불활성화될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 알터나리아 브라시시콜라를 배양하는 단계 및

상기 알터나리아 브라시시콜라로부터 분비된 라카아제를 회수하는 단계를 포함하는 라카아제의 생산방법을 제공할 수 있다.

상기 라카아제는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 알터나리아 브라시시콜라 균주를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 라카아제를 제조할 수 있다. 따라서, 산업적으로 필요한 라카아제 등을 대량으로 생산할 수 있으므로, 산업 활용 가능성이 높다.

이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자들 중 적어도 하나가 불활성화되고, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 라카아제를 코딩하는 유전자가 도입된 알터나리아　브라시시콜라 균주를 제공한다.

상기 알터나리아 브라시시콜라는 자낭균 속에 속하며, 식물 병원균으로 알려져 있다. 대부분의 알터나리아 속 균주는 경제적으로 중요한 작물의 수확량을 감소시키거나, 인간의 안구 및 호흡기 점막에 감염을 일으킬 수 있는 병원균이다. 본 발명은 일반적으로 병원성 생물체인 알터나리아 속 균주 중 알터나리아 브라시시콜라를 유전자 재조합시킴으로써, 목적 단백질인 라카아제를 많이 생산하는 방법을 개발하였다.

상기 알터나리아 브라시시콜라는 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제 중 적어도 하나를 분비하지 않을 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "펩티다아제"란, 단백질 분해 효소의 일종으로 펩티드 결합을 가수분해하는 효소인데, 펩티다아제가 분비됨으로써 함께 분비되는 효소의 펩티드 결합을 분해할 수 있다.

예를 들어, 죽은 식물체나 동물에서 유래한 영양분과 같은 복잡한 화합물이 다량 포함된 환경에서 알터나리아 브라시시콜라가 자라는 경우, 발현되는 단백질의 약 10%가 키모트립신일 수 있다. 그러나, 키모트립신과 동시에 여러 종의 펩티다아제가 분비되기 때문에, 생산되는 양에 비해 키모트립신을 수득하기가 어렵다. 따라서, 상기 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 6종의 펩티다아제 중 일부 또는 전부의 분비를 방지함으로써, 분비되는 라카아제의 분해를 방지하여 생산량을 증가시킬 수 있다.

이때 키모트립신을 코딩하는 유전자 서열을 라카아제를 코딩하는 서열로 대체시킴으로써, 목적 단백질인 라카아제를 대량으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 키모트립신 관련 유전자를 불활성화시키면서 해당 부위에 라카아제를 코딩하는 유전자를 도입시킬 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "키모트립신"이란, 단백질 분해를 일으키는 소화 효소이다. 키모트립신은 단백질 분해를 일으키는 소화 효소로 펩티드 결합을 끊는다. 키모트립신은 포유동물과 다른 생물체의 소화계에서 단백질 분해 효소로 작용한다. 키모트립신의 기질로는 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 메티오닌이 있으며 이들의 카복시 말단을 잘라낸다. 다른 단백질 분해효소와 같이 펩티드결합을 끊는 반응을 일으킨다.

본원에서 사용된 용어, "라카아제"는 p-디페놀(히드로퀴논)을 산소와 결합하여 p-퀴논으로 만드는 페놀산화효소의 일종이다. p-디페놀산화효소라고도 한다. 옻나무의 수액 속에서 옻을 산화시키고 경화하는 효소로서 발견되었으며, 1894년 G.E.베르트랑은 인도네시아산 옻나무에서 효소를 상세히 연구하여 라카아제라 명명하였다. 각종 미생물 ·균류에도 분포한다. 구리 단백질의 일종으로 청색을 띤다. 분자량 약 12만, 구리 4 분자를 함유하며 CN-로 전해된다. 옻의 액즙 속에서 이 효소에 의해 산화되어 흑색 색소가 되는 물질은 우루시올, 히드로우루시올 등이 있다.

라카아제는 바이오 연료전지에 이용되는 등 산업적으로 그 가치가 높아 생산 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있고, 본 발명자들은 알터나리아 브라시시콜라에서 라카아제를 대량으로 수득하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기 펩티다아제는 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열 중 어느 하나에 해당하는 것일 수 있고, 상기 서열의 다양하게 변형된 펩티드인 변이체일 수 있다. 상기 변형은 펩티다아제의 활성을 변형시키지 않는 내에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 변형, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 펩티드는 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열과 각각 독립적으로, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 16개의 아미노산, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단 16개의 아미노산, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단 16개의 아미노산, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단 18개의 아미노산, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열의 N-말단 18개의 아미노산은 신호 서열이 번역된 아미노산이다.

본원에서 사용된 용어 "신호 서열"은 융합 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(AB09756.1)를 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(AB0957.1)를 코딩하는 유전자가 불활성화될 수 있다.

서열번호 1 및 서열번호 2의 펩티다아제는 텐덤 반복으로 존재하기 때문에 한번에 아래와 같은 Disruption construct를 제조할 수 있다.

상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자를 제거하는데 사용한 프라이머는 다음과 같다:

또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 6종의 펩티다아제를 코딩하는 각각의 유전자가 모두 불활성화될 수 있다.

서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제 코딩 부분을 제거한 후, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(AB05880.1)의 기능을 제거하면 다음과 같다:

상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자를 제거하는데 사용한 프라이머는 다음과 같다:

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(AB07157.1)의 기능을 제거하면 다음과 같다:

상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자를 제거하는데 사용한 프라이머는 다음과 같다:

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(AB06142.1)의 기능을 제거하면 다음과 같다:

상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자를 제거하는데 사용한 프라이머는 다음과 같다:

서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(AB00937.1)의 기능을 제거하면 다음과 같다:

상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자를 제거하는데 사용한 프라이머는 다음과 같다:

아울러, 아래와 같은 컨스트럭트를 이용하여, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 키모트립신 유전자를 제거하고, 라카아제를 코딩하는 유전자를 도입할 수 있다:

키모트립신 코딩 서열에서 신호 서열만 남기고 그 하류의 코딩 서열을 라카아제의 코딩 서열로 변경하는데 사용한 프라이머는 다음과 같다:

상기 불활성화는 해당 펩티다아제를 코딩하는 유전자가 돌연변이됨으로써 발생할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "돌연변이", "변이"는 야생형과 비교하여, 유전자 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 변화를 가리킨다. 이러한 돌연변이는 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution), 점 돌연변이(point mutation), 다수의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 돌연변이, 전위(transposition), 역위(inversion), 프레임 쉬프트(frame shift), 표적 서열을 넌센스 돌연변이 또는 유전자의 야생형 서열과 차별화하는 다른 형태의 변형을 포함한다. 하지만, 상기 돌연변이는 상기 6종의 펩티다아제들 중 하나 이상의 유전자의 작용(예를 들면, 발현)을 억제 또는 감소시키는 한 특별한 제한이 없다.

전술한 본 발명에 따른 변이 알터나리아 브라시시콜라는 변이되지 않은 균주, 예컨대 야생형(wild-type) 알터나리아 브라시시콜라의 키모트립신 생성능과 비교하여 대체 효소인 라카아제의 개선된 생성능을 나타내는 것을 특징으로 한다. 상기 우수한 라카아제 생성능은 변이 알터나리아 브라시시콜라가 야생형에 비해 동일한 조건에서 증가된 라카아제 생산량을 나타낸다는 것을 의미한다. 이는 본 발명에서 확인된 펩티다아제의 불활성화가 균주에서 라카아제의 생산에 크게 기여한다는 것을 가리킨다. 예를 들어, 본 발명에 따른 알터나리아 브라시시콜라는 변이되지 않은 야생형과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상의 증가된 라카아제 생산량을 나타낸다.

또한, 본원이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6의 펩티다아제를 코딩하는 유전자가 불활성화된, 예컨대 돌연변이된 알터나리아 브라시시콜라만을 기술하고 있음에도 불구하고, 본 기술분야의 숙련자라면, 타겟 미생물이 게놈 내에 상기 유전자를 가지는 한, 본 발명의 방법이 알터나리아 브라시시콜라 이외의 다른 다양한 타겟 미생물에 적용될 수 있음을 인식할 것이다.

또한, 본 발명의 다른 측면은, 전술한 알터나리아 브라시시콜라 균주를 배양하는 단계 및 상기 알터나리아 브라시시콜라로부터 분비된 라카아제를 회수하는 단계를 포함하는 라카아제의 생산방법을 제공할 수 있다.

또한, 상기 라카아제는 서열번호 7의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열의 다양하게 변형된 펩티드인 변이체일 수 있다. 상기 변형은 펩티다아제의 활성을 변형시키지 않는 내에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 변형, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다. 한편, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열의 N-말단 26개의 아미노산은 신호 서열이다.

또한, 상기 라카아제는 아래와 같은 염기서열의 폴리뉴클레오타이드로 코딩될 수 있다. 아래 붉은색으로 표기한 핵산은 신호 서열이다.

이와 같이, 본 발명의 일 구체예는 본 발명은 특정 유전자가 불활성화된 알터나리아 브라시시콜라 균주를 이용하여 라카아제를 생산함으로써, 적은 비용으로 고순도의 라카아제를 대량으로 제공할 수 있다.

<110> ProxEnrem <120> METHOD FOR THE MASS PRODUCTION OF LACCASE <130> FPD/201802-0017/C <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidase <400> 1 Met Lys Leu Ser Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ala Pro Val Ile Val Pro Arg Ala Gly Thr Pro Ile Pro Gly Arg 20 25 30 Tyr Ile Val Lys Met Lys Asn Glu Asn Leu Gln Asn Leu Ile Asp Thr 35 40 45 Ala Leu Lys Ile Leu Arg Lys Asp Pro Ala His Val Tyr Lys Phe Gly 50 55 60 Gly Phe Gly Gly Phe Ser Ala Asp Met Ala Asp Asp Ile Val Asp Leu 65 70 75 80 Leu Arg Asn Leu Pro Gly Val Asp Tyr Ile Glu Gln Asp Ala Ile Val 85 90 95 Arg Ala Asn Leu Gly Glu Ser His Leu Glu Lys Lys Ala Tyr Val Thr 100 105 110 Gln Ser Ser Ser Thr Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Gln Asn Arg 115 120 125 Gly Ser Ala Ser Tyr Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Ala Gly Thr Cys 130 135 140 Ala Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Ser Thr Ser His Pro Glu Phe Glu 145 150 155 160 Gly Arg Ala Thr Phe Leu Ala Asn Phe Ala Arg Asp 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Phe Pro Lys Leu Lys Trp 85 90 95 Asp Asn Ile Lys Lys Asn Leu Glu Tyr Tyr Ser Thr Phe His Thr Arg 100 105 110 Phe Ser Glu Thr Glu Ser Gly Ala Glu Ala Ala Gln Trp Leu Leu Gly 115 120 125 Gln Val Gln Asp Val Val Leu Lys Ser Gly Lys Glu Gly Val Thr Ala 130 135 140 Glu Ala Phe Pro His Ala Arg Trp Pro Gln Asn Ser Val Val Ala Arg 145 150 155 160 Val Gln Gly Arg Ser Asn Arg Thr Val Val Val Gly Ala His Leu Asp 165 170 175 Ser Ile Asn Gly Ala Asp Arg Met Asn Gly Arg Ala Pro Gly Val Asp 180 185 190 Asp Asp Gly Ser Gly Ser Phe Met Ile Leu Glu Ala Leu Arg Val Leu 195 200 205 Leu Ser Asp Lys Asp Phe Gly Pro Asn Lys Leu Gln Asn Ser Ile Glu 210 215 220 Phe His Trp Tyr Ala Ala Glu Glu Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Asp 225 230 235 240 Ile Phe Thr Gln Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Asp Ile Trp Ala Met Leu 245 250 255 Gln Gln Asp Met Val Gly Tyr Thr Lys Ala Thr Leu Asp Ala Gly Lys 260 265 270 Pro Glu Ser Phe Gly Leu Ile Thr Asp Phe Thr Asp Pro Ala Leu Asn 275 280 285 Glu Tyr Ile Thr Arg Val Ile Lys Glu Tyr Thr Asp Ile Thr Tyr Val 290 295 300 Asn Ser Thr Cys Gly Tyr Ala Cys Ser Asp His Gly Ser Ala Met Arg 305 310 315 320 Ser Gly Tyr Pro Ala Ser Phe Val Phe Glu Ala Ala Phe Glu Tyr Arg 325 330 335 Asn Pro His Ile His Thr Ala Asn Asp Thr Met Glu His Met Asp Pro 340 345 350 Asp His Val Ile Gln His Gly Gln Leu Val Leu Gly Tyr Ile Tyr Glu 355 360 365 Leu Gly Phe Ser Lys His Asp Leu 370 375 <210> 6 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidase <400> 6 Met Lys Val Ser Ser Ala Ile Val Leu Ala Gly Ala Ala Gln Ala Phe 1 5 10 15 Ala Ala Val Arg Pro Arg Pro Met Val Ser Ser Gly Pro Ile Gln Ala 20 25 30 Glu Ile Lys Thr Glu Lys Leu Met Ser Asn Leu Lys Ala Phe Asp Ser 35 40 45 Ile Ala Lys Ala Asn Gly Gly Asn Arg Ala Phe Gly Leu Pro Gly Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Val Asp Tyr Met Leu Ala Lys Thr Gln Asn Thr His Phe 65 70 75 80 Lys Thr Trp Thr Gln Asp Phe Pro Ala Leu Phe Asn Arg Val Asp Ser 85 90 95 Ile Glu Phe Ser Val Ser Asn Ser Ser Tyr Arg Val Val Gly Leu Ser 100 105 110 Tyr Ser Pro Ser Thr Thr Pro Glu Gly Leu Thr Leu Pro Leu Val Leu 115 120 125 Gly Pro Ser Gly Ala Glu Gly Cys Thr Asn Glu Ala Tyr Asp Ser Leu 130 135 140 Asp Val Glu Gly Lys Ile Val Leu Val Gln Arg Gly Ala Cys Pro Asp 145 150 155 160 Gly Thr Thr Leu Ala Gly Arg Met Lys Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ser Ala Val Ile Ile Tyr Ala Ser Asp Thr Ala Asn Val Thr Gly Gly 180 185 190 Thr Leu Ser Asn Pro Asn Pro Glu Tyr Ile Pro Thr Gly Tyr Ile Asn 195 200 205 Leu Ala Asp Ala Glu Pro Leu Val Ala Arg Leu Lys Ala Gly Glu Thr 210 215 220 Ile Glu Ala Tyr Phe Gln Gln Thr Gln Ile Val Glu Thr Arg Ile Thr 225 230 235 240 Gln Asn Val Phe Ala Glu Thr Lys Asp Gly Asp Pro Thr Asn Val Ile 245 250 255 Met Leu Gly Ala His Leu Asp Ser Val Gln Ala Gly Ala Gly Ile Asn 260 265 270 Asp Asp Gly Ser Gly Ser Thr Leu Ile Leu Glu Ile Ala Lys Ala Leu 275 280 285 Arg Arg Phe Gly Val Lys Asn Lys Val Arg Phe Ala Trp Trp Gly Ala 290 295 300 Glu Glu Asn Gly Leu Leu Gly Ser Lys Tyr Tyr Thr Gln Asn Leu Asn 305 310 315 320 Ala Thr Glu Ala Asn Asn Ile Leu Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Met Val 325 330 335 Ser Arg Gly Tyr Phe Gly Val Phe Asp Gly Asp Gly Ser Thr Phe Asn 340 345 350 Leu Thr Gly Ala Pro Gly Ser Gly Ala Ile Glu Lys Leu Phe Val Glu 355 360 365 His Phe Glu Lys Glu Gly Val Asn Val Thr Ala Ala Arg Phe Thr Gly 370 375 380 Gly Ser Asp Tyr Gln Ser Phe Met Asn Ile Gly Lys Pro Val Gly Gly 385 390 395 400 Leu His Thr Gly Thr Gly Val Glu Gln Asp Pro Cys Tyr His Gln Ala 405 410 415 Cys Asp Asn Ile Asp Asn Pro Asn Pro Glu Thr Leu Leu Ile Asn Ala 420 425 430 Lys Ala Ala Ala His Val Leu Ser Ile Leu Ala Thr Arg Gly Glu Glu 435 440 445 Ile Ile Pro Lys Ser Pro Val Asn Ala Ser Met Ile Thr Glu Arg Gly 450 455 460 Ile Ile Gly Val Glu Pro Arg Trp Thr Leu Pro Ala Glu Gly Glu Met 465 470 475 480 His Leu Ser Thr Cys Gly His Glu Ile 485 <210> 7 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laccase <400> 7 Met Ala Val Ser Val Ser Arg Val Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Phe Val Ala Phe Gly Arg Val Glu Ala Ala Ile Gly Pro Arg Ala Thr 20 25 30 Leu Thr Ile Ala Asn Lys Val Ile Ala Pro Asp Gly Phe Pro Arg Ser 35 40 45 Ala Val Leu Ala Gly Gly Thr Phe Pro Gly Pro Leu Ile Arg Gly Lys 50 55 60 Thr Gly Asp Arg Leu Lys Ile Asn Val Val Asn Ala Leu Ala Asp Lys 65 70 75 80 Thr Met Ala Val Asp Thr Thr Ile His Trp His Gly Leu Phe Gln Lys 85 90 95 Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Val Ala Met Val Thr Gln Cys Pro Ile 100 105 110 Ile Pro Gly His Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Arg Val Pro Asp Gln Ala 115 120 125 Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu Gly Thr Gln Tyr Cys Asp Gly 130 135 140 Leu Arg Gly Pro Leu Val Ile Tyr Ser Lys Asn Asp Pro His Lys His 145 150 155 160 Leu Tyr Asp Val Asp Asp Glu Ser Thr Val Leu Thr Ile Gly Asp Trp 165 170 175 Tyr His Leu Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Val Pro His Pro Asp Ala 180 185 190 Thr Leu Phe Asn Gly Leu Gly Arg Ser Leu Asn Gly Pro Lys Ser Pro 195 200 205 Leu Tyr Val Met Asn Val Val Arg Gly Lys Arg Tyr Arg Ile Arg Leu 210 215 220 Ile Asn Ile Gly Cys Asp Ser Asn Tyr Gln Phe Ser Ile Asp Gly His 225 230 235 240 Ser Phe Thr Val Ile Glu Ala Asp Gly Glu Asp Thr Arg Pro Leu Glu 245 250 255 Val Asp Arg Val Gln Ile Phe Ser Gly Gln Arg Tyr Ser Leu Ile Leu 260 265 270 Lys Ala Asn Arg Pro Ile Gly Asn Tyr Trp Ile Arg Gly Asn Pro Asn 275 280 285 Ser Gly Asp Pro Gly Tyr Glu Asn Gln Met Asn Ser Ala Ile Leu Arg 290 295 300 Tyr Arg Gly Ala Pro Trp Ile Asp Pro Thr Thr His Glu Arg Asn Ala 305 310 315 320 Thr Lys Pro Leu Ile Glu Ser Glu Leu Arg Pro Leu Arg His Glu Arg 325 330 335 Ala Pro Gly Arg Pro Tyr Pro Gly Gly Ala Asp Val Asn Ile Asn Leu 340 345 350 Asn Phe Gly Phe Asp Pro Lys Thr Ala Leu Phe Thr Thr Asn Asn Gln 355 360 365 Thr Phe Val Pro Pro Ser Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly 370 375 380 Ala His Asp Val His Glu Leu Ala Pro Ser Gly Thr Ile Tyr Asp Ile 385 390 395 400 Lys His Gly Gln Val Val Glu Leu Thr Met Pro Ala Leu Ala Phe Ala 405 410 415 Gly Pro His Pro Met His Leu His Gly His Ala Phe Ser Val Val Arg 420 425 430 Ser Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Leu Arg Arg Asp 435 440 445 Val Val Asn Ile Gly Thr Asp Pro Thr Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe 450 455 460 Val Ala Asp Asn Ser Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Trp 465 470 475 480 His Leu Asp Leu Gly Phe Ala Val Val Phe Ala Glu Ala Thr Ala Gln 485 490 495 Thr Lys Lys Asp Asn Pro Val Pro Lys Ala Trp Lys Asp Leu Cys Pro 500 505 510 Leu Tyr Asn Ser Ser Ser Pro Ala Lys Leu Leu Met Gly Thr Asn Ala 515 520 525 Leu His Arg Leu Pro Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 530 535 540 <210> 8 <211> 3397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chymotripsyn <400> 8 cgggtaaggc cgctcctgtg gacggcgttt actgaggcag aatacaggaa tggccagtcc 60 agcctcccaa gatcttcact cggtgtgtag cgccatcatg gcagagacga tgcacagcta 120 ccgctatagg cggaacttgg tgcccacagg acactaaaga gcgagatcga cggtggcttg 180 gagattcgcc aaacgaatga aacgcccgaa tatggcgcaa tgagagatga gccaatcacg 240 accggccgtc gccaagctcc tctcaactag acgtttttcc gatattacaa gtgatagacg 300 tcttggctct tggcaacgga agacatgttc aatggggaag gtatggtaga aaagtgtcca 360 gggccttcac catctgctgt tcgcccatgc ggggtcgcgg tccaaggctg gcacatggtc 420 cgagcgactt tctcgttcag tactaatgga gctcttccat atctctacct ccttcctctt 480 aggctactgg catggcgtag tgtaggggca catgcagtct gcctgttttg ctgtcgacag 540 atgctgcttc gatacgaagt aaacaccccc gggcgaatgt cttatcaggt gccttttggg 600 gattaacacc atggacgcat gtcttgtgag gcgcccttcg cggagcatga ttccgaggct 660 gctggcacac ccaacagaca cctggcggcc gatggggcag gagatgcttt ggtatcggct 720 gatgcaattt caaactcttg tgaaatgcct attacggact acccttctca taccgccgca 780 tcgcgtaaca acaccttgcg gcggatgagg aaggagactt ttcgtagcgc cggatcaaac 840 ttgggactcc atctttggat gatcgtgtcc agggcgtgct caaagtcaca acgcccaagc 900 tggagctggt ataagtatag gcctgtgttc ccgtcccaag tccaatcagt acaaaaaagt 960 tggcgcacac tcatcttcca agcatctcgc ctcttgcaac gtctacgcct cgtctcttca 1020 gtcttgttcc caaccccatc gccatggagc tcaccggatt cctcgctgcc ctggcagtct 1080 tcctgcctat cgtctacggc gcccctacca cagccgccaa cagcctgcac cccgagatcc 1140 tcgctgccat gaagcgcgat ttgggactcg acgctgagca ggctcatgtt cgtgttgccc 1200 gcgagctcaa ggccaccgag gtcatcgagc agctacgtac caaggccggc agctccttcg 1260 gtggcgcctg gctcgtcgat ggcgagctca aggtcgccgt caccgacgac gccttgacat 1320 ctgatgtcac cactgctggc gccaccgctt tggttgtttc cactcctctc tccaagctgc 1380 aggaagccca gaaggcactt gacaacctcg actttgactc gacccttggc aagcgctccg 1440 acgaggctgc cagcggaatt gcgacctact atgtcgatgt cgctgccaac aagctcgtac 1500 tagaggccct cgctggcagc actgctcagg ctgaggagct ggccaagaag gtcggtctta 1560 ccgagtccga gttcgaggtc aagaccgttg ctgctctgcc gaccaccttt gccacggtcc 1620 gcggtggcga cgcctacctc atcaaccgat ctggacgatg ctccgttggc ttctccgtca 1680 ccggcggttt cgtcactgct ggccactgcg gtgttgccgg caacactgcc tctaccaccg 1740 ccggtgagac tgttggaacc ttctcgggct cagtcttccc aggcaacggc gactacgcct 1800 acgtccgcgg taccactgga aacacctaca gtggcagaat caacaactac aacggcggta 1860 cacttcccgt gtcaggcagc accgctgccg ctatcggagc cagcgtctgc cgctccggct 1920 ccaccactgg tgtcttctgc ggcaccgtcc gcgcctatgg agcgaccgtc tcctacaggg 1980 agggacgtgt tactggtctc acccagacca ctgtctgcgc cgagcccggc gactctggcg 2040 gttcttgtaa gcaatacacc ccctatcaac tgcatgtgat acacatactg actttgttta 2100 ctctcattct agtctactct ggtgcccaag cccagggtgt cacttctgga ggctctggcg 2160 actgccaggt tggtggagta accttcttcc agcctgtcaa cgagatcctg tccgcttacg 2220 gactcacttt gactcgtggt taagtttctc ctttttcgca ctctttggtg cagattccaa 2280 gcgggacatg actagtggga ttcacaagtt tgtatatatt cgaattcatt tgcaagccca 2340 ctttgtaccg cacttgaagg ttctgtgatg ttgtgatgct tgcctgcaag tatacttgaa 2400 aggaggaatg tgagcttcca cgcgcccctt gcaaggtgag aattgtctgt tcgtaaacta 2460 gcagaccatc gttttcggga gatgtgggtt tctgtggata tctgttcggt gcatctgagg 2520 agggtgatat tggaacgtgc gtgagcgtca cgtgttttgc acggccccaa ggtcgctcgc 2580 agtcagggca aaagagtgcg ggaaacctac ggttagcaat ccacctcaag gcagtttgtt 2640 tgtttgtttt ttgaaaccca tgcatccaaa catggcggcc cggcatagca agtctagcag 2700 gacccgagta atccgcccac ctacgctata ccagatacag ccagcatagc caccttcttc 2760 gcaccactca ttgatcaaaa gcgcatactc gggggagcag acagcattgt gctgtctcac 2820 cattactggc tgtttccgtc gtagctctag agagatgaat cgataggacg gcagtgtcac 2880 aaggcgctat gcacgcgcga cttggatgct gcagcgacct catggaacta tcgttgccta 2940 ggggatgacg cgatggcttt atacttcaca gccggacttg tgagctggca aatccagctc 3000 ttcctcgttg tacagcagct ttcccctctt cccaacaaca ggactgctca taccgacctc 3060 tgtccacgaa tctccaaagt ctgttcagta ggtagaatgg ccatggctca ggaacgccct 3120 cttcgcatcc tcactctctt tactagcgcg cttgcaactc cccttctcat tgccacgacc 3180 attgtatccc tcgaatccca ctattggtac aggcatcgcc atgtgacgac gttctgcttt 3240 ggctatattc cactggccat gaccgccgtt gcgtcagccg tgagcatcct tcatcaacga 3300 cggggtggta gtgcaccagg acccaggttc actcttgtgg atggattggc gggtatcgcg 3360 tatctggcga tactcattcc gatctgggca gtcgaga 3397

Claims

서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제(peptidase)를 코딩하는 유전자들 중 적어도 하나가 불활성화되고,
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 라카아제(laccase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 알터나리아　브라시시콜라(Alternaria brassicicola).
제1항에 있어서,
서열번호 8의 염기서열을 포함하는 키모트립신 유전자가 결실된, 알터나리아　브라시시콜라.
제1항에 있어서,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티다아제를 코딩하는 유전자가 불활성화된, 알터나리아　브라시시콜라.
제1항에 있어서,
서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 6종의 펩티다아제를 코딩하는 각각의 유전자가 모두 불활성화된, 알터나리아　브라시시콜라.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 알터나리아 브라시시콜라를 배양하는 단계; 및
상기 알터나리아 브라시시콜라로부터 분비된 라카아제(laccase)을 회수하는 단계를 포함하는, 라카아제의 생산방법.
제5항에 있어서,
상기 라카아제는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 라카아제의 생산방법.