KR20240036720A - 노화-관련된 인지 장애 치료제로서의 혈장 분획 - Google Patents
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Abstract
노화-관련된 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 기재되어 있다. 본 방법에 사용되는 조성물은 신경인지 장애와 같은 노화-관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 효능이 있는 혈장으로부터 유래된 분획을 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
35 U.S.C. § 119(e) 항에서, 본 출원은 2016년 10월 24일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/412,258호의 출원일에 우선권을 주장하며; 상기 출원의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 노화-관련된 질환의 예방 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 노화-관련된 질환, 예컨대 신경인지 및 신경퇴행성 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 혈액 제제, 예컨대 혈장 분획의 용도에 관한 것이다.
하기는 단지 배경 정보로서 제공되며, 본 발명에 대한 선행기술로 인정되지는 않는다.
노화는 인지 장애, 암, 관절염, 시력 손실, 골다공증, 당뇨병, 심혈관 질환 및 뇌졸중을 포함하는 여러 가지 인체 질환의 중요한 위험 인자이다. 자연 노화 중에 정상적인 시냅스 손실에 더해, 시냅스 손실은 많은 신경퇴행성 질환에 공통적인 초기 병리적 사건이며, 이들 조건과 관련된 신경 및 인지 장애에 가장 관련이 있다. 이와 같이, 노화는 알츠하이머병(AD)과 같은 치매-관련된 신경퇴행성 질환의 가장 우세한 위험 인자로 남아 있다((Bishop, N.A. 등, Neural mechanisms of ageing and cognitive decline. Nature 464(7288), 529-535 (2010); Heeden, T. 등, Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 5(2), 87-96 (2004); Mattson, M.P., 등, Ageing and neuronal vulnerability. Nat. Rev. Neurosci. 7(4), 278-294 (2006)). 노화는 중추신경계를 비롯한 신체의 모든 조직과 기능에 영향을 미치며, 인지와 같은 기능 저하는 삶의 질에 심각한 영향을 줄 수 있다. 인지력 감퇴 및 신경퇴행성 장애 치료는 손상을 예방하고 후퇴시키는데 제한된 성공을 거두었다. 따라서 노화의 영향을 막거나 대항하거나 또는 역전시킴으로써 인지 완전성을 유지하기 위한 신규한 치료법을 찾아내는 것이 중요하다.
본 발명은 연령 관련 장애, 예컨대 인지 장애 질환, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 혈액 제제의 제조 및 사용에 기반을 둔다. 본 발명은 다른 것들 중에서, 인지 장애, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 치료법의 필요성을 인식한다. 본 발명의 조성물은 혈액 및 혈장으로부터 유래된 것이며, 인지 장애, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방에 효능을 나타내는 혈장 분획의 이용을 통한 현재의 치료법의 실패 및 단점에 대한 해결책에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 인지 장애 및 연령-관련된 치매 자체에 대한 치료제 또는 예방적 제제로서 효능을 나타내고, 또는 추가 제제에 의한 억제에 대하여 표적화할 수 있는 혈장 분획에서 확인된 단백질, 표적에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상이한 혈장 분획들(예를 들어, 분획, 유출물, "혈장 분획", 혈장 단백질 분획, 인간 알부민 용액) 사이의 단백질 함량 차이가 특정 인지 장애의 예방 및/또는 개선 및 신경퇴행성 질환의 경감에 기여할 수 있음을 인식한다. 예로써, 및 비제한적으로, 본 발명의 구현예는 단순한 높은 알부민 농도의 인간 알부민 용액(HAS) 제제가 낮은 알부민 농도를 갖는 혈장 단백질 분획(PPF) 제제와 관련된 향상된 인지의 추진력이 아님을 입증한다.
젊은 공여체로부터의 혈액과 혈장은 분자, 구조적, 기능적, 인지 수준을 포함하여, 뇌 노화의 기존 효과의 향상 및 역전을 나타냈다. (Saul A. Villeda, 등 Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine 20 659-663 (2014)). 본 발명은 혈장의 분획 및 유출물에 관한 것이며, 이들 중 일부는 환자의 쇼크를 치료하기 위해 종래에 사용되어 왔으며, 노화-관련된 인지 장애의 치료 방법으로 효과적이라는 발견에 관한 것이다.
본 발명의 양태에 따라, 혈장의 혈액 제제 분획을 사용하는 노화-관련된 인지 장애, 연령-관련된 치매 및/또는 신경퇴행성 질환의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법의 양태는 노화-관련된 인지 장애 또는 신경퇴행성 질환으로 고통받고 있거나 발병할 위험이 있는 개체에게 혈장 분획을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법의 추가 양태는 노화-관련된 인지 장애로 고통받고 있거나 발병 위험이 있는 개체에게 특정 연령 범위의 공여체 풀로부터 유래된 혈장 분획을 투여하는 것을 포함한다. 또한 본 방법을 실시하는데 사용되는 시약, 장치 및 키트도 제공된다.
일 구현예에서, 혈장 분획은 혈액 분별화 공정, 예컨대 하기 기재된 Cohn 분별화공정으로부터 수득된 몇 개의 혈장 분획 중 하나일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 정상 인간 알부민, 알파 및 베타 글로불린, 감마 글로불린 및 다른 단백질로 구성된 용액인, 개별적으로 또는 복합체 형태의 "혈장 분획"으로 언급되는 유형일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 "혈장 단백질 분획"(PPF)으로서 당해 분야의 숙련가에게 공지된 일종의 혈장 분획일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 "인간 알부민 용액"(HAS) 분획일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 혈전증 위험이 감소된 분획의 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거되는 혈장 분획일 수 있다. 본 발명의 구현예는 또한 예를 들어 젊은 공여체 또는 젊은 공여체의 풀로부터 유래된 분획을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예는 혈장 분획으로 치료된 대상체에서의 인지 향상의 모니터링을 포함할 수 있다.
참조에 의한 편입
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 편입된다.
첨부된 도면은 본 발명의 구현예를 도시하고, 설명과 함께 본 발명을 설명하는 역할을 한다. 이들 도면은 제한이 아닌 예시의 방식으로 제공된다: 도면의 다양한 특징들이 스케일되지 않을 수도 있음을 강조한다.
도 1. 도 1은 노지 챔버에 15분 동안 두었던 대조군, PPF1 또는 HAS1-처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스에 의해 사육된 시간을 도시한다.
도 2. 도 2는 노지 챔버에 15분 동안 두었던 대조군, PPF1 또는 HAS1-처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 속도를 도시한다.
도 3. 도 3은 노지 챔버에 15분 동안 두었던 대조군, PPF1 또는 HAS1-처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 거리를 도시한다.
도 4. 도 4는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 큐잉된 Y-미로 시험에서 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스에 의해 신규한 아암에 소비된 시간을 도시한다.
도 5. 도 5는 큐잉된 Y-미로 시험의 신규한 아암 대 친숙한 아암(신규한: 친숙한 아암의 비율)에서, 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 큐잉된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스에 의해 소비된 시간의 비율을 도시한다.
도 6. 도 6은 큐잉된 Y-미로 시험에서 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 속도를 도시한다.
도 7. 도 7은 큐잉된 Y-미로 시험에서 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 거리를 도시한다.
도 8a. 도 8a는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 메모리에 대한 상황적 공포 조건화 시험에서 동결 시간의 퍼센트를 도시한다.
도 8b. 도 8b는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 메모리에 대한 청각적 공포 조건화 시험에서 동결 시간의 퍼센트를 도시한다.
도 9. 도 9는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스의 메모리에 대한 큐잉된 공포 조건화 시험의 마지막 90초 동안 동결 시간의 퍼센트를 정량화한다.
도 10a. 도 10a는 공간적 메모리를 테스트하는 Barnes 미로 지연 시간을 차트로 보여준다. 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에서 상기 목표 구멍에 도달하는 지연 시간이 보고되었다.
도 10b. 도 10b는 도 10a에 도시된 마지막 3가지 시도의 평균을 정량화한다.
도 11a. 도 11a는 최대 6개월동안 매주 2회 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스의 덴테이트 뇌이랑에서 신생 뉴런에 대한 마커인, 더블코르틴(Doublecortin, Dcx)을 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 11b. 도 11b는 최대 6개월동안 매주 2회 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스의 덴테이트 뇌이랑에서 증식하는 세포에 대한 마커인, Ki67을 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 12. 도 12는 5주 동안 주당 3회 대조군, PPF1, 1X 농축된 HAS1 또는 5X 농축된 HAS1로 처리된 13개월령 NSG 마우스에서 Dcx를 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 13. 도 13은 5주 동안 주당 3회 대조군, PPF1, 1X 농축된 HAS1 또는 5X 농축된 HAS1로 처리된 13개월령 NSG 마우스에서 Ki67을 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 14a. 도 14a는 생후 6개월부터 시작되어 염수(대조군) 또는 PPF1을 정맥내 꼬리 정맥 주사로 매주 2회 처리된 NODscid 마우스의 노지 챔버에서의 사육 횟수를 도시한다. 일단 마우스가 노지 챔버에 놓여지면 15분 동안 양육이 측정되었다.
도 14b. 도 14b는 생후 6개월부터 시작되어 염수(대조군) 또는 PPF1을 정맥내 꼬리 정맥 주사로 매주 2회 처리된 마우스의 노지 챔버에서의 운동 속도를 도시한다. 일단 마우스가 노지 챔버에 놓여지면 15분 동안 속도가 측정되었다.
도 14c. 도 14c는 생후 6개월부터 시작되어 염수(대조군) 또는 PPF1을 정맥내 꼬리 정맥 주사로 매주 2회 처리된 마우스의 노지 챔버에서의 운동 거리를 도시한다. 일단 마우스가 노지 챔버에 놓여지면 15분 동안 속도가 측정되었다.
도 15. 도 15는 Barnes 미로 지연 시간 및 해마-의존적 공간 학습 및 메모리를 도시한다. 150 μL 염수 대조군, 신생(young) 혈장, 유출물 I 또는 유출물 II/III로 처리된, 늙은 NSG 마우스(12개월령)의 상기 목표 구멍에 도달하는 지연 시간이 보고된다.
도 16. 도 16은 수컷 늙은 NSG 마우스(12개월령)의 해마-의존적 공간 학습 및 메모리에 대한 신생 인간 혈장, PPF1 및 염수 조절의 효과를 보고한다. 마우스는 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1, 또는 염수 150 μL로 4주 동안주당 3회(iv) 및 그 다음 5주 및 6주동안(시험이 수행된 주) 매주 2회 처리되었다. 각각의 처리 그룹에 대한 Barnes 미로(Maze) 보류 상태에 도달하는 지연 시간이 보고된다.
도 17. 도 17은 매일 시험동안 마지막 3회의 시도동안 Barnes 미로 목표 구멍을 찾기 위한 평균 대기 시간에 신생 인간 혈장, PPF1 및 염수 대조군이 미치는 효과를 보고한다. 늙은 NSG 마우스(12개월령)를 4주간(시험이 수행된 주) 주당 3회 (iv) 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1 또는 염수 150 μL로 처리하고, 후속적으로 5 및 6주동안 매주 2회 처리하였다.
도 18. 도 18은 BrdU 검출에 의해 결정된 바와 같이, 신생 인간 혈장, PPF1 및 염수 대조군이 세포 생존에 미치는 영향을 보고한다. 늙은 NSG 마우스(12개월령)를 시험이 수행된, 4주간(시험이 수행된 주) 주당 3회 (iv) 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1 또는 염수 150 μL로 처리하고, 후속적으로 5 및 6주동안 매주 2회 처리하였다. 희생 후 해마 섹션이 분석되었다.
도 19. 도 19는 피질 배양에서 신경구 증식에 대한 대조군, PPF1 및 HAS1의 효과를 도시한다. 이 도면은 Tuj1, DAPI, 또는 Tuj1 및 DAPI에 대해 이미지화된 시험관내 21일 후의 피질 배양에서의 신경구의 이미지를 도시한다.
도 20. 도 20은 피질 배양에서 순 신경돌이 길이에 대한 대조군, PPF1 및 HAS1의 효과를 도시한다.
도 21. 도 21은 비히클, PPF1 및 HAS1이 피질 배양에서 구형체 및 공정 성장에 미치는 효과를 도시한다. 황색 음영은 구형체를 강조표시하고, 분홍색 음영은 IncuCyte 소프트웨어 알고리즘(Essen BioScience, Inc., Ann Arbor, MI)에 의해 결정된 신경돌기를 강조표시한다.
도 22a. 도 22a는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%) 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경산구 수의 정량화를 도시한다.
도 22b. 도 21b는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경돌기 길이의 정량화를 도시한다.
도 22c. 도 21c는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경돌기 분지점의 정량화를 도시한다.
도 22d. 도 22d는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경구 크기의 정량화를 도시한다.
도 23. 도 23은 대조군 비히클(B27 및 2 mM Glutamax를 보충한 신경 기초 배지), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)으로 처리된 Sox2에 대해 양성으로 염색된 신경구 수의 정량화를 도시한다. Sox2 염색은 신경구의 신경 발생 가능성을 나타내는 지표이다.
도 1. 도 1은 노지 챔버에 15분 동안 두었던 대조군, PPF1 또는 HAS1-처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스에 의해 사육된 시간을 도시한다.
도 2. 도 2는 노지 챔버에 15분 동안 두었던 대조군, PPF1 또는 HAS1-처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 속도를 도시한다.
도 3. 도 3은 노지 챔버에 15분 동안 두었던 대조군, PPF1 또는 HAS1-처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 거리를 도시한다.
도 4. 도 4는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 큐잉된 Y-미로 시험에서 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스에 의해 신규한 아암에 소비된 시간을 도시한다.
도 5. 도 5는 큐잉된 Y-미로 시험의 신규한 아암 대 친숙한 아암(신규한: 친숙한 아암의 비율)에서, 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 큐잉된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스에 의해 소비된 시간의 비율을 도시한다.
도 6. 도 6은 큐잉된 Y-미로 시험에서 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 속도를 도시한다.
도 7. 도 7은 큐잉된 Y-미로 시험에서 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 또는 13개월령 NSG 마우스의 운동 거리를 도시한다.
도 8a. 도 8a는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 메모리에 대한 상황적 공포 조건화 시험에서 동결 시간의 퍼센트를 도시한다.
도 8b. 도 8b는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 메모리에 대한 청각적 공포 조건화 시험에서 동결 시간의 퍼센트를 도시한다.
도 9. 도 9는 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스의 메모리에 대한 큐잉된 공포 조건화 시험의 마지막 90초 동안 동결 시간의 퍼센트를 정량화한다.
도 10a. 도 10a는 공간적 메모리를 테스트하는 Barnes 미로 지연 시간을 차트로 보여준다. 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에서 상기 목표 구멍에 도달하는 지연 시간이 보고되었다.
도 10b. 도 10b는 도 10a에 도시된 마지막 3가지 시도의 평균을 정량화한다.
도 11a. 도 11a는 최대 6개월동안 매주 2회 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스의 덴테이트 뇌이랑에서 신생 뉴런에 대한 마커인, 더블코르틴(Doublecortin, Dcx)을 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 11b. 도 11b는 최대 6개월동안 매주 2회 대조군, PPF1 또는 HAS1로 처리한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스의 덴테이트 뇌이랑에서 증식하는 세포에 대한 마커인, Ki67을 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 12. 도 12는 5주 동안 주당 3회 대조군, PPF1, 1X 농축된 HAS1 또는 5X 농축된 HAS1로 처리된 13개월령 NSG 마우스에서 Dcx를 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 13. 도 13은 5주 동안 주당 3회 대조군, PPF1, 1X 농축된 HAS1 또는 5X 농축된 HAS1로 처리된 13개월령 NSG 마우스에서 Ki67을 양성으로 염색한 세포의 수를 정량화한다.
도 14a. 도 14a는 생후 6개월부터 시작되어 염수(대조군) 또는 PPF1을 정맥내 꼬리 정맥 주사로 매주 2회 처리된 NODscid 마우스의 노지 챔버에서의 사육 횟수를 도시한다. 일단 마우스가 노지 챔버에 놓여지면 15분 동안 양육이 측정되었다.
도 14b. 도 14b는 생후 6개월부터 시작되어 염수(대조군) 또는 PPF1을 정맥내 꼬리 정맥 주사로 매주 2회 처리된 마우스의 노지 챔버에서의 운동 속도를 도시한다. 일단 마우스가 노지 챔버에 놓여지면 15분 동안 속도가 측정되었다.
도 14c. 도 14c는 생후 6개월부터 시작되어 염수(대조군) 또는 PPF1을 정맥내 꼬리 정맥 주사로 매주 2회 처리된 마우스의 노지 챔버에서의 운동 거리를 도시한다. 일단 마우스가 노지 챔버에 놓여지면 15분 동안 속도가 측정되었다.
도 15. 도 15는 Barnes 미로 지연 시간 및 해마-의존적 공간 학습 및 메모리를 도시한다. 150 μL 염수 대조군, 신생(young) 혈장, 유출물 I 또는 유출물 II/III로 처리된, 늙은 NSG 마우스(12개월령)의 상기 목표 구멍에 도달하는 지연 시간이 보고된다.
도 16. 도 16은 수컷 늙은 NSG 마우스(12개월령)의 해마-의존적 공간 학습 및 메모리에 대한 신생 인간 혈장, PPF1 및 염수 조절의 효과를 보고한다. 마우스는 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1, 또는 염수 150 μL로 4주 동안주당 3회(iv) 및 그 다음 5주 및 6주동안(시험이 수행된 주) 매주 2회 처리되었다. 각각의 처리 그룹에 대한 Barnes 미로(Maze) 보류 상태에 도달하는 지연 시간이 보고된다.
도 17. 도 17은 매일 시험동안 마지막 3회의 시도동안 Barnes 미로 목표 구멍을 찾기 위한 평균 대기 시간에 신생 인간 혈장, PPF1 및 염수 대조군이 미치는 효과를 보고한다. 늙은 NSG 마우스(12개월령)를 4주간(시험이 수행된 주) 주당 3회 (iv) 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1 또는 염수 150 μL로 처리하고, 후속적으로 5 및 6주동안 매주 2회 처리하였다.
도 18. 도 18은 BrdU 검출에 의해 결정된 바와 같이, 신생 인간 혈장, PPF1 및 염수 대조군이 세포 생존에 미치는 영향을 보고한다. 늙은 NSG 마우스(12개월령)를 시험이 수행된, 4주간(시험이 수행된 주) 주당 3회 (iv) 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1 또는 염수 150 μL로 처리하고, 후속적으로 5 및 6주동안 매주 2회 처리하였다. 희생 후 해마 섹션이 분석되었다.
도 19. 도 19는 피질 배양에서 신경구 증식에 대한 대조군, PPF1 및 HAS1의 효과를 도시한다. 이 도면은 Tuj1, DAPI, 또는 Tuj1 및 DAPI에 대해 이미지화된 시험관내 21일 후의 피질 배양에서의 신경구의 이미지를 도시한다.
도 20. 도 20은 피질 배양에서 순 신경돌이 길이에 대한 대조군, PPF1 및 HAS1의 효과를 도시한다.
도 21. 도 21은 비히클, PPF1 및 HAS1이 피질 배양에서 구형체 및 공정 성장에 미치는 효과를 도시한다. 황색 음영은 구형체를 강조표시하고, 분홍색 음영은 IncuCyte 소프트웨어 알고리즘(Essen BioScience, Inc., Ann Arbor, MI)에 의해 결정된 신경돌기를 강조표시한다.
도 22a. 도 22a는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%) 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경산구 수의 정량화를 도시한다.
도 22b. 도 21b는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경돌기 길이의 정량화를 도시한다.
도 22c. 도 21c는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경돌기 분지점의 정량화를 도시한다.
도 22d. 도 22d는 B27 및 2 mM Glutamax(비히클), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)을 보충한 신경 기초 배지에 현탁된 E14-15 마우스 배아로부터의 피질로부터의 비히클의 백분율로서 신경구 크기의 정량화를 도시한다.
도 23. 도 23은 대조군 비히클(B27 및 2 mM Glutamax를 보충한 신경 기초 배지), PPF1(5% 모액의 10%), 또는 HAS1(5% 모액의 10%)으로 처리된 Sox2에 대해 양성으로 염색된 신경구 수의 정량화를 도시한다. Sox2 염색은 신경구의 신경 발생 가능성을 나타내는 지표이다.
1.
도입
본 발명은 연령-관련 치매 및 신경퇴행성 질환을 포함하는, 인지 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물의 확인 및 발견에 관한 것이다. 본 발명의 양태인 상기 장애로 고통받고 있는 대상체의 치료 방법 및 조성물이 본원에 기술되어 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 인지 장애, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환 예방; 인지 장애, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환의 증상 완화; 노화-관련된 인지 장애, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환의 진행 속도를 늦추는 것; 및/또는 노화-관련된 인지 장애, 연령-관련된 치매 및 신경퇴행성 질환의 진행을 역전시키는데 유용하다. 본 발명의 구현예는 혈액 분별화 공정, 예를 들어 하기 기재된 Cohn 분별화 공정으로부터 수득된, 처리로서 혈장 분획, 예컨대 하나 이상의 분획 또는 유출물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 구현예는 혈장 분획(정상 인간 알부민, 알파 및 베타 글로불린, 감마 글로불린, 및 개별적으로 또는 복합체로서의 다른 단백질로 구성된 용액, 이하 "혈장 분획(Plasma Fraction)"으로 칭함)을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 처리로서 혈장 단백질 분획(Plasma Protein Fraction, PPF)을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 치료로서 인간 알부민 용액(HAS) 분획을 사용하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예는 하기 기재된, 혈액 분별화 공정으로부터의 유출물, 예컨대 유출물 I 또는 유출물 II/III을 사용하는 것을 포함한다. 추가의 구현예는 혈전증의 위험을 감소시키면서 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거된 혈장 분획을 포함한다(예를 들어, 미국특허 출원 제62/236,710호를 참조하며, 이는 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨).
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 비제한적으로, 기재된 특정 방법 또는 조성물이며, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항들에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하기 위한 것은 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에서 논의된 공보들은 본원의 출원일 이전에 그것의 개시내용에 대하여단독으로 제공된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 상기 공보에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공되는 공보의 날짜는 실제 공개일과 상이할 수 있으며, 이는 독립적으로 확인해야 할 수도 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한선과 하한선 사이에서 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한, 각각의 개입 값, 즉 하한 단위의 10분의 1까지가 구체적으로 개시됨을 이해해야 한다. 언급된 범위 내에서 임의의 언급된 값 또는 개입 값 사이의 작은 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개입 값은 본 발명에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위 내에 포함되거나 배제될 수 있으며, 어느 한쪽 또는 양쪽 모두의 범위가 더 작은 범위에 포함되는 각각의 범위는 또한 본 발명에 포함되며, 언급된 범위내에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 속한다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 둘 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
청구범위는 임의의 선택적인 요소를 배제하기 위해 작성될 수 있음에 유의해야 한다. 이와 같이, 이 진술은 청구항 구성요소의 인용, 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기준으로서의 역할을 하기 위한 것이다.
본 개시내용을 판독할 때 당해 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재되고 설명된 개별적인 구현예 각각은 본 발명의 범위 또는 사상으로부터 벗어남없이, 다른 몇몇 구현예의 임의의 특징과 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로, 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
2.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적인 및 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보는 공보가 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 개시내용은 모순이 존재하는 범위까지 통합된 공보의 임의의 개시내용을 대체하는 것으로 이해된다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥 상 달리 명확히 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 상기 세포를 포함하고, "펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩타이드 및 이의 등가물, 예를 들어, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 폴리펩타이드 등을 포함한다.
본 발명의 방법을 기술함에 있어서, "숙주", "대상체", "개체” 및 "환자"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되고, 개시된 방법에 따라 상기 치료를 필요로 하는 임의의 포유동물을 지칭한다. 상기 포유동물은 예를 들어 인간, 양, 소, 말, 돼지, 개과, 고양이, 비-인간 영장류, 마우스 및 랫트를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 농장 동물이다. 다른 구현예에서, 상기 대상체는 애완 동물이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 특정 사례에서, 상기 대상체는 인간이다. 다른 대상체는 애완 동물(예를 들어, 개 및 고양이), 가축(예를 들어, 소, 돼지, 염소, 말 등), 설치류(예를 들어, 마우스, 기니아 피그 및 랫트, 예를 들어 질환의 동물모델), 뿐만 아니라 비-인간 영장류(예를 들어, 침팬지 및 원숭이)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 대상체는 비제한적으로 포유동물, 예를 들어 인간 및 다른 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 등을 포함하며, 특정 구현예에서 상기 대상체는 인간이다. 대상체라는 용어는 임의의 연령, 체중 또는 다른 신체적 특징을 지닌 인간 또는 유기체를 포함하는 의미이며, 그 대상체는 성인, 아동, 영아 또는 신생아가 될 수 있다.
"젊은" 또는 "젊은 개체"는 40세 이하, 예를 들어 30세 이하, 예를 들어, 25세 이하 또는 22세 이하를 포함하는, 35세 이하의 생활 나이를 갖는 개체를 의미한다. 일부 경우, 신생(young) 혈장-함유 혈액 제제의 공급원으로 작용하는 대상체는 10세 이하, 예를 들어 1세 이하를 포함하는 5세 이하의 대상체이다. 일부 사례에서, 상기 대상체는 신생아이고, 혈장 생성물의 공급원은 탯줄이며, 이 경우 혈장 생성물이 신생아의 탯줄로부터 수확된다. 이와 같이, "젊은" 및 "젊은 개체"는 0세 내지 40세의 대상체, 예를 들어 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40세의 대상체를 지칭할 수 있다. 다른 사례에서, "젊은” 및 "젊은 개체"는 비교적 더 나이가 많은 개체에서 나타나는 혈장내 염증성 사이토카인의 수준을 나타내지 않은 개체와 같은 생물학적(나이와 반대로) 나이를 지칭할 수 있다. 반대로 이러한 "젊음" 및 "젊은 개체"는 비교적 나이가 더 많은 개체의 혈장과 비교하여 혈장내 더 높은 수준의 항-염증성 사이토카인을 나타내는 개체와 같은 생물학적(나이와 반대로) 나이를 지칭할 수 있다. 예로서, 염증성 사이토카인은 에오탁신(Eotaxin)이며, 젊은 대상체 또는 젊은 개체와 더 나이가 많은 개체의 배율 차이는 적어도 20%이다. 유사하게, 다른 염증성 사이토카인에서 나이가 많은 개체들과 더 젊은 개체들 사이의 배수 차이는 생물학적 나이를 지칭하는데 사용될 수 있다. (미국특허 출원 번호 제13/575,437호(본원에 참고로 포함됨) 참조 ). 일반적으로, 개체는 건강하며, 예를 들어, 개체는 수확시에 혈액 악성종양 또는 자가면역 질환이 없다.
"노화-관련된 인지 기능 손상으로 고통받고 있거나, 고통받을 위험에 처한 개체"는 그의 기대 수명을 통해 약 50% 이상, 예컨대 60% 이상, 예를 들어 70% 이상, 예컨대 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그의 기대 수명을 통해 심지어 99%인 개체를 의미한다. 개체의 나이는 문제의 종에 따라 다를 것이다. 따라서, 이 백분율은 해당 종의 예상 기대수명에 근거한다. 예를 들어 인간의 경우 상기 개체는 하기 추가로 기재된 바와 같은 노화-관련된 질환, 예를 들어, 자연 노화 과정과 관련된 인지 장애로 고통받고 있는, 50세 이상, 예를 들어, 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 90세 이상 및 일반적으로 100세 미만 예컨대 90세 미만, 즉 약 50세 내지 100세, 예를 들어, 50... 55... 60... 65... 70... 75... 80... 85... 90... 95... 100세 이상, 또는 임의의 연령 약 50세 내지 1000세; 노화-관련된 질환 예를 들어, 인지 장애의 증상을 보이기 시작하지 않은 50세 이상, 예를 들어, 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 90세 이상 및 일반적으로 100세 미만, 즉, 즉 약 50세 내지 100세, 예를 들어, 50... 55... 60... 65... 70... 75... 80... 85... 90... 95... 100세; 하기 추가로 기재된 바와 같은, 노화-관련된 질환으로 인한 예를 들어, 인지 장애로 고통받고 있는 임의의 연령의 개체, 및 전형적으로 인지 장애가 동반된 노화-관련된 질환으로 진단받은 임의의 연령의 개체이며, 상기 개체는 아직 인지 장애의 증상을 보이기 시작하지 않았다. 비-인간 대상체에 대한 상응하는 연령은 공지되어 있으며, 본원에서 적용하고자 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 (i) 질환 또는 장애의 예방, 또는 (ii) 질환 또는 장애의 증상의 감소 또는 제거 중 임의의 것을 지칭한다. 치료는 예방적으로 (질환의 발병 이전에) 또는 치료적으로 (질병의 발병 후) 수행될 수 있다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고, 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 역효과에 대한 부분적 또는 완전한 치료 관점에서 치료적일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 포유동물에서 노화-관련된 질환 또는 장애의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질환에 취약할 수 있지만 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발병되는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 전개를 저지하는 것; 또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료는 다양한 상이한 물리적 징후, 예를 들어 유전자 발현의 조절, 조직 또는 장기의 회복 등을 초래할 수 있다. 치료제는 질환의 발병 전, 발병 중 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는, 진행중인 질환의 치료는 특히 관심의 대상이다. 이러한 치료는 감염된 조직에서 기능이 완전히 소실되기 전에 수행될 수 있다. 상기 대상체 요법은 질환의 증상 단계동안, 및 일부 경우에 질환의 증상 단계 이후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료되는 노화-관련된 질환은 개체의 인지 능력의 노화-관련된 손상이다. 인지 능력, 또는 "인지"란 주목 및 집중, 복잡한 작업과 개념의 학습, 메모리(단기간 및/또는 장기간에 신규한 정보의 획득, 유지 및 검색), 정보 처리(오감각에 의해 모아진 정보 취급), 시공간적 기능(시각적 인식, 심도 인식, 정신적 이미지 사용, 도면 복사, 목적 또는 형상 구성), 언어 생성 및 이해, 언어 유창성(단어-찾기), 문제 해결, 의사 결정, 실행 기능(계획 및 우선순위 지정)을 포함하는 정신 과정을 의미한다. "인지력 감퇴"란 메모리, 언어, 사고력, 판단력 등의 저하와 같은 이러한 능력 중 하나 이상의 진행성 감소를 의미한다. "인지 능력의 손상" 및 "인지 장애"에 의해 건강한 개체, 예를 들어, 연령-매칭된 건강한 개체 또는 더 이른 시점, 예를 들어 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 5년 또는 10년 이상에서의 개체의 능력과 관련하여 인지 능력의 감소를 의미한다. "노화-관련된 인지 장애"는 자연 노화 과정과 관련된 인지 장애, 예를 들어, 경증 인지 장애(M.C.I.)를 포함하는, 노화-관련된 인지 능력의 손상; 및 노화-관련된 장애, 즉 노화 증가 빈도가 증가하는 것으로 보이는 장애, 예를 들어 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 전측두엽 치매, 헌팅톤질환, 근위축 측삭 경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이상증, 혈관 치매 등과 관련된 인지 장애를 의미한다.
혈장 성분을 포함하는 혈액 제품. 본 방법을 실시함에 있어서, 혈장 성분을 포함하는 혈액 제제는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 인지 장애 및/또는 연령-관련된 치매로 고통받고 있거나 또는 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여된다. 이와 같이, 개체(“공여체 개체” 또는 "공여체")로부터, 인지 장애 및/또는 연령-관련된 치매로 고통받고 있거나 적어도 고통받을 위험이 있는 개체(“수령체 개별” 또는 "수령체")에게 혈장 성분을 포함하는 혈액 제제를 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 구현예들에 따른 방법."혈장 성분을 포함하는 혈액 제제"는 혈장(예를 들어, 전혈, 혈장 또는 그의 분획)을 포함하는 혈액 유래의 임의의 제제를 의미한다. "혈장"이라는 용어는 약 92% 물, 7% 단백질, 예컨대 알부민, 감마 글로불린, 항-혈우병 인자 및 다른 응고 인자 및 1% 미네랄 염, 당, 지방, 호르몬 및 비타민으로 구성된 혈액의 담황색/옅은-황색 액체 성분을 지칭하는 종래의 의미로 사용된다. 본 방법에 사용하기에 적합한 혈장-함유 혈액 제제의 비-제한적인 예는 항-응고제(예를 들어, EDTA, 시트레이트, 옥살레이트, 헤파린 등)로 처리된 전혈, 전혈을 여과하여 백혈구를 제거하여 생산된 혈액 제제(“백혈구제거(leukoreduction)"), 혈장분리교환적(plasmapheretically)-유래된 또는 혈장교환적(apheretically)-유래된 혈장, 신선한-냉동된 혈장으로 구성된 혈액 제제, 본질적으로 정제된 혈장으로 구성된 혈액 제제 및 본질적으로 혈장 분획으로 구성된 혈액 제제로 구성된 혈액 제제를 포함한다. 일부 사례에서, 이용된 혈장 생성물은 비-전체의 혈장 생성물로, 적어도 이들 성분이 전혈에 존재하는 한 전혈이 아니어서 적혈구, 백혈구 등과 같은 전혈에서 발견되는 하나 이상의 성분이 결핍되어 있음을 의미한다. 일부 사례에서, 혈장 생성물은 실질적으로 완전하지는 않더라도, 실질적으로 무 세포이며, 그와 같은 사례에서 세포 함량은 0.5% 이하를 포함하여 5 부피% 이하, 예컨대 1 부피% 이하일 수 있으며, 일부 사례에서 무세포성 혈장 분획은 세포가 완전히 결여된 즉, 세포를 포함하지 않는 조성물이다.
혈장 성분을 포함하는 혈액 제제 수집. 본 명세서에 기재된 방법의 구현예는 인간 지원자를 포함하는 공여체로부터 유래될 수 있는 혈장 성분을 포함하는 혈액 제제의 투여를 포함한다. "인간 유래"라는 용어는 상기 생성물을 지칭할 수 있다. 공여체로부터의 혈액 제제를 포함하는 혈장 수집 방법은 당 업계에 공지되어 있다(예를 들어, AABB TECHNICAL MANUAL, (Mark A. Fung, 등, eds., 18th ed. 2014 참조, 이는 본원에 참고로 편입됨).
일 구현예에서, 기증은 정맥천자에 의해 수득된다. 다른 구현예에서, 정맥천자는 단지 단일 정맥천자이다. 또 다른 구현예에서, 염수 용적 대체물이 이용되지 않는다. 일 구현예에서, 혈장분리반출술의 공정은 혈액 제제를 포함하는 혈장을 수득하는데 사용된다. 혈장분리반출술은 공여체에 세포 성분의 반환과 함께 혈장의 체중-조절된 용적의 제거를 포함할 수 있다. 이 구현예에서, 세포 응고를 방지하기 위해 혈장분리반출술 동안 나트륨 시트레이트가 사용된다. 공여체로부터 수집된 혈장의 용적은 바람직하게는 시트레이트 투여 후 690 내지 880 mL이며, 바람직하게는 공여체의 체중과 일치한다.
3.
혈장 분획
2차 세계 대전 중 병사들이 다량의 피를 흘렸을 때 전쟁터에서 이용될 수 있는 안정한 혈장 익스팬더가 필요했다. 그 결과, 동결건조된 혈장의 제조 방법이 개발되었다. 그러나, 재구성은 멸균수를 필요로 하기 때문에, 동결건조된 혈장의 사용은 전투 상황에서 어려웠다. 대안으로 Dr. E.J. Cohn은 알부민을 사용할 수 있고, 쇼크를 치료하기 위해 즉시 도입될 수 있는 사용준비된 안정한 용액을 준비할 수 있다고 제안했다. (참조 Johan Vandersande, 현재의 혈장 분획 제조 방법 참조 in (혈액의 생명공학 ) 165 (Jack Goldstein ed., 1st ed. 1991)). Dr. Cohn의 혈장 분획 정제 과정은 변성 효과를 위해 차가운 에탄올을 사용하고, 분리를 달성하기 위해 pH 및 온도의 변화를 사용한다.
본 명세서에 기재된 방법의 구현예는 대상체에게 혈장 분획을 투여하는 것을 포함한다. 분별화(fractionation)는 특정 단백질 서브셋이 혈장으로부터 분리되는 과정이다. 분별화 기술은 당 업계에 공지되어 있으며, 1940년대 Cohn 등에 의해 개발된 단계에 의존한다. (E. Cohn, Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. 68 J Am Chem Soc 459 (1946), 본원에서 참고로 포함됨). 몇 개의 단계가 이 공정에 관여되며, 각각의 단계는 선택적 단백질 침전을 초래하는 pH, 온도 및 오스몰 농도뿐만 아니라 특정 에탄올 농도를 포함한다. 또한 침전물은 원심분리 또는 침전을 통해 분리된다. 원래의 "Cohn 분별화 과정"은 침전물을 통해 단백질의 분획물 I, 분획 II+III, 분획 IV-1, 분획 IV-4 및 분획 V로 지정된 5개의 분획으로의 분리를 포함했다. 알부민은 이 과정의 본래 확인된 종점(분획 V) 생성물이었다. 본 발명의 구현예에 따라, 각각의 분획(또는 이전의 분리 단계로부터의 유출물)은 치료적으로-유용한 단백질 분획을 함유하거나 잠재적으로 함유한다. (참조 Thierry Burnouf, Modern Plasma Fractionation, 21(2) Transfusion Medicine Reviews 101 (2007); Adil Denizli, 혈장 분별화: 알부민 정제를 위한 종래의 및 크로마토그래피 방법, 4 J. Biol. & Chem.315, (2011); 및 T. Brodniewicz-Proba, Human Plasma Fractionation and the Impact of New Technologies on the Use and Quality of Plasma-derived Products, 5 Blood Reviews 245 (1991) 및 미국특허 번호 3869431, 5110907, 5219995, 7531513, 및 8772461 참조, 본원에 참고로 포함됨). 특정 단백질 분획을 얻기 위해 상기 실험적 파라미터의 조정이 이루어질 수 있다.
더욱 최근에, 분별화는 더욱 복잡해지고, 그 자체로 본 발명의 추가의 구현예들을 포함한다. 최근 복잡성의 증가는 하기를 통해 발생했다. 동결침전물, 동결-결핍성 혈장 및 Cohn 분획과 같은 현존하는 분획으로부터 신규한 단백질을 단리시키는 크로마토그래피의 도입; 크로마토그래피 및 에탄올 분별화 공정을 통합하여 IgG 회수율 증가; 및 바이러스성 감소/불활성화/제거. (Id.) 생리적 pH 및 이온 강도에서 단백질을 포착하기 위해, 음이온-교환 크로마토그래피가 이용될 수 있다. 이것은 단백질 및/또는 단백질 분획의 기능적 활성을 보존한다. 헤파린 및 단클론성 항체는 친화성 크로마토그래피에도 사용된다. 당해 분야의 숙련가는 상기 기재된 파라미터가 조정되어, 구체적으로-요구되는 혈장 단백질-함유 분획을 얻을 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 혈장은 산업 환경에서 분별화된다. 냉동된 혈장은 1 ℃ 내지 4 ℃에서 해동된다. 해동된 혈장에 연속 냉장된 원심분리가 적용되고 동결침전물이 단리된다. 회수된 동결침전물이 -30 ℃ 이하에서 냉동되어 저장된다. 동결침전물-불량한(“동결결핍성") 혈장은 불안정성 응고 인자, 예컨대 인자 IX 복합체 및 그의 성분뿐만 아니라 프로테아제 억제제, 예컨대 항트롬빈 및 C1 에스테라제 억제제의 (예를 들어, 1차 크로마토그래피를 통한) 포획을 위해 즉시 가공된다. 연속 원심분리 및 침전물 단리는 후속적인 단계에서 적용될 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4624780호, 제5219995호, 제5288853호 및 미국 특허 출원 번호 20140343255 및 20150343025에 기재되어 있으며, 이들 개시내용은 본원에서 참고로 포함된다.
본 발명의 일 구현예에서, 혈장 분획은 상당한 농도의 알부민을 함유하는 혈장 분획을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 상당한 농도의 IgG 또는 정맥내 면역 글로불린(IGIV)(예를 들어, Gamunex-C®)을 함유하는 혈장 분획을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 IGIV 혈장 분획, 예컨대 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 방법, 예컨대 단백질 A-매개된 고갈에 의해 면역 글로불린(IgG)을 실질적으로 감손시킨 Gamunex-C®를 포함할 수 있다. (Keshishian, H., 등, Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury, Molecular & Cellular Proteomics, 14 at 2375-93 (2015) 참조). 추가의 구현예에서, 혈장 분획은 혈전증의 위험이 감소된 분획의 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거된 혈장 분획일 수 있다. 예를 들어, 혈장 분획은 2016년 8월 18일에 출원된 미국 특허 번호 제62/376,529호에 기재된 바와 같은 혈장 분획일 수 있으며; 그의 개시내용은 본 명세서에서 참고로 전체적으로 포함된다.
4.
알부민 생성물
당해 분야의 숙련가에게는 알부민 혈장 생성물(“APP")의 두 가지 일반적인 카테고리가 있다: 혈장 단백질 분획(PPF) 및 인간 알부민 용액(HAS). PPF는 HAS보다 높은 수율을 갖는 공정으로부터 유래되었지만 HAS보다 낮은 최소 알부민 순도를 가진다(PPF의 경우 >83%, HAS의 경우 >95%). (인간 알부민 용액의 생산: 지속적 개발 콜로이드, P.Matejtschuk 등, British J. of Anaesthesia 85(6): 887-95, at 888(2000)). 추가로, 일부는 PPF가 단백질 "오염물질", 예컨대 PKA가 존재하기 때문에 약점을 가짐을 지적했다. Id.그 결과, PPF 제제는 알부민 혈장 생성물로서의 인기를 잃었으며, 심지어 특정 국가의 약전에서 폐기되었다. Id.이러한 우려와는 달리, 본 발명은 이러한 "오염물질"을 유익하게 사용하도록 한다. 상기 언급된 PKA뿐만 아니라 α, β 및 γ 글로불린 외에, 본 발명의 방법은 신경 발생, 신경 세포 생존 및 향상된 인지와 같은 과정을 촉진시키는 "오염물질" 내의 추가의 단백질 또는 다른 인자를 이용한다.
당해 분야의 숙련가는 상기 PPF의 몇 개의 상업적 공급원(“상업적 PPF 제제”)이 있거나, 있어왔음을 인식할 것이다. 이들은 하기를 포함한다: Plasma-Plex™ PPF(Armor Pharmaceutical Co., Tarrytown, NY), Plasmanate™(Plasmanate™) PPF(Grifols, Clayton, NC), Plasmatein™(Alpha Therapeutics, Los Angeles, CA) 및 Protenate™ PPF(Baxter Labs, Inc.Deerfield, IL).
당해 분야의 숙련가는 상기 HAS의 몇 개의 상업적 공급원(“상업적 HAS 제제”)이 있거나, 있어왔음을 인식할 것이다. 이들은 하기를 포함한다: Albuminar™(CSL Behring), AlbuRx™(CSL Behring), Albutein™(Grifols, Clayton, NC), Buminate™(Baxatla, Inc., Bannockburn, IL), Flexbumin™(Baxatla, Inc., Bannockburn, IL), 및 Plasbumin™(Grifols, Clayton, NC).
A.
혈장 단백질 분획(인간)(PPF)
미국 식품 의약품국(FDA)에 따르면, " 혈장 단백질 분획(인간)” 또는 PPF는 "인간 혈장으로부터 유래된, 알부민 및 글로불린으로 구성된 단백질의 멸균 용액으로 정의된 생성물의 적절한 명칭이다. "(연방 규정의 Code "CFR" 21 CFR 640.90, 본 명세서에 참고로 포함됨). PPF의 원료 물질은 21 CFR 640.1-640.5(본 명세서에 참고로 포함됨)에 규정된대로 제조된 전혈 또는 21 CFR 640.60-640.76(본원에 참조로 포함됨)에 규정된대로 제조된 공급원 혈장으로부터 회수된다.
PPF는 21 CFR 640.92(본 명세서에 참고로 포함됨)에 따라 하기 표준을 충족하는지 확인하기 위해 시험된다.
(a)
최종 생성물은 단백질의 5.0 +/- 0.30% 용액이어야 한다; 및
(b)
최종 생성물의 총 단백질은 적어도 83%의 알부민과 17% 이하의 글로불린으로 구성되어야 한다. 총 단백질의 1% 이하는 감마 글로불린이어야 한다. 단백질 조성은 식품 의약품국의 생물제제 평가 및 연구 센터장에 의해 각각의 제조자에 대해 승인된 방법에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "혈장 단백질 분획” 또는 "PPF"는 인간 혈장으로부터 유래된 알부민 및 글로불린으로 구성된 단백질의 멸균 용액을 지칭하며, 전기 영동에 의해 결정된, 적어도 83%의 알부민 함량 및 17% 이하의 글로불린(α1, α2, β 및 γ 글로불린) 및 다른 혈장 단백질, 및 1% 이하의 감마 글로불린을 갖는다. (Hink, J.H., Jr., 등., Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction, Vox Sanguinis 2(174) (1957)). 또한, PPF는 용매에 현탁되었을 때 유사한 조성을 갖는 고체 형태를 지칭할 수 있다. 총 글로불린 분획은 총 단백질에서 알부민을 빼서 결정될 수 있다. (Busher, J., Serum Albumin and Globulin, Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations, Chapter 10, Walker HK, Hall WD, Hurst JD, eds. (1990)).
B.
알부민(인간)(HAS)
FDA에 따르면 "알부민(인간)"(또한, 본 명세서에서 일명 "HAS"라고도 함)은 "인간 혈장에서 유래된 알부민의 멸균 용액"으로 정의된 생성물의 고유 명칭이다(연방 규정 "CFR" 21 CFR 640.80의 Code, 이는 본원에 참고로 포함됨). 알부민(인간)에 대한 원료 물질은 21 CFR 640.1-640.5(본원에 참고로 포함됨)에 규정된 바와 같이 제조된 전혈 또는 21 CFR 640.60-640.76(본원에 참고로 포함됨)에 규정된 바와 같이 제조된 공급원 혈장으로부터 회수된 혈장이다. 알부민(인간)에 대한 다른 요건은 21 CFR 640.80-640.84(본원에 참고로 포함됨)에 열거되어 있다.
알부민(인간)은 21 CFR 640.82에 따라 하기 표준을 충족하는지 여부를 결정하기 위해 시험된다:
(a) 단백질 농도. 최종 생성물은 하기 농도 중 하나를 준수해야 한다: 4.0 +/-0.25%; 5.0 +/-0.30%; 20.0 ± 1.2%; 및 25.0 +/-1.5%의 단백질 용액.
(b) 단백질 조성. 최종 생성물의 총 단백질의 적어도 96%는 식품 의약품국의 생물제제 평가 및 연구 센터장에 의해 각각의 제조자에 대해 승인된 방법에 의해 결정된 알부민이어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "알부민(인간)” 또는 "HAS"는 인간 혈장으로부터 유래된 알부민 및 글로불린으로 구성된 단백질의 멸균 용액을 지칭하며, 적어도 95%의 알부민 함량 및 5% 이하의 글로불린(α1, α2, β 및 γ 글로불린) 및 다른 혈장 단백질을 갖는다. 또한 HAS는 용매에 현탁되었을 때 유사한 조성을 갖는 고체 형태를 지칭할 수 있다. 총 글로불린 분획은 총 단백질에서 알부민을 빼서 결정될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, PPF 및 HAS 분획은 또한 동결건조되거나 다른 고체 형태일 수 있다. 상기 제제는 적절한 제제와 함께 예를 들어, 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 고체 형태는 수성 또는 비-수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고급 지방산 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르; 및 요망하는 경우 종래의 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 보존제에 이들을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 주사용 제제로 제형화될 수 있다.
5.
응고 인자-감소된 분획
본 발명의 또 다른 구현예는 혈전증의 위험이 감소된 분획의 효능을 유지하기 위해 실질적으로 모든 응고 인자가 제거된 혈장 분획을 사용한다. 편리하게, 혈액 제제는 젊은 공여체 또는 젊은 공여체 풀로부터 유래될 수 있으며, ABO와 양립가능한 신규한 혈액 제제를 제공하기 위해 IgM이 결여될 수 있다. 현재, 수혈되는 혈장은 A 및 B 항원에 대한 자연 발생 항체의 존재가 수혈 반응을 일으킬 수 있기 때문에 ABO 혈액형과 매칭된다. IgM은 ABO와 매칭되지 않는 혈장을 환자에게 투여할 때 수혈 반응을 일으키는 것으로 보인다. 혈액 제제 또는 분획으로부터 IgM을 제거하는 것은 본 발명의 혈액 제제 및 혈장 분획을 투여받는 대상체에서의 수혈 반응을 제거하는 것을 돕는다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 노화-관련된 질환, 예컨대 인지 장애 또는 신경퇴행을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은: 개체 또는 개체의 풀로부터의 전체 혈액으로부터 유래된 혈액 제제 또는 혈액 분획을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 혈액 제제 또는 혈액 분획은 (a) 적어도 하나의 응고 인자 및/또는 (b) IgM이 실질적으로 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 혈액 제제 또는 혈액 분획이 유래된 개체(들)은 젊은 개체이다. 일부 구현예에서, 혈액 제제는 적어도 하나의 응고 인자 및 IgM이 실질적으로 결여되어 있다. 특정 구현예에서, 혈액 제제는 실질적으로 피브리노겐(인자 I)이 결여되어 있다. 추가의 구현예에서, 혈액 제제는 적혈구 및/또는 백혈구가 실질적으로 결여되어 있다. 추가의 구현예에서, 혈액 제제는 실질적으로 무세포성이다. 다른 구현예에서, 혈액 제제는 혈장으로부터 유래된다. 본 발명의 상기 구현예들은 미국특허 출원 번호 제62/376,529호(2016년 8월 18일자로 출원됨)에 의해 추가로 지지되며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
6.
단백질-강화된 혈장 단백질 생성물
본 발명의 추가의 구현예는 PPF와 비교하여 감소된 알부민 농도를 갖지만, 증가된 양의 글로불린 및 다른 혈장 단백질(일부는 "오염물질"로 지칭됨)을 갖는 혈장 분획을 사용한다. PPF, HAS, 유출물 I 및 유출물 II/III와 같은 구현예는 모두 응고 인자가 효과적으로 결여되어 있다. 상기 혈장 분획은 이하에서 "단백질-강화된 혈장 단백질 생성물"이라고 칭한다. 예를 들어, 본 발명의 구현예는 82% 알부민 및 18% α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예는 81% 알부민 및 19%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예는 80% 알부민 및 20%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 70-79% 알부민 및 상응하는 21-30%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 60~69% 알부민 및 상응하는 31~40%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 50~59% 알부민 및 상응하는 41~50%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 40~49% 알부민 및 상응하는 51~60%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 30~39% 알부민 및 상응하는 61~70%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 20~29% 알부민 및 상응하는 71~80%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 10~19% 알부민 및 상응하는 81~90%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 1~9% 알부민 및 상응하는 91~99%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예는 0~1% 알부민 및 상응하는 99~100%의 α, β 및 γ 글로불린으로 구성된 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물 및/또는 다른 혈장 단백질을 사용할 수 있다.
상기 기재된 본 발명의 구현예는 또한 0 내지 5%의 총 감마 글로불린 농도를 가질 수 있다.
혈장 분획 중의 단백질의 특정 농도는 관련 기술 분야의 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예로써, 및 비제한적으로 이러한 기술은 전기영동, 질량 분광분석법, ELISA 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 포함한다.
7.
혈장 분획의 제조
PPF 및 다른 혈장 분획을 제조하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지된다. 본 발명의 구현예는 Hink 등에 기술된 방법((참조 Hink, J.H., Jr., 등, Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction, Vox Sanguinis 2(174) (1957), 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 방법에 따라, 인간 혈장 단백질 분획의 제조에 사용된 혈액을 응고 억제를 위한 시트레이트 또는 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액으로, 분획 I, II + III, IV 및 PPF의 추가 분리로 플라스크 내에 수집하도록 한다. 이 방법에 따르면, 혼합물은 2~8°C에서 수집될 수 있다. 그다음 후속적으로 혈장이 7 ℃에서 원심분리에 의해 분리되고, 제거되고, -20 ℃에서 저장될 수 있다. 그다음 혈장은 37 ℃에서 해동될 수 있으며, -20 ℃에서 제거한 후 바람직하게 8시간 이내에 분별화될 수 있다.
혈장은 pH 7.2 및 -2 ~ -2.5 ℃ 온도에서 8% 에탄올을 사용하여, 단백질 농도가 5.1 내지 5.6%인 분획 I로부터 분리될 수 있다. 아세테이트 완충액(200 mL 4M 아세트산 나트륨, 230 mL 빙초산, H2O)에 의해 1 L로 적당량)으로 53.3%의 냉 에탄올(혈장 176 mL/L)은 혈장 온도를 -2 ℃로 낮추는 동안 예를 들어 분당 450 mL의 속도로 제트를 사용하여 첨가될 수 있다. 분획 I은 초원심분리를 통해 유출물(유출물 I)로부터 분리 및 제거될 수 있다. 피브리노겐은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 분획 I로부터 수득될 수 있다.
분획 II + III은 유출물을 pH 6.8의 21% 에탄올, 온도 -6°C, 단백질 농도 4.3%로 조정하여 유출물 I로부터 분리될 수 있다. pH 조정을 위해 사용된 10M 아세트산을 갖는 냉 95% 에탄올(유출물 I 176mL/L)은 유출물 I의 온도를 -6°C로 낮추는 동안 예를 들어, 500mL/분의 속도로 제트를 사용하여 첨가될 수 있다. 생성된 침전물(분획 II + III)은 -6°C에서 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 감마 글로불린은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 분획 II + III으로부터 수득될 수 있다.
분획 IV-1은 pH 5.2, 에탄올 온도 -6°C, 및 단백질 농도 3%에서 유출물을 19% 에탄올로 조정하여 유출물 II + III(“유출물 II/III")로부터 분리될 수 있다. pH 조정에 사용된 H20 및 10M 아세트산은 유출물 II/III을 -6°C에서 6시간 동안 유지하면서 제트를 사용하여 첨가될 수 있다. 침전된 분획 VI-1은 -6℃에서 6시간 동안 침강될 수 있으며, 이후 동일한 온도에서 원심분리에 의해 유출물로부터 분리될 수 있다. 에탄올 농도를 pH 4.65, 온도 -7 ℃ 및 단백질 농도 2.5%에서 30%로 조정하여 유출물 IV-1로부터 안정한 혈장 단백질 분획이 회수될 수 있다. 냉 산-알콜(2 M 아세트산 2부 및 95% 에탄올 1부)에 의해 유출물 IV-1의 pH를 조절하여 상기가 달성될 수 있다. -7 ℃의 온도를 유지하면서, 조정된 유출물 IV-1 1 리터당 170 mL 냉 에탄올(95%)이 첨가된다. 침전된 단백질은 36시간 동안 안정화된 후 -7 ℃에서 원심분리에 의해 제거될 수 있다.
회수된 단백질(안정한 혈장 단백질 분획)은 알코올 및 H20를 제거하기 위해 건조(예를 들어, 동결건조에 의해)될 수 있다. 수득된 건조 분말은 예를 들어, 15L의 물/분말 kg을 사용하여 멸균 증류수에 용해될 수 있으며, 용액은 1M NaOH에 의해 pH 7.0으로 조정된다. 최종 농도 5% 단백질은 나트륨 아세틸 트립토파네이트, 나트륨 카프릴레이트 및 NaCl을 함유하는 멸균 증류수를 첨가하여 0.004 M 아세틸 트립토파네이트, 0.004 M 카프릴레이트, 및 0.112 M 나트륨의 최종 농도로 조정하여 얻을 수 있다. 마지막으로 용액을 10 ℃에서 여과하여, 맑은 용액을 얻은 다음 60 ℃에서 적어도 10시간 동안 병원체의 불활성화를 위해 열처리할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 질환을 치료하기 위해 상기 기재된 상이한 분획 및 유출물 각각이 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 제한없이, 유출물 I 또는 유출물 II/III이 인지 및 신경퇴행성 장애와 같은 질환을 치료하는데 이용될 수 있으며, 본 발명의 구현예이다.
이전의 혈장 분획 및 혈장 단백질 분획(PPF)의 제조 방법은 단지 예시적인 것이며, 단지 본 발명의 구현예를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 이들 방법이 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, pH, 온도 및 에탄올 농도가 본 발명의 상이한 구현예 및 방법에서 혈장 분획 및 혈장 단백질 분획의 상이한 변형을 생성하도록 조정될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 추가의 구현예는 혈장 분획 및 혈장 단백질 분획으로부터 병원체의 제거/불활성화를 위한 나노여과의 사용을 고려한다.
본 발명의 추가의 구현예는 추가의 혈장 분획을 사용 및/또는 포함하는 방법 및 조성물을 고려한다. 예를 들어, 본 발명은 특히, 알부민의 특정 농도가 인지 활성을 개선시키는데 중요하지 않음을 입증한다. 따라서, 83% 이하의 알부민을 갖는 상기 분획과 같이, 감소된 알부민 농도를 갖는 분획이 본 발명에 의해 고려된다.
8.
치료
본원에 기술된 본 발명의 방법의 양태는, 혈액 제제, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 혈장 분획을 포함하는 혈장으로 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 일 구현예는 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 인간 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 혈액 제제를 포함하는 혈장으로 대상체를 치료하는 방법이 당 업계에 인식되어 있음을 인식할 것이다. 예로써, 및 비제한적으로, 본원에 기술된 본 발명의 방법의 한 구현예는 인지 장애 및/또는 연령-관련된 치매의 치료 및/또는 예방을 위해 대상체에게 신선한 냉동된 혈장을 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 혈액 제제를 포함하는 혈장은 공여체로부터 수집 즉시, 예를 들어 약 12 내지 48시간 이내에, 인지 장애 및/또는 연령-관련된 치매로 고통받는 개체 또는 위험에 처한 개체에게 투여된다. 그와 같은 사례에서, 생성물은 냉동하에, 예를 들어, 0 내지 10 ℃에서 저장될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 신선한 냉동된 혈장은 -18°C 이하에서 냉동 보관(동결보존)된 혈장이다. 투여하기 전에, 신선한 냉동 혈장은 해동되고, 일단 해동되면 해동 과정이 시작된 후 60 내지 75분에 대상체에게 투여된다. 각각의 대상체는 바람직하게는 신선한 냉동 혈장(200 내지 250 mL)의 단일 단위를 받으며, 상기 신선한 냉동 혈장은 바람직하게는 소정의 연령 범위의 공여체로부터 유래된다. 본 발명의 일 구현예에서, 신선한 냉동 혈장은 젊은 개체에 의해 증여된다(유래). 본 발명의 다른 구현예에서, 신선한 냉동 혈장은 동일한 성별의 공여체에 의해 증여된다(유래). 본 발명의 또 다른 구현예에서, 신선한 냉동 혈장은 18 내지 22세의 연령 범위의 공여체에 의해 증여된다(유래). 일 구현예에서, 대상체는 매주 2회, 3 내지 4일간의 주입에 의해 치료된다. 본 발명의 일 구현예에서, 치료는 특정 종점에 도달될 때까지 지속된다.
본 발명의 일 구현예에서, 혈액 제제를 포함하는 혈장은 혈액형에 의한 기증 후 선별된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 혈액 제제를 포함하는 혈장은 21 CFR 640.33의 요건 및 FDA 지침에 포함된 권고에 따른 감염성 질환 인자, 예컨대 HIV I 및 II, HBV, HCV, HTLV I 및 II, 항-HBc에 대해 선별된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 "혈장 분획"으로 치료된다. 본 발명의 구현예에서, 혈장 분획은 PPF 또는 HAS이다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 혈장 분획은 상업적 HAS 제제의 상업적 PPF 제제 중 하나이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 젊은 개체와 같은 특정 연령 범위의 개체 풀로부터 유래된 PPF 또는 HAS이거나, 또는 추가의 분별화 또는 처리를 거친 변형된 PPF 또는 HAS 분획(예를 들어, 부분적으로 또는 실질적으로 제거된 하나 이상의 특정 단백질을 갖는 PPF 또는 HAS)이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 혈장 분획은 면역 글로불린(IgG)이 실질적으로 감손된 IGIV 혈장 분획이다. "실질적으로 감손된” 또는 "실질적으로 제거된" 특이 단백질, 예컨대 IgG를 갖는 혈액 분획은 당해 분야에서 잘 알려진 표준 검정을 사용하여 측정된 바와 같이, 대조군 제품 또는 전혈 혈장에서 발생하는 양의 약 50% 미만, 예를 들어 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, .25%, .1%, 검출불가능한 수준 또는 이들 값 사이의 임의의 정수를 함유하는 혈액 분획을 지칭한다.
9.
모니터링
본 발명의 또 다른 양태는 치료 전후의 인지 기능을 비교하는 단계를 포함하는, 인지 장애 및/또는 연령 관련 치매 치료를 위한 피험자에 대한 약물의 효과를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 당해 분야의 숙련가는 인지 기능을 평가하는 공지된 방법이 있음을 인식한다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 이 방법은 치매 및 인지 기능을 전문으로 하는 임상의에 의한 병력, 가족력, 신체 및 신경적 검사, 실험실 검사 및 심경심리적 평가에 기초한 인지 기능의 평가를 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 추가 구현예는 하기를 포함한다: 글라스고 코마 스케일(EMV)을 사용하는 것과 같은 의식 평가; 단축된 정신 시험 스코어(AMTS) 또는 미니-정신 상태 검사(MMSE)를 포함한 정신 상태 검사(Folstein 등, J. Psychiatr. Res 1975; 12: 1289-198); 고등 기능의 전반적인 평가; 검안경검사(fundoscopy)와 같은 두개내압 측정.
일 구현예에서, 말초 신경계의 검사는 하기 중 하나를 포함하여 인지 기능을 평가하는데 사용될 수 있다: 개별적으로 시험될 수 있는, 후각, 시야 및 시력, 눈 운동 및 눈동자(교감신경 및 부교감신경), 얼굴의 감각 기능, 안면 및 어깨 거들 근육의 강도, 청력, 맛, 인두 운동 및 반사, 혀의 움직임(예를 들어 시력은 스넬렌 차트로 검사될 수 있으며; 반사는 교근, 이두박근, 삼두근 힘줄, 무릎 힘줄, 발목 저크(jerk) 및 발바닥(즉, 바빈스키 징후)을 포함하는 해머 사용된 반사 신경 검사; MRC 척도 1 내지 5의 근육 강도; 근육 톤 및 경직성의 증상.
10.
투여
본 발명의 실시 방법에서, 혈장 분획이 상기 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 혈장 분획은 정맥내 주입에 의해 투여된다. 주입 속도는 다를 수 있지만, 본 발명의 일 구현예에서는 주입 속도가 5 내지 8 mL/분이다. 당해 분야의 숙련가는 주입 속도가 대상체의 상태 및 투여에 대한 반응에 의존할 수 있음을 인식할 것이다.
유효량의 활성제가 성체 포유동물에 투여되는 구현예에서, 양 또는 투여량은 2주 이상, 예를 들어 3주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 1년 이상 등을 포함하는 적절한 기간 동안 투여될 때 인지 감소, 예를 들어 인지 장애, 또는 인지 장애의 지연 및/또는 성체 포유동물의 인지 향상에 효과적이다. 예를 들어, 효과적인 용량은 적합한 시간 동안 투여될 때 예를 들어 약 20% 이상, 예를 들어 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상, 일부 사례에서 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상까지 늦출 용량이다. 예를 들어, 자연 노화 또는 노화-관련된 장애로 고통받고 있는 환자의 인지력 감퇴를 멈추게 할 것이다. 일부 사례에서, 유효량 또는 용량의 혈액 제제는 질환 상태의 진행을 늦추거나 중지시킬뿐만 아니라 병태의 역전을 유도할 것이며, 즉, 인지 능력의 향상을 초래할 것이다. 예를 들어, 일부 사례에서, 유효량은 적당한 기간, 보통 적어도 약 1주, 아마도 약 2주 이상, 약 3주, 4주, 8주 이상동안 투여될 때 노화-관련된 인지 장애로 고통받고 있는 개체의 인지 능력을 혈액 제제 또는 분획의 투여 전 인지에 비해 예를 들어, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 일부 사례에서 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상 향상시킬 양이다. 일부 사례에서, 유효량 또는 용량의 활성제는 질환 상태의 진행을 늦추거나 중지시킬뿐만 아니라 병태의 역전을 유도할 것이며, 즉, 인지 기능의 향상을 초래할 것이다. 예를 들어, 일부 사례에서, 유효량은 적당한 기간동안 투여될 때 인지력 감퇴 또는 손상으로 고통받고 있는 개체의 증상을 제제의 투여 전 치료받지 않은 개체에 비해 예를 들어, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 일부 사례에서 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상 향상시킬 양이다.
다른 구현예에서, 혈장 분획(plasma fraction) 또는 플라스마 프랙션(Plasma Fraction)은 하기에 기재된 하나 이상의 투약 레지멘에 따라 투여된다: 미국특허 출원 제62/490,519호(전체가 본원에 참고로 포함됨). 이와 같이, 본 발명의 일 구현예는 상기 대상체에게 유효량의 혈장 또는 혈장 분획을 투여함으로써 인지 장애로 진단된 대상체를 치료하는 단계를 포함하며, 상기 혈장 또는 혈장 분획은 가장 최근에 투여된 용량(본 명세서에서 "펄스 투여” 또는 "펄스 투약된"으로 언급됨)에 비해 혈장 단백질 또는 혈장 분획 단백질의 평균 또는 중앙 반감기가 도달된 후 인지 기능 또는 신경 발생을 향상시키는 방식으로 투여된다. 본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 2일 연속 투약 레지멘을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하는 단계 및 최종 투여일로부터 적어도 3일 후에 향상된 인지 기능에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 연속 투약 레지멘을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하는 단계 및 최종 투여일로부터 적어도 3일 후에 향상된 인지 기능에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 2일 연속 투약 레지멘을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하는 단계 및 혈장 또는 혈장 분획내 단백질의 평균 반감기가 도달되었을 때를 초과하는 인지 향상을 모니터링하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 2 내지 14개의 비-연속적 투약 레지멘을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 용량 사이의 각각의 간격은 각각 0 내지 3일 수 있다. 일부 사례에서, 본 발명에 따른 펄스 투약은, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 용량의 제1 세트의 투여를 포함하며, 투약이 없는 기간, 예를 들어 " 투약-없는 기간"이 뒤이어 이어지며, 차례로 또 다른 용량 또는 용량 세트 투여가 이어진다. 이 " 투약-없는 "기간의 지속기간은 다양할 수 있지만, 일부 구현예에서는, 7일 이상, 예컨대 10일 이상, 및 14일 이상을 포함하며, 일부 사례에서 투약-없는 기간은 15 내지 365일, 예컨대 30 내지 90일 및 30 내지 60일 포함한다. 이와 같이, 본 방법의 구현예는 비-만성(즉, 비-연속적) 투약, 예를 들어, 혈장 생성물의 비-만성 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투약-없는 기간이 뒤따르는 펄스 투여 패턴이 필요에 따라 여러 번 반복되며, 이 경우 일부 사례에서 패턴은 1년 이상, 예컨대 2년 이상, 및 대상체의 일생을 포함하여 계속된다. 본 발명의 또 다른 구현예는 2일 내지 3일의 투약-없는 기간 이후 연속 2 내지 14일동안의 투여와 함께 5일 투약 레지멘을 통해 혈장 또는 혈장 분획을 투여하는 단계를 포함한다.
생화학적으로, 활성제의 "유효량” 또는 "효과적인 용량"은 약 20% 이상, 예를 들어 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상, 일부 사례에서 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 일부 경우에 약 100%까지, 즉 무시할 정도의 양으로 억제, 길항, 감소, 감소 또는 억제하고, 및 일부 사례에서 인지 장애 또는 연령-관련된 치매의 진행을 역전시킬 활성제의 양을 의미한다.
11.
혈장 단백질 분획
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 혈장 분획이 상기 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 혈장 분획은 혈장 단백질 분획(PPF)이다. 추가 구현예에서, PPF는 상업적 PPF 제제로부터 선택된다.
다른 구현예에서, PPF는 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 88% 정상 인간 알부민, 12% 알파 및 베타 글로불린 및 1% 이하의 감마 글로불린으로 구성된다. 본 발명의 방법을 실시하는데 사용되는 이 구현예의 구현예는, 예를 들어, 탄산나트륨으로 완충되고 0.004M 나트륨 카프릴레이트 및 0.004M 아세틸트립토판으로 안정화된 PPF의 5% 용액으로서 본 구현예를 포함한다. 용액 중에 PPF의 백분율(예를 들어, 약 1% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%)뿐만 아니라 용매 및 안정화제의 농도를 변형시키는 것을 포함하 추가의 제형이 본 발명의 방법을 실시하는데 이용될 수 있다.
12.
특정 공여체 연령의 혈장 분획
본 발명의 일 구현예는 특정 연령대의 개체의 혈장으로부터 유래된 혈장 분획 또는 혈장 분획을 투여하는 것을 포함한다. 추가의 구현예는 특정 연령 범위의 개체의 혈장으로부터 유래된 혈장 단백질 분획을 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예는 젊은 개체의 혈장으로부터 유래된 PPF 또는 HAS를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 젊은 개체는 단일 특정 연령 또는 특정 연령 범위를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 공여체의 평균 연령은 상기 대상체의 평균 연령보다 낮거나, 치료되는 대상체의 평균 연령 미만이다.
본 발명의 특정 구현예는 특정 연령 범위의 개체로부터 혈액 또는 혈장을 풀링하는 것 및 PPF 또는 HAS와 같은 혈장 단백질 분획 생성물을 얻기 위해 상기 기재된 바와 같이 혈장을 분별화하는 것을 포함한다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 혈장 단백질 분획 또는 특정 혈장 단백질 분획은 명시된 연령 범위에 맞는 특정 개체로부터 획득된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 혈장 분획(blood plasma fraction), 혈장 분획(Plasma Fraction) 또는 특정 혈장 단백질 분획 생성물은 젊은 개체 풀로부터 얻어지며, 그 중 "젊은"은 상기한 바와 같이 연대 또는 생물학적 연령에 의해 결정될 수 있고, 개체의 연령(대)는 특정 연령 또는 연령대일 수 있다.
13.
징후
본 발명의 방법 및 혈장-포함 혈액 제제 및 분획은 노화-관련된 병태, 예컨대 개체의 인지 능력 손상, 예를 들어 (비제한적으로) 연령-관련된 치매, 면역학적 병태, 암 및 물리적 및 기능적 감퇴를 포함하는 인지 장애 예방을 포함하는 치료에 사용된다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 의해 상기 대상체 혈장-함유 혈액 제제로 치료함으로써 이익을 얻을 노화-관련된 인지 장애로 고통받고 있거나 발병할 위험이 있는 개체는 약 50세 이상, 예를 들어 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 90세 이상 및 100세 이상, 즉 약 50세 내지 100세 사이의 연령, 예를 들어 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100세이고, 및 경증 인지 장애(M.C.I.)와 같은 자연 노화 과정과 관련된 인지 장애로 고통받고 있는 개체; 및 약 50세 이상, 예를 들어 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 90세 이상, 및 일반적으로 100세 미만, 즉 약 50세 내지 90세 사이의 연령, 예를 들어, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100세이고, 및 인지 장애 증상이 아직 나타나기 시작하지 않은 개체를 포함한다. 자연 노화로 인한 인지 장애의 예는 하기를 포함한다:
A. 경미한 인지 장애(M.C.I.) 는 메모리 또는 다른 정신 기능, 예컨대 계획을 세우거나, 지시를 따르거나, 경시적으로 악화된 결정을 내리는 것에 문제가 있음을 나타내지만, 전체적인 정신 기능 및 일상 활동이 손상되지 않은 약간의 인지 장애이다. 따라서, 상당한 뉴런 사멸이 전형적으로 일어나지는 않지만, 노화된 뇌의 뉴런은 모두 인지 기능을 손상시키는, 구조, 시냅스 완전성 및 시냅스에서의 분자 처리에 있어서 하위-치명적인 연령-관련 변화에 취약하다.
예를 들어, 본원에 개시된 방법에 의해 상기 대상체 혈장-함유 혈액 제제 또는 분획으로 치료함으로써 이익을 얻을 노화-관련된 인지 장애로 고통받고 있거나 발병할 위험이 있는 개체는 또한 노화-관련된 장애로 인한 인지 장애로 고통받고 있는 임의의 연령의 개체; 및 전형적으로 인지 장애를 수반하는 노화-관련된 장애로 진단받았으며, 인지 장애 증상이 아직 나타나기 시작하지 않은 임의의 연령의 개체를 포함한다. 상기 노화-관련된 장애의 예는 하기를 포함한다:
B. 알츠하이머병 . 알츠하이머병은 대뇌 피질의 과도한 수의 노인성 플라크 및, 타우 단백질로 구성된 b-아밀로이드 및 신경섬유 엉킴을 포함하는 피질하 회백질과 관련된 인지 기능의 진행성 냉혹한 인지 기능 손실증이다. 통상적인 형태는 60세 이상인 사람에게 영향을 미치며, 나이가 증가함에 따라 발병률이 증가한다. 그것은 노인의 치매의 65% 이상을 차지한다.
알츠하이머병의 원인은 알려져 있지 않다. 이 질환은 사례의 약 15 ~ 20%가 유전적이다. 나머지, 소위 산발적인 경우에는 일부 유전적 결정인자가 있다. 이 질환은 대부분의 초기-발병 및 일부 후발성 사례에서 상염색체 우세한 유전적 패턴을 가지지만, 후기의 삶의 침투율은 다양하다. 활성 조사의 초점은 환경 인자이다.
질환의 과정에서 시냅스와 궁극적으로 뉴런은 대뇌 피질, 해마 및 피질하 구조(메이너트(Meynert) 기저 핵의 선택적인 세포 손실 포함), 청색 반점, 및 좌골 구 및 등쪽 솔기핵에서 손실된다. 뇌의 글루코스 사용 및 관류는 뇌의 일부 영역에서 감소한다(초기 단계 질환의 두정엽 및 측두엽 피질, 말기 단계 질환의 전전두엽 피질). 신경증의(Neuritic) 또는 노인성 플라크(아밀로이드 코어 주위의 신경 돌기, 별아교세포, 및 신경교세포로 구성됨) 및 신경섬유 엉킴(페어링되는 나선형 필라멘트로 구성됨)은 알츠하이머병의 발병 기전에 중요한 역할을 한다. 노인성 플라크 및 신경섬유 엉킴은 정상적인 노화와 함께 발생하지만, 알츠하이머병이 있는 사람들에게는 훨씬 더 만연하다.
C. 파킨슨병 . 파킨슨병(PD)은 느리고 감소된 운동, 근육 강성/경직성, 휴지성 떨림 및 체위성 불안정을 특징으로 하는 특발성, 느린 진행성, 퇴행성 CNS 장애이다. 원래 주로 운동 장애로 간주되는, PD는 인지, 행동, 수면, 자율신경 및 감각 기능에 영향을 미치는 것으로 인식되고 있다. 가장 흔한 인지 장애는 주의 집중과 집중력, 작업 기억력, 실행 기능, 언어 생성 및 시공간적 기능에 있어서 손상을 포함한다.
1차 파킨슨병에서 흑색질, 청색 반점 및 다른 뇌간 도파민작용성 세포 그룹의 착색된 뉴런은 소실된다. 원인을 알려지지 않았다. 미상핵(caudate nucleus) 및 조가비핵(putamen)에 투사되는 흑질 뉴런의 손실은 이 부위에서 신경전달물질인 도파민의 고갈을 초래한다. 발병은 일반적으로 40세 이후로, 노년층에서 발병률이 증가한다.
2차 파킨슨증은 다른 특발성 퇴행성 질환, 약물 또는 외인성 독소로 인해 기저핵에서 도파민의 작용을 상실하거나 간섭함으로써 생긴다. 2차 파킨슨증의 가장 흔한 원인은 도파민 수용체를 차단하여 파킨슨증을 유발하는 항정신병 약물 또는 레세르핀의 섭취이다. 덜 일반적인 원인으로는 일산화탄소 또는 망간 중독, 수두증, 구조적 병변(종양, 중뇌 또는 기저핵에 영향을 미치는 경색), 경막하 혈종, 및 줄무늬체 흑질변성을 포함한 퇴행성 장애가 있다.
D. 전측두엽 치매. 전측두엽 치매(FTD)는 뇌의 전두엽의 점진적인 악화로부터 야기되는 질환이다. 경시적으로, 퇴행성 변화가 측두엽으로 진행될 수 있다. 유병률에서, 알츠하이머병(AD) 다음으로 FTD는 전-노인성 치매 사례의 20%를 차지한다. 증상들은 영향을 받는 전두엽과 측두엽의 기능에 따라 세 그룹으로 분류된다:
한편으로는 무기력과 비-자발성(aspontaneity), 및 다른 한편으로는 탈억제(disinhibition)를 포함하는 증상들을 갖는, 행동 변종(variant) FTD(bvFTD); 조음 장애(articulation difficulty), 음운적(phonological) 및/또는 구문 착오(syntactic error)로 인한 말하기 능변(speech fluency)의 장애가 관찰되지만 단어 이해력은 보존되는, 진행성 비유창성 실어증(progressive nonfluent aphasia, PNFA); 및 환자들이 정상적인 음운론과 구문에 능통하지만 이름과 단어 이해력에 어려움을 겪고 있는, 의미론적 치매(semantic dementia, SD). 모든 FTD 환자에게 공통적으로 나타나는 다른 인지 증상으로는 실행 기능 및 집중력의 손상이 있다. 지각, 공간 기술, 기억 및 실천을 포함하는 다른 인지 능력들은 전형적으로 온전하게 남아 있다. FTD는 구조적 MRI 스캔에서 노출된 전두엽 및/또는 측두엽 위축의 관찰로 진단될 수 있다.
다수의 FTD 형태가 존재하며, 이들 중 어느 하나는 본 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. 예를 들어, 전측두엽 치매의 한 형태는 의미 치매(SD)이다. SD는 언어 및 비-언어 영역 모두에서 의미 기억의 손실을 특징으로 한다. SD 환자는 흔히 언어-발견 어려움에 대한 불만을 표시한다. 임상 징후는 달변 실어증(fluent aphasia), 명칭 실어증(anomia), 단어 의미의 이해력 저하, 및 연관성 시각 인식불능증 (associative visual agnosia, 의미론적으로 관련된 사진들과 대상들을 일치시킬 수 없음)을 포함한다. 질환이 진행됨에 따라, 비록 거의 말기 증상들을 갖지 않는 "순수한" 의미 치매의 사례들이 기재되었으나 행동 및 인격 변화들이 측두엽 치매에서 볼 수 있는 것과 유사하게 나타난다 구조적 MRI 영상은 측두엽들(주로 왼쪽) 내의 위축증의 특징적인 패턴을 나타내며, 하부가 상부 관련보다 크고, 전방 측두엽 위축증이 후방보다 크다
또 다른 예로서 전측두엽 치매의 또 다른 형태는 피크 병(PiD, 또한 PcD)이다. 정의하는 질병의 특성은 은(silver) 염색의, "피크 바디들"로서 공지된 구형 응집체(spherical aggregation)들 내로 축적하는, 뉴런 내의 타우 단백질들의 빌드-업이다. 증상으로는 언어 장애(실어증) 및 치매가 있다. 안와전두 장애(orbitofrontal dysfunction)를 갖는 환자들은 공격적이 되고 사회적으로 부적절하게 될 수 있다. 그들은 강탈하거나 혹은 강박적이거나 또는 반복적인 고착 행동(stereotyped behavior)들을 나타낼 수 있다. 배내 측(dorsomedial) 또는 배외 측(dorsolateral) 전두엽 장애를 갖는 환자들은 관심 부족, 무관심, 또는 감소된 자발성을 나타낼 수 있다. 환자들은 자가-모니터링의 부재, 비정상적 자기-인식, 및 의미 공감의 불능을 나타낼 수 있다. 양쪽 후측방 전두엽 피질(bilateral posterolateral orbitofrontal cortex) 및 오른쪽 전전두엽 피질(right anterior insula) 내의 회백질 손실(gray matter loss)을 갖는 환자들은 병적으로 단것을 좋아하는(sweet tooth) 것과 같은, 섭식 행동들의 변화를 나타낼 수 있다. 전외측(anterolateral) 전두엽 피질 내의 더 많은 중심의 회백질 손상이 있는 환자들은 과식증(hyperphagia)이 발생할 수 있다. 일부 증상들은 초기에 완화될 수 있으나, 질환은 진행되고 환자들은 종종 2 내지 10년 이내에 사망한다.
E. 헌팅턴병 . 헌팅턴 병(HD)은 감정, 행동, 및 정신적 비정상; 지식 또는 인지 기능의 상실; 및 운동 이상(운동 방해)의 발생을 특징으로 하는 유전적 진행성 신경퇴행성 장애이다. HD의 고전적 징후들은 무도병(chorea, 얼굴, 팔, 다리, 몸통에 영향을 미칠 수 있는 불수의(involuntary), 급속의, 불규칙한, 요동 운동)의 발생뿐만 아니라 사고 과정 및 후천적 지식 능력들의 점진적인 손상을 포함하는 인지 감퇴를 포함한다. 기억, 추상적 사고, 및 판단의 장애; 시간, 위치, 또는 정체성의 부적절한 인식(방향감각 상실); 증가된 불안; 및 성격 변화들(성격 붕괴)이 존재할 수 있다. 비록 증상들이 일반적으로 인생의 40대 또는 50대 동안에 분명하게 나타나나, 발병 연령은 다양하며, 초기 아동기부터 후기 성인기(예를 들면, 70대 또는 80대)까지 범위이다.
HD는 상염색체 우성 질환으로서 가족들 내에서 전염된다. 장애는 4번 염색체(4p 16.3) 상의 유전자 내의 비정상적으로 긴 서열 또는 코딩된 명령들의 "반복"의 결과로서 발생한다. HD와 관련된 신경계 기능의 점진적인 손실은 기저 핵(basal ganglia) 및 대뇌 피질(cerebral cortex)을 포함하는, 뇌의 특정 영역들 내의 뉴런의 손실로부터 야기한다.
F. 근위축성 측색 경화증. 근위축성 측색 경화증(ALS)은 운동 뉴런을 공격하는 급성 진행성의, 예외 없이 치명적인 신경 질환이다. 근력 약화 및 위축 및 전각 세포 기능 장애(anterior horn cell dysfunction)의 징후들이 손에서 가장 자주 나타나고, 발에서 덜 자주 나타난다. 발병 부위는 랜덤이고, 진행은 비대칭이다. 경련이 일반적이고, 위축을 선행할 수 있다. 드물게, 환자는 30년 생존하고; 50%는 발병 3년 이후에 사망하고, 20%가 5년 생존하며, 10%가 10년 생존한다.
진단 특징들은 중간 또는 후반 성인 동안의 발병 및 감각 이상이 없는 진행성의, 일반화된 운동 관련을 포함한다. 신경 전도 속도는 질병의 말기까지 정상이다. 최근 연구들은 인지 장애뿐만 아니라, 특히 즉각적 언어 기억, 시각 기억, 언어, 및 실행 기능의 감퇴에 대한 제시를 문서화하였다.
ALS 환자의 심지어 정상으로 나타나는 뉴런에서도 세포체 면적, 시냅스 수, 및 총 시냅스 길이의 감소가 보고되었다. 활성 구역의 가소성이 그 한계에 도달할 때 시냅스의 연속적인 손실이 기능 장애에 이르게 한다는 사실이 제안되었다. 신규한 시냅스들의 형성 촉진 또는 시냅스 손실의 방지는 이들 환자에서 뉴런 기능을 유지할 수 있다.
G. 다발성 경화증. 다발성 경화증(Multi Sclerosis, MS)은 차도 및 악화의 재발을 갖는, 다양한 증상들 및 CNS 기능장애의 징후들을 특징으로 한다. 가장 흔하게 나타나는 증상들은 몸통 내의, 또는 얼굴의 일 측 상의 하나 이상의 끝 부위의 지각이상; 다리 또는 손의 쇠약 또는 동작의 서투름; 또는 시각 장애, 예를 들면 부분 실명(blindness) 및 한쪽 안구의 통증(구 후시 신경염, retrobulbar optic neuritis), 시야의 흐릿함, 또는 암점(scotomas)이다. 통상의 인지 장애는 기억(새로운 정보의 습득, 유지, 및 검색), 주의 및 집중(특히 분리 주의), 정보 처리, 실행 기능, 시공간 기능, 및 언어 유창성의 손상을 포함한다. 통상의 초기 증상은 복시(double vision, diplopia), 하나 이상의 사지의 일시적 쇠약, 사지(limb)의 경미한 경직 또는 비정상적인 피로도, 가벼운 보행 장애, 방광 조절 장애, 현기증, 및 경미한 감정 장애를 야기하는 안구 마비이며; 모두 산발적 CNS 관여를 나타내고 때때로 질병이 인식되기 수개월 또는 수년 전에 발생한다. 과도한 열이 증상들과 징후들을 악화시킬 수 있다.
이 과정은 상당히 다양하고, 예측할 수 없으며, 대부분의 환자에서, 이장성이다(remittent). 처음에, 차도 후 수개월 또는 수년은 특히 질병이 구 후시 신경염으로 시작할 때, 에피소드(episode)들을 분리할 수 있다. 그러나 일부 환자들은 빈번한 공격을 가질 수 있고 급격하게 무능력해지며; 소수에 대하여 과정은 급속도로 진행될 수 있다.
H. 녹내장. 녹내장은 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell, RGC)들에 영향을 미치는 흔한 신경퇴행성 질환이다. 증거는 RGC를 포함하여, 시냅스 및 수상 돌기들 내의 분획된 퇴행 프로그램의 존재를 지지한다. 최근의 증거는 또한 노령 성인들에서의 인지 장애와 녹내장 사이의 상관관계를 나타낸다(Yochim BP, 등, 녹내장을 가진 노인들의 인지 장애, 우울증, 불안 증상의 유병률.J Glaucoma.2012; 21(4): 250-254).
I. 근긴장성 이영양증. 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy, DM)은 이영양성 근 위축 및 근긴장을 특징으로 하는 상염색체 우성 다중 시스템 장애이다. 분자 결함은 염색체 19q 상의 미오토닌(myotonin)-단백질 키나아제 유전자의 3' 비-전사 영역에서의 확대된 트리뉴클레오타이드(CTG) 반복이다. 증상들은 어떠한 연령에서도 발생할 수 있으며, 임상 중증도의 범위는 광범위하다. 근긴장은 손 근육들에서 두드러지고, 하수증(ptosis)은 심지어 가벼운 사례에서도 흔하다. 중증 사례에서, 현저한 말초 근육 약화가 흔히 백내장(cataracts), 조기 대머리, 마르고 모난 얼굴, 심부정맥(cardiac arrhythmia), 정소 위축(testicular atrophy), 및 내분비 이상(예를 들어, 당뇨병)과 함께 발생한다. 심각한 선천적 형태에서 정신 지체가 흔하나, 전방 및 시간적 인지 기능들의 노화-관련된 감퇴, 특히 언어 및 실행 기능들의 감퇴가 장애의 경증 성인 형태에서 관찰된다. 심각하게 영향을 받은 사람들은 50대 초반에 사망한다.
J. 치매. 치매는 일상 기능을 방해하기에 충분히 심각하게 사고 및 사회 능력들에 영향을 미치는 증상들을 갖는 장애들의 분류를 설명한다. 위에 설명된 노화-관련된 장애들의 후기 단계들에서 관찰되는 치매의 다른 사례들은 하기에 기재된, 혈관성 치매(vascular dementia), 및 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies)를 포함한다.
혈관성 치매, 또는 "다-경색 치매(multi-infarct dementia)"에서, 인지 장애는 전형적으로 일련의 경미한 발작, 또는 때때로 선행되는 한 번의 큰 뇌졸중 또는 다른 작은 뇌졸중 이후에 뇌로의 혈액 공급의 문제점들에 의해 야기된다. 혈관성 병변은 소혈관 질환(small vessel disease), 또는 국소적 병소, 또는 둘 모두와 같은, 만성 뇌혈관 질환(diffuse cerebrovascular disease)의 결과일 수 있다. 혈관성 치매로 고통을 받는 환자들은 진행성 인지 감퇴가 관측되는, 급성 뇌혈관 사고 이후에, 급성으로 또는 아급성으로(subacutely), 인지 장애를 나타낸다. 인지 장애는 비록 관련된 뇌의 변화들이 AD 병리학에 기인하지 않고 결국 치매를 야기하는, 뇌 내의 만성 혈류 감소에 기인하더라도, 언어, 기억, 복합 시각 처리, 또는 실행 기능을 포함하는, 알츠하이머병에서 관측되는 것과 유사하다. 정신 상태 검사와 관련한 평가들과 함께 다-경색 치매의 진단을 확인하기 위하여 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission computed tomography, SPECT) 및 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography, PET) 신경 촬영법이 사용될 수 있다.
루이소체 치매(DLB, 또한 루이소체 치매, 만성 루이소체 질환, 피질 루이소체 질환, 및 루이형 노인성 치매를 포함하는 다른 다양한 명칭들로 알려짐)는 해부학적으로 사후 뇌 조직학에서 검출될 수 있는 뉴런 내의 루이소체들(알파-시누클레인(alpha-synuclein) 및 유비퀴틴 단백질의 집단)의 존재를 특징으로 한다. 그것의 주요 특징은 인지 감퇴, 특히 실행 기능의 인지 감퇴이다. 민첩성 및 단기간 기억이 올라갔다 떨어졌다 할 것이다.
선명하고 상세한 화상들의 지속적 또는 재발성 환시(visual hallucinations)가 흔히 초기 진단 증상이다. DLB는 흔히 그 초기 단계에서 일반적으로 상당히 점진적으로 시작하는 알츠하이머병 및/또는 혈관성 치매와 혼동되지만, DLB는 급속 또는 급성 발병을 갖는다. DLB 증상들은 또한 파킨슨병에서와 유사한 운동 증상(motor symptoms)을 포함한다. DLB는 치매 증상들이 파킨슨 증상들에 대하여 나타나는 기간에 의해 때때로 파킨슨병에서 발생하는 치매와 구별된다. 치매 발병이 파킨슨병의 발병 이후에 1년 이상이 되면 치매 동반 파킨슨병(POD)이 진단된다. DLB는 인지 증상들이 동시에 또는 파킨슨 증후군의 1년 이내에 시작할 때 진단된다.
K. 진행성 핵상성 마비(progressive supranuclear palsy). 진행성 핵상성 마비(PSP)는 복잡한 안구 운동 및 사고 문제와 함께 걸음걸이와 균형의 제어에 심각하고 진행성인 문제점들을 일으키는 뇌 장애이다. 질병의 전형적인 징후 중 하나는 안구 운동을 조정하는 뇌 영역의 병변으로 인해 눈을 적절하게 조준할 수 없는 것이다. 일부 개체들은 이러한 효과를 블러링(blurring)으로서 설명한다. 영향을 받은 개체들은 종종 우울증, 무관심뿐만 아니라 진행성 경증 치매를 포함하여, 감정과 행동의 변경을 나타낸다. 장애의 긴 이름은 질병이 느리게 그리고 계속해서 악화되기 시작하고(진행성), 안구 운동들을 제어하는 핵이라 불리는 완두콩 크기의 구조체들 위의(핵상) 뇌의 특정 부분들의 손상에 의한 약화(마비)를 야기하는 것을 나타낸다. PSP는 3명의 과학자가 파킨슨병과 이 질환을 구별한 논문을 발표한 1964년에 처음으로 독특한 장애로 기재되었다. 이는 때때로 장애를 정의한 과학자들의 결합된 이름을 반영하여, 스틸-리차드슨-올체브스키 증후군(Steele-Richardson-Olszewski syndrome)으로서 언급된다. 비록 PSP가 점진적으로 악화되더라도, 누구도 PSP 자체로 사망하지는 않는다.
L.
운동 실조증. 운동 실조증을 갖는 인간들은 운동 및 균형을 제어하는 신경계의 일부분이 영향을 받기 때문에 협응력(coordination)에 대한 문제점을 갖는다. 운동 실조증은 손가락, 손, 팔, 다리, 신체, 언어 및 안구 운동에 영향을 미칠 수 있다. 용어 운동 실조증은 종종 감염, 장애, 다른 질병들, 또는 중추신경계 내의 퇴행성 변화들과 관련될 수 있는 비-협응력의 증상을 설명하는데 사용된다. 운동 실조증은 또한 전국적 운동 실조증 재단(National Ataxia Foundation)의 주요 역점인 유전성 및 산발적 운동 실조증으로 불리는 신경계의 특정 퇴행성 질환들의 그룹을 나타내기 위해 사용된다.
M.
다-계통 위축증. 다-계통 위축증(MSA)은 퇴행성 신경 장애이다. MSA는 뇌의 특정 영역에 있는 신경 세포의 퇴행과 관련이 있다. 이 세포 퇴행은 신체의 운동, 균형, 및 방광 조절 또는 혈압 조절과 같은 다른 자율신경 기능에 문제를 일으킨다.
MSA의 원인은 알려지지 않으며, 어떠한 특정 위험 인자들도 확인되지 않았다. 약 55%의 사례가 남성에서 발생하고, 발병하는 전형적인 연령은 50대 후반 내지 60대 초반이다. MSA는 종종 파킨슨병과 일부 동일한 증상을 나타낸다. 그러나 MSA 환자는 만일 있더라도 일반적으로 파킨슨병을 위하여 사용되는 도파민 약물에 대한 최소 반응을 나타낸다.
N.
허약. 허약 증후군(Frailty Syndrome, 이하 "허약")은 운동 능력 저하, 근력 약화, 육체적인 느림, 열악한 지구력, 적은 신체 활동, 영양 실조 및 비자발적 체중 감소를 포함한 기능적 및 신체적 쇠약을 특징으로 하는 노인 증후군이다. 이러한 쇠약은 종종 인지 기능이상 및 암과 같은 질환에서 동반되며, 이의 결과이다. 그러나 질환이 없는 경우에도 허약이 발생할 수 있다. 허약으로 고통받고 있는 개체는 골절, 우발적인 낙상, 장애, 동반이환 및 조기 사망으로 인한 부정적 예후의 위험이 증가한다. (C.Bigigues, 등 프리바이오틱 제형이 허약 증후군에 미치는 영향: 무작위화된, 이중맹검 임상 시험, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 932). 또한, 허약으로 고통받고 있는 개체는 건강 관리 소모가 증가하는 유병률이 증가된다. (Id.)
허약의 일반적인 증상은 특정 유형의 검사에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 의도하지 않은 체중 감소는 최소 10 lbs. 또는 전년도 체중의 5% 이상의 손실을 수반하며; 근육 약화는 기준선에서 최저 20%의 악력 감소로 결정될 수 있으며(성별 및 BMI 조정); 육체적인 느림은 15 피트의 거리를 걷는데 필요한 시간을 기반으로 할 수 있으며; 불량한 지구력은 개체의 고갈에 대한 자기보고에 의해 결정될 수 있으며; 적은 신체 활동은 표준화된 설문지를 사용하여 측정될 수 있다. (Z.Palace 등, 허약 증후군, 오늘날의 노인 의학 7(1), 18(2014)).
일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 노화-관련된 인지 장애의 진행을 늦추는데 사용된다. 환언하면, 개개인의 인지 능력은 개시된 방법에 의한 치료 후, 개시된 방법에 의한 치료 전후에 비해 보다 느리게 감소할 것이다. 그러한 일부 사례에, 본 치료 방법은 치료 후 인지력 감퇴의 진행을 측정하는 단계, 및 인지력 감퇴의 진행이 감소한 것을 결정하는 단계를 포함한다. 그러한 일부 사례에서, 예를 들어 대상체 혈액 제제의 투여 전의 2개 이상의 시점에서 인지를 측정하여 결정된 바와 같이, 치료 전의 개체의 인지력 감퇴의 비율과 같은 기준과 비교함으로써 결정이 이루어진다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 예를 들어 노화-관련된 인지력 감퇴 저하로 고통받거나, 또는 노화-관련된 인지력 감퇴로 고통받을 위험이 있는 개체의 인지 능력을 안정화시키는데 사용된다. 예를 들어, 개체는 노화-관련된 인지 장애를 입증할 수 있으며, 개시된 방법으로 치료하기 전에 관측된 인지 장애의 진행은 개시된 방법에 의한 치료 후에 중단될 것이다. 또 다른 예로서, 노화-관련된 인지력 감퇴(예를 들어, 개체는 50세 이상이거나, 노화-관련된 장애로 진단되었을 수 있음)가 발병할 위험이 있을 수 있으며, 개체의 인지 능력이 실질적으로 변함없으며, 즉, 개시된 방법에 의한 치료 전과 비교하여 개시된 방법에 의한 치료 후에 인지력 감퇴가 검출될 수 없다.
본 방법 및 조성물은 또한 노화-관련된 인지 장애로 고통받고 있는 개체의 인지 장애를 감소시키는데 사용된다. 환언하면, 본 방법에 의한 치료 후 개체의 인지 능력이 향상된다. 예를 들어, 개체의 인지 능력은 본 방법에 의한 치료 전에 개체에서 관측되는 인지 능력에 비해 본 방법에 의한 치료후 예를 들어, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상 또는 100배 이상을 포함하여, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 또는 40배 이상 증가한다. 일부 사례에서, 본 방법 및 조성물에 의한 치료는 노화-관련된 인지력 감퇴로 고통받고 있는 개체의 인지 능력을, 예를 들어, 개체가 약 40세 이하인 경우의 수준으로 회복시킨다. 환언하면, 인지 장애는 폐지된다.
14.
신경인지-관련된 질환의 진단 및 향상을 위한 모니터링 방법
일부 사례에서, 질병 진행 및 신경인지-관련 질환을 진단하는, 및 향상을 위한 질환을 모니터링하는 다양한 방법 중에서 하기와 같은 유형의 평가가 필요에 따라 신경퇴행성 질환으로 고통받고 있는 대상체와 단독으로 또는 조합하여 사용된다. 하기 유형의 방법은 예시로 제공되며, 비제한적으로 인용된 방법이다. 질환을 모니터링하기 위한 임의의 편리한 방법이 원하는 대로 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 또한 본 발명의 방법에 의해 고려된다.
A.
일반적인 인지
본 발명의 방법의 구현예는 치료 전후의 인지 기능을 비교하는 것을 포함하는, 인지 장애 및/또는 연령-관련된 치매 치료를 위한 대상체에 대한 약물 또는 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 추가로 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 인지 기능을 평가하는 공지된 방법이 있음을 인식한다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 이 방법은 치매 및 인지 기능을 전문으로 하는 임상의에 의한 병력, 가족력, 신체 및 신경적 검사, 실험실 검사 및 심경심리적 평가에 기초한 인지 기능의 평가를 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 추가 구현예는 하기를 포함한다: 글라스고 코마 스케일(EMV)을 사용하는 것과 같은 의식 평가; 단축된 정신 시험 스코어(AMTS) 또는 미니-정신 상태 검사(MMSE)를 포함한 정신 상태 검사(Folstein 등, J. Psychiatr. Res 1975; 12: 1289-198); 고등 기능의 전반적인 평가; 검안경검사(fundoscopy)와 같은 두개내압 측정.
일 구현예에서, 말초 신경계의 검사는 하기 중 하나를 포함하는 인지 기능을 평가하는데 사용될 수 있다: 후각, 시야 및 시력, 눈 운동 및 눈동자(교감신경 및 부교감신경), 얼굴의 감각 기능, 안면 및 어깨 거들 근육의 강도, 청력, 맛, 인두 운동 및 반사, 혀의 움직임(예를 들어 시력은 스넬렌 차트로 검사될 수 있으며; 반사는 교근, 이두박근, 삼두근 힘줄, 무릎 힘줄, 발목 저크(jerk) 및 발바닥(즉, 바빈스키 징후)을 포함하는 해머 사용된 반사 신경 검사; MRC 척도 1 내지 5의 근육 강도; 근육 톤 및 경직성의 증상
15.
시약, 장치 및 키트
또한 상기-기재된 방법 중 하나 이상을 실시하기 위한 시약, 장치 및 키트가 제공된다. 대상 시약, 장치 및 키트는 크게 다를 수 있다.
관심의 대상이 되는 시약 및 장치는, 이를 필요로 하는 대상체에 수혈하기 위한 혈장-함유 혈액 제제, 예를 들어, 항-응고제, 동결보존제, 완충액, 등장성 용액 등을 제조하는 방법과 관련하여 상기에서 언급한 것들을 포함한다.
키트는 또한 채혈 백, 튜빙, 바늘, 원심분리 튜브 등을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 6개 이상의 혈장 생성물의 컨테이너를 포함하여, 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 혈장 생성물, 예커대 혈장 단백질 분획의 컨테이너를 포함한다. 일부 사례에서, 키트 내의 혈장 생성물의 구별되는 컨테이너의 수는 36개 이상, 예를 들어 48개 이상을 포함하여 9개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 21개 이상, 24개 이상, 30개 이상일 수 있다. 각각의 컨테이너는 그 안에 포함된 혈장 생성물에 관한 다양한 데이터를 포함하는 식별 정보와 관련될 수 있으며, 이러한 식별 정보는 혈장 생성물의 공여체의 연령, 혈장 생성물에 관한 처리 세부사항, 예를 들면 (상기 설명된 바와 같은) 평균 분자량을 초과하는 단백질을 제거하도록 처리되었는지의 여부, 혈액형의 세부 사항 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 키트 내의 각각의 컨테이너는 그 안에 포함된 혈장에 관한 식별 정보를 포함하고, 식별 정보는 혈장 생성물의 공여체 연령에 관한 정보를 포함하며, 예를 들어 식별 정보는 혈장 생성물 공여체의 연령 관련 데이터의 확인을 제공한다(상기 식별 정보는 채취 시기의 공여체의 연령일 수 있다). 일부 사례에서, 키트의 각각의 컨테이너는 실질적으로 동일한 연령의 공여체로부터의 혈장 생성물을 함유하며, 즉, 모든 컨테이너는 동일한 연령이 아니라도 실질적으로 동일한 공여체로부터의 생성물을 포함한다. 실질적으로 동일한 연령이란 키트의 혈장 생성물이 수득되는 다양한 공여체가 일부 사례에서, 5년 이하, 예를 들어 4년 이하, 예를 들어 3년 이하 (2년 이하 포함), 예를 들어 1년 이하, 예를 들어 9개월 이하, 6개월 이하, 3개월 이하 (1개월 이하 포함)만큼 각각 차이가 나는 것을 의미한다. 식별 정보는 라벨, RFID 칩 등과 같은 컨테이너의 임의의 편리한 구성요소 상에 존재할 수 있다. 식별 정보는 원하는 대로 인간 판독가능한, 컴퓨터 판독가능한, 등일 수 있다. 컨테이너는 임의의 편리한 배치형태를 가질 수 있다. 컨테이너의 용적은 변할 수 있지만, 일부 사례에서 용적은 100 mL 내지 500 mL를 포함하여 10 mL 내지 5000 mL, 예컨대 25 mL 내지 2500 mL, 예를 들어 50 mL 내지 1000 mL이다. 컨테이너는 강성 또는 가요성일 수 있으며, 의료용 플라스틱 재료를 비롯한 임의의 편리한 물질, 예컨대 중합체성 물질로 제조될 수 있다. 일부의 경우, 컨테이너는 백 또는 파우치 배치형태를 갖는다. 컨테이너 이외에, 상기 키트는 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 투여 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트의 구성 요소는 컨테이너 및 다른 키트 구성요소를 보유하도록 구성된, 임의의 적합한 패키징, 예를 들어 박스 또는 유사 구조로 제공될 수 있다.
상기 성분들 외에도, 본 키트는 본 방법을 실시하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 이 지침은 여러 가지 형태로 본 키트에 존재할 수 있으며, 그 중 하나 이상이 키트에 존재할 수 있다. 이 지침이 존재할 수 있는 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 기재에, 예를 들어, 정보가 인쇄된 종이 또는 조각에, 키트의 패키징에, 포장 삽입물 등에 인쇄된 정보이다. 또 다른 수단은 그 안에 정보가 기록된 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들어 디스켓, CD, 휴대용 플래시 드라이브 등이다. 존재할 수 있는 또 다른 수단은 제거된 사이트의 정보에 인터넷을 통해 액세스하기 위해 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 키트에 편리한 수단이 있을 수 있다.
16.
실험 절차
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 당해 분야의 숙련가에게 제공하기 위해 제시된 것이며, 하기의 실험이 수행된 모든 실험 또는 수행된 단독 실험임을 나타내고자 하는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확도를 확보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 거의 대기압이다.
분자 및 세포 생화학의 일반적인 방법은 하기에서 발견될 수 있으며: Molecular Cloning에 대한 표준 교과서: 실험실 메뉴얼, 3th Ed. (Sambrook 등, HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 등 eds., John Wiley & Sons 1999); 단백질 방법(Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); 유전자 치료를 위한 비바이러스성 벡터(Wagner 등 eds., Academic Press 1999); 바이러스성 벡터(Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995; 면역학 방법 매뉴얼(I.Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 세포 및 조직 배양: 생물학의 실험실 과정(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), 이들은 이후에 본원에 참고로 포함된다. 본 개시내용에서 언급된 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich 및 Clontech와 같은 상업적 판매사로부터 입수할 수 있다.
A.
물질 및 시약.
USP 염수는 Hospira(Lake Forest, IL)에서 구입했다. 주사는 주입 당 150 μL의 용적으로 27.5G 또는 30G 니들로 수행하였다. 상업적으로-이용가능한 PPF(“PPF1"), 예컨대 5% 용액내 상기 기재된 상업용 PPF 제제는 4 ℃에서 보관하였다. 상업적으로-이용가능한 HAS(“HAS1"), 예컨대 5% 용액내 상기 기재된 상업용 HAS 제제를 4 ℃에서 보관하였다.
B.
동물 공급 및 축산.
마우스 균주 NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl(“NODscid,” 균주 Code 394, Charles River, MA) (Bosma, M. 등, scid 마우스 돌연변이체.137 Curr Top Microbiol Immunol 197(1988)) 및 NOD scid 감마(“NSG," 균주 Code 005557, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 사용하였다. 각각의 마우스는 고유한 식별 번호를 지정하기 위해 귀 펀치를 사용했다. 모든 마우스는 12-시간의 명주기, 12-시간 암주기 하에 특정 병원체가 없는 조건하에 개별적으로 하우징되었으며, 모든 동물 취급 및 사용은 IACUC 승인된 표준 지침에 따랐다.
C.
투여.
아래에서 상이하게 설명하지 않는 한, NSG 및 NODscid 마우스에는 최대 6개월 동안 정맥내 꼬리 정맥 주사(주사 1회당 150μL)를 통해 매주 2회 USP 염수, 5% PPF1 또는 5% HAS1을 주사했다.
D.
노지
노지 테스트를 사용하여 상기 대상체 마우스의 탐색 행동을 결정했다. 노지 테스트는 비어있는 테스트 아레나이며, 일반적으로 원형 또는 정사각형이다. 마우스를 50cm x 50cm 노지 아레나 안쪽에 15분 동안 놓고, 마우스의 활동 수준을 측정한다. 양육 시간은 앞발이 박스 벽에 걸려 있는 지속시간을 추적하여 측정하였다. 커버된 총 거리 및 속도는 또한 시험 기간 동안 측정하였다. 노지에서 마우스 행동을 추적하기 위해 CleverSys TopScan V3.0(Reston, VA)을 사용하였다. 노지 챔버는 CleverSys에서 제작했다.
E.
Y-미로
마우스를 5분 동안 Y-미로(시작 + 익숙한)의 두 아암(arm)을 탐험시켰다. 1시간 후, 마우스는 3개의 모든 아암을 탐험할 수 있었으며, 총 시간과 아암의 엔트리 수를 기록하였다.
F.
Barnes 미로
마우스를 변형된 Barnes 미로에서 4일 연속 훈련을 받으며, 탈출구를 찾기 위해 최대 120초가 주어졌다. (참조 Barnes, C.A., 노화-관련된 기억 상실: 랫트의 신경생리학 및 행동 연구, J>g1>. 비교 및 생리 심리학, 93(1): 74-104(1979); 및 변형된 미로의 경우, Faizi, M. 등, 알츠하이머병의 Thy1-hAPP(Lond/Swe+) 마우스 모델은 감각 운동, 인지 및 사회적 기능에 넓은 행동 적 결핍을 나타낸다., BRAIN BEHAV.2(2): 142-54, (2012)). 탈출구는 훈련 일에 4번의 시도에서 동일하게 유지되었지만 훈련일 사이에는 변화되었다. 탈출구까지의 대기 시간은 4일 별도의 훈련일에 각각의 마우스 집단 별로 기록되었다.
G.
DCX- 및 Ki67-양성 세포
더블코르틴(DCX)은 뉴런 전구체 세포에 의해 발현되는 미세소관-관련된 단백질이다. 그것은 또한 배아 및 성인 피질 구조내 미성숙한 뉴런에 의해 발현된다. 그들이 활동적으로 나눌 때, 뉴런의 전구체 세포는 DCX를 발현한다. 단백질은 2주 후에 하향조절한다. 이 연관 때문에, 그것은 신경발생의 마커로서 유용하다.
뇌 조직 처리 및 면역조직화학을 자유-부유 섹션 잘 기재된 기술에 대해 수행하였다(Luo, J. 등, TH17 경로와 독립적으로 작용하는 신경교-의존적 TGF-b 신호전달은 쥣과 자가면역 뇌척수염의 개시에 중요하다. J. Clin.Invest. 117, 3306-3315(2007)). 마우스를 마취시키고, 0.9% 염수로 관류시켰다. 뇌를 제거하고, 4 ℃에서 포스페이트-완충된 4% 파라포름알데하이드(pH 7.4)로 고정한 후, 동결보존을 위해 30% 수크로스를 통해 침지시켰다. 이어서 뇌를 -22 ℃에서 저온 마이크로톰으로 30μm 절단하였다. 섹션은 동결방지용 배지에 저장하였다. 사용된 1차 항체는 염소 항-Dcx(Santa Cruz Biotechnology, 주 2회 투약실험의 경우 1: 500, 주 3회 투약 실험의 경우 1: 200) 또는 토끼 항-Ki67(1: 500 Abcam)이었다. 1차 항체 염색은 바이오티닐화된 2차 항체 및 디아미노벤지딘(DAB, Sigma-Aldrich) 또는 형광-접합된 2차 항체를 갖는 ABCkit(벡터)를 사용하여 드러났다. 덴테이트 뇌이랑 당 Dcx-양성 세포의 총 수를 추정하기 위해, 덴테이트 뇌이랑의 과립 세포 및 서브과립 세포층의 면역양성 세포를 해마를 통한 3개의 관상면 하 반부 절편에서 카운트하고 평균내었다.
H.
신생 혈장, 유출물 I 또는 유출물 II/III로 치료받은 늙은 NSG 마우스에 대한 Barnes 미로 검사
늙은 NSG 마우스(12개월령)를 여러 그룹으로 나누어(모두 n=14), 행동 테스트를 시작하기 전에 꼬리 정맥 주사로 150μL 염수, 신생 혈장, 유출물 I, 또는 유출물 II/III을 투여받았다. 각각의 개별 그룹을 3개의 코호트로 분리하여, 각각의 코호트를 다른 주에 행동 테스트로 개시하였다.
I.
신생 혈장 또는 PPF1로 주당 3회 치료된 늙은 NSG 마우스의 Barnes 미로 및 세포 생존(BrdU 염색)
늙은(12개월령) 수컷 NSG 마우스를 150 μL의 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1 또는 염수로 4주간 3회 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥 내로 처리하였다. 레지멘은 5주 및 6주 동안 매주 2회로 바뀌었으며, 행동 검사 주였다.
치료 전에, 마우스를 각각 13 내지 15마리의 3개의 코호트로 나누었다. 각각의 코호트는 상기 기재된 바와 같이, 신생 혈장, PPF1 또는 염수의 치료 시작 전에 복강내로(i.p.) 5일간의 BrdU 주사를 받았다.
5주 및 6주 동안, 행동 테스트를 수행하고, Barnes 미로 시험에서 각각의 마우스에 대해 목표 구멍에 대한 대기 시간을 측정했다. 각 테스트 세션은 최대 120초 동안 지속되었다. 목표 구멍을 찾는 이벤트는 마우스의 코가 목표 구멍으로 정의된 영역에 들어갔을 때 결정된 소프트웨어를 사용하여 기록하였다.
행동 테스트가 끝나면, 동물을 희생시키고, 해마 당 6개 섹션을 명시야 현미경을 사용하여 정량화하여 덴테이트 뇌이랑의 과립 세포층 내 BrdU 양성 세포의 존재를 측정하였다. 해마의 각기 상이한 영역의 대표적인 부분으로서, BrdU 양성 세포의 평균 수는 BrdU 양성 세포의 총 수를 예측하기 위해 각각의 동물의 해마의 섹션의 총 수인 72로 곱했다.
J.
신경구 및 피질 배양 검사
1.
Tuj1 및 DAPI 염색
마우스 C57 E14,15 피질(Lonza: M-CX-300)을 B27, 2 mM Glutamax(Sigma-Aldrich)가 보충된 신경기초 배지 12 ml에 현탁시켰다. 콜라겐 I(Corning, Inc.)로 예비-코팅된 96-웰 플레이트의 각 웰에 200 μL를 첨가하였다. 16시간 후, 플레이팅 배지를 사전-가온된(37 ℃) 대조군 배지(B27, 2 mM Glutamax(Gibco)와 신경 기초 배지로 대체하였다. 시험관내에서 4일째(“시험관내 일” 또는 "DIV"), 배양 배지를 새로운 대조군 배지, 대조군 배지 및 10% PPF1, 대조군 배지 및 10% HAS1, 비히클 및 10% PPF1 또는 비히클, 및 10% HAS1로 대체하였다. 배양물을 21일 동안 유지하였으며, 배지의 75%를 3일마다 신선한 배지로 교체하였다. 21 DIV에서, 배양물을 PBS로 3회 세정한 후, 4% 파라포름알데하이드로 실온(RT)에서 20분간 고정시켰다. 고정 후, 배양물을 PBS로 2회 세정한 후, 0.1% Triton X100으로 5 내지 20분 동안 투과시켰다. 투과 후, 배양물을 실온에서 60분 동안 3% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)으로 차단시켰다. 60분 후, 블로킹 용액을 흡인하고, 배양물을 항-Tuj1 항체(AbCam-1: 500)로 4 ℃에서 밤새 라벨링하였다. 라벨링 후, 배양물을 PBS + 0.1% BSA로 3회 세정한 다음, 4 ℃에서 밤새 (1: 1000) A647-접합 당나귀 항-마우스 항체로 염색하였다. 이어서 배양물을 PBS로 2회 세정하고, Hoechst 33342(1: 1000)로 20분 동안 라벨링하였다. 샘플을 Hoechst 라벨링 후 PBS로 3회 세정하였다. GE InCell 분석기 2000(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 10배 배율을 사용하여 각각의 웰에 대해 25개의 필드를 획득했다. 결과는 도 19에 도시되어 있다.
2.
순 신경돌기 길이
순 신경돌기 길이는 이전 부문에서 기재된대로 배양물로부터 결정하였다. 신경돌기 분석은 GE InCell 조사자 현상액 툴박스(Investigator Developer Toolbox)에서 생성된 맞춤 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 대조군 및 비히클 처리된 샘플의 결과는 거의 동일하므로, 통계 분석을 위해 조합하였다. 결과는 도 20에 도시되어 있다.
3.
피질 배양물 구형체 수 및 크기; 프로세스 길이 및 분기
마우스 C57 E14,15 피질(Lonza: M-CX-300)를 B27, 2 mM Glutamax(Sigma-Aldrich)가 보충된 신경기초 배지 12 mL에 현탁시켰다. 폴리라이신 및 라미닌으로 예비-코팅된 96-웰 플레이트의 각 웰에 200 μL를 첨가하였다. 4일 후, 배지 50%를 신선한 배지로 교환하고, 시험 물질(비히클, PPF1 또는 HAS1)을 최종 농도 10%로 처리하였다. 이것은 3일 후에 반복하였다. 처리 7일째에, 세포를 IncuCyte(Ann Arbor, MI)로 10X 배율로 위상차 이미지화하여, 표준 "신경 돌기 및 세포-몸체" 알고리즘으로 분석하였다. 6개의 복제물을 복제 당 4개의 이미지로 분석하였다. 표준 오차가 표시된다. 2 테일드 T-시험에 대한 유의성은 P<0.5로 나타냈다. 결과는 도 21 및 22에 도시되어 있다.
4.
Sox2 신경구 염색
마우스 C57 E14,15 피질 뉴런(Lonza: M-CX-300)를 100-200K 세포/ml로, B27, 2mM Glutamax(Sigma-Aldrich)가 보충된 신경기초 배지에 현탁시켰다. 콜라겐 I(Corning, Inc.)로 예비-코팅된 96-웰 플레이트의 각 웰에 200 μL를 첨가하였다. 16시간 후, 플레이트 배지를 사전-가온된(37 ℃) 대조군 배지(B27, 2 mM Glutamax(Gibco)를 갖는 신경기초 배지)로 대체하였다. 4일째 시험관내에서(“시험관내 일” 또는 "DIV"), 배양 배지를 신선한 대조군 배지로, 대조군 배지를 HAS 비히클(비히클)로, 대조군 배지 및 10% PPF1, 대조군 배지 및 10% HAS1로 대체하였다. 배양물을 21일 동안 유지시켰으며, 매질의 75%는 3 내지 4일마다 신선한 배지로 교체시켰다. 21 DIV에서, 배양물을 PBS로 3회 세정한 후, 4% 파라포름알데하이드로 실온(RT)에서 20분간 고정시켰다. 고정 후, 배양물을 PBS로 2회 세정한 후, 0.1% Triton 100X로 5 내지 20분 동안 투과시켰다. 투과 후, 배양물을 실온에서 60분 동안 3% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)으로 차단시켰다. 60분 후, 블로킹 용액을 흡인하고, 배양물을 항-Tuj1 항체(AbCam-1: 500) 및 토끼-항 SOX2(AbCam: 1: 5000 4 ℃에서 밤새 표지하였다. 라벨링 후, 배양액을 PBS + 0.1% BSA로 3회 세정한 다음 당나귀 항-마우스-647(AbCam) 및 양 항-토끼-텍사스 레드로 4 ℃에서 밤새(1: 1000) 염색하였다. 배양물을 PBS로 2회 세정하고, Hoechst(1: 1000)로 20분 동안 라벨링하였다. 샘플을 Hoechst 라벨링 후 PBS로 3회 세정하였다. InCell 분석기 2000(GE Healthcare Life Sciences)의 10X 배율을 사용하여 각각의 웰에 대해 25개(20개 또는 25개)의 필드를 획득했다. 신경구 및 신경돌기 분석은 GE InCell 조사자 현상액 툴박스(Investigator Developer Toolbox)에서 생성된 맞춤 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 대조군 및 비히클 처리된 샘플의 결과는 거의 동일하므로, 통계 분석을 위해 조합하였다. 결과는 도 23에 도시되어 있다.
K.
생체내 실험 결과
1.
3개월령 및 13개월령 NSG 마우스를 대상으로 한 노지 시험
3개월령(젊은) 또는 13개월령(나이많은) NSG 마우스를 노지 챔버에 15분 동안 두었다. 양육에 소비된 시간 도 1, 속도 도 2 및 거리 도 3의 양육 시간을 측정했다. 도 1은 13개월령 마우스가 생후 3개월령 마우스보다 시간을 덜 소비했지만 PPF1 및 HAS1-처리된 마우스는 젊은 마우스와 유의한 차이가 없다는 것을 도시한다. 도 2는 염수(대조군) 및 PPF1-처리된 13개월령 마우스가 3개월령 마우스보다 유의하게 느린 것을 도시한다. 그러나, HAS1-처리된 마우스는 염수-처리된 마우스보다 유의하게 빨랐으며, 젊은 마우스와 유의한 차이가 없었다. 도 3은 염수(대조군) 및 HAS1-처리된 늙은 마우스가 젊은 마우스보다 이동 활성이 적고 PPF1-처리된 마우스가 염수-처리된 마우스보다 더 많은 거리를 커버함을 도시한다. 표시된 모든 데이터는 평균 ± s.e.m이다; * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; t-시험; n = 20, 18, 18, 19. (SAL = 염수).
2.
3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 Y-미로 시험
젊은(3개월령)와 늙은 (13개월령) NSG 마우스를 기억을 위한 테스트로서 큐잉된 Y-미로에서 시험하였다. 도 4는 모든 마우스가 익숙한(F) 아암보다 신규한(N) 아암에서 훨씬 더 많은 시간을 소비했음을 보여준다. 도 5는 HAS1-처리된 늙은 마우스가 젊은 마우스에 비해 익숙한 아암에 대한 기억이 상당히 손상된 반면, PPF1-처리된 마우스는 익숙한 아암에 대한 기억이 향상되는 경향이 있음을 보여준다. 도 6은 HAS1-처리된 늙은 마우스가 아닌 염수 및 PPF1-처리된 마우스가 젊은 마우스보다 상당히 느린 것을 보여준다. 도 7은 HAS1-처리된 늙은 마우스가 아닌 염수 및 PPF1-처리된 마우스가 젊은 마우스보다 더 적은 거리를 커버함을 보여준다. 표시된 모든 데이터는 평균 ± s.e.m이다; * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; 페어링된 t-시험; n = 20, 18, 18, 19. (SAL = 염수).
3.
3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 기억에 대한 공포 조건화 시험
젊은(3개월령) 및 늙은(13개월령) NSG 마우스를 기억에 대한 공포 조건화 시험에서 시험하였다. 도 8a는 13개월령 마우스가 생후 3개월령 마우스보다 프리징하여 더 적은 시간이 소모되는 경향이 있는 반면, HAS1-처리된 마우스는 생후 3개월령 마우스만큼 프리징하는데 시간이 더 오래 걸리는 경향이 있음을 보여준다. 도 8b는 청각적 큐잉에 대한 큐잉 테스트에서 13개월령 대조군-처리된 마우스가 최악의 수행 시간과 가장 적은 시간의 프리징 시간을 보여준다. HAS1-처리된 마우스는 프리징하는데 더 많은 시간을 소비하는 추세였고, 이는 톤에 대한 기억이 향상되었음을 나타낸다. 도 9는 메모리에 대한 큐잉 테스트의 마지막 90초의 정량화를 보여주며, HAS1-처리된 마우스가 프리징하는데 더 많은 시간을 소모하여 기억이 향상되었음을 보여준다. n = 20, 16, 17, 19. (SAL = 염수).
4.
3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 공간 기억을 위한 Barnes 미로 시험
Barnes 미로 시험에서 젊은(3개월령)와 늙은(13개월령) NSG 마우스를 공간 기억에 대하여 시험하였다. 도 10a는 3개월령 마우스가 가장 잘 수행했으며, 마지막 시도에 의해 목표 구멍에 도달하는데 가장 빠른 대기 시간을 가졌음을 보여준다. 도 10b는 염수-처리된 및 HAS1-처리된 마우스가 젊은 마우스에 비해 목표 구멍에 대한 기억이 상당히 손상되었음을 입증하는 마지막 3회 실험의 평균을 정량화한 것이지만, PPF1-처리된 마우스는 젊은 마우스와 유의한 차이가 없었다. ** P <0.01; *** P <0.001; 페어링되지 않은 t-시험; n = 20, 18, 18, 19. (SAL = 염수).
5.
3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 면역염색
뇌 절편은 신생 뉴런에 대한 마커인 더블코르틴(doublecortin, Dcx) 또는 염수, PPF1 또는 HAS1로 매주 2회 치료한 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에서 증식하는 세포의 마커인 Ki67에 대해 염색하였다. 젊은 및 늙은 NSG 마우스의 덴테이트 뇌이랑에서 Dcx- 및 Ki67-양성 세포를 카운팅하였다. 도 11a 및 도 11b는 각각 모든 늙은 마우스가 적은 수의 Dcx- 또는 Ki67-양성 세포 수를 가졌음을 보여준다. PPF1 및 HAS1-처리된 마우스는 염수-처리된 마우스와 비교하여 Dcx- 및 Ki67-양성 세포 수가 증가하는 경향을 보였다.
6.
PPF1 및 HAS1로 매주 3회 처리된 3개월령 및 13개월령 NSG 마우스에 의한 면역염색
뇌 절편은 신생 뉴런에 대한 마커인 더블코르틴(Dcx) 또는 13개월령 마우스에서 증식하는 세포의 마커인 Ki67에 대해 염색하였다. 마우스를 염수, PPF1, 1X 농축된 HAS1, 또는 5X 농축된 HAS1로 3회 처리하였다. dcx- 및 Ki67-양성 세포를 덴테이트 뇌이랑에서 카운트하였다. 도 12는 PPF1으로 처리한 마우스가 염수 대조군 처리된 동물과 비교하여, 신경발생의 증가 경향을 보여준다(Dcx 염색으로 나타남). 또한, HAS1이 염수-처리된 동물에 비해 신경발생이 증가하는 경향이 더 집중된 것으로 나타났다.
도 13은 염수 대조군 처리 동물과 비교하여, PPF1으로 처리한 마우스가 세포 증식이 유의하게 증가했다는 것을 보여준다(Ki67 염색으로 나타남). 또한, HAS1이 염수-처리된 동물에 비해 신경발생이 증가하는 경향이 더 집중된 것으로 나타났다. *P<0.05; 염수 그룹에 대한 비페어링 t-시험; 모든 데이터는 평균 ± s.e.m이다.
7.
NODscid 마우스에 의한 노지 시험
NODscid 마우스는 생후 6개월부터 시작하여 염수 또는 PPF1로 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 매주 2회 처리하였다. 마우스의 개시 수는 각 그룹당 20마리였다. 마우스를 노지 챔버에 15분 동안 두었고, 이동 활성을 기록하였다. 도 14a는 PPF1-처리된 마우스가 염수-처리된 마우스와 비교하여, 증가된 양육 활성 경향을 나타내는 것을 보여준다. 도 14b 및 도 14c 는 각각 PPF1-처리된 마우스가 염수-처리된 마우스와 비교하여 속도 및 거리를 향상시키는 경향이 있음을 보여준다.
8.
신생 혈장, 유출물 I 및 유출물 II/III로 처리된 늙은(12개월령) NSG 마우스에 의한 Barnes 미로
늙은 NSG 마우스(12개월령)를 여러 그룹(모든 크기 n = 14)으로 나누어 행동 시험을 시작하기 전에 꼬리 정맥 주사로 150μL 염수, 신생 혈장, 유출물 I, 또는 유출물 II/III을 받았다. 각각의 별개의 그룹을 3개의 코호트로 더 분리하여, 각 코호트는 다른 주에 행동 시험을 개시하였다. 공간 학습 및 기억을 평가하기 위해 변형된 Barnes 미로(상기에 기재된 바와 같이)에서 마우스를 시험하였다. 도 15는 신생 혈장, 유출물 I, 또는 유출물 II/III로 처리하면 늙은 NSG 마우스가 목표 구멍에 도달할 때 대기 시간이 현저하게 개선되는 경향이 있음을 보여준다.
9.
신생 혈장 및 PPF1로 치료받은 늙은 NSG 마우스에 의한 Barnes 미로 및 세포 생존
상기에 기재된 바와 같이, 늙은 수컷 NSG 마우스(12개월령)를 정화된 신생 인간 혈장(신생 혈장), PPF1, 또는 염수 150 ㎕로 4주간 주당 (iv) 3회 처리하고, 그다음 5 및 6주동안 매주 2회 시험을 수행하였으며, 시험한 주는 보고되었다.
도 16은 각각의 치료 코호트의 Barnes 미로 구멍에 도달하는 대기 시간을 보고한다. PPF1에 의한 처리는 대조군에 비해 늙은 마우스에서 공간 기억을 상당히 향상시켰고, 신생 혈장에 의한 처리는 대조군에 비해 공간 기억을 향상시키는 경향을 보였다. (n: 염수 = 12, PPF1 = 14, 신생 혈장 = 11). *P< 0.05; 평균 ± s.e.m; 페어링되지않은 T-시험.
도 17은 테스트의 각 날에 대한 마지막 3회의 시도에 대한 목표 구멍을 찾기 위한 평균 대기 시간을 보고한다. 또한, PPF1에 의한 처리는 대조군에 비해 늙은 마우스의 공간 기억을 상당히 향상시켰으며, 신생 혈장에 의한 처리는 대조군에 비해 공간 기억이 향상되는 경향이 나타났다. *P< 0.05; 평균 ± s.e.m; 페어링되지않은 T-시험.
도 18은 늙은(12개월령) NSG 마우스의 덴테이트 뇌이랑의 과립층 내 BrdU 양성-표지된 세포(즉, 증식 세포)의 수로 결정된 바와 같은, 세포 생존에 대한 신생 인간 혈장 및 PPF1의 효과를 보고한다. BrdU는 상기에 기재된 바와 같이 신생 혈장, PPF1 또는 염수 대조군의 정맥내 주사를 시작하기 전에 5일 동안 투여하였다(i.p.). 염수 대조군과 비교하여, 신생 인간 혈장 및 PPF1-처리된 마우스에서 세포 생존의 유의한 증가가 관측되었다. 통계적 유의도는 염수 처리와 비교된 PPF1과 신생 인간 혈장 사이의 던넷(Dunnett) 다중 비교 후-hoc 분석으로 원-웨이(One-Way) ANOVA를 사용하여 결정하였다. (n: 염수 = 13; PPF1 = 13; 신생 혈장 = 11, **** P 0.0001, PPF1 또는 신생 인간 혈장과 염수 처리 사이의 페어링되지않은 T-시험).
L. 시험관내 신경구 및 피질 배양 검사 결과
도 19는 PPF1 및 HAS1이 피질 배양에서 신경구 증식을 차별적으로 조절한다는 것을 보여준다. 비히클 단독, PPF1(10%) 또는 HAS1(10%)를 함유한 배양 배지에서 콜라겐 I-코팅 96-웰 플레이트에서 E14-15 C57 마우스로부터의 피질을 배양하였다. Tuj1(뉴런-특이 부류 III 베타-튜불린), DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌), 또는 TuJ1 및 DAPI 둘 다에 대해 이미지화한 21일 후의 피질 배양물에서의 신경구의 예시 이미지가 도시되어있다. 도 19는 PPF1이 Tuj1 또는 DAPI를 발현하는 신경구의 양을 증가시킨다는 것을 보여준다. Tuj1 발현의 증가는 PPF1-처리된 피질 배양물이 보다 많은 뉴런-유사 표현형으로 분화된 보다 많은 신경구를 생산한다는 것을 입증한다.
도 20은 하기에 현탁된 C57 마우스 E14-15 피질 뉴런의 3개의 배양물을 도시한다(Lonza: M-CX-300): 비히클, PPF1(10%), 또는 HAS1(10%)를 함유하는 배양 배지에서 콜라겐 I-코팅된 96-웰 플레이트에 코팅된, B27, 2 mM Glutamax(Sigma-Aldrich)를 100-200 K 세포/mL로 보충한 신경기초 배지.신경발생을 나타내는 순 신경돌기 길이는 대조군 또는 HAS1-처리된 배양물과 비교하여 PPF1-처리된 배양물에서 발생하였다.
도 21은 하기에 현탁된 C57 마우스 E14-15 피질 뉴런의 3개의 배양물을 도시한다(Lonza: M-CX-300): 비히클, PPF1(10%), 또는 HAS1(10%)를 함유하는 배양 배지에서 콜라겐 I-코팅된 96-웰 플레이트에 코팅된, B27, 2 mM Glutamax(Sigma-Aldrich)를 100-200 K 세포/mL로 보충한 신경기초 배지.Essen BioSciences(MI, Ann Arbor, MI)에서 입수가능한 IncuCyte 소프트웨어 알고리즘은 피질 배양 구형체(황색으로 강조표시됨) 및 프로세스(분홍색으로 강조표시됨)를 검출하였다. PPF1-처리된 배양물에서 더 많은 구형체 및 과정이 관측되었으며, PPF1-처리된 배양물에서 증가된 구형체 크기 및 공정 분지(process branching)가 관측되었다. 기준자는 각각 300μm이다.
도 22. 도 22a 내지 22d는 구형체의 수, 공정 길이, 공정 분지점 및 구형체 크기를 각각 나타낸다. 정량화는 Essen BioSciences(Ann Arbor, MI)에서 입수가능한 IncuCyte 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 표준 오차가 표시된다. 2-테일드 T-시험을 사용하여 유의성이 표시된다. 도 22a는 PPF1 처리된 배양액이 비히클 또는 HAS1-처리된 배양물과 비교하여 증가된 수의 구형체를 가지고 있음을 보여준다. (P = 0.0006, PPF1 대 비히클; P = 0.0007, PPF1 대 HAS1). 도 22b는 PPF1-처리된 배양물이 비히클 또는 HAS1-처리된 배양물과 비교하여 증가된 공정 길이를 나타낸다는 것을 보여준다. (P = 4e-8, PPF1 대 비히클; P = 0.002, PPF1 대 HAS1; 및 P = 0.018, HAS1 대 비히클). 도 22c는 PPF1-처리된 배양물이 비히클 또는 HAS1-처리된 배양물과 비교하여 더 많은 분지점을 생성함을 보여준다. (P = 0.002 PPF1 대 비히클; P = 0.004, PPF1 대 HAS1). 도 22d는 PPF1-처리된 배양물이 비히클 또는 HAS1-처리된 배양물과 비교하여 증가된 구형체 크기와 관련되어 있음을 보여준다. (P = 0.002 PPF1 대 비히클; P = 0.004, PPF1 대 HAS1). 함께, 이 데이터의 결과는 PPF1(및 덜 중요한 정도에 대한 HAS1) 처리가 증가된 피질 배양 세포 성장 및 프로세스 형성을 나타내는 특징과 관련된다는 것을 나타낸다.
도 23은 배아 및 신경 줄기 세포 유지에 중요한 역할을 하는 전사 인자인, Sox2에 대해 양성으로 염색된 신경구의 수를 도시한다. 정량화는 GE InCell 조사자 툴박스(Investigator Toolbox) 알고리즘을 사용하여 수행하였다. PPF1-처리된 배양물은 Sox2에 대해 양성으로 염색된 신경구의 수가 상당히 증가하여 생산되어, PPF1 처리가 신경발생 가능성을 가진 세포 수가 증가하는 것과 관련이 있음을 나타냈다.
전술한 것은 본 발명의 원리를 설명하는 것일 뿐이다. 당해 분야의 숙련가는 본원에 명시적으로 기재되거나 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 그의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 본 발명을 진보시키는데 발명자가 기여한 개념을 이해하는 것을 돕기 위한 것이며, 상기 구체적으로 언급된 예 및 조건에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 양태 및 구현예 및 그의 특정 예를 기재한 본 명세서의 모든 설명은 그것의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하도록 의도된다. 또한, 상기 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발되는 등가물, 즉 구조와 관계없이 동일한 기능을 수행하는 임의의 개발 요소를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에 도시되고 설명된 예시적인 구현예들에 한정되는 것으로 간주되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구항들에 의해 구체화된다.
Claims (15)
- 인지 장애로 진단된 대상체에게 유효량의 혈장 분획을 투여하는 단계를 포함하는, 인지 장애를 치료하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 혈장 분획이 혈장 단백질 분획인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 혈장 단백질 분획이 상업적으로 입수가능한 혈장 단백질 분획인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 혈장 분획이 인간 알부민 용액인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 인간 알부민 용액은 상업적으로 입수가능한 인간 알부민 용액인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 혈장 분획은 단백질-강화된 혈장 단백질 생성물인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 혈장 분획이 유출물 I인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 혈장 분획이 유출물 II/III인 방법.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 인지 기능에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 분획은 젊은 개체의 풀(pool)로부터의 혈장으로부터 유래된 방법.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 분획이 포유동물 혈액 제제로부터 생산되는 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 포유동물 혈액 제제가 인간 혈액 제제인 방법.
- 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
- 인지 장애에 대하여 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 키트로서, 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 혈장 분획을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트.
Applications Claiming Priority (6)
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|---|---|---|---|
| US201662376529P | 2016-08-18 | 2016-08-18 | |
| US62/376,529 | 2016-08-18 | ||
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