ES2899147T3

ES2899147T3 - Fracciones de plasma sanguíneo como tratamiento de los trastornos cognitivos asociados al envejecimiento

Info

Publication number: ES2899147T3
Application number: ES17841780T
Authority: ES
Inventors: David Bell; Ian Gallager; Steven P Braithwaite; S Sakura Minami; Vu Dang; Joe Mccracken; Karoly Nikolich
Original assignee: Alkahest Inc
Current assignee: Alkahest Inc
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2022-03-10
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CY1124695T1; EP3995140A1; RS62558B1; WO2018034712A1; MA45692B1; AU2017312722B2; CA3033051A1; IL264660B2; HUE056294T2; NZ750885A; MX2024008963A; US20220152161A1; LT3484502T; JP7316931B2; CL2019000304A1; JP2023156459A; BR112019003172A2; ZA202004834B; KR20190032614A; AU2020200181A1

Abstract

Una Fracción de Proteínas de Plasma (FPP) para su uso en el tratamiento de un trastorno cognitivo relacionado con la edad, en la que una cantidad eficaz de la FPP se administra a un sujeto diagnosticado con el trastorno cognitivo relacionado con la edad, en el que la FPP tiene un contenido total de proteínas que consiste en al menos 83 % pero menos del 95 % de albúmina, no más del 17 % de globulinas y otras proteínas de plasma, y no más del 1 % de gamma globulina, en la que dicha FPP se deriva del plasma humano.

Description

DESCRIPCIÓN

Fracciones de plasma sanguíneo como tratamiento de los trastornos cognitivos asociados al envejecimiento

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la prevención y el tratamiento de enfermedades asociadas al envejecimiento. La invención se relaciona con el uso de productos sanguíneos, tales como fracciones de plasma sanguíneo, para tratar y/o prevenir condiciones asociadas con el envejecimiento, tales como trastornos neurocognitivos y neurodegenerativos.

ANTECEDENTES

El envejecimiento es un importante factor de riesgo para múltiples enfermedades humanas, incluyendo el deterioro cognitivo, el cáncer, la artritis, la pérdida de visión, la osteoporosis, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y los accidentes cerebrovasculares. Además de la pérdida normal de sinapsis durante el envejecimiento natural, la pérdida de sinapsis es un evento patológico temprano común a muchas condiciones neurodegenerativas, y es el mejor correlato del deterioro neuronal y cognitivo asociado a estas condiciones. Por ello, el envejecimiento sigue siendo el factor de riesgo más dominante para las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) (Bishop, N.A. et al., Neural mechanisms of ageing and cognitive decline. Nature 464(7288), 529-535 (2010); Heeden, T. et al., Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 5(2), 87-96 (2004); Mattson, M.P., et al., Ageing and neuronal vulnerability. Nat. Rev. Neurosci. 7(4), 278-294 (2006)). El envejecimiento afecta a todos los tejidos y funciones del cuerpo, incluyendo el sistema nervioso central, y el deterioro de funciones tal como la cognición, puede afectar gravemente a la calidad de vida. El documento US 2014/328856 A1 divulga una composición de IgG para el Alzheimer. El documento WO 2009/155069 A1 enseña el uso de una composición enriquecida con plaquetas para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, el tratamiento del deterioro cognitivo y de los trastornos neurodegenerativos ha tenido un éxito limitado en la prevención y reversión del deterioro. Por lo tanto, es importante identificar nuevos tratamientos para mantener la integridad cognitiva protegiendo, contrarrestando o reversando los efectos del envejecimiento.

SUMARIO

El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación se basa en la producción y el uso de productos sanguíneos para el tratamiento y/o la prevención de trastornos relacionados con la edad, tales como las condiciones de deterioro cognitivo, la demencia relacionada con la edad y las enfermedades neurodegenerativas. La presente divulgación reconoce, entre otras cosas, la necesidad de nuevas terapias para el tratamiento y/o la prevención del deterioro cognitivo, la demencia relacionada con la edad y las enfermedades neurodegenerativas. Derivadas de la sangre y del plasma sanguíneo, las presentes composiciones se refieren a una solución para los fallos y deficiencias de las terapias actuales mediante la utilización de fracciones de plasma sanguíneo que muestran eficacia en el tratamiento y/o prevención del deterioro cognitivo, la demencia relacionada con la edad y las enfermedades neurodegenerativas. Además, la presente divulgación se refiere a las proteínas identificadas en las fracciones del plasma sanguíneo que pueden ser eficaces como tratamientos o agentes preventivos para el deterioro cognitivo y la demencia relacionada con la edad, o son objetivos para la inhibición por agentes adicionales.

La divulgación actual también reconoce que las diferencias en el contenido de proteínas entre las diferentes fracciones del plasma sanguíneo (por ejemplo, fracciones, efluentes, "Fracciones del Plasma", Fracción de Proteínas del Plasma, Solución de Albúmina Humana) pueden ser responsables de prevenir y/o mejorar ciertos deterioros cognitivos y aliviar la enfermedad neurodegenerativa. A modo de ejemplo, y no de limitación, las realizaciones de la presente divulgación demuestran que la mera concentración de albúmina más alta de las preparaciones de Solución de Albúmina Humana (HAS) no es la fuerza motriz detrás de la mejora de la cognición asociada con las preparaciones de Fracción de Proteína de plasma (PPF) con concentraciones de albúmina más bajas.

La sangre y el plasma sanguíneo de donantes jóvenes han mostrado una mejora y reversión de los efectos preexistentes del envejecimiento cerebral, incluyendo a nivel molecular, estructural, funcional y cognitivo. (Saúl A. Villeda, et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine 20 659-663 (2014)). La presente divulgación se refiere a fracciones y efluentes del plasma sanguíneo, algunos de los cuales se han utilizado tradicionalmente para tratar el choque de los pacientes, y al descubrimiento de que son eficaces como procedimientos de tratamiento del deterioro cognitivo asociado al envejecimiento.

De acuerdo con aspectos de la divulgación entonces, se proporcionan fracciones de productos sanguíneos de plasma sanguíneo para su uso en el tratamiento del deterioro cognitivo asociado al envejecimiento, la demencia relacionada con la edad, y/o la enfermedad neurodegenerativa. Aspectos del uso para el tratamiento incluyen que una fracción de plasma sanguíneo se administra a un individuo que sufre o tiene riesgo de desarrollar un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento o una enfermedad neurodegenerativa. Aspectos adicionales del uso incluyen que una fracción derivada de plasma sanguíneo de un grupo de donantes de un intervalo de edad específico se administra a un individuo que sufre de o tiene riesgo de desarrollar un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. También se divulgan reactivos, dispositivos y kits de los mismos que se utilizan en la práctica de los procedimientos en cuestión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos adjuntos ilustran realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar la invención. Estos dibujos se ofrecen a título ilustrativo y no limitativo: se hace énfasis que las diversas características de los dibujos pueden no estar a escala.

Figura 1. La Figura 1 muestra el tiempo de cría de los ratones NSG de 3 o 13 meses de edad tratados con PPF1 o HAS1 que fueron colocados en una cámara de campo abierto durante 15 minutos.

Figura 2. La Figura 2 muestra la velocidad de movimiento de los ratones NSG de 3 o 13 meses de edad tratados con PPF1 o HAS1 que fueron colocados en una cámara de campo abierto durante 15 minutos. Figura 3. La Figura 3 muestra la distancia de movimiento recorrida por los ratones NSG de 3 o 13 meses de edad tratados con PPF1 o HAS1 que fueron colocados en una cámara de campo abierto durante 15 minutos.

Figura 4. La Figura 4 muestra el tiempo de permanencia en el brazo novedoso de los ratones NSG de 3 o 13 meses en la prueba del laberinto Y con señales que fueron tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 5. La Figura 5 muestra la proporción de tiempo que pasan los ratones NSG de 3 meses o 13 meses en los brazos novedosos frente a los familiares (proporción de novedoso: familiar) de la prueba del laberinto Y con señales, habiendo sido los ratones tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 6. La Figura 6 muestra la velocidad de movimiento de los ratones NSG de 3 y 13 meses de edad, tratados con PPF1 o HAS1, en la prueba del laberinto en Y.

Figura 7. La Figura 7 muestra la distancia de movimiento recorrida por ratones NSG de 3 o 13 meses de edad en la prueba del laberinto en Y, habiendo sido los ratones tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 8A. La Figura 8A muestra el porcentaje de tiempo de congelación en la prueba de condicionamiento del miedo contextual para la memoria en ratones NSG de 3 y 13 meses tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 8B. La Figura 8B muestra el porcentaje de tiempo de congelación en la prueba de condicionamiento de miedo con pistas auditivas para la memoria en ratones NSG de 3 y 13 meses tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 9. La Figura 9 cuantifica el porcentaje de tiempo de congelación durante los últimos 90 segundos de la prueba de condicionamiento de miedo con pistas para la memoria en ratones NSG de 3 y 13 meses de edad tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 10A. La Figura 10A muestra la latencia del laberinto de Barnes, que pone a prueba la memoria espacial. Se informa de la latencia para alcanzar el agujero objetivo en ratones NSG de 3 y 13 meses de edad tratados con control, PPF1 o HAS1.

Figura 10B. La Figura 10B cuantifica el promedio de los 3 últimos ensayos representados en la figura 10A. Figura 11A. La Figura 11A cuantifica el número de células que se tiñen positivamente para Doublecortin (Dcx), un marcador de neuronas recién nacidas en el giro dentado de ratones NSG de 3 y 13 meses de edad tratados con control, PPF1 o HAS1 dos veces por semana durante un máximo de 6 meses.

Figura 11B. La Figura 11B cuantifica el número de células que se tiñen positivamente para Ki67, un marcador de células proliferantes en el giro dentado de ratones NSG de 3 y 13 meses de edad tratados con control, PPF1 o HAS1 dos veces por semana durante un máximo de 6 meses.

Figura 12. La Figura 12 cuantifica el número de células que tiñen positivamente para Dcx en ratones NSG de 13 meses tratados con control, PPF1, HAS1 concentrado 1X o HAS1 concentrado 5X tres veces por semana durante cinco semanas.

Figura 13. La Figura 13 cuantifica el número de células que tiñen positivamente para Ki67 en ratones NSG de 13 meses tratados con control, PPF1, HAS1 concentrado 1X o HAS1 concentrado 5X tres veces por semana durante cinco semanas.

Figura 14A. La Figura 14A muestra el número de sesiones de cría en una cámara de campo abierto en ratones NODscid tratados dos veces por semana mediante una inyección intravenosa en la vena de la cola con solución salina (control) o PPF1 a partir de los 6 meses de edad. La cría se midió durante un lapso de 15 minutos una vez que los ratones fueron colocados en la cámara de campo abierto.

Figura 14B. La Figura 14B informa de la velocidad de movimiento en una cámara de campo abierto de ratones tratados dos veces por semana mediante una inyección intravenosa en la vena de la cola con solución salina (control) o PPF1 a partir de los 6 meses de edad. La velocidad se midió durante un lapso de 15 minutos una vez que los ratones fueron colocados en la cámara de campo abierto.

Figura 14c . La Figura 14C muestra la distancia recorrida en una cámara de campo abierto por ratones tratados dos veces por semana mediante una inyección intravenosa en la vena de la cola con solución salina (control) o PPF1 a partir de los 6 meses de edad. La velocidad se midió durante un lapso de 15 minutos una vez que los ratones fueron colocados en la cámara de campo abierto.

Figura 15. La Figura 15 muestra la latencia del laberinto de Barnes y el aprendizaje y la memoria espaciales dependientes del hipocampo. Se informa de la latencia para alcanzar el agujero objetivo en ratones NSG envejecidos (de 12 meses) tratados con 150 pl de control salino, plasma joven, Efluente I o Efluente II/IN.

Figura 16. La Figura 16 informa del efecto del plasma humano joven, el PPF1 y el control salino sobre el aprendizaje y la memoria espacial dependiente del hipocampo en ratones NSG macho envejecidos (de 12 meses). Los ratones fueron tratados con 150 |jl de plasma humano joven clarificado (plasma joven), PPF1 o solución salina tres veces por semana (i.v.) durante 4 semanas, y luego se informó dos veces por semana durante las semanas 5 y 6, que fueron las semanas en las que se realizaron las pruebas . Se informa de la latencia para llegar a la retención del laberinto de Barnes para cada grupo de tratamiento.

Figura 17. La Figura 17 muestra el efecto del plasma humano joven, el PPF1 y el control salino en la latencia promedio para encontrar el agujero objetivo del laberinto de Barnes en los tres últimos ensayos de cada día de la prueba. Los ratones NSG envejecidos (de 12 meses) fueron tratados con 150 j l de plasma humano joven clarificado (plasma joven), PPF1 o solución salina tres veces por semana (i.v.) durante 4 semanas, y posteriormente fueron tratados dos veces por semana durante las semanas 5 y 6, que fueron las semanas en las que se realizaron las pruebas.

Figura 18. La Figura 18 muestra el efecto del plasma humano joven, el PPF1 y el control salino sobre la supervivencia de las células, determinada por la detección de BrdU. Los ratones NSG envejecidos (de 12 meses) fueron tratados con 150 j l de plasma humano joven clarificado (plasma joven), PPF1 o solución salina tres veces por semana (i.v.) durante 4 semanas, y posteriormente fueron tratados dos veces por semana durante las semanas 5 y 6, que fueron las semanas en las que se realizaron las pruebas de comportamiento. Las secciones del hipocampo se analizaron después del sacrificio.

Figura 19. La Figura 19 muestra los efectos del control, PPF1 y HAS1 en la proliferación de neuroesferas en el cultivo de la corteza. La figura muestra imágenes de ejemplo de neuroesferas de cultivos corticales después de 21 días in vitro, con imágenes de Tuj1, DAPI, o Tuj1 y DAPI.

Figura 20. La Figura 20 muestra los efectos del control, PPF1 y HAS1 sobre la longitud neta de las neuritas en el cultivo de la corteza.

Figura 21. La Figura 21 muestra los efectos del vehículo, de PPF1 y de HAS1 sobre el crecimiento de esferas y procedimientos en el cultivo de corteza. El sombreado amarillo resalta las esferas, y el sombreado rosa resalta las neuritas determinadas por un algoritmo del software IncuCyte (Essen BioScience, Inc., Ann Arbor, MI).

Figura 22A. La Figura 22A muestra la cuantificación del número de neuroesferas como porcentaje del vehículo a partir de corticales de embriones de ratón E14-15 suspendidos en medio basal neural suplementado con B27 y 2 mM de Glutamax (vehículo), PPF1 (10 % de una solución madre al 5 %), o HAS1 (10 % de una solución madre al 5 %).

Figura 22B. La Figura 21B muestra la cuantificación de la longitud de las neuritas como porcentaje del vehículo de las cortezas de embriones de ratón E14-15 suspendidos en medio basal neural suplementado con B27 y 2 mM de Glutamax (vehículo), PPF1 (10 % de una solución madre al 5 %), o HAS1 (10 % de una solución madre al 5 %).

Figura 22C. La Figura 21C muestra la cuantificación de los puntos de ramificación de las neuritas como porcentaje del vehículo a partir de corticales de embriones de ratón E14-15 suspendidos en medios basales neuronales suplementados con B27 y 2 mM de Glutamax (vehículo), PPF1 (10 % de una solución madre al 5 %), o HAS1 (10 % de una solución madre al 5 %).

Figura 22D. La Figura 22D muestra la cuantificación del tamaño de las neuroesferas, como porcentaje del vehículo, a partir de corticales de embriones de ratón E14-15 suspendidos en medio basal neural suplementado con B27 y 2 mM de Glutamax (vehículo), PPF1 (10 % de una solución madre al 5 %), o HAS1 (10 % de una solución madre al 5 %).

Figura 23. La Figura 23 muestra la cuantificación del número de neuroesferas con tinción positiva para Sox2, que fueron tratadas con el vehículo de control (medio basal neural suplementado con B27 y 2 mM de Glutamax), PPF1 (10 % de una solución madre al 5 %), o HAS1 (10 % de una solución madre al 5 %). La tinción de Sox2 es un indicador del potencial de neurogénesis de una neuroesfera.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Introducción

La presente divulgación se refiere a la identificación y el descubrimiento de procedimientos y composiciones para el tratamiento y/o la prevención del deterioro cognitivo, incluyendo la demencia asociada a la edad y la enfermedad neurodegenerativa. En el presente documento se describen procedimientos y composiciones para el tratamiento de sujetos que padecen dichos trastornos. Los usos y composiciones descritos en el presente documento son útiles para: prevenir el deterioro cognitivo, la demencia asociada a la edad y la enfermedad neurodegenerativa; mejorar los síntomas del deterioro cognitivo, la demencia asociada a la edad y la enfermedad neurodegenerativa; ralentizar la progresión del deterioro cognitivo asociado al envejecimiento, la demencia asociada a la edad y la enfermedad neurodegenerativa; y/o revertir la progresión del deterioro cognitivo asociado al envejecimiento, la demencia asociada a la edad y la enfermedad neurodegenerativa. Una implementación de la descripción incluye el uso de fracciones de plasma sanguíneo como tratamiento, tales como una o más fracciones o efluentes obtenidos de procedimientos de fraccionamiento de sangre, por ejemplo, como el procedimiento de fraccionamiento de Cohn descrito a continuación. La descripción incluye el uso de la Fracción de Plasma (una solución compuesta por albúmina humana normal, alfa y beta globulinas, gammaglobulina y otras proteínas, ya sea individualmente o en forma de complejos, en lo sucesivo denominada "Fracción de Plasma"). Además, la descripción incluye el uso de la Fracción de Proteínas del Plasma (PPF) o la fracción de Solución de Albúmina Humana (HAS) como tratamiento. La descripción incluye el uso de efluentes de procedimientos de fraccionamiento de la sangre tal como el Efluente I o el Efluente II/III descritos a continuación. Además, se puede utilizar una fracción de plasma sanguíneo de la que se han eliminado sustancialmente todos los factores de coagulación con el fin de conservar la eficacia al tiempo que se reduce el riesgo de trombosis (por ejemplo, véase Solicitud de Patente de EE. UU. No. 62/236.710).

Se entiende que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se divulga específicamente. Cada intervalo menor entre cualquier valor declarado o valor intermedio en un intervalo declarado y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse de forma independiente en el intervalo, y cada intervalo en el que uno, ninguno o ambos límites se incluyan en los intervalos más pequeños también se abarcan dentro de la invención, sin perjuicio de cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la invención.

2. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por alguien que tenga conocimientos ordinarios en la técnica. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente invención, se describen ahora algunos procedimientos y materiales potenciales y preferidos.

Cabe señalar que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "el péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por aquellos que tienen habilidad en la técnica, y así sucesivamente.

Al describir los procedimientos, los términos "anfitrión", "sujeto", "individuo" y "paciente" se utilizan indistintamente y se refieren a cualquier mamífero que necesite dicho tratamiento de acuerdo con los procedimientos divulgados. Dichos mamíferos incluyen, por ejemplo, humanos, ovinos, bovinos, equinos, porcinos, caninos, felinos, primates no humanos, ratones y ratas. En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de granja. En otras realizaciones, el sujeto es una mascota. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunos casos, el sujeto es humano. Otros sujetos pueden incluir animales domésticos (por ejemplo, perros y gatos), ganado (por ejemplo, vacas, cerdos, cabras, caballos y similares), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas, por ejemplo, como en los modelos animales de enfermedades), así como primates no humanos (por ejemplo, chimpancés y monos). Como tal, los sujetos incluyen, pero no se limitan a los mamíferos, por ejemplo, seres humanos y otros primates, tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; y similares, donde en ciertas realizaciones el sujeto son los seres humanos. El término sujeto también incluye a una persona u organismo de cualquier edad, peso u otra característica física, donde los sujetos pueden ser un adulto, un niño, un bebé o un recién nacido.

Por "joven" o "individuo joven" se entiende un individuo que tiene una edad cronológica de 40 años o menos, por ejemplo, 35 años o menos, incluso 30 años o menos, por ejemplo, 25 años o menos o 22 años o menos. En algunos casos, el individuo que sirve como fuente del producto sanguíneo que comprende plasma joven es uno que tiene 10 años o menos, por ejemplo, 5 años o menos, incluyendo 1 año o menos. En algunos casos, el sujeto es un recién nacido y la fuente del producto de plasma es el cordón umbilical, donde el producto de plasma se recoge del cordón umbilical del recién nacido. Como tal, "joven" e "individuo joven" pueden referirse a un sujeto que tiene entre 0 y 40 años, por ejemplo, 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 años. En otros casos, "joven" e "individuo joven" pueden referirse a una edad biológica (en contraposición a la cronológica), tal como un individuo que no ha mostrado los niveles de citoquinas inflamatorias en el plasma exhibidos en individuos comparativamente mayores. Por el contrario, estos términos "joven" e "individuo joven" pueden referirse a una edad biológica (en contraposición a la cronológica), tal como en un individuo que presenta mayores niveles de citoquinas antiinflamatorias en el plasma en comparación con los niveles de individuos comparativamente mayores. A modo de ejemplo, y no de limitación, la citoquina inflamatoria es la Eotaxina, y la diferencia de pliegues entre un sujeto o un individuo jóvenes y los individuos mayores es de al menos un 20 %. Del mismo modo, la diferencia de pliegues entre individuos mayores y más jóvenes en otras citocinas inflamatorias puede utilizarse para referirse a una edad biológica. (Véase la Solicitud de Patente de EE. UU. No.

13/575.437). Por lo general, el individuo está sano, por ejemplo, no tiene ninguna neoplasia hematológica o enfermedad autoinmune en el momento de la recolección.

Por "un individuo que padece o corre el riesgo de padecer un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento" se entiende un individuo que se encuentra a más del 50 % de su esperanza de vida, como más del 60 %, por ejemplo, más del 70 %, como más del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o incluso 99 % de su esperanza de vida. La edad del individuo dependerá de la especie en cuestión. Así, este porcentaje es con base en la esperanza de vida prevista para la especie en cuestión. Por ejemplo, en los seres humanos, dicho individuo tiene 50 años o más, por ejemplo, 60 años o más, 70 años o más, 80 años o más, 90 años o más, y normalmente no más de 100 años, tal como 90 años, es decir, entre las edades de aproximadamente 50 y 100, por ejemplo, 50 ... 55... 60... 65... 70... 75... 80... 85... 90... 95... 100 años o más, o cualquier edad entre 50 y 1000, que sufre una condición asociada al envejecimiento como se describe más adelante, por ejemplo, deterioro cognitivo asociado al procedimiento natural de envejecimiento; un individuo que tiene aproximadamente 50 años o más, por ejemplo, 60 años o más, 70 años o más, 80 años o más, 90 años o más, y normalmente no más de 100 años, es decir, entre las edades de aproximadamente 50 y 100, por ejemplo, 50... 55...

60... 65... 70... 75... 80... 85... 90... 95 ... 100 años, que aún no ha empezado a mostrar síntomas de una condición asociada al envejecimiento, por ejemplo, el deterioro cognitivo; un individuo de cualquier edad que sufre un deterioro cognitivo debido a una enfermedad asociada al envejecimiento, como se describe más adelante, y un individuo de cualquier edad al que se le ha diagnosticado una enfermedad asociada al envejecimiento que suele ir acompañada de un deterioro cognitivo, cuando el individuo aún no ha empezado a mostrar síntomas de deterioro cognitivo. Las edades correspondientes para los sujetos no humanos son conocidas y se pretenden aplicar en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" se refiere a cualquiera de (i) la prevención de la enfermedad o trastorno, o (ii) la reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad o trastorno. El tratamiento puede ser profiláctico (antes de la aparición de la enfermedad) o terapéutico (tras la aparición de la enfermedad). El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o total de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. Por lo tanto, el término "tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el envejecimiento en un mamífero, e incluye: (a) evitar que la enfermedad se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla, pero al que aún no se le ha diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar su regresión. El tratamiento puede dar lugar a una variedad de manifestaciones físicas diferentes, por ejemplo, la modulación en la expresión de genes, el rejuvenecimiento de tejidos u órganos, etc. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después de la aparición de la enfermedad. El tratamiento de la enfermedad en curso, donde el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Este tratamiento puede realizarse antes de la pérdida completa de la función de los tejidos afectados. La terapia del sujeto puede ser administrada durante la etapa sintomática de la enfermedad, y en algunos casos después de la etapa sintomática de la enfermedad.

En algunas realizaciones, la condición asociada al envejecimiento que se trata es un deterioro de la capacidad cognitiva asociado al envejecimiento en un individuo. Por capacidad cognitiva, o "cognición", se entienden los procedimientos mentales que incluyen la atención y la concentración, el aprendizaje de tareas y conceptos complejos, la memoria (adquisición, retención y recuperación de nueva información a corto y/o largo plazo), el procesamiento de la información (tratamiento de la información recogida por los cinco sentidos), la función visoespacial (percepción visual, percepción de la profundidad, uso de imágenes mentales, copia de dibujos, construcción de objetos o formas), la producción y comprensión del lenguaje, la fluidez verbal (búsqueda de palabras), la resolución de problemas, la toma de decisiones y las funciones ejecutivas (planificación y establecimiento de prioridades). Por "deterioro cognitivo", se entiende una disminución progresiva de una o más de estas capacidades, por ejemplo, una disminución de la memoria, el lenguaje, el pensamiento, el juicio, etc. Por "un deterioro de la capacidad cognitiva" y "deterioro cognitivo", se entiende una reducción de la capacidad cognitiva en relación con un individuo sano, por ejemplo, un individuo sano de la misma edad, o en relación con la capacidad del individuo en un momento anterior, por ejemplo, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 5 años o 10 años o más antes. Por "deterioro cognitivo asociado al envejecimiento" se entiende un deterioro de la capacidad cognitiva que se asocia típicamente al envejecimiento, incluyendo, por ejemplo, el deterioro cognitivo asociado al procedimiento natural de envejecimiento, por ejemplo, el deterioro cognitivo leve (M.C.I.); y el deterioro cognitivo asociado a un trastorno asociado al envejecimiento, es decir, un trastorno que se observa con mayor frecuencia con el aumento de la senectud, por ejemplo una afección neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la demencia frontotemporal, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, el glaucoma, la distrofia miotónica, la demencia vascular, etc.

Productos sanguíneos con componentes de plasma. En la práctica de los procedimientos del sujeto, los productos sanguíneos que comprenden componentes de plasma son para su uso en el tratamiento de un deterioro cognitivo, en el que el producto sanguíneo que comprende componentes de plasma se administra a un individuo que lo necesita, por ejemplo, un individuo que sufre o está en riesgo de sufrir un deterioro cognitivo y/o demencia relacionada con la edad. Como tal, el uso de un producto sanguíneo incluye la administración de un producto sanguíneo que comprende componentes de plasma de un individuo (el "individuo donante", o "donante") a un individuo que tiene al menos el riesgo de sufrir o padecer deterioro cognitivo y/o demencia relacionada con la edad (el "individuo receptor" o "receptor"). Por "producto sanguíneo con componentes de plasma" se entiende cualquier producto derivado de la sangre que comprenda plasma (por ejemplo, sangre completa, plasma sanguíneo o fracciones de la misma). El término "plasma" se utiliza en su sentido convencional para referirse al componente líquido de color pajizo/amarillo pálido de la sangre, compuesto por aproximadamente 92 % de agua, 7 % de proteínas tales como la albúmina, la gammaglobulina, el factor antihemofílico y otros factores de coagulación, y 1 % de sales minerales, azúcares, grasas, hormonas y vitaminas. Ejemplos no limitantes de productos sanguíneos que comprenden plasma adecuados para su uso en los procedimientos en cuestión incluyen la sangre total tratada con anticoagulantes (por ejemplo, EDTA, citrato, oxalato, heparina, etc.), productos sanguíneos producidos mediante el filtrado de la sangre total para eliminar los glóbulos blancos ("leucorreducción"), productos sanguíneos que consisten en plasma derivado de la plasmaféresis o apéresis, plasma fresco congelado, productos sanguíneos que consisten esencialmente en plasma purificado y productos sanguíneos que consisten esencialmente en fracciones de plasma. En algunos casos, el producto de plasma que se emplea es un producto de plasma no sanguíneo, lo que indica que el producto no es sangre completa, ya que carece de uno o más componentes que se encuentran en la sangre completa, tales como eritrocitos, leucocitos, etc., al menos en la medida en que estos componentes están presentes en la sangre completa. En algunos casos, el producto de plasma es sustancialmente, si no completamente, acelular, donde en tales casos el contenido celular puede ser del 5 % en volumen o menos, tal como 1 % o menos, incluyendo 0,5 % o menos, donde en algunos casos las fracciones de plasmas acelulares son aquellas composiciones que carecen completamente de células, es decir, no incluyen células.

Recolección de productos sanguíneos con componentes de plasma. El uso de los productos sanguíneos descritos en el presente documento incluye la administración de productos sanguíneos que comprenden componentes de plasma que pueden proceder de donantes, incluyendo voluntarios humanos. El término "de origen humano" puede referirse a estos productos. Los procedimientos de obtención de plasma que comprende productos sanguíneos de los donantes son bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, AABB Te CHNICAL mAn UAL, (Mark A. Fung, et al., eds., 18a ed. 2014)).

En una realización, las donaciones se obtienen por venopunción. En otra realización, la venopunción es una única venopunción. En otra realización, no se emplea el reemplazo de volumen de solución salina. En una realización, se utiliza el procedimiento de plasmaféresis para obtener el plasma que comprende los productos sanguíneos. La plasmaféresis puede comprender en la extracción de un volumen de plasma ajustado al peso con la devolución de componentes celulares al donante. En la realización, se utiliza citrato de sodio durante la plasmaféresis para evitar la coagulación de las células. El volumen de plasma recogido de un donante está preferentemente entre 690 y 880 ml después de la administración de citrato, y se coordina preferentemente con el peso del donante.

3. Fracciones del plasma sanguíneo

Durante la Segunda Guerra Mundial, surgió la necesidad de un expansor de plasma estable que pudiera ser empleado en el campo de batalla cuando los soldados perdían grandes cantidades de sangre. Como resultado, se desarrollaron procedimientos de preparación de plasma liofilizado. Sin embargo, el uso del plasma liofilizado era difícil en situaciones de combate, ya que la reconstitución requería agua estéril. Como alternativa, el Dr. E.J. Cohn sugirió que se podía utilizar la albúmina y preparó una solución estable lista para usar que podía introducirse inmediatamente para el tratamiento del choque. (Véase JOHAN VANDERSANDE, CURRENT APPROACHES TO THE PREPARATION OF PLASMA FRACTIONS in (BIOTECHNOLOGY OF BLOOD) 165 (Jack Goldstein ed., 1st ed.) 1991)). El procedimiento del Dr. Cohn para purificar las fracciones de plasma utilizó etanol frío por su efecto desnaturalizador, y emplea cambios de pH y temperatura para lograr la separación.

Los productos sanguíneos descritos en el presente documento para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen la administración de fracciones de plasma a un sujeto. El fraccionamiento es el procedimiento por el que se separan ciertos subconjuntos de proteínas del plasma. La tecnología de fraccionamiento es conocida en la técnica y se basa en los pasos desarrollados por Cohn et a/. durante la década de 1940. (E. Cohn, Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. 68 J Am Chem Soc 459 (1946)). En este procedimiento intervienen varios pasos, cada uno de los cuales implica concentraciones específicas de etanol, así como cambios de pH, temperatura y osmolalidad que dan lugar a una precipitación selectiva de las proteínas. Los precipitados también se separan mediante centrifugación o precipitación. El "procedimiento de fraccionamiento de Cohn" original implicaba la separación de las proteínas a través de precipitados en cinco fracciones, designadas como fracción I, fracción II+NI, fracción IV-1, fracción IV-4 y fracción V. La albúmina era el producto final originalmente identificado (fracción V) de este procedimiento. Cada fracción (o efluente de un paso de separación previa) contiene o puede contener fracciones proteicas de utilidad terapéutica. (Véase Thierry Bumouf, Modern Plasma Fractionation, 21(2) Transfusion Medicine Reviews 101 (2007) Adil Denizli, Plasma fractionation: conventional and chromatographic methods for albumin purification, 4 J. Biol. & Chem. 315, (2011); y T. Brodniewicz-Proba, Human Plasma Fractionation and the Impact of New Technologies on the Use and Quality of Plasma-derived Products, 5 Blood Reviews 245 (1991), y la Patente de EE. UU. No. 3869431, 5110907, 5219995, 7531513y 8772461). Se pueden ajustar los parámetros experimentales anteriores para obtener fracciones de proteínas específicas.

Más recientemente, el fraccionamiento ha alcanzado una mayor complejidad. Este reciente aumento de la complejidad se ha producido a través de: la introducción de la cromatografía, que ha dado lugar al aislamiento de nuevas proteínas a partir de fracciones existentes como el crioprecipitado, el plasma criopotenciado y las fracciones de Cohn; el aumento de la recuperación de IgG mediante la integración de la cromatografía y el procedimiento de fraccionamiento en etanol; y la reducción/inactivación/eliminación viral. (Id.) Para capturar las proteínas a pH fisiológico y fuerza iónica, se puede utilizar la cromatografía de intercambio aniónico. Esto preserva la actividad funcional de las proteínas y/o las fracciones de proteínas. La heparina y los anticuerpos monoclonales también se utilizan en la cromatografía de afinidad. Un experto en la técnica reconocerá que los parámetros descritos anteriormente pueden ajustarse para obtener fracciones que contengan proteínas de plasmas específicamente deseadas.

En una realización de la divulgación, el plasma sanguíneo se fracciona en un entorno industrial. El plasma congelado se descongela entre 1 °C y 4 °C. Se aplica una centrifugación refrigerada continua al plasma descongelado y se aísla el crioprecipitado. El crioprecipitado recuperado se congela a -30 °C o menos y se almacena. El plasma pobre en crioprecipitado ("criopobre") se procesa inmediatamente para la captura (mediante, por ejemplo, cromatografía primaria) de factores de coagulación lábiles tales como el complejo del factor IX y sus componentes, así como de inhibidores de la proteasa tales como la antitrombina y el inhibidor de la esterasa C1. La centrifugación en serie y el aislamiento del precipitado pueden aplicarse en pasos posteriores. Dichas técnicas son conocidas por un experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU. Nos. 4624780, 5219995, 5288853y Solicitudes de Patente de EE. UU. Nos. 20140343255 y 20150343025.

En una realización de la divulgación, la fracción de plasma puede comprender una fracción de plasma que contenga una concentración sustancial de albúmina. En otra realización, la fracción de plasma puede comprender una fracción de plasma que contenga una concentración sustancial de IgG o inmunoglobulina intravenosa (IGIV) (por ejemplo, Gamunex-C®). En otra realización, la fracción de plasma puede comprender una fracción de plasma de IGIV, tal como Gamunex-C®, que ha sido sustancialmente reducida de inmunoglobulina (IgG) por procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica, tal como por ejemplo, la reducción mediada por la proteína A. (Véase Keshishian, H., et al., Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury, Molecular & Cellular Proteomics, 14 at 2375-93 (2015)). En una realización adicional, la fracción de plasma sanguíneo puede ser una en la que se eliminen sustancialmente todos los factores de coagulación para conservar la eficacia de la fracción con un riesgo reducido de trombosis. Por ejemplo, la fracción de plasma puede ser una fracción de plasma como se describe en la Patente de EE. UU. No. 62/376.529 presentada el 18 de agosto de 2016.

4. Productos de albúmina

Para aquellos que tienen una habilidad ordinaria en la técnica, hay dos categorías generales de Productos de Plasma de Albúmina ("APP"): fracción de proteína de plasma (PPF) y solución de albúmina humana (HAS). La PPF se deriva de un procedimiento con un mayor rendimiento que la HAS, pero tiene una pureza mínima de albúmina menor que la HAS (>83 % para la PPF y > 95 % para la HAS). (Production of human albumin solution: a continually developing colloid, P. Matejtschuk et al., British J. of Anaesthesia 85(6): 887-95, en 888 (2000)). Además, algunos han señalado que la PPF tiene una desventaja debido a la presencia de "contaminantes" proteicos tal como PKA. Id. Como consecuencia, los preparados de PPF han perdido popularidad como Productos de Plasma de Albúmina, e incluso han sido retirados de las farmacopeas de algunos países. Id. En contra de estas preocupaciones, la divulgación hace un uso beneficioso de estos "contaminantes" Además de las a, p y y globulinas, así como la mencionada PKA, los procedimientos divulgados utilizan proteínas adicionales u otros factores dentro de los "contaminantes" que promueven procedimientos tales como la neurogénesis, la supervivencia de las células neuronales y la mejora de la cognición.

Los expertos en la técnica reconocerán que existen, o han existido, varias fuentes comerciales de PPF (los "Preparados Comerciales de PPF") Entre ellos se encuentran Plasma-Plex™ PPF (Armour Pharmaceutical Co., Tarrytown, NY), Plasmanate™ PPF (Grifols, Clayton, NC), Plasmatein™ (Alpha Therapeutics, Los Ángeles, CA) y Protenate™ p Pf (Baxter Labs, Inc. Deerfield, IL).

Los expertos en la técnica también reconocerán que existen, o han existido, varias fuentes comerciales de HAS (los "Preparados Cmerciales de HAS") Entre ellos se encuentran Albuminar™ (CSL Behring), AlbuRx™ (CSL Behring), Albutein™ (Grifols, Clayton, NC), Buminate™ (Baxatla, Inc., Bannockburn, IL), Flexbumin™ (Baxatla, Inc., Bannockburn, IL) y Plasbumin™ (Grifols, Clayton, NC).

A. Fracción de Proteína de Plasma (Humana) (PPF)

De acuerdo con la United States Food and Drug Administration ("FDA"), "Fracción de Proteína de Plasma (humana)", o PPF, es el nombre propio del producto definido como "una solución estéril de proteína compuesta de albúmina y globulina, derivada del plasma humano" (Code of Federal Regulations "CFR" 21 CFR 640.90). El material fuente de PPF es plasma recuperado de Sangre Total preparada como se prescribe en 21 CFR 640.1 - 640.5, o Plasma Fuente preparado como se prescribe en 21 CFR 640.60 - 640.76.

La PPF se somete a pruebas para determinar si cumple con las siguientes normas según 21 CFR 640.92:

(a) El producto final será una solución de proteínas del 5,0 /- 0,30 por ciento; y

(b) La proteína total del producto final consistirá en un mínimo del 83 por ciento de albúmina y un máximo del 17por ciento de globulinas. No más del 1por ciento de la proteína total será gammaglobulina. La composición proteica se determina mediante un procedimiento que ha sido aprobado para cada fabricante por el Director del Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration.

Tal como se utiliza en el presente documento, la "Fracción de Proteína de Plasma" o "PPF" se refiere a una solución estéril de proteína compuesta por albúmina y globulina, derivada del plasma humano, con un contenido de albúmina de al menos el 83 % con no más del 17 % de globulinas (incluyendo a l, a2, p y y globulinas) y otras proteínas de plasmas, y no más del 1 % de gamma globulina según lo determinado por electroforesis. (Hink, J.H., Jr. y otros, Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction, VOX SANGUINIS 2(174) (1957)). La PPF también puede referirse a una forma sólida, que cuando se suspende en el disolvente, tiene una composición similar. La fracción de globulina total puede determinarse restando la albúmina de la proteína total. (Busher, J., Serum Albumin and Globulin, CLINICAL METHODS: THE HISTORY, PHYSICAL, AND LABORATORY EXAMINATIONS, Capítulo 10, Walker HK, Hall WD, Hurst JD, eds. (1990)).

B. Albúmina (Humana) (HAS)

De acuerdo con la FDA, "Albúmina (Humana)" (también referida en el presente documento como "HAS") es el nombre propio del producto definido como "solución estéril de la albúmina derivada del plasma humano" (Code of Federal Regulations "CFR" 21 CFR 640.) El material fuente para la Albúmina (Humana) es el plasma recuperado de la Sangre Completa preparada como se prescribe en 21 CFR 640.1-640.5, o el Plasma Fuente preparado como se prescribe en 21 CFR 640.60-640.76. Otros requisitos para la albúmina (humana) se enumeran en 21 CFR 640.80 - 640.84.

La albúmina (humana) se somete a pruebas para determinar si cumple con las siguientes normas según 21 CFR 640.82:

(a) Concentración de proteínas. El producto final deberá ajustarse a una de las siguientes concentraciones: 4,0 /-0,25 por ciento; 5,0 /-0,30 por ciento; 20,0 /-1,2 por ciento; y 25,0 /-1,5 por ciento de solución de proteínas.

(b) Composición proteica. Al menos el 96 por ciento de la proteína total del producto final deberá ser albúmina, según un procedimiento que haya sido aprobado para cada fabricante por el Director del Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration.

Tal como se utiliza en el presente documento, "Albúmina (Humana)" o "HAS" se refiere a una solución estéril de proteína compuesta por albúmina y globulina, derivada del plasma humano, con un contenido de albúmina de al menos el 95 %, con no más del 5 % de globulinas (incluyendo a1, a2, p y y globulinas) y otras proteínas de plasma. La HAS también puede referirse a una forma sólida, que cuando se suspende en el disolvente, tiene una composición similar. La fracción de globulina total puede determinarse restando la albúmina de la proteína total.

Como puede reconocer una persona que tiene conocimientos ordinarios en la técnica, las fracciones de PPF y HAS también pueden ser liofilizadas o en otra forma sólida. Dichas preparaciones, con los aditivos adecuados, pueden utilizarse para hacer tabletas, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo. La forma sólida puede formularse en preparados para inyección disolviéndolos, suspendiéndolos o emulsionándolos en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes.

5. Fracciones Reducidas por el Factor de Coagulación

En la divulgación se utiliza una fracción de plasma sanguíneo de la que se eliminan sustancialmente todos los factores de coagulación para conservar la eficacia de la fracción con un riesgo reducido de trombosis. Convenientemente, el producto sanguíneo puede proceder de un donante joven o de un grupo de donantes jóvenes, y puede ser desprovisto de IgM para proporcionar un producto sanguíneo joven que sea compatible con ABO. En la actualidad, el plasma que se transfunde se ajusta al tipo de sangre ABO, ya que la presencia de anticuerpos naturales contra los antígenos A y B puede provocar reacciones a la transfusión. IgM parece ser la responsable de las reacciones transfusionales cuando los pacientes reciben plasma que no es ABO compatible. La eliminación de IgM de los productos o fracciones sanguíneas ayuda a eliminar las reacciones de transfusión en los sujetos a los que se les administran los productos sanguíneos y las fracciones de plasma sanguíneo.

En consecuencia, se divulgan productos sanguíneos para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una condición relacionada con el envejecimiento, tal como el deterioro cognitivo o la neurodegeneración en un sujeto. El procedimiento comprende: administrar al sujeto un producto o una fracción sanguíneos derivada de la sangre total de un individuo o grupo de individuos, en el que el producto o la fracción sanguíneos está sustancialmente desprovisto de (a) al menos un factor de coagulación y/o (b) IgM. En algunas realizaciones, los individuos de los que se deriva el producto o la fracción sanguíneos son individuos jóvenes. En algunas realizaciones, el producto sanguíneo está sustancialmente desprovisto de al menos un factor de coagulación y de IgM. En ciertas realizaciones, el producto sanguíneo está sustancialmente desprovisto de fibrinógeno (Factor I). En otras realizaciones, el producto sanguíneo carece sustancialmente de eritrocitos y/o leucocitos. En otras realizaciones, el producto sanguíneo es sustancialmente acelular. En otras realizaciones, el producto sanguíneo se deriva del plasma. Tales realizaciones se divulgan además en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 62/376.529 presentada el 18 de agosto de 2016.

6. Productos Proteicos de Plasma Enriquecido con Proteínas

Otras realizaciones utilizan fracciones de plasma con una concentración reducida de albúmina en comparación con la PPF, pero con mayores cantidades de globulinas y otras proteínas de plasma (lo que ha sido denominado por algunos como "contaminantes"). Las realizaciones, al igual que la PPF, la HAS, el Efluente I y el Efluente II/IN carecen efectivamente de factores de coagulación. Estas fracciones de plasma se denominan en lo sucesivo "productos proteicos de plasma enriquecidos con proteínas". Por ejemplo, puede utilizarse un producto proteico de plasma enriquecido con proteínas compuesto por 82 % de albúmina y 18 % de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otra realización de la descripción se puede utilizar un producto proteico de plasma enriquecido con proteínas, compuesto por 81 % de albúmina y 19 % de a, p y y globulinas y/o otras proteínas de plasma. En otra realización se puede utilizar un producto proteico de plasma enriquecido con proteínas compuesto por 80 % de albúmina y 20 % de a, p y y globulinas y/o otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteínas, compuestos por 70-79 % de albúmina y un 21-30 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteínas, compuestos por 60-69 % de albúmina y un 31-40 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteinas, compuestos por 50-59 % de albúmina y un 41-50 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteinas, compuestos por 40-49 % de albúmina y un 51-60 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasmas. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteinas, compuestos por 30-39 % de albúmina y un 61-70 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteínas, compuestos por 20-29 % de albúmina y un 71-80 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteinas, compuestos por 10-19 % de albúmina y un 81-90 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. En otras realizaciones se pueden utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteínas, compuestos por 1-9 % de albúmina y un 91-99 % correspondiente de a, p y y globulinas y otras proteínas de plasma. Otra realización puede utilizar productos proteicos de plasma enriquecidos con proteínas, compuestos por 0-1 % de albúmina y 99-100 % de a, p y Y globulinas y otras proteínas de plasma.

Las realizaciones descritas anteriormente también pueden tener concentraciones totales de gammaglobulina de 0-5 %.

Las concentraciones específicas de proteínas en una fracción de plasma pueden determinarse mediante técnicas bien conocidas por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. A modo de ejemplo, y no como limitación, dichas técnicas incluyen la electroforesis, la espectrometría de masas, el análisis ELISA y el análisis Western blot.

7. Preparación de Fracciones de Plasma Sanguíneo

Los procedimientos de preparación de PPF y de otras fracciones de plasma son bien conocidos por quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Una realización de la descripción permite que la sangre utilizada en la preparación de la fracción de proteínas del plasma humano se recoja en frascos con solución de citrato o anticoagulante de dextrosa para la inhibición de la coagulación, con la posterior separación de las Fracciones I, II III, IV y PPF según el procedimiento divulgado en Hink et al. (Véase Hink, J.H., Jr., et al., Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction, Vox SANGUINIS 2(174) (1957),). De acuerdo con este procedimiento, la mezcla puede recogerse a 2-8 °C. A continuación, el plasma puede separarse por centrifugación a 7 °C, extraerse y almacenarse a -20 °C. El plasma puede entonces descongelarse a 37°C y fraccionarse, preferentemente dentro de las ocho horas siguientes a su extracción del almacenamiento a -20 °C.

El plasma puede separarse de la Fracción I utilizando etanol al 8 % a pH 7,2 y una temperatura de -2 a -2,5 °C con una concentración de proteínas de 5,1 a 5,6 por ciento. Se puede añadir etanol frío al 53,3 % (176 ml/l de plasma) con tampón de acetato (200 ml de acetato de sodio 4M, 230 ml de ácido acético glacial quantum satis a 1 l con H²O) mediante chorros a una tasa, por ejemplo, de 450 ml/minuto durante la bajada de la temperatura del plasma a -2°C. La Fracción I puede separarse y eliminarse del efluente (efluente I) mediante ultracentrifugación. El fibrinógeno puede obtenerse a partir de la Fracción I según procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.

La fracción II III puede separarse del Efluente I mediante el ajuste del efluente al etanol al 21 por ciento a pH 6,8, temperatura a -6 °C, con una concentración de proteínas del 4,3 por ciento. Se puede añadir etanol frío al 95 por ciento (176 ml/l de Efluente I) con ácido acético 10 M utilizado para el ajuste del pH utilizando chorros a una tasa, por ejemplo, de 500 ml/minuto durante la disminución de la temperatura del Efluente I a -6°C. El precipitado resultante (Fracción II III) puede eliminarse por centrifugación a -6°C. La gammaglobulina puede obtenerse a partir de la Fracción II III utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.

La Fracción IV-1 puede separarse del Efluente II III ("Efluente II/IN") mediante el ajuste del efluente al 19 por ciento de etanol a pH 5,2, temperatura a -6°C y concentración de proteínas del 3 por ciento. E1H²O y el ácido acético 10 M utilizados para el ajuste del pH pueden añadirse mediante chorros mientras se mantiene el Efluente II/III a -6°C durante 6 horas. La Fracción VI-1 precipitada puede sedimentarse a -6°C durante 6 horas y posteriormente separarse del efluente por centrifugación a la misma temperatura. La fracción de proteínas de plasma estables puede recuperarse a partir del efluente IV-1 mediante el ajuste de la concentración de etanol al 30 por ciento a un pH de 4,65, una temperatura de -7° C y una concentración de proteínas del 2,5por ciento. Esto puede lograrse ajustando el pH del Efluente IV-1 con ácido-alcohol frío (dos partes de ácido acético 2 M y una parte de etanol al 95por ciento). Manteniendo una temperatura de -7°C, a cada litro de efluente IV-1 ajustado se le añaden 170 ml de etanol frío (95 %). Las proteínas que precipitan pueden dejarse sedimentar durante 36 horas y posteriormente eliminarse por centrifugación a -7 °C.

Las proteínas recuperadas (fracción de proteínas de plasma estables) pueden secarse (por ejemplo, mediante liofilización) para eliminar el alcohol y el H²O. El polvo seco resultante puede disolverse en agua destilada estéril, por ejemplo, utilizando 15 litros de agua/kg de polvo, con la solución ajustada a pH 7,0 con NaOH 1 M. Se puede conseguir una concentración final del 5por ciento de proteínas añadiendo agua destilada estéril que contenga acetil-triptófano de sodio, caprilato de sodio y NaCl, ajustando a concentraciones finales de 0,004 M de acetil-triptófano, 0,004 M de caprilato y 0,112 M de sodio. Por último, la solución puede filtrarse a 10 °C para obtener una solución clara y, posteriormente, tratarse térmicamente para inactivar los patógenos a 60 °C durante al menos 10 horas.

Una persona que tiene conocimientos ordinarios en la técnica reconocería que cada una de las diferentes fracciones y efluentes descritos anteriormente podría utilizarse con los procedimientos para tratar la enfermedad. Por ejemplo, y no a modo de limitación, los Efluentes I o Efluentes II/III pueden utilizarse para tratar enfermedades tales como trastornos cognitivos y neurodegenerativos y son realizaciones de la divulgación.

Los procedimientos precedentes de preparación de fracciones de plasma sanguíneo y fracción de proteínas de plasma (PPF) son sólo ejemplares e implican meramente realizaciones de la divulgación. Una persona que tiene conocimientos ordinarios en la técnica reconocería que estos procedimientos pueden variar. Por ejemplo, el pH, la temperatura y la concentración de etanol, entre otras cosas, pueden ajustarse para producir diferentes variaciones de las fracciones de plasma y de la fracción de proteínas del plasma en las diferentes realizaciones y procedimientos. En otro ejemplo, otras realizaciones contemplan el uso de la nanofiltración para la eliminación/inactivación de patógenos de las fracciones de plasma y de la fracción de proteínas del plasma.

Una realización adicional contempla procedimientos y composición que utilizan y/o comprenden fracciones adicionales de plasma sanguíneo. Por ejemplo, la descripción, entre otras cosas, demuestra que las concentraciones específicas de albúmina no son críticas para mejorar la actividad cognitiva. Por lo tanto, las fracciones con una concentración reducida de albúmina, tal como las fracciones que tienen menos del 83 % de albúmina, están contempladas en la divulgación.

8. Tratamiento

En el presente documento se describe un producto sanguíneo que comprende plasma, tal como una fracción de plasma sanguíneo, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de un sujeto. Una realización incluye el uso en el tratamiento de un sujeto humano con un producto sanguíneo que comprende plasma. Un experto en la técnica reconocería que el uso de plasma que comprende productos sanguíneos en los procedimientos de tratamiento de los sujetos está reconocido en la técnica. A modo de ejemplo, y no de limitación, una realización descrita en el presente documento consiste en administrar plasma fresco congelado a un sujeto para el tratamiento y/o la prevención del deterioro cognitivo y/o la demencia relacionada con la edad. En una realización, el plasma que comprende el producto sanguíneo se administra inmediatamente, por ejemplo, dentro de las 12-48 horas siguientes a la recogida de un donante, al individuo que sufre o corre el riesgo de sufrir un deterioro cognitivo y/o una demencia relacionada con la edad. En estos casos, el producto puede almacenarse bajo refrigeración, por ejemplo, a 0-10 °C. En otra realización, el plasma fresco congelado es aquel que ha sido almacenado congelado (criopreservado) a -18 °C o más frío. Antes de su administración, el plasma fresco congelado se descongela y, una vez descongelado, se administra al sujeto entre 60 y 75 minutos después de iniciado el procedimiento de descongelación. Cada sujeto recibe preferentemente una sola unidad de plasma fresco congelado (200-250 ml), el plasma fresco congelado proviene preferentemente de donantes de un intervalo de edad predeterminado. En una realización, el plasma fresco congelado es donado por (derivado de) individuos jóvenes. En otra realización, el plasma fresco congelado es donado por (derivado de) donantes del mismo sexo. En otra realización, el plasma fresco congelado es donado por (derivado de) donantes del intervalo de edad entre 18-22 años. En una realización, los sujetos son tratados dos veces por semana con 3-4 días entre infusiones. En una realización, el tratamiento persiste hasta que se alcanza un punto final específico.

En una realización, el plasma que comprende los productos sanguíneos es cribado después de la donación por el tipo de sangre. En otra realización, el plasma que comprende los productos sanguíneos se somete a un cribado para detectar agentes de enfermedades infecciosas tales como VIH I y II, VHB, VHC, HTLV I y II, anti-HBc según los requisitos de 21 CFR 640.33 y las recomendaciones contenidas en los documentos de orientación de la FDA.

En otra realización, el sujeto es tratado con una "Fracción de Plasma" En una realización, la Fracción de Plasma es PPF o HAS. En otra realización, la Fracción de Plasma es uno de los Preparados Comerciales PPF de los Preparados Comerciales HAS. En otra realización, la Fracción de Plasma es una PPF o HAS derivada de un grupo de individuos de un intervalo de edad específico, tales como individuos jóvenes, o es una fracción PPF o HAS modificada que ha sido sometida a un fraccionamiento o procesamiento adicional (por ejemplo, PPF o HAS con una o más proteínas específicas eliminadas parcial o sustancialmente). En otra realización, la Fracción de Plasma es una fracción de plasma de IGIV que ha sido substancialmente despojada de inmunoglobulina (IgG). Una fracción sanguínea que está "sustancialmente agotada" o que tiene proteínas específicas "sustancialmente eliminadas", tal como la IgG, se refiere a una fracción sanguínea que contiene menos del 50 % de la cantidad que se encuentra en el producto de referencia o en el plasma sanguíneo completo, tal como menos del 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,1 %, niveles indetectables, o cualquier número entero entre estos valores, medidos mediante ensayos estándar bien conocidos en la técnica.

9. Monitorización

La presente divulgación se refiere a procedimientos de monitorización del efecto de una medicación en un sujeto para tratar el deterioro cognitivo y/o la demencia relacionada con la edad, comprendiendo el procedimiento la comparación de la función cognitiva antes y después del tratamiento. Los expertos en la técnica reconocen que existen procedimientos bien conocidos para evaluar la función cognitiva. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el procedimiento puede comprender la evaluación de la función cognitiva con base en la historia clínica, los antecedentes familiares, los exámenes físicos y neurológicos realizados por clínicos especializados en demencia y función cognitiva, las pruebas de laboratorio y la evaluación neuropsicológica. Otras realizaciones son: la evaluación del estado de conciencia, tal como la escala de coma de Glasgow (EMV); el examen del estado mental, incluyendo la puntuación abreviada de la prueba mental (AMTS) o el miniexamen del estado mental (MMSE) (Folstein et al., J. Psychiatr. Res 1975; 12:1289-198); la evaluación global de las funciones superiores; la estimación de la presión intracraneal, por ejemplo, mediante fundoscopia.

En una realización, los exámenes del sistema nervioso periférico pueden utilizarse para evaluar la función cognitiva, incluyendo uno cualquiera de los siguientes: sentido del olfato, campos visuales y agudeza, movimientos oculares y pupilas (simpáticos y parasimpáticos), función sensorial de la cara, fuerza de los músculos faciales y de la cintura escapular, audición, gusto, movimiento y reflejo faríngeo, movimientos de la lengua, que pueden probarse individualmente (por ejemplo, la agudeza visual puede probarse mediante una tabla de Snellen; un martillo de reflejos utilizado para probar los reflejos, incluyendo el tendón del masetero, del bíceps y del tríceps, el tendón de la rodilla, el tirón del tobillo y el plantar (es decir, el signo de Babinski); la fuerza muscular, a menudo en la escala MRC de 1 a 5; el tono muscular y los signos de rigidez).

10. Administración

Se puede administrar al sujeto una fracción de plasma sanguíneo. En una realización, la fracción de plasma sanguíneo se administra por infusión intravenosa. La tasa de infusión puede variar, pero en una realización, la tasa de infusión es de 5-8 ml/minuto. Quienes tengan conocimientos ordinarios de la técnica reconocerán que la tasa de infusión puede depender del estado del sujeto y de su respuesta a la administración.

En aquellas realizaciones en las que una cantidad efectiva de un agente activo debe administrarse al mamífero adulto, la cantidad o dosis es efectiva cuando se administra durante un periodo de tiempo adecuado, tal como una semana o más, incluyendo dos semanas o más, tal como 3 semanas o más, un mes o más, 2 meses o más, 3 meses o más, 4 meses o más, 5 meses o más, 6 meses o más, 1 año o más, etc., para evidenciar una reducción de la condición, por ejemplo, el deterioro cognitivo, o el retraso del deterioro cognitivo y/o la mejora cognitiva en el mamífero adulto. Por ejemplo, una dosis efectiva es la dosis que, cuando se administra durante un periodo de tiempo adecuado, ralentizará, por ejemplo, aproximadamente20 % o más, por ejemplo, en un 30 % o más, en un 40 % o más, o en un 50 % o más, en algunos casos en un 60 % o más, en un 70 % o más, en un 80 % o más, o en un 90 % o más. Por ejemplo, detendrá el declive cognitivo de un paciente que sufre un envejecimiento natural o un trastorno asociado al envejecimiento. En algunos casos, una cantidad o dosis eficaz del producto sanguíneo no sólo ralentizará o detendrá la progresión de la enfermedad, sino que también inducirá la reversión de la misma, es decir, provocará una mejora de la capacidad cognitiva. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz es la cantidad que, cuando se administra durante un periodo de tiempo adecuado, normalmente al menos una semana, y tal vez dos semanas, o más, hasta una persona de aproximadamente 3 semanas, 4 semanas, 8 semanas o más, mejorará las capacidades cognitivas de un individuo que sufre un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento en, por ejemplo, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, en algunos casos 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces o más en relación con la cognición antes de la administración del producto o fracción sanguínea. En algunos casos, una cantidad o dosis efectiva de agente activo no sólo ralentizará o detendrá la progresión de la condición de la enfermedad, sino que también inducirá la reversión de la condición, es decir, causará una mejora en la función cognitiva. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad efectiva es la cantidad que cuando se administra durante un período de tiempo adecuado, mejorará los síntomas de un individuo que sufre de deterioro cognitivo o deficiencia, por ejemplo 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, en algunos casos 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o 10 veces o más en relación con los individuos no tratados antes de la administración del agente.

En otras realizaciones, la fracción de plasma sanguíneo o Fracción de Plasma debe administrarse de acuerdo con uno o más regímenes de dosificación descritos en Solicitud de Patente de EE. UU. No. 62/490.519. Como tal, una realización incluye el tratamiento de un sujeto diagnosticado con un deterioro cognitivo mediante la administración al sujeto de una cantidad efectiva de plasma sanguíneo o Fracción de Plasma en la que el plasma sanguíneo o la Fracción de Plasma se administra de una manera que resulta en la mejora de la función cognitiva o la neurogénesis después de que la media o la mediana de la vida media de las proteínas del plasma sanguíneo o de las proteínas de la Fracción de Plasma se ha alcanzado, en relación con la dosis administrada más reciente (referido como "Dosis Pulsada" o "Pulso Dosificado" en el presente documento). Otra realización incluye la administración del plasma sanguíneo o de la Fracción de Plasma mediante un régimen de dosificación de al menos dos días consecutivos y la monitorización del sujeto para comprobar la mejora de la función cognitiva al menos 3 días después de la fecha de la última administración. Otra realización incluye la administración del plasma sanguíneo o de la Fracción de Plasma mediante un régimen de dosificación de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días consecutivos y la monitorización del sujeto para comprobar la mejora de la función cognitiva al menos 3 días después de la fecha de la última administración. Otra realización más incluye la administración del plasma sanguíneo o de la Fracción de plasma mediante un régimen de dosificación de al menos 2 días consecutivos y después de la fecha de la última administración, la monitorización de la mejora cognitiva más allá de cuando se haya alcanzado la vida media de las proteínas en el plasma sanguíneo o la Fracción de plasma. Otra realización incluye la administración del plasma sanguíneo o de la Fracción de Plasma a través de un régimen de dosificación de 2 a 14 días no consecutivos en los que cada intervalo entre las dosis puede ser de entre 0 y 3 días. En algunos casos, la Dosificación Pulsada incluye la administración de un primer conjunto de dosis, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, seguido de un periodo sin dosificación, por ejemplo, un "periodo sin dosis", que a su vez es seguido por la administración de otra dosis o conjunto de dosis. La duración de este periodo "libre de dosificación" puede variar, pero en algunas realizaciones, es de 7 días o más, tal como 10 días o más, incluyendo 14 días o más, en algunos casos el periodo libre de dosificación oscila entre 15 y 365 días, tal como 30 a 90 días e incluyendo 30 a 60 días. Como tal, las realizaciones de los procedimientos incluyen la dosificación no crónica (es decir, no continua), por ejemplo, la administración no crónica de un producto de plasma sanguíneo. En algunas realizaciones, el patrón de Dosificación Pulsada seguida de un período sin dosificación se repite durante un número de veces, según se desee, donde en algunos casos esta pauta se continúa durante 1 año o más, como 2 años o más, hasta e incluyendo la vida del sujeto. El plasma sanguíneo o la Fracción de Plasma pueden administrarse mediante un régimen de dosificación de 5 días consecutivos, con un periodo libre de dosificación de 2-3 días, seguido de la administración durante 2-14 días consecutivos.

Bioquímicamente, por una "cantidad efectiva" o "dosis efectiva" de agente activo se indica una cantidad de agente activo que inhibirá, antagonizará, disminuirá, reducirá o suprimirá en aproximadamente 20 % o más, por ejemplo en un 30 % o más, en un 40 % o más, o en un 50 % o más, en algunos casos en un 60 % o más, en un 70 % o más, en un 80 % o más, o en un 90 % o más, en algunos casos en un 100 % aproximadamente, es decir, hasta cantidades insignificantes, y en algunos casos, invertir la progresión del deterioro cognitivo o de la demencia asociada a la edad.

11. Fracción de Proteínas de Plasma

Se puede administrar una fracción de plasma al sujeto. La fracción de plasma utilizada en los procedimientos divulgados puede ser la fracción de proteínas de plasma (PPF). La PPF puede seleccionarse entre los preparados comerciales de PPF.

En otra realización, el PPF está compuesto por un 88 % de albúmina humana normal, un 12 % de alfa y beta globulinas y no más de un 1 % de gammaglobulina, según lo determinado por electroforesis. Las realizaciones de esta realización incluyen, por ejemplo, esta realización como una solución al 5 % de PPF tamponada con carbonato de sodio y estabilizada con caprilato de sodio 0,004 M y acetiltriptófano 0,004 M. Pueden utilizarse otras formulaciones, incluyendo las que modifican el porcentaje de PPF (por ejemplo, aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 20 % a 25 %, aproximadamente 25 % a 30 %)en la solución, así como las concentraciones de disolvente y estabilizadores.

12. Fracciones de Plasma de la Edad Específica del Donante

Una realización de la divulgación incluye la administración de una fracción de plasma sanguíneo o una Fracción de Plasma derivada del plasma de individuos de ciertos intervalos de edad. Otras realizaciones incluyen la administración de una fracción de proteína de plasma derivada del plasma de individuos de determinados intervalos de edad. Una realización incluye la administración de un PPF o una HAS que se ha derivado del plasma de individuos jóvenes. En otra realización, los individuos jóvenes son de una sola edad específica o de un intervalo de edad específico. En otra realización, la edad media de los donantes es menor que la del sujeto o menor que la edad media de los sujetos en tratamiento.

Ciertas realizaciones incluyen la agrupación de sangre o plasma sanguíneo de individuos de intervalos de edad específicos y el fraccionamiento del plasma sanguíneo como se ha descrito anteriormente para obtener un producto de fracción de proteína de plasma tal como PPF o HAS. En una realización alternativa, la fracción de proteínas de plasma o la fracción específica de proteínas de plasma se obtiene de individuos específicos que se ajustan a un intervalo de edad específico. En otra realización, la fracción de plasma sanguíneo, la Fracción de Plasma o el producto de la fracción de proteína de plasma específica se obtiene de un grupo de individuos jóvenes, de los cuales "joven" puede ser determinado por la edad cronológica o biológica como se describe anteriormente, y las edades de los individuos puede ser una edad específica o intervalo de edad.

13. Indicaciones

Los procedimientos del sujeto y los productos sanguíneos que contienen plasma y sus fracciones se utilizan en el tratamiento, incluyendo la prevención, de las condiciones asociadas con el envejecimiento, tales como el deterioro de la capacidad cognitiva de los individuos, por ejemplo, los trastornos cognitivos, incluyendo (pero no limitado a) la demencia asociada con la edad, las condiciones inmunológicas, el cáncer y el deterioro físico y funcional. Los individuos que sufren o corren el riesgo de desarrollar un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento y que se beneficiarán del tratamiento con el producto sanguíneo que comprende plasma, por ejemplo, mediante los procedimientos divulgados en el presente documento, incluyen a individuos que tienen aproximadamente 50 años o más, por ejemplo, 60 años o más, 70 años o más, 80 años o más, 90 años o más y 100 años o más, es decir, con edades entre aproximadamente 50 y 100 años, por ejemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o aproximadamente 100 años, y que sufren un deterioro cognitivo asociado al procedimiento natural de envejecimiento, por ejemplo, un deterioro cognitivo leve (M.C.I.); y personas que tienen aproximadamente 50 años o más, por ejemplo de 60 años o más, 70 años o más, de 80 años o más, 90 años o más, y normalmente no mayores de 100 años, es decir, con edades entre aproximadamente 50 y 90 años, por ejemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o aproximadamente 100 años, que aún no han empezado a mostrar síntomas de deterioro cognitivo. Algunos ejemplos de deficiencias que se deben al envejecimiento natural son los siguientes:

A. Deterioro cognitivo leve (DCL) es una alteración modesta de la cognición que se manifiesta como problemas de memoria u otras funciones mentales tales como la planificación, el seguimiento de instrucciones o la toma de decisiones que han empeorado con el tiempo, mientras que la función mental general y las actividades cotidianas no están deterioradas. Por lo tanto, aunque no se produzca una muerte neuronal significativa, las neuronas del cerebro que envejece son vulnerables a alteraciones subletales relacionadas con la edad en su estructura, integridad sináptica y procesamiento molecular en la sinapsis, todo lo cual perjudica la función cognitiva.

Los individuos que sufren o corren el riesgo de desarrollar un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento y que se beneficiarán del tratamiento con el producto sanguíneo que contiene plasma o la fracción, por ejemplo, mediante los procedimientos divulgados en el presente documento, también incluyen a los individuos de cualquier edad que sufren un deterioro cognitivo debido a un trastorno asociado al envejecimiento; y a los individuos de cualquier edad a los que se les ha diagnosticado un trastorno asociado al envejecimiento que suele ir acompañado de un deterioro cognitivo, cuando el individuo aún no ha empezado a presentar síntomas de deterioro cognitivo. Algunos ejemplos de estos trastornos asociados al envejecimiento son los siguientes: B. Enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer es una pérdida progresiva e inexorable de la función cognitiva asociada a un número excesivo de placas seniles en la corteza cerebral y la materia gris subcortical, que también contiene b-amiloide y ovillos neurofibrilares que consisten en la proteína tau. La forma común afecta a personas > 60 años, y su incidencia aumenta a medida que avanza la edad. Representa más del 65 % de las demencias en las personas mayores.

Se desconoce la causa de la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad es hereditaria en un 15-20 % de los casos. El resto, los llamados casos esporádicos, tienen algunos determinantes genéticos. La enfermedad tiene un patrón genético autosómico dominante en la mayoría de los casos de inicio temprano y en algunos de inicio tardío, pero una penetración variable en la vida tardía. Los factores ambientales son el centro de la investigación activa.

En el curso de la enfermedad, se pierden sinapsis y, en última instancia, neuronas dentro de la corteza cerebral, el hipocampo y las estructuras subcorticales (incluyendo la pérdida selectiva de células en el núcleo basal de Meynert), el locus coeruleus y el núcleo raphae dorsal. El uso y la perfusión de la glucosa cerebral se reducen en algunas zonas del cerebro (lóbulo parietal y córtex temporal en la fase inicial de la enfermedad, córtex prefrontal en la fase final). Las placas neuríticas o seniles (compuestas por neuritas, astrocitos y células gliales alrededor de un núcleo amiloide) y los ovillos neurofibrilares (compuestos por filamentos helicoidales emparejados) desempeñan un papel en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. Las placas seniles y los ovillos neurofibrilares se producen con el envejecimiento normal, pero son mucho más frecuentes en las personas con la enfermedad de Alzheimer.

C. Enfermedad de Parkinson. La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno idiopático, lentamente progresivo y degenerativo del sistema nervioso central que se caracteriza por la lentitud y la disminución del movimiento, la rigidez muscular, el temblor en reposo y la inestabilidad postural. Aunque en un principio se consideraba principalmente un trastorno motor, ahora se reconoce que la PD también afecta a la cognición, el comportamiento, el sueño, la función autonómica y la función sensorial. Las deficiencias cognitivas más comunes incluyen un deterioro de la atención y la concentración, la memoria de trabajo, la función ejecutiva, la producción del lenguaje y la función visoespacial.

En la enfermedad de Parkinson primaria, se pierden las neuronas pigmentadas de la sustancia negra, el locus coeruleus y otros grupos de células dopaminérgicas del tronco cerebral. Se desconoce la causa. La pérdida de neuronas de la sustancia negra, que se proyectan al núcleo caudado y al putamen, provoca el agotamiento del neurotransmisor dopamina en estas zonas. La aparición es generalmente después de los 40 años, con una incidencia creciente en los grupos de mayor edad.

El parkinsonismo secundario es el resultado de la pérdida o la interferencia de la acción de la dopamina en los ganglios basales debido a otras enfermedades degenerativas idiopáticas, fármacos o toxinas exógenas. La causa más común de parkinsonismo secundario es la ingestión de fármacos antipsicóticos o reserpina, que producen parkinsonismo al bloquear los receptores de dopamina. Las causas menos comunes son la intoxicación por monóxido de carbono o manganeso, la hidrocefalia, las lesiones estructurales (tumores, infartos que afectan al cerebro medio o a los ganglios basales), el hematoma subdural y los trastornos degenerativos, incluyendo la degeneración estriatonigral.

D. Demencia frontotemporal. La demencia frontotemporal (DFT) es una enfermedad que resulta del deterioro progresivo del lóbulo frontal del cerebro. Con el tiempo, la degeneración puede avanzar hasta el lóbulo temporal. En segundo lugar, después de la enfermedad de Alzheimer (AD), la FTD representa el 20 % de los casos de demencia presenil. Los síntomas se clasifican en tres grupos con base en las funciones de los lóbulos frontales y temporales afectados:

La variante conductual de la FTD (bvFTD), cuyos síntomas incluyen, por un lado, el letargo y la espontaneidad y, por otro, la desinhibición; la afasia progresiva no fluida (PNFa ), en la que se observa un deterioro de la fluidez del habla debido a la dificultad de articulación y a los errores fonológicos y/o sintácticos, pero se conserva la comprensión de las palabras; y la demencia semántica (SD), en la que los pacientes mantienen la fluidez con una fonología y una sintaxis normales, pero tienen una dificultad creciente para nombrar y comprender las palabras. Otros síntomas cognitivos comunes para todos los pacientes con FTD son el deterioro de la función ejecutiva y la capacidad de concentración. Otras capacidades cognitivas, incluyendo la percepción, las habilidades espaciales, la memoria y la praxis suelen permanecer intactas. La FTD puede diagnosticarse mediante la observación de la revelación la atrofia del lóbulo frontal y/o del lóbulo temporal anterior en las resonancias magnéticas estructurales.

Existen un número de formas de FTD, cualquiera de las cuales puede ser tratada o prevenida utilizando los procedimientos y composiciones en cuestión. Por ejemplo, una forma de demencia frontotemporal es la Demencia Semántica (SD). La SD se caracteriza por una pérdida de memoria semántica tanto en el ámbito verbal como en el no verbal. Los pacientes con SD a menudo se presentan con la queja de dificultades para encontrar palabras. Los signos clínicos incluyen la afasia fluida, la anomia, el deterioro de la comprensión del significado de las palabras y la agnosia visual asociativa (la incapacidad de emparejar imágenes u objetos semánticamente relacionados). A medida que la enfermedad progresa, suelen observarse cambios de comportamiento y de personalidad similares a los observados en la demencia frontotemporal, aunque se han descrito casos de demencia semántica "pura" con pocos síntomas conductuales tardíos. Las imágenes estructurales de resonancia magnética muestran un patrón característico de atrofia en los lóbulos temporales (predominantemente en el izquierdo), con una afectación inferior mayor que el superior y una atrofia del lóbulo temporal anterior mayor que el posterior.

Como otro ejemplo, otra forma de demencia frontotemporal es la enfermedad de Pick (PiD, también PcD). Una característica que define la enfermedad es la acumulación de proteínas tau en las neuronas, que se acumulan en agregados esféricos teñidos de plata conocidos como "cuerpos de Pick" Los síntomas incluyen la pérdida del habla (afasia) y la demencia. Los pacientes con disfunción orbitofrontal pueden volverse agresivos y socialmente inapropiados. Pueden robar o demostrar comportamientos estereotipados obsesivos o repetitivos. Los pacientes con disfunción frontal dorsomedial o dorsolateral pueden demostrar una falta de preocupación, apatía o disminución de la espontaneidad. Los pacientes pueden demostrar una ausencia de autocontrol, una autoconciencia anormal y una incapacidad para apreciar el significado. Los pacientes con pérdida de materia gris en el córtex orbitofrontal posterolateral bilateral y en la ínsula anterior derecha pueden mostrar cambios en las conductas alimentarias, tal como un gusto patológico por los dulces. Los pacientes con una pérdida de materia gris más focal en la corteza orbitofrontal anterolateral pueden desarrollar hiperfagia. Aunque algunos de los síntomas pueden aliviarse inicialmente, la enfermedad progresa y los pacientes suelen morir en un plazo de dos a diez años.

E. Enfermedad de Huntington. La enfermedad de Huntington (HD) es un trastorno neurodegenerativo hereditario y progresivo que se caracteriza por el desarrollo de anomalías emocionales, de conducta y psiquiátricas, la pérdida del funcionamiento intelectual o cognitivo y las anomalías del movimiento (alteraciones motoras). Los signos clásicos de la HD incluyen el desarrollo de corea -movimientos involuntarios, rápidos, irregulares y espasmódicos que pueden afectar a la cara, los brazos, las piernas o el tronco-, así como un deterioro cognitivo que incluye la pérdida gradual del procesamiento del pensamiento y de las capacidades intelectuales adquiridas. Puede haber deterioro de la memoria, el pensamiento abstracto y el juicio; percepciones inadecuadas del tiempo, el lugar o la identidad (desorientación); aumento de la agitación; y cambios de personalidad (desintegración de la personalidad). Aunque los síntomas suelen hacerse evidentes durante la cuarta o quinta década de la vida, la edad de inicio es variable y va desde la primera infancia hasta la edad adulta tardía (por ejemplo, los 70 u 80 años).

La HD se transmite en las familias como un rasgo autosómico dominante. El trastorno se produce como resultado de secuencias anormalmente largas o "repeticiones" de instrucciones codificadas dentro de un gen del cromosoma 4 (4p16.3). La pérdida progresiva de la función del sistema nervioso asociada a la HD es el resultado de la pérdida de neuronas en ciertas áreas del cerebro, incluyendo los ganglios basales y la corteza cerebral.

F. Esclerosis lateral amiotrófica. La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurológica rápidamente progresiva e invariablemente mortal que ataca a las neuronas motoras. La debilidad y atrofia muscular y los signos de disfunción de las células de la asta anterior se observan inicialmente con mayor frecuencia en las manos y con menor frecuencia en los pies. El lugar de aparición es aleatorio y la progresión es asimétrica. Los calambres son comunes y pueden preceder a la debilidad. En raras ocasiones, un paciente sobrevive 30 años; el 50 % muere a los 3 años de su aparición, el 20 % vive 5 años y el 10 % vive 10 años. Las características diagnósticas incluyen la aparición durante la vida adulta media o tardía y la afectación motora progresiva y generalizada sin anomalías sensoriales. Las velocidades de conducción nerviosa son normales hasta una fase avanzada de la enfermedad. Estudios recientes han documentado también la presentación de alteraciones cognitivas, en particular una reducción de la memoria verbal inmediata, la memoria visual, el lenguaje y la función ejecutiva.

Se ha notificado una disminución en el área del cuerpo celular, el número de sinapsis y la longitud sináptica total incluso en las neuronas de apariencia normal de los pacientes con ALS. Se ha sugerido que cuando la plasticidad de la zona activa llega a su límite, una pérdida continua de sinapsis puede conducir a un deterioro funcional. Promover la formación de nuevas sinapsis o prevenir la pérdida de sinapsis puede mantener la función neuronal en estos pacientes.

G. Esclerosis múltiple. La esclerosis múltiple (MS) se caracteriza por diversos síntomas y signos de disfunción del sistema nervioso central, con remisiones y exacerbaciones recurrentes. Los síntomas más comunes que se presentan son parestesias en una o más extremidades, en el tronco o en un lado de la cara; debilidad o torpeza de una pierna o mano; o alteraciones visuales, por ejemplo, ceguera parcial y dolor en un ojo (neuritis óptica retrobulbar), visión borrosa o escotomas. Entre las deficiencias cognitivas más comunes se encuentran las de la memoria (adquisición, retención y recuperación de información nueva), la atención y la concentración (especialmente la atención dividida), el procesamiento de la información, las funciones ejecutivas, las funciones visoespaciales y la fluidez verbal. Los síntomas tempranos más comunes son la parálisis ocular que da lugar a una visión doble (diplopía), la debilidad transitoria de una o más extremidades, la rigidez leve o la fatiga inusual de una extremidad, los trastornos menores de la marcha, la dificultad para controlar la vejiga, el vértigo y los trastornos emocionales leves; todos ellos indican una afectación dispersa del sistema nervioso central y a menudo se producen meses o años antes de que se reconozca la enfermedad. El exceso de calor puede acentuar los síntomas y signos.

El curso es muy variado, imprevisible y, en la mayoría de los pacientes, remitente. Al principio, meses o años de remisión pueden separar los episodios, especialmente cuando la enfermedad comienza con una neuritis óptica retrobulbar. Sin embargo, algunos pacientes tienen ataques frecuentes y quedan rápidamente incapacitados; para unos pocos el curso puede ser rápidamente progresivo.

H. Glaucoma. El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa común que afecta a las células ganglionares de la retina (RGC). Las pruebas apoyan la existencia de programas de degeneración compartimentados en sinapsis y dendritas, incluso en las RGC. Las pruebas recientes también indican una correlación entre el deterioro cognitivo en los adultos mayores y el glaucoma (Yochim BP, et al. Prevalence of cognitive impairment, depression, and anxiety symptoms among older adults with glaucoma. J Glaucoma.

2012;21(4):250-254).

I. Distrofia miotónica. La distrofia miotónica (DM) es un trastorno multisistémico autosómico dominante caracterizado por debilidad muscular distrófica y miotonía. El defecto molecular es una repetición expandida de trinucleótidos (CTG) en la región no traducida 3' del gen de la miotoninproteína quinasa en el cromosoma 19q. Los síntomas pueden aparecer a cualquier edad y el intervalo de gravedad clínica es amplio. La miotonía es prominente en los músculos de la mano, y la ptosis es común incluso en los casos leves. En los casos graves, se produce una marcada debilidad muscular periférica, a menudo con cataratas, calvicie prematura, facies de hacha, arritmias cardíacas, atrofia testicular y anomalías endocrinas (por ejemplo, diabetes mellitus). El retraso mental es común en las formas congénitas graves, mientras que en las formas adultas más leves del trastorno se observa un declive de las funciones cognitivas frontales y temporales relacionado con el envejecimiento, en particular del lenguaje y las funciones ejecutivas. Las personas gravemente afectadas mueren a principios de los 50 años.

J. Demencia. La demencia describe una clase de trastornos que presentan síntomas que afectan a las capacidades de pensamiento y sociales con la suficiente gravedad como para interferir en el funcionamiento diario. Otros casos de demencia, además de la demencia observada en las últimas etapas de los trastornos asociados al envejecimiento mencionados anteriormente incluyen la demencia vascular y la demencia con cuerpos de Lewy, que se describen a continuación.

En la demencia vascular, o "demencia multiinfarto", el deterioro cognitivo está causado por problemas en el suministro de sangre al cerebro, normalmente por una serie de accidentes cerebrovasculares menores, o a veces, un gran accidente cerebrovascular precedido o seguido de otros accidentes cerebrovasculares más pequeños. Las lesiones vasculares pueden ser el resultado de una enfermedad cerebrovascular difusa, tal como la enfermedad de pequeños vasos, o de lesiones focales, o de ambas. Los pacientes que sufren demencia vascular presentan un deterioro cognitivo, de forma aguda o subaguda, tras un evento cerebrovascular agudo, tras el cual se observa un deterioro cognitivo progresivo. Las alteraciones cognitivas son similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer, incluyendo las alteraciones del lenguaje, la memoria, el procesamiento visual complejo o la función ejecutiva, aunque los cambios relacionados en el cerebro no se deben a la patología de la A d , sino a la reducción crónica del flujo sanguíneo en el cerebro, que acaba provocando la demencia. La tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la neuroimagen por tomografía por emisión de positrones (PET) pueden utilizarse para confirmar el diagnóstico de demencia multiinfarto junto con evaluaciones que incluyan el examen del estado mental.

La demencia con cuerpos de Lewy (DLB, también conocida con otros nombres, incluyendo demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad difusa con cuerpos de Lewy, enfermedad cortical con cuerpos de Lewy y demencia senil de tipo Lewy) es un tipo de demencia caracterizada anatómicamente por la presencia de cuerpos de Lewy (aglomeraciones de alfa-sinucleína y proteína ubiquitina) en las neuronas, detectables en la histología cerebral post mortem. Su característica principal es el deterioro cognitivo, especialmente del funcionamiento ejecutivo. El estado de alerta y la memoria a corto plazo aumentarán y disminuirán.

Las alucinaciones visuales persistentes o recurrentes con imágenes vívidas y detalladas suelen ser un síntoma de diagnóstico temprano. La DLB se confunde a menudo en sus primeras fases con la enfermedad de Alzheimer y/o la demencia vascular, aunque, mientras que la enfermedad de Alzheimer suele comenzar de forma bastante gradual, la DLB suele tener un inicio rápido o agudo. Los síntomas de la DLB también incluyen síntomas motores similares a los del Parkinson. La DLB se distingue de la demencia que a veces se produce en la enfermedad de Parkinson por el lapso en el que aparecen los síntomas de demencia en relación con los de Parkinson. La enfermedad de Parkinson con demencia (POD) sería el diagnóstico cuando el inicio de la demencia se produce más de un año después de la aparición del Parkinson. La DLB se diagnostica cuando los síntomas cognitivos comienzan al mismo tiempo o en el plazo de un año de los síntomas de Parkinson.

K. Parálisis supranuclear progresiva. La parálisis supranuclear progresiva (PSP) es un trastorno cerebral que provoca problemas graves y progresivos en el control de la marcha y el equilibrio, junto con complejos movimientos oculares y problemas de pensamiento. Uno de los signos clásicos de la enfermedad es la incapacidad de dirigir los ojos correctamente, que se produce debido a las lesiones en la zona del cerebro que coordina los movimientos oculares. Algunas personas describen este efecto como un desenfoque. Los individuos afectados suelen mostrar alteraciones del estado de ánimo y del comportamiento, incluyendo depresión y apatía, así como demencia leve progresiva. El nombre largo del trastorno indica que la enfermedad comienza lentamente y sigue empeorando (progresiva), y causa debilidad (parálisis) al dañar ciertas partes del cerebro por encima de estructuras del tamaño de un guisante llamadas núcleos que controlan los movimientos oculares (supranucleares). La PSP se describió por primera vez como un trastorno distinto en 1964, cuando tres científicos publicaron un artículo que distinguía la afección de la enfermedad de Parkinson. A veces se denomina síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, que refleja los nombres combinados de los científicos que definieron el trastorno. Aunque la PSP empeora progresivamente, nadie muere por la propia PSP.

L. Ataxia. Las personas con ataxia tienen problemas de coordinación porque están afectadas partes del sistema nervioso que controlan el movimiento y el equilibrio. La ataxia puede afectar a los dedos, las manos, los brazos, las piernas, el cuerpo, el habla y los movimientos oculares. La palabra ataxia se utiliza a menudo para describir un síntoma de incoordinación que puede estar asociado a infecciones, lesiones, otras enfermedades o cambios degenerativos en el sistema nervioso central. La ataxia también se utiliza para designar un grupo de enfermedades degenerativas específicas del sistema nervioso denominadas ataxias hereditarias y esporádicas, en las que se centra la Fundación Nacional de la Ataxia.

M. Atrofia múltiple sistémica. La atrofia múltiple sistémica (MSA) es un trastorno neurológico degenerativo. La MSA está asociada con la degeneración de las células nerviosas en zonas específicas del cerebro. Esta degeneración celular provoca problemas de movimiento, equilibrio y otras funciones autonómicas del cuerpo, tal como el control de la vejiga o la regulación de la presión sanguínea.

La causa de la MSA es desconocida y no se han identificado factores de riesgo específicos. Alrededor del 55 % de los casos se dan en hombres, y la edad típica de aparición es entre finales de los 50 y principios de los 60 años. La MSA suele presentar algunos de los mismos síntomas que la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, los pacientes con MSA suelen mostrar una respuesta mínima, si es que hay alguna, a los medicamentos dopaminérgicos utilizados para el Parkinson.

N. Fragilidad. El Síndrome de Fragilidad ("Fragilidad ") es un síndrome geriátrico caracterizado por el deterioro funcional y físico que incluye la disminución de la movilidad, la debilidad muscular, la lentitud física, la escasa resistencia, la baja actividad física, la desnutrición y la pérdida de peso involuntaria. Este declive suele ir acompañado y ser consecuencia de enfermedades tal como la disfunción cognitiva y el cáncer. Sin embargo, la Fragilidad puede producirse incluso sin enfermedad. Las personas que padecen Fragilidad tienen un mayor riesgo de pronóstico negativo por fracturas, caídas accidentales, discapacidad, comorbilidad y mortalidad prematura. (C. Buigues, et al. Effect of a Prebiotic Formulation on Frailty Syndrome: A Randomized, Double-Blind Clinical Trial, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 932). Además, los individuos que padecen Fragilidad tienen una mayor incidencia de gasto sanitario. (Id.)

Los síntomas comunes de la fragilidad pueden ser determinados por ciertos tipos de pruebas. Por ejemplo, la pérdida de peso no intencionada implica una pérdida de al menos 10 libras o de más del 5 % del peso corporal en el año anterior; la debilidad muscular puede determinarse por la reducción de la fuerza de agarre en el 20 % más bajo en la línea de base (ajustada por el género y el BMI); la lentitud física puede basarse en el tiempo necesario para caminar una distancia de 15 pies; la resistencia pobre puede determinarse por el autoinforme de agotamiento del individuo; y la baja actividad física puede medirse utilizando un cuestionario estandarizado. (Z. Palace et al., The Frailty Syndrome, Today's Geriatric Medicine 7(1), en 18 (2014)).

En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones del sujeto se utilizan para retrasar la progresión del deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. En otras palabras, las capacidades cognitivas del individuo declinarán más lentamente tras el tratamiento con los procedimientos divulgados que antes o en ausencia del tratamiento con los procedimientos divulgados. En algunos de estos casos, los procedimientos de tratamiento del sujeto incluyen la medición de la progresión del deterioro cognitivo después del tratamiento, y la determinación de que la progresión del deterioro cognitivo se reduce. En algunos de estos casos, la determinación se realiza comparando con una referencia, por ejemplo, la tasa de deterioro cognitivo en el individuo antes del tratamiento, por ejemplo, como se determina midiendo la cognición previa en dos o más puntos de tiempo antes de la administración del producto sanguíneo del sujeto.

Los procedimientos y composiciones en cuestión también se utilizan para estabilizar las capacidades cognitivas de un individuo, por ejemplo, un individuo que sufre de deterioro cognitivo asociado al envejecimiento o un individuo en riesgo de sufrirlo. Por ejemplo, el individuo puede mostrar algún deterioro cognitivo asociado al envejecimiento, y la progresión del deterioro cognitivo observado antes del tratamiento con los procedimientos divulgados se detendrá tras el tratamiento con los procedimientos divulgados. Como otro ejemplo, el individuo puede estar en riesgo de desarrollar un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento (por ejemplo, el individuo puede tener 50 años o más, o puede haber sido diagnosticado con un trastorno asociado al envejecimiento), y las capacidades cognitivas del individuo son sustancialmente sin cambios, es decir, no se puede detectar el deterioro cognitivo, después del tratamiento por los procedimientos divulgados en comparación con antes del tratamiento con los procedimientos divulgados.

Los procedimientos y las composiciones en cuestión también se utilizan para reducir el deterioro cognitivo en un individuo que sufre un deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. En otras palabras, la capacidad cognitiva mejora en el individuo tras el tratamiento con los procedimientos del sujeto. Por ejemplo, la capacidad cognitiva en el individuo se incrementa, por ejemplo, en 2 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 15 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, o 40 veces o más, incluyendo 50 veces o más, 60 veces o más, 70 veces o más, 80 veces o más, 90 veces o más, o 100 veces o más, después del tratamiento por los procedimientos del sujeto en relación con la capacidad cognitiva que se observa en el individuo antes del tratamiento por los procedimientos del sujeto. En algunos casos, el tratamiento con los procedimientos y composiciones objeto de estudio restablece la capacidad cognitiva en el individuo que sufre el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento, por ejemplo, a su nivel cuando el individuo tenía unos 40 años o menos. En otras palabras, el deterioro cognitivo queda anulado.

14. Procedimientos de Diagnóstico y Seguimiento para la Mejora de la Enfermedad Asociada a lo Neurocognitivo

En algunos casos, entre la variedad de procedimientos para diagnosticar y monitorizar la progresión de la enfermedad y la mejora de la enfermedad asociada a la neurocognición, los siguientes tipos de evaluaciones se utilizan solos o en combinación con los sujetos que sufren la enfermedad neurodegenerativa, según se desee. Los siguientes tipos de procedimientos se presentan como ejemplos y no se limitan a los procedimientos recitados.

A. Cognición general

La divulgación comprende además procedimientos de monitorización del efecto de un medicamento o tratamiento en un sujeto para tratar el deterioro cognitivo y/o la demencia relacionada con la edad, comprendiendo el procedimiento la comparación de la función cognitiva antes y después del tratamiento. Los expertos en la técnica reconocen que existen procedimientos bien conocidos para evaluar la función cognitiva. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el procedimiento puede comprender la evaluación de la función cognitiva con base en la historia clínica, los antecedentes familiares, los exámenes físicos y neurológicos realizados por clínicos especializados en demencia y función cognitiva, las pruebas de laboratorio y la evaluación neuropsicológica. Otras realizaciones son: la evaluación del estado de conciencia, tal como la escala de coma de Glasgow (EMV); el examen del estado mental, incluyendo la puntuación abreviada de la prueba mental (AMTS) o el miniexamen del estado mental (MMSE) (Folstein et al., J. Psychiatr. Res 1975; 12:1289-198); la evaluación global de las funciones superiores; la estimación de la presión intracraneal, por ejemplo, mediante fundoscopia.

15. Reactivos, Dispositivos y Kits

También se divulgan reactivos, dispositivos y kits de los mismos para practicar uno o más de los procedimientos descritos anteriormente. Los reactivos, dispositivos y kits de los mismos pueden variar mucho.

Los reactivos y dispositivos de interés incluyen los mencionados anteriormente con respecto a los procedimientos de preparación del producto sanguíneo que contiene plasma para su transfusión a un sujeto que lo necesita, por ejemplo, anticoagulantes, crioconservantes, tampones, soluciones isotónicas, etc.

Los kits también pueden comprender bolsas de recogida de sangre, tubos, agujas, tubos de centrifugación y similares. En otras realizaciones, los kits descritos en el presente documento incluyen dos o más contenedores de producto de plasma sanguíneo, tal como la fracción de proteína de plasma, tal como tres o más, cuatro o más, cinco o más, incluyendo seis o más contenedores de producto de plasma sanguíneo. En algunos casos, el número de contenedores distintos de producto de plasma sanguíneo en el kit puede ser de 9 o más, 12 o más, 15 o más, 18 o más, 21 o más, 24 o más 30 o más, incluyendo 36 o más, por ejemplo, 48 o más. Cada contenedor puede tener asociada una información de identificación que incluya diversos datos sobre el producto de plasma sanguíneo contenido en el mismo, cuya información de identificación puede incluir uno o más de la edad del donante del producto de plasma sanguíneo, detalles de procesamiento en relación con el producto de plasma sanguíneo, por ejemplo, si el producto de plasma fue procesado para eliminar las proteínas por encima de un peso de molécula promedio (tal como el descrito anteriormente), detalles del tipo de sangre, etc. En algunos casos, cada contenedor en el kit incluye información de identificación sobre el plasma sanguíneo contenido en el mismo, y la información de identificación incluye información sobre la edad del donante del producto de plasma sanguíneo, por ejemplo, la información de identificación proporciona datos de confirmación de la edad del donante del producto de plasma sanguíneo (donde dicha información de identificación puede ser la edad del donante en el momento de la recolección). En algunos casos, cada contenedor del kit contiene un producto de plasma sanguíneo de un donante de sustancialmente la misma edad, es decir, todos los contenedores incluyen producto de donantes que son sustancialmente iguales, si no tienen la misma edad. Por edad sustancialmente igual se entiende que los diversos donantes de los que se obtienen los productos de plasma sanguíneo de los kits difieren en cada uno, en algunos casos, en 5 años o menos, tal como 4 años o menos, por ejemplo, 3 años o menos, incluyendo 2 años o menos, tal como 1 año o menos, por ejemplo, 9 meses o menos, 6 meses o menos, 3 meses o menos, incluyendo 1 mes o menos. La información de identificación puede estar presente en cualquier componente conveniente del contenedor, tal como una etiqueta, un chip RFID, etc. La información de identificación puede ser legible para el ser humano, para el ordenador, etc., según se desee. Los contenedores pueden tener cualquier configuración conveniente. Aunque el volumen de los recipientes puede variar, en algunos casos los volúmenes van de 10 ml a 5.000 ml, tales como 25 ml a 2.500 ml, por ejemplo, 50 ml a 1.000 ml, incluyendo 100 ml a 500 ml. Los contenedores pueden ser rígidos o flexibles, y pueden estar fabricados de cualquier material conveniente, por ejemplo, materiales poliméricos, incluyendo materiales plásticos de grado médico. En algunos casos, los contenedores tienen una configuración de bolsa o de bolsita. Además de los contenedores, dichos kits pueden incluir además dispositivos de administración, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Los componentes de dichos kits pueden suministrarse en cualquier empaquetado adecuado, por ejemplo, una caja o estructura análoga, configurada para contener los contenedores y otros componentes del kit.

Además de los componentes anteriores, los kits del sujeto incluirán además instrucciones para practicar los procedimientos del sujeto. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits del sujeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una pieza o piezas de papel en las que se imprime la información, en el empaquetado del kit, en un prospecto, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un disquete, un CD, una unidad flash portátil, etc., en el que se haya grabado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio retirado. En los kits puede haber cualquier medio conveniente.

16. Procedimientos experimentales

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo hacer y utilizar el presente hallazgo, y no pretenden representar que los experimentos que se presentan a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras utilizadas (por ejemplo, las cantidades, la temperatura, etc.), pero hay que tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio ponderado, la temperatura es grados centígrados y la presión es casi atmosférica.

Los procedimientos generales de la bioquímica molecular y celular pueden encontrarse en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001)Short Protocols in Molecular Biology, 4ta Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999) Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996) Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999) Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995 Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Precedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta divulgación están disponibles en proveedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y Clontech.

A. Materiales y reactivos.

La solución salina USP se compró a Hospira (Lake Forest, IL). Las inyecciones se realizaron con agujas de 27,5 G o 30 G, a un volumen de 150 pl por inyección. Se almacenó a 4°C, la PPF ("PPF1") disponible comercialmente, tal como los Preparados Comerciales de PPF descritos anteriormente en solución al 5 %. Se almacenó a 4°C la HAS disponible comercialmente ("HAS1"), tal como los preparados comerciales de HAS descritos anteriormente en solución al 5 %.

B. Abastecimiento y Cría de Animales.

Se usaron las cepas de ratón NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl ("NODscid", Código de cCpa 394, Charles River, MA) (Bosma, M. et al., The scid mouse mutant. 137 Curr Top Microbiol Immunol 197 (1988)) y NOD scid gamma ("NSG", Código de Cepa 005557, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Cada ratón fue perforado en la oreja para designar un número de identificación único. Todos los ratones fueron alojados individualmente en condiciones específicas libres de patógenos bajo un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, y toda la manipulación y uso de los animales se realizó de acuerdo con las directrices estándar aprobadas por el IACUC.

C. Administración.

A menos que se describa de otra manera más adelante, se inyectaron los ratones NSG y NODscid con solución salina USP, 5 % de PPF1, o 5 % de HAS1 dos veces por semana a través de una inyección intravenosa en la vena de la cola (150 |jl por inyección) durante un máximo de 6 meses.

D. Campo abierto

Se utilizaron pruebas de campo abierto para determinar el comportamiento exploratorio de los ratones sujetos. La prueba de campo abierto es una arena de pruebas vacía, normalmente redonda o cuadrada. El ratón se coloca dentro de una arena abierta de 50cm x 50cm durante 15 minutos y se mide el nivel de actividad del ratón. El tiempo de cría se midió siguiendo la duración de las patas delanteras en las paredes de la caja. También se midió la distancia total recorrida y la velocidad durante la prueba. Se utilizó CleverSys TopScan V3.0 (Reston, VA) para seguir el comportamiento del ratón en campo abierto. Las cámaras de campo abierto fueron construidas por CleverSys.

E. Laberinto Y

Se permitió a los ratones explorar dos brazos de un laberinto Y (inicial familiar) durante 5 minutos. Una hora después, se permitió a los ratones explorar los tres brazos, y se registraron el tiempo total y el número de entradas en los brazos.

F. Laberinto de Barnes

Los ratones fueron entrenados durante cuatro días consecutivos en un laberinto de Barnes modificado y se les dio un máximo de 120 segundos para encontrar el agujero de escape. (Véase Barnes, C.A., Memory deficits associated with senescence: Un estudio neurofisiológico y conductual en la rata, J. COMPARATIVE AND PHYSIOLOGICAL PSYCHOLOGY, 93(1): 74-104 (1979); y para el laberinto modificado, Faizi, M. et al., Thy1-hAPP(Lond/Swe+) mouse model of Alzheimer's disease displays broad behavioral deficits in sensorimotor, cognitive and social function, BRAIN BEHAV. 2(2): 142-54, (2012)). El agujero de escape permaneció igual durante cuatro ensayos en un día de entrenamiento, pero cambió entre los días de entrenamiento. Se registró la latencia al agujero de escape para cada cohorte de ratones en cuatro días de entrenamiento distintos.

G. Células Positivas a DCX y Ki67

La doble cortinilla (DCX) es una proteína asociada a los microtúbulos que se expresa en las células precursoras de las neuronas. También se expresa en las neuronas inmaduras de las estructuras corticales embrionarias y adultas. Cuando se dividen activamente, las células precursoras de las neuronas expresan DCX. La proteína disminuye después de dos semanas. Debido a esta asociación, es útil como marcador de neurogénesis.

El procesamiento del tejido cerebral y la inmunohistoquímica se llevaron a cabo en técnicas bien descritas de secciones de flotación libre (Luo, J. et al. Glia-dependent TGF-b signaling, acting independently of the TH17 pathway, is critical for initiation of murine autoimmune encephalomyelitis. J. CLIN. INVIERTE. 117, 3306-3315 (2007)). Los ratones fueron anestesiados y perfundidos con solución salina al 0,9 %. Se extrajeron los cerebros y posteriormente se fijaron con paraformaldehído al 4 % tamponados con fosfato, pH 7,4, a 4°C antes de pasarlos por sacarosa al 30 % para su crioprotección. Posteriormente se seccionaron los cerebros a 30 jm con un criomicrotomo a -22 °C. Las secciones se almacenaron en un medio de ciberprotección. El anticuerpo primario utilizado fue anti-Dcx de cabra (Santa Cruz Biotechnology a 1:500 para los experimentos de dosificación dos veces por semana o 1:200 en los experimentos de dosificación tres veces por semana) o anti-Ki67 de conejo (1:500 Abcam). La tinción con anticuerpos primarios se reveló utilizando anticuerpos secundarios biotinilados y el ABCkit (Vector) con diaminobencidina (DAB, Sigma-Aldrich) o anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia. Para estimar el número total de células Dcxpositivas por giro dentado, se contaron las células inmunopositivas en la capa de células granulares y subgranulares del giro dentado en tres secciones hemisféricas coronales a través del hipocampo y se promediaron.

H. Prueba del Laberinto de Barnes en Ratones NSG Envejecidos Tratados con Plasma Joven, Efluente I o Efluente II/III

Los ratones NSG envejecidos (de 12 meses de edad), fueron separados en varios grupos (todos de n=14), y recibieron 150 |jl de solución salina, plasma joven, Efluente I, o Efluente II/III por inyección en la vena de la cola antes de iniciar las pruebas de comportamiento. Cada grupo se separó en 3 cohortes y cada cohorte se inició con pruebas de comportamiento en una semana diferente.

I. Laberinto de Barnes y Supervivencia Celular (Tinción de BrdU) en Ratones NSG Envejecidos Tratados Tres Veces por Semana con Plasma Joven o PPF1

Los ratones NSG machos envejecidos (12 meses) fueron tratados por vía intravenosa a través de una inyección en la vena de la cola con 150 j l de plasma humano joven clarificado (plasma joven), PPF1 o solución salina tres veces por semana durante cuatro semanas. El régimen se cambió a dos veces por semana durante las semanas 5 y 6, que fueron las semanas de pruebas de comportamiento.

Antes del tratamiento, los ratones se dividieron en tres cohortes de 13-15 ratones cada una. Cada cohorte se sometió a cinco días de inyecciones de BrdU por vía intraperitoneal (i.p.) antes del inicio del tratamiento de plasma joven, PPF1 o solución salina, como se ha descrito anteriormente.

Durante las semanas 5 y 6, se realizaron pruebas de comportamiento, y se midió la latencia hacia el agujero objetivo para cada ratón en la prueba del laberinto de Barnes. Cada sesión de pruebas duró un máximo de 120 segundos. El evento de encontrar el agujero objetivo se registró utilizando un software que determinó cuando la nariz del ratón entró en el área definida como el agujero objetivo.

Al final de las pruebas de comportamiento, los animales fueron sacrificados y se cuantificaron seis secciones por hipocampo utilizando un microscopio de campo brillante para determinar la presencia de células positivas a BrdU dentro de la capa de células granulares del giro dentado. Como secciones representativas a través de las diferentes regiones del hipocampo, el número promedio de células BrdU positivas se multiplicó por 72, que era el número total de secciones para el hipocampo de cada animal, con el fin de dar una estimación del número total de células BrdU positivas.

J. Ensayos de Cultivo de Neuroesferas y Cortezas

1. Tinción de Tuj 1 y DAPI

Se suspendieron corticales de ratón C57 E14,15 (Lonza: M-CX-300) en 12 ml de medio basal neural suplementado con B27, 2 mM de Glutamax (Sigma-Aldrich). Se añadieron 200 j l a cada pocillo de una placa de 96 pocillos precubierta con colágeno I (Corning, Inc.). Después de 16 horas, se sustituyó el medio de cultivo por un medio de control precalentado (37°C) (medio basal neural con B27, 2 mM de Glutamax (Gibco)). En el día 4 in vitro ("días in vitro", o "DIV"), los medios de cultivo se sustituyeron por medios de control frescos, medios de control y 10 % de PPF1, medios de control y 10 % de HAS1, vehículo y 10 % de PPF1, o vehículo y 10 % de HAS1. Los cultivos se mantuvieron durante 21 días con el 75 % de los medios cambiados por medios frescos cada 3 días. A las 21 DIV, los cultivos se lavaron 3 veces con PBS y luego se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT). Tras la fijación, los cultivos se lavaron 2 veces con PBS y luego se permeabilizaron con Tritón X100 al 0,1 % durante 5-20 minutos. Tras la permeabilización, los cultivos se bloquearon con albúmina de suero bovino al 3 % (Sigma-Aldrich) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras 60 minutos, se aspiró la solución de bloqueo y los cultivos se marcaron con el anticuerpo anti-Tujl (AbCam-1:500) a 4°C durante toda la noche. Tras el etiquetado, los cultivos se lavaron 3 veces con PBS BSA al 0,1 % y se tiñeron con el anticuerpo antiratón de burro conjugado con A647 a 4 °C durante toda la noche (1:1000). A continuación, los cultivos se lavaron 2 veces con PBS y se marcaron con Hoechst 33342 (1:1000) durante 20 minutos. Las muestras se lavaron 3 veces con PBS después del marcado con Hoechst. Se adquirieron veinticinco (25) campos para cada pocillo con un aumento de 10X utilizando el GE InCell Analyzer 2000 (Ge Healthcare Life Sciences). Los resultados se muestran en la Figura 19.

2. Longitud Neta de la Neuritas

La longitud neta de las neuritas se determinó a partir de los cultivos como se describe en la sección anterior. El análisis de las neuritas se realizó utilizando un algoritmo personalizado generado por GE InCell Investigator Developer Toolbox. Los resultados de las muestras de control y de las tratadas con vehículo fueron casi idénticos, por lo que se combinaron para el análisis estadístico. Los resultados se muestran en la Figura 20.

3. Número y Tamaño de la Esfera de Cultivo de la Corteza; Longitud del Procedimiento y Ramificación

Se suspendieron corticales de ratón C57 E14,15 (Lonza: M-CX-300) en 12 ml de medio neurobasal suplementado con B27, 2 mM de Glutamax (Sigma-Aldrich). Se añadieron 200 j l a cada pocillo de una placa de 96 pocillos precubierta con polilisina y laminina. Cuatro días después, el 50 % del medio se cambió por medio fresco y se trató con el artículo de prueba (vehículo, PPF1 o HAS1) hasta una concentración final del 10 %. Esto se repitió tres días después. El día 7 del tratamiento, las células fueron fotografiadas en contraste de fase con un aumento de 10X con IncuCyte (Ann Arbor, MI) y analizadas con los algoritmos estándar de "Neurita y Cuerpo Celular". Se analizaron seis réplicas con cuatro imágenes tomadas por réplica. Se muestra el error estándar. La significación se muestra para la prueba T de 2 colas como P < 0,5. Los resultados se muestran en las Figuras 21 y 22.

4. Tinción de la Neuroesfera Sox2

Se suspendieron neuronas corticales de ratón C57 E14,15 (Lonza: M-CX-300) en medio neurobasal suplementado con B27, 2 mM de Glutamax (Sigma-Aldrich) a 100-200K células/ml. Se añadieron 200 pl a cada pocillo de una placa de 96 pocillos precubierta con colágeno I (Corning, Inc.). Después de 16 horas, se sustituyó el medio de cultivo por un medio de control precalentado (37 °C) (medio Neurobasal con B27, 2 mM Glutamax (Gibco)). En el día 4 in vitro ("días in vitro", o "DIV"), los medios de cultivo se sustituyeron por medios de control frescos, medios de control con vehículo HAS (vehículo), medios de control y 10 % de PPF1, medios de control y 10 % de HAS1. Los cultivos se mantuvieron durante 21 días con el 75 % de los medios cambiados por medios frescos cada 3-4 días. A las 21 DIV, los cultivos se lavaron 3 veces con PBS y luego se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT). Tras la fijación, los cultivos se lavaron 2 veces con PBS y luego se permeabilizaron con Tritón 100X al 0,1 % durante 5-20 minutos. Tras la permeabilización, los cultivos se bloquearon con 3 % de albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de 60 minutos, se aspiró la solución de bloqueo y los cultivos se marcaron con el anticuerpo anti-Tujl (AbCam-1:500) y el anticuerpo de conejo anti SOX2 (AbCam: 1:5000 a 4 °C durante la noche. Tras el marcaje, los cultivos se lavaron 3 veces con PBS BSA al 0,1 % y se tiñeron con Rojo Texas de Asno anti-ratón-647 (AbCam) y de Oveja anti-conejo a 4°C durante la noche (1:1000). A continuación, los cultivos se lavaron 2 veces con PBS y se marcaron con Hoechst (1:1000) durante 20 minutos. Las muestras se lavaron 3 veces con PBS después del marcado con Hoechst. Se adquirieron 25 campos (20 o 25) para cada pocillo utilizando un aumento de 10X del InCell Analyzer 2000 (GE Healthcare Life Sciences). El análisis de las neuroesferas y de las neuritas se realizó mediante un algoritmo personalizado generado por GE InCell Investigator Developer Toolbox. Los resultados de las muestras de control y de las tratadas con vehículo fueron casi idénticos, por lo que se combinaron para el análisis estadístico. Los resultados se muestran en la Figura 23.

K. Resultados de los Experimentos in Vivo

1. Prueba de Campo Abierto con Ratones NSG de 3 meses y 13 meses de edad

Los ratones NSG de 3 meses (jóvenes) o de 13 meses (viejos) fueron colocados en una cámara de campo abierto durante 15 minutos. Se midieron el tiempo de crianza Figura 1, la velocidad Figura 2 y la distancia Figura 3. La Figura 1 muestra que los ratones de 13 meses pasaron menos tiempo de cría que los de 3 meses, pero que los ratones tratados con PPF1 y HAS 1- no fueron significativamente diferentes de los ratones jóvenes. La Figura 2 muestra que los ratones de 13 meses tratados con solución salina (control) y con PPF1 eran significativamente más lentos que los de 3 meses. Sin embargo, los ratones tratados con HAS 1 fueron significativamente más rápidos que los tratados con solución salina, y no fueron significativamente diferentes de los ratones jóvenes. La Figura 3 muestra que los ratones viejos tratados con solución salina (control) y HAS1 tenían menos actividad locomotora que los ratones jóvenes, y los ratones tratados con PPF1 cubrían más distancia que los ratones tratados con solución salina. Todos los datos mostrados son la media ± s.e.m *P < 0,05 **P < 0,01 ***P< 0,001; prueba t; n = 20, 18, 18, 19. (SAL = solución salina).

2. Prueba del Laberinto Y con ratones NSG de 3 meses y 13 meses

Los ratones NSG jóvenes (de 3 meses) y viejos (de 13 meses) fueron sometidos a la prueba del laberinto Y con pistas como prueba de memoria. La Figura 4 muestra que todos los ratones pasaron significativamente más tiempo en el brazo novedoso (N) que en el familiar (F). La Figura 5 muestra que los ratones viejos tratados con HAS 1 tenían una memoria significativamente deteriorada para el brazo familiar en comparación con los ratones jóvenes, mientras que los ratones tratados con PPF1 tendían a mejorar su memoria para el brazo familiar. La Figura 6 muestra que los ratones viejos tratados con solución salina y PPF1, pero no con HAS 1, eran significativamente más lentos que los ratones jóvenes. La Figura 7 muestra que los ratones viejos tratados con solución salina y PPF1, pero no los tratados con HAS 1, cubrieron menos distancia que los ratones jóvenes. Todos los datos mostrados son la media ± s.e.m; *P < 0,05 **P < 0,01 ***P< 0,001; Prueba t pareada; n = 20, 18, 18, 19. (SAL = solución salina).

3. Prueba de Condicionamiento del Miedo para la Memoria con Ratones NSG de 3 meses y 13 meses

Los ratones NSG jóvenes (de 3 meses) y viejos (de 13 meses) fueron sometidos a la prueba de condicionamiento del miedo para la memoria. La Figura 8A muestra que los ratones de 13 meses tienden a pasar menos tiempo congelados que los de 3 meses, mientras que los ratones tratados con HAS1 pasan casi tanto tiempo congelados como los de 3 meses. La Figura 8B muestra que, en la prueba con señales de la señal auditiva, los ratones de 13 meses tratados con el control fueron los que peor se comportaron y los que menos tiempo se congelaron. Los ratones tratados con HAS 1 tendieron a pasar más tiempo congelados, lo que indica una mejor memoria para el tono. La Figura 9 muestra la cuantificación de los últimos 90 segundos de la prueba de memoria y muestra que los ratones tratados con HAS 1 tienden a pasar más tiempo congelados, lo que indica una mejora de la memoria. n = 20, 16, 17, 19. (SAL = solución salina).

4. Prueba del Laberinto de Barnes para la Memoria Espacial con Ratones NSG de 3 meses y 13 meses

Los ratones NSG jóvenes (de 3 meses) y viejos (de 13 meses) fueron sometidos a la prueba del laberinto de Barnes para la memoria espacial. La Figura 10A muestra que los ratones de 3 meses son los que mejor se comportan y los que más rápido llegan al agujero objetivo en el último ensayo. La Figura 10B muestra la cuantificación del promedio de los últimos 3 ensayos, que demuestra que los ratones viejos tratados con solución salina y HAS1 estaban significativamente deteriorados en su memoria del agujero objetivo en comparación con los ratones jóvenes, pero los ratones tratados con PPF1 no eran significativamente diferentes de los ratones jóvenes. **P<0,01 ***P< 0,001; Prueba t no apareada; n = 20, 18, 18, 19. (SAL = solución salina).

5. Inmunotinción en Ratones NSG de 3 meses y 13 meses

Se tiñeron secciones cerebrales para la doublecortina (Dcx), un marcador de neuronas recién nacidas o para Ki67, un marcador de células proliferantes en ratones NSG de 3 meses y 13 meses tratados dos veces por semana con solución salina, PPF1 o HAS1. Se contaron las células positivas para Dcx y Ki67 en el giro dentado de ratones NSG jóvenes y viejos. Las Figuras 11A y 11B muestran, respectivamente, que todos los ratones viejos tenían un número dramáticamente menor de células positivas para Dcx o Ki67. Los ratones tratados con PPF1 y HAS1 tendieron a aumentar el número de células positivas para Dcx y Ki67 en comparación con los ratones tratados con solución salina.

6. Inmunotinción con Ratones NSG de 3 meses y 13 meses Tratados Tres veces por Semana con PPF1 y HAS1

Las secciones cerebrales se tiñeron para la doublecortina (Dcx), un marcador de las neuronas recién nacidas o para el Ki67, un marcador de las células proliferantes en ratones de 13 meses. Los ratones fueron tratados tres veces por semana con solución salina, PPF1, HAS1 concentrado 1X o HAS1 concentrado 5X. Se contaron las células positivas para Dcx y Ki67 en el giro dentado. La Figura 12 muestra que los ratones tratados con PPF1 tienden a aumentar la neurogénesis (como indica la tinción Dcx), en comparación con los animales tratados con solución salina. También se muestra que una mayor concentración de HAS1 tiende a aumentar la neurogénesis en comparación con los animales tratados con solución salina.

La Figura 13 muestra que los ratones tratados con PPF1 tuvieron un aumento significativo de la proliferación celular (como indica la tinción Ki67), en comparación con los animales tratados con solución salina de control. También se muestra que una mayor concentración de HAS1 tiende a aumentar la neurogénesis en comparación con los animales tratados con solución salina. *P < 0,05; prueba t no emparejada frente al grupo de solución salina; todos los datos mostrados son la media ± s.e.m.

7. Prueba de Campo Abierto con Ratones NODscid

Los ratones NODscid fueron tratados dos veces por semana mediante una inyección intravenosa en la vena de la cola con solución salina o PPF1 a partir de los 6 meses de edad. El número inicial de ratones fue de 20 para cada grupo. Los ratones se colocaron en la cámara de Campo abierto durante 15 minutos y se registró la actividad locomotora. La Figura 14A muestra que los ratones tratados con PPF1 tienden a aumentar la actividad de cría en comparación con los ratones tratados con solución salina. Las Figuras 14B y 14C muestran, respectivamente, que los ratones tratados con PPF1 también tienden a mejorar la velocidad y la distancia recorrida en comparación con los ratones tratados con solución salina.

8. Laberinto de Barnes con Ratones NSG Envejecidos (12 meses) Tratados con Plasma joven, Efluente I y Efluente II/III

Los ratones NSG envejecidos (de 12 meses de edad), fueron separados en varios grupos (todos de tamaño n=14), y recibieron 150 pl de solución salina, plasma joven, Efluente I, o Efluente II/III por inyección en la vena de la cola antes de iniciar las pruebas de comportamiento. Cada grupo se dividió en 3 cohortes y cada cohorte se inició con pruebas de comportamiento en una semana diferente. Los ratones fueron sometidos a pruebas en un laberinto de Barnes modificado (como se ha descrito anteriormente) para evaluar el aprendizaje y la memoria espaciales. La Figura 15 muestra que el tratamiento con plasma joven, Efluente I o Efluente II/III tiende a mejorar significativamente la latencia de los ratones NSG envejecidos para alcanzar el agujero objetivo.

9. Laberinto de Barnes y Supervivencia Celular en Ratones NSG Envejecidos Tratados con Plasma Joven y PPF1

Como se ha descrito anteriormente, los ratones NSG macho envejecidos (de 12 meses) fueron tratados con 150 pl de plasma humano joven clarificado (plasma joven), PPF1 o solución salina tres veces por semana (i.v.) durante 4 semanas, y luego dos veces por semana durante las semanas 5 y 6, que fueron las semanas en las que se realizaron las pruebas se informa.

La Figura 16 informa de la latencia para alcanzar el agujero del Laberinto de Barnes para cada cohorte de tratamiento. El tratamiento con PPF1 mejoró significativamente la memoria espacial en ratones envejecidos en comparación con el control, mientras que el tratamiento con plasma joven tendió a mejorar la memoria espacial en comparación con el control. (n: Solución Salina=12, PPF1=14, plasma joven=11). *P < 0,05; media ± s.e.m.; prueba T no apareada.

La Figura 17 muestra la latencia promedio para encontrar el agujero objetivo en los tres últimos ensayos de cada día de prueba. De nuevo, el tratamiento con PPF1 mejoró significativamente la memoria espacial en los ratones envejecidos en comparación con el control, mientras que el tratamiento con plasma joven tendía a mejorar la memoria espacial en comparación con el control. *P < 0,05; media ± s.e.m.; prueba T no apareada.

La Figura 18 informa del efecto del plasma humano joven y del PPF1 sobre la supervivencia celular, determinada por el número de células marcadas positivamente con BrdU (es decir, células proliferantes) dentro de la capa granular del giro dentado de ratones NSG envejecidos (12 meses). Se administró BrdU durante cinco días (i.p.) antes de comenzar las inyecciones intravenosas de plasma joven, PPF1, o control de solución salina como se ha descrito anteriormente. Se observó un aumento significativo de la supervivencia celular tanto en el plasma humano joven como en los ratones tratados con PPF1 en comparación con el control de solución salina. La significación estadística se determinó mediante un ANOVA de una vía con el análisis post-hoc de comparación múltiple de Dunnett entre el PPF1 y el plasma humano joven en comparación con el tratamiento salino. (n: Solución salina=13; PPF1=13; plasma joven=11, **** P > 0,0001, prueba T no apareada entre PPF1 o plasma humano joven y tratamiento salino).

L. Resultados de los Ensayos de Cultivo In Vitro de Neuroesferas y Cortezas

La Figura 19 muestra que PPF1 y HAS1 modulan diferencialmente la proliferación de neuroesferas en el cultivo de corteza. Las cortezas de ratones C57 E14-15 se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I en medios de cultivo que contenían sólo vehículo, PPF1 (10 %) o HAS1 (10 %). Se muestran imágenes de ejemplo de neuroesferas de cultivos corticales después de 21 días in vitro, con imágenes de Tuj1 (beta-tubulina de clase III específica de las neuronas), DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), o tanto TuJ1 como DAPI. La Figura 19 muestra que la PPF1 aumenta la cantidad de neuroesferas que expresan Tuj1 o DAPI. El aumento de la expresión de Tuj1 demuestra que los cultivos corticales tratados con PPF1 producen más neuroesferas que se han diferenciado en un fenotipo más parecido al neuronal.

La Figura 20 muestra tres cultivos de neuronas corticales de ratón C57 E14-15 (Lonza: M-CX-300) suspendidas en medio neurobasal suplementado con B27, 2 mM de Glutamax (Sigma-Aldrich) a 100-200K células/ml, recubiertas en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I en medio de cultivo que contenía vehículo, PPF1 (10 %) o HAS1 (10 %). La longitud neta de las neuritas, indicativa de la neurogénesis, se produjo en los cultivos tratados con PPF1 en comparación con los cultivos de control o tratados con HAS 1.

La Figura 21 muestra tres cultivos de neuronas corticales de ratón C57 E14-15 (Lonza: M-CX-300) suspendidas en medio neurobasal suplementado con B27, 2 mM de Glutamax (Sigma-Aldrich) a 100-200K células/ml, recubiertas en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I en medio de cultivo que contenía vehículo, PPF1 (10 %) o HAS1 (10 %). Un algoritmo del software IncuCyte disponible en Essen BioSciences (Ann Arbor, MI) detectó las esferas de cultivo de la corteza (resaltadas en amarillo) y los procedimientos (resaltados en rosa). Se observaron más esferas y procedimientos en los cultivos tratados con PPF1 y también se observó un aumento del tamaño de las esferas y de la ramificación de los procedimientos en los cultivos tratados con PPF1. Las barras de escala son de 300 pm cada una.

La Figura 22. Las Figuras 22A-D informan del número de esferas, la longitud del procedimiento, los puntos de ramificación del procedimiento y el tamaño de la esfera, respectivamente. La cuantificación se realizó mediante un algoritmo de software IncuCyte disponible en Essen BioSciences (Ann Arbor, MI). Se muestra el error estándar. La significancia se muestra mediante una prueba T de 2 colas. La Figura 22A muestra que los cultivos tratados con PPF1 tienen un mayor número de esferas en comparación con los cultivos tratados con vehículo o con HAS 1. ( P = 0,0006, PPF1 vs. vehículo; P = 0,0007, PPF1 vs. hAs 1). La Figura 22B muestra que los cultivos tratados con PPF1 muestran un aumento de la longitud del procedimiento en comparación con los cultivos tratados con vehículo o con HAS 1. ( P = 4e'8, PPF1 frente a vehículo; P = 0,002, PPF1 frente a HAS1; y P = 0,018, HAS1 frente a vehículo). La Figura 22C muestra que los cultivos tratados con PPF1 producen más puntos de ramificación del procedimiento en comparación con los cultivos tratados con vehículo o HAS1. ( P = 0,002 PPF1 vs. vehículo; P = 0,004, PPF1 frente a HAS1). La Figura 22D muestra que los cultivos tratados con PPF1 se asocian con un mayor tamaño de las esferas en comparación con los cultivos tratados con vehículo o HAS1. ( P = 0,002 PPF1 vs. vehículo; P = 0,004, PPF1 frente a HAS1). En conjunto, los resultados de estos datos indican que el tratamiento con PPF1 (y HAS1 en un grado menos significativo) se asocia con características indicativas de un mayor crecimiento celular del cultivo de corteza y formación de procedimientos.

La Figura 23 muestra el número de neuroesferas con tinción positiva para Sox2, un factor de transcripción que juega un papel importante en el mantenimiento de las células madre embrionarias y neuronales. La cuantificación se realizó mediante un algoritmo de GE InCell Investigator Toolbox. Los cultivos tratados con PPF1 produjeron un número significativamente mayor de neuroesferas con tinción positiva para Sox2, lo que indica que el tratamiento con PPF1 se asocia con un aumento del número de células con potencial para la neurogénesis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una Fracción de Proteínas de Plasma (FPP) para su uso en el tratamiento de un trastorno cognitivo relacionado con la edad, en la que una cantidad eficaz de la FPP se administra a un sujeto diagnosticado con el trastorno cognitivo relacionado con la edad, en el que la FPP tiene un contenido total de proteínas que consiste en al menos 83 % pero menos del 95 % de albúmina, no más del 17 % de globulinas y otras proteínas de plasma, y no más del 1 % de gamma globulina, en la que dicha FPP se deriva del plasma humano.

2. La PPF para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en laque laPPF es una PPF comercialmente disponible.

3. La PPF para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores comprende además la monitorización del sujeto para la mejora de la función cognitiva.

4. La PPF para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la PPF se deriva del plasma de un grupo de humanos menores de 40 años.

5. La PPF para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sujeto es un mamífero.

6. La PPF para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el mamífero es un humano.