KR20240032996A - B7h6 항체 및 이의 응용 - Google Patents

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궈슈아이 카오
웨이화 샤오
루이 순
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허페이 티지 이뮤노파마 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 B7H6 항체 및 이의 응용을 개시한다. 상기 항체는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3을 포함한다. 본 발명의 항체는 B7H6에 결합하여 B7H6과 NK 세포 활성화 수용체 NKp30의 결합을 촉진할 수 있으며, 항암 기능을 갖는다.

Description

B7H6 항체 및 이의 응용
본원 발명은 2021년 12월 07일자로 중국 국가지식재산권국에 제출한 특허 출원 번호가 202111485380.9인 특허 출원의 우선권 및 권리를 주장하는 바, 그 전체 내용은 참조로서 여기에 포함된다.
본 발명은 항체 분야에 관한 것으로, 구체적으로, B7H6에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 용도에 관한 것이다.
NK 세포는 유기체에서 매우 중요한 선천성 림프구로 항바이러스 및 항종양에서 중요한 역할을 한다. NK 세포 표면은 NKp30, NKG2D 등을 포함하여 종양 세포 표면에 발현되는 리간드를 인식하고 결합하는 다양한 활성화 수용체를 발현하는데, 이러한 리간드는 모두 자체 유전자에 의해 코딩되고, 세포 악성 형질전환(종양)과 같은 조건에서 세포 표면에 발현된다.
NKp30은 중요한 NK 세포 활성화 수용체로 리간드와 결합한 후 활성화 신호를 전달하고, NK 세포가 종양을 살상하도록 촉진한다. B7H6은 막 단백질 형태로 발현되는 것으로 알려진 NKp30 리간드로 B7-H6은 흑색종, 간암과 같은 다양한 종양 조직에서 많이 발현되지만 정상 조직에서는 발현되지 않으며 종양 특이성을 갖는다.
종양 미세 환경에서 TGF-β 등 사이토카인은 NK 세포 표면의 NKp30 발현을 하향 조절하므로, NK 세포가 NKp30-B7H6 상호 작용을 이용하여 종양을 정확히 인식하고 사멸하지 못하게 되어 종양 면역 탈출이 초래된다. 따라서 B7H6을 표적으로 하는 치료성 항체 약물의 제공이 매우 필요하다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 단점을 극복하여 인간 및 원숭이 B7H6에 결합할 수 있고, B7H6와 NKp30의 결합을 촉진하는 B7H6 항체 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 항체는 B7H6와 NKp30의 결합을 촉진함으로써 NK 세포의 항암 기능을 촉진한다.
일 양태에서, 본 발명은 B7H6에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3을 포함하되,
상기 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고;
상기 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하며;
상기 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고;
상기 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하며;
상기 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고; 및
상기 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
1) SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3: 또는
2) SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, (i) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 및/또는, (ii) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 (i)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 (ii)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
1) SEQ ID NO: 13으로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:14로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
2) SEQ ID NO: 15로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
3) SEQ ID NO: 17로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열; 또는
4) SEQ ID NO: 19로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
1) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO:27로 표시되는 아미노산 서열;
2) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 28로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO: 29로 표시되는 아미노산 서열;
3) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO: 31로 표시되는 아미노산 서열; 또는
4) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 32로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO: 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 분리된 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 단일 클론 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 인간 개질 항체, 인간 항체, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2이다.
일부 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역 접합체를 제공하며, 상기 면역 접합체는 치료제 및 치료제에 커플링된 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 조성물은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 상기 면역 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내 B7H6 검출용 키트를 제공하며, 상기 키트는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내 B7H6 검출용 시약의 제조에 있어서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 B7H6-매개 질환의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조에 있어서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공하며, 상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이고,
선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산을 제공하며, 이는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 벡터 또는 형질전환체를 제공하며, 이는 상기 핵산을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제공하며, 상기 재조합 세포는 전술한 핵산, 발현 벡터 또는 형질전환체를 운반하거나, 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약물을 제공하며, 이는 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 약물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 B7H6-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 약물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포의 용도를 제공한다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합하여 B7H6와 NKp30 사이의 상호 작용을 촉진하고, NK 세포의 항암 기능을 강화할 수 있으므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질은 모두 B7H6-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 B7H6-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 면역 접합체; 3) 전술한 조성물; 4) 전술한 약물; 5) 전술한 핵산; 6) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 7) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합하여 B7H6와 NKp30 사이의 상호 작용을 촉진하고, NK 세포의 항암 기능을 강화할 수 있으므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 물질은 모두 B7H6-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따른 방법은 B7H6-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나를 사용하여 테스트 샘플 내 B7H6을 검출하는 단계: 및 상기 B7H6의 검출 결과를 기반으로 상기 테스트 샘플 내 B7H6의 함량을 결정하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6의 검출에 사용될 수 있으며, 또한 B7H6은 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 B7H6의 수준에 따라 상기 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다. 이 밖에, 상기 물질을 이용하여 피험자의 테스트 샘플 내 B7H6의 함량을 모니터링할 수도 있으며, 즉 상기 물질은 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 피험자에 대한 병기 분류에도 사용될 수 있고, B7H6-매개 질환의 예후 평가에도 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 데 있어서, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나의 용도를 제공한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6의 검출에 사용될 수 있으며, 또한 B7H6은 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 B7H6의 수준에 따라 상기 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다.
상기 기술적 해결수단을 통해, 본 발명은 인간 및 원숭이 B7H6에 결합할 수 있는 항-B7H6 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 및 원숭이 B7H6에 결합할 수 있고; B7H6와 NKp30 사이의 상호 작용을 촉진할 수 있으며; NK 세포의 항암 기능을 촉진할 수 있는 특징 중 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 구체적인 실시형태에서 부분적으로 상세히 설명될 것이다.
본 발명의 추가 양태 및 이점은 하기 설명에서 부분적으로 제시될 것이며, 부분적으로는 하기 설명으로부터 자명하거나 본 발명의 실천을 통해 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 및/또는 부가 양태 및 이점은 하기 도면과 함께 실시예의 설명으로부터 명백하고 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 여기서,
첨부된 도면은 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 사용되고 또한 명세서의 일부를 구성하며, 하기 구체적인 실시형태와 함께 본 발명을 해석하기 위해 사용되지만 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 도면에서,
도 1은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 뮤린 B7H6 항체가 인간 B7H6에 결합된 ELISA 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 뮤린 B7H6 항체가 HL60-B7H6 세포에 결합된 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 인간화 B7H6 항체가 인간 B7H6에 결합된 ELISA 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 인간화 B7H6 항체가 HL60-B7H6 세포에 결합된 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 인간화 B7H6 항체가 CHO-K1-cyno B7H6 세포에 결합된 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 인간화 B7H6 항체가 원숭이 B7H6에 결합된 ELISA 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 B7H6 항체가 수용체 NKp30의 결합을 촉진함을 보여주는 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 B7H6 항체가 보체 의존성 세포 독성을 매개하는 효과를 보여주는 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 구체적인 실시형태에 따른 B7H6 항체가 인간 급성 골수성 백혈병 U-937 종양에 대한 누드 마우스의 저항을 촉진함을 보여주는 결과 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하며, 상기 실시예의 예시는 도면에 도시된다. 첨부된 도면을 참조하여 후술되는 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐, 본 발명에 대한 한정으로 이해해서는 안된다.
용어 "제 1", "제 2"는 단지 설명의 목적을 위한 것일 뿐, 상대적인 중요성을 시사 또는 암시하거나 또는 시사하는 기술적 특징의 수를 암시적으로 나타내는 것으로 이해해서는 안된다는 점에 유의해야 한다. 따라서, "제 1", "제 2"로 한정된 특징은 명시적 또는 암시적으로 하나 이상의 해당 특징을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명의 설명에 있어서, 별도의 설명이 없는 한, "복수"는 2 개 이상을 의미한다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시형태를 상세히 설명한다. 여기에 설명된 구체적인 실시형태는 본 발명을 설명하고 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에 개시된 범위의 종점과 임의의 값은 상기 정확한 범위 또는 값에 한정되지 않으며, 이러한 범위 또는 값은 이러한 범위 또는 값에 근접한 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 범위의 경우, 각 범위의 종점 값 사이, 각 범위의 종점 값과 개별 포인트 값 사이, 및 개별 포인트 값 사이를 서로 조합하여 하나 이상의 새로운 수치 범위를 얻을 수 있으며, 이러한 수치 범위는 본 명세서에 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 일부 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본 문서의 다른 곳에서 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 아미노산 잔기의 약어는 당업계에서 사용되는 20개의 L-아미노산 중 하나를 지칭하는 표준 3 문자 및/또는 1 문자 코드이다.
본 발명에서, 달리 언급하지 않는 한, 사용되는 용어 항원 결합 단편은 바로 "항체 단편"으로 항체 단편은 일반적으로 완전한 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함할 수 있는 항원 결합성 항체 단편을 의미하며, 항체 단편의 구현예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 등을 포함한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 또는 "CDR 서열"은 항원 결합을 담당하는 항체 내의 아미노산 서열을 의미하는 바, 예를 들어, 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 23-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 부근, 및 중쇄 가변 영역에서 31-35B(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 부근의 아미노산 잔기(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))를 포함하거나; 및/또는 "초가변 루프"(예를 들어, 경쇄 가변 영역에서 26-32(LI), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 영역에서 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3) 부근의 아미노산 잔기(Chothia 및 Lesk J.Mol.Biol.196: 901-917(1987))로부터 유래된다.
용어 "보존적 변형 형태의 아미노산 서열"은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함하며, 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 변형은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 그 중 아미노산 잔기가 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기 패밀리가 당업계에서 확인되었다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄가 있는 아미노산(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄가 있는 아미노산(예: 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있고, 여기에 설명된 기능 측정 방법을 사용하여 변경된 항체의 유지 기능을 테스트할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형의 수는 1개 또는 2개를 초과하지 않는다.
폴리펩티드와 관련하여 용어 "실질적 상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교될 때(뉴클레오티드가 그 중에 적절히 삽입 또는 결실됨) 적어도 약 80%의 아미노산, 일반적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 아미노산이 동일함을 나타낸다.
두 가닥의 서열 사이의 동일성 %는 서열이 최적으로 정렬될 때 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 따라 변하며(즉 상동성 %＝동일한 위치의 수/위치의 총 수Х100), 여기서 최적의 정렬은 두 가닥의 서열의 최적 정렬을 달성하기 위해 도입해야 하는 빈자리 수 및 각 빈자리의 길이에 따라 결정된다. 두 가닥의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율 측정은 하기 비제한적 실시예에서 설명된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
항체 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 전제 하에(적어도 95% 활성을 유지함), 당업자는 본 발명의 서열에 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 또는 그 이상)의 아미노산을 교체, 추가 및/또는 삭제하여 상기 항체 또는 이의 기능성 단편의 서열 변이체를 얻을 수 있다. 이들은 본 발명의 보호 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 예를 들어 가변 영역에서 유사한 성질을 갖는 아미노산을 대체한다. 본 발명에 따른 변이체의 서열은 참조 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성(또는 상동성)을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN을 사용할 수 있다. 본 발명에 언급된 아미노산 서열은 모두 N-말단 내지 C-말단 방식으로 표시된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 항체는 전장(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나 항원 결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만 포함할 수 있거나, 기능에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-B7H6 항체를 포함한다. 일부 적용에서, 원치 않는 글리코실화 부위 또는 올리고당 사슬 상에 푸코스가 존재하지 않는 부분을 제거하기 위해 항체를 변형시키는 것은 예를 들어 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 기능을 향상시키는 데 유용할 수 있다. 다른 일부 적용에서, 보체 의존성 세포 독성(CDC)을 변경하기 위해 갈락토실화 변형을 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "기능성 단편"은 특히 Fv, scFv(sc는 단일 사슬을 의미함), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아바디(diabody)와 같은 항체 단편을 의미하거나, 또는 화학적으로 변형되거나 리포좀에 혼입되어 반감기를 증가시킬 수 있는 임의의 단편을 의미하며, 상기 화학적 변형은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜("페길화, PEG화")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG로 명명된 페길화 단편)("PEG"는 폴리에틸렌 글리콜임)과 같은 폴리(알킬렌) 글리콜의 첨가이고, 상기 단편은 B7H6 결합 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 기능성 단편은 이들이 유래된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 부분 서열로 구성되거나 이를 포함하고, 상기 부분 서열은 이들이 유래된 항체와 동일한 결합 특이성 및 충분한 친화력을 유지하기에 충분하며, B7H6의 경우, 바람직하게는 이들이 유래된 항체의 친화력의 1/100, 보다 바람직하게는 1/10과 적어도 동일하다. 이러한 기능 단편은 최소 5개의 아미노산, 바람직하게는 이들이 유래된 항체 서열의 10, 15, 25, 50 및 100개의 연속 아미노산을 포함할 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 B7H6에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 항체는 B7H6, 특히 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체의 생물학적 수용성을 더욱 향상시키기 위해, 항체는 인간화될 수도 있는데, 즉, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 용어 "키메라 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 한 종(예: 마우스)으로부터의 단일 클론 항체의 불변 영역 아미노산 서열을 다른 종(예: 인간)으로부터의 항체의 불변 영역으로 대체하여 얻은 재조합 항체를 의미한다. 용어 "인간화 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 한 종(예: 마우스)으로부터의 단일 클론 항체의 불변 영역 및 가변 영역의 비-CDR(Fv 프레임워크 영역(FR)) 아미노산 서열을 전부 다른 종(예: 인간)으로부터의 항체의 불변 영역 및 가변 영역의 비-CDR 아미노산 서열로 대체하여 얻은 재조합 항체를 의미한다. 즉, 하나의 항체의 불변 영역이 인간화되면 키메라 항체라 하고, 불변 영역 및 가변 영역의 비-CDR 아미노산 서열을 전부 인간화한 후 인간화 항체라 한다. 인간화 방법은 종래의 항체 공정 기술을 참조하여 수행할 수 있으며, 여기서 더 이상 설명하지 않는다.
본 발명에 의해 제공되는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 18로 표시되거나; 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 20으로 표시된다.
본 발명에 의해 제공되는 면역 접합체는 치료제 및 치료제에 커플링된 전술한 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 치료제에 커플링되는 방식은 통상적인 방식일 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물은 전술한 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 상기 면역 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 함께 작용할 수 있는 한, 시간적 및/또는 공간적으로 분리된 조합을 포함한다. 예를 들어, 상기 조성물에 함유된 성분은 피험자에게 전체적으로 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 상기 조성물에 함유된 성분이 피험자에게 개별적으로 투여되는 경우, 각 성분은 동시에 또는 순차적으로 피험자에게 투여될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 조성물의 투여를 방해하는 불리한 생리학적 반응 없이 피험자에게 조성물을 투여할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, "약학적으로 허용 가능한 벡터"는 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 약학적 조성물의 제조에 유용한 벡터를 의미하며, 바람직하게는, 이러한 벡터 또는 희석제의 구현예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스, 만니톨, 덱스트로스, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 0.3% 글리세린, 투명 알코올, 에탄올, 폴리프로필렌 글리콜, 트리글리세리드, 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 비휘발성 오일과 같은 리포좀 및 비수성 비히클을 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 서로 조합되거나, 하나 이상의 다른 치료 화합물과 조합하여 투여될 수 있는데, 예를 들어, 화학요법제와 조합하여 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 화학요법제를 더 함유할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 면역 접합체는 제2 치료제와 조합될 수도 있으며, 상기 제2 치료제의 예시적인 시약은 B7H6 활성을 억제하는 다른 시약(다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 펩티드 억제제, 소분자 길항제 등 포함) 및/또는 B7H6 상류 또는 하류 신호 전달을 방해하는 시약을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유효량으로 투여되는데, 즉 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어, 치료될 질환과 관련된 증상의 예방 또는 완화를 유발하는 양으로 투여되며, 상기 질환은 예를 들어 B7H6과 관련된 질환이다. 피험자에게 투여되는 조성물의 유효량은 질환의 유형, 중증도 및 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성과 같은 개체 특징에 따라 달라질 수 있고; 질환의 중증도 및 유형에 따라 달라질 수도 있으며, 당업자는 이러한 요인 등에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 샘플 내 B7H6 검출용 키트는 상기와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 샘플은 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 환자(특히 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환 또는 암환자, 보다 바람직하게는 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나를 앓고 있는 환자)의 조직일 수 있다. 상기 키트는 코팅액 등과 같은 통상적인 B7H6 검출용 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 샘플 내 B7H6 검출용 시약의 제조에 있어서 상기와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 전술한 바와 같이, 상기 샘플은 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 환자의 조직일 수 있으며, 여기서는 더 이상 설명하지 않는다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7H6과 양호한 친화성을 가져 샘플 내 B7H6을 효과적으로 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 B7H6-매개 질환의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조에 있어서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 B7H6-매개 질환은 이식 거부, 자가 면역 질환, 감염성 질환 또는 암이다. 보다 바람직하게는, 상기 암은 B7H6을 발현하는 암이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 감염성 질환은 HIV 바이러스 감염 및/또는 B형 간염 바이러스 감염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 약물에 관한 것으로, 상기 약물은 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 약물은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 약물은 약학적으로 허용 가능한 벡터 및 유효량의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 B7H6-매개 질환(전술한 바와 같음)의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 재조합 세포, 핵산 및 약물 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 여기서, 투여 방식은 경구 투여, 비강 투여, 피내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여 또는 정맥 투여 또는 복강 내 투여일 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합하여 B7H6와 NKp30 사이의 상호 작용을 촉진하고, NK 세포의 항암 기능을 강화할 수 있다. 따라서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 물질은 모두 B7H6-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따른 방법은 B7H6-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명에서 언급된 "환자" 또는 "피험자"는 일반적으로 영장류 동물 및/또는 설치류 동물, 특히 인간 또는 마우스와 같은 포유동물을 지칭한다.
당업자는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA 분자를 벡터(특히 발현 벡터)에 클로닝하여 숙주 세포를 형질전환하고, 발현을 유도함으로써 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 (분리된) 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공한다. 상기 핵산은 바람직하게는 유전 공학 수단으로 얻어진 발현 카세트이다.
재조합 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 의미할 수 있고, 이는 상기 핵산과 시판되는 벡터(예: 플라스미드 또는 바이러스 벡터)를 작동 가능하게 연결하여 얻을 수 있으며, 일반적으로 사용되는 플라스미드는 pSeTag2, PEE14, pMH3 등을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 코딩된 상기 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및/또는 불변 영역의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 2종의 발현 벡터, 즉 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 발현 벡터와 경쇄 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 발현 벡터를 별도로 구축하여 포유동물 세포를 함께 형질감염시킬 수도 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 프로모터, 분비 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 및 스크리닝을 위한 적어도 하나의 약물 내성 유전자를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 원핵 숙주 세포, 진핵 숙주 세포 또는 파지일 수 있다. 상기 원핵 숙주 세포는 대장균, 고초균, 스트렙토마이세스 또는 프로테우스 미라빌리스 등일 수 있다. 상기 진핵 숙주 세포는 피키아 파스토리스, 양조 효모, 분열 효모, 자일로마이신 등 진균, 군대벌레 등 곤충 세포, 담배 등 식물 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포 등 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이고, 보다 바람직하게는 BHK 세포, CHO 세포, NSO 세포 또는 COS 세포이다.
본 발명은 재조합 세포에 관한 것으로, 상기 재조합 세포는 전술한 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체, 또는 항체 또는 항원 결합 단편을 운반한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환시켜 얻는다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적합한 조건에서 상기 항체를 고효율적으로 발현할 수 있고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합할 수 있으며, 나아가, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 양호한 B7H6-매개 질환의 예방 및/또는 치료 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 재조합 세포는 특별히 한정되지 않으며, 원핵 세포, 진핵 세포 또는 파지일 수 있음에 유의해야 한다. 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균, 스트렙토마이세스 또는 프로테우스 미라빌리스 등일 수 있다. 상기 진핵 세포는 피키아 파스토리스, 양조 효모, 분열 효모, 자일로마이신 등 진균, 군대벌레 등 곤충 세포, 담배 등 식물 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포 등 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 세포는 바람직하게는 BHK 세포, CHO 세포, NSO 세포 또는 COS 세포를 포함하는 포유동물 세포이고, 동물 생식 세포, 수정란 또는 배아 줄기 세포는 포함하지 않는다.
본원 발명의 명세서에서 언급된 "적합한 조건"은 본원 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현에 적합한 조건을 의미함에 유의해야 한다. 당업자는 항체 또는 항원 결합 단편의 발현에 적합한 조건이 적절한 형질전환 또는 형질감염 방식, 적절한 형질전환 또는 형질감염 조건, 건강한 숙주 세포 상태, 적절한 숙주 세포 밀도, 적합한 세포 배양 환경, 적합한 세포 배양 시간을 포함하나 이에 한정되지 않음을 용이하게 이해할 수 있다. "적합한 조건"은 특별히 한정되지 않으며, 당업자는 실험실의 구체적 환경에 따라 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 최적 발현 조건을 최적화할 수 있다.
본 발명은 또한 B7H6-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 조성물, 약물, 핵산, 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 재조합 세포의 용도에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합하여 B7H6와 NKp30 사이의 상호 작용을 촉진하고, NK 세포의 항암 기능을 강화할 수 있으므로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적절한 조건에서 발현시킬 수 있는 물질은 모두 B7H6-매개 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, B7H6-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 상기 용도는 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 방법을 제안한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나를 사용하여 상기 B7H6의 검출 결과를 기반으로 상기 테스트 샘플 내 B7H6의 함량을 결정하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6의 검출에 사용될 수 있으며, 또한 B7H6은 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 B7H6의 수준에 따라 상기 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다. 이 밖에, 상기 물질을 이용하여 피험자의 테스트 샘플 내 B7H6의 함량을 모니터링할 수도 있으며, 즉 상기 물질은 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 피험자에 대한 병기 분류에도 사용될 수 있고, B7H6-매개 질환의 예후 평가에도 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 방법은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 테스트 샘플 내 B7H6의 함량이 질환에 대한 최저 기준보다 낮지 않다는 것은 테스트 샘플이 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 환자로부터 유래된 것임을 시사한다. 상기 최저 기준값은 상기 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 많은 개체와 많은 건강한 개체의 테스트할 샘플 내 B7H6의 함량 차이를 비교 분석하고 검증하여 결정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 테스트 샘플은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 땀, 대변 및 소변 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 데 있어서, 1) 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 2) 전술한 핵산; 3) 전술한 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및 4) 전술한 재조합 세포; 중 적어도 하나의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 본 발명 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6에 효과적으로 결합할 수 있으므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 B7H6의 검출에 사용될 수 있으며, 또한 B7H6은 다양한 질환을 매개하므로, 피험자로부터 유래한 생물학적 샘플에 포함된 상기 B7H6의 수준에 따라 상기 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 용도는 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나이다.
본 발명에 언급된 서열에 대한 상세한 설명은 표 1을 참조하기 바란다.
아미노산 서열 설명표
SEQ ID NO: 서열 설명
1 GYTFTSYY 12F5 HCDR1
2 INPSNGGT 12F5 HCDR2
3 TRTLYYGNDWYFDV 12F5 HCDR3
4 SSVNY 12F5 LCDR1
5 DTS 12F5 LCDR2
6 QQWSSNPVT 12F5 LCDR3
7 GYTFTDYN 12G4 HCDR1
8 INPNNGGT 12G4 HCDR2
9 ARSEVFYGNYADY 12G4 HCDR3
10 QSVDYDGDSY 12G4 LCDR1
11 AAS 12G4 LCDR2
12 QQSKEDPRT 12G4 LCDR3
13 QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRTLYYGNDWYFDVWGAGTTVTVSS 뮤린 12F5 중쇄 가변 영역
14 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVNYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPVTFGAGTKLELK 뮤린 12F5 경쇄 가변 영역
15 EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS 뮤린 12G4 중쇄 가변 영역
16 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK 뮤린 12G4 경쇄 가변 영역
17 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRTLYYGNDWYFDVWGQGTTVTVSS 인간화 12F5중쇄 가변 영역
18 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVNYMHWYQQKPDQSPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPVTFGQGTKLEIK 인간화 12F5경쇄 가변 영역
19 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS 인간화 12G4중쇄 가변 영역
20 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK 인간화 12G4경쇄 가변 영역
21 MTWRAAASTCAALLILLWALTTEGDLKVEMMAGGTQITPLNDNVTIFCNIFYSQPLNITSMGITWFWKSLTFDKEVKVFEFFGDHQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLEVVASPASRLLLDQVGMKENEDKYMCESSGFYPEAINITWEKQTQKFPHPIEISEDVITGPTIKNMDGTFNVTSCLKLNSSQEDPGTVYQCVVRHASLHTPLRSNFTLTAARHSLSETEKTDNFSIHWWPISFIGVGLVLLIVLIPWKKICNKSSSAYTPLKCILKHWNSFDTQTLKKEHLIFFCTRAWPSYQLQDGEAWPPEGSVNINTIQQLDVFCRQEGKWSEVPYVQAFFALRDNPDLCQCCRIDPALLTVTSGKSIDDNSTKSEKQTPREHSDAVPDAPILPVSPIWEPPPATTSTTPVLSSQPPTLLLPLQ B7H6 단백질
22 DLKVEMMAGGTQITPLNDNVTIFCNIFYSQPLNITSMGITWFWKSLTFDKEVKVFEFFGDHQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLEVVASPASRLLLDQVGMKENEDKYMCESSGFYPEAINITWEKQTQKFPHPIEISEDVITGPTIKNMDGTFNVTSCLKLNSSQEDPGTVYQCVVRHASLHTPLRSNFTLTAARHSLSETEKTDNFSLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 재조합 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질
23 DLKVEMMARGIQATRLNDSVTISCKVIYSQPLNITSMGITWFRKSLTLDKEVKVFEFFGDHQKAFRPGANVSLWRLKSGDASLKLPGVQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLKVVASPTSRLFQDQAVVKENEGKYMCESSRFYPKDINITWEKWTQKSPHHVVISENVITGPTIKNMDGTFNITSYLKLNSSQEDPGTVYRCVIRHESLHTPVSIDFILTAPQQSLSEPEKTDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 재조합 게잡이 원숭이 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질
24 MAWRAASSACAAPLLLWCALMTAGDLKVEMMARGIQATRLNDSVTISCKVIYSQPLNITSMGITWFRKSLTLDKEVKVFEFFGDHQKAFRPGANVSLWRLKSGDASLKLPGVQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLKVVASPTSRLFQDQAVVKENEGKYMCESSRFYPKDINITWEKWTQKSPHHVVISENVITGPTIKNMDGTFNITSYLKLNSSQEDPGTVYRCVIRHESLHTPVSIDFILTAPQQSLSEPEKTDIFSIYGWLFSFIAAGLILLIVLIHWKKVPLREEEGRN 게잡이 원숭이 B7H6 단백질
25 WVSQPPEIRTLEGSSAFLPCSFNASQGRLAIGSVTWFRDEVVPGKEVRNGTPEFRGRLAPLASSRFLHDHQAELHIRDVRGHDASIYVCRVEVLGLGVGTGNGTRLVVEKEHPQLGENLYFQSLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 재조합 NKp30 세포외 영역 Fc 융합 단백질
26 QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRTLYYGNDWYFDVWGAGTTVTVSS AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 뮤린 12F5 중쇄
27 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVNYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPVTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 뮤린 12F5 경쇄
28 EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 뮤린 12G4 중쇄
29 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 뮤린 12G4 경쇄
30 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRTLYYGNDWYFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 인간화 12F5중쇄
31 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVNYMHWYQQKPDQSPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPVTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 인간화 12F5경쇄
32 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 인간화 12G4중쇄
33 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 인간화 12G4경쇄
본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산은 본 발명의 범위 내에 있는 바, 당업자는 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 따라 상응한 핵산 서열을 쉽게 얻을 수 있으며, 이를 표 2에 나타내었다.
뉴클레오티드 서열 설명표
SEQ ID NO: 서열 설명
34 GGGTACACATTTACCAGCTACTAT 12F5 HCDR1
35 ATTAATCCATCTAACGGGGGAACC 12F5 HCDR2
36 ACTAGGACCCTGTATTACGGTAACGACTGGTATTTCGATGTG 12F5 HCDR3
37 TCTTCTGTTAACTAT 12F5 LCDR1
38 GACACCTCC 12F5 LCDR2
39 CAGCAATGGAGCAGTAATCCAGTCACA 12F5 LCDR3
40 GGGTACACATTTACAGACTACAAT 12G4 HCDR1
41 ATCAATCCAAACAATGGCGGTACC 12G4 HCDR2
42 GCTCGCTCTGAAGTCTTTTATGGGAATTATGCTGACTAC 12G4 HCDR3
43 CAGAGCGTGGACTATGATGGCGACAGCTAT 12G4 LCDR1
44 GCCGCCTCC 12G4 LCDR2
45 CAGCAGAGCAAAGAGGATCCTAGAACC 12G4 LCDR3
46 CAGGTGCAGTTGCAACAATCTGGTGCAGAGCTGGTGAAACCTGGTGCATCAGTGAAGCTTTCATGTAAAGCTTCCGGGTACACATTTACCAGCTACTATATGTACTGGGTTAAGCAGCGTCCTGGACAGGGTCTGGAGTGGATCGGCGAGATTAATCCATCTAACGGGGGAACCAACTTTAACGAAAAGTTCAAGTCTAAGGCTACACTGACAGTCGATAAATCCTCATCCACCGCCTACATGCAGCTCTCTTCTCTGACTTCAGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCACTAGGACCCTGTATTACGGTAACGACTGGTATTTCGATGTGTGGGGTGCCGGTACAACAGTGACCGTGTCCTCA 뮤린 12F5 중쇄 가변 영역
47 CAAATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCAATAATGTCCGCATCTCCTGGTGAGAAAGTGACCATGACTTGTTCAGCTTCCTCTTCTGTTAACTATATGCACTGGTACCAACAGAAGTCTGGCACCTCCCCAAAGCGGTGGATTTATGACACCTCCAAGCTGGCTAGCGGGGTACCCGCAAGGTTCTCCGGTTCAGGCAGCGGCACTTCTTACTCCCTGACTATTAGCTCTATGGAGGCAGAGGATGCCGCTACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGTAATCCAGTCACATTTGGGGCCGGAACCAAGCTGGAGCTGAAG 뮤린 12F5 경쇄 가변 영역
48 GAAGTTCTGCTTCAGCAGTCTGGCCCAGAAGTTGTTAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAAATTACTTGCAAGGCCTCCGGGTACACATTTACAGACTACAATATGGACTGGGTGAAGCAGTCCCATGGAAAGAGTCTGGAATGGATCGGCGATATCAATCCAAACAATGGCGGTACCCTCTATAACCAGAAATTTCGCGGACGTGTGACCTTGATCGTCGACAAAAGTAGTTCTACTGCCTACATGGAGCTGCGCAGCCTGACTAGTGACGACACCGCCGTCTACTATTGCGCTCGCTCTGAAGTCTTTTATGGGAATTATGCTGACTACTGGGGCCAGGGTACCACTTTGACCGTCTCCAGT 뮤린 12G4 중쇄 가변 영역
49 GACATTGTGCTGACTCAGAGTCCTGTAAGTCTGGCAGTTCCCCTCGGCCAAAGAGCTACCATTAGTTGTAAGGCTTCCCAGAGCGTGGACTATGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCATTCAGGTATCCCTGTGCGATTTTCTGGTAGTGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTGAATATCCATCCAGTTGAGGAGGAGGATGCTGCCTCTTACTACTGTCAGCAGAGCAAAGAGGATCCTAGAACCTTCGGCGGTGGCACTAAGCTGGAAATTAAG 뮤린 12G4 경쇄 가변 영역
50 GAAGTTCAACTGGTTCAGAGCGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCAGGTGCCAGCGTGAAAGTTAGTTGCAAGGCATCCGGATACACTTTCACTAGCTATTATATGTATTGGGTGCGACAGGCCCCAGGGCAAGGTTTGGAGTGGATCGGAGAGATCAATCCTTCAAATGGCGGCACAAATTTCAACGAAAAGTTCAAATCTCGCGTGACTCTGACAGTGGACAAGTCCATCTCCACAGCATATATGGAGCTGAGCCGGCTTAGATCCGATGACACTGCTGTCTACTATTGTACAAGAACACTGTACTATGGCAACGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGACAGGGGACCACTGTGACCGTCTCCAGT 인간화 12F5중쇄 가변 영역
51 GAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGATTTCCAGAGTGTCACACCAAAGGAGAAGGTAACAATTACATGCAGTGCCAGCAGTAGCGTGAACTATATGCATTGGTATCAGCAGAAACCCGATCAGTCCCCTAAGCGACTGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCAGCGGTGTTCCAAGTAGGTTCTCTGGCAGCGGGTCTGGGACAGACTACACTCTCACTATCAACTCTCTGGAAGCTGAGGATGCTGCTACTTATTATTGCCAGCAGTGGAGCTCAAATCCCGTTACCTTTGGCCAGGGTACCAAGCTCGAAATTAAA 인간화 12F5경쇄 가변 영역
52 GAAGTGCAGCTTGTACAGAGTGGAGCAGAGGTCAAGAAACCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTATACCTTTACTGATTACAACATGGACTGGGTCCGTCAGGCTCCTGGAAAAGGACTGGAGTGGATTGGTGACATTAATCCTAATAACGGCGGCACACTTTACAATCAGAAGTTTCGTGGTAGAGTTACACTGACTGTGGATAAATCAATCAGCACCGCCTATATGGAGCTGTCCCGACTGCGGTCCGACGATACTGCAGTGTATTACTGCGCCAGGTCAGAGGTGTTTTACGGTAACTACGCAGACTATTGGGGCCAGGGGACAACAGTGACAGTCAGCAGC 인간화 12G4중쇄 가변 영역
53 GACATAGTATTGACCCAGACACCATTGTCTTTGAGCGTTACCCCAGGCCAGCCAGCTTCAATATCTTGCAAGGCCTCTCAGTCCGTCGACTATGATGGCGATTCCTACATGAATTGGTACCTCCAAAAGCCAGGCCAACCACCACAGCTGTTGATTTATGCCGCTTCTACACTCCACAGTGGCGTGCCCGATCGATTTTCAGGATCCGGCTCAGGGACCGATTTCACCCTTAAGATTTCTCGAGTGGAAGCCGAGGATGTGGGCGTGTATTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGATCCTAGAACTTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATTAAA 인간화 12G4경쇄 가변 영역
54 ATGACGTGGAGGGCTGCCGCCTCCACGTGCGCGGCGCTCCTGATTCTGCTGTGGGCGCTGACGACCGAAGGTGATCTGAAAGTAGAGATGATGGCAGGGGGGACTCAGATCACACCCCTGAATGACAATGTCACCATATTCTGCAATATCTTTTATTCCCAACCCCTCAACATCACGTCTATGGGTATCACCTGGTTTTGGAAGAGTCTGACGTTTGACAAAGAAGTCAAAGTCTTTGAATTTTTTGGAGATCACCAAGAGGCATTCCGACCTGGAGCCATTGTGTCTCCATGGAGGCTGAAGAGTGGGGACGCCTCACTGCGGCTGCCTGGAATCCAGCTGGAGGAAGCAGGAGAGTACCGATGTGAGGTGGTGGTCACCCCTCTGAAGGCACAGGGAACAGTCCAGCTTGAAGTTGTGGCTTCCCCAGCCAGCAGATTGTTGCTGGATCAAGTGGGCATGAAAGAGAATGAAGACAAATATATGTGTGAGTCAAGTGGGTTCTACCCAGAGGCTATTAATATAACATGGGAGAAGCAGACCCAGAAGTTTCCCCATCCCATAGAGATTTCTGAGGATGTCATCACTGGTCCCACCATCAAGAATATGGATGGCACATTTAATGTCACTAGCTGCTTGAAGCTGAACTCCTCTCAGGAAGACCCTGGGACTGTCTACCAGTGTGTGGTACGGCATGCGTCCTTGCATACCCCCTTGAGGAGCAACTTTACCCTGACTGCTGCTCGGCACAGTCTTTCTGAAACTGAGAAGACAGATAATTTTTCCATTCATTGGTGGCCTATTTCATTCATTGGTGTTGGACTGGTTTTATTAATTGTTTTGATTCCTTGGAAAAAGATATGTAACAAATCATCTTCAGCCTATACTCCTCTCAAGTGCATTCTGAAACACTGGAACTCCTTTGACACTCAGACTCTGAAGAAAGAGCACCTCATATTCTTTTGCACTCGGGCATGGCCGTCTTACCAGCTGCAGGATGGGGAGGCTTGGCCTCCTGAGGGAAGTGTTAATATTAATACTATTCAACAACTAGATGTTTTCTGCAGACAGGAGGGCAAATGGTCCGAGGTTCCTTATGTGCAAGCCTTCTTTGCCTTGCGAGACAACCCAGATCTTTGTCAGTGTTGTAGAATTGACCCTGCTCTCCTAACAGTTACATCAGGCAAGTCCATAGATGATAATTCCACAAAGTCTGAGAAACAAACCCCTAGGGAACACTCGGATGCAGTTCCGGATGCCCCAATCCTTCCTGTCTCCCCTATCTGGGAACCTCCTCCAGCCACAACATCAACAACTCCAGTTCTATCCTCCCAACCCCCAACTTTACTGTTACCCCTACAGTAA B7H6 단백질
55 GACCTGAAGGTGGAAATGATGGCAGGGGGTACTCAGATAACACCTCTCAATGATAATGTCACAATTTTTTGTAACATCTTTTACTCTCAGCCACTTAATATCACCTCCATGGGAATCACTTGGTTTTGGAAGTCATTGACCTTCGATAAGGAGGTGAAGGTATTTGAGTTTTTCGGGGACCACCAGGAAGCTTTCCGACCAGGAGCAATTGTGTCCCCTTGGCGCTTGAAGTCTGGCGACGCCAGCTTGAGACTTCCTGGAATCCAATTGGAGGAAGCTGGGGAGTACAGATGTGAGGTTGTCGTGACTCCTCTGAAAGCTCAGGGTACCGTGCAGTTGGAGGTTGTCGCCTCACCCGCTTCCCGGCTTCTGCTGGACCAGGTTGGAATGAAGGAGAACGAAGATAAGTATATGTGCGAGAGTTCCGGATTTTATCCCGAGGCCATCAACATTACATGGGAGAAACAGACCCAAAAGTTTCCTCACCCCATTGAAATCAGCGAGGATGTGATTACCGGACCCACCATTAAAAATATGGATGGCACTTTCAACGTTACCTCATGTTTGAAATTGAACAGTAGTCAGGAAGACCCTGGAACAGTCTATCAGTGCGTCGTGAGACACGCATCCCTCCATACACCTCTGCGTTCAAACTTCACTCTCACTGCCGCCAGGCATAGCCTGAGCGAGACCGAGAAGACCGATAACTTCTCTCTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCACCCTGTCCAGCCCCTGAGCTGCTGGGGGGGCCCTCCGTGTTCCTTTTCCCTCCAAAACCCAAGGACACCCTGATGATCTCTAGAACCCCCGAAGTCACATGCGTGGTGGTAGATGTCTCTCATGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTCGATGGAGTGGAGGTGCATAACGCCAAGACTAAGCCTAGGGAAGAGCAGTATAATTCAACCTACCGCGTCGTGTCTGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGACTGGCTCAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCTAACAAGGCTCTGCCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAACCCAGGGAGCCCCAAGTCTACACACTGCCTCCATCACGTGAAGAGATGACTAAAAATCAAGTTAGTTTGACCTGCTTGGTTAAGGGCTTCTATCCATCTGATATAGCAGTCGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAAAACAACTACAAGACAACTCCACCCGTCTTGGACTCCGACGGTAGTTTTTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGATAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCATGTTCCGTCATGCATGAAGCTCTCCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGTCTCTCTCCCGGTAAA 재조합 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질
56 GATTTGAAGGTGGAGATGATGGCTCGAGGAATTCAGGCCACCAGACTCAACGACAGCGTCACAATCTCTTGCAAAGTGATCTATAGTCAGCCCCTCAACATAACCAGTATGGGAATTACCTGGTTTCGCAAATCACTGACTTTGGATAAAGAGGTTAAAGTCTTTGAATTTTTTGGCGATCACCAGAAGGCCTTCAGACCCGGAGCAAATGTGTCCCTGTGGAGGCTGAAGTCTGGCGACGCTAGCCTGAAACTTCCAGGAGTTCAGCTCGAAGAGGCCGGCGAGTACAGGTGCGAAGTTGTAGTAACCCCTCTCAAAGCACAGGGCACCGTTCAGCTGAAGGTGGTGGCTTCACCTACTTCTAGACTTTTCCAGGATCAGGCCGTGGTTAAGGAGAACGAGGGCAAATATATGTGCGAGTCCTCTCGTTTTTATCCCAAAGACATCAATATCACCTGGGAGAAATGGACACAGAAATCACCTCACCACGTTGTAATTAGCGAGAACGTGATCACAGGCCCCACAATAAAGAACATGGACGGAACTTTCAATATAACCTCCTACTTGAAGCTGAACTCCTCTCAAGAAGATCCTGGCACTGTGTATAGATGTGTGATTAGGCACGAGAGCCTCCACACACCCGTCTCTATTGACTTCATATTGACTGCACCACAGCAGTCTCTGTCTGAACCAGAAAAGACCGATCCAAAATCCTGTGACAAGACTCATACATGTCCTCCTTGTCCAGCACCAGAGCTGCTTGGTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCAAGAACCCCCGAGGTGACTTGTGTGGTCGTGGATGTGAGCCACGAGGATCCTGAAGTCAAATTCAATTGGTACGTTGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAAACCAAGCCACGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGTTGCATCAGGACTGGCTTAATGGAAAAGAATACAAGTGTAAGGTCTCCAATAAAGCTCTCCCTGCCCCAATCGAGAAGACTATCTCTAAGGCTAAAGGACAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCCCCAAGCCGAGATGAATTGACAAAAAATCAGGTTTCCTTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCATCTGATATCGCCGTTGAGTGGGAGAGCAATGGACAGCCTGAGAACAATTACAAAACAACCCCTCCTGTGTTGGATAGTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCTAAGCTTACCGTGGATAAGTCTAGATGGCAGCAAGGAAATGTGTTTTCCTGCAGCGTAATGCACGAAGCACTTCATAATCATTATACACAGAAGTCTCTCTCTCTTAGCCCAGGGAAG 재조합 게잡이 원숭이 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질
57 ATGGCATGGAGAGCTGCATCTTCCGCTTGTGCTGCTCCTTTGCTTCTGTGGTGTGCTTTGATGACTGCCGGAGACCTGAAAGTCGAAATGATGGCTAGAGGAATCCAAGCTACTCGCCTGAATGATAGTGTGACAATCTCATGTAAAGTAATTTATTCCCAGCCTTTGAACATCACCTCTATGGGCATTACCTGGTTTCGCAAGAGTCTCACCCTGGATAAAGAGGTAAAAGTGTTCGAGTTCTTTGGAGACCATCAAAAAGCTTTCCGCCCTGGAGCTAATGTGAGCCTTTGGCGCCTGAAGAGTGGAGACGCCAGTCTGAAATTGCCTGGTGTGCAGCTCGAAGAGGCTGGTGAATATAGGTGCGAAGTGGTGGTGACTCCTCTGAAGGCTCAGGGGACCGTCCAGCTTAAAGTGGTGGCCAGTCCTACCAGTCGCCTGTTTCAGGACCAGGCAGTGGTCAAGGAGAACGAAGGTAAATATATGTGTGAATCTTCTCGTTTCTACCCAAAGGATATTAATATCACCTGGGAGAAGTGGACCCAAAAGAGCCCACACCATGTGGTCATCTCAGAGAATGTGATCACCGGCCCCACCATCAAGAATATGGATGGAACTTTCAATATCACATCTTACCTGAAGCTGAATTCAAGCCAAGAGGATCCTGGAACCGTATATAGGTGCGTCATCAGACATGAGAGCCTCCACACACCCGTGAGCATCGACTTCATTCTGACAGCTCCACAGCAGAGTCTCAGTGAACCTGAGAAAACAGACATTTTTTCTATCTATGGGTGGCTTTTTTCTTTTATCGCCGCTGGGCTGATCTTGCTGATCGTGCTCATCCACTGGAAAAAAGTGCCACTGCGAGAAGAAGAAGGCAGAAAC 게잡이 원숭이 B7H6 단백질
58 TGGGTGAGTCAACCACCTGAGATTAGAACTCTGGAGGGCAGCTCTGCATTCTTGCCATGCTCCTTCAACGCAAGTCAGGGGAGGCTGGCTATCGGTTCCGTAACATGGTTTAGGGATGAGGTGGTGCCAGGAAAAGAAGTGAGGAACGGAACCCCAGAGTTCAGAGGAAGACTGGCCCCTCTGGCAAGTTCCCGCTTTCTGCATGATCACCAAGCCGAACTTCACATTCGCGACGTCAGGGGGCACGACGCATCTATATACGTGTGCAGAGTGGAGGTGCTTGGTCTGGGTGTGGGCACCGGAAACGGCACTCGACTCGTCGTTGAGAAAGAGCATCCACAGCTGGGAGAAAATCTGTACTTTCAGAGCCTCGAACCTAAGTCTTGTGACAAGACCCATACCTGTCCTCCCTGTCCTGCTCCTGAACTGTTGGGGGGCCCCTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAGGACACACTGATGATTAGCAGGACACCAGAAGTCACATGTGTCGTGGTTGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAGGTTAAATTTAATTGGTATGTGGACGGTGTTGAGGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCTCGAGAAGAGCAGTACAATTCCACTTATAGGGTAGTCTCCGTATTGACCGTGCTCCATCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAATGCAAGGTCTCCAATAAGGCCCTTCCAGCCCCAATTGAAAAGACTATTTCAAAGGCCAAGGGGCAACCCAGAGAGCCTCAGGTGTATACACTTCCTCCCTCACGTGAGGAGATGACAAAGAACCAAGTGAGTCTGACATGTCTCGTGAAAGGCTTTTACCCTTCAGACATTGCTGTGGAGTGGGAAAGCAACGGCCAACCCGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGACAGCGATGGGTCTTTCTTTCTCTACAGCAAGCTGACTGTGGACAAAAGTCGCTGGCAGCAAGGCAATGTCTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAAGCCCTCCATAATCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCCAGGAAAG 재조합 NKp30 세포외 영역 Fc 융합 단백질
59 CAGGTGCAGTTGCAACAATCTGGTGCAGAGCTGGTGAAACCTGGTGCATCAGTGAAGCTTTCATGTAAAGCTTCCGGGTACACATTTACCAGCTACTATATGTACTGGGTTAAGCAGCGTCCTGGACAGGGTCTGGAGTGGATCGGCGAGATTAATCCATCTAACGGGGGAACCAACTTTAACGAAAAGTTCAAGTCTAAGGCTACACTGACAGTCGATAAATCCTCATCCACCGCCTACATGCAGCTCTCTTCTCTGACTTCAGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCACTAGGACCCTGTATTACGGTAACGACTGGTATTTCGATGTGTGGGGTGCCGGTACAACAGTGACCGTGTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCTAGTGTATATCCACTTGCCCCTGTCTGCGGCGACACTACAGGGTCTTCTGTGACACTCGGGTGTCTGGTCAAGGGGTATTTCCCTGAGCCAGTGACCCTCACTTGGAACTCAGGCTCCCTTTCTAGCGGCGTCCACACATTTCCAGCCGTGCTTCAGTCTGATCTGTATACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTCACCTCCTCCACATGGCCTTCACAAAGCATAACTTGTAATGTCGCCCACCCTGCCTCATCTACCAAAGTCGACAAGAAGATCGAGCCTCGAGGCCCCACTATCAAACCCTGTCCACCCTGTAAGTGCCCCGCTCCAAACTTGCTGGGCGGACCATCCGTTTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAAGACGTGCTGATGATTTCACTCAGCCCTATTGTCACTTGTGTAGTGGTGGACGTGTCAGAAGATGATCCTGACGTGCAGATTTCCTGGTTTGTCAACAATGTTGAGGTGCATACAGCTCAGACACAGACCCACCGCGAAGATTATAACTCTACTTTGAGGGTCGTTTCCGCCCTGCCAATTCAGCACCAGGACTGGATGTCTGGAAAGGAATTCAAATGTAAAGTGAATAATAAGGACCTCCCCGCTCCCATCGAACGGACTATCTCTAAGCCTAAAGGGAGCGTACGAGCTCCTCAGGTGTATGTCCTGCCCCCCCCAGAGGAAGAAATGACCAAGAAACAGGTGACCCTTACCTGTATGGTTACTGACTTTATGCCTGAGGACATCTATGTAGAGTGGACCAACAACGGGAAGACTGAGTTGAACTACAAAAACACAGAACCTGTGCTTGATAGTGATGGTTCTTATTTCATGTATAGCAAGCTCAGAGTCGAAAAAAAAAACTGGGTGGAACGCAATTCTTACTCCTGTTCCGTGGTGCACGAGGGGTTGCACAATCACCACACTACAAAAAGCTTCAGTAGGACCCCCGGCAAG 뮤린 12F5 중쇄 가변 영역
60 CAAATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCAATAATGTCCGCATCTCCTGGTGAGAAAGTGACCATGACTTGTTCAGCTTCCTCTTCTGTTAACTATATGCACTGGTACCAACAGAAGTCTGGCACCTCCCCAAAGCGGTGGATTTATGACACCTCCAAGCTGGCTAGCGGGGTACCCGCAAGGTTCTCCGGTTCAGGCAGCGGCACTTCTTACTCCCTGACTATTAGCTCTATGGAGGCAGAGGATGCCGCTACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGTAATCCAGTCACATTTGGGGCCGGAACCAAGCTGGAGCTGAAGCGAGCTGATGCAGCTCCCACAGTATCTATTTTTCCTCCATCTTCTGAGCAGCTCACATCTGGTGGGGCCTCCGTGGTCTGCTTCTTGAATAACTTCTATCCTAAGGACATTAACGTGAAATGGAAGATCGACGGATCCGAACGGCAGAACGGAGTGCTTAACAGCTGGACCGACCAGGATAGTAAGGATTCTACATATTCCATGTCTTCCACCCTCACACTCACAAAGGACGAGTATGAGAGACACAACAGCTACACATGTGAAGCCACTCACAAAACCTCCACATCTCCAATTGTGAAGTCCTTTAATAGGAATGAGTGT 뮤린 12F5 경쇄 가변 영역
61 GAAGTTCTGCTTCAGCAGTCTGGCCCAGAAGTTGTTAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAAATTACTTGCAAGGCCTCCGGGTACACATTTACAGACTACAATATGGACTGGGTGAAGCAGTCCCATGGAAAGAGTCTGGAATGGATCGGCGATATCAATCCAAACAATGGCGGTACCCTCTATAACCAGAAATTTCGCGGACGTGTGACCTTGATCGTCGACAAAAGTAGTTCTACTGCCTACATGGAGCTGCGCAGCCTGACTAGTGACGACACCGCCGTCTACTATTGCGCTCGCTCTGAAGTCTTTTATGGGAATTATGCTGACTACTGGGGCCAGGGTACCACTTTGACCGTCTCCAGT GCCAAAACAACAGCCCCTAGTGTATATCCACTTGCCCCTGTCTGCGGCGACACTACAGGGTCTTCTGTGACACTCGGGTGTCTGGTCAAGGGGTATTTCCCTGAGCCAGTGACCCTCACTTGGAACTCAGGCTCCCTTTCTAGCGGCGTCCACACATTTCCAGCCGTGCTTCAGTCTGATCTGTATACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTCACCTCCTCCACATGGCCTTCACAAAGCATAACTTGTAATGTCGCCCACCCTGCCTCATCTACCAAAGTCGACAAGAAGATCGAGCCTCGAGGCCCCACTATCAAACCCTGTCCACCCTGTAAGTGCCCCGCTCCAAACTTGCTGGGCGGACCATCCGTTTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAAGACGTGCTGATGATTTCACTCAGCCCTATTGTCACTTGTGTAGTGGTGGACGTGTCAGAAGATGATCCTGACGTGCAGATTTCCTGGTTTGTCAACAATGTTGAGGTGCATACAGCTCAGACACAGACCCACCGCGAAGATTATAACTCTACTTTGAGGGTCGTTTCCGCCCTGCCAATTCAGCACCAGGACTGGATGTCTGGAAAGGAATTCAAATGTAAAGTGAATAATAAGGACCTCCCCGCTCCCATCGAACGGACTATCTCTAAGCCTAAAGGGAGCGTACGAGCTCCTCAGGTGTATGTCCTGCCCCCCCCAGAGGAAGAAATGACCAAGAAACAGGTGACCCTTACCTGTATGGTTACTGACTTTATGCCTGAGGACATCTATGTAGAGTGGACCAACAACGGGAAGACTGAGTTGAACTACAAAAACACAGAACCTGTGCTTGATAGTGATGGTTCTTATTTCATGTATAGCAAGCTCAGAGTCGAAAAAAAAAACTGGGTGGAACGCAATTCTTACTCCTGTTCCGTGGTGCACGAGGGGTTGCACAATCACCACACTACAAAAAGCTTCAGTAGGACCCCCGGCAAG 뮤린 12G4 중쇄 가변 영역
62 GACATTGTGCTGACTCAGAGTCCTGTAAGTCTGGCAGTTCCCCTCGGCCAAAGAGCTACCATTAGTTGTAAGGCTTCCCAGAGCGTGGACTATGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCATTCAGGTATCCCTGTGCGATTTTCTGGTAGTGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTGAATATCCATCCAGTTGAGGAGGAGGATGCTGCCTCTTACTACTGTCAGCAGAGCAAAGAGGATCCTAGAACCTTCGGCGGTGGCACTAAGCTGGAAATTAAGCGAGCTGATGCAGCTCCCACAGTATCTATTTTTCCTCCATCTTCTGAGCAGCTCACATCTGGTGGGGCCTCCGTGGTCTGCTTCTTGAATAACTTCTATCCTAAGGACATTAACGTGAAATGGAAGATCGACGGATCCGAACGGCAGAACGGAGTGCTTAACAGCTGGACCGACCAGGATAGTAAGGATTCTACATATTCCATGTCTTCCACCCTCACACTCACAAAGGACGAGTATGAGAGACACAACAGCTACACATGTGAAGCCACTCACAAAACCTCCACATCTCCAATTGTGAAGTCCTTTAATAGGAATGAGTGT 뮤린 12G4 경쇄 가변 영역
63 GAAGTTCAACTGGTTCAGAGCGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCAGGTGCCAGCGTGAAAGTTAGTTGCAAGGCATCCGGATACACTTTCACTAGCTATTATATGTATTGGGTGCGACAGGCCCCAGGGCAAGGTTTGGAGTGGATCGGAGAGATCAATCCTTCAAATGGCGGCACAAATTTCAACGAAAAGTTCAAATCTCGCGTGACTCTGACAGTGGACAAGTCCATCTCCACAGCATATATGGAGCTGAGCCGGCTTAGATCCGATGACACTGCTGTCTACTATTGTACAAGAACACTGTACTATGGCAACGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGACAGGGGACCACTGTGACCGTCTCCAGTGCCAGTACAAAGGGACCATCTGTGTTTCCTCTGGCACCTTCATCTAAGAGCACTTCTGGTGGTACTGCTGCTCTGGGCTGCCTTGTAAAGGACTATTTCCCAGAGCCCGTGACCGTCAGTTGGAATTCAGGCGCCCTTACCAGCGGGGTTCACACTTTCCCAGCTGTGTTGCAGTCTTCAGGGCTTTACAGTCTCAGCAGTGTTGTCACCGTCCCTTCCTCCTCACTGGGCACCCAAACCTATATTTGTAATGTCAACCATAAACCAAGTAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCATGTGATAAAACTCACACTTGTCCACCATGCCCTGCTCCCGAACTGTTGGGCGGACCTAGCGTGTTTCTCTTTCCACCCAAACCAAAGGATACCCTGATGATCAGCAGGACTCCCGAGGTGACTTGTGTGGTGGTTGACGTGTCCCATGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTTCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAGTATAACTCTACTTACCGGGTGGTTTCAGTCTTGACTGTGTTGCACCAGGACTGGCTGAATGGAAAGGAGTATAAGTGTAAAGTGAGTAACAAAGCCCTGCCAGCTCCCATTGAGAAGACAATCTCAAAAGCTAAGGGTCAGCCCCGCGAACCACAGGTGTATACACTCCCACCCTCCCGCGAGGAGATGACCAAAAACCAGGTGTCCCTCACCTGCCTGGTCAAGGGATTTTACCCCAGCGATATTGCTGTCGAGTGGGAGTCAAACGGTCAGCCCGAGAATAATTATAAAACTACCCCTCCCGTGCTTGACAGCGATGGATCTTTCTTCCTGTACTCAAAACTGACCGTCGACAAATCCCGATGGCAGCAAGGTAACGTGTTCTCTTGCAGCGTAATGCACGAGGCTCTTCACAATCACTATACTCAGAAGTCACTCAGCCTTAGTCCTGGAAAG 인간화 12F5중쇄 가변 영역
64 GAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGATTTCCAGAGTGTCACACCAAAGGAGAAGGTAACAATTACATGCAGTGCCAGCAGTAGCGTGAACTATATGCATTGGTATCAGCAGAAACCCGATCAGTCCCCTAAGCGACTGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCAGCGGTGTTCCAAGTAGGTTCTCTGGCAGCGGGTCTGGGACAGACTACACTCTCACTATCAACTCTCTGGAAGCTGAGGATGCTGCTACTTATTATTGCCAGCAGTGGAGCTCAAATCCCGTTACCTTTGGCCAGGGTACCAAGCTCGAAATTAAACGTACAGTCGCAGCACCTAGTGTCTTCATCTTTCCTCCCTCTGACGAGCAGTTGAAGAGCGGAACTGCAAGCGTCGTTTGCCTCCTGAACAATTTCTATCCCCGGGAGGCTAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCTCTCCAGAGCGGTAACTCACAAGAGTCTGTTACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCTACCTATAGTCTGAGCTCTACCCTGACACTGTCCAAGGCCGATTACGAGAAACACAAAGTGTATGCCTGCGAAGTAACCCACCAGGGCCTGAGTTCCCCAGTGACCAAGTCTTTCAATAGGGGGGAGTGT 인간화 12F5경쇄 가변 영역
65 GAAGTGCAGCTTGTACAGAGTGGAGCAGAGGTCAAGAAACCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTATACCTTTACTGATTACAACATGGACTGGGTCCGTCAGGCTCCTGGAAAAGGACTGGAGTGGATTGGTGACATTAATCCTAATAACGGCGGCACACTTTACAATCAGAAGTTTCGTGGTAGAGTTACACTGACTGTGGATAAATCAATCAGCACCGCCTATATGGAGCTGTCCCGACTGCGGTCCGACGATACTGCAGTGTATTACTGCGCCAGGTCAGAGGTGTTTTACGGTAACTACGCAGACTATTGGGGCCAGGGGACAACAGTGACAGTCAGCAGCGCCAGTACAAAGGGACCATCTGTGTTTCCTCTGGCACCTTCATCTAAGAGCACTTCTGGTGGTACTGCTGCTCTGGGCTGCCTTGTAAAGGACTATTTCCCAGAGCCCGTGACCGTCAGTTGGAATTCAGGCGCCCTTACCAGCGGGGTTCACACTTTCCCAGCTGTGTTGCAGTCTTCAGGGCTTTACAGTCTCAGCAGTGTTGTCACCGTCCCTTCCTCCTCACTGGGCACCCAAACCTATATTTGTAATGTCAACCATAAACCAAGTAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCATGTGATAAAACTCACACTTGTCCACCATGCCCTGCTCCCGAACTGTTGGGCGGACCTAGCGTGTTTCTCTTTCCACCCAAACCAAAGGATACCCTGATGATCAGCAGGACTCCCGAGGTGACTTGTGTGGTGGTTGACGTGTCCCATGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTTCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAGTATAACTCTACTTACCGGGTGGTTTCAGTCTTGACTGTGTTGCACCAGGACTGGCTGAATGGAAAGGAGTATAAGTGTAAAGTGAGTAACAAAGCCCTGCCAGCTCCCATTGAGAAGACAATCTCAAAAGCTAAGGGTCAGCCCCGCGAACCACAGGTGTATACACTCCCACCCTCCCGCGAGGAGATGACCAAAAACCAGGTGTCCCTCACCTGCCTGGTCAAGGGATTTTACCCCAGCGATATTGCTGTCGAGTGGGAGTCAAACGGTCAGCCCGAGAATAATTATAAAACTACCCCTCCCGTGCTTGACAGCGATGGATCTTTCTTCCTGTACTCAAAACTGACCGTCGACAAATCCCGATGGCAGCAAGGTAACGTGTTCTCTTGCAGCGTAATGCACGAGGCTCTTCACAATCACTATACTCAGAAGTCACTCAGCCTTAGTCCTGGAAAG 인간화 12G4중쇄 가변 영역
66 GACATAGTATTGACCCAGACACCATTGTCTTTGAGCGTTACCCCAGGCCAGCCAGCTTCAATATCTTGCAAGGCCTCTCAGTCCGTCGACTATGATGGCGATTCCTACATGAATTGGTACCTCCAAAAGCCAGGCCAACCACCACAGCTGTTGATTTATGCCGCTTCTACACTCCACAGTGGCGTGCCCGATCGATTTTCAGGATCCGGCTCAGGGACCGATTTCACCCTTAAGATTTCTCGAGTGGAAGCCGAGGATGTGGGCGTGTATTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGATCCTAGAACTTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATTAAACGTACAGTCGCAGCACCTAGTGTCTTCATCTTTCCTCCCTCTGACGAGCAGTTGAAGAGCGGAACTGCAAGCGTCGTTTGCCTCCTGAACAATTTCTATCCCCGGGAGGCTAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCTCTCCAGAGCGGTAACTCACAAGAGTCTGTTACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCTACCTATAGTCTGAGCTCTACCCTGACACTGTCCAAGGCCGATTACGAGAAACACAAAGTGTATGCCTGCGAAGTAACCCACCAGGGCCTGAGTTCCCCAGTGACCAAGTCTTTCAATAGGGGGGAGTGT 인간화 12G4경쇄 가변 영역
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 실시예 또는 시험예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 모두 통상적인 조건에 따라 수행된다.
이하, 실시예를 결합하여 본 발명의 해결수단을 해석한다. 당업자라면 아래 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안됨을 이해할 수 있다. 실시예에서 구체적인 기술이나 조건이 명시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 기재된 기술 또는 조건 또는 제품 사양에 따라 수행된다. 사용되는 시약 또는 기기는 제조업체가 명시되지 않은 경우, 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다.
실시예 1: 항체의 제조
인간 B7H6에 대한 뮤린 단일 클론 항체를 생성하고, 정제된 재조합 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질(B7H6-Fc)(재조합 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 22로 표시됨)을 항원으로 사용하여 Balb/c 마우스(9주령, 상하이 레스크에서 구입, 무게 약 20g)를 면역시켰다.
면역 마우스에 대해 정제 항원 및 완전 프로인트 아쥬반트를 사용하여 3회 면역화를 수행하고, 꼬리 정맥을 통해 방혈한 후 면역 응답을 검출하였다. ELISA, 유세포 분석을 통해 혈청을 스크리닝하여 항-인간 B7H6 면역 글로불린을 갖는 마우스를 얻었다. 가장 높은 항-B7H6 면역 글로불린을 갖는 마우스에서 비장 세포를 꺼내 마우스 골수종 세포인 SP2/0 세포(ATCC 번호 CRL-1581)와 융합하였다. 융합된 하이브리도마 세포를 이용하여 항체 스크리닝을 수행하여 마우스 단일클론 항체를 얻었다.
후보 하이브리도마 세포의 총 수를 106개로 배양하고 800rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 수집하였으며, Trizol 키트(Invitrogen)로 총 RNA를 추출하고; 총 RNA를 주형으로 하여 cDNA 라이브러리(Invitrogen)로 역전사 및 합성하였으며, 또한 cDNA를 주형으로 하여 하이브리도마 세포의 대응되는 가변 영역 핵산 서열을 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 반응에 사용되는 프라이머 서열과 항체 가변 영역의 제1 프레임 워크 영역 또는 신호 펩티드 영역과 불변 영역은 상보적이다(Larrick, J.W., et al., (1990) Scand.J.Immunol., 32, 121-128 및 Coloma, J.J.et al., (1991) BioTechniques, 11, 152-156). 50μl 반응 시스템에 cDNA 2μL, 10ХPCR 완충액 5μL, 상류 및 하류 프라이머 2μL(5μmol), dNTP 2μL, Taq 효소 1μLL(Takara, Ex Taq), H2O 38μL를 각각 첨가하고; 95℃에서 5min 동안 사전 변성하였으며, 온도 사이클에 진입하여 PCR 증폭을 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 30S 동안 변성하고, 58℃에서 45S 동안 어닐링하며, 72℃에서 50S 동안 연장시키고, 총 32 사이클 후, 72℃에서 7 min 동안 연장시켰다. 증폭 생성물을 시퀀싱한 후, 마우스 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열(아미노산 서열 및 핵산 서열 포함)을 얻었다.
실시예 2: 뮤린 B7H6 항체 ELISA 결합 실험
ELISA 실험은 B7H6 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 사용되었다. B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질(B7H6-Fc)을 96-웰 플레이트에 코팅하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 B7H6에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS 완충액으로 B7H6-Fc 융합 단백질(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 22로 표시됨)을 1μg/mL로 희석하여 100μL/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. 96-웰 플레이트에서 PBS 완충액을 흡입하고, PBST(0.1% Tween 20을 포함하는 pH7.2 PBS) 완충액으로 플레이트를 6회 세척한 후, 200μL/웰 PBS/10% BSA를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, PBST/0.05% BSA로 적절한 농도로 희석된 테스트할 B7H6 항체 100μL/웰을 첨가하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, HRP(양고추냉이 과산화효소)로 표지된 항뮤린 항체 2차 항체를 PBST/0.05% BSA로 100μL/웰로 희석하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 80μL/웰 TMB(테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 3min 동안 인큐베이션하였으며, 80μL/웰의 4M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 450mm에서 흡광도를 판독하였다. 결과(도 1)는 본 발명의 뮤린 항체 12F5(SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:27), 12G4(SEQ ID NO:28 및 SEQ ID NO:29)가 B7H6에 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 유세포 분석에 의한 뮤린 B7H6 결합 실험
유세포 분석 실험은 B7H6 항체의 결합 특성을 검출하기 위한 것으로, HL60 세포(ATCC 번호 CCL-240)에서 B7H6 단백질(HL60-B7H6, SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:54)을 과발현하되, 발현 벡터는 pLVX-EF1a-B7H6-IRES-ZsGreen이고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 B7H6에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
HEK293T 세포를 5×105 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 이중 항체가 없는 DMEM 배지를 사용하여 밤새 배양하였다. 형질감염 전에 배지를 버리고, 이중 항체가 없는 신선한 DMEM 배지 1mL를 첨가하였다. pLVX-EF1a-B7H6-IRES-ZsGreen(pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1) 벡터의 효소 절단 부위 EcoRI와 BamHI 사이에 B7H6 단백질(SEQ ID NO: 21)이 삽입된 코딩 서열(SEQ ID NO: 54), pMD2G, psPAX2 벡터(총 3μg)를 2:1:1의 비율로 무혈청 DMEM 배지 200μl에 첨가하고, 12μg 폴리에테르이미드(PEI, Polysciences사)를 첨가하였다. 균일하게 혼합한 후 16min 동안 방치한 다음 모든 액체를 HEK293T 세포가 플레이팅된 6-웰 플레이트에 첨가하였다. 6h 동안 배양한 후, 배지를 버리고, 신선한 완전 DMEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 형질감염 48h 후, 세포 배양 상층액을 수집하여 0.45μm 필터(Millipore)를 통과시켜 바이러스 상층액을 얻었다. 바이러스 상층액을 모두 1×104 HL60 세포를 포함하는 6-웰 플레이트에 첨가하고, 최종 농도가 4μg/ml인 폴리아미드(Sigma)를 첨가하여 12h 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 버리고, 신선한 완전 RPMI1640 배지를 첨가하였다. 얻어진 세포는 HL60-B7H6 세포이다.
PBS로 HL60-B7H6 세포를 2×106/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5ml EP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 염소 혈청을 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 1μg/튜브의 B7H6 항체를 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여 4℃에서 3500rpmХ5min으로 원심분리하고, 상층액을 버린 후, PBS로 1회 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μl/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하였으며, 여기에 0.1μL/튜브 Alexa-647로 표지된 염소 항-뮤린 항체 2차 항체(Invitrogen)를 첨가하고, 4℃ 어둠 속에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하고, 유세포 분석기로 검출한 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 뮤린 항체 12F5(SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:27), 12G4(SEQ ID NO:28 및 SEQ ID NO:29)가 B7H6에 결합할 수 있음을 추가로 보여준다.
실시예 4: 뮤린 항체 인간화 실험
B7H6 항체의 경쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 가변 영역 서열을 참조하여 비-CDR 영역과 가장 매칭되는 인간화 주형을 선택하였다. 뮤린 항체의 CDR 영역을 선택된 인간화 주형에 이식하고, 인간화 주형의 CDR 영역을 대체하여 인간화 항체를 얻었다. 그 후, 뮤린 항체의 3차원 구조를 바탕으로 포매된 잔기, CDR 영역과 직접적으로 상호 작용하는 잔기, 및 VL과 VH의 구조에 중요한 영향을 미치는 잔기를 역돌연변이시켜 인간화된 항체를 얻되, 인간화 B7H6 항체 12F5 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 17로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 18로 표시되거나, 또는 인간화 B7H6 항체 12G4중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 20으로 표시된다.
실시예 5: 인간화 B7H6 항체의 ELISA 결합 실험
ELISA 실험은 인간화 B7H6 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 사용되었다. B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질(B7H6-Fc)을 96-웰 플레이트에 코팅하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 B7H6에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS 완충액으로 B7H6-Fc 융합 단백질(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 22로 표시됨)을 1μg/mL로 희석하여 100μL/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. 96-웰 플레이트에서 PBS 완충액을 흡입하고, PBST(0.1% Tween 20을 포함하는 pH7.2 PBS) 완충액으로 플레이트를 6회 세척한 후, 200μL/웰 PBS/10% BSA를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, PBST/0.05% BSA로 적절한 농도로 희석된 테스트할 B7H6 항체 100μL/웰을 첨가하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, HRP(양고추냉이 과산화효소)로 표지된 항뮤린 항체 2차 항체를 PBST/0.05% BSA로 100μL/웰로 희석하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 80μL/웰 TMB(테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 3min 동안 인큐베이션하였으며, 80μL웰의 4M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 450mm에서 흡광도를 판독하였다. 결과(도 3)는 본 발명의 인간화 항체 h12F5(SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31), h12G4(SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:33)가 B7H6에 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 6: 인간화 B7H6 유세포 분석에 의한 결합 실험
유세포 분석 실험은 B7H6 항체의 결합 특성을 검출하기 위한 것으로, HL60 세포(ATCC 번호 CCL-240)에서 B7H6 단백질(HL60-B7H6)(예: 실시예 3에서 나타낸 바와 같음)을 과발현하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 B7H6에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
PBS로 HL60-B7H6 세포를 2×106/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5ml EP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 마우스 혈청을 첨가하여 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 1μg/튜브의 B7H6 항체를 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여 4℃에서 3500rpmХ5min으로 원심분리하고, 상층액을 버린 후, PBS로 1회 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μl/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하였으며, 여기에 1μL/튜브 Alexa-647로 표지된 마우스 항-인간 IgG-Fc 2차 항체(Biolegend)를 첨가하여 4℃ 어둠 속에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하고, 유세포 분석기로 검출한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 인간화 항체 h12F5(SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31), h12G4(SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:33)가 B7H6에 결합할 수 있음을 추가로 보여준다.
실시예 7: 인간화 B7H6 유세포 분석에 의한 결합 실험
유세포 분석 실험은 인간화 B7H6 항체의 결합 특성을 검출하기 위한 것으로, CHO-K1 세포(ATCC 번호 CCL-240)에서 원숭이 B7H6 단백질(CHO-K1-cyno-B7H6)을 과발현하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 원숭이 B7H6에 대한 항체의 결합 특성을 판단하였다.
HEK293T 세포를 5×105 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 이중 항체가 없는 DMEM 배지를 사용하여 밤새 배양하였다. 형질감염 전에 배지를 버리고, 이중 항체가 없는 신선한 DMEM 배지 1mL를 첨가하였다. pLVX-EF1a-cynoB7H6-IRES-ZsGreen(pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1) 벡터의 효소 절단 부위 EcoRI와 BamHI 사이에 원숭이 B7H6 단백질(SEQ ID NO: 24)이 삽입된 코딩 서열(SEQ ID NO: 57), pMD2G, psPAX2 벡터(총 3μg)를 2:1:1의 비율로 무혈청 DMEM 배지 200μl에 첨가하고, 12μg 폴리에테르이미드(PEI, Polysciences사)를 첨가하였다. 균일하게 혼합한 후 16min 동안 방치한 다음 모든 액체를 HEK293T 세포가 플레이팅된 6-웰 플레이트에 첨가하였다. 6h 동안 배양한 후, 배지를 버리고, 신선한 완전 DMEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 형질감염 48h 후, 세포 배양 상층액을 수집하여 0.45μm 필터(Millipore)를 통과시켜 바이러스 상층액을 얻었다. 바이러스 상층액을 모두 1Х104 CHO-K1 세포를 포함하는 6-웰 플레이트에 첨가하고, 최종 농도가 4μg/ml인 폴리아미드(Sigma)를 첨가하여 12h 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 버리고, 신선한 완전 RPMI1640 배지를 첨가하였다. 얻어진 세포는 CHO-K1-cyno B7H6 세포이다.
PBS로 CHO-K1-cynoB7H6 세포를 2×106/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5mLEP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 마우스 혈청을 첨가하여 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 1μg/튜브의 인간화 B7H6 항체를 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여 4℃에서 3500rpmХ5min으로 원심분리하고, 상층액을 버린 후, PBS로 1회 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μl/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하였으며, 여기에 1μL/튜브 Alexa-647로 표지된 마우스 항-인간 IgG-Fc 2차 항체(Biolegend)를 첨가하여 4℃ 어둠 속에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하고, 유세포 분석기로 검출한 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 항체 h12F5, h12G4가 원숭이 B7H6에 결합할 수 있음을 추가로 보여준다.
실시예 8: 인간화 B7H6 항체의 ELISA 결합 실험
ELISA 실험은 인간화 B7H6 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 사용되었다. 원숭이 B7H6 세포외 영역 Fc 융합 단백질(cynoB7H6-Fc)을 96-웰 플레이트에 코팅하고, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 항체와 원숭이 B7H6의 결합 특성을 검출하였다.
PBS 완충액으로 cynoB7H6-Fc 융합 단백질(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23으로 표시됨)을 1μg/mL로 희석하여 100μL/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하였다. 96-웰 플레이트에서 PBS 완충액을 흡입하고, PBST(0.1% Tween 20을 포함하는 pH7.2 PBS) 완충액으로 플레이트를 6회 세척한 후, 200μL/웰 PBS/10% BSA를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, PBST/0.05% BSA로 적절한 농도로 희석된 테스트할 B7H6 항체 100μL/웰을 첨가하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고, PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, HRP(양고추냉이 과산화효소)로 표지된 항뮤린 항체 2차 항체를 PBST/0.05% BSA로 100μL/웰로 희석하고, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. PBST로 플레이트를 6회 세척한 후, 80μL/웰 TMB(테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 실온에서 3min 동안 인큐베이션하였으며, 80μL/웰의 4M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 450mm에서 흡광도를 판독하였다. 결과(도 6)는 본 발명의 인간화 항체 h12G4가 원숭이 B7H6에 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 생체 외 결합 친화력 및 동역학 실험
Biacore 방법은 단백질의 상호 친화력 및 동역학을 객관적으로 검출하는 공인된 방법으로, Biacore T200을 통해 본 발명의 B7H6 항체의 친화력 및 결합 동역학 특성화를 분석하였다.
표준 아미노 커플링 방법으로 B7H6 세포외 도메인 Fc 융합 단백질(B7H6-Fc)을 CM5(GE) 칩에 공유 결합하였다. 그 후 PBS에 희석된 일련의 농도 구배를 갖는 B7H6 항체를 각 사이클마다 주입하고, 주입 후 10mM NaOH 용액으로 재생시켰다. 항원-항체 결합 동역학을 3분간 추적하고 해리 동역학을 10분간 추적하여 얻은 데이터를 GE의 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 1:1(Langmuir) 결합 모델로 분석하였다. 이러한 방법으로 측정된 뮤린 12F5의 KD값은 2.2nM이고, 뮤린 12G4의 KD값은 0.15nM이었다.
실시예 10: NKp30에 대한 B7H6의 결합 능력을 촉진하는 항체 스크리닝
B7H6 항체는 B7H6 세포외 영역에 결합함으로써 B7H6과 이의 수용체 NKp30 사이의 신호 통로를 촉진하는 것으로, 유세포 분석 실험은 수용체 NKp30 에 결합하는 B7H6 항체의 강화된 결합을 검출하기 위해 사용되었다.
PBS로 HL60-B7H6 세포(위와 같음)를 2×106/mL로 희석하고, 100μL/튜브의 부피로 1.5ml EP 튜브에 첨가하였으며, 여기에 10μL/튜브의 마우스 혈청을 첨가하여 4℃에서 30min 동안 블로킹하였다. 4μg/튜브의 NKp30 세포외 영역 Fc 융합 단백질(NKp30-Fc, SEQ ID NO:25, 본 실험실에서 발현됨)을 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. B7H6 항체를 첨가하고, 4℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다. EP 튜브에 1mL PBS를 첨가하여 4℃에서 3500rpmХ5min으로 원심분리하고, 상층액을 버린 후, PBS로 1회 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, 100μl/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하였으며, 여기에 1μL/튜브647로 표지된 마우스 항-인간 항체 2차 항체(Biolegend)를 첨가하여 4℃ 어둠 속에서 30min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척하고, 원심분리 후 상층액을 버렸다. 200μL/튜브의 PBS로 세포를 재현탁하고, 유세포 분석기로 검출한 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 뮤린 12F5 항체가 B7H6와 수용체 NKp30의 결합을 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실시예 11: 보체 의존성 세포 독성 검출
보체 의존성 세포 독성 실험은 B7H6 항체가 종양 세포에 대한 살상 작용을 검출하기 위해 사용되었다. 여기에 사용된 종양 세포는 HL60-B7H6 세포이다.
(1) 종양 세포를 무혈청 RPMI-1640 배지로 재현탁하고 계수하였다. 완전 RPMI-1640 배지로 4Х105/mL로 희석하였다. 희석된 세포를 25μL/웰의 부피로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다.
(2) 무혈청 RPMI-1640 배지로 B7H6 항체 또는 대조군 마우스 IgG를 희석하고, 희석된 B7H6 항체 또는 마우스 IgG를 25μL/웰의 부피로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다.
(3) 1mL의 초순수로 토끼 보체(Cedarlane)를 용해시킨 후, 1mL의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하여 균일하게 혼합한 후 작업액으로 사용하였다. 40μL/웰의 부피로 보체 작업액을 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 30min 동안 인큐베이션하였다.
(4) 110μL/웰의 부피로 완전 RPMI-1640 배지를 96웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 1μL/웰의 부피로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 7-AAD(BD)를 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 웰 내의 모든 액체를 유동형 튜브로 옮기고, 유세포 분석기로 검출하였다. 결과는 도 8에 도시한 바와 같으며, 이로부터 본 발명의 B7H6 뮤린 12F5 항체는 보체 의존성 세포 독성 작용이 있음을 보아낼 수 있다.
실시예 12: B7H6 항체의 마우스 항암 능력 촉진
생체 내 약물 효능 실험은 B7H6 항체가 누드 마우스의 항암 기능을 촉진하는 작용을 검출하기 위해 사용되었다. 여기에 사용된 종양 세포는 각각 급성 골수성 백혈병 U-937 세포(ATCC 번호 CRL-1953.2)이다.
(1) 누드 마우스의 우측 옆구리 피하 종양을 마우스당 1.5Х106 U-937 세포씩 취한 후, 마우스를 랜덤으로 그룹화하였다.
(2) 5, 7, 9, 11, 13일째에 항체를 마우스당 1mg씩 복강내 주사하였다.
(3) 2일마다 종양 부피를 1회 측정하였다.
그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 본 발명의 뮤린 항체 12F5는 항암 기능을 가짐을 보아낼 수 있다.
상기 실험 결과로부터 본 발명에서 얻어진 항체는 인간 및 원숭이 B7H6에 결합할 수 있고; B7H6과 NKp30 사이의 상호 작용을 촉진할 수 있으며; 마우스의 항암을 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
이상 본 발명의 바람직한 실시형태에 대하여 상세히 설명하였지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 구상 범위 내에서, 다른 적절한 방식으로 각 기술적 특징을 조합하는 것을 포함하여 본 발명의 기술적 해결수단에 대해 다양한 간단한 변형이 이루어질 수 있으며, 이러한 간단한 변형 및 조합도 마찬기지로 본 발명의 개시된 내용으로 간주되어야 하고, 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 명세서의 설명에 있어서, 용어 "일 실시예", "일부 실시예", "예시", "구체적인 예시" 또는 "일부 예시" 등을 참조한 설명은 해당 실시예 또는 예시를 결부하여 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예시에 포함됨을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어의 예시적인 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예시를 가리키는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성은 임의의 하나 이상의 실시예 또는 예시에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 이 밖에, 당업자는 서로 상충되지 않는 범위에서 본 명세서에 설명된 상이한 실시예 또는 예시 및 상이한 실시예 또는 예시의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예를 도시하고 설명하였지만, 상기 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안 된다는 것을 이해할 수 있을 것이며, 당업자는 본 발명의 범위 내에서 상기 실시예에 대한 변경, 수정, 대체 및 변형을 수행할 수 있다.

Claims (27)

  1. B7H6에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3을 포함하되,
    상기 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고;
    상기 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하며;
    상기 중쇄 CDR3은 EQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고;
    상기 경쇄 CDR1은 EQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하며;
    상기 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고; 및
    상기 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    1) SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3: 또는
    2) SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, (i) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 및/또는, (ii) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형 형태의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 (i)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 (ii)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    1) SEQ ID NO: 13으로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:14로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    2) SEQ ID NO: 15로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    3) SEQ ID NO: 17로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열; 또는
    4) SEQ ID NO: 19로 표시되는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    1) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO:27로 표시되는 아미노산 서열;
    2) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 28로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO: 29로 표시되는 아미노산 서열;
    3) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO: 31로 표시되는 아미노산 서열; 또는
    4) 상기 중쇄의 SEQ ID NO: 32로 표시되는 아미노산 서열, 및 상기 경쇄의 SEQ ID NO: 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리된 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 단일 클론 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 인간 개질 항체, 인간 항체, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 면역 접합체로서,
    상기 면역 접합체는 치료제 및 치료제에 커플링된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 접합체.
  11. 조성물로서,
    상기 조성물은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 제10항에 따른 면역 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함하는 조성물.
  12. 샘플 내 B7H6 검출용 키트로서,
    상기 키트는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
  13. 샘플 내 B7H6 검출용 시약의 제조에 있어서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  14. B7H6-매개 질환의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도로서,
    상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 용도.
  15. 핵산으로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산.
  16. 재조합 벡터 또는 형질전환체로서,
    제15항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터 또는 형질전환체.
  17. 재조합 세포로서,
    상기 재조합 세포는 제15항에 따른 핵산, 제16항에 따른 발현 벡터 또는 형질전환체, 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 운반하는 재조합 세포.
  18. 약물로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항에 따른 면역 접합체, 제11항에 따른 조성물, 제15항에 따른 핵산, 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 제17항에 따른 재조합 세포를 포함하는 약물.
  19. B7H6-매개 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항에 따른 면역 접합체, 제11항에 따른 조성물, 제18항에 따른 약물, 제15항에 따른 핵산, 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체 또는 제17항에 따른 재조합 세포의 용도.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 용도.
  21. B7H6-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법으로서,
    1) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    2) 제10항에 따른 면역 접합체;
    3) 제11항에 따른 조성물;
    4) 제18항에 따른 약물;
    5) 제15항에 따른 핵산;
    6) 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및
    7) 제17항에 따른 재조합 세포; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 방법으로서,
    1) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    2) 제15항에 따른 핵산;
    3) 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및
    4) 제17항에 따른 재조합 세포; 중 적어도 하나를 사용하여 테스트 샘플 내 B7H6을 검출하는 단계; 및
    상기 B7H6의 검출 결과를 기반으로 상기 테스트 샘플 내 B7H6의 함량을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 테스트 샘플 내 B7H6의 함량이 질환에 대한 최저 기준보다 낮지 않다는 것은 테스트 샘플이 B7H6-매개 질환을 앓고 있는 환자로부터 유래된 것임을 시사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 피험자가 B7H6-매개 질환을 앓고 있는지 여부를 진단하는 데 있어서,
    1) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    2) 제15항에 따른 핵산;
    3) 제16항에 따른 재조합 벡터 또는 형질전환체; 및
    4) 제17항에 따른 재조합 세포; 중 적어도 하나의 용도.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 B7H6-매개 질환은 암 또는 감염성 질환이고;
    선택적으로, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 결장암, 유방암, 신경아교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평 세포암 및 두경부암 중 적어도 하나인 용도.
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