CN117177770A

CN117177770A - 使用抗tigit抗体与抗pd1抗体组合治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN117177770A
Application number: CN202280010805.7A
Authority: CN
Inventors: 张彤; 薛柳; 刘琦; 魏旻; 李康; 左云霞
Original assignee: Beigene Ltd
Current assignee: Beigene Ltd
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2023-12-05
Also published as: CO2023009626A2; EP4281189A1; TW202243691A; IL304600A; KR20230158464A; MX2023008597A; US20230391883A1; AU2022211109A1; JP2024504331A; WO2022156726A1; BR112023014582A2

Abstract

本披露提供了用特异性结合于TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，WUCAM或Vstm3)及其抗原结合片段的抗体与抗PD1抗体组合治疗癌症或增加、增强或刺激免疫应答的方法。

Description

使用抗TIGIT抗体与抗PD1抗体组合治疗癌症的方法

技术领域

本申请涉及特异性结合TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)的抗体与抗PD1抗体组合用于治疗癌症。

背景技术

TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域)是I型跨膜蛋白，是CD28蛋白家族的成员，其在抗肿瘤免疫中对抑制T细胞和NK细胞介导的功能活性起重要作用(Boles KS等人,2009Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志],39:695-703；Stanietsky N等人,2009PNAS 106:17858-63；Yu X等人2009Nat.Immunol[自然免疫学],10:48-57)。

在小鼠和人中克隆并表征编码TIGIT的基因和cDNA。全长人TIGIT的长度为244个氨基酸的序列(SEQ ID NO:1)，其中前21个氨基酸组成信号肽。成熟人TIGIT的氨基酸序列含有223个氨基酸(aa)残基(NCBI登录号：NM_173799)。成熟人TIGIT的细胞外结构域(ECD)由以下组成：具有V型Ig样结构域(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸39-127)的120个氨基酸残基(SEQ ID NO:2，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸22-141)，随后21个氨基酸跨膜序列、和具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的82个氨基酸细胞质结构域(Yu X等人2009Nat.Immunol[自然免疫学],10:48-57；Stengel KF等人2012PNAS 109:5399-04)。在ECD中，人TIGIT与小鼠和食蟹猴分别仅具有59％和87％氨基酸序列同一性。

TIGIT在T细胞(包括活化的T细胞、记忆T细胞、调节性T(Treg)细胞、和卵泡T辅助(Tfh)细胞)和NK细胞上表达(Boles KS等人,2009Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志],39:695-703；Joller N等人,2014Immunity[免疫力]40:569-81；Levin SD等人,2011Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志],41:902-15；Stanietsky N等人,2009PNAS 106:17858-63；Yu X等人2009Nat.Immunol[自然免疫学],10:48-57)。

迄今为止，已经鉴定出两种TIGIT配体，CD155(也称为脊髓灰质炎病毒受体或PVR)和CD112(也称为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2、PVRL2、粘连蛋白-2)。这些配体主要在APC(如树突状细胞和巨噬细胞)和肿瘤细胞上表达(Casado JG等人,2009Cancer ImmunolImmunother[癌症免疫学与免疫疗法]58:1517-26；Levin SD等人,2011Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志],41:902-15；Mendelsohn CL等人,198956:855-65；Stanietsky N等人,2009PNAS 106:17858-63；Yu X等人2009Nat.Immunol[自然免疫学],10:48-57)。作为免疫“检查点”分子，TIGIT在与其配体CD155和CD112接合时，会在免疫细胞中启动抑制性信号传导。TIGIT与CD155的结合亲和力(Kd：约1nM)远高于其与CD112的结合亲和力，并且TIGIT:CD112相互作用是否在功能上与介导抑制性信号相关仍有待确定。共刺激受体CD226(DNAM-1)以较低亲和力(Kd：约100nM)与相同的配体结合，但递送阳性信号(Bottino C等人,2003JExp Med[实验医学杂志]198:557-67)。此外，CD96(Tactile)(“TIGIT样”受体)在相同途径中也起到类似的抑制作用(Chan CJ等人,2014Nat.Immunol[自然免疫学]15:431-8)。

TIGIT可以通过不同的机制抑制免疫应答。首先，TIGIT和PVR对树突状细胞(DC)的相互作用可以在DC中递送“反向信号传导”，导致IL-10的上调和IL-12分泌的减少，从而抑制T细胞活化(Yu X等人Nat Immunol.[自然免疫]200910:48-57)。其次，TIGIT以较高的亲和力与CD155结合，从而竞争DNAM-1-CD155相互作用。第三，TIGIT与T细胞的直接连接可以下调TCR介导的活化和随后的增殖，并且TIGIT与NK细胞的结合阻断NK细胞的细胞毒性(Joller N等人2011 186:1338-42；Stanietsky N等人,2009PNAS 106:17858-63)。第四，TIGIT在Treg上的表达与肿瘤组织中的高度活化和抑制表型有关，并且TIGIT在Treg中的信号传导可能有利于Treg的稳定性(Joller N等人Immunity[免疫力]2014 40:569-81；Kurtulus S等人J Clin Invest.[临床研究杂志]2015 125:4053-4062)。

TIGIT在其胞质尾区(cytoplasmic tail)具有免疫球蛋白尾部酪氨酸(ITT)样基序，随后是基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(Yu X等人Nat Immunol.[自然免疫]2009 10:48-57；Engels N等人Curr Opin Immunol[免疫学当前观点]2011 23:324-329)。这些基序可以介导磷酸酶SHIP-1和β-抑制蛋白2的募集(Li M等人J Biol Chem.[生物化学杂志]2014 289:17647-17657；Liu S等人Cell death and differentiation[细胞死亡和分化]2013 20:456-464)，从而提供了一种机制，通过该机制，TIGIT可以内在地递送抑制性信号以抑制活化信号。

据报道，TIGIT在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和外周血单核细胞(PBMC)中的表达上调已在许多类型的癌症中出现，如肺癌(Tassi等人,Cancer Res.[癌症研究]2017 77:851-861)、食管癌(Xie J等人,Oncotarget[肿瘤靶标]2016 7:63669-63678)、乳腺癌(Gil DelAlcazar CR等人2017Cancer Discov.[癌症发现])、急性髓性白血病(AML)(Kong Y等人,Clin Cancer Res.[临床癌症研究]2016 22:3057-66)和黑色素瘤(Chauvin JM等人,JClin Invest.[临床研究杂志]2015 125:2046-2058)。TIGIT在AML中的表达增加与患者存活结果的不良预后有关(Kong Y等人,Clin Cancer Res.[临床癌症研究]2016 22:3057-66)。TIGIT信号传导的上调不仅在对癌症的免疫耐受中起重要作用，也对慢性病毒感染的免疫耐受中起重要作用。在HIV感染期间，TIGIT在T细胞上的表达显著升高，并且与病毒载量和疾病进展呈正相关(Chew GM等人,2016PLoS Pathog.[科学公共图书馆·病原学]12:e1005349)。此外，单独阻断TIGIT受体或与其他阻断组合可在体外和体内拯救功能性“耗尽”的T细胞(Chauvin JM等人,J Clin Invest.[临床研究杂志]2015 125:2046-2058；ChewGM等人,2016PLoS Pathog.[科学公共图书馆·病原学]12:e1005349；Johnston RJ等人Cancer Cell[癌细胞]201426:923-937)。在癌症和病毒感染的情况下，TIGIT信号传导的活化促进免疫细胞功能障碍，导致癌症生长或病毒感染延长。治疗剂对TIGIT介导的抑制性信号传导的抑制可能恢复免疫细胞(包括T细胞、NK细胞和树突状细胞(DC))的功能活性，从而增强针对癌症或慢性病毒感染的免疫力。

靶向PD1或PDL1的单克隆抗体可以阻断这种相互作用并增强针对癌细胞的免疫应答。这些抗体已显示出有助于治疗几种类型的癌症，包括皮肤黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤。大多数对单一药剂检查点抑制剂无应答的癌细胞会通过先天机制逃避，该机制允许癌细胞得以生长并存活。结果，疾病以与自然病史相一致的速度发展。然而，与固有抗性不同的是，经过较长时间的临床试验随访后，具有先前临床获益的患者现已出现晚期复发，这表明出现了获得性抗性(Jenkins等人,Br.J.Cancer[英国癌症杂志]118,9-16 2018)。

因此，抗TIGIT抗体与抗PD1抗体的组合可以避免免疫细胞产生耐受性，在癌症或慢性病毒感染的治疗中诱导有效的免疫应答。

发明内容

本披露涉及癌症治疗的方法，将抗TIGIT抗体与抗PD1抗体组合施用。

在特定的实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含具有选自SEQ ID NO:3、4、5或13的氨基酸序列或其变体的一个、两个或三个CDR，这些变体包含一个或多个保守取代，例如SEQ ID NO 3、4、5或13的氨基酸序列中的一个或两个保守取代；和/或轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含具有选自SEQ ID NO:6、7、或8的氨基酸序列或其变体的一个、两个或三个CDR，这些变体包含一个或多个保守取代，例如SEQID NO:6、7、或8的氨基酸序列中的一个或两个保守取代。

在更特定的实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其变体的VH-CDR1，该变体包含一个或多个保守取代，例如一个或两个保守取代；具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其变体的VH-CDR2，该变体包含一个或多个保守取代，例如一个或两个保守取代；以及具有SEQID NO:5的氨基酸序列或其变体的VH-CDR3，该变体包含一个或多个保守取代，例如一个或两个保守取代；和/或轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其变体的VL-CDR1，该变体包含一个或多个保守取代，例如一个或两个保守取代；具有SEQID NO:7的氨基酸序列或其变体的VL-CDR2，该变体包含一个或多个保守取代，例如一个或两个保守取代；以及具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体的VL-CDR3，该变体包含一个或多个保守取代，例如一个或两个保守取代。

本申请的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段能够与人TIGIT结合并且包含重链可变区，该重链可变区具有选自SEQ ID NO:9、14、19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9、14、19具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在一个实施例中，序列的差异在于框架区。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含由选自SEQ ID NO:10、15或20的核苷酸序列或其变体编码的重链可变区。

本申请的抗体或其抗原结合片段能够与人TIGIT结合并且包含重链可变区，该重链可变区具有选自SEQ ID NO:11、16、21、或24的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11、16、21或24具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列。在一个实施例中，序列的差异在于框架区。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含由选自SEQ ID NO:12、17或22的核苷酸序列或其变体编码的重链可变区。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段能够以约1x10^-9 M至约1x10^-12M的Kd值与人TIGIT结合。例如，抗体或其抗原结合片段能够以小于约1x10^-9 M、小于约1x10^-10 M、小于约1x10^-11 M、或小于约1x10^-12 M的Kd值与人TIGIT结合。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其变体亚类的重链恒定区，和κ或λ型或其变体的轻链恒定区。在更特定的实施例中，抗体的Fc区是人IgG1 Fc或其变体，例如SEQ ID NO:18的Fc区。

一种癌症治疗的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗PD1抗体或其抗原结合片段的组合。

该方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段与抗PD1抗体的组合，该抗体或其抗原结合片段与人TIGIT特异性结合，并且包含：

(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR(重链互补决定区)1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，和(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含(d)SEQ ID NO:6的LCDR(轻链互补决定区)1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；或

(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR1，(b)SEQ ID NO:13的HCDR2，和(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3。

该方法，其中该TIGIT抗体或其抗原结合片段包含：

(i)含有SEQ ID NO:19的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:21的轻链可变区(VL)；

(ii)含有SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:16的轻链可变区(VL)；或

(iii)含有SEQ ID NO:9的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:11的轻链可变区(VL)。

该方法，其中该抗PD1抗体包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD1，并且包含：

重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:25的HCDR1，(b)SEQ ID NO:26的HCDR2，和(c)SEQ ID NO:27的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含(d)SEQ ID NO:28的LCDR1，(e)SEQ ID NO:29的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:30的LCDR3。

该方法，其中该抗PD1抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD1，并且包含含有SEQID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

该方法，其中该抗PD1抗体包含含有SEQ ID NO:35的IgG4恒定结构域。

该方法，其中该抗TIGIT抗体是选自下组的抗体片段，该组由以下组成：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv、和(Fab')2片段。

该方法，其中该抗PDl抗体是选自下组的抗体片段，该组由以下组成：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv、和(Fab')2片段。

该方法，其中该癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、头颈癌、胃癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。

该方法，其中该小细胞肺癌是局限期小细胞肺癌。

该方法，其中该癌症是非小细胞肺癌。

该方法，其中该头颈癌是鼻咽癌。

该方法，其中该食管癌是食管鳞状细胞癌(ESCC)。

该方法，其中该癌症是子宫癌。

该方法，其中该胃癌是胃或胃食管连接处癌。

该方法，其中该宫颈癌是复发或转移性宫颈癌。

该方法，其中该皮肤癌是基底细胞癌。

该方法，其中该癌症是胰腺癌。

该方法进一步包括施用化疗。

该方法，其中该化疗是化放疗。

该方法，其中该抗PD1抗体以每三周200mg给药。

该方法，其中该抗TIGIT抗体以50mg-900mg的范围给药。

该方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周50mg给药。

该方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周150mg给药。

该方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周450mg给药。

该方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周900mg给药。

该方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周1800mg给药。

附图说明

图1TIGIT-mIgG2a(顶部)和TIGIT-huIgG1(底部)的示意图。TIGIT ECD：TIGIT细胞外结构域。N：N-末端。C：C-末端。

图2A-B抗TIGIT抗体Vh(A)和Vk(B)区域的系统发生树。使用DNASTAR的Megalign软件对候选抗TIGIT抗体的Vh和Vk序列进行比对。序列同源性在系统发生树中显示。

图3通过表面等离子共振(SPR)测定纯化的鼠抗TIGIT抗体的亲和力。

图4A-B通过流式细胞术测定TIGIT结合。

图5A-B(A)显示抗TIGIT mAb对TIGIT-配体相互作用的抑制的示意图。(B)通过流式细胞术测定可溶性TIGIT(TIGIT-huIgG1融合蛋白)与表达TIGIT配体的HEK293细胞(HEK293/PVR或HEK293/PVR-L2)的结合。对TIGIT-配体相互作用的阻断通过添加连续稀释的抗TIGIT抗体定量测定。结果以两次重复的平均值±SD表示。

图6A-B通过抗TIGIT mAb活化CMV特异性人T细胞。在抗TIGIT抗体存在下，用CMV肽脉冲的靶细胞HCT116细胞(10⁴)刺激人CMV肽(NLVPMVATV，495-503)致敏的HLA-A2.1⁺PBMC(4x10⁴)过夜。通过ELISA测定培养上清液中的IFN-γ。所有条件均一式三份进行。结果以平均值±SD表示。

图7A-B抗TIGIT mAb促进NK细胞介导的细胞毒性。(A)在工程化的NK92MI/TIGIT-DNAM-1稳定细胞系上的TIGIT和DNAM-1表达。(B)如实例8所述，在hu1217-2-2/IgG1mf(0.007-30μg/ml)的存在下，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定确定NK92MI/TIGIT-DNAM-1细胞对SK-MES-1/PVR细胞的杀伤。结果以三次重复的平均值±SD表示。

图8抗TIGIT mAb hu1217-2-2/IgG1wt通过FcγR介导的胞啃(trogocytosis)降低TIGIT受体的表面表达。在生物素标记的抗TIGIT mAb的存在下，将Jurkat/TIGIT细胞与表达FcγR的HEK293细胞在完全培养基中孵育过夜。在一些情况下，添加10％的人AB血清以确定大量人IgG对胞啃的作用。通过用SA-APC(博奇公司(Biolegend))染色确定TIGIT受体的表面表达。通过流式细胞术确定MFI。所有数据点一式两份。结果以平均值±SD表示。

图9A显示抗TIGIT mAb对人外周血单核细胞(PBMC)的ADCC作用。通过流式细胞术确定健康供体的PHA刺激的PBMC上的TIGIT表达。CD4⁺(CD4⁺Foxp3^-)、CD8⁺T效应子和调节性T细胞(Treg，CD4⁺Foxp3⁺)都表达了显著水平的TIGIT(18％-41％)。显示的数据是来自3名健康供体的代表性结果。

图9B在TIGIT mAb(30μg/mL)或对照抗体(以5μg/ml的OKT3作为阳性对照，并且以30μg/ml的huIgG作为阴性对照)的存在下，使用CD16⁺人NK细胞系NK92MI/CD16V作为效应细胞和PHA刺激的PBMC作为靶细胞进行ADCC测定，持续42小时。通过流式细胞术确定CD3⁺、CD8⁺T细胞和Treg的百分比。

图10显示抗TIGIT mAb对人PBMC的CDC作用。使用PHA刺激的PBMC作为靶细胞和自体血清作为补体来源进行CDC测定。在最终浓度为15％的自体血清中，将预活化的PBMC与抗TIGIT mAb(0.01-100μg/ml)共培养3天后，如实例11中所述通过细胞滴度发光测定测量并计算CDC百分比(y轴)。显示了供体A和B的数据。将HuIgG用作阴性对照，而将抗MHC-A、B、C用作阳性对照。

图11描绘了静脉内输注50mg至900mg后hu1217-2-2的血清浓度的下降。

图12显示hu1217-2-2作为单一药剂或与BGB-A317组合促进IFN-γ体外分泌。

图13显示hu1217-2-2作为单一药剂在小鼠胶质瘤模型中可以减少肿瘤生长。

图14显示了hu1217-2-2与抗PD1抗体组合在TIGIT敲除的MC结肠癌小鼠模型中的功效。

具体实施方式

定义

氨基酸的保守氨基酸取代是本领域公知的并且示例性地显示在下表中。

通常，保守氨基酸取代意指氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基替换。

除非在本文件的其他地方具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文所用，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则如“一个”、“一种”和“该”的单数形式包括它们相应的复数指代。

除非上下文另外明确说明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。

贯穿本说明书和以下权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及变化形式如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为隐含包括所陈述的氨基酸序列、DNA序列、其步骤或组，但不排除任何其他氨基酸序列、DNA序列、步骤。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”来取代，或者有时用“具有”取代。

术语“TIGIT”包括各种哺乳动物同种型，例如人TIGIT、人TIGIT的同源物，和包含TIGIT内至少一个表位的类似物。TIGIT(例如人TIGIT)的氨基酸序列和编码该TIGIT的核苷酸序列是本领域已知的(参见Genbank AAI01289)。

如本文所用的术语“施用(administration/administering)”和“治疗(treating/treatment)”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与细胞接触。术语“施用”或“治疗”还包括通过试剂、诊断剂、结合化合物或另一种细胞进行的例如细胞的体外和离体处理。本文中的术语“受试者”是指任何生物，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。

本文术语“抗体”以最广义使用并且具体地涵盖抗体(包括全长单克隆抗体)和抗体片段只要它们识别抗原，例如TIGIT。抗体通常是单特异性的，但是还可以描述为不同特异性的、异特异性的、或多特异性的。抗体分子通过特异性结合位点与抗原上的特定性抗原决定簇或表位结合。

本文中的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指基本上同质的抗体的群体，即，除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，该群体中包含的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂典型地包括在其可变结构域中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，特别地其互补决定区(CDR)，它们通常对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征并且不应理解为要求通过任何具体方法产生抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法获得单克隆抗体(mAb)。参见，例如Kohler G等人,Nature[自然]1975 256:495-497；美国专利号4,376,110；AusubelFM等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[分子生物学现代方法]1992；HarlowE等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL[抗体：实验室手册],Cold spring HarborLaboratory[冷泉港实验室]1988；以及Colligan JE等人,CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY[免疫学现代方法]1993。本文披露的mAb可以是任何免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及其任何亚类。产生mAb的杂交瘤可以在体外或在体内培养。高效价的mAb可以通过体内产生获得，其中将来自单个杂交瘤的细胞腹膜内注射到小鼠中，例如原始引发的Balb/c小鼠，以产生含有高浓度所需mAb的腹水。可以使用本领域技术人员熟知的柱层析方法从这样的腹水，或从培养上清液中纯化同种型IgM或IgG的MAb。

通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可以定义为主要负责效应子功能的恒定区。典型地，人轻链被分类为κ和λ轻链。此外，人重链典型地分类为α、δ、ε、γ或μ，并且分别将抗体的同种型定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。

每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，一般而言两个结合位点是相同的。

典型地，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为“互补决定区(CDR)”，其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常由框架区对齐，使得能够结合特异性表位。一般而言，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域两者按顺序都包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。通常，每个结构域的氨基酸分配符合免疫学上感兴趣的蛋白质序列的定义，Kabat等人,NationalInstitutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州；第5版；NIH公开号91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.[高级防护化学]32:1-75；Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]252:6609-6616；Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917或Chothia等人,(1989)Nature[自然]342:878-883。

术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”(即，轻链可变结构域中的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3以及重链可变结构域中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3)的氨基酸残基。参见，Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(通过序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基意指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

除非另外说明，“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如，单链Fv(ScFv)；纳米抗体以及从抗体片段形成的多特异性抗体。

与特定靶蛋白特异性结合的抗体也被描述为与特定靶蛋白特异性结合。这意指与其他蛋白相比，抗体表现出优先结合靶蛋白，但这种特异性不需要绝对的结合特异性。如果抗体的结合决定了样品中靶蛋白的存在，例如，没有产生不希望的结果，如假阳性，则抗体被认为是对其预期靶标为“特异性的”。可用于本发明的抗体或其结合片段会以比非靶蛋白的亲和力高至少两倍，优选高至少10倍，更优选高至少20倍，和最优选高至少100倍的亲和力结合至靶蛋白。将本文的抗体称作与包含给定氨基酸序列(例如成熟人TIGIT分子的氨基酸序列)的多肽特异性结合，如果其与包含该序列的多肽结合但不与缺乏该序列的蛋白质结合。

表达“pH依赖性结合”、“pH依赖性靶结合”和“pH依赖性抗原结合”在本披露中可以互换，表明本申请的抗体以pH依赖性方式与其靶标/抗原，即人TIGIT结合。特定地，与生理pH(例如pH 7.4)下的结合亲和力和/或结合信号相比，本申请的抗体在弱酸性pH值(例如pH6.0，通常在肿瘤微环境中发现)下对其抗原显示出更高的结合亲和力和/或结合信号。用于确定本申请的抗体的结合亲和力和/或结合信号强度的方法是本领域公知的，包括但不限于表面等离子共振(Biacore)或类似技术。更特定地，如通过表面等离子共振(Biacore)或类似技术测量，本申请的抗体在pH 7.4/pH 6.0下具有大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更大的K_D比率。可替代地或另外地，本申请的抗体在pH 6.0下的Rmax(RU)值至少比通过表面等离子共振(Biacore)或类似技术测量的在pH 7.4下的Rmax高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍。抗体的结合亲和力可在25℃或37℃下测量。已发现肿瘤微环境显示出比生理病症或正常组织相对更具酸性的pH(Zhang等人Focus on molecular Imaging[关注分子成像]2010；Tannock和Rotin等人Cancer Res[癌症研究]1989)。因此，具有上述pH依赖性结合的本申请的抗体作为抗TIGIT治疗剂对于选择性地靶向肿瘤微环境中的TIGIT阳性淋巴细胞是有利的，并且具有与淋巴细胞外周活化相关的较低毒性。

本文中的术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”意指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。

术语“人源化抗体”意指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部，其高变环的全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。当有必要区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体时，将前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加到抗体克隆名称中。人源化形式的啮齿动物抗体会通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，但是可包括某些氨基酸取代以增加亲和力，增加人源化抗体的稳定性，或出于其他原因。

本申请的抗体在治疗癌症中具有潜在治疗用途。本文的术语“癌症”或“肿瘤”意指或描述哺乳动物的特征一般为细胞生长失调的生理病症。癌症的实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、或非小细胞肺癌)、肾上腺癌、肝癌、胃部癌、宫颈癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、膀胱癌、骨癌、脑癌、子宫内膜癌、头颈癌、淋巴瘤、卵巢癌、皮肤癌、甲状腺瘤、或癌症的转移性病变。

此外，本申请的抗体在控制病毒感染和其他人类疾病中具有潜在的治疗用途，这些疾病在机理上涉及免疫耐受或“耗尽”。在本申请的上下文中，术语“耗尽”是指导致免疫细胞在癌症或慢性病毒感染期间反应能力减弱的过程。

如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病或障碍、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以影响该疾病、障碍或症状的治疗的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体、疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状、疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度、待治疗的受试者的年龄、和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合中所包含的活性剂的总量。

如本文所用的“受试者”是哺乳动物，例如，啮齿动物或灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人(例如患有本文所述的障碍或处于患有本文所述的障碍的风险的患者)。

抗TIGIT抗体

本披露提供了特异性结合人TIGIT的抗体、抗原结合片段。此外，本披露提供了具有期望的药代动力学特征和其他期望的属性的抗体，其因此可用于降低癌症的可能性或治疗癌症。本披露进一步提供了包含抗体的药物组合物以及制备和使用此类药物组合物用于预防和治疗癌症和相关障碍的方法。

本披露提供了与TIGIT特异性结合的抗体或其抗原结合片段。本披露的抗体或抗原结合片段包括但不限于如下所述产生的抗体或其抗原结合片段。

本披露提供了与TIGIT特异性结合的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:9、14或19的氨基酸序列的VH结构域。本披露还提供了特异性结合TIGIT的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含VH CDR，该VH CDR具有本文提供的VH CDR中的任一个的氨基酸序列。在一方面，本披露提供了与TIGIT特异性结合的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含(或替代地，由其组成)一个、两个、三个或更多个VH CDR，这些VH CDR具有本披露提供的VH CDR中的任一个的氨基酸序列。

本披露提供了与TIGIT特异性结合的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:11、16或21的氨基酸序列的VL结构域。本披露还提供了与TIGIT特异性结合的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含VL CDR，该VLCDR具有本文列出的VL CDR中的任一个的氨基酸序列。特别地，本披露提供了与TIGIT特异性结合的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含(或替代地，由其组成)一个、两个、三个或更多个VL CDR，这些VL CDR具有当前披露的VL CDR中的任一个的氨基酸序列。

本披露的其他抗体或其抗原结合片段包括已经突变，但在CDR区中具有与本文所述序列中描绘的CDR区至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的氨基酸。在一些方面，其包括突变氨基酸序列，其中与提供的序列中披露的CDR区相比时，在CDR区中突变不超过1、2、3、4或5个氨基酸。

本披露的其他抗体包括其中氨基酸或编码这些氨基酸的核酸已经突变；但与表5中所述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的那些。在一些方面，其包括突变氨基酸序列，其中与本文所述的序列中描绘的可变区相比，在可变区中突变不超过1、2、3、4或5个氨基酸，同时保持基本上相同的治疗活性。

抗PD1抗体

本披露提供了例如在美国专利号：8,735,553中发现的抗PD1抗体。PD1抗体也在本文中提供并且包含，例如，重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)：如在SEQID NO:25中列出的HCDR1、如在SEQ ID NO:26中列出的HCDR2、以及如在SEQ ID NO:27中列出HCDR3；和轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含：如在SEQ ID NO:28中列出的LCDR1、如在SEQ ID NO:29中列出的LCDR2、以及如在SEQ ID NO:30中列出的LCDR3。在此将该抗体指定为“BGB-A317”。

在另一个实施例中，抗PD1抗体或抗原结合片段特异性结合人PD1，并且包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在又另一个实施例中，抗PD1抗体包含含有SEQ ID NO:35的IgG4恒定结构域。

对Fc区框架的进一步改变

在其他方面，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法描述于例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。

在另一方面，可以用一个或多个不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法描述于例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。

在另一方面，改变一个或多个氨基酸残基从而改变抗体固定补体的能力。该方法描述于例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中。在特定方面，本披露的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被IgG1亚类和κ同种型的一个或多个同种异型氨基酸残基替换。同种异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区，如Jefferis等人,MAbs[单克隆抗体].1:332-338(2009)所述。

在另一方面，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法描述于例如Presta的PCT公开WO 00/42072中。此外，已经绘制了人IgG1上针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276:6591-6604,2001)。

在又另一个方面，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏或具有降低的糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。

另外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了细胞系，这些细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在经工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180,1999)。

在另一方面，如果期望ADCC的降低，许多先前的报道显示人抗体亚类IgG4仅具有适度的ADCC并且几乎没有CDC效应子功能(Moore G L等人2010MAbs[单克隆抗体],2:181-189)。另一方面，发现天然IgG4在应激条件下(如在酸性缓冲剂中或在升高的温度下)较不稳定(Angal,S.1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Dall′Acqua,W.等人,1998Biochemistry[生物化学],37:9266-9273；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。降低的ADCC可以通过将抗体可操作地连接至用具有降低或无效的FcγR结合或C1q结合活性的改变的组合工程化的IgG4，从而降低或消除ADCC和CDC效应子功能来实现。考虑到抗体作为生物药物的物理化学性质，IgG4的较不期望的固有特性之一是其两条重链在溶液中动态分离以形成半抗体，这导致通过称为“Fab臂交换”的过程在体内产生双特异性抗体(Van der Neut Kolfschoten M等人2007Science[科学],317:1554-157)。228位(EU编号系统)丝氨酸突变为脯氨酸表现出对IgG4重链分离的抑制作用(Angal,S.1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。据报道，铰链区和γFc区中的一些氨基酸残基对抗体与Fcγ受体的相互作用具有影响(Chappel SM等人1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报],88:9036-9040；Mukherjee,J.等人,1995FASEB J[美国实验生物学学会联合会杂志],9:115-119；Armour,K.L.等人,1999Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志],29:2613-2624；Clynes,R.A.等人,2000NatureMedicine[自然医学],6:443-446；Arnold J.N.,2007Annu Rev immunol[免疫学年鉴],25:21-50)。此外，在人群中一些罕见的IgG4同种型也可引起不同的物理化学特性(Brusco,A.等人,1998Eur J Immunogenet[欧洲免疫遗传学杂志],25:349-55；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。为了产生具有低ADCC、CDC和不稳定性的TIGIT抗体，可以修饰人IgG4的铰链区和Fc区并引入许多改变。这些修饰的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO:83-88，美国专利号8,735,553中找到。

抗体产生

抗TIGIT抗体及其抗原结合片段可通过本领域已知的任何方法产生，包括但不限于抗体四聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。

本披露还提供了编码本文所述抗体的多核苷酸，例如编码包含本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与编码SEQ ID NO:9、14或19的多肽的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与编码SEQ ID NO:11、16或21的多肽的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％核酸序列同一性。

本披露的多核苷酸可以编码抗TIGIT抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含示例性抗TIGIT抗体之一的重链和轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与一种鼠抗体的重链和轻链的可变区基本上相同的两个多肽区段。

本披露还提供了用于产生抗TIGIT抗体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择取决于表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有可操作地连接至编码抗TIGIT抗体链或抗原结合片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些方面，除了在诱导条件的控制下，使用诱导型启动子来防止插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除启动子外，其他调节元件也可以是有效表达抗TIGIT抗体或抗原结合片段所需要或期望的。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见例如，Scharf等人,ResultsProbl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。

用于携带并表达抗TIGIT抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本披露多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌，和其他肠杆菌科，如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常任选地用操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达抗TIGIT多肽。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。

在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的抗TIGIT多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的必死或正常或异常的永生的动物或人细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HEK293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽一般在例如Winnacker,From Genes to Clones[从基因到克隆],VCH出版社,NY,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学综述]89:49-68,1986)和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。

检测和诊断方法

本披露的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于检测TIGIT的方法。在一方面，抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中TIGIT的存在。本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织。在其他方面，这些组织包括相对于其他组织以更高水平表达TIGIT的正常和/或癌性组织。

在一方面，本披露提供了检测生物样品中TIGIT的存在的方法。在某些方面，该方法包括在允许抗体与抗原结合的条件下，将生物样品与抗TIGIT抗体接触，并检测抗体和抗原之间是否形成复合物。生物样品可以包括但不限于尿液或血液样品。

还包括诊断与TIGIT表达相关的障碍的方法。在某些方面，该方法包括使测试细胞与抗TIGIT抗体接触；通过检测抗TIGIT抗体与TIGIT多肽的结合，测定测试细胞中TIGIT的表达水平(定量或定性)；以及将测试细胞的表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞相同组织来源的正常细胞或非TIGIT表达细胞)中的TIGIT表达水平进行比较，其中与对照细胞相比，测试细胞中较高水平的TIGIT表达表明存在与TIGIT表达相关的障碍。

治疗方法

本披露的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于治疗TIGIT相关障碍或疾病的方法。在一方面，TIGIT相关障碍或疾病是癌症。

在一方面，本披露提供了治疗癌症的方法。在某些方面，该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗TIGIT抗体或抗原结合片段。癌症可包括但不限于乳腺癌、头颈癌、胃癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。

本发明的抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。

本发明的抗体或抗原结合片段可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。关于这点要考虑的因素包括治疗的特定障碍、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案、和医疗从业者已知的其他因素。抗体不需要但任选地与目前用于预防或治疗所研究的障碍的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗体的量、障碍或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％-99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。

为预防或治疗疾病，本发明的抗体或抗原结合片段的合适的剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的应答、以及主治医生的判断。抗体适当地以一次或经一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至100mg/kg的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直到出现疾病症状的期望抑制。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的抗体)。施用初始较高负载剂量，随后施用一个或多个较低剂量。但是，其他给药方案可以是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。

组合疗法

在一方面，本披露的TIGIT抗体可与其他治疗剂(例如抗PD1抗体)组合使用。可与本披露的TIGIT抗体一起使用的其他治疗剂包括但不限于化疗剂(例如，紫杉醇或紫杉醇药剂；(例如)、多西他赛；卡铂；拓扑替康；顺铂；伊立替康、多柔比星、来那度胺、5-氮杂胞苷、异环磷酰胺、奥沙利铂、培美曲塞二钠、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨、氟达拉滨、长春新碱、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼)、多激酶抑制剂(例如，MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向剂(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向剂(例如，阿仑单抗)、泼尼松龙、达贝泊汀α、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如，奥利默森钠)、极光激酶抑制剂(例如，MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、CD-19靶向剂(例如，MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如，ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如，INCB018424)、mTOR抑制剂(例如，坦罗莫司(temsirolimus)、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如，伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如，ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如，CS-1008)、HGF/SF抑制剂(例如，AMG 102)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如，BI 672)。

本披露的TIGIT抗体可与其他治疗剂(例如抗PD1抗体)组合使用。抗PD1抗体可包括但不限于美国专利号：8,735,553中披露的抗体。由默克公司(Merck)披露的派姆单抗(以前称为MK-3475)是人源化lgG4-K免疫球蛋白，分子量约为149kDa，其靶向PD1受体，并且抑制PD1受体配体PD-L1与PD-L2的结合。派姆单抗已被批准用于转移性黑色素瘤和转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的适应症，并且正在进行用于治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和难治性霍奇金淋巴瘤(cHL)的临床研究。纳武单抗(如由百时美施贵宝公司(Bristol-MeyersSquibb)披露)是全人lgG4-K单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)披露于美国专利号US 8,008,449和WO 2006/121168中。纳武单抗被批准用于治疗黑色素瘤、肺癌、肾癌、和霍奇金淋巴瘤。

药物组合物和配制品

还提供了包含抗TIGIT抗体或抗原结合片段、或包含编码抗TIGIT抗体或抗原结合片段的序列的多核苷酸的组合物，包括药物配制品。在某些实施例中，组合物包含与TIGIT结合的一种或多种抗体或抗原结合片段，或包含编码与TIGIT结合的一种或多种抗体或抗原结合片段的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物还可包含合适的载剂，例如本领域熟知的药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。

通过将具有所需纯度的这种抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备本文所述的TIGIT抗体或抗原结合片段的药物配制品(Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition[雷明顿药物科学第16版],Osol,A.编(1980))，呈冻干配制品或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对于接受者通常是无毒性的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(百特国际有限公司(Baxter International,Inc.))。在美国专利号US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

示例性冻干抗体配制品描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体配制品包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。

用于体内施用的配制品通常是无菌的。无菌可以例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

药物组合物和试剂盒

在一些方面，本披露提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包括与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所述的抗TIGIT抗体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。

本文的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。合适的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的合适组合物是可注射或输注溶液的形式。一种合适的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施例中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在某些实施例中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。

实例

实例1：抗TIGIT单克隆抗体的生成

基于常规杂交瘤融合技术产生抗TIGIT单克隆抗体(mAb)(de St Groth和Sheidegger,1980J Immunol Methods[免疫学方法杂志]35:1；Mechetner,2007MethodsMol Biol[分子生物学方法]378:1)，略作修改。选择在酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)测定中具有高结合活性的mAb用于进一步表征。

用于免疫和结合测定的TIGIT重组蛋白

编码全长人TIGIT(SEQ ID NO:1)的cDNA基于其GenBank序列(登录号：NM_173799)由义翘神州公司(Sino Biological)(中国北京)合成或购自该公司。PCR扩增对应于SEQ IDNO:1的氨基酸(AA)1-141的全长人TIGIT的细胞外结构域(ECD)的编码区，并克隆到基于pcDNA3.1的表达载体(英杰公司(Invitrogen),卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)中，其中C末端融合到小鼠IgG2a的Fc结构域或人IgG1重链的Fc结构域，其分别产生两种重组融合蛋白表达质粒TIGIT-mIgG2a和TIGIT-huIgG1。TIGIT融合蛋白的示意图如图1所示。为了产生重组融合蛋白，将TIGIT-mIgG2a和TIGIT-huIgG1质粒瞬时转染到293G细胞(内部开发)中，并在装备有旋转振荡器的CO₂培养箱中培养7天。收集含有重组蛋白的上清液并离心澄清。使用蛋白A柱(目录号：17127901，通用生命科学公司(GE Life Sciences))纯化TIGIT-mIgG2a和TIGIT-huIgG1。将TIGIT-mIgG2a和TIGIT-huIgG1蛋白用磷酸盐缓冲盐水(DPBS)透析，并以小等分试样保存在-80℃冰箱中。

稳定表达细胞系

为了建立表达全长人TIGIT(huTIGIT)或猴TIGIT(mkTIGIT，登录号：XM_005548101.2)的稳定细胞系，将TIGIT基因(由中国南京金斯瑞公司(Genescript)合成)克隆到逆转录病毒载体pFB-Neo(目录号：217561，美国安捷伦公司)。根据先前的方案(ZhangT等人2005,Blood[血液])产生双嗜性逆转录病毒载体。将含有huTIGIT和mkTIGIT的载体分别转导到Jurkat和NK92MI细胞(ATCC,马纳萨斯(Manassas),弗吉尼亚州,美国)中，以产生细胞系Jurkat/huTIGIT和NK92MI/mkTIGIT。使用G418和FACS结合测定通过在培养基中培养来选择高表达细胞系。

免疫、杂交瘤融合和克隆

用100μL含有10μg TIGIT-mIgG2a和水溶性佐剂(目录号KX0210041，KangBiQuan，中国北京)的抗原混合物腹膜内(i.p.)免疫8-12周龄Balb/c小鼠(来自北京华阜康生物科技有限公司(HFK BIOSCIENCE CO.,LTD),中国北京)。3周后重复该过程。第二次免疫后两周，通过ELISA和FACS评价小鼠血清的TIGIT结合。血清筛选后十天，通过i.p.注射50μg的TIGIT-mIgG2a加强具有最高抗TIGIT抗体血清滴度的小鼠。加强后三天，使用标准技术(Gefter等人,Somat Cell Genet[体细胞遗传学],1977 3(2):231-6)，分离脾细胞并将其与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(ATCC)融合。

通过ELISA和FACS评估抗体的TIGIT结合活性

杂交瘤克隆的上清液最初通过Methods in Molecular Biology[分子生物学方法](2007)378:33-52中描述的ELISA进行筛选。简言之，将TIGIT-huIgG1蛋白包被在96孔板中。使用HRP-连接的抗小鼠IgG抗体(目录号7076S，细胞传导技术公司(Cell SignalingTechnology)，美国)和底物(目录号00-4201-56，伊生物技术公司(eBioscience)，美国)来产生波长为450nm的颜色吸收信号，其通过使用读板器(SpectraMax Paradigm，分子设备公司(Molecular Devices)，美国)来测量。使用上述NK92MI/huTIGIT或NK92mi/mkTIGIT细胞通过FACS进一步验证ELISA阳性克隆。将表达TIGIT的细胞(10⁵个细胞/孔)与ELISA阳性杂交瘤上清液一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号A0473，碧云天生物技术公司(Beyotime Biotechnology)，中国)结合。使用流式细胞仪(GuavaeasyCyte 8HT，默克密理博公司(Merck-Millipore)，美国)定量细胞荧光。

对来自杂交瘤的在ELISA和FACS筛选中显示阳性信号的条件培养基进行功能测定，以鉴定在基于人免疫细胞的测定中具有良好功能活性的抗体(参见以下部分)。对具有所需功能活性的抗体进一步亚克隆和表征。

杂交瘤亚克隆和对无血清或低血清培养基的适应

如上所述通过ELISA、FACS和功能测定进行初步筛选后，通过有限稀释亚克隆阳性杂交瘤克隆。从每块板基于ELISA和FACS筛选选择三个阳性亚克隆并通过功能测定表征。通过功能测定验证的靠前抗体亚克隆适于在含3％ FBS的CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02,Hyclone,美国)中生长。

单克隆抗体的表达和纯化

将用抗体表达质粒(目录号R79007,英杰公司)瞬时转染的杂交瘤细胞或293G细胞在CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02,Hyclone)中或在Freestyle^TM 293表达培养基(目录号12338018,英杰公司)中培养，并在CO₂培养箱中在37℃下孵育5至7天。通过离心收集条件培养基并在纯化前通过0.22μm膜过滤。依照制造商的指导应用含有鼠或重组抗体的上清液并结合到蛋白A柱(目录号17127901，通用生命科学公司)。该程序通常产生纯度高于90％的抗体。将蛋白A亲和纯化的抗体用PBS透析或使用HiLoad 16/60Superdex200柱(目录号17531801，通用生命科学公司)进一步纯化以除去聚集体。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。将最终的抗体制剂以等分试样储存在-80℃冰箱中。

实例2：TIGIT抗体的克隆和序列分析

根据制造商的方案，使用Ultrapure RNA试剂盒(目录号74104，凯杰公司(QIAGEN)，德国)收获鼠杂交瘤克隆以制备总细胞RNA。使用来自英杰公司的cDNA合成试剂盒(目录号：18080-051)合成第一条链cDNA，并使用PCR试剂盒(目录号：CW0686，CWBio，中国北京)进行编码鼠mAb的重链可变区(Vh)和κ链可变区(Vk)的核苷酸序列的PCR扩增。根据先前报道的序列(Brocks等人2001Mol Med[分子医学]7:461)通过英杰公司(中国北京)合成用于Vh和Vk的抗体cDNA克隆的寡核苷酸引物。然后将PCR产物亚克隆到pEASY-Blunt克隆载体(目录号：CB101-02，全式金公司(TransGen)，中国)中，并通过金唯智公司(Genewiz)(中国北京)测序。从DNA测序结果推导出Vh和Vk区的氨基酸序列。

通过比较序列同源性分析鼠mAb，并且基于序列相似性分组(图2A-B)。根据Kabat(Wu和Kabat 1970J.Exp.Med.[实验医学杂志]132:211-250)和IMGT(Lefranc 1999NucleicAcids Research[核酸研究]27:209-212)系统通过序列注释并通过IMGT网站上基于互联网的序列分析来定义互补决定区(CDR)。代表性靠前克隆mu1217(Vh和Vk)的氨基酸序列在表1中列出(SEQ ID NO:9和11)。mu1217的CDR序列在表2中列出(SEQ ID NO:3-8)。

表1mu1217 Vh和Vk区的氨基酸序列

mu1217 Vh	SEQ ID NO 9
		mu1217Vk	SEQ ID NO 11

表2mu1217 Vh和Vk区的CDR序列(氨基酸)

实例3：通过SPR测定纯化的鼠抗TIGIT抗体的亲和力

通过使用BIAcore^TM T-200(通用生命科学公司)进行SPR测定，表征在ELISA和FACS中具有高结合活性以及在基于细胞的测定中具有有效功能活性的TIGIT抗体(如实例1和2中所述)的结合动力学。简言之，将抗人IgG抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号：BR100530，通用生命科学公司)上。使加Fc标签的人TIGIT流过芯片表面并被抗人IgG抗体捕获。然后使纯化的鼠抗体的连续稀释液(0.12nM至10nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)。将平衡解离常数(K_D)计算为比率k_off/k_on。包括mu1217、mu1257、mu1226和mu242的靠前mAb的结合亲和力谱图示于图3和表3中。

表3通过SPR测定杂交瘤抗体的结合亲和力

抗体	k_on(M^-1s^-1)	k_off(s^-1)	K_D(nM)
				mu1217	4.33E+06	3.96E-05	9.15E-12
mu1257	3.99E+06	4.20E-05	1.05E-11
				mu1266	1.07E+07	8.49E-05	7.94E-12
mu242	5.12E+06	7.13E-05	1.39E-11

实例4：鼠抗人TIGIT mAb mu1217的人源化

mAb人源化和工程化

对于mu1217的人源化，通过与IMGT中的人免疫球蛋白基因数据库运行对比，搜索人种系IgG基因中与mu1217可变区的cDNA序列具有高度同源性的序列。选择以高频率存在于人抗体库(Glanville等人,PNAS 106:20216-20221 2009)中并且与mu1217高度同源的人IGVH和基因作为人源化的模板。

通过CDR移植进行人源化(Methods in Molecular Biology,Vol 248:AntibodyEngineering,Methods and Protocols[分子生物学方法，第248卷：抗体工程，方法和方案],Humana出版社)和使用内部开发的表达载体将人源化抗体(hu1217)工程化为人IgG1mf形式。在第一轮的人源化中，框架区中从鼠到人氨基酸残基的突变由模拟的3D结构指导，并且在最初的人源化抗体1217(hu1217-1-1，具有六个CDR，这些CDR具有SEQ ID NO:3、13、5(重链CDR)和SEQ ID NO:6、7、8(轻链CDR)的氨基酸序列，具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列并由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码的重链可变区，以及具有SEQ ID No:16的氨基酸序列并由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码的轻链可变区)中保留了具有结构重要性的鼠框架残基，以维持CDR的规范结构。特定地，将mu1217 Vκ的CDR(SEQ ID NO:6-8)移植到保留了1个鼠框架残基(V₅₈)的人种系可变基因IGVκ3-15的框架中，导致Hu1217-1-1的人源化Vκ序列(SEQ ID NO:16表示氨基酸序列，以及SEQ ID NO:17表示核苷酸序列)。将mu1217 Vh的H-CDR2(SEQ ID NO:4)、H-CDR1和H-CDR3(SEQ ID NO:3和5)的N末端移植到保留了两个鼠框架(SEQ ID NO:10的T₂₄和I₃₇)残基的人种系可变基因IGVH3-7的框架中。在hu1217人源化变体中，仅移植了Kabat H-CDR2的N末端的一半，因为根据模拟的3D结构，预测只有N末端的一半对抗原结合很重要。所得Hu1217-1-1的人源化Vh序列的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中。

使用内部开发的表达载体将Hu1217-1-1构建为人全长抗体形式，这些表达载体含有分别称为IgG1mf(SEQ ID NO:18)和κ链的人IgG1变体的恒定区，具有容易适应的亚克隆位点。通过将上述两种构建体共转染到293G细胞中并使用蛋白A柱(目录号17543802，通用生命科学公司)纯化来实现hu1217-1-1抗体的表达和制备。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。

基于hu1217-1-1模板，我们进行了几次单突变，将Vκ的框架区中保留的鼠残基转化为相应的人种系残基，这些人种系残基包括Vκ中的V58I，T24A和I37V Vh。得到的hu1217-2A-1(T24A)、hu1217-2B-1(I37V)、和hu1217-1-2a(V58I)都具有与hu1217-1-1相似的结合和功能活性。使用在特定位置含有突变的引物和定点诱变试剂盒(目录号FM111-02，全式金公司，中国北京)进行所有人源化突变。通过测序分析验证所需的突变。如前所述在结合和功能测定中测试hu1217衍生的变体抗体。

通过在CDR和框架区中引入突变以改善用于人类治疗用途的分子和生物物理特性来进一步工程化Hu1217抗体。考虑因素包括氨基酸组成、热稳定性(T_m)、表面疏水性和等电点(pI)，同时保持功能活性。

总之，从上述突变过程中衍生出经过良好工程化的人源化单克隆抗体hu1217-2-2(SEQ ID NO:3、5-8、13和19-21)，并对其进行详细表征。结果表明，hu1217-2-2和hu1217-1-1在结合亲和力和功能活性(如抑制TIGIT介导的下游信号传导)方面非常相似。

对于亲和力测定，抗体被抗人Fc表面捕获，并用于基于表面等离子共振(SPR)技术的亲和力测定。抗TIGIT抗体的SPR测定的结合谱图的结果总结于表4中。Hu1217-2-2与hu1217-1-1显示出非常相似的结合谱图，平均解离常数分别为0.415nM和0.266nM，与ch1217的平均解离常数接近。

表4通过SPR测定hu1217抗体的结合亲和力

*ch1217由与人IgG1mf/κ恒定区融合的mu1217可变结构域构成

**NA：不可得。

表5hu1217抗体的CDR

还证实了以上所示的所有人源化抗体对分离自健康供体的原代人免疫细胞的功能活性(在实例7中描述)。

实例5：不同形式的1217与天然TIGIT的结合活性

为了评估抗TIGIT抗体与活细胞上的天然TIGIT的结合活性，将NK92mi细胞工程化以过表达人TIGIT。将活NK92mi/TIGIT细胞接种在96孔板中，并与连续稀释的抗TIGIT抗体一起孵育。将山羊抗人IgG用作二抗来检测抗体与细胞表面的结合。与人天然TIGIT的剂量依赖性结合的EC₅₀值通过用GraphPad Prism将剂量应答数据与四参数逻辑模型拟合来确定。如图4A-B和表6所示。人源化1217抗体、hu1217-1-1和hu1217-2-2在活细胞上显示与天然TIGIT良好的结合亲和力。

表6人源化1217变体与天然TIGIT的剂量依赖性结合的EC₅₀

实例6：抗TIGIT抗体阻断TIGIT与其配体PVR和PVR-L2的相互作用

TIGIT以高亲和力(Kd：约1nM)与PVR结合，可与CD266-PVR相互作用竞争(Yu X等人2009Nat.Immunol[自然免疫学],10:48-57)

为了确定抗TIGIT抗体是否可以阻断TIGIT-PVR与TIGIT-PVR-L2相互作用，将HEK293细胞工程化以表达高水平的PVR或PVR-L2。将得到的细胞系分别命名为HEK293/PVR和HEK293/PVR-L2。通过流式细胞术测定可溶性TIGIT(TIGIT-mIgG2a融合蛋白)与PVR或PVR-L2的结合(图5A)。对TIGIT-配体相互作用的阻断通过添加连续稀释的抗TIGIT抗体定量测定。如图5B所示，hu1217-2-2/IgG1(包含野生型IgG1 Fc区并具有与hu1217-2-2/IgG1mf相同的VH和VL序列的人源化形式)和hu1217-2-2/IgG1mf可以以剂量依赖性方式阻断TIGIT与PVR的结合，IC₅₀分别为0.64和0.55μg/mL。同样，hu1217-2-2/IgG1和hu1217-2-2/IgG1mf阻断TIGIT-PVR-L2相互作用的IC₅₀分别为0.25和0.18μg/mL。

实例7：通过抗TIGIT抗体活化CMV特异性人T细胞

使用识别人CMV PP65肽(NLVPMVATV，495-503，HLA-A2.1限制性)的天然衍生T细胞进一步评估TIGIT抗体的功能活性(Boeckh等人,2011J Clin Invest.[临床研究杂志]121:1673-80)。简而言之，用PP65肽(纯度>98％，由上海吉尔生化(GL Biochem)合成)在含有10％ FBS的完全RPMI中模拟来自HLA-A2.1⁺健康供体的PBMC，持续一周。将pp65引发的PBMC用作效应细胞。在测定之前，将靶细胞HCT116细胞(HLA-A2.1⁺，10⁴)用pp65肽(5μg/mL)脉冲30min，并在存在或不存在抗TIGIT抗体或空白对照(仅培养基)的96孔板中与等量的pp65致敏的PBMC共培养过夜。如图6A-B所示，hu1217-2-2/IgG1促进pp65特异性T细胞在细胞培养上清液中以剂量依赖性方式对两个供体分泌IFN-γ。

实例8：抗TIGIT抗体增强NK细胞介导的细胞毒性

已知TIGIT在自然杀伤(NK)细胞上以相对较高的水平组成性表达，并且TIGIT与其配体之间的相互作用抑制NK细胞介导的细胞毒性(Wang F等人2015Eur.J.Immunology[欧洲免疫学杂志]45:2886-97；Stanietsky N等人,2009Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院学报]106:17858-63)。

为了确认人源化抗TIGIT抗体是否可以促进NK介导的细胞毒性，根据先前描述的方案，通过逆转录病毒转导，将NK细胞系NK92MI工程化以作为效应细胞共表达TIGIT和DNAM-1受体(NK92MI/TIGIT-DNAM-1)(Zhang等人,2006Cancer Res.[癌症研究]66:5927-5933)。类似地建立表达PVR的肺癌细胞系SK-MES-1/PVR作为靶标。

使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊)，通过LDH释放测定确定NK92MI/TIGIT-DNAM-1细胞对SK-MES-1/PVR细胞的细胞毒性。简言之，将NK92MI/TIGIT-DNAM-1细胞(8x10⁵)与SK-MES-1/PVR细胞(2x10⁴)在抗TIGIT Ab(0.007-30μg/mL)存在下在96孔V-底板中共培养5小时。LDH-释放测定。使用以下方程确定特异性裂解：特异性裂解百分比＝[(实验-效应子自发-靶标自发)/(靶标最大-靶标自发)]x 100。结果表明，抗TIGIT抗体hu1217-2-2/IgG1mf以剂量依赖性方式增强NK细胞杀伤(EC₅₀：0.185μg/mL)(图7A-B)。

实例9：抗TIGIT抗体通过FcγR介导的胞啃降低TIGIT受体的表面表达。

胞啃是细胞表面分子从供体细胞转移到受体细胞的现象(Joly E等人2003Nat.Immunol[自然免疫学]；Machlenkin A等人2008Cancer Res.[癌症研究]；Beum PV等人2008J.Immunol[免疫学杂志]；Rossi EA等人2013Blood[血液])。抗体诱导的胞啃通过Fcγ受体(FcγR)导致细胞表面受体的下调(Carlsten等人2016Clin Cancer Res[临床癌症研究]；Beum等人2011J.Immunology[免疫学杂志])。因此，通过胞啃下调靶受体可能导致信号传导减弱。鉴于这些观察，hu1217-2-2/IgG1可能会在FcγR⁺细胞存在的情况下诱导TIGIT受体的胞啃，从而导致较低的表面表达。为了解决这种可能性，将Jurkat/TIGIT细胞与表达各种FcγR(包括FcγRIIA_H131、FcγRIIB、FcγRIIIA_V158)的HEK细胞和生物素标记的hu1217-2-2/IgG1wt(人源化抗体，其包含与hu1217-2-2/IgG1mf相同的VL和VH序列以及野生型IgG1 Fc区)或hu1217-2-2/IgG1mf孵育过夜。通过用SA-APC(博奇公司)确定TIGIT受体的表面表达。如图8所示，与阴性对照人IgG处理的细胞相比，hu1217-2-2/IgG1而非hu1217-2-2/IgG1mf导致TIGIT表面表达显著降低，表明Jurkat/TIGIT细胞表面TIGIT的降低是FcγR结合依赖性的。此外，10％的人血清(含有高水平的内源性IgG)的存在可以部分减少FcγRIIA_H131或FcγRIIIA_V158介导的，而不是FcγRIIB介导的TIGIT受体的胞啃，表明FcγRIIB可以发挥关键作用，减少体内抗TIGIT mAb(例如，hu1217-2-2/IgG1wt)的TIGIT表面表达。这些观察结果也与之前的发现一致(Ganesan LP等人2012JImmunol[免疫学杂志]189:4981-8；Taylor RP等人2015Blood[血液]125:762-6)。

实例10：抗TIGIT抗体的ADCC和CDC效应子功能

使用如下所述的体外测定确定抗TIGIT抗体在人原代PBMC中诱导ADCC和CDC的能力。

使用人PBMC作为靶细胞的ADCC

设置了基于流式细胞术的ADCC测定以确定TIGIT抗体是否可以在TIGIT⁺T细胞中诱导ADCC。通过共转导含有CD16_V158(V158等位基因)和FcRγcDNA的表达质粒，从NK92MI细胞(ATCC)中产生测定效应细胞系NK92MI/CD16V细胞。用PHA(1μg/ml)刺激健康供体的人PBMC，以上调TIGIT表达。如图9A所示，T细胞，包括CD4⁺效应子(CD3⁺CD4⁺Foxp3^-)、CD8⁺和调节性T细胞(CD4⁺Foxp3⁺)都表达大量的TIGIT。将这些活化的PBMC(来自3名健康供体)用作靶细胞。将荧光染料CFSE标记的NK92MI/CD16V细胞(5x10⁴)与等量的靶细胞在TIGIT抗体(hu1217-2-2/IgG1mf或hu1217-2-2/IgG1wt，30μg/mL)或对照抗体(阳性对照抗CD3抗体OKT3(5μg/ml，博奇公司)或阴性对照人IgG，30μg/mL)存在下共培养40小时。与人IgG和hu1217-2-2/IgG1mf相比，hu1217-2-2/IgG1wt可以通过ADCC导致Treg的适度减少。然而，在总T细胞和CD8⁺T细胞中未观察到明显的ADCC作用(图9B)。

使用人PBMC作为靶细胞的CDC

通过使用预活化的人PBMC和来自健康供体的新鲜自体血清，确定hu1217-2-2/IgG1mf和hu1217-2-2/IgG1wt是否会触发CDC。CDC的细胞裂解通过细胞滴度glo测定试剂盒(普洛麦格公司，北京，中国)确定。简言之，将PBMC用PHA(10μg/mL)预活化3天，然后在37℃下在RPMI1640加自体血清(15％)和抗TIGIT或对照抗体(0.01-100μg/mL)中孵育过夜。通过在反应结束时细胞裂解后从活细胞释放的ATP的减少测定由CDC导致的细胞死亡。将抗MHC-I A、B、C用作阳性对照。使用96孔荧光计(PHERA Star FS，BMG莱伯泰科公司(BMGLABTECH))进行荧光读数，并且如下由相对荧光单位(RFU)读数计算CDC活性：％CDC活性＝[(RFU测试-RFU背景)/(总细胞裂解时的RFU-RFU背景)]x 100。实验结果表明，hu1217-2-2/IgG1mf和hu1217-2-2/IgG1wt与分离自两个不同供体的PBMC都没有可检测的CDC。相反，阳性对照抗体(抗MHC-I)诱导显著的CDC活性(图10)。

实例11：Hu1217-2-2/IgG1的pH依赖性结合亲和力

为了研究pH是否会影响hu1217-2-2/IgG1的结合特性，在pH 7.4和pH6.0的运行缓冲液中进行了靶向结合SPR测试，以进行比较。将抗体hu1217-2-2/IgG1固定在CM5芯片(GE公司)上。TIGIT-his的系列稀释液在pH 7.4或pH 6.0的运行缓冲液HBS中流过固定的hu1217-2-2/IgG1。

如下表7所列结果所示，与在pH 7.4(生理pH值)下获得的数据相比，hu1217-2-2/IgG1在pH 6.0(酸性pH值，与肿瘤微环境的pH相似)下对人TIGIT显示出更高的结合亲和力(KD)和更强的结合信号(Rmax)。这些结果表明，抗体作为靶向肿瘤环境中TIGIT阳性淋巴细胞的治疗剂具有潜在的优势，因为hu1217-2-2/IgG1可能更有选择性地靶向肿瘤微环境中的TIGIT阳性淋巴细胞，同时具有与活化周边淋巴细胞有关的较低的潜在毒性。

表7通过SPR检测hu1217-2-2/IgG1在pH 7.4和pH 6.0时的结合亲和力

pH	k_on(M^-1s^-1)	k_off(s^-1)	K_D(M)	Rmax(RU)
					7.4	4.34E+05	9.53E-05	2.19E-10	21
6.0	2.54E+06	7.60E-05	2.99E-11	37

实例12：hu1217-2-2抗体毒理学

与CD3+人外周血单核细胞相比，抗体hu1217-2-2在TIGIT受体占用测定中显示出与人源化TIGIT敲入型小鼠的CD3+脾细胞相当的结合亲和力(EC50分别为48.8ng/ml和63.2ng/ml)。此外，以≥0.4mg/kg的剂量，通过每周腹膜内给药，hu1217-2-2对人源化TIGIT敲入型小鼠的GL261肿瘤生长有明显的抑制作用。

hu1217-2-2的毒性和安全性特性在人源化TIGIT敲入型小鼠的4周重复剂量毒理学研究和在食蟹猴的13周重复剂量毒理学研究中得到了表征。还在具有皮下MC-38肿瘤的人源化TIGIT敲入型小鼠的4周重复剂量研究中评估了hu1217-2-2。基于hu1217-2-2的靶序列同源性和跨物种的TIGIT结合活性，认为食蟹猴是毒性研究的相关物种。

每2周一次以10、30或100mg/kg的hu1217-2-2重复给药13周后，在猴子中未观察到明显的毒性。猴子研究中的毒物动力学谱图表明，全身暴露似乎与剂量成正比，没有性别差异。在猴子的13周给药期间，没有观察到累积现象。由于没有观察到临床病理学或组织病理学的变化，因此没有明显的免疫毒性。

与人IgG相比，用hu1217-2-2处理非活化外周血单核细胞后，从体外细胞因子释放测定中没有观察到细胞因子释放的明显增加。结果表明，hu1217-2-2引起急性细胞因子释放综合症的概率很低。

总的来说，在猴子的毒性研究中没有发现明显的毒性。在人或猴的组织中没有发现意外的组织交叉反应性。毒物动力学谱图显示全身暴露的剂量比例增加，没有明显的累积或性别差异。在13周的猴子毒性研究中，hu1217-2-2的未观测到不良效应水平(NOAEL)为100mg/kg。

实例13：hu1217-2-2临床药理学

共有11名患者用以下治疗：hu1217-2-2，剂量水平为50mg(n＝1)、150mg(n＝3)、450mg(n＝4)、和900mg(n＝3)，与BGB-A317(剂量为200mg)组合。最大的施用剂量是hu1217-2-2(1800mg)，与BGB-A317(200mg Q3W)组合。静脉内输注后hu1217-2-2的血清浓度以双指数方式下降，并且hu1217-2-2的暴露量(Cmax和AUC)从50mg到900mg大约按剂量比例增加(图11)。

外周TIGIT受体占用数据可用于用hu1217-2-2治疗的11名患者，剂量为50mg(n＝1)、150mg(n＝3)、450mg(n＝4)、和900mg(n＝3)。在所有测试的剂量水平上，包括50mg的最低剂量，外周血中的CD8、CD4、NK和Treg细胞都观察到完全的TIGIT受体占用(100％)。

实例14：在PBMC测定中，hu1217-2-2单独或与BGB-A317组合促进IFN-γ分泌

为了确定hu1217-2-2与BGB-A317的组合是否能比单一疗法更好地增强原代人免疫细胞的活化，预刺激来自健康供体的PBMC以上调TIGIT表达，并用作效应细胞。将PD-L1和T细胞接合剂(OS8)阳性的A549细胞(A549/OS8-PD-L1)用作靶细胞。将预活化的PBMC与A549/OS8-PD-L1和A549/PD-L1的混合物在hu1217-2-2和BGB-A317存在下或任一抗体单独存在下在指定浓度下共培养18小时。通过ELISA测定IFN-γ产生。将IFN-γ分泌用作T细胞活化的读数。结果显示，以剂量依赖性方式用hu1217-2-2处理PBMC，增加IFN-γ产生。相对于单独使用hu1217-2-2或BGB-A317的增加，hu1217-2-2和BGB-A317的组合明显增加了IFN-γ产生，表明TIGIT和PD1的组合阻断可以缓解活化后效应细胞耗尽，该数据在图12中显示。

实例15：hu1217-2-2减少小鼠胶质瘤肿瘤模型中的肿瘤生长

在人源化TIGIT敲入型小鼠的GL261小鼠胶质瘤癌症模型中也测试了hu1217-2-2的抗肿瘤活性。将GL261细胞(1×10⁷)皮下植入人源化TIGIT敲入型小鼠中。植入3天后，将小鼠随机分配到4个组，并且如所示用DPBS(媒介物)或hu1217-2-2腹膜内治疗29天。每周测量肿瘤体积两次。数据以每组12只动物的平均肿瘤体积±SEM表示。如图13和表8所示，每周一次(QW)施用hu1217-2-2诱导剂量依赖性抗肿瘤活性。在治疗的第29天(第四次用药后7天)，hu1217-2-2在所有测试剂量(分别为0.4、2和10mg/kg QW)下诱导了明显的TGI(56％、94％和100％的TGI)(表8)。

在给药前以及第一次给药hu1217-2-2后的2、8、24、48、96和168小时(每个时间点3只小鼠，每只小鼠用于不超过2个时间点)收集血样(约100μL)。血清中hu1217-2-2的浓度通过ELISA测定确定，并且每个时间点的hu1217-2-2的血清浓度通过将剂量应答数据与5参数逻辑模型拟合来确定。第一次注射后7天，表征了3个剂量(0.4、2和10mg/kg)的hu1217-2-2的药代动力学特性，观察到hu1217-2-2的剂量依赖性暴露(Cmax第一剂量和AUC0-168 h)(表9)。在整个研究中，治疗对动物体重无明显影响。

表1hu1217-2-2在人源化TIGIT敲入型小鼠的GL261合成肿瘤模型中的剂量依赖性功效

缩写：QW，每周一次；TGI，肿瘤生长抑制；使用t检验计算p值。在治疗的第29天计算TGI。

表2人源化TIGIT敲入型小鼠单次给药后hu1217-2-2的药代动力学参数

对于表9，在给药前以及第一次给药hu1217-2-2后的2、8、24、48、96和168小时(每个时间点3只小鼠，每只小鼠用于不超过2个时间点)收集血样(约100μL)。血清中hu1217-2-2的浓度通过ELISA测定确定，并且每个时间点的hu1217-2-2的血清浓度通过将剂量应答数据与5参数逻辑模型拟合来确定。

实例16：人源化TIGIT敲入型小鼠模型的MC38小鼠结肠癌模型中hu1217-2-2和抗PD1抗体的组合

在人源化TIGIT敲入型小鼠的MC38小鼠结肠癌模型中，研究了hu1217-2-2与抗小鼠PD1(muPD1)的组合的抗肿瘤活性。将MC38肿瘤细胞(1×10⁶)皮下植入人源化TIGIT敲入型小鼠中。植入7天后，将小鼠随机分配到4个组，并且如所示用媒介物(DPBS)、muPD1(1mg/kg腹膜内注射，每5天一次(Q5D))、hu1217-2-2(3mg/kg腹膜内注射，Q5D)或组合治疗。

每周测量肿瘤体积两次。数据以10只动物的平均肿瘤体积±SEM表示。使用学生t检验计算p值。hu1217-2-2与muPD1的组合显示出比任何单独的抗体(muPD1单独为73％或hu1217-2-2单独为11％)显示更高的TGI(102％)(图14和表10)。在整个研究中，治疗对动物体重无明显影响。

表3hu1217-2-2与抗小鼠PD1抗体组合的功效

实例17：抗TIGIT和抗PD1抗体给药

在正在进行的Ph1/1b研究中测试了hu1217-2-2的剂量，范围从50mg到900mg，最大为1800mg，每3周一次，与200mg的抗PD1抗体BGB-A317结合，每3周一次。所有测试的hu1217-2-2剂量水平都通过了剂量限制性毒性(DLT)窗口，没有任何明显的安全性或耐受性事件。hu1217-2-2暴露大约以呈剂量比例方式增加。因此，选择施用剂量为900mg的hu1217-2-2作为推荐的II期剂量。

在研究中的所有测试剂量下，在外周血中的循环T细胞和NK细胞中观察到完全的TIGIT受体占用。如上所述，数据显示，在50mg时实现了100％的受体占用。预计900mg剂量的hu1217-2-2增加整个给药间隔内组织中TIGIT受体的有效浓度和饱和度的可能性。

研究中关于hu1217-2-2的药代动力学数据表明，hu1217-2-2的暴露量与患者的体重之间缺乏明显的关系，因此表明固定剂量的hu1217-2-2将是最佳的。对于hu1217-2-2抗体与BGB-A317的组合，选择固定剂量为900mg的hu1217-2-2，以及固定剂量为200mg的BGB-A317，每3周一次静脉内施用。BGB-A317剂量根据以前的BGB-A317研究中2至5mg/kg之间的相当安全性和功效特性选择。

实例18：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗体的组合

启动了1期研究，调查hu1217-2-2与BGB-A317组合，使用或不使用化疗在不可切除的局部晚期或转移性实体肿瘤患者中的安全性/耐受性、药代动力学(PK)和初步抗肿瘤活性。

被纳入研究的患者每3周一次用递增剂量的hu1217-2-2(50、150、450或900mg)与BGB-A317(200mg)组合治疗；所有患者都清除了剂量限制性毒性(DLT)期，没有出现需要从治疗中移除患者或减少剂量的毒性。因此，hu1217-2-2似乎是安全和耐受性良好的。

实例19：hu1217-2-2抗体与抗PD1抗体(BGB-A317)组合治疗局限期小细胞肺癌

BGB-A317作为单一药剂或与化疗一起在局部晚期或转移性非鳞状NSCLC、鳞状NSCLC和ES-SCLC的2期试验中进行了测试，并且BGB-A317加化疗显示出抗癌活性；17名小细胞肺癌(SCLC)患者中有13名对BGB-A317加化疗的一线治疗有应答。BGB-A317加铂类双药化疗作为局部晚期和转移性非鳞状和鳞状NSCLC的一线治疗的两项3期研究显示，无进展生存期作为主要终点的结果是积极的。hu1217-2-2和BGB-A317抗体具有不重叠的抗癌机制，并且在治疗SCLC方面可能具有协同和/或附加活性。

实例20：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗PD1抗体和化放疗组合治疗局限期小细胞肺癌

作为新型的免疫治疗组合，已经在小鼠模型中评估了抗PD-L1加抗TIGIT与放射疗法同时给予的情况(Grapin等人,J Immunother Cancer[癌症免疫治疗杂志]2019；7:160-71)。该实验比较了用抗PD-L1加抗TIGIT加放射疗法期间的肿瘤应答与单一药剂疗法加放射疗法或单独放射疗法的肿瘤应答。在CT26模型中，放射疗法与抗TIGIT和抗PD-L1疗法组合明显更有效，在3×8Gy低分级放射疗法中，与抗TIGIT、抗PD-L1和单独放射疗法的小鼠完全应答率分别为2/10(20％)、3/10(30％)、0/10(0％)相比，小鼠完全应答率为9/10(90％)。与抗TIGIT、抗PD-L1和单独放射疗法在相同分级RT中观察到小鼠完全应答率分别为3/12(25％)、8/12(66.7％)和1/10(10％)相比，在抗TIGIT和抗PD-L1与18×2Gy的正常分级放射疗法的组合中观察到小鼠完全应答率为7/12(58.3％)。SCLC表征为具有相对较高的TIGIT和PVR表达，并且PVR高表达与预后不良相关(Yu等人,Cancer Res.[癌症研究]2018；1538-7445.AM2018-3637)。

hu1217-2-2和BGB-A317组合化放疗的新型治疗策略旨在增强目前SCLC的适度改善，具体到局限期，仍然只有化疗组合放疗作为护理标准。

调查将使用BGB-A317，以200mg每3周一次静脉内注射，同时结合化放疗4个周期，然后再使用BGB-A317，以200mg每3周一次静脉内注射。

这将与以下进行比较：BGB-A317 200mg静脉内注射，每3周一次，加hu1217-2-2900mg静脉内注射，每3周一次，并同时进行4个周期的化放疗，然后再进行BGB-A317 200mg静脉内注射，每3周一次，加hu1217-2-2 900mg静脉内注射，每3周一次。

优选的化疗方案是第1天顺铂75mg/m2，以及第1、2、3天依托泊苷100mg/m2，用于前4个周期。第一周期后可根据肾脏、血液学或其他毒性情况调整剂量。放射疗法应在C1D1与化疗同时开始，最晚有可接受的窗口，与第3周期第1天化疗同时进行。推荐的总剂量由研究者决定为3周内45Gy或6.5周内60-70Gy。跟据当地的护理标准，允许预防性颅脑照射的总剂量为2周内25Gy(25Gy，每天10次分量)。该方案详见下表11。

表11hu1217-2-2和BGB-A317与化疗的组合的剂量、施用频率和施用途径

缩写：AUC，浓度时间曲线下的面积

实例21：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗PD1抗体组合治疗非小细胞肺癌(NSCLC)

肺癌是最常见的癌症，2018年全球大约有209万新诊断病例和176万死亡病例，这相当于癌症中最高的发病率和最常见的癌症相关死亡率。该疾病在男性中比在女性中更常见，占男性所有癌症的16.8％，并且占女性所有癌症的8.8％。在中国，肺癌是男性和女性癌症相关死亡的首要原因，2015年估计有61.02万例死亡，估计有73.33万新病例(Chen等人,CACancer J Clin.[CA：临床医师癌症杂志]2016；66(2):115-32)。非小细胞肺癌(NSCLC)起源于肺部的上皮细胞，并且占所有肺癌的80％至85％。NSCLC有3种主要的组织学亚型，腺癌占所有NSCLC的40％，鳞状细胞癌占25％，以及大细胞癌占所有NSCLC的10％。

NSCLC患者的预后相对较差，尽管它在很大程度上取决于检测到癌症的阶段。肺癌的分期在世界范围内是根据恶性肿瘤的肿瘤、淋巴结和转移(TNM)分类，第七版进行的(Goldstraw等人,J Thorac Oncol[胸肺肿瘤期刊]2007；2(8):706-14)。如果肺癌在早期被诊断出来，可以通过手术或化学放射疗法治愈。不幸的是，肺癌病例通常是在相对晚期发现的。大约三分之一的NSCLC患者出现局部晚期III期疾病，包括局部纵隔淋巴结或器官受累。III期患者的五年生存率从36％(IIIA期)到13％(IIIC期)不等。55％的新诊断的NSCLC患者有远端转移(四期)。IVA期患者表现为对侧肺部受累、恶性胸腔积液和恶性心包积液，或在胸部以外的单个部位(例如远端淋巴结或器官，如脑、肝或骨)出现转移。IVB期患者的疾病已扩散到远端淋巴结或器官的多个部位。IV期NSCLC患者的5年生存率为5％(Siegel等人,ACancer Journal for Clinicians[临床医生癌症杂志]2020；70(1):7-30)。鳞状NSCLC患者可接受含吉西他滨、长春瑞滨或紫杉烷的基于铂的双药。向非鳞状NSCLC患者施用基于培美曲塞的卡铂或顺铂的组合化疗。基于KEYNOTE 024试验的结果，单一药剂派姆单抗被美国食品和药物管理局(FDA)批准为转移性NSCLC患者的一线治疗药物，其肿瘤表达高水平PD-L1(肿瘤比例评分[TPS]≥50％)(Reck等人,N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2016；375(19):1823-33)。在这项研究中，与基于铂的化疗相比，派姆单抗在6个月的OS率(80.2％比对72.4％[95％ CI:0.4、0.9])和进展生存期(PFS；10.3个月比对6个月[95％ CI：6.7，NR])方面有明显改善。根据KEYNOTE 021的结果，派姆单抗与培美曲塞和基于铂的治疗的组合也已被FDA加速批准作为非鳞状NSCLC IIIB或IV期患者的一线治疗，并且无EGFR或ALK基因组异常(Langer等人,Lancet Oncol.[柳叶刀肿瘤学]2016；17(11):1497-1508)。

据报道，在NSCLC中，TIGIT在肿瘤浸润性淋巴细胞中的表达上调(Tassi等人,Cancer Res[癌症研究].2017；77:851-61)。已经显示单独阻断TIGIT受体或与PD1/PD-L1阻断组合可在体外和体内拯救功能性“耗尽”的T细胞(Johnston等人,Cancer Cell.[癌细胞]2014；26:923-3；Chauvin等人,J Clin Invest.[临床研究杂志]2015；125:2046-58)。在小鼠模型中，TIGIT阻断与抗PD1/PD-L1抗体的组合显示出明显优于单一疗法的抗肿瘤功效(Johnston等人,2014同上；Dixon等人,J Immunol.[免疫学杂志]2018；200:3000-7)。

这项试验将评估hu1217-2-2与BGB-A317组合施用于先前未经治疗的、PD-L1选择的、无EGFR或ALK基因组异常的局部晚期、不可切除或转移性NSCLC患者。根据一种或多种作用机制，通过hu1217-2-2阻断TIGIT和BGB-A317阻断PD1，预计将比单独使用BGB-A317提高功效。

在每个21天周期的第1天，先施用BGB-A317 200mg，随后施用hu1217-2-2 900mg(每3周一次)。用此剂量治疗的NSCLC(鳞状)患者的早期读数显示，疾病稳定(SD)，病变自基线的变化为-11.1。

实例22：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗PD1抗体组合治疗鼻咽癌

鼻咽癌(NPC)在世界范围内相对不常见，129,079个新病例仅占2018年诊断的所有癌症的0.7％，而>70％的新病例在东亚和东南亚，中国的年龄标准化率(世界)为3.0/10万。在流行地区中，在中国，男性的发病率高于女性，2015年的比例约为2.5比1(Bray等人,CACancer J Clin.[CA：临床医师癌症杂志]2018；68(6):394-424和Chen等人,CA Cancer JClin.[CA：临床医师癌症杂志]2016；66(2):115-32)。

在几个流行地区，NPC的发病率和死亡率已经下降，这可能是生活方式改变的结果，以及管理方面的进展，包括放射疗法技术的改进、化疗的更广泛应用和更准确的疾病分期(Lau等人,BMC Cancer[BMC癌症]13:298,2013；Hsu等人,Cancer Epidemiol BiomarkersPrev[癌症流行病学生物标志物和预防]15:856-861,2006)。NPC仍然是癌症死亡的首要原因，全球每年的死亡发生率大约为72,987例(Bray等人,同上)。根据分化程度的不同，NPC根据世界卫生组织(WHO)的标准被分为三种病理亚型。具有表面角质的分化肿瘤被定义为I型，而II型和III型分别指非角质化的分化肿瘤和未分化的肿瘤。1991年，II型和III型被组合为单一类别的非角化性癌。在NPC流行的地区，非角质化的亚型构成大多数病例(>95％)，并且总是与Epstein-Barr病毒(EBV)感染相关，而I型疾病在世界其他地区更常见(Wei等人,Lancet[柳叶刀]2005；365:2041-54；Nicholls等人,Adv Anat Path[解剖病理学进展]1997；4:71-84)。EBV感染是研究最广泛的NPC的病因因素。根据EBV编码RNA的原位杂交技术，该病毒只在所有的肿瘤细胞中检测到，而在正常的鼻咽上皮细胞中没有，这表明EBV活化在NPC的发病机制中是必要的(Pathmanathan等人,N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]1995；333:Chan等人,Cancer Res[癌症研究]2000；60:5365-70)。NPC在中国南方和东南亚地区流行。标准的一线治疗是含铂的多药化疗。然而，对于一线治疗以外的治疗，目前还没有达成共识。临床上仍然需要更有效且耐受性好的新药剂。

如前所述，抗TIGIT抗体提供了从免疫抑制性肿瘤微环境中拯救免疫细胞的潜在机制，从而诱导高效的抗肿瘤免疫应答。研究表明，TIGIT途径与PD1合作，最大限度地抑制效应性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，并促进对抗PD1疗法的抗性。

一线复发或转移性NPC的标准护理治疗由含铂的多药化疗组成；然而，对于铂难治性/复发或转移性NPC患者，一线设定(setting)之外没有标准的治疗方案。最近，其他抗PD1抗体的临床研究，如纳武单抗、派姆单抗、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、和特瑞普利单抗(toripalimab)单一疗法，在二线或以上治疗设定的晚期NPC患者中表现出良好的临床活性(中位ORR，20.5％至34％；中位OS，16.5至17.4个月；中位PFS，1.9至6.5个月)。在之前的临床试验中，BGB-A317作为单一疗法的NPC患者扩大队列的初步数据也令人鼓舞(中位ORR：43％；中位OS，未达到；中位PFS，12.4个月)。但目前的一个挑战是，PD1抑制仅使一部分难治/复发或转移性NPC患者受益，对这一患者群体更有效的治疗需求仍然没有得到满足。

在该试验中，患者将单独接受BGB-A317+hu1217-2-2或BGB-A317作为比较。患者将每3周一次静脉内接受BGB-A317 200mg+hu1217-2-2 900mg，直至研究者根据RECIST v1.1评估的疾病进展、不可接受的毒性或临床益处丧失，以先发生者为准。

在试验期间，根据RECIST v1.1，前24周将每6周(±7天)进行一次肿瘤评估，第1年的剩余时间每9周(±7天)进行一次评估，此后每12周(±7天)进行一次评估，不考虑管理毒性的剂量延迟。为了确定BGB-A317和hu1217-2-2组合的PK特性，将在各个时间点收集血液样品。在基线(第1周期第1天的预先剂量)、第一次肿瘤应答时(下一周期第1天的预先剂量)和疾病进展后的治疗结束(EOT)访视时，将采集可选的血液样品(每个时间点10mL)。

表12 NPC中hu1217-2-2和BGB-A317的计划剂量、施用频率和施用途径

表13NPC中hu1217-2-2和BGB-A317的施用

初步临床结果显示，鼻咽癌患者在施用hu1217-2-2与BGB-A317组合36周后没有进展。肿瘤病变(TL)最初出现时大小为31mm，在36周的治疗过程中恢复到23mm，导致肿瘤大小从基线减少25.81％，并且从最低点没有变化。

表14

实例23：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗PD1抗体组合治疗食管癌

食管癌是世界上第七大最常见的癌症，也是癌症死亡的第六大常见原因。发病率最高的地区从伊朗北部到中亚各共和国，并进入中国北部。食管癌最常见的组织学类型是食管鳞状细胞癌(ESCC)，这在东欧和亚洲更为常见。超过三分之二被诊断为食管癌的患者将有晚期或转移性疾病，中位生存期为8至10个月，并且预期5年生存率<5％。这些数据，再加上相对缺乏高效的治疗方法，表明被诊断为一般食管癌和具体的ESCC的患者有大量未满足的医疗需求。

与化疗相比，抗PD1疗法作为ESCC的二线治疗已显示出优越的功效。KEYNOTE-181试验招募了628名复发的局部晚期或转移性食管癌患者，这些患者在先前一线系统治疗晚期疾病时或之后出现进展，与化疗相比，接受派姆单抗治疗的患者的主要终点OS有明显改善(10.3个月对比6.7个月，HR，0.62；95％ CI：0.46至0.90)。ATTRACTION-3试验招募了419名患有不可切除的晚期、复发性或转移性ESCC的患者，这些患者对≥1种氟嘧啶和基于铂的方案难治或不耐受，据报道，与研究者选择的他紫杉烷化疗相比，使用纳武单抗治疗的患者的主要终点OS有明显改善(10.9个月对比8.4个月；HR，0.77；95％ CI：0.62至0.96)。无论PD-L1表达水平如何，都能观察到总的生存获益。

抗TIGIT抗体的施用提供了从免疫抑制性肿瘤微环境中拯救免疫细胞的潜在机制，从而诱导高效的抗肿瘤免疫应答。研究表明，TIGIT途径与PD1合作，最大限度地抑制效应TIL，并促进对抗PD1疗法的抗性。如上述试验所述，靶向PD1/PD-L1途径的阻断抗体在治疗ESCC方面取得了显著效果。因此，抗TIGIT抗体可以显著改善和/或延长抗PD1疗法在ESCC中的治疗效果。

患有不可切除、局部晚期、复发或转移性ESCC且一线化疗失败的患者代表了有着巨大的未满足医疗需求的患者群体。因此，本试验旨在比较BGB-A317加hu1217-2-2对比BGB-A317作为单一药剂治疗PD-L1表达阳性和食管癌患者的功效。食管癌可以是不可切除的、局部晚期的、复发的或转移的ESCC。

患者将每3周一次静脉内接受BGB-A317(200mg)加hu1217-2-2(900mg)，直至研究者根据RECIST v1.1评估的出现不可接受的毒性或患者退出治疗。患者将在每个21天周期的第1天(即每3周一次)接受BGB-A317 200mg，随后在每个21天周期的第1天施用hu1217-2-2 900mg。

表15ESCC治疗的计划剂量、施用频率和施用途径

研究药物	剂量	施用时间	施用途径	治疗持续时间
					hu1217-2-2	900mg	每个21天周期的第1天	静脉内	如上所述
BGB-A317	200mg	每个21天周期的第1天	静脉内	如上所述。

表16施用研究药物并监测ESCC的治疗时间

初步临床结果显示，食管癌患者在施用hu1217-2-2与BGB-A317组合6周后没有进展。肿瘤病变(TL)最初出现时大小为38mm，并且随着治疗过程中恢复到23mm，导致肿瘤大小从基线和最低点减少39.47％。

表17

实例24：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗PD1抗体组合治疗宫颈癌

宫颈癌是第四大最常见的癌症，也是妇女癌症死亡的第四大原因，2018年全球约有57万新诊断病例和31.1万例死亡。全球宫颈癌的估计的年龄标准化发病率为每10万名妇女中13.1例，并且各国之间差异很大，发病率范围从每10万名妇女小于2例到75例。中国和印度共占全球宫颈癌负担的超过三分之一，中国有10.6万例病例和4.8万例死亡，印度有9.7万例病例和6万例死亡(Arbyn等人,Lancet Glob Health.[柳叶刀全球健康]2020；8:e191-e203)。

据估计，15％至61％的妇女会出现复发或转移性宫颈癌，通常是在完成初级治疗后的前2年内。对于在基于铂的一线治疗后出现进展的患者，治疗选择有限，而且没有建立护理标准。单一的细胞抑制剂仅导致了有限的应答率和有限的持续时间。这表明宫颈癌和/或转移性宫颈癌患者有重大的未满足的医疗需求。

宫颈癌的最主要原因是持续的乳头瘤病毒感染。人乳头瘤病毒(HPV)在99％的宫颈肿瘤(特别是致癌亚型，如HPV 16和18)中被检测到。由于HPV已被认为是宫颈癌中最重要的致病因素，因此，宫颈癌是有吸引力的免疫疗法靶标，因为病毒蛋白是强烈的免疫刺激物。2018年6月，派姆单抗获得了US FDA的加速批准，用于治疗化疗时或化疗后疾病进展且肿瘤表达程序性死亡配体1(PD-L1)的宫颈癌患者。

鉴于该适应症中报道的抗PD1抗体具有良好的抗肿瘤活性，并且鉴于抗TIGIT抗体可以提高抗PD1疗法的治疗效果的科学原理，hu1217-2-2与BGB-A317的组合可以为宫颈癌的治疗带来显著的临床益处。

该试验将评估hu1217-2-2与BGB-A317组合在宫颈癌、转移性宫颈癌或先前治疗过的复发性宫颈癌患者中的施用。试验的第一阶段将对宫颈癌患者施用hu1217-2-2与BGB-A317的组合，而不考虑PD-L1表达。患者将按1:1的比例随机接受hu1217-2-2(900mg，每三周(Q3W))与BGB-A317(200mg Q3W)的组合或作为单一疗法的BGB-A317(200mg Q3W)。第一阶段结束后，将招募更多的患者。这些患者将施用hu1217-2-2(900mg Q3W)与BGB-A317(200mgQ3W)的组合。

实例25：hu1217-2-2抗体与BGB-A317抗PD1抗体组合治疗实体瘤

在针对实体瘤的试验中，hu1217-2-2与BGB-A317组合施用。表18显示了七(7)名患者的应答，这些患者被施用hu1217-2-2与BGB-317的组合，其中使用不同剂量的hu1217-2-2，但保持BGB-A317的剂量为200mg。在下面的病例中，肿瘤病变(TL)在组合疗法下出现了消退，并且在六个病例中，导致疾病稳定(SD)，其中一个患者有部分应答(PR)。总的来说，组合治疗后，肿瘤消退或没有进展。例如，作为部分应答者的胃/胃食管交界处患者的TL大小为84mm，经过6周的治疗后，其TL大小减少到53mm，从而使TL从基线和最低点减少了36.9％。

表18

实例26：hu1217-2-2抗体以剂量递增与BGB-A317抗PD1抗体组合

在晚期、转移性、不可切除的实体瘤患者中进行了1期剂量递增研究，对于这些患者，标准疗法无效、无法忍受或无法获得。患者在第1个周期的第1天以50mg的剂量静脉内(IV)接受hu1217-2-2作为单一药剂，并在第1个周期的第8天以200mg IV接受BGB-A317。如果能耐受，患者接受四次剂量递增的hu1217-2-2，剂量范围从150-900mg，在第29天和此后每三周(Q3W)依次加BGB-A317 200mg，直到停药。鼻咽癌患者在hu1217-2-2剂量为150mg(Q3W)，组合BGB-A317 200mg(Q3W)持续54周下癌症稳定，这是测试的最长持续时间。hu1217-2-2以450mg的剂量(Q3W)与200mg的BGB-A317(Q3W)组合下，子宫癌患者和另一名基底细胞癌患者的病情稳定。在此相同的剂量下，胃癌患者有部分应答。最后，900mg剂量的hu1217-2-2(Q3W)与200mg的BGB-A317(Q3W)的组合导致六名癌症患者病情稳定(2名肾癌患者，1名黑色素瘤患者，1名肉瘤患者，1名胰腺癌患者和1名唾液腺癌患者)。这个剂量的施用在间皮瘤患者中也出现一次部分应答。

实例27：hu1217-2-2抗体与BGB-A317和BAT1706抗体组合用于治疗肝细胞癌

BAT1706是贝伐单抗(bevacizumab)注射液(贝伐单抗注射液(BevacizumabInjection)，品牌名)的类似生物制品。贝伐单抗是重组人源化免疫球蛋白G1(IgG1)单克隆抗体，其以高亲和力与人血管内皮生长因子(VEGF)结合。贝伐单抗能够选择性地以高亲和力与所有人VEGF A同种型结合，并阻断VEGF与VEGF受体-1(VEGFR-1)和VEGF受体2(VEGFR-2)的结合，从而中和VEGF的生物活性。它是目前唯一的抗肿瘤血管生成药物，其在延长癌症患者的总生存期和无进展生存期方面有确切的临床功效。一些随机、对照的II期和III期研究表明，与单独使用标准化疗相比，贝伐单抗与标准化疗组合治疗可使总生存期、无进展生存期和总缓解率得到统计学上的显著改善。

体外药效学比较研究的结果表明，BAT1706和贝伐单抗均表现出与VEGF的特异性结合，这与文献报道一致。用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖抑制测试来测量BAT1706的生物活性。结果表明，BAT1706与贝伐单抗对HUVEC的生长表现出类似的剂量依赖性关系，两者均表现出对VEGF的有效中和功效。发现BAT1706的生物活性在(1.0±0.2)×104U/mg的预定范围内与贝伐单抗相当。

比较了BAT1706和贝伐单抗在几种人癌症模型(NSCLC、卵巢癌和横纹肌肉瘤)中的抗致瘤作用。将NCI-H358人NSCLC细胞皮下接种于非肥胖性糖尿病/严重组合免疫缺陷(NOD/SCID)雌性小鼠，以建立人NSCLC异种移植模型。动物被分为以下5组，每组由8只雌性小鼠组成：

媒介物对照组

贝伐单抗5.0mg/kg组

贝伐单抗0.5mg/kg组

BAT1706 5.0mg/kg组

BAT1706 0.5mg/kg组。

允许肿瘤生长到平均体积为128mm³。此后，在随后的3周内，每周的第1、3和5天通过尾静脉注射进行施用。功效是通过肿瘤重量、肿瘤体积和相对肿瘤生长抑制(TGI)来测量的。也观察到了肿瘤潜伏期，但未评估统计学意义。在该研究中，与媒介物对照组相比，BAT1706和贝伐单抗用于评估肿瘤潜伏期的靶肿瘤重量是相同的(600mm3)。BAT1706 5mg/kg和贝伐单抗5mg/kg组的平均肿瘤体积，但不是BAT1706 0.5mg/kg和贝伐单抗0.5mg/kg组的平均肿瘤体积在剂量终止后1天与媒介物对照组有统计学上的显著差异。肿瘤重量数据与肿瘤体积数据一致。值得注意的是，BAT1706和贝伐单抗的配对剂量(0.5或5mg/kg)的肿瘤体积和肿瘤重量结果没有统计学差异。BAT1706 5mg/kg和贝伐单抗5mg/kg的相对TGI(％)分别为94％和93％。0.5mg/kg的BAT1706和0.5mg/kg的贝伐单抗的相对TGI(％)分别为67％和63％。总之，BAT1706以剂量依赖性方式显示出与贝伐珠单抗相似的功效。

在SK-OV-3人卵巢癌细胞异种移植模型小鼠模型和673人横纹肌肉瘤细胞异种移植小鼠模型中也出现了类似的结果，其中BAT1706以剂量依赖性方式显示出与贝伐单抗相似的功效。两项研究中的所有治疗组都没有出现死亡或严重毒性的迹象，并且两种抗体在整个治疗过程中都有良好的耐受性。

在新西兰进行的一项I期研究评估了BAT1706的安全性，并在健康受试者中比较了EU-贝伐单抗和US-贝伐单抗。共有125名健康受试者接受了3种研究药物：BAT1706、EU-贝伐单抗、或US-贝伐单抗中的1种的单次、1mg/kg施用，作为90分钟的IV输注，并且研究结果显示，BAT1706的单次IV输注是安全的，并且耐受性良好，只与轻微的注射部位反应有关。

在中国进行的一项单独的I期研究(BAT1706-002-CR)也评估了BAT1706的安全性，并在健康受试者中与贝伐单抗(欧洲)进行了比较。共有80名健康受试者(BAT1706组39名受试者和贝伐单抗组41名受试者)接受了研究药物的单次、1mg/kg施用。研究结果显示，两种药物都表现出良好的安全性和耐受性特征。在新西兰和中国的研究中，没有任何受试者报告出现抗药抗体阳性结果。

肝细胞癌(HCC)是主要的全球健康问题，占所有报告的肝癌病例的85％-90％(该术语与HCC经常互换使用)(El-Serag等人,Gastroenterology[胃肠病学]2007；132(7):2557-76)。根据世界卫生组织的GLOBOCAN 2012数据库，肝癌是当年第六大最常见的癌症类型，全世界有78.2万个新病例；它也是癌症相关死亡的第二个常见原因，估计造成74.6万人死亡(Torre等人,CA Cancer J Clin.[CA：临床医师癌症杂志]2015；65(2):87-108)。大多数HCC病例(>80％)发生在东亚和撒哈拉以南非洲，典型的发病率为>20人/10万人。仅中国就占了全世界HCC新病例和HCC相关死亡病例的大约50％(Torre,同上)。南欧国家，如西班牙、意大利和希腊，往往有更适中的发病率(大约每10万人中有10至20人)，而北美、南美、北欧和大洋洲的HCC发病率相对较低(每10万人中有<5人)(El-Serag等人,Gastroenterology.[胃肠病学]2012；142(6):1264-73)。

如前所述，抗PD-1/PD-L1抑制剂单一疗法已显示出对先前治疗的HCC的临床益处(Qin等人,Lancet Oncol.[柳叶刀肿瘤学]2020；21(4):571-80)。然而，与索拉非尼相比，它在一线HCC患者中没有显示出明显的改善(Yau等人,Ann Oncol.[肿瘤学年鉴]2019；30,(增刊5)；v874-v75)。鉴于HCC中报道的抗PD-1抗体具有良好的抗肿瘤活性，并且鉴于TIGIT可以改善抗PD-1疗法的治疗效果，hu1217-2-2与BGB-A317的组合可以在该适应症中带来显著的临床益处。

在HCC患者中已经观察到贝伐单抗的单药活性(Boige等人,Oncologist.[肿瘤学家]2012；17:1063-72；Siegel J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]2008；26:2992-8)。与PD-L1抑制剂组合，贝伐单抗在其他类型的肿瘤中显示出免疫调节作用，具有良好的临床益处和安全性特性(Wallin等人,Nat Commun.[自然通讯]2016；7:12624)。IMbrave150研究和Orient32研究的阳性结果表明，将抗PD-1/PD-L1抑制剂与抗血管生成药剂组合具有协同作用。

在研究hu1217-2-2与BGB-A317的组合加BAT1706作为晚期HCC患者的一线治疗的有效性和安全性的研究中，该研究将招募大约90名患者，按2:1的比例随机分配到以下2个治疗组中的一个：

A组(n＝60)：每3周一次静脉内注射hu1217-2-2 900mg(以21天的周期给药)+每3周一次静脉内注射BGB-A317 200mg(以21天的周期给药)+每3周一次静脉内注射BAT170615mg/kg(以21天的周期给药)。

B组(n＝30)：每3周一次静脉内注射BGB-A317 200mg(以21天的周期给药)+每3周一次静脉内注射BAT1706 15mg/kg(以21天的周期给药)。

如上所披露的，靶向TIGIT提供了从免疫抑制性肿瘤微环境中拯救免疫细胞的潜在机制，从而诱导高效的抗肿瘤免疫应答。研究表明，TIGIT途径与PD-1合作，最大限度地抑制效应肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，并促进对抗PD-1疗法的抗性。靶向PD-1/PD-L1途径的抗体在治疗HCC方面已经取得了成果，因此，用hu1217-2-2与BGB-A317和BAT1706的组合可以显著改善HCC的治疗。

序列表

<110> 百济神州有限公司（BeiGene, Ltd.）

<120> 使用抗TIGIT抗体与抗PD1抗体组合治疗癌症的方法

<130> F22W0881PCT

<160> 24

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

165 170 175

Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

210 215 220

Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

225 230 235 240

Thr Glu Thr Gly

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

115 120

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Asp Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

Gln Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 6

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

Trp Ala Ser Ala Arg His Thr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 9

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 357

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 10

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcaa cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggat tcggcagact 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attactaagg gtggtggtag cacctattat 180

ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaagtga gccgtctgaa gtctgaggac acagccatat attactgtgc aagacagact 300

aactacgact ttactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcacggt ctcctca 357

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 12

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcatctgca aggccagtca ggatgtgggt acttctgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaacctact gatttactgg gcatccgccc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtacagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagtt atcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-1-1 HCDR2

<400> 13

Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-1-1 VH pro

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-1-1 VH DNA

<400> 15

gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60

agctgcgcca ccagcggctt caccttctcc gactactaca tgtactggat caggcaggcc 120

cctggcaaag gcctggagtg ggtggcctac atcaccaagg gcggcggcag cacctactac 180

cccgatagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc caggcagacc 300

aactacgact tcaccatgga ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt gagcagc 357

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-1-1 VK pro

<400> 16

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-1-1 VK DNA

<400> 17

gagatcgtga tgacccagag ccctgccaca ctgagcgtga gccctggcga gagagccacc 60

ctgagctgca aggccagcca ggatgtgggc accagcgtgg cctggtacca gcagaaaccc 120

ggccaggctc ccaggctgct gatctactgg gccagcgcca gacacacagg cgtgcctgcc 180

agatttagcg gcagcggcag cggcaccgag tttaccctga ccatcagcag cctgcagtcc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacagcagct accccctgac attcggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 18

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1mf

<400> 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-2-2 VH pro

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-2-2 VH DNA

<400> 20

gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttctcc gactactaca tgtactgggt caggcaggcc 120

cctggcaaag gcctggagtg ggtggcctac atcaccaagg gcggcggcag cacctactac 180

cccgatagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc caggcagacc 300

aactacgact tcaccatgga ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt gagcagc 357

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-2-2 VK pro

<400> 21

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hu1217-2-2 VK DNA

<400> 22

gagatcgtga tgacccagag ccctgccaca ctgagcgtga gccctggcga gagagccacc 60

ctgagctgca aggccagcca ggatgtgggc accagcgtgg cctggtacca gcagaaaccc 120

ggccaggctc ccaggctgct gatctactgg gccagcgcca gacacacagg catccctgcc 180

agatttagcg gcagcggcag cggcaccgag tttaccctga ccatcagcag cctgcagtcc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacagcagct accccctgac attcggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A7 VH pro

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Arg Ser Gly Ser Gly Ile Val Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Pro Leu Gly His Asn Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A7 VK pro

<400> 24

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Ser

20 25 30

Gly Val Lys Glu Asn Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ile Arg Phe Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Gly Ile Asn Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 26

Val Ile Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 28

Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Tyr Ala Phe His Arg Phe Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

His Gln Ala Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 31

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4B6 DNA-VH

<400> 31

caggtgcagc tgcaggagtc gggaccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctgggtt ttcattaacc agctatggtg tacactggat ccggcagccc 120

ccagggaagg gactggagtg gatcggggtc atatacgccg atggaagcac aaattataat 180

ccctccctca agagtcgagt gaccatatca aaagacacct ccaagaacca ggtttccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agcctatggt 300

aactactggt acatcgatgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 32

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4B6 VH

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4B6 VL

<400> 33

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcga gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca gcagaaacca 120

ggacagcctc ctaagctgct cattaactat gcatttcatc gcttcactgg ggtccctgac 180

cgattcagtg gcagcgggta tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct 240

gaagatgtgg cagtttatta ctgtcaccag gcttatagtt ctccgtacac gtttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4B6 VL

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Tyr Ala Phe His Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ala Tyr Ser Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huIgG4mt10 pro

<400> 35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Ala Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

Claims

1.一种癌症治疗的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗PD1抗体或其抗原结合片段的组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段与抗PD1抗体的组合，该抗体或其抗原结合片段与人TIGIT特异性结合，并且包含：

(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR(重链互补决定区)1，(b)SEQ ID NO:13的HCDR2，和(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含(d)SEQ ID NO:6的LCDR(轻链互补决定区)1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3；或

(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:3的HCDR1，(b)SEQ ID NO:4的HCDR2，和(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:6的LCDR1，(e)SEQ ID NO:7的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:8的LCDR3。

3.如权利要求2所述的方法，其中该抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含：

4.如权利要求1所述的方法，其中该抗PD1抗体包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD1，并且包含：

5.如权利要求4所述的方法，其中该抗PD1抗体或其抗原结合片段特异性结合人PD1，并且包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中该抗PD1抗体包含含有SEQ ID NO:35的IgG4恒定结构域。

7.如权利要求1所述的方法，其中该抗TIGIT抗体是选自下组的抗体片段，该组由以下组成：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv、和(Fab')2片段。

8.如权利要求1所述的方法，其中该抗PD1抗体是选自下组的抗体片段，该组由以下组成：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv、和(Fab')2片段。

9.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括施用有效量的抗VEGF抗体。

10.如权利要求9所述的方法，其中该抗VEGF抗体是贝伐单抗或BAT1706。

11.如权利要求1或权利要求9所述的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、头颈癌、胃癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。

12.如权利要求9所述的方法，其中该小细胞肺癌是局限期小细胞肺癌。

13.如权利要求9所述的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌。

14.如权利要求9所述的方法，其中该头颈癌是鼻咽癌。

15.如权利要求9所述的方法，其中该食管癌是食管鳞状细胞癌(ESCC)。

16.如权利要求9所述的方法，其中该癌症是子宫癌。

17.如权利要求9所述的方法，其中该胃癌是胃或胃食管连接处癌。

18.如权利要求9所述的方法，其中该宫颈癌是复发或转移性宫颈癌。

19.如权利要求9所述的方法，其中该皮肤癌是基底细胞癌。

20.如权利要求9所述的方法，其中该癌症是胰腺癌。

21.如权利要求9所述的方法，其中该肾癌是肝细胞癌。

22.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括施用化疗。

23.如权利要求22所述的方法，其中该化疗是化放疗。

24.如权利要求1所述的方法，其中该抗PD1抗体以每三周200mg给药。

25.如权利要求24所述的方法，其中该抗TIGIT抗体以50mg-900mg的范围给药。

26.如权利要求25所述的方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周50mg给药。

27.如权利要求25所述的方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周150mg给药。

28.如权利要求25所述的方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周450mg给药。

29.如权利要求25所述的方法，其中该抗TIGIT抗体以每三周900mg给药。