KR20230158464A - 항-pd1 항체와 조합하여 항-tigit 항체를 사용하는암 치료 방법 - Google Patents

항-pd1 항체와 조합하여 항-tigit 항체를 사용하는암 치료 방법 Download PDF

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Abstract

TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체, WUCAM 또는 Vstm3) 및 이의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 항-PD1 항체와 조합하여 사용하여 암을 치료하거나 면역 반응을 증가, 향상 또는 자극시키는 방법이 제공된다.

Description

항-PD1 항체와 조합하여 항-TIGIT 항체를 사용하는 암 치료 방법
본 출원은 암 치료를 위해 항-PD1 항체와 조합하여 TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
TIGIT(T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인)은 항종양 면역에서 T 세포 및 NK 세포 매개의 기능적 활성을 저해하는 데 중요한 역할을 하는 CD28 계열의 단백질의 구성원인 I형 막관통 단백질이다(Boles KS, 등, 2009 Eur J Immunol, 39:695-703; Stanietsky N, 등, 2009 PNAS 106:17858-63; Yu X, 등 2009 Nat. Immunol, 10:48-57).
TIGIT를 코딩하는 유전자 및 cDNA를 클로닝하고 마우스 및 인간에서 특성화했다. 전체 길이의 인간 TIGIT는 244개 아미노산(서열번호 1) 길이의 서열을 가지며, 여기서 처음 21개 아미노산은 신호 펩타이드로 이루어진다. 성숙한 인간 TIGIT의 아미노산 서열은 223개의 아미노산(aa) 잔기를 함유한다(NCBI 수탁 번호: NM_173799). 성숙한 인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)은 V형 Ig-유사 도메인(서열번호 1의 아미노산 39-127에 상응함)을 갖는 120개 아미노산 잔기(서열번호 1의 아미노산 22-141에 상응하는 서열번호 2), 이어서 21aa 막관통 서열, 및 면역수용체 티로신 기반의 저해성 모티프(ITIM)를 갖는 82aa 세포질 도메인으로 이루어진다(Yu X, 등 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57; Stengel KF, 등 2012 PNAS 109:5399-04). ECD 내에서 인간 TIGIT는 마우스 및 사이노몰구스 원숭이와 각각 단지 59% 및 87% aa 서열 동일성을 공유한다.
TIGIT는 T 세포(활성화 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T(Treg) 세포 및 여포성 T 헬퍼(Tfh) 세포 포함) 및 NK 세포(Boles KS, 등, 2009 Eur J Immunol, 39:695-703; Joller N, 등, 2014 Immunity 40:569-81; Levin SD, 등, 2011 Eur J Immunol, 41:902-15; Stanietsky N, 등, 2009 PNAS 106:17858-63; Yu X, 등 2009 Nat. Immunol, 10:48-57)에서 발현된다.
지금까지, 2개의 TIGIT 리간드인 CD155(폴리오바이러스 수용체 또는 PVR로도 알려짐) 및 CD112(폴리오바이러스 수용체-관련 2, PVRL2, 넥틴-2로도 알려짐)가 식별되었다. 이들 리간드는 주로 APC(예컨대, 수지상 세포 및 대식세포) 및 종양 세포에서 발현된다(Casado JG, 등, 2009 Cancer Immunol Immunother 58:1517-26; Levin SD, 등, 2011 Eur J Immunol, 41: 902-15; Mendelsohn CL 등, 1989 56:855-65; Stanietsky N, 등, 2009 PNAS 106:17858-63; Yu X, 등 2009 Nat. Immunol, 10:48-57). 면역 "관문" 분자로서 TIGIT는 이의 리간드인 CD155 및 CD112에 의해 결합될(engaged) 때 면역 세포에서 저해성 신호전달을 개시한다. CD155에 대한 TIGIT의 결합 친화성(Kd: ~1 nM)은 CD112에 대한 것보다 훨씬 더 높으며, TIGIT:CD112 상호작용이 저해성 신호를 매개하는 데 기능적으로 관련이 있는지 여부는 아직 결정되어야 할 것으로 남아 있다. 공동자극 수용체인 CD226(DNAM-1)은 동일한 리간드들에 더 낮은 친화성(Kd:~100 nM)으로 결합하지만 양성 신호를 전달한다(Bottino C, 등, 2003 J Exp Med 198:557-67). 또한, "TIGIT-유사" 수용체인 CD96(Tactile)도 동일한 경로에서 유사한 저해 역할을 한다(Chan CJ, 등, 2014 Nat. Immunol 15:431-8).
TIGIT는 상이한 메커니즘을 통해 면역 반응을 저해할 수 있다. 첫째, 수지상 세포(DC)에서 TIGIT와 PVR 사이의 상호작용은 DC에서 "역 신호전달"을 전달할 수 있어, IL-10의 상향조절 및 IL-12 분비의 감소를 야기하고, 이로써 T 세포 활성화를 저해한다(Yu X, 등 Nat Immunol. 2009 10:48-57). 둘째, TIGIT는 더 높은 친화성으로 CD155에 결합하여 DNAM-1-CD155 상호작용과 경쟁한다. 셋째, T 세포에 대한 TIGIT의 직접적인 결찰은 TCR-매개 활성화를 하향 조절할 수 있고, 후속 증식 및 NK 세포에 대한 TIGIT의 결합(engagement)은 NK 세포 세포독성을 차단한다(Joller N, 등 2011 186: 1338-42; Stanietsky N, 등, 2009 PNAS 106:17858-63). 넷째, Treg에서의 TIGIT 발현은 종양 조직에서 고도로 활성화 및 억제성 표현형과 연관이 있었고, Treg에서의 TIGIT 신호전달은 Treg 안정성에 유리할 수 있다(Joller N, 등 Immunity 2014 40:569-81; Kurtulus S, 등 J Clin Invest. 2015 125: 4053-4062).
TIGIT는 면역글로불린 꼬리 티로신(ITT)-유사 모티프에 이어서 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 이의 세포질 꼬리에 갖는다(Yu X, 등 Nat Immunol. 2009 10:48-57; Engels N, 등 Curr Opin Immunol 2011 23: 324-329). 이들 모티프는 포스파타제 SHIP-1 및 β-아레스틴 2의 동원을 매개할 수 있고(Li M, 등 J Biol Chem. 2014 289:17647-17657; Liu S, 등 Cell death and differentiation 2013 20: 456-464), 이에 따라 TIGIT가 활성화 신호를 약화시키는 저해 신호를 내재적으로 전달할 수 있는 메커니즘을 제공한다.
종양-침윤 림프구(TIL) 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 TIGIT 발현의 상향 조절은 폐(Tassi, 등, Cancer Res. 2017 77: 851-861), 식도(Xie J, 등, Oncotarget 2016 7:63669-63678), 유방(Gil Del Alcazar CR, 등 2017 Cancer Discov.), 급성 골수성 백혈병(AML)(Kong Y 등, Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66) 및 흑색종(Chauvin JM, 등, J Clin Invest. 2015 125:2046-2058)과 같은 많은 유형의 암에서 보고되었다. AML에서 TIGIT의 증가된 발현은 환자 생존 결과의 불량한 예후와 연관이 있다(Kong Y 등, Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66). TIGIT 신호전달의 상향 조절은 암에 대한 면역 관용뿐만 아니라 만성 바이러스 감염에도 중요한 역할을 한다. HIV 감염 동안, T 세포에서 TIGIT의 발현은 상당히 더 높았고 바이러스 부하 및 질환 진행과 양성적 상관관계가 있었다(Chew GM, 등, 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349). 또한, TIGIT 수용체 단독의 차단 또는 다른 차단과의 조합은 시험관내 및 생체내 모두에서 기능적으로 "소진된" T 세포를 구제할 수 있다(Chauvin JM, 등, J Clin Invest. 2015 125:2046-2058; Chew GM, 등, 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349; Johnston RJ, 등 Cancer Cell 2014 26:923-937). 암 및 바이러스 감염의 경우에, TIGIT 신호전달의 활성화는 면역 세포 기능 장애를 촉진하여 암의 과성장 또는 바이러스 감염 확대를 야기한다. 치료제에 의한 TIGIT 매개 저해성 신호전달의 저해는 T 세포, NK 세포 및 수지상 세포(DC)를 포함한 면역 세포의 기능적 활성을 회복시켜 암 또는 만성 바이러스 감염에 대한 면역을 향상시킬 수 있다.
PD1 또는 PDL1을 표적으로 하는 단클론 항체는 이러한 상호작용을 차단하고 암세포에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 이들 항체는 피부 흑색종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암, 방광암, 두경부암 및 호지킨 림프종을 포함한 여러 유형의 암을 치료하는 데 도움이 되는 것으로 밝혀졌다. 단일 작용제 관문 저해제에 대한 대부분의 무반응자에서 암 세포는 이 암 세포가 성장하고 생존할 수 있도록 하는 선천적인 메커니즘을 통해 탈출한다. 결과적으로, 질환은 자연사와 일치하는 속도로 진행한다. 그러나, 내인성 내성과 달리, 현재 임상 시험의 더 오랜 추적조사 후 이전 임상 이점이 있는 환자에서 후기 재발이 나타나고 있으며, 이는 후천적 내성의 출현을 암시한다(Jenkins 등, Br. J. Cancer 118, 9-16 2018).
따라서, 항-PD1 항체와 함께 항-TIGIT 항체의 조합은 관용으로부터 면역 세포를 구제하여 암 또는 만성 바이러스 감염의 치료에서 효율적인 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 개시내용은 항-PD1 항체와 조합하여 항-TIGIT 항체를 투여하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 항-TIGIT 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 3, 4, 5 또는 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR, 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어, 서열번호 3, 4, 5 또는 13의 아미노산 서열에 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 6, 7 또는 8로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR, 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어 서열번호 6, 7 또는 8의 아미노산 서열에 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
보다 구체적인 실시양태에서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어, 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 4 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어, 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어, 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 또는 1개 이상의 보존적 치환, 예를 들어 1개 또는 2개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
본 출원의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 TIGIT에 결합할 수 있고 서열번호 9, 14, 19로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9, 14, 19와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열의 차이는 프레임워크 영역에 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 10, 15 또는 20으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 변이체에 의해 인코딩된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT에 결합할 수 있고 서열번호 11, 16, 21 또는 24로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 11, 16, 21 또는 24와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열의 차이는 프레임워크 영역에 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 12, 17 또는 22로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 변이체에 의해 인코딩된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1x10-9 M 내지 약 1x10-12 M의 Kd 값으로 인간 TIGIT에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1x10-9 M 미만, 약 1x10-10 M 미만, 약 1x10-11 M 미만 또는 약 1x10-12 M 미만의 Kd 값으로 인간 TIGIT에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 서브클래스, 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역, 및 카파 또는 람다 유형, 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 또는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18의 Fc 영역이다.
암 치료 방법으로서, 대상체에게 항-PD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합으로 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
방법으로서, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 항-PD1 항체와 조합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법:
(i) (a) 서열번호 3의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열번호 4의 HCDR2, 및 (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(ii) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 13의 HCDR2, 및 (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
방법으로서, TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기를 포함하는, 방법:
(i) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(ii) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(iii) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
방법으로서, 항-PD1 항체가 인간 PD1에 특이적으로 결합하고, 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법:
(a) 서열번호 25의 HCDR1, (b) 서열번호 26의 HCDR2, 및 (c) 서열번호 27의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 28의 LCDR1, (e) 서열번호 29의 LCDR2 및 (f) 서열번호 30의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
방법으로서, 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 PD1에 특이적으로 결합하고 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 방법.
방법으로서, 항-PD1 항체가 서열번호 35를 포함하는 IgG4 불변 도메인을 포함하는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 방법.
방법으로서, 항-PD1 항체가 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 방법.
방법으로서, 상기 암은 유방암, 결장암, 췌장암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 또는 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
방법으로서, 소세포 폐암이 제한된 병기의 소세포 폐암인 방법.
방법으로서, 암이 비-소세포 폐암인 방법.
방법으로서, 두경부암이 비인두암인 방법.
방법으로서, 식도암이 식도 편평 세포 암종(ESCC)인 방법.
방법으로서, 암이 자궁암인 방법.
방법으로서, 위암이 위 또는 위식도 접합부 암인 방법.
방법으로서, 자궁경부암이 재발성 또는 전이성 자궁경부암인 방법.
방법으로서, 피부암이 기저 세포 암종인 방법.
방법으로서, 암이 췌장암인 방법.
방법으로서, 화학요법의 투여를 추가로 포함하는 방법.
방법으로서, 화학요법이 화학방사선요법인 방법.
방법으로서, 항-PD1 항체가 3주마다 200mg으로 투여되는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 50mg-900mg의 범위로 투여되는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 3주마다 50mg으로 투여되는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 3주마다 150mg으로 투여되는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 3주마다 450mg으로 투여되는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 3주마다 900mg으로 투여되는 방법.
방법으로서, 항-TIGIT 항체가 3주마다 1800mg으로 투여되는 방법.
도 1 TIGIT-mIgG2a(위) 및 TIGIT-huIgG1(아래)의 개략도. TIGIT ECD: TIGIT 세포외 도메인. N: N-말단. C: C-말단.
도 2a-b 항-TIGIT 항체 Vh (a) 및 Vk (b) 영역의 계통수. 후보 항-TIGIT 항체의 Vh 및 Vk 서열은 DNASTAR의 Megalign 소프트웨어를 사용하여 정렬되었다. 서열 상동성은 계통수에서 표시되었다.
도 3 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 정제된 뮤린 항-TIGIT 항체의 친화성 결정.
도 4 a-b 유세포분석에 의한 TIGIT 결합의 결정.
도 5 a-b (a) 항-TIGIT mAb에 의한 TIGIT-리간드 상호작용의 저해를 보여주는 개략도. (b) TIGIT 리간드-발현 HEK293 세포(HEK293/PVR 또는 HEK293/PVR-L2)에 대한 가용성 TIGIT(TIGIT-huIgG1 융합 단백질)의 결합을 유세포분석에 의해 결정했다. TIGIT-리간드 상호작용의 차단은 연속적으로 희석된 항-TIGIT 항체를 첨가하여 정량적으로 측정했다. 결과는 반복물의 평균 ± SD로 표시했다.
도 6 a-b 항-TIGIT mAb에 의한 CMV-특이적 인간 T 세포의 활성화. 인간 CMV 펩타이드(NLVPMVATV, 495-503)-감작된 HLA-A2.1+ PBMC(4x104)를 항-TIGIT 항체의 존재 하에 CMV 펩타이드-펄스화된 표적 세포 HCT116 세포(104)로 밤새 자극했다. 배양 상청액의 IFN-γ를 ELISA로 결정했다. 모든 조건은 3반복으로 수행했다. 결과는 평균 ± SD로 표시했다.
도 7 a-b 항-TIGIT mAb는 NK 세포-매개 세포독성을 촉진한다. (A) 조작된 NK92MI/TIGIT-DNAM-1 안정한 세포주에서의 TIGIT 및 DNAM-1 발현. (B) hu1217-2-2/IgG1mf(0.007-30 μg/ml)의 존재 하에 SK-MES-1/PVR 세포에 대한 NK92MI/TIGIT-DNAM-1 세포의 사멸은 실시예 8에 기술된 바와 같은 젖산염 탈수소효소(LDH) 방출 검정에 의해 결정되었다. 결과는 3반복물의 평균±SD로 나타냈다.
도 8 항-TIGIT mAb hu1217-2-2/IgG1wt는 FcγR-매개 트로고사이토시스(trogocytosis)를 통해 TIGIT 수용체의 표면 발현을 감소시킨다. Jurkat/TIGIT 세포는 완전 배지에서 비오틴-표지된 항-TIGIT mAb의 존재 하에 FcγR-발현 HEK293 세포와 함께 밤새 인큐베이션했다. 일부 경우에는 트로고사이토시스에 대한 벌크 인간 IgG의 효과를 결정하기 위해 10% 인간 AB 혈청을 첨가했다. TIGIT 수용체의 표면 발현은 SA-APC(Biolegend)로 염색하여 결정했다. MFI는 유세포분석에 의해 결정되었다. 모든 데이터 점은 2반복으로 이루어졌다. 결과는 평균±SD로 나타냈다.
도 9a는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 항-TIGIT mAb의 ADCC 효과를 보여준다. 건강한 공여자로부터의 PHA-자극된 PBMC에서 TIGIT 발현은 유세포분석에 의해 결정되었다. CD4+(CD4+Foxp3-), CD8+ T 이펙터 및 조절 T 세포(Treg, CD4+ Foxp3+)는 모두 유의미한 수준의 TIGIT(18~41%)를 발현했다. 표시된 데이터는 3명의 건강한 공여자로부터의 대표적인 결과이다.
도 9b는 TIGIT mAb(30 μg/mL) 또는 대조군 항체(양성 대조군으로서 5 μg/ml의 OKT3, 및 음성 대조군으로서 30 μg/ml의 huIgG)의 존재 하에 표적 세포로서 PHA-자극된 PMBC 및 이펙터 세포로서 CD16+ 인간 NK 세포주 NK92MI/CD16V를 사용하여 42시간 동안 수행한 ADCC 검정이다. CD3+, CD8+ T 세포 및 Treg의 백분율은 유세포분석으로 결정했다.
도 10은 인간 PBMC에 대한 항-TIGIT mAb의 CDC 효과를 입증한다. CDC 검정은 표적 세포로서 PHA-자극된 PBMC 및 보체 공급원으로서 자가 혈청을 사용하여 수행했다. 15% 자가 혈청의 최종 농도에서 항-TIGIT mAb(0.01-100 μg/ml)와 사전 활성화된 PBMC의 공동 배양 3일 후, CDC의 백분율(y축)을 세포 역가 글로우 검정으로 측정하고, 실시예 11에 기술된 바와 같이 계산했다. 공여자 A 및 B로부터의 데이터를 나타냈다. HuIgG는 음성 대조군으로 사용한 반면, 항-MHC-A, B, C는 양성 대조군으로 사용했다.
도 11은 50mg 내지 900mg의 정맥내 주입 후 hu1217-2-2의 혈청 농도 감소를 도시한다.
도 12는 단일 작용제로서 또는 BGB-A317과 조합된 hu1217-2-2가 시험관내에서 IFN-γ 분비를 촉진한다는 것을 보여준다.
도 13은 hu1217-2-2가 마우스 신경교종 모델에서 단일 작용제로서 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
도 14는 MC 결장암의 TIGIT 녹인(knock in) 마우스 모델에서 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2의 효능을 보여준다.
정의
아미노산의 보존적 아미노산 치환은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있고 이하 표에 예시적으로 제시된다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다.
이 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본원에 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"와 같은 단어의 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 상응하는 복수 지시대상을 포함한다.
용어 "또는"은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 "및/또는"이라는 용어를 의미하는 것으로 사용되며 상호교환적으로 사용된다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 후속 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 및 변형어, 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 명시된 아미노산 서열, DNA 서열, 단계 또는 이들의 그룹의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 아미노산 서열, DNA 서열, 단계를 배제하는 것은 아님을 이해할 것이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는", "포함하는(including)" 또는 때로 "갖는"으로 치환될 수 있다.
용어 "TIGIT"는 다양한 포유동물 이소형, 예를 들어 인간 TIGIT, 인간 TIGIT의 오르토로그(ortholog), 및 TIGIT 내에 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 유사체를 포함한다. TIGIT의 아미노산 서열, 예를 들어 인간 TIGIT, 및 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다(Genbank AAI01289 참조).
본원에서 사용되는 용어 "투여", "투여하는", "치료하는" 및 "치료"는 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물의 접촉을 의미한다. 세포의 치료는 세포에 대한 시약의 접촉 뿐만 아니라 유체가 세포와 접촉하고 있는 경우, 유체에 대한 시약의 접촉을 포함한다. 용어 "투여" 또는 "치료"는 또한 시약, 진단, 결합 화합물에 의한, 또는 다른 세포에 의한, 예를 들어 세포의 시험관내 및 생체외 치료를 포함한다. 본원에서 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼), 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로 항체(전체 길이의 단클론 항체 포함) 및 항원, 예를 들어 TIGIT를 인식하는 한 항체 단편을 커버한다. 항체는 일반적으로 단일특이성이지만, 특정항원특이성(idiospecific), 이종특이성 또는 다중특이성으로도 기술될 수 있다. 항체 분자는 항원 상의 에피토프 또는 특정 항원 결정기에 대해 특정 결합 부위를 통해 결합한다.
본원에서 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 동종인 항체의 집단을 의미하며, 즉 집단에 포함된 항체 분자는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외한 아미노산 서열이 동일하다. 대조적으로, 통상적인 (다클론) 항체 제제는 전형적으로 이들의 가변 도메인, 특히 이들의 상보성 결정 영역(CDR)에 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함하며, 이는 종종 상이한 에피토프에 특이적이다. 수식어 "단클론"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 단클론 항체(mAb)는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 문헌[Kohler G 등, Nature 1975 256:495-497; 미국 특허 제4,376,110호; Ausubel FM 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow E 등, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988; 및 Colligan JE 등, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993] 참조. 본원에 개시된 mAb는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 이들의 임의의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 높은 역가의 mAb는 개별 하이브리도마로부터의 세포를 원초적-프라이밍된 Balb/c 마우스와 같은 마우스에 복강내 주사하여 고농도의 원하는 mAb를 함유하는 복수액을 생산하는 생체내 생산에 의해 수득될 수 있다. 이소형(isotype) IgM 또는 IgG의 mAb는 이러한 복수액 또는 배양 상청액으로부터 관련 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍을 포함하며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50-70kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카복시-말단 부분은 이펙터 기능에 주로 책임이 있는 불변 영역을 한정할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 전형적으로 α, δ, ε, γ 또는 μ로서 분류되며, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로서 항체의 이소형을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
각 경쇄/중쇄(VL/VH) 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용기성 또는 이중특이성 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인은 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR) 사이에 위치한 "상보성 결정 영역(CDR)"이라고도 하는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특정 에피토프에 결합할 수 있게 한다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 둘 모두가 FR-1(또는 FR1), CDR-1(또는 CDR1), FR-2(FR2), CDR-2(CDR2), FR-3(또는 FR3), CDR-3(CDR3) 및 FR-4(또는 FR4)를 순차적으로 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배정은 일반적으로 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, 등, National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242(1991); Kabat(1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, 등, (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia 등, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia 등, (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.
용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "CDR"(즉, 경쇄 가변 도메인의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 및 중쇄 가변 도메인의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3)의 아미노산 잔기를 포함한다. Kabat 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함); 또한 Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917(구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조한다. 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 전체 길이의 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 의미한다. 항원 결합 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자, 예를 들어, 단쇄 Fv(ScFv); 항체 단편으로부터 형성된 나노바디 및 다중특이성 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특이성을 갖고 특정 표적 단백질에 결합하는 항체는 또한 특정 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 것으로서 기술된다. 이것은 항체가 다른 단백질과 비교하여 해당 표적에 대한 우선적인 결합을 나타내지만 이 특이성이 절대적인 결합 특이성을 필요로 하지는 않는다는 것을 의미한다. 항체는 이의 결합이 거짓 양성과 같은 원치 않는 결과를 생산함이 없이 샘플 내 표적 단백질의 존재에 결정적인 것이라면, 그의 의도된 표적에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명에 유용한 항체 또는 이의 결합 단편은 비-표적 단백질과의 친화성보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게는 적어도 10배 더 큰, 보다 바람직하게는 적어도 20배 더 큰, 가장 바람직하게는 적어도 100배 더 큰 친화성으로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본원에서 항체는 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에는 결합하지만 해당 서열이 결여된 단백질에는 결합하지 않는다면, 주어진 아미노산 서열, 예를 들어 성숙한 인간 TIGIT 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다고 한다.
"pH-의존적 결합", "pH-의존적 표적 결합" 및 "pH-의존적 항원 결합"이라는 표현은 본 개시내용에서 상호교환가능하며, 이는 본 출원의 항체가 이의 표적/항원, 즉 인간 TIGIT에 pH 의존적 방식으로 결합한다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 본 출원의 항체는 pH 7.4와 같은 생리적 pH에서의 결합 친화성 및/또는 결합 신호와 비교하여, 종양 미세환경에서 일반적으로 발견되는 pH 6.0과 같은 약산성 pH에서 그의 항원에 대해 더 높은 결합 친화성 및/또는 결합 신호를 보여준다. 본 출원의 항체의 결합 친화성 및/또는 결합 신호의 강도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며 표면 플라스몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 출원의 항체는 표면 플라스몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술에 의해 측정했을 때, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 그 이상인 pH 7.4/pH 6.0에서의 KD 비율을 갖는다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 출원의 항체는 표면 플라스몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술에 의해 측정했을 때, pH 7.4에서의 Rmax보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 더 높은 pH 6.0에서의 Rmax(RU) 값을 갖는다. 항체의 결합 친화성은 25℃ 또는 37℃에서 측정될 수 있다. 종양 미세환경은 생리학적 조건이나 정상 조직보다 비교적 더 산성인 pH를 보이는 것으로 발견되었다(Zhang 등 Focus on molecular Imaging 2010; Tannock and Rotin 등 Cancer Res 1989). 따라서, 상기 언급된 pH 의존적 결합을 갖는 본 출원의 항체는 종양 미세환경의 TIGIT 양성 림프구를 선택적으로 표적화하고 림프구의 말초 활성화와 연관된 독성이 더 낮은 항-TIGIT 치료제로서 유리하다.
본원에서 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포에서 유래된 하이브리도마에서 생산된다면, 뮤린 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각 마우스 또는 래트 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다.
용어 "인간화 항체"는 인간 항체뿐만 아니라 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 의미한다. 이러한 항체는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 해당 영역을 포함할 것이다. 접두사 "hum", "hu", "Hu" 또는 "h"는 부모 설치류 항체와 인간화 항체를 구별하기 위해 필요한 경우 항체 클론 명칭에 첨가된다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 부모 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이지만, 인간화 항체의 친화성을 증가시키거나 안정성을 증가시키기 위해 또는 다른 이유로 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
본 출원의 항체는 암 치료에 잠재적인 치료 용도를 갖는다. 본원에서 용어 "암" 또는 "종양"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 기술한다. 암의 예로는 폐암(소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암 포함), 부신암, 간암, 위암, 자궁경부암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 백혈병, 방광암, 골암, 뇌암, 자궁내막암, 두경부암, 림프종, 난소암, 피부암, 갑상선 종양 또는 암의 전이성 병변을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 출원의 항체는 바이러스 감염 및 면역 관용 또는 "소진"에 기계적으로 연루된 다른 인간 질환을 제어하는 데 잠재적인 치료 용도를 갖는다. 본 출원의 정황에서, 용어 "소진"은 암 또는 만성 바이러스 감염 동안 반응하는 면역 세포의 고갈된 능력을 야기하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 질환 또는 장애, 또는 질환 또는 장애의 임상적 증상 중 적어도 하나를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 때, 질환, 장애 또는 증상에 대한 그러한 치료에 영향을 미치기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 항체, 질환, 장애 및/또는 질환 또는 장애의 증상, 질환, 장애 및/또는 질환 또는 장애의 증상의 중증도, 치료할 대상체의 연령, 및/또는 치료할 대상체의 체중에 따라 달라질 수 있다. 임의의 주어진 경우에 적절한 양은 관련 기술분야의 기술자에게 명백할 수 있거나 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 조합 요법의 경우, "치료 유효량"은 질환, 장애 또는 병태의 효과적인 치료를 위해 조합에 포함된 활성 작용제의 총량을 지칭한다.
본원에 사용된 "대상체"는 포유동물, 예를 들어 설치류 또는 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본원에 기술된 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자)이다.
항-TIGIT 항체
본 개시내용은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체, 항원-결합 단편을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 바람직한 약동학적 특징 및 다른 바람직한 속성을 갖고, 따라서 암의 가능성을 감소시키거나 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 항체를 제공한다. 본 개시내용은 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 암 및 연관 장애의 예방 및 치료를 위해 이러한 약제학적 조성물을 제조 및 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 기재된 바와 같이 생성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)은 서열번호 9, 14 또는 19의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 본 개시내용은 또한 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에 제공된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체는 본 개시내용에서 제공된 임의의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 VH CDR을 포함한다(또는 대안적으로, 이것으로 이루어진다).
본 개시내용은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 11, 16 또는 21의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 본 개시내용은 또한 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에 나열된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 개시내용은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 본 개시내용의 임의의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 VL CDR을 포함한다(또는 대안적으로 이것으로 이루어진다).
본 개시내용의 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 돌연변이되었지만 CDR 영역에서 본원에 기술된 서열에 도시된 CDR 영역과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 이는 제공된 서열에 개시된 CDR 영역과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 CDR 영역에서 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 인코딩하는 핵산이 돌연변이되었고; 하지만 표 5에 기술된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성 퍼센트를 갖는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하면서, 본원에 기술된 서열에 도시된 가변 영역과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 가변 영역에서 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
항-PD1 항체
본 개시내용은 예를 들어 미국 특허 제8,735,553호에서 발견되는 항-PD1 항체를 제공한다. PD1 항체는 본원에도 제공되며, 예를 들어, 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH): 서열번호 25에 제시된 HCDR1, 서열번호 26에 제시된 HCDR2, 및 서열번호 27에 제시된 HCDR3; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL): 서열번호 28에 제시된 LCDR1, 서열번호 29에 제시된 LCDR2, 및 서열번호 30에 제시된 LCDR3을 포함한다. 이 항체는 본원에서 "BGB-A317"로 지명된다.
다른 실시양태에서, 항-PD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 PD1에 특이적으로 결합하고 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD1 항체는 서열번호 35를 포함하는 IgG4 불변 도메인을 포함한다.
Fc 영역의 프레임워크의 추가 변경
또 다른 측면에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화성을 갖지만 부모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화성이 변경되는 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 둘 다 Winter 등에 의한 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 기술되어 있다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소 또는 폐지된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 Idusogie 등에 의한 미국 특허 제6,194,551호에 기술되어 있다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이 접근법은 예를 들어 Bodmer 등에 의한 PCT 공개 WO 94/29351에 기술되어 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 아미노산은 IgG1 서브클래스 및 카파 이소형에 대해 하나 이상의 알로타입(allotype) 아미노산 잔기로 대체된다. 알로타입 아미노산 잔기는 또한 문헌[Jefferis 등, MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기술된 바와 같은 카파 이소형의 경쇄 불변 영역 뿐만 아니라 IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스의 중쇄 불변 영역을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, Fc 영역은 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변형된다. 이 접근법은 예를 들어 Presta에 의한 PCT 공보 WO 00/42072에 기술되어 있다. 더욱이, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1의 결합 부위는 매핑되어 있고 개선된 결합을 갖는 변이체가 기술되어 있다(Shields 등, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001 참조).
또 다른 측면에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 만들어질 수 있다(즉, 글리코실화가 결여되거나 감소된 항체). 글리코실화는, 예를 들어, "항원"에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내에 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서의 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 Co 등에 의한 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 기술되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화된 항체 또는 증가된 양분성(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기술되어 있으며 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP 제1,176,195호는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기술하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. Presta에 의한 PCT 공보 WO 03/035835는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주인 Lecl3 세포를 기술하며, 이 또한 해당 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 초래한다(또한 Shields 등, (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). Umana 등에 의한 PCT 공보 WO 99/54342는 조작된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내도록 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))을 발현하도록 조작된 세포주를 기술한다(또한 Umana 등, Nat. Biotech. 17:176-180, 1999 참조).
또 다른 측면에서, ADCC의 감소가 요구되는 경우, 인간 항체 서브클래스 IgG4는 많은 이전 보고서에서 적당한 ADCC만을 갖고 CDC 이펙터 기능을 거의 갖지 않는 것으로 밝혀졌다(Moore GL, 등 2010 MAbs, 2:181-189). 한편, 천연 IgG4는 산성 완충액 또는 온도 상승과 같은 스트레스 조건에서 덜 안정한 것으로 발견되었다(Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Dall'Acqua, W. 등, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273; Aalberse 등 2002 Immunol, 105:9-19). ADCC 감소는 FcγR 결합 또는 C1q 결합 활성을 감소시키거나 무효화하는 변경의 조합으로 조작된 IgG4에 항체를 작동 가능하게 연결시켜 ADCC 및 CDC 이펙터 기능을 감소 또는 제거함으로써 달성될 수 있다. 생물학적 약물로서 항체의 물리화학적 특성을 고려할 때, IgG4의 덜 바람직한 내재적 특성 중 하나는 2개의 중쇄가 용액에서 동적 분리하여 절반항체를 형성하는 것으로, 이는 "Fab 아암(arm) 교환"이라는 과정을 통해 생체 내에서 생성된 이중특이성 항체를 야기한다(Van der Neut Kolfschoten M, 등 2007 Science, 317:1554-157). 위치 228(EU 넘버링 시스템)에서 세린에서 프롤린으로의 돌연변이는 IgG4 중쇄 분리에 저해성인 것으로 나타났다(Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Aalberse 등 2002 Immunol, 105:9-19). 힌지 및 γFc 영역에서 아미노산 잔기의 일부는 Fcγ 수용체와의 항체 상호작용에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Chappel S M, 등 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040; Mukherjee, J 등, 1995 FASEB J, 9:115-119, Armour, K. L. 등, 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624; Clynes, R. A. 등, 2000 Nature Medicine, 6:443-446; Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol, 25:21-50). 또한, 인간 집단에서 드물게 발생하는 일부 IgG4 이소형은 또한 상이한 물리화학적 특성을 유도할 수 있다(Brusco, A. 등 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55; Aalberse 등 2002 Immunol, 105:9-19). ADCC, CDC 및 불안정성이 낮은 TIGIT 항체를 생성하기 위해 인간 IgG4의 힌지 및 Fc 영역을 변형시키고 많은 변경을 도입시키는 것이 가능하다. 이들 변형된 IgG4 Fc 분자는 서열번호 83-88에서 개시된 것을 찾아볼 수 있다, 미국 특허 제8,735,553.
항체 생산
항-TIGIT 항체 및 이의 항원-결합 단편은 항체 사량체의 재조합 발현, 화학적 합성 및 효소 분해를 포함하나 이에 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있는 반면, 전체 길이의 단클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 또는 재조합 생산에 의해 수득될 수 있다. 재조합 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기술된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 분절을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 일부 측면에서, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9, 14 또는 19의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 측면에서, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11, 16 또는 21의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 항-TIGIT 항체의 가변 영역 서열을 인코딩할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 영역과 불변 영역을 모두 인코딩할 수 있다. 일부 폴리뉴클레오타이드 서열은 예시된 항-TIGIT 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 다른 폴리뉴클레오타이드는 뮤린 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 각각 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩타이드 분절을 인코딩한다.
또한 본 개시내용에는 항-TIGIT 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. 발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되어야 하는 의도된 숙주 세포에 따라 달라진다. 전형적으로, 발현 벡터는 항-TIGIT 항체 사슬 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 기타 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 측면에서, 유도성 프로모터는 유도 조건의 제어하에서를 제외하고는 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은 발현 산물이 숙주 세포에 의해 더 잘 용인되는 코딩 서열에 대해 집단을 편향시킴이 없이 비유도 조건 하에서 확장될 수 있다. 프로모터 외에도, 항-TIGIT 항체 또는 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 필요하거나 바람직할 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용 중인 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함함으로써 향상될 수 있다(예를 들어, Scharf 등, Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner 등, Meth.Enzymol., 153:516, 1987). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
항-TIGIT 항체 사슬을 보유하고 발현시키기 위한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. E. 콜라이는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주로는 바실러스 서브틸리스와 같은 바실러스, 살모넬라, 세라티아 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 다른 장내세균과를 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 숙주 세포와 호환되는 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 전형적으로 함유하는 발현 벡터를 만들 수도 있다. 또한, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은 임의의 수의 다양한 공지된 프로모터가 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열을 이용하여 발현을 제어하고, 전사 및 해독을 개시 및 완료하기 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 효모와 같은 다른 미생물도 항-TIGIT 폴리펩타이드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 함께 곤충 세포가 사용될 수도 있다.
다른 측면에서, 포유동물 숙주 세포는 본 개시내용의 항-TIGIT 폴리펩타이드를 발현하고 생산하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 필사의 또는 정상 또는 비정상적인 불멸의 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HEK 293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하는, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩타이드를 발현하기 위한 포유동물 조직 세포 배양물의 사용은 예를 들어, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y., 1987에서 일반적으로 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터로는 발현 제어 서열, 예컨대, 복제 기점, 프로모터 및 인핸서(예를 들어, Queen 등, Immunol. Rev. 89:49-68, 1986 참조), 및 필수적인 프로세싱 정보 부위, 예컨대, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 터미네이터 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 일반적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능할 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대, 인간 즉시-초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
검출 및 진단 방법
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 TIGIT의 검출 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 적용예에 유용하다. 한 측면에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 생물학적 샘플에서 TIGIT의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에서 사용되는 "검출하는"이라는 용어는 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 측면에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 다른 측면에서, 이러한 조직은 다른 조직에 비해 더 높은 수준으로 TIGIT를 발현하는 정상 및/또는 암 조직을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플에서 TIGIT의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 방법은 항원에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 항-TIGIT 항체와 접촉시키는 단계 및 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 제한 없이 소변 또는 혈액 샘플을 포함할 수 있다.
또한 TIGIT의 발현과 연관된 장애를 진단하는 방법이 포함된다. 특정 측면에서, 방법은 테스트 세포를 항-TIGIT 항체와 접촉시키는 단계; TIGIT 폴리펩타이드에 대한 항-TIGIT 항체의 결합을 검출함으로써 테스트 세포에서 TIGIT의 발현 수준 (정량적으로 또는 정성적으로)을 결정하는 단계; 및 테스트 세포에서의 발현 수준을 대조군 세포(예를 들어, 테스트 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 비-TIGIT 발현 세포)에서의 TIGIT 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 대조군 세포와 비교하여 테스트 세포에서 더 높은 수준의 TIGIT 발현은 TIGIT의 발현과 연관된 장애의 존재를 나타낸다.
치료 방법
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 TIGIT-연관 장애 또는 질환의 치료 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 적용예에 유용하다. 한 측면에서, TIGIT-연관 장애 또는 질환은 암이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 방법은 유효량의 항-TIGIT 항체 또는 항원-결합 단편을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 암은 제한 없이 유방암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하고, 필요하다면 국소 치료, 병변내 투여를 위한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사에 의해, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있고, 이는 부분적으로 투여가 단기인지 장기적인지에 따라 달라진다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 정황에서 고려해야 할 인자로는 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만 문제의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 선택적으로 제형화된다. 그러한 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 위에서 논의된 기타 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg의 항체가, 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여이거나 또는 연속 주입이든지 간에, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 위에서 언급한 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 병태에 따라 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 항체의 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량을 받도록) 투여될 수 있다. 초기에 더 높은 로딩 용량과, 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
조합 요법
한 측면에서, 본 개시내용의 TIGIT 항체는 다른 치료제, 예를 들어 항-PD1 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 본 개시내용의 TIGIT 항체와 함께 사용될 수 있는 다른 치료제로는 화학요법제(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 제제; (예를 들어 Abraxane®), 도세탁셀; 카보플라틴; 토포테칸; 시스플라틴; 이리노테칸, 독소루비신, 레날리도마이드, 5-아자시티딘, 이포스파마이드, 옥살리플라틴, 페메트렉세드 이나트륨, 사이클로포스파마이드, 에토포사이드, 데시타빈, 플루다라빈, 빈크리스틴, 벤다무스틴, 클로람부실, 부술판, 젬시타빈, 멜팔란, 펜토스타틴, 미톡산트론, 페메트렉세드 이나트륨), 티로신 키나제 저해제(예를 들어, EGFR 저해제(예를 들어, 에를로티닙), 멀티키나제 저해제(예를 들어, MGCD265, RGB-286638), CD-20 표적화제(예를 들어, 리툭시맙, 오파투무맙, RO5072759, LFB-R603), CD52 표적화제(예를 들어, 알렘투주맙), 프레드니솔론, 다베포에틴 알파, 레날리도마이드, Bcl-2 저해제(예를 들어, 오블리메르센 나트륨), 오로라 키나제 저해제(예를 들어, MLN8237, TAK-901), 프로테아좀 저해제(예를 들어, 보르테조밉), CD-19 표적화제(예를 들어, MEDI-551, MOR208), MEK 저해제(예를 들어, ABT-348), JAK-2 저해제(예를 들어, INCB018424), mTOR 저해제(예를 들어, 템시롤리무스, 에베롤리무스), BCR/ABL 저해제(예를 들어, 이마티닙), ET-A 수용체 길항제(예를 들어, ZD4054), TRAIL 수용체 2(TR-2) 작동제(예를 들어, CS-1008), HGF/SF 저해제(예를 들어, AMG 102), EGEN-001, Polo-유사 키나제 1 저해제(예를 들어, BI 672)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다..
본 개시내용의 TIGIT 항체는 다른 치료제, 예를 들어 항-PD1 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 항-PD1 항체는 제한 없이 미국 특허 제8,735,553호에 개시된 항체를 포함할 수 있다. Merck에 의해 개시된 펨브롤리주맙(이전 MK-3475)은 분자량이 약 149 kDa인 인간화 IgG4-K 면역글로불린으로서, PD1 수용체를 표적으로 하고 PD1 수용체 리간드인 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 저해한다. 펨브롤리주맙은 전이성 흑색종 및 전이성 비-소세포폐암(NSCLC)의 적응증에 대해 승인되었으며 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 및 불응성 호지킨 림프종(cHL)의 치료용으로 임상 조사 중에 있다. 니볼루맙(Bristol-Meyers Squibb에 의해 개시된 것)은 완전 인간 IgG4-K 단클론 항체이다. 니볼루맙(클론 5C4)은 미국 특허 제 US 8,008,449호 및 WO 2006/121 168에 개시되어 있다. 니볼루맙은 흑색종, 폐암, 신장암 및 호지킨 림프종의 치료용으로 승인되어 있다.
약제학적 조성물 및 제형
또한, 항-TIGIT 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 항-TIGIT 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 약제학적 제형을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 TIGIT에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 TIGIT에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 조성물은 관련 기술분야에 잘 알려진 완충액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제와 같은 적절한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 TIGIT 항체 또는 항원 결합 단편의 약제학적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 이에 제한되는 것은 아니지만 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 본원에 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 제US 7,871,607호 및 제2006/0104968호에 기술되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기술된 것을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
약제학적 조성물 및 키트
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화된 본원에 기술된 항-TIGIT 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 부형제"라는 용어는 생리학적으로 화합성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 부형제는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 직장, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합할 수 있다.
본원의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대, 액체 용액(예를 들어, 주사 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜 및 좌약을 포함한다. 적합한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 적용예에 따라 달라진다. 전형적인 적합한 조성물은 주사용 또는 주입 용액의 형태이다. 하나의 적합한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
실시예
실시예 1: 항-TIGIT 단클론 항체의 생성
항-TIGIT 단클론 항체(mAb)는 종래의 하이브리도마 융합 기술(de St Groth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1)을 기반으로 하여 미량의 변형을 가하여 생성되었다. 효소 면역흡착 검정(Eenzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 및 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 검정에서 높은 결합 활성을 갖는 mAb를 추가 특성화를 위해 선택했다.
면역화 및 결합 검정을 위한 TIGIT 재조합 단백질
전체 길이의 인간 TIGIT(서열번호1)를 코딩하는 cDNA는 GenBank 서열(수탁 번호: NM_173799)에 기초하여 Sino Biological(중국 베이징)에 의해 합성되고 구입되었다. 서열번호 1의 아미노산(AA) 1-141에 상응하는 전체 길이의 인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)의 코딩 영역을 PCR 증폭하고, C-말단이 마우스 IgG2a의 Fc 도메인 또는 인간 IgG1 중쇄의 Fc 도메인에 융합되어 있는 pcDNA3.1 기반 발현 벡터(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 클로닝하여, 각각 TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1인 2개의 재조합 융합 단백질 발현 플라스미드를 초래했다. TIGIT 융합 단백질의 개략도는 도 1에 제시했다. 재조합 융합 단백질 생산을 위해 TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1 플라스미드를 293G 세포(사내 개발)에 일시적으로 형질감염시키고 회전 진탕기가 장착된 CO2 인큐베이터에서 7일 동안 배양했다. 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 수집하고 원심분리에 의해 청징화했다. TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1은 Protein A 컬럼(Cat.: 17127901, GE Life Sciences)을 사용하여 정제했다. TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1 단백질 둘 모두는 인산염 완충 식염수(DPBS)에 대해 투석하고 소량씩 -80℃ 냉동고에 보관했다.
안정한 발현 세포주
전체 길이의 인간 TIGIT(huTIGIT) 또는 원숭이 TIGIT(mkTIGIT, 수탁 번호: XM_005548101.2)를 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해, TIGIT 유전자(중국 난징에 소재하는 Genescript에 의해 합성됨)를 레트로바이러스 벡터 pFB-Neo(Cat.: 217561, Agilent, 미국)에 클로닝했다. 이중-지향성(dual-tropic) 레트로바이러스 벡터는 이전 프로토콜(Zhang T, 등 2005, Blood)에 따라 생성했다. huTIGIT 및 mkTIGIT를 함유하는 벡터를 Jurkat 및 NK92MI 세포(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스)에 각각 형질도입시켜 세포주 Jurkat/huTIGIT 및 NK92MI/mkTIGIT를 생성했다. G418과 함께 배지에서 배양 및 FACS 결합 검정에 의해 고발현 세포주를 선택했다.
면역화, 하이브리도마 융합 및 클로닝
8 내지 12주령의 Balb/c 마우스(중국 베이징 소재의 HFK BIOSCIENCE CO., LTD로부터)를 10μg의 TIGIT-mIgG2a 및 수용성 보조제(Cat.: KX0210041, KangBiQuan, 중국 베이징)를 함유하는 항원 혼합물 100μl로 복강내(i.p.) 면역화했다. 이 절차는 3주 후 반복했다. 2차 면역화 2주 후, 마우스 혈청은 ELISA 및 FACS에 의해 TIGIT 결합에 대해 평가했다. 혈청 스크리닝 10일 후, 가장 높은 항-TIGIT 항체 혈청 역가를 갖는 마우스에게 50μg의 TIGIT-mIgG2a를 복강내 주사하여 추가 항원자극시켰다. 추가 항원자극 3일 후, 비장 세포를 분리하고 표준 기술(Gefter 등, Somat Cell Genet, 1977 3(2):231-6)을 사용하여 뮤린 골수종 세포주, SP2/0 세포(ATCC)에 융합시켰다.
ELISA 및 FACS에 의한 항체의 TIGIT 결합 활성 평가
하이브리도마 클론의 상청액은 먼저 약간의 변형을 준 문헌[Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52]에 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 스크리닝했다. 간략하게, TIGIT-huIgG1 단백질은 96-웰 플레이트에 코팅했다. HRP-연결된 항-마우스 IgG 항체(Cat.: 7076S, Cell Signaling Technology, USA) 및 기질(Cat.: 00-4201-56, eBioscience, 미국)을 사용하여 450nm의 파장에서 색상 흡광 신호를 발달시켰고, 이는 플레이트 판독기(SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, USA)를 사용하여 측정했다. ELISA-양성 클론은 상기 기술된 NK92MI/huTIGIT 또는 NK92mi/mkTIGIT 세포를 사용하여 FACS에 의해 추가로 검증했다. TIGIT-발현 세포(105 세포/웰)를 ELISA-양성 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션한 후, Alexa Fluro-647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체(Cat.: A0473, Beyotime Biotechnology, 중국)와 결합시켰다. 유세포 분석기(Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, 미국)를 사용하여 세포 형광을 정량했다.
ELISA 및 FACS 스크리닝 둘 모두에서 양성 신호를 나타낸 하이브리도마로부터의 조정 배지는 기능 검정으로 처리하여 인간 면역 세포 기반 검정에서 우수한 기능적 활성을 갖는 항체를 식별했다(다음 섹션 참조). 원하는 기능 활성을 갖는 항체를 추가로 서브클로닝하고 특성화했다.
무혈청 또는 저혈청 배지에 대한 하이브리도마의 서브클로닝 및 적응
전술한 ELISA, FACS 및 기능 검정에 의한 1차 스크리닝 후, 양성 하이브리도마 클론을 한계 희석에 의해 서브클로닝했다. 각 플레이트로부터의 ELISA 및 FACS 스크리닝에 기초한 3개의 양성 서브클론을 선택하고 기능 검정에 의해 특성화했다. 기능 검정을 통해 검증된 상위 항체 서브클론은 3% FBS가 포함된 CDM4MAb 배지(Cat.: SH30801.02, Hyclone, 미국)에서 성장을 위해 적응시켰다.
단클론 항체의 발현 및 정제
항체 발현 플라스미드(Cat. No. R79007, Invitrogen)로 일시적으로 형질감염된 하이브리도마 세포 또는 293G 세포를 CDM4MAb 배지(Cat.: SH30801.02, Hyclone) 또는 FreestyleTM 293 발현 배지(Cat.: 12338018, Invitrogen)에서 배양하고, 37℃에서 5 내지 7일 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션했다. 조정 배지는 원심분리를 통해 수집하고 정제 전에 0.22 μm 막을 통과시켜 여과했다. 뮤린 또는 재조합 항체를 함유하는 상청액을 단백질 A 컬럼(Cat.: 17127901, GE Life Sciences)에 제조자의 지침에 따라 적용하고 결합시켰다. 절차는 일반적으로 90% 이상의 순도로 항체를 산출했다. 단백질 A-친화성 정제된 항체는 PBS에 대해 투석하거나 HiLoad 16/60 Superdex200 컬럼(Cat.: 17531801, GE Life Sciences)을 사용하여 추가로 정제하여 응집체를 제거했다. 단백질 농도는 280nm에서 흡광도를 측정하여 결정했다. 최종 항체 제조물은 -80℃ 냉동고에 분취량으로 보관했다.
실시예 2: TIGIT 항체의 클로닝 및 서열 분석
Ultrapure RNA 키트(Cat.: 74104, QIAGEN, 독일)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 기초하여 전체 세포 RNA를 제조하기 위해 뮤린 하이브리도마 클론을 수확했다. Invitrogen(Cat.: 18080-051)의 cDNA 합성 키트를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고, PCR 키트(Cat.: CW0686, CWBio, 중국 베이징)를 사용하여 뮤린 mAb의 중쇄 가변 영역(Vh) 및 카파 사슬 가변 영역(Vk)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 PCR 증폭을 수행했다. Vh 및 Vk의 항체 cDNA 클로닝에 사용된 올리고 프라이머는 이전에 보고된 서열(Brocks 등 2001 Mol Med 7:461)에 기초하여 Invitrogen(중국 베이징)에 의해 합성되었다. 그런 다음 PCR 산물을 pEASY-Blunt 클로닝 벡터(Cat.:C B101-02, TransGen, 중국)에 서브클로닝하고 Genewiz(중국 베이징)가 시퀀싱했다. Vh 및 Vk 영역의 아미노산 서열은 DNA 시퀀싱 결과로부터 추론했다.
뮤린 mAb를 서열 상동성을 비교함으로써 분석하고 서열 유사성에 기초하여 그룹화했다(도 2a-b). 상보적 결정 영역(CDR)은 Kabat(Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250) 및 IMGT(Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27:209-212) 시스템을 기반으로 서열 주석 및 IMGT 웹사이트에서 인터넷-기반의 서열 분석에 의해 정의되었다. 대표적인 상위 클론 mu1217(Vh 및 Vk)의 아미노산 서열은 표 1(서열번호 9 및 11)에 나열되어 있다. mu1217의 CDR 서열은 표 2(서열번호 3-8)에 나열했다.
실시예 3: SPR에 의한 정제된 뮤린 항-TIGIT 항체의 친화성 결정
ELISA 및 FACS에서 높은 결합 활성뿐만 아니라 세포 기반 검정에서 강력한 기능적 활성(실시예 1 및 2에 기술됨)을 갖는 TIGIT 항체는 BIAcoreTM T-200(GE Life Sciences)을 사용하여 SPR 검정에 의해 결합 동역학에 대해 특성화했다. 간략히 설명하면, 활성화된 CM5 바이오센서 칩(Cat. No.: BR100530, GE Life Sciences)에 항-인간 IgG 항체를 고정화했다. 인간 Fc-태그화된 TIGIT는 칩 표면 위로 유동시키고 항-인간 IgG 항체에 의해 포획시켰다. 그런 다음 정제된 뮤린 항체의 연속 희석액(0.12 nM 내지 10 nM)을 칩 표면 위로 유동시키고 표면 플라스몬 공명 신호의 변화를 분석하여 결합률(k on) 및 해리율(k off)을 1:1 Langmuir 결합 모델(BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 사용하여 계산했다. 평형 해리 상수(K D)는 k off/k on 비율로 계산했다. mu1217, mu1257, mu1226 및 mu242를 포함하는 상위 mAb의 결합 친화성 프로파일은 도 3 및 표 3에 제시된다.
실시예 4: 뮤린 항-인간 TIGIT mAb mu1217의 인간화
mAb 인간화 및 조작
mu1217의 인간화를 위해, IMGT에서 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스와의 비교를 수행함으로써 mu1217 가변 영역의 cDNA 서열에 대해 고도의 상동성을 공유하는 서열에 대해 인간 생식계열 IgG 유전자를 검색했다. 높은 빈도로 인간 항체 레퍼토리에 존재하고(Glanville 등, PNAS 106:20216-20221 2009), mu1217과 고도로 상동성인 인간 IGVH 및 IGVΚ 유전자를 인간화를 위한 주형으로서 선택했다.
인간화는 CDR-접목(Methods in Molecular Biology, Vol 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press)에 의해 수행되었고 인간화 항체(hu1217)는 사내에서 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간 IgG1mf 형식으로 조작했다. 인간화의 초기 라운드에서 프레임워크 영역에 뮤린으로부터 인간 아미노산 잔기로의 돌연변이는 시뮬레이션된 3D 구조에 의해 유도되었고, CDR의 표준 구조를 유지하는데 구조적 중요성이 있는 뮤린 프레임워크 잔기는 인간화 항체 1217의 첫 번째 버전(hu1217-1-1, 서열번호 3, 13, 5(중쇄 CDR) 및 서열번호 6, 7, 8(경쇄 CDR)의 아미노산 서열을 갖는 6개의 CDR, 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역을 가짐)에 보유되었다. 구체적으로, mu1217 Vκ의 CDR(서열번호 6-8)은 1개의 뮤린 프레임워크 잔기(V58)를 보유하는 인간 생식계열 가변 유전자 IGVκ3-15의 프레임워크에 접목시켜 Hu1217-1-1의 인간화 Vκ 서열을 초래했다(아미노산 서열에 대해 서열번호 16, 뉴클레오타이드 서열에 대해 서열번호 17). H-CDR2의 N-말단(서열번호 4), mu1217 Vh의 H-CDR1 및 H-CDR3(서열번호 3 및 5)을 2개의 뮤린 프레임워크(서열번호 10의 T24 및 I37) 잔기를 보유하는 인간 생식계열 가변 유전자 IGVH3-7의 프레임워크에 접목시켰다. hu1217 인간화 변이체에서, Kabat H-CDR2의 N-말단 절반만을 접목시켰는데, 이는 N-말단 절반만이 시뮬레이션된 3D 구조에 따라 항원 결합에 중요한 것으로 예측되었기 때문이다. 결과적으로 생성된 Hu1217-1-1의 인간화 Vh 서열의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 14 및 서열번호 15에 제시된다.
Hu1217-1-1은 쉽게 적응하는 서브클로닝 부위를 갖는, 각각 IgG1mf(서열번호 18) 및 카파 사슬로 불리는 인간 IgG1 변이체의 불변 영역을 함유하는 자체 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간 전체 길이의 항체 형식으로 작제했다. hu1217-1-1 항체의 발현 및 제조는 293G 세포에 상기 2개의 작제물을 공동-형질감염시키고, 단백질 A 컬럼(Cat.: 17543802, GE Life Sciences)을 사용하여 정제함으로써 달성되었다. 정제된 항체는 PBS에 0.5 내지 5 mg/mL로 농축하고 분취량으로 -80℃ 냉동고에 보관했다.
hu1217-1-1 주형에 기초하여, 본 발명자들은 Vκ의 프레임워크 영역에 보유된 뮤린 잔기를 Vκ에 V58I 및 Vh에 T24A 및 I37V를 포함하는 상응하는 인간 생식계열 잔기로 전환시키는 몇 가지 단일 돌연변이를 만들었다. 생성된 hu1217-2A-1(T24A), hu1217-2B-1(I37V) 및 hu1217-1-2a(V58I)는 모두 hu1217-1-1과 유사한 결합 및 기능적 활성을 가졌다. 모든 인간화 돌연변이는 특정 위치에 돌연변이를 함유하는 프라이머 및 부위 지정 돌연변이유발 키트(Cat. No. FM111-02, TransGen, 중국 베이징)를 사용하여 만들었다. 시퀀싱 분석을 통해 원하는 돌연변이를 검증했다. 이들 hu1217-유래 변이체 항체는 이전에 기술된 바와 같은 결합 및 기능 검정에서 테스트했다.
Hu1217 항체는 인간에서 치료용으로 사용하기 위한 분자 및 생체물리학적 특성을 개선하기 위해 CDR 및 프레임워크 영역에 돌연변이를 도입하여 추가로 조작했다. 고려 사항으로는 기능적 활성을 유지하는 동안의 등전점(pI), 아미노산 조성, 열 안정성(Tm), 및 표면 소수성을 포함한다.
종합하면, 인간화 단클론 항체의 잘 조작된 버전인 hu1217-2-2(서열번호 3, 5-8, 13 및 19-21)는 상기와 같이 기술된 돌연변이 과정으로부터 유도되었고, 세부적으로 특성화되었다. 결과는 hu1217-2-2 및 hu1217-1-1 둘 모두가 결합 친화성 및 TIGIT-매개 하류 신호전달 저해와 같은 기능적 활성이 매우 유사함을 보여주었다.
친화성 결정을 위해, 항-인간 Fc 표면에 의해 항체를 포획했고, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 기초한 친화성 검정에 사용했다. 항-TIGIT 항체의 SPR-결정된 결합 프로파일의 결과는 표 4에 요약했다. Hu1217-2-2 및 hu1217-1-1은 각각 평균 해리 상수가 0.415 nM 및 0.266 nM인 매우 유사한 결합 프로파일을 나타내었고, 이는 ch1217의 것에 가깝다.
상기 제시된 모든 인간화 항체는 또한 건강한 공여자로부터 단리된 1차 인간 면역 세포에 대한 기능 활성에 대해 확인했다(실시예 7에 기술됨).
실시예 5: 천연 TIGIT에 대한 여러 1217 버전의 결합 활성
살아있는 세포에서 천연 TIGIT에 대한 항-TIGIT 항체의 결합 활성을 평가하기 위해, NK92mi 세포를 인간 TIGIT를 과발현하도록 조작했다. 살아있는 NK92mi/TIGIT 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고 항-TIGIT 항체의 연속 희석액과 함께 인큐베이션했다. 염소 항-인간 IgG는 세포 표면에 대한 항체 결합을 검출하기 위한 2차 항체로 사용했다. 인간 천연 TIGIT에 대한 용량 의존적 결합에 대한 EC50 값은 GraphPad Prism을 이용한 4-매개변수 로지스틱 모델에 용량-반응 데이터를 피팅하여 결정했다. 도 4a-b 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 인간화 1217 항체인, hu1217-1-1 및 hu1217-2-2 둘 모두는 살아있는 세포에서 천연 TIGIT에 대해 우수한 결합 친화성을 나타내었다.
실시예 6: 항-TIGIT 항체는 TIGIT와 이의 리간드 PVR 및 PVR-L2의 상호작용을 차단한다
TIGIT는 CD266-PVR 상호작용에 대해 경쟁할 수 있는 높은 친화성(Kd: ~1 nM)으로 PVR에 결합한다(Yu X, 등 2009 Nat. Immunol, 10:48-57).
항-TIGIT 항체가 TIGIT-PVR 및 TIGIT-PVR-L2 상호작용을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 높은 수준의 PVR 또는 PVR-L2를 발현하도록 HEK293 세포를 조작했다. 생성된 세포주를 각각 HEK293/PVR 및 HEK293/PVR-L2로 명명했다. PVR 또는 PVR-L2에 대한 가용성 TIGIT(TIGIT-mIgG2a 융합 단백질)의 결합은 유세포분석에 의해 결정했다(도 5A). TIGIT-리간드 상호작용의 차단은 연속 희석된 항-TIGIT 항체를 첨가함으로써 정량적으로 측정했다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1(야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하고 hu1217-2-2/IgG1mf와 동일한 VH 및 VL 서열을 갖는 인간화 버전) 및 hu1217-2-2/IgG1mf는 각각 0.64 및 0.55 μg/mL의 IC50으로 용량 의존적 방식으로 PVR에 대한 TIGIT 결합을 차단할 수 있었다. 유사하게, TIGIT-PVR-L2 상호작용을 차단하는 데 있어서 hu1217-2-2/IgG1 및 hu1217-2-2/IgG1mf의 IC50은 각각 0.25 및 0.18 μg/mL이다.
실시예 7: 항-TIGIT 항체에 의한 CMV-특이적 인간 T 세포의 활성화
TIGIT 항체의 기능적 활성은 인간 CMV PP65 펩타이드(NLVPMVATV, 495-503, HLA-A2.1-제한)를 인식하는 천연 유래 T-세포를 사용하여 추가로 평가했다(Boeckh 등, 2011 J Clin Invest. 121:1673-80). 간단히 말해서, HLA-A2.1+ 건강한 공여자로부터의 PBMC는 10% FBS를 포함하는 완전한 RPMI에서 PP65 펩타이드(>98% 순도, 상하이에 소재하는 GL Biochem에 의해 합성됨)로 1주일 동안 자극했다. pp65-프라이밍된 PBMC를 이펙터 세포로 사용했다. 검정에 앞서, 표적 세포인 HCT116 세포(HLA-A2.1+, 104)를 pp65 펩타이드(5 μg/mL)로 30분 동안 펄싱하고 96웰 플레이트에서 동일한 수의 pp65-감작된 PBMC와 항-TIGIT 항체의 존재 또는 부재 하에 또는 블랭크 대조군(배지만)과 밤새 공동배양했다. 도 6a-b에 도시된 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1은 두 공여자에 대해 용량 의존적 방식으로 세포 배양 상청액에서 IFN-γ를 분비하도록 pp65-특이적 T 세포를 촉진했다.
실시예 8: 항-TIGIT 항체는 NK 세포-매개 세포독성을 향상시켰다
TIGIT는 자연 살해(NK) 세포에서 비교적 높은 수준으로 구성적으로 발현되는 것으로 알려져 있으며 TIGIT와 이의 리간드 사이의 상호작용은 NK 세포-매개 세포독성을 저해한다(Wang F, 등 2015 Eur. J. Immunology 45: 2886-97; Stanietsky N 등, 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106:17858-63).
인간화 항-TIGIT 항체가 NK-매개 세포독성을 촉진할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, NK 세포주 NK92MI를 이전에 기술된 프로토콜(Zhang 등, 2006 Cancer Res. 66: 5927-5933)에 따라 레트로바이러스 형질도입에 의해 이펙터 세포로서 TIGIT 및 DNAM-1 수용체(NK92MI/TIGIT-DNAM-1) 둘 모두를 공동-발현하도록 조작했다. PVR-발현 폐암 세포주 SK-MES-1/PVR을 표적으로서 유사하게 확립시켰다.
SK-MES-1/PVR 세포에 대한 NK92MI/TIGIT-DNAM-1 세포의 세포독성은 CytoTox 96 비방사성 세포독성 검정 키트(Promega, 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 LDH 방출 검정에 의해 결정했다. 요약하면, NK92MI/TIGIT-DNAM-1 세포(8x105)를 항-TIGIT Ab(0.007-30 μg/mL)의 존재 하에 SK-MES-1/PVR 세포(2x104)와 96-웰 V-바닥 플레이트에서 5시간 동안 공동배양했다. LDH 방출 검정. 특이적 용해는 다음 등식을 사용하여 결정했다: 특이적 용해의 백분율 = [(실험-이펙터 자발적-표적 자발적)/(표적 최대값 - 표적 자발적)] x 100. 결과는 항-TIGIT 항체 hu1217-2-2/ IgG1mf가 용량 의존적 방식으로 NK 세포 사멸을 향상시킨다는 것을 보여주었다(EC50: 0.185 μg/mL)(도 7a-b).
실시예 9: 항-TIGIT 항체는 FcγR-매개 트로고사이토시스를 통해 TIGIT 수용체의 표면 발현을 감소시킬 수 있다.
트로고사이토시스는 세포 표면 분자가 공여자 세포로부터 수용자 세포로 전달되는 현상이다(Joly E, 등 2003 Nat. Immunol; Machlenkin A, 등 2008 Cancer Res.; Beum PV 등 2008 J. Immunol; Rossi EA, 등 2013 Blood). Fc γ 수용체(FcγR)를 통한 항체-유도 트로고사이토시스는 세포 표면에서 수용체의 하향조절을 야기한다(Carlsten 등 2016 Clin Cancer Res; Beum 등 2011 J. Immunology). 따라서, 트로고사이토시스에 의한 표적 수용체의 하향조절은 약화된 신호전달을 유발할 수 있다. 이러한 관찰의 관점에서, hu1217-2-2/IgG1은 FcγR+ 세포의 존재 하에 TIGIT 수용체의 트로고사이토시스를 유도하여 더 낮은 표면 발현을 초래할 수 있다는 것이 가능할 것이다. 이러한 가능성을 다루기 위해, Jurkat/TIGIT 세포를 비오틴 표지된 hu1217-2-2/IgG1wt(hu1217-2-2/IgG1mf와 동일한 VL 및 VH 서열 및 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 인간화 항체) 또는 hu1217-2-2/IgG1mf와 함께 다양한 FcγR(FcγRIIAH131, FcγRIIB, FcγRIIIAV158 포함)을 발현하는 HEK 세포와 함께 밤새 인큐베이션했다. TIGIT 수용체의 표면 발현은 SA-APC(Biolegend)에 의해 결정되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1mf는 아닌 hu1217-2-2/IgG1은 음성 대조군 인간 IgG-처리된 세포와 비교하여 TIGIT 표면 발현의 현저한 감소를 유발했고, 이는 Jurkat/TIGIT 세포 상에서 표면 TIGIT의 감소가 FcγR-결합 의존적임을 나타낸다. 또한, 10% 인간 혈청(높은 수준의 내인성 IgG 함유)의 존재는 TIGIT 수용체의 FcγRIIB 매개 트로고사이토시스는 아닌, FcγRIIAH131- 또는 FcγRIIIAV158-매개의 트로고사이토시스를 부분적으로 감소시킬 수 있었고, 이는 FcγRIIB가 생체내에서 항-TIGIT mAb(예를 들어, hu1217-2-2/IgG1wt)에 의한 TIGIT 표면 발현을 감소시키는 중대한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 관찰은 이전의 발견과도 일치한다(Ganesan LP, 등 2012 J Immunol 189:4981-8; Taylor RP, 등 2015 Blood 125:762-6).
실시예 10: 항-TIGIT 항체의 ADCC 및 CDC 이펙터 기능
인간 1차 PBMC에서 ADCC 및 CDC를 유도하는 항-TIGIT 항체의 능력은 하기에 기술된 바와 같은 시험관내 검정을 사용하여 결정했다.
인간 PBMC를 표적 세포로 사용하는 ADCC
TIGIT 항체가 TIGIT+ T 세포에서 ADCC를 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 유세포분석-기반 ADCC 검정을 설정했다. 검정 이펙터 세포주, NK92MI/CD16V 세포는 CD16 V158 (V158 대립유전자) 및 FcRγ cDNA를 함유하는 발현 플라스미드를 공동 형질도입시켜 NK92MI 세포(ATCC)로부터 생성되었다. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC를 PHA(1μg/ml)로 자극하여 TIGIT 발현을 상향 조절했다. 도 9A에 나타낸 바와 같이, CD4+ 이펙터(CD3+CD4+Foxp3-), CD8+ 및 조절자 T 세포(CD4+Foxp3+)를 포함하는 T 세포는 모두 유의미한 양의 TIGIT를 발현했다. 이러한 활성화된 PBMC(3명의 건강한 공여자로부터)를 표적 세포로 사용했다. 형광 염료 CFSE-표지된 NK92MI/CD16V 세포(5x104)를 동일한 수의 표적 세포와, TIGIT 항체(hu1217-2-2/IgG1mf 또는 hu1217-2-2/IgG1wt, 30 μg/mL) 또는 대조군 항체(양성 대조군 항-CD3 항체 OKT3(5 μg/ml, Biolegend) 또는 음성 대조군 인간 IgG, 30 μg/mL)의 존재 하에 40시간 동안 공동배양했다. 인간 IgG 및 hu1217-2-2/IgG1mf와 비교하여, hu1217-2-2/IgG1wt는 ADCC를 통해 Treg의 적당한 감소를 초래할 수 있었다. 그러나, 유의미한 ADCC 효과는 전체 T 세포 및 CD8+ T 세포에서 관찰되지 않았다(도 9B).
인간 PBMC를 표적 세포로 사용하는 CDC
hu1217-2-2/IgG1mf 및 hu1217-2-2/IgG1wt가 CDC를 촉발할 수 있는지 여부는 사전 활성화된 인간 PBMC 및 건강한 공여자로부터의 새로운 자가 혈청을 사용하여 결정했다. CDC에 의한 세포 용해는 Celltiter glo 검정 키트(Promega, 중국 베이징)로 결정했다. 요약하면, PBMC를 PHA(10μg/mL)로 3일 동안 사전 활성화시킨 다음, RPMI1640 + 자가 혈청(15%) 및 항-TIGIT 또는 대조군 항체(0.01-100μg/mL)에서 밤새 37℃에서 인큐베이션했다. CDC로 인한 세포사는 반응 종료 시 세포 용해 후 생존 세포에서 방출된 ATP의 감소에 의해 검정되었다. 항-MHC-I A, B, C는 양성 대조군으로 사용했다. 형광 판독은 96-웰 형광계(PHERA Star FS, BMG LABTECH)를 사용하여 수행했고, CDC 활성은 상대 형광 단위(RFU) 판독으로부터 다음과 같이 계산했다: CDC 활성 % = [(RFU 테스트 - RFU 배경) /(총 세포 용해에서의 RFU - RFU 배경)] x 100. 실험 결과는 hu1217-2-2/IgG1mf 및 hu1217-2-2/IgG1wt 둘 모두가 2개의 상이한 공여자로부터 단리된 PBMC에 의해 검출가능한 CDC를 나타내지 않음을 입증했다. 대조적으로, 양성 대조군 항체인 항-MHC-I는 유의미한 CDC 활성을 유도한다(도 10).
실시예 11: Hu1217-2-2/IgG1의 pH 의존적 결합 친화성
pH가 hu1217-2-2/IgG1의 결합 특성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 비교를 위해 pH 7.4 및 pH 6.0의 진행 완충액에서 표적 결합 SPR 테스트를 수행했다. 항체 hu1217-2-2/IgG1을 CM5 칩(GE)에 고정화했다. TIGIT-his의 연속 희석물을 pH 7.4 또는 pH 6.0의 진행 완충액 HBS에서 고정된 hu1217-2-2/IgG1 위로 유동시켰다.
하기 표 7에 열거된 결과로 나타낸 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1은 pH 7.4(생리학적 pH)에서 수득한 데이터와 비교하여, pH 6.0(종양 미세 환경의 pH와 유사한 산성 pH)에서 인간 TIGIT에 대해 더 높은 결합 친화성(KD) 및 더 강한 결합 신호(Rmax)를 나타냈다. 이러한 결과는 hu1217-2-2/IgG1이 종양 미세환경의 TIGIT-양성 림프구를 더 선택적으로 표적화할 수 있는 반면, 말초 림프구의 활성화와 연관된 잠재적 독성은 더 낮기 때문에, 종양 환경의 TIGIT-양성 림프구를 표적으로 하는 치료제로서 항체의 잠재적 이점을 나타낸다.
실시예 12: hu1217-2-2 항체 독성학
항체 hu1217-2-2는 TIGIT 수용체 점유 검정에서 인간화 TIGIT 녹-인 마우스로부터의 CD3+ 비장세포와의 결합 친화성이 CD3+ 인간 말초 혈액 단핵 세포와 비교하여 비슷한 것으로 입증되었다(각각 48.8 ng/ml 대 63.2 ng/ml의 EC50을 가짐). 또한, hu1217-2-2는 인간화 TIGIT 녹-인 마우스에서 매주 복강내 투약을 통한 ≥ 0.4 mg/kg의 용량에서 GL261 종양 성장의 유의미한 저해를 나타냈다.
hu1217-2-2의 독성 및 안전성 프로파일은 인간화 TIGIT 녹-인 마우스의 4주 반복 용량 독성 연구 및 사이노몰구스 원숭이의 13주 반복 용량 독성 연구에서 특성화되었다. hu1217-2-2는 또한 피하 MC-38 종양이 있는 인간화 TIGIT 녹-인 마우스에서 4주 반복 용량 연구로 평가했다. 사이노몰구스 원숭이는 hu1217-2-2의 표적 서열 상동성 및 종간 TIGIT 결합 활성에 기초하여 독성 연구에 적절한 종으로 간주되었다.
13주 동안 2주마다 한번씩 hu1217-2-2를 10, 30, 또는 100 mg/kg으로 반복 투약한 후 원숭이에서 명백한 독성이 관찰되지 않았다. 원숭이 연구에서 독성동태 프로파일은 전신 노출이 성별 차이 없이 용량 비례적인 것으로 나타났음을 보여주었다. 원숭이에서 13주 투약 기간 동안 축적은 관찰되지 않았다. 임상병리학 또는 조직병리학에서 변화가 관찰되지 않았으므로 명백한 면역독성은 없었다.
인간 IgG와 비교할 때 hu1217-2-2에 의한 비활성화된 말초 혈액 단핵 세포의 처리 후 시험관내 사이토카인 방출 검정으로부터 사이토카인 방출의 유의미한 증가는 관찰되지 않았다. 결과는 hu1217-2-2가 급성 사이토카인 방출 증후군을 유발한 가능성이 낮다는 것을 나타낸다.
전반적으로, 원숭이 독성 연구에서 어떠한 명백한 독성도 주목되지 않았다. 인간 또는 원숭이 조직에서 예상치 못한 조직 교차 반응성은 발견되지 않았다. 독성동태 프로파일은 명백한 축적 또는 성별 차이 없이 전신 노출에서 용량 비례 증가를 보여주었다. hu1217-2-2의 무관찰 부작용 수준(NOAEL)은 13주 원숭이 독성 연구에서 100 mg/kg이었다.
실시예 13: hu1217-2-2 임상 약리학
총 11명의 환자를 200mg 용량의 BGB-A317과 조합으로 50 mg(n = 1), 150 mg(n = 3), 450 mg(n = 4), 및 900 mg(n = 3) 용량 수준의 hu1217-2-2로 처리했다. 최대 투여 용량은 Q3W로의 200mg의 BGB-A317과 조합된 1800mg의 hu1217-2-2였다. hu1217-2-2의 혈청 농도는 정맥내 주입 후 이중-지수 방식으로 감소했고 hu1217-2-2 노출(Cmax 및 AUC)은 50 mg에서 900 mg까지 대략 용량 비례적으로 증가했다(도 11).
말초 TIGIT 수용체 점유 데이터는 50 mg(n=1), 150 mg(n=3), 450 mg(n=4), 및 900mg(n=3) 용량의 hu1217-2-2로 처리된 11명의 환자에서 이용가능했다. 완전한 TIGIT 수용체 점유(100%)는 50mg의 최저 용량을 포함한 테스트된 모든 용량 수준에서 말초 혈액의 CD8, CD4, NK 및 Treg 세포에서 관찰되었다.
실시예 14: hu1217-2-2 단독 또는 BGB-A317과의 조합은 PBMC 검정에서 IFN-γ 분비를 촉진한다
BGB-A317과 조합된 hu1217-2-2가 단일 요법보다 우수하게 1차 인간 면역 세포 활성화를 향상시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 건강한 공여자로부터의 PBMC를 TIGIT 발현을 상향조절하도록 사전 자극했고 이펙터 세포로 사용했다. PD-L1 및 T-세포 결합자 (engager)(OS8) 양성 A549 세포(A549/OS8-PD-L1)는 표적 세포로 사용했다. 사전 활성화된 PBMC를 hu1217-2-2 및 BGB-A317의 존재 하에 또는 표시된 농도의 어느 한 항체 단독의 존재 하에 A549/OS8-PD-L1 및 A549/PD-L1의 혼합물과 18시간 동안 공동 배양했다. IFN-γ 생산은 ELISA에 의해 결정되었다. IFN-γ 분비는 T-세포 활성화에 대한 판독값으로 사용했다. 결과는 PBMC를 hu1217-2-2로 처리하면 용량 의존적 방식으로 IFN-γ 생성을 증가시켰음을 보여주었다. hu1217-2-2 및 BGB-A317의 조합은 hu1217-2-2 또는 BGB-A317 단독에서 관찰된 증가에 비해 IFN-γ 생산을 유의미하게 향상시켰고, 이는 TIGIT 및 PD1의 조합 차단이 활성화 후 이펙터 세포 소진을 완화할 수 있음을 입증하며, 이 데이터는 도 12에 그래프로 제시된다.
실시예 15: hu1217-2-2는 마우스 신경교종 종양 모델에서 종양 성장을 감소시킨다
hu1217-2-2의 항종양 활성은 또한 인간화 TIGIT 녹-인 마우스의 GL261 마우스 신경교종 암 모델에서 테스트했다. GL261 세포(1 x 107)를 인간화 TIGIT 녹-인 마우스에 피하 이식했다. 이식 3일 후, 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누고 표시된 바와 같이 29일 동안 DPBS(비히클) 또는 hu1217-2-2로 복강내 처리했다. 종양 부피는 매주 2회 측정했다. 데이터는 각 그룹에서 12마리 동물의 평균 종양 부피 ± SEM으로 표시된다. 도 13 및 표 8에 제시된 바와 같이, hu1217-2-2의 주 1회(QW) 투여는 용량 의존적 항종양 활성을 유도했다. 치료 29일째(4차 용량 후 7일)에, hu1217-2-2는 테스트된 모든 용량(각각 0.4, 2 및 10 mg/kg QW)에서 유의미한 TGI(56%, 94% 또는 100%의 TGI)를 유도했다(표 8).
hu1217-2-2의 투여 전 및 1차 투약 후 2, 8, 24, 48, 96 및 168시간에 혈액 샘플(~100 μL)을 수집했다(시점당 마우스 3마리, 모든 마우스는 2회 이하의 시점에 사용됨). 혈청 내 hu1217-2-2의 농도는 ELISA 검정에 의해 결정되었고, 각 시점에서 hu1217-2-2의 혈청 농도는 용량-반응 데이터를 5-매개변수 로지스틱 모델에 피팅함으로써 결정되었다. 3가지 용량(0.4, 2 및 10 mg/kg)에서 hu1217-2-2의 약동학적 프로파일은 1차 주사 후 7일 동안 특성화했고, hu1217-2-2의 용량 의존적 노출(Cmax 1차 용량 및 AUC0-168h)이 관찰되었다(표 9). 처리는 연구 내내 동물의 체중에 유의미한 영향을 미치지 않았다.
표 9의 경우, 혈액 샘플(~100 μL)을 투여 전 및 hu1217-2-2의 1차 투약 후 2, 8, 24, 48, 96 및 168시간(시점마다 마우스 3마리, 모든 마우스는 2회 이하의 시점에 사용됨)에 수집했다. 혈청 내 hu1217-2-2의 농도는 ELISA 검정에 의해 결정했고, 각 시점에서 hu1217-2-2의 혈청 농도는 용량-반응 데이터를 5-매개변수 로지스틱 모델에 피팅하여 결정했다.
실시예 16: 인간화 TIGIT 녹-인 마우스 모델의 MC38 마우스 결장암 모델에서 hu1217-2-2 및 항-PD1 항체의 조합
hu1217-2-2와 항-마우스 PD1(muPD1)의 조합에 대한 항종양 활성은 인간화 TIGIT 녹-인 마우스의 MC38 마우스 결장암 모델에서 조사했다. MC38 종양 세포(1 x 106)를 인간화 TIGIT 녹-인 마우스에 피하 이식했다. 이식 7일 후, 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누고 비히클(DPBS), muPD1(5일마다 1회(Q5D) 복강내 1 mg/kg), hu1217-2-2(3 mg/kg 복강내 Q5D), 또는 조합으로 표시된 바와 같이 처리했다.
종양 부피는 매주 2회 측정했다. 데이터는 10마리 동물의 평균 종양 부피 ± SEM으로 제시된다. p 값은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 계산했다. hu1217-2-2 및 muPD1의 조합은 항체 단독(muPD1 단독의 경우 73% 또는 hu1217-2-2 단독의 경우 11%)보다 더 높은 TGI(102%)를 보여주었다(도 14 및 표 10). 처리는 연구 내내 동물의 체중에 유의미한 영향을 미치지 않았다.
실시예 17: 항-TIGIT 및 항-PD1 항체 투약
3주마다 1회 최대 1800mg과 함께 50 mg 내지 900 mg 범위의 hu1217-2-2의 용량을 3주마다 1회 200mg의 항-PD1 항체 BGB-A317과 조합하여, 진행 중인 Ph1/1b 연구에서 테스트했다. 테스트된 모든 hu1217-2-2 용량 수준은 임의의 유의미한 안전성 또는 내약성 이벤트 없이 용량 제한 독성(DLT) 창을 통과했다. hu1217-2-2 노출은 대략 용량 비례 방식으로 증가했다. 이에 따라, 투여된 hu1217-2-2 용량 900mg을 권장되는 2상 용량으로 선택했다.
완전한 TIGIT 수용체 점유는 본 연구의 모든 테스트된 용량에서 말초혈액의 순환성 T 세포 및 NK 세포에서 관찰되었다. 위에서 언급한 바와 같이, 데이터는 50mg에서 100% 수용체 점유가 달성되었음을 보여주었다. hu1217-2-2의 900mg 용량은 전체 투약 간격에 걸쳐 전적으로 조직에서 TIGIT 수용체의 포화 및 효과적인 농도의 가능성을 증가시킬 것으로 예상된다.
연구로부터 hu1217-2-2에 대한 약동학 데이터는 hu1217-2-2 노출과 환자 체중 사이에 유의미한 관계가 없음을 나타냈고, 이에 따라 고정 용량의 hu1217-2-2가 최적일 것임을 나타낸다. hu1217-2-2 항체와 BGB-A317의 조합의 경우, hu1217-2-2의 용량은 고정 용량으로서 900 mg이고, BGB-A317은 3주마다 1회 정맥내로 투여되는 200mg 고정 용량으로 선택되었다. BGB-A317 용량은 이전 BGB A317 연구에서 2 내지 5 mg/kg 사이에서 비슷한 안전성 및 효능 프로파일에 기초하여 선택되었다.
실시예 18: BGB-A317 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
1상 연구는 절제 불가능한 국소 진행성 또는 전이성 고형 종양 환자에서 화학요법을 받거나 받지 않고 BGB-A317과 조합된 hu1217-2-2의 안전성/내약성, 약동학(PK) 및 예비 항종양 활성을 조사하기 위해 개시했다.
연구에 등록된 환자는 3주마다 1회 200mg의 BGB-A317과 조합된 hu1217-2-2의 점증 용량(50, 150, 450 또는 900mg)으로 처리되었고; 모든 환자는 치료법으로부터 환자를 제외하거나 용량을 감소시켜야 하는 독성 없이 용량 제한 독성(DLT) 기간을 통과했다. 따라서, hu1217-2-2는 안전하고 내약성이 좋은 것으로 나타난다.
실시예 19: 제한된 병기의 소세포 폐암의 치료에 항-PD1 항체(BGB-A317)와 조합된 hu1217-2-2 항체
단일 작용제로서 또는 화학요법과 함께 BGB-A317은 국소 진행성 또는 전이성 비편평세포 NSCLC, 편평세포 NSCLC 및 ES-SCLC의 2상 시험으로 테스트되었고 BGB-A317 + 화학요법은 항암 활성을 나타냈고; 소세포폐암(SCLC) 환자 17명 중 13명은 1차 치료에서 BGB-A317 + 화학요법에 반응했다. 국소 진행성 및 전이성 비편평세포 및 편평세포 NSCLC에서 1차 치료로서 BGB-A317 + 백금-이중 화학요법의 2가지 3상 연구는 1차 평가변수로서 무진행 생존의 양성 결과를 입증했다. hu1217-2-2 및 BGB-A317 항체는 중첩되지 않는 항암 메커니즘을 가지며 SCLC의 치료에 상승작용 및/또는 부가적 활성을 가질 가능성이 있다.
실시예 20: 제한된 병기의 소세포 폐암의 치료에 BGB-A317 항-PD1 항체 및 화학방사선요법과 조합된 hu1217-2-2 항체
새로운 면역요법 조합으로서, 방사선요법과 동시에 제공된 항-PD-L1 + 항-TIGIT를 마우스 모델에서 평가했다(Grapin 등, J Immunother Cancer 2019;7:160-71). 실험은 항-PD-L1 + 항-TIGIT + 방사선 요법으로 치료하는 동안의 종양 반응을 단일 작용제 요법 + 방사선 요법 또는 방사선 요법 단독 요법과 비교했다. CT26 모델에서 방사선 요법은 각각 3×8 Gy 저-분할 방사선요법 하에, 항-TIGIT, 항-PD-L1 및 방사선요법 단독에 대해 2/10(20%), 3/10(30%), 0/10(0%)의 완전 반응률에 비해 9/10(90%)의 완전 반응률을 갖는 항-TIGIT 및 항-PD-L1 요법과의 조합에서 극적으로 더 효과적이었다. 18×2 Gy 표준 분할 방사선요법과 조합된 항-TIGIT 및 항-PD-L1의 완전 반응률은 항-TIGIT, 항 PD-L1 및 동일한 분할 RT의 방사선 요법 단독의 경우 3/12(25%), 8/12(66.7%) 및 1/10(10%) 마우스에 비해, 7/12(58.3%)의 마우스에서 관찰되었다. SCLC는 비교적 높은 TIGIT 및 PVR 발현을 특징으로 하며 높은 PVR 발현은 불량한 예후와 상관이 있다(Yu 등, Cancer Res. 2018; 1538-7445.AM2018-3637).
화학방사선요법과 조합된 hu1217-2-2 및 BGB-A317의 신규한 치료 전략은 제한된 병기에 특이적인 현재 SCLC의 적당한 개선을 증강시키고자 하며, 이는 여전히 치료 표준으로서 방사선 요법과 조합된 화학요법만을 갖는다.
이 조사는 3주마다 1회 정맥내로 200mg의 BGB-A317을 4주기 동안 현행 화학방사선요법과 조합으로 이용하고, 이어서 3주마다 1회 정맥내로 200mg BGB-A317을 이용할 것이다.
이것은 4 주기 동안 현행 화학방사선요법과 조합된 3주마다 1회 정맥내로 200mg BGB-A317 + 3주마다 1회 정맥내로 900mg hu1217-2-2, 및 이어서 3주마다 1회 정맥내로 200mg BGB-A317 + 3주마다 1회 정맥내로 900mg hu1217-2-2와 비교될 것이다.
바람직한 화학요법은 1일째 75 mg/m2 시스플라틴 및 처음 4주기 동안 1일, 2일 및 3일째 100 mg/m2 에토포사이드이다. 용량 조정은 제1 주기 후 신장, 혈액, 및 기타 독성에 따라 허용된다. 방사선 요법은 C1D1에 화학요법과 동시에 시작해야 하며, 늦어도 화학 요법을 사용하는 3주기 1일과 일치하는 허용가능한 창을 갖는다. 3주 동안 45Gy 또는 6.5주 동안 60-70Gy의 권장 총 선량은 연구자의 재량에 따른다. 예방적 두개골 광조사는 국소 표준 치료에 따라 2주 동안 총 25Gy(10회의 1일 분할로 25Gy)의 선량으로 허용된다. 이 요법은 아래 표 11에 자세히 설명되어 있다.
실시예 21: 비-소세포 폐암(NSCLC) 치료에서 BGB-A317 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
폐암은 2018년에 전 세계적으로 약 209만 건의 신규 진단과 176만 건의 사망을 갖는 가장 흔한 암이며, 이는 암 중에서 가장 높은 발병률과 가장 흔한 암-관련 사망률에 해당한다. 이 질환은 여성보다 남성에서 더 흔하며 남성에서 모든 암의 16.8%, 여성에서 모든 암의 8.8%를 나타낸다. 중국에서 폐암은 남성과 여성 모두에서 암 관련 사망의 주요 원인이며, 2015년에 약 610,200명의 사망 및 약 733,300명의 신규 증례가 추정되었다(Chen 등, CA Cancer J Clin. 2016;66(2):115-32). 비-소세포폐암(NSCLC)은 폐의 상피세포에서 기원하며 모든 폐암의 80~85%를 차지한다. NSCLC에는 3가지 주요 조직학적 하위 유형, 즉 모든 NSCLC의 40%를 차지하는 선암종, 25%를 차지하는 편평 세포 암종 및 모든 NSCLC의 10%를 차지하는 대세포 암종이 있다.
NSCLC 환자의 예후는 암이 검출되는 병기에 따라 크게 달라지지만, 비교적 좋지 않다. 폐암 병기결정은 전세계적으로 종양, 림프절 및 전이(TNM)(Classification of Malignant Tumors, Seventh Edition)(Goldstraw 등, J Thorac Oncol 2007;2(8):706-14)에 따라 수행된다. 폐암이 초기에 진단된다면, 수술이나 화학방사선 요법을 통해 치료가 가능하다. 불행하게도, 폐암 사례는 비교적 후기에 가장 종종 검출된다. NSCLC 환자의 약 1/3은 국소영역 종격동 림프절 또는 기관의 침범을 포함하는 국소 진행성 III기 질환으로 존재한다. III기 질환 환자의 5년 생존율은 36%(IIIA기) 내지 13%(IIIC기) 범위이다. 새로 진단된 NSCLC 환자의 55%에는 원위부 전이가 있다(IV기). IVA기 환자에는 반대측 폐 침범, 악성 흉막 삼출액 및 악성 심낭 삼출액이 존재하거나, 또는 흉부 외부의 단일 위치, 예를 들어 원위 림프절 또는 뇌, 간 또는 뼈와 같은 기관에서 전이가 있는 상태로 존재한다. 병기 IVB 환자에는 원위부 림프절 또는 기관의 여러 위치로 퍼진 질환이 존재한다. IV기 NSCLC 환자의 5년 생존율은 5%이다(Siegel 등, A Cancer Journal for Clinicians 2020;70(1):7-30). 편평 NSCLC 환자는 젬시타빈, 비노렐빈 또는 탁산과 함께 백금 기반 이중 요법을 받을 수 있다. 비편평 NSCLC 환자는 카보플라틴 또는 시스플라틴과 함께 페메트렉시드 기반의 조합 화학요법을 투여받는다. 단일 작용제 펨브롤리주맙은 KEYNOTE 024 시험(Reck 등, N Engl J Med.2016;375(19):1823-33)의 결과에 기초하여 종양이 높은 수준의 PD-L1(종양 비율 점수[TPS] ≥ 50%)을 발현하는 전이성 NSCLC 환자를 위한 1차 치료법으로서 미국 식약청(FDA)의 승인을 받았다. 이 연구에서 펨브롤리주맙은 무진행 생존율(PFS; 10.3개월 대 6개월[95% CI: 6.7, NR]) 및 6개월째 OS율(80.2% 대 72.4%[95% CI: 0.4, 0.9])의 유의미한 개선을 백금-기반의 화학요법에 대비하여 나타냈다. 페메트렉시드 및 백금 기반 요법과 조합된 펨브롤리주맙도 KEYNOTE 021(Langer 등, Lancet Oncol.2016;17(11):1497-1508)의 결과에 기초하여 EGFR 또는 ALK 게놈 변이 없이, IIIB기 또는 IV기 비편평 NSCLC 환자에 대한 1차 치료로서 FDA의 신속 승인을 부여받았다.
종양 침윤 림프구에서 TIGIT 발현의 상향조절이 NSCLC에서 보고되었다(Tassi 등, Cancer Res. 2017;77: 851-61). TIGIT 수용체 단독의 차단 또는 PD1/PD-L1 차단과의 조합 차단은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기능적으로 "소진된" T-세포를 구제하는 것으로 나타났다(Johnston 등, Cancer Cell. 2014; 26:923-3; Chauvin 등, J Clin Invest. 2015; 125:2046-58). 마우스 모델에서 항-PD1/PD-L1 항체와 조합된 TIGIT 차단은 단일 요법보다 유의미하게 우수한 항종양 효능을 입증했다(Johnston 등, 2014 상기 문헌 참조; Dixon 등, J Immunol. 2018; 200:3000-7).
이 시험은 EGFR 또는 ALK 게놈 변이 없이, 국소 진행성, 절제 불가능 또는 전이성 NSCLC를 가진, 이전에 치료받지 않은 PD-L1-선택 환자에서 BGB-A317과 조합으로 hu1217-2-2의 투여를 평가할 것이다. 작용 메커니즘(들)을 기반으로, hu1217-2-2에 의한 TIGIT 및 BGB-A317에 의한 PD1의 조합 차단은 BGB-A317 단독에 의해 관찰된 것보다 효능을 개선시킬 것으로 예상된다.
BGB-A317 200mg을 투여한 후 각 21일 주기의 1일(3주마다 1회)에 hu1217-2-2 900mg을 투여했다. NSCLC(편평)의 사례에서 이 용량으로 처리된 환자의 조기 판독 결과는 기준선으로부터 -11.1 병변 변화를 갖는 안정한 질환(SD)으로 나타났다.
실시예 22: 비인두 암종의 치료에서 BGB-A317 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
비인두 암종(NPC)은 2018년에 진단된 모든 암의 0.7%에 불과한 신규 사례가 129,079건인 전 세계적으로 비교적 드문 반면, 동아시아 및 남동아시아에서는 신규 사례의 >70%를 차지하고, 중국에서는 100,000명당 3.0의 연령-표준화 비율(세계)을 나타낸다. 엔데믹 지역 중 중국에서 발병률은 2015년 약 2.5:1의 비율로 여성보다 남성에서 더 높았다(Bray 등, CA Cancer J Clin. 2018; 68(6):394-424 및 Chen 등, CA Cancer J Clin. 2016;66(2):115-32).
NPC의 발생률 및 사망률은 여러 엔데믹 지역에서 감소했는데, 이는 아마도 생활방식 변화, 및 방사선 요법 기술의 개선, 화학요법의 보다 광범위한 적용 및 보다 정확한 질환 병기결정을 포함하는 처치의 진보에 따른 결과일 가능성이 있다(Lau 등, BMC Cancer 13:298, 2013; Hsu 등, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15:856-861, 2006). NPC는 연간 대략 72,987건의 세계적 사망률을 갖는 암으로 인한 사망의 주요 원인으로 남아있다(Bray 등, 상기 문헌 참조). 분화 정도에 따라 NPC는 세계보건기구(WHO) 기준에 따라 3가지 병리학적 아형으로 범주화된다. 표면 케라틴이 있는 분화된 종양은 I형로 정의되는 반면, II형 및 III형은 각각 비각질화 분화 및 미분화 종양을 지칭한다. 1991년에 II형과 III형은 비각질화 암종의 단일 범주로 조합되었다. NPC가 엔데믹인 지역에서는 비각질화 아형이 대부분의 사례(>95%)를 차지하고 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 감염과 변함없이 연관이 있는 반면, I형 질환은 세계의 다른 지역에서 더 일반적이다(Wei 등, Lancet 2005; 365: 2041-54; Nicholls 등, Adv Anat Path 1997; 4: 71-84). EBV 감염은 NPC에 대해 가장 광범위하게 연구된 병인학적 인자이다. EBV-인코딩된 RNA에 대한 동일계내 하이브리드화 기술을 기반으로, 바이러스는 모든 종양 세포에서 전적으로 검출되지만 정상 비인두 상피에서는 검출되지 않으므로, 이는 EBV 활성화가 NPC의 병인에 필수적임을 시사한다(Pathmanathan 등, N Engl J Med. 1995; 333: Chan 등, Cancer Res 2000; 60: 5365-70). NPC는 남중국 및 남동아시아에서 엔데믹이다. 표준 1차 치료는 백금 함유 다중작용제 화학요법이다. 그러나 1차 요법 이후의 치료에 대해서는 합의에 도달하지 못했다. 보다 효과적이고 내약성이 우수한 신규 작용제에 대한 충족되지 않은 임상적 요구가 남아있다.
앞서 기술된 바와 같이, 항-TIGIT 항체는 면역억제성 종양 미세환경으로부터 면역 세포를 구제하는 잠재적인 메커니즘을 제공하여 효율적인 항종양 면역 반응을 유도한다. 연구에 따르면 TIGIT 경로는 PD1과 협동하여 이펙터 종양 침윤 림프구(TIL)의 억제를 최대화하고 항 PD1 요법에 대한 내성을 촉진하는 것으로 나타났다.
1차 재발성 또는 전이성 NPC에 대한 치유 표준 치료는 백금 함유 다중작용제 화학요법으로 구성되며; 하지만, 백금 불응성/재발성 또는 전이성 NPC 환자에 대한 1차 설정 이후의 표준 치료 옵션은 없다. 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 캄렐리주맙 및 토리팔리맙 단일 요법과 같은 다른 항-PD1 항체에 대한 최근 임상 연구는 2차 또는 그 이후의 치료 설정에서 진행된 NPC 환자에서 유리한 임상 활성을 입증했다(중앙 ORR, 20.5% 내지 34%; 중앙 OS, 16.5 내지 17.4개월; 중앙 PFS, 1.9 내지 6.5개월). 이전 임상 시험에서 NPC 환자의 확장 코호트에서 단일 요법으로서 BGB-A317의 예비 데이터도 고무적이다(중앙 ORR: 43%; 중앙 OS, 미도달; 중앙 PFS, 12.4개월). 그러나, 1가지 현재의 과제는 PD1 저해가 불응성/재발성 또는 전이성 NPC 환자의 하위집합에만 이익을 주어, 이 환자 집단에 대해 보다 효과적인 치료에 대한 미충족 요구가 남아 있다는 것이다.
이 시험에서, 환자는 BGB-A317 + hu1217-2-2 또는 비교자로서 BGB-A317 단독을 투여 받을 것이다. 환자는 어느 것이 먼저 발생하든지 간에, RECIST v1.1에 따라 조사자가 평가한 질병 진행, 허용할 수 없는 독성 또는 임상적 이점의 상실까지 3주마다 1회 정맥내로 BGB-A317 200 mg + hu1217-2-2 900 mg을 투여받을 것이다.
시험 동안, 종양 평가는 독성을 관리하기 위한 용량 지연에 상관없이, RECIST v1.1에 기초하여 처음 24주 동안 6주마다(± 7일), 1년차의 나머지 기간 동안 9주마다(± 7일), 그리고 이후 12주마다(± 7일) 수행될 것이다. BGB-A317 및 hu1217-2-2 조합의 PK 특성을 결정하기 위해 혈액 샘플을 다양한 시점에서 수집할 것이다. 선택적인 혈액 샘플은 기준선(1 주기 1일에 사전 투여), 1차 종양 반응 시점(다음 주기의 1일차에 사전 투여) 및 질환 진행 후 치료 방문 마지막(EOT)에 채취될 것이다(각 시점마다 10 mL).
예비 임상 결과는 비인두암 환자가 BGB-A317과 조합으로 hu1217-2-2의 투여 후 36주 후에 진행되지 않았음을 입증했다. 종양 병변(TL) 크기는 초기 제시 시 31mm였고 36주 치료 과정에 걸쳐 23mm로 퇴행하여, 최저점의 변화 없이 기준선으로부터 종양 크기의 25.81% 감소를 초래했다.
실시예 23: 식도암 치료에서 BGB-A317 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
식도암은 전 세계적으로 7번째로 가장 흔한 암이며 암으로 인한 사망의 6번째로 가장 흔한 원인이다. 발병률이 가장 높은 지역은 이란 북부에서 중앙아시아 공화국을 거쳐 북중국까지 이어진다. 식도암의 가장 흔한 조직학적 유형은 식도 편평 세포 암종(ESCC)으로, 이는 동유럽과 아시아에서 훨씬 더 흔하다. 식도암 진단을 받은 환자의 3분의 2 초과는 진행성 또는 전이성 질환을 앓게 되며 평균 생존 기간은 8~10개월이고 예상 5년 생존율은 5% 미만이다. 이들 데이터는 고효율 치료의 상대적 부족과 함께, 일반적으로 식도암, 특히 ESCC 진단을 받은 환자에서 미충족 의료 수요가 크다는 것을 나타낸다.
항-PD1 요법은 ESCC의 2차 치료로서 화학요법과 비교하여 우수한 효능을 나타냈다. KEYNOTE-181 시험에는 진행성 질환에 대한 이전 1차 전신 치료 시 또는 그 이후에 진행된 재발성 국소 진행성 또는 전이성 식도암 환자 628명이 등록되었으며, 펨브롤리주맙으로 처리된 환자의 1차 평가변수 OS에서 화학요법과 비교하여 유의미한 개선이 관찰되었다(10.3개월 대 6.7개월, HR, 0.62; 95% CI: 0.46 대 0.90). ATTRACTION-3 시험에는 1회 이상의 플루오로피리미딘- 및 백금-기반 요법에 불응성이거나 또는 과민증이 있는 절제불가능한 진행성, 재발성 또는 전이성 ESCC 환자 419명이 등록되었으며, 니볼루맙으로 처리된 환자의 경우 1차 평가변수 OS에서 연구자가 선택한 탁산 화학요법과 비교하여 유의미한 개선이 보고되었다(10.9개월 대 8.4개월; HR, 0.77; 95% CI: 0.62 대 0.96). 전체 생존 이점은 PD-L1 발현 수준에 관계없이 관찰되었다.
항-TIGIT 항체의 투여는 면역억제성 종양 미세환경으로부터 면역 세포를 구제하는 잠재적인 메커니즘을 제공하여 효율적인 항종양 면역 반응을 유도한다. 연구에 따르면 TIGIT 경로는 PD1과 협동하여 이펙터 TIL의 억제를 최대화할 뿐만 아니라 항 PD1 요법에 대한 저항성을 촉진한다. PD1/PD-L1 경로를 표적으로 하는 항체 차단은 위의 시험에서 기술된 바와 같이 ESCC 치료에서 놀라운 결과를 달성했다. 따라서 항-TIGIT 항체는 ESCC에서 항-PD1 요법의 치료적 이점을 유의미하게 개선 및/또는 확장시킬 수 있다.
1차 화학요법에서 실패한 절제 불가능, 국소 진행성, 재발성 또는 전이성 ESCC 환자는 상당한 미충족 의료 요구를 가진 환자 집단을 나타낸다. 따라서, 이 시험은 PD-L1 발현 및 식도암에 대해 양성인 환자의 치료에서 BGB-A317 + hu1217-2-2 대 단일 작용제로서 BGB-A317의 효능을 비교하도록 설계된다. 식도암은 절제불가능, 국소 진행성, 재발성 또는 전이성 ESCC일 수 있다.
환자는 RECIST v1.1에 따라 조사자가 평가할 때까지, 허용할 수 없는 독성 또는 환자 철회까지, 3주마다 1회 BGB-A317(200mg) + hu1217-2-2(900mg)를 정맥내로 투여받을 것이다. 환자는 각 21일 주기의 1일차에 BGB-A317 200 mg(즉, 3주마다 1회)을 투여받은 후, 각 21일 주기의 1일차에 hu1217-2-2 900 mg을 투여받을 것이다.
예비 임상 결과는 식도암 환자가 BGB-A317과 조합된 hu1217-2-2 투여 후 6주 후 진행되지 않았음을 보여주었다. 종양 병변(TL) 크기는 초기 제시 시 38mm였으며 치료 과정 동안 23mm로 퇴행하여 기준선 및 최저점으로부터 39.47% 감소를 초래했다.
실시예 24: 자궁경부암 치료에서 BGB-A317 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
자궁경부암은 2018년에 전 세계적으로 약 570,000건의 신규 진단과 311,000건의 사망을 갖는 여성에서 4번째로 가장 흔한 암이자 암 사망의 4번째 주요 원인이다. 자궁경부암의 대략 연령-표준화된 빈도는 전세계적으로 100,000명의 여성당 13.1명이었고, 국가마다 매우 달라 100,000명의 여성당 2명 미만부터 75명의 비율 범위였다. 중국과 인도는 함께 전세계의 1/3이 넘는 자궁경부암 부담에 기여했고, 중국에서 106,000건의 사례와 48,000건의 사망 및 인도에서 97,000건의 사례와 60,000건의 사망을 보였다(Arbyn 등, Lancet Glob Health. 2020; 8:e191-e203).
재발성 또는 전이성 자궁경부암은 일반적으로 1차 치료 완료 후 처음 2년 이내에 여성의 15 내지 61%에서 발병하는 것으로 추정된다. 1차 백금 기반 요법 후 진행된 환자의 경우, 치료 옵션은 제한되고 표준 치료가 확립되지 않았다. 단일 세포증식억제제는 제한된 반응률과 제한된 기간만을 초래했다. 이는 자궁경부암 및/또는 전이성 자궁경부암 환자에 대한 유의미한 미충족 의료 요구를 나타낸다.
자궁경부암의 가장 중요한 원인은 지속적인 유두종 바이러스 감염이다. 인간 유두종 바이러스(HPV)는 자궁경부 종양의 99%에서, 특히 HPV 16 및 18과 같은 발암성 아형이 검출된다. HPV는 자궁경부암에서 가장 중요한 병인학적 인자인 것으로 인식되었고, 따라서 자궁경부암은 바이러스 단백질이 강력한 면역 자극제임으로 인해 면역요법의 매력적인 표적이다. 2018년 6월, 펨브롤리주맙은 화학요법 중 또는 이후에 질환이 진행되고 종양이 프로그래밍된 사망-리간드 1(PD-L1)을 발현하는 자궁경부암 환자의 치료에 대해 미국 FDA에 의해 신속 승인을 받았다.
이 적응증에서 보고된 항-PD1 항체의 유망한 항종양 활성 및 항-TIGIT 항체가 항-PD1 요법의 치료적 이점을 개선할 수 있다는 과학적 근거를 감안할 때, hu1217-2-2와 BGB-A317의 조합은 자궁경부암 치료에 유의미한 임상적 이점을 가져올 수 있다.
시험은 자궁경부암, 전이성 자궁경부암 또는 이전에 치료받은 재발성 자궁경부암 환자에서 BGB-A317과 함께 hu1217-2-2의 투여를 평가하는 것이다. 시험의 첫 번째 단계는 PD-L1 발현과 관계없이 자궁경부암 환자에게 BGB-A317과 함께 hu1217-2-2를 투여하는 것일 것이다. 환자는 단일 요법으로서 BGB-A317(200mg Q3W) 또는 BGB-A317(200mg Q3W)과 함께 hu1217-2-2(3주마다 900mg(Q3W))를 투여 받기 위해 1:1 비율로 무작위 배정될 것이다. 1단계 이후에는 더 많은 환자가 모집될 것이다. 이들 환자에게는 BGB-A317(200mg Q3W)과 함께 hu1217-2-2(900mg Q3W)가 투여될 것이다.
실시예 25: 고형 종양 치료에서 BGB-A317 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
hu1217-2-2는 고형 종양에 대한 시험에서 BGB-A317과 조합으로 투여되었다. 표 18은 BGB-A317의 용량을 200mg으로 유지하면서 hu1217-2-2의 다양한 용량을 이용하여, BGB-317과 조합으로 hu1217-2-2를 투여한 7명의 환자의 반응을 보여준다. 아래의 사례에서 종양 병변(TL)은 병용요법 하에서 퇴행을 보였고, 6명의 사례에서는 부분 반응(PR)을 보인 1명의 환자와 함께 안정한 질환(SD)을 초래했다. 일반적으로, 조합 치료 후 종양은 퇴행하거나 진행하지 않았다. 예를 들어, 부분 반응자로서 위/위식도 접합부 환자는 84mm의 TL 크기를 제시했고, 치료 6주 후에 TL 크기가 53mm로 감소하여, 기준선 및 최저점으로부터 36.9%의 TL 감소를 초래했다.
실시예 26: 용량 증량으로 BGB-A317 항-PD1 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
1상 용량 증량 연구는 표준 요법이 비효과적이거나 과민증이 있거나 이용할 수 없는 진행성, 전이성, 절제 불가능한 고형 종양을 가진 환자에서 수행되었다. 환자는 hu1217-2-2를 50mg 용량으로 1주기 1일에 단일 작용제로서 정맥내(IV)로 투여받았고 BGB-A317을 1주기 8일에 200mg IV로 투여받았다. 이것이 용인되었다면, 환자는 150-900mg 용량 범위의 hu1217-2-2의 4회의 증량 용량 및 후속적으로 29일 및 그 후 중단할 때까지 3주마다(Q3W) BGB-A317 200mg을 투여받았다. 비인두암 환자는 테스트된 가장 긴 기간인 54주 동안 BGB-A317 200mg(Q3W)과 조합으로 150mg(Q3W)의 hu1217-2-2 용량에서 안정한 암을 나타냈다. BGB-A317 200mg(Q3W)과 조합된 450mg(Q3W)의 hu1217-2-2 용량에서는 자궁암 환자 및 다른 기저 세포 암종 환자에서 안정한 암이 존재했다. 이와 동일한 용량에서 위암 환자는 부분 반응을 보였다. 마지막으로, BGB-A317 200mg(Q3W)과 조합된 900mg(Q3W)의 hu1217-2-2 용량은 안정한 암을 가진 6명의 환자, 즉 신장암 환자 2명, 흑색종 1명, 육종 1명, 췌장암 1명 및 침샘암 환자 1명을 초래했다. 이 투여량 투여는 또한 중피종을 가진 환자에서 하나의 부분적 반응을 보였다.
실시예 27: 간세포암 치료를 위한 BGB-A317 및 BAT1706 항체와 조합된 hu1217-2-2 항체
BAT1706은 베바시주맙 주사(베바시주맙 주사, 상품명 Avastin®)의 유사한 생물학적 제품이다. 베바시주맙은 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 높은 친화성으로 결합하는 재조합 인간화 면역글로불린 G1(IgG1) 단클론 항체이다. 베바시주맙은 모든 인간 VEGF A 이소형에 높은 친화성으로 선택적으로 결합할 수 있고 VEGF 수용체-1(VEGFR-1) 및 VEGF 수용체 2(VEGFR-2)에 대한 VEGF의 결합을 차단하여 VEGF의 생체 활성을 중화할 수 있다. 이는 현재 암 환자의 전체 생존 기간 및 무진행 생존 기간을 연장하는 임상적 효능이 입증된 유일한 항종양 혈관신생 약물이다. 몇몇 무작위, 제어된 II상 및 III상 연구는 표준 화학요법과 조합된 베바시주맙 치료가 표준 화학요법 단독 사용에 비해 전체 생존, 무진행 생존 및 전체 관해율의 통계적으로 유의미한 개선을 초래했음을 보여주었다.
비교용 시험관내 약력학 연구의 결과는 BAT1706 및 베바시주맙 둘 모두가 문헌 보고와 일치하는 VEGF와의 특이적 결합을 나타냄을 보여주었다. BAT1706의 생물학적 활성은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 증식 저해 테스트를 사용하여 측정했다. 결과는 BAT1706이 베바시주맙에 대한 HUVEC의 성장과 유사한 용량 의존적 관계를 나타냈고, 둘 모두 VEGF에 대해 강력한 중화 효능을 나타낸다는 것을 입증했다. BAT1706의 생물학적 활성은 (1.0 ± 0.2) × 104 U/mg의 소정의 범위 내에서 베바시주맙의 생물학적 활성과 비슷한 것으로 발견되었다.
여러 인간 암 모델(NSCLC, 난소암 및 횡문근육종)에서 BAT1706 및 베바시주맙의 항종양유발 효과를 비교했다. NCI-H358 인간 NSCLC 세포를 비만이 아닌 당뇨병/중증 복합 면역결핍(NOD/SCID) 암컷 마우스에 피하 접종하여 인간 NSCLC 이종이식편 모델을 확립시켰다. 동물을 다음 5개의 그룹으로 나누었고 각 그룹은 8마리의 암컷 마우스로 이루어졌다:
비히클 대조군
베바시주맙 5.0 mg/kg 그룹
베바시주맙 0.5 mg/kg 그룹
BAT1706 5.0 mg/kg 그룹
BAT1706 0.5 mg/kg 그룹.
종양은 128 mm3의 평균 부피로 성장하도록 했다. 그 후, 후속 3주 동안 매주 1일, 3일 및 5일에 꼬리 정맥 주사로 치료를 투여했다. 효능은 종양 무게, 종양 부피 및 상대적 종양 성장 저해(TGI)로 측정했다. 종양 잠복기가 또한 관찰되었지만 통계적 유의성에 대해서는 평가되지 않았다. 이 연구에서 비히클 대조군과 비교하여 종양 잠복기를 평가하는 데 사용된 표적 종양 무게는 BAT1706 및 베바시주맙에 대해 동일했다(600 mm3). BAT1706 0.5mg/kg 및 베바시주맙 0.5mg/kg 그룹은 아니지만, BAT1706 5mg/kg 및 베바시주맙 5mg/kg 그룹의 평균 종양 부피는 용량 종료 1일 후 비히클 대조군과 통계적으로 유의미한 차이를 입증했다. 종양 무게 데이터는 종양 부피 데이터와 일치했다. 특히, BAT1706과 베바시주맙의 쌍을 이룬 용량(0.5 또는 5mg/kg)의 경우 종양 부피 및 종양 무게 결과는 통계적으로 다르지 않았다. BAT1706 5 mg/kg 및 베바시주맙 5 mg/kg의 상대적 TGI(%)는 각각 94% 및 93%였다. BAT1706 0.5 mg/kg 및 베바시주맙 0.5 mg/kg에서 상대적 TGI(%)는 각각 67% 및 63%였다. 요컨대, BAT1706은 용량 의존적 방식으로 베바시주맙과 유사한 효능을 보였다.
SK-OV-3 인간 난소암 세포 이종이식편 모델 마우스 모델 및 673 인간 횡문근육종 세포 이종이식편 마우스 모델에서, BAT1706이 용량 의존적 방식으로 베바시주맙과 유사한 효능을 나타낸다는 유사한 결과가 관찰되었다. 두 연구에서 모든 치료 그룹은 사망이나 심각한 독성 징후를 보이지 않았으며 두 항체 모두 치료 기간 동안 내약성이 양호했다.
뉴질랜드에서 수행된 I상 연구는 BAT1706의 안전성을 평가하고 건강한 대상체에서 EU-베바시주맙과 US-베바시주맙 사이를 비교했다. 총 125명의 건강한 대상체에게 3가지 연구 약물인 BAT1706, EU-베바시주맙 또는 US-베바시주맙 중 하나를 90분 IV 주입으로 1 mg/kg 단일 투여했으며 연구 결과는 BAT1706의 단일 IV 주입이 안전하고 내약성이 좋으며 단지 경미한 주사 부위 반응과 연관이 있다는 것을 나타냈다.
중국에서 수행된 별도의 I상 연구(BAT1706-002-CR)도 건강한 대상체에서 BAT1706의 안전성을 평가하고 베바시주맙(유럽)과 비교했다. 총 80명의 건강한 대상체는 연구 약물 1 mg/kg을 단일 투여로 투여 받았다(BAT1706 그룹에 39명의 대상체 및 베바시주맙 그룹에 41명의 대상체). 연구 결과는 두 약물이 모두 우수한 안전성과 내약성을 보였음을 나타냈다. 뉴질랜드 또는 중국 연구 중 어떤 대상체에 대해서도 항약물 항체 양성 결과가 보고되지 않았다.
간세포 암종(HCC)은 보고된 모든 간암(HCC가 종종 상호교환적으로 사용되는 용어) 사례의 85-90%를 차지하는 주요 세계적 건강 문제이다(El-Serag 등, Gastroenterology 2007; 132(7):2557-76). 세계보건기구(WHO)의 GLOBOCAN 2012 데이터베이스에 따르면 간암은 그해 전 세계적으로 782,000건의 신규 사례가 발생한 6번째로 가장 흔한 암 유형이었다; 또한 약 746,000명의 사망에 책임이 있는 암 관련 사망률의 2번째로 가장 흔한 원인이었다(Torre 등, CA Cancer J Clin. 2015;65(2):87-108). 대부분의 HCC 사례(>80%)는 동아시아와 사하라 이남 아프리카에서 발생하며 전형적인 발병률은 100,000명의 개체당 >20명이다. 중국은 단독으로 세계적인 신규 HCC 사례 및 HCC 관련 사망의 대략 50%를 차지한다(Torre, 상기 문헌 참조). 스페인, 이탈리아, 및 그리스와 같은 남부 유럽 국가에서는 보다 중등도의 발생률(100,000명 개체당 약 10 내지 20명)을 나타내는 경향이 있는 반면, 북미, 남미, 북유럽 및 오세아니아에서는 상대적으로 낮은 발병률의 HCC를 나타냈다(100,000명당 5명 미만)(El-Serag 등, Gastroenterology. 2012;142(6):1264-73).
앞서 기술된 바와 같이, 항-PD-1/PD-L1 저해제 단일요법은 이전에 치료된 HCC에서 임상적 이점을 보였다(Qin 등, Lancet Oncol. 2020;21(4):571-80). 그러나 1차 HCC 환자에서의 소라페닙과 비교하여 유의미한 개선을 보이지는 않는다(Yau 등, Ann Oncol. 2019;30, (Suppl 5); v874-v75). HCC에서 보고된 항-PD-1 항체의 유망한 항종양 활성 및 TIGIT가 항-PD-1 요법의 치료적 이점을 개선할 수 있다는 점을 고려할 때, hu1217-2-2와 BGB-A317의 조합은 이 적응증에 유의미한 임상적 이점을 유발할 수 있다.
HCC 환자에서는 베바시주맙에 의해 단일 작용제 활성이 관찰되었다(Boige 등, Oncologist. 2012;17:1063-72; Siegel J Clin Oncol 2008; 26: 2992-8). PD-L1 저해제와 조합 시, 베바시주맙은 유망한 임상적 이점과 우수한 안전성 프로파일과 함께 다른 종양 유형에서 면역조절 효과를 나타냈다(Wallin 등, Nat Commun. 2016; 7:12624). IMbrave150 연구와 Orient32 연구의 긍정적인 결과는 항혈관신생제와 조합한 항-PD-1/PD-L1 저해제의 상승작용적 이점을 입증한다.
진행성 HCC 환자의 1차 치료로서 BGB-A317 + BAT1706과 조합된 hu1217-2-2의 효능 및 안전성을 조사하기 위한 연구에서, 본 연구에는 2가지 치료 아암 중 하나에 2:1의 비율로 무작위로 나눈 대략 90명의 환자가 등록될 것이다:
아암 A (n=60): 3주마다 1회 정맥내로 hu1217-2-2 900mg(21일 주기로 투약) + 3주마다 1회 정맥내로 BGB-A317 200 mg(21일 주기로 투약) + 3주마다 1회 정맥내로 BAT1706 15 mg/kg(21일 주기로 투약).
아암 B (n=30): 3주마다 1회 정맥내로 BGB-A317 200 mg(21일 주기로 투약) + 3주마다 1회 정맥내로 BAT1706 15 mg/kg(21일 주기로 투약).
상기 개시된 바와 같이, TIGIT를 표적화하는 것은 면역억제성 종양 미세환경으로부터 면역 세포를 구제하는 잠재적인 메커니즘을 제공하여 효율적인 항종양 면역 반응을 유도한다. 연구에 따르면 TIGIT 경로는 PD-1과 협동하여 이펙터 종양 침윤 림프구(TIL)의 억제를 최대화하고, 뿐만 아니라 항 PD-1 요법에 대한 내성을 촉진하는 것으로 나타난다. PD-1/PD-L1 경로를 표적으로 하는 항체는 HCC 치료에서 결과를 달성했으므로, BGB-A317 및 BAT1706과 조합된 hu1217-2-2로의 치료는 HCC 치료를 유의미하게 개선시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BeiGene, Ltd. <120> METHODS OF CANCER TREATMENT USING ANTI-TIGIT ANTIBODIES IN COMBINATION WITH ANTI-PD1 ANTIBODIES <130> F22W0881PCT <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn 20 25 30 Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser 35 40 45 Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln 50 55 60 Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln 85 90 95 Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr 100 105 110 Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu 115 120 125 Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly 130 135 140 Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val 145 150 155 160 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Claims (29)

  1. 암 치료 방법으로서, 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 조합하여 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 항-PD1 항체와 조합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법:
    (i) (a) 서열번호 3의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열번호 13의 HCDR2, 및 (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (ii) (a) 서열번호 3의 HCDR1, (b) 서열번호 4의 HCDR2, 및 (c) 서열번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 6의 LCDR1, (e) 서열번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기를 포함하는, 방법:
    (i) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (iii) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  4. 제1항에 있어서, 항-PD1 항체가 인간 PD1에 특이적으로 결합하고, 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호 25의 HCDR1, (b) 서열번호 26의 HCDR2, 및 (c) 서열번호 27의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 28의 LCDR1, (e) 서열번호 29의 LCDR2 및 (f) 서열번호 30의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 PD1에 특이적으로 결합하고 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 서열번호 35를 포함하는 IgG4 불변 도메인을 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체가 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항-VEGF 항체의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 베바시주맙 또는 BAT1706인, 방법.
  11. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 암이 유방암, 결장암, 췌장암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 식도암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 또는 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 소세포 폐암이 제한된 병기의 소세포 폐암인, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 암이 비-소세포 폐암인, 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 두경부암이 비인두암인, 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 식도암이 식도 편평 세포 암종(ESCC)인, 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 암이 자궁암인, 방법.
  17. 제9항에 있어서, 상기 위암이 위 또는 위식도 접합부 암인, 방법.
  18. 제9항에 있어서, 상기 자궁경부암이 재발성 또는 전이성 자궁경부암인, 방법.
  19. 제9항에 있어서, 상기 피부암이 기저 세포 암종인, 방법.
  20. 제9항에 있어서, 상기 암이 췌장암인, 방법.
  21. 제9항에 있어서, 상기 신장암이 간세포 암종인, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 화학요법의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 화학요법이 화학방사선요법인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 3주마다 200mg으로 투여되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체가 50mg-900mg의 범위로 투여되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체가 3주마다 50mg으로 투여되는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체가 3주마다 150mg으로 투여되는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체가 3주마다 450mg으로 투여되는, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체가 3주마다 900mg으로 투여되는, 방법.
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