JP2024504331A - 抗ｐｄ１抗体と組み合わせて抗ｔｉｇｉｔ抗体を使用するがん処置方法 - Google Patents

Abstract

ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体、ＷＵＣＡＭまたはＶｓｔｍ３）及びその抗原結合断片に特異的に結合する抗体を、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて用いて、がんを処置するか、または免疫応答を増大、強化もしくは刺激する方法を、提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、がんの処置のための抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）に特異的に結合する抗体に関する。

ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、抗腫瘍免疫におけるＴ細胞及びＮＫ細胞媒介の機能活性の阻害に重要な役割を果たすタンパク質のＣＤ２８ファミリーのメンバーである（Ｂｏｌｅｓ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３９：６９５－７０３；Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６：１７８５８－６３；Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：４８－５７）。

ＴＩＧＩＴをコードする遺伝子及びｃＤＮＡを、マウス及びヒトでクローニングして、特徴付けした。全長ヒトＴＩＧＩＴは、長さ２４４アミノ酸の配列（配列番号１）を有し、ここで最初の２１アミノ酸がシグナルペプチドを構成する。成熟ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸配列には、２２３アミノ酸（ａａ）残基が含まれている（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿１７３７９９）。成熟ヒトＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、１２０アミノ酸残基（配列番号２、配列番号１のアミノ酸２２～１４１に相当）からなり、Ｖ型Ｉｇ様ドメイン（配列番号１のアミノ酸３９～１２７に相当）を有し、その後に２１アミノ酸の膜貫通配列、及び免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する８２アミノ酸の細胞質ドメインが続く（Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：４８－５７；Ｓｔｅｎｇｅｌ ＫＦ，ｅｔ ａｌ．２０１２ ＰＮＡＳ １０９：５３９９－０４）。ＥＣＤ内では、ヒトＴＩＧＩＴは、マウス及びカニクイザルとそれぞれ５９％及び８７％のａａ配列同一性しか共有しない。

ＴＩＧＩＴは、Ｔ細胞（活性化Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、及び濾胞性Ｔヘルパー（Ｔｆｈ）細胞を含む）及びＮＫ細胞上で発現される（Ｂｏｌｅｓ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３９：６９５－７０３；Ｊｏｌｌｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：５６９－８１；Ｌｅｖｉｎ ＳＤ，ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４１：９０２－１５；Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６：１７８５８－６３；Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：４８－５７）。

これまでに、２つのＴＩＧＩＴリガンド、ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体またはＰＶＲとしても公知）とＣＤ１１２（ポリオウイルス受容体関連２、ＰＶＲＬ２、ネクチン－２としても公知）が同定されている。これらのリガンドは、主にＡＰＣ（樹状細胞及びマクロファージなど）及び腫瘍細胞上で発現される（Ｃａｓａｄｏ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５８：１５１７－２６；Ｌｅｖｉｎ ＳＤ，ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４１：９０２－１５；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ＣＬ ｅｔ ａｌ．，１９８９ ５６：８５５－６５；Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６：１７８５８－６３；Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：４８－５７）。免疫「チェックポイント」分子として、ＴＩＧＩＴは、そのリガンドであるＣＤ１５５及びＣＤ１１２と結合すると、免疫細胞内で抑制性シグナル伝達を開始する。ＣＤ１５５に対するＴＩＧＩＴの結合親和性（Ｋｄ：約１ｎＭ）は、ＣＤ１１２に対するよりもはるかに高く、ＴＩＧＩＴ：ＣＤ１１２相互作用が抑制シグナルの媒介に機能的に関連しているか否かはまだ解明されていない。共刺激受容体であるＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）は、より低い親和性（Ｋｄ：約１００ｎＭ）で同じリガンドに結合するが、正のシグナルを伝達する（Ｂｏｔｔｉｎｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：５５７－６７）。さらに、「ＴＩＧＩＴ様」受容体であるＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）も、同じ経路において同様の阻害的役割を果たす（Ｃｈａｎ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：４３１－８）。

ＴＩＧＩＴは、さまざまな機序を通じて免疫応答を阻害し得る。まず、樹状細胞（ＤＣ）上のＴＩＧＩＴとＰＶＲとの間の相互作用は、ＤＣに「逆シグナル伝達」をもたらし、ＩＬ－１０のアップレギュレーション及びＩＬ－１２分泌の減少をもたらし、それによってＴ細胞の活性化を阻害し得る（Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ １０：４８－５７）。第２に、ＴＩＧＩＴはより高い親和性でＣＤ１５５に結合し、それによってＤＮＡＭ－１－ＣＤ１５５相互作用と競合する。第３に、Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴの直接ライゲーションは、ＴＣＲ媒介活性化を下方制御し、その後のＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴの増殖及び関与がＮＫ細胞の細胞毒性をブロックし得る（Ｊｏｌｌｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．２０１１ １８６：１３３８－４２；Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６：１７８５８－６３）。第４に、Ｔｒｅｇ上のＴＩＧＩＴ発現は、腫瘍組織における高度に活性化され抑制的な表現型と関連しており、ＴｒｅｇにおけるＴＩＧＩＴシグナル伝達はＴｒｅｇの安定性に有利であり得る（Ｊｏｌｌｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１４ ４０：５６９－８１；Ｋｕｒｔｕｌｕｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５ １２５：４０５３－４０６２）。

ＴＩＧＩＴは、その細胞質尾部に免疫グロブリン尾部チロシン（ＩＴＴ）様モチーフとそれに続く免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ １０：４８－５７；Ｅｎｇｅｌｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１１ ２３：３２４－３２９）。これらのモチーフは、ホスファターゼＳＨＩＰ－１及びβ－アレスチン２の動員を媒介し得（Ｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１４ ２８９：１７６４７－１７６５７；Ｌｉｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０１３ ２０：４５６－４６４）、したがって、ＴＩＧＩＴが本質的に抑制性シグナルを伝達して活性化シグナルを弱め得る機構を提供する。

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＩＧＩＴ発現の上方制御は、多くの種類のがん、例えば、肺（Ｔａｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ ７７：８５１－８６１）、食道（Ｘｉｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６ ７：６３６６９－６３６７８）、乳房（Ｇｉｌ Ｄｅｌ Ａｌｃａｚａｒ ＣＲ，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｋｏｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６ ２２：３０５７－６６）及び黒色腫（Ｃｈａｕｖｉｎ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５ １２５：２０４６－２０５８）で報告されている。ＡＭＬにおけるＴＩＧＩＴの発現増加は、患者の生存転帰の予後不良と関連している（Ｋｏｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６ ２２：３０５７－６６）。ＴＩＧＩＴシグナル伝達の上方制御は、がんに対する免疫寛容だけでなく、慢性ウイルス感染症に対しても重要な役割を果たす。ＨＩＶ感染中、Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴの発現は、有意に高く、ウイルス負荷及び疾患の進行と正の相関があった（Ｃｈｅｗ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，２０１６ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１２：ｅ１００５３４９）。さらに、ＴＩＧＩＴ受容体を単独で遮断するか、または他の遮断と組み合わせて、インビトロ及びインビボの両方で機能的に「疲弊した」Ｔ細胞を救済し得る（Ｃｈａｕｖｉｎ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５ １２５：２０４６－２０５８；Ｃｈｅｗ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，２０１６ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１２：ｅ１００５３４９；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１４ ２６：９２３－９３７）。がん及びウイルス感染の場合、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の活性化により免疫細胞の機能不全が促進され、がんの増殖またはウイルス感染の拡大につながる。治療剤によるＴＩＧＩＴ媒介抑制性シグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞の機能活性を回復させ、その結果、がんまたは慢性ウイルス感染に対する免疫力を強化し得る。

ＰＤ１またはＰＤＬ１のいずれかを標的とするモノクローナル抗体は、この相互作用をブロックし、がん細胞に対する免疫応答をブーストし得る。これらの抗体は、皮膚の黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、及びホジキンリンパ腫など、いくつかの種類のがんの治療に役立つことが示されている。単剤チェックポイント阻害剤に反応しないほとんどの患者のがん細胞は、がん細胞の増殖及び生存を可能にする生来の機構を通じて逃れる。その結果、疾患は自然史と一致する速度で進行する。しかし、本質的な耐性とは異なり、臨床試験の長期追跡調査の後、以前に臨床効果があった患者に遅発性再発が出現しており、獲得耐性の出現が示唆されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１８，９－１６ ２０１８）。

したがって、抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ１抗体を組み合わせると、免疫細胞を寛容から救済し、がんまたは慢性ウイルス感染症の処置において効率的な免疫応答を誘導し得る。

本開示は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて抗ＴＩＧＩＴ抗体を投与する、がんの処置方法に関する。

特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、配列番号３、４、５もしくは１３から選択されるアミノ酸配列を有する１つ、２つもしくは３つのＣＤＲ、または配列番号３、４、５、もしくは１３のアミノ酸配列における１つ以上の保存的置換、例えば、１つもしくは２つの保存的置換を含むそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び／あるいは配列番号６、７もしくは８から選択されるアミノ酸配列を有する１、２もしくは３つのＣＤＲ、または配列番号６、７、もしくは８のアミノ酸配列における１つ以上の保存的置換、例えば、１つもしくは２つの保存的置換を含むそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

より具体的な実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ－ＣＤＲ１、または１つ以上の保存的置換、例えば、１つもしくは２つの保存的置換を含むそのバリアント、配列番号４もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ－ＣＤＲ２、または１つ以上の保存的置換、例えば、１つもしくは２つの保存的置換を含むそのバリアント、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ－ＣＤＲ３、または１つ以上の保存的置換、例えば、１つまたは２つの保存的置換を含むそのバリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに／あるいは配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ－ＣＤＲ１、または１つ以上の保存的置換、例えば、１つまたは２つの保存的置換を含むそのバリアント、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ－ＣＤＲ２または１つ以上の保存的置換、例えば、１つまたは２つの保存的置換を含むそのバリアント、ならびに配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ－ＣＤＲ３または１つ以上の保存的置換、例えば、１つまたは２つの保存的置換を含むそのバリアントを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。

本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し得、配列番号９、１４、１９から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または配列番号９、１４、１９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列の違いはフレームワーク領域にある。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０、１５もしくは２０から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域またはそのバリアントを含む。

本出願の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し得、配列番号１１、１６、２１、もしくは２４から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または配列番号１１、１６、２１もしくは２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列の違いはフレームワーク領域にある。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２、１７もしくは２２から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域またはそのバリアントを含む。

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０^－９Ｍ～約１×１０^－１２ＭのＫｄ値でヒトＴＩＧＩＴに結合し得る。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０^－９Ｍ未満、約１×１０^－１０Ｍ未満、約１×１０^－１１Ｍ未満、または約１×１０^－１２Ｍ未満というＫｄ値でヒトＴＩＧＩＴに結合し得る。

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のサブクラスの重鎖定常領域またはそのバリアント、及びカッパもしくはラムダ型の軽鎖定常領域、またはそのバリアントを含む。より具体的な実施形態では、抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃまたはそのバリアント、例えば、配列番号１８のＦｃ領域である。

がんの処置方法であって、有効量の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与することを含む、方法。

ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合し、以下：
（ｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む有効量の抗体またはその抗原結合断片を、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて対象に投与することを含む、方法。

前記ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片が以下：
（ｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
（ｉｉｉ）配列番号９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１１を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む、方法。

前記抗ＰＤ１抗体が、ヒトＰＤ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、かつ以下：
（ａ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｄ）配列番号２８のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、方法。

前記抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＰＤ１に特異的に結合し、かつ配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、方法。

前記抗ＰＤ１抗体が、配列番号３５を含むＩｇＧ４定常ドメインを含む、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、方法。

前記抗ＰＤ１抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、方法。

前記がんが、乳癌、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫からなる群から選択される、方法。

前記小細胞肺癌が、限局型小細胞肺癌である、方法。

前記がんが、非小細胞肺癌である、方法。

前記頭頸部癌が、鼻咽頭癌である、方法。

前記食道癌が、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）である、方法。

前記がんが、子宮癌である、方法。

前記胃癌が、胃癌または胃食道接合部癌である、方法。

前記子宮頸癌が、再発性または転移性子宮頸癌である、方法。

前記皮膚癌が、基底細胞癌である、方法。

前記がんが、膵臓癌である、方法。

化学療法を施すことをさらに含む、方法。

前記化学療法が、化学放射線療法である、方法。

前記抗ＰＤ１抗体が、３週間ごとに２００ｍｇ投与される、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、５０ｍｇ～９００ｍｇの範囲で投与される、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに５０ｍｇ投与される、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに１５０ｍｇ投与される、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに４５０ｍｇ投与される、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに９００ｍｇ投与される、方法。

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに１８００ｍｇ投与される、方法。

ＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａ（上）及びＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１（下）の模式図。ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ：ＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン。Ｎ：Ｎ末端。Ｃ：Ｃ末端。 抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｖｈ（Ａ）及びＶｋ（Ｂ）領域の系統樹。候補抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶｈ及びＶｋ配列を、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用してアラインメントした。配列相同性は、系統樹で表示した。 抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｖｈ（Ａ）及びＶｋ（Ｂ）領域の系統樹。候補抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶｈ及びＶｋ配列を、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用してアラインメントした。配列相同性は、系統樹で表示した。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による精製マウス抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性測定。 フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴ結合の測定。 （Ａ）抗ＴＩＧＩＴｍＡｂによるＴＩＧＩＴ－リガンド相互作用の阻害を示す概略図。（Ｂ）ＴＩＧＩＴリガンド発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ＰＶＲまたはＨＥＫ２９３／ＰＶＲ－Ｌ２）への可溶性ＴＩＧＩＴ（ＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質）の結合をフローサイトメトリーによって測定した。ＴＩＧＩＴ－リガンド相互作用の遮断は、段階希釈した抗ＴＩＧＩＴ抗体を添加することによって定量的に測定した。結果は、二連の平均±ＳＤで示された。 抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂによるＣＭＶ特異的ヒトＴ細胞の活性化。ヒトＣＭＶペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、４９５－５０３）感作ＨＬＡ－Ａ２．１^＋ ＰＢＭＣ（４×１０^４）を、抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下、ＣＭＶペプチドパルス標的細胞ＨＣＴ１１６細胞（１０^４）で一晩刺激した。培養上清中のＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡにより測定した。すべての条件は、三連で行った。結果は平均値±ＳＤとして示した。 抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂは、ＮＫ細胞媒介細胞毒性を促進する。（Ａ）操作されたＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ－ＤＮＡＭ－１安定細胞株におけるＴＩＧＩＴ及びＤＮＡＭ－１の発現。（Ｂ）ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆ（０．００７－３０μｇ／ｍｌ）の存在下でのＳＫ－ＭＥＳ－１／ＰＶＲ細胞に対するＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ－ＤＮＡＭ－１細胞の死滅は実施例８に記載の乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによって測定された。結果は三連の平均±ＳＤで示す。 抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔは、ＦｃγＲ媒介トロゴサイトーシスを介してＴＩＧＩＴ受容体の表面発現を減少させる。Ｊｕｒｋａｔ／ＴＩＧＩＴ細胞を、ビオチン標識抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの存在下、完全培地中でＦｃγＲ発現 ＨＥＫ２９３細胞とともに一晩インキュベートした。場合によっては、トロゴサイトーシスに対するバルクのヒトＩｇＧの効果を測定するために１０％ヒトＡＢ血清を添加した。ＴＩＧＩＴ受容体の表面発現は、ＳＡ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色することによって決定した。ＭＦＩは、フローサイトメトリーによって測定した。すべてのデータポイントは二連であった。結果は平均値±ＳＤで示した。 ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＡＤＣＣ効果を示す。健康なドナー由来のＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ上のＴＩＧＩＴ発現をフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ４^＋（ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－）、ＣＤ８^＋Ｔエフェクター及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋）はすべて、有意なレベル（１８～４１％）のＴＩＧＩＴを発現した。示されているデータは、３人の健康なドナーからの代表的な結果である。 ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）または対照抗体（５μｇ／ｍＬのＯＫＴ３を陽性対照として、３０μｇ／ｍｌのｈｕＩｇＧを陰性対照として）の存在下で、４２時間、ＣＤ１６^＋ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖをエフェクター細胞として、及びＰＨＡ刺激ＰＢＭＣを標的細胞として使用して実行した、ＡＤＣＣアッセイである。ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇのパーセンテージを、フローサイトメトリーによって測定した。 ヒトＰＢＭＣに対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＣＤＣ効果を示す。ＣＤＣアッセイは、標的細胞としてＰＨＡ刺激ＰＢＭＣを使用し、補体の供給源として自己血清を使用して実行した。最終濃度１５％の自己血清中で、前活性化ＰＢＭＣと抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（０．０１～１００μｇ／ｍｌ）を３日間共培養した後、ＣＤＣのパーセンテージ（ｙ軸）をセルタイターグローアッセイによって測定し、実施例１１に記載のように計算した。ドナーＡ及びＢからのデータが示されている。ＨｕＩｇＧを、陰性対照として使用し、抗ＭＨＣ－Ａ、Ｂ、Ｃを陽性対照として使用した。 ５０ｍｇ～９００ｍｇの静脈内注入後のｈｕ１２１７－２－２の血清濃度の減少を示す。 ｈｕ１２１７－２－２が、単剤として、またはＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて、インビトロでＩＦＮ－γ分泌を促進することを示す。 ｈｕ１２１７－２－２がマウス神経膠腫モデルにおいて単一薬剤として腫瘍増殖を減少し得ることを実証している。 ＭＣ結腸癌のＴＩＧＩＴノックインマウスモデルにおける抗ＰＤ１抗体と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２の有効性を示す。

定義
アミノ酸の保存的アミノ酸置換は、当技術分野で一般に公知であり、以下の表に例示的に示されている。概して、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置換されていることを意味する。

本明細書の他の箇所で特に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含めて、本明細書で使用される場合、「１つの、ある（ａ：不定冠詞）」、「１つの、ある（ａｎ：不定冠詞）」、及び「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」などの単数形の単語は、文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、それらの対応する複数の言及を含む。

「または」という用語は、文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、「及び／または」という用語を意味するために使用され、「及び／または」と同義に使用される。

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通じて、文脈上別段の要求がない限り、「含む」という語、及び「含む」及び「含んでいる」などの変形は、記載されたアミノ酸配列、ＤＮＡ配列、ステップまたはそのグループを包含するものとし、ただし、他のアミノ酸配列、ＤＮＡ配列、ステップは除外されないことが理解される。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または場合によっては「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語に置き換えてもよい。

「ＴＩＧＩＴ」という用語には、様々な哺乳動物アイソフォーム、例えば、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＴＩＧＩＴのオルソログ、及びＴＩＧＩＴ内に少なくとも１つのエピトープを含む類似体が含まれる。ＴＩＧＩＴ、例えば、ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸配列、及びそれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＩ０１２８９を参照のこと）。

本明細書で使用される「投与」、「投与すること」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生体液への外因性医薬品、治療剤、診断剤、または組成物の接触を意味する。細胞の処置は、試薬の細胞への接触、ならびに試薬の流体への接触を包含し、ここでは流体が細胞と接触する。「投与」または「処置」という用語はまた、例えば、細胞の、試薬、診断、結合化合物による、または別の細胞による、インビトロ及びエクスビボ治療を含む。本明細書における「対象」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、及び最も好ましくはヒトを指す。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、抗原（例えば、ＴＩＧＩＴ）を認識する限り、抗体（全長モノクローナル抗体を含む）及び抗体断片を包含する。抗体は通常単一特異性であるが、イディオ特異性、異種特異性、または多重特異性と表現されてもよい。抗体分子は、特異的な結合部位によって、抗原上の特異的な抗原決定基またはエピトープに結合する。

本明細書では、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」という用語は、実質的に同種の抗体の集団を意味し、すなわち、その集団を構成する抗体分子は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いてアミノ酸配列が同一である。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物には通常、それらの可変ドメイン、特に異なるエピトープに特異的なことが多い相補性決定領域（ＣＤＲ）に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体が含まれている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるものとして抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９７５ ２５６：４９５－４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １９９２；Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８；及びＣｏｌｌｉｇａｎ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ １９９３を参照のこと。本明細書に開示されるｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のｍＡｂは、個々のハイブリドーマ由来の細胞をマウス（新鮮感作Ｂａｌｂ／ｃマウスなど）に腹腔内注射して、高濃度の所望のｍＡｂを含む腹水を産生するｉｎ ｖｉｖｏ産生によって得てもよい。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのＭＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、そのような腹水液または培養上清から精製され得る。

一般的に、基本的な抗体構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対を含み、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸長の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義し得る。通常、ヒトの軽鎖はカッパ軽鎖とラムダ軽鎖に分類される。さらに、ヒト重鎖は通常、α、δ、ε、γ、またはμとして分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭとして定義される。軽鎖及び重鎖内では、可変領域と定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合されており、重鎖にはさらに約１０個のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれている。

各軽鎖／重鎖（ＶＬ／ＶＨ）対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全な抗体には２つの結合部位がある。二機能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は一般に同じである。

通常、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれる３つの超可変領域を含み、これらは比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の間に位置する。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ－１（またはＦＲ１）、ＣＤＲ－１（またはＣＤＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＦＲ－３（またはＦＲ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３）、及びＦＲ－４（またはＦＲ４）を順に含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ． Ｐｒｏｔ． Ｃｈｅｍ．３２：１－７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ，（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の定義に従う。

「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメインのＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、及びＶＬ－ＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメインのＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、及びＶＨ－ＣＤＲ３）由来のアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列による抗体のＣＤＲ領域の定義）を参照のこと；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（構造による抗体のＣＤＲ領域の定義）もまた参照のこと。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という用語は、ＣＤＲ残基として本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。

他に示さない限り、「抗体断片」または「抗原結合断片」とは、抗体の抗原結合断片、すなわち、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片を意味する。抗原結合断片の例としては、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；例えば、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）；ナノボディ及び抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。

特定の標的タンパク質に特異性をもって結合する抗体とはまた、特定の標的タンパク質に特異的に結合するとも記載される。これは、抗体が他のタンパク質と比較してその標的に対して優先的な結合を示すが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要としないことを意味する。抗体は、例えば、偽陽性などの望ましくない結果を生じることなく、その結合がサンプル中の標的タンパク質の存在を決定する場合、その意図する標的に対して「特異的」であるとみなされる。本発明において有用な抗体またはその結合断片は、非標的タンパク質に対する親和性の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、及び最も好ましくは少なくとも１００倍の親和性で標的タンパク質に結合するであろう。本明細書における抗体は、所定のアミノ酸配列、例えば、成熟ヒトＴＩＧＩＴ分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合、そのポリペプチドに特異的に結合すると言われる。

「ｐＨ依存性結合」、「ｐＨ依存性標的結合」及び「ｐＨ依存性抗原結合」という表現は、本開示において交換可能であり、本出願の抗体がその標的／抗原、すなわちヒトＴＩＧＩＴに対して、ｐＨ依存した方式で結合することを示す。具体的には、本出願の抗体は、生理学的ｐＨ、例えば、ｐＨ７．４で、結合親和性及び／または結合シグナルと比較して、腫瘍微小環境で通常見られる弱酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ６．０でその抗原に対してより高い結合親和性及び／または結合シグナルを示す。本出願の抗体の結合親和性及び／または結合シグナルの強度を決定するための方法は、当技術分野で周知であり、これには、限定するものではないが、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）または同様の技術が挙げられる。より具体的には、本出願の抗体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）または同様の技術によって測定した場合、ｐＨ７．４／ｐＨ６．０で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上を超えるＫ_Ｄ比を有する。あるいは、またはさらに、本出願の抗体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）または同様の技術によって測定した場合、ｐＨ７．４でのＲｍａｘよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍高い、ｐＨ６．０のＲｍａｘ（ＲＵ）値を有する。抗体の結合親和性は２５℃または３７℃で測定され得る。腫瘍微小環境は、生理学的状態または正常組織よりも比較的酸性のｐＨを示すことがわかっている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ２０１０；Ｔａｎｎｏｃｋ ａｎｄ Ｒｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９）。したがって、上記ｐＨ依存性結合を有する本出願の抗体は、腫瘍微小環境におけるＴＩＧＩＴ陽性リンパ球を選択的に標的とし、末梢リンパ球活性化に伴う毒性が低い抗ＴＩＧＩＴ治療剤として有利である。

本明細書において「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマで産生される場合、マウスの糖鎖を含む場合がある。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」とは、それぞれマウスまたはラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）抗体及びヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態を意味する。このような抗体には、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列が含まれている。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体と親のげっ歯類抗体を区別するために必要な場合、接頭辞「ｈｕｍ」、「ｈｕ」、「Ｈｕ」または「ｈ」が、抗体クローンの名称に追加される。げっ歯動物抗体のヒト化型には、一般に、親げっ歯動物抗体と同じＣＤＲ配列を含むが、親和性の増大、ヒト化抗体の安定性の増大、または他の理由のために、特定のアミノ酸置換が含まれてもよい。

本出願の抗体は、がんの処置において潜在的な治療用途を有する。「がん」または「腫瘍」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を意味するか、または記述する。がんの例としては、限定するものではないが、肺癌（小細胞肺癌または非小細胞肺癌を含む）、副腎癌、肝臓癌、胃癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、膀胱癌、骨癌、脳癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、リンパ腫、卵巣癌、皮膚癌、甲状腺腫瘍、またはがんの転移病変が挙げられる。

さらに、本出願の抗体は、免疫寛容または「消耗」に機構的に関与するウイルス感染及び他のヒト疾患の制御において潜在的な治療用途を有する。本出願の文脈において、「消耗」という用語は、がんまたは慢性ウイルス感染症の間に応答する免疫細胞の能力の枯渇につながるプロセスを指す。

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の臨床症状のうちの少なくとも１つを処置するために対象に投与するときに、その疾患、障害、または症状に対してそのような処置を行うのに十分である抗体の量を指す。「治療有効量」とは、抗体、疾患、障害、ならびに／またはその疾患もしくは障害の症状、その疾患、障害の重症度、及び／または疾患もしくは障害の症状、治療される対象の年齢、及び／または治療される対象の体重と共に変化し得る。任意の所与の事例における適切な量は、当業者には明白である場合もあるし、または慣用的な実験によって決定してもよい。併用療法の場合、「治療有効量」とは、疾患、障害、または状態の効果的な処置のための併用から構成される活性剤の総量を指す。

本明細書において用いる場合、「対象」とは、哺乳動物、例えば、げっ歯類または霊長類、好ましくは高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載の障害を有するか、または有するリスクがある患者）である。

抗ＴＩＧＩＴ抗体
本開示は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体、抗原結合断片を提供する。さらに、本開示は、所望の薬物動態特性及び他の所望の属性を有し、したがって、がんの可能性を低減するために、またはがんを処置するために使用し得る抗体を提供する。本開示は、がん及び関連する障害の予防及び処置のために、抗体を含む薬学的組成物、ならびにそのような薬学的組成物を作製及び使用する方法をさらに提供する。

本開示は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。本開示の抗体または抗原結合断片としては、限定するものではないが、以下に記載されるように生成される抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。

本開示は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）は、配列番号９、１４、または１９のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。本開示はまた、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片も提供し、ここで前記抗体または抗原結合断片は、本明細書に提供されるＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。一態様では、本開示は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、ここで前記抗体は、本開示で提供されるＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、１、２、３またはそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（あるいはそれらから構成される）。

本開示は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号１１、１６、または２１のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本開示はまた、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片も提供し、ここで前記抗体または抗原結合断片は、本明細書に提供されるＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む。特に、本開示は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、前記抗体または抗原結合断片は、本開示の任意のＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（またはそれらからなる）。

本開示の他の抗体またはその抗原結合断片は、変異しているが、本明細書に記載の配列に示されているＣＤＲ領域においてＣＤＲ領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様では、提供される配列で開示されるＣＤＲ領域と比較した場合、ＣＤＲ領域において１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が変異している変異アミノ酸配列が含まれる。

本開示の他の抗体としては、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異している抗体が挙げられる；さらに、表５に記載の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する。いくつかの態様では、それは、実質的に同じ治療活性を保持しながら、本明細書に記載の配列に示される可変領域と比較した場合、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が可変領域で変異している、変異体アミノ酸配列を含む。

抗ＰＤ１抗体
本開示は、例えば、米国特許第８，７３５，５５３号に見られる抗ＰＤ１抗体を提供する。ＰＤ１抗体も本明細書で提供され、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号２５に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２６に記載のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７に記載のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号２８に記載のＬＣＤＲ１、配列番号２９に記載のＬＣＤＲ２、及び配列番号３０に記載のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。この抗体を本明細書では「ＢＧＢ－Ａ３１７」と呼ぶ。

別の実施形態では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合断片であって、ヒトＰＤ１に特異的に結合し、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。さらに別の実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、配列番号３５を含むＩｇＧ４定常ドメインを含む。

ＦＣ領域のフレームワークの更なる変更
さらに他の態様では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて抗体のエフェクター機能を改変することにより、Ｆｃ領域が改変される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原－結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えてもよい。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号（両方ともＷｉｎｔｅｒらによる）に記載されている。

別の態様では、抗体が改変されたＣ１ｑ結合及び／または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、１つ以上のアミノ酸残基が、１つ以上の異なるアミノ酸残基に置き換えられてもよい。このアプローチについては、例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号に記載されている。

さらに別の態様では、１つ以上のアミノ酸残基が変更され、それにより、抗体が補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、例えば、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１に記載される。特定の態様では、本開示の抗体またはその抗原結合断片の１つ以上のアミノ酸は、ＩｇＧ１サブクラス及びカッパアイソタイプについての１つ以上のアロタイプのアミノ酸残基によって置き換えられる。アロタイプのアミノ酸残基には、限定するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、ならびにＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂ．１：３３２－３３８（２００９）によって記述されるカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も含まれる。

別の態様では、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させるため、及び／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるために改変される。このアプローチは、例えば、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎの結合部位をマッピングしており、結合が改善されたバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４，２００１を参照のこと）。

さらに別の態様では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化抗体を作製し得る（すなわち、抗体はグリコシル化が欠如しているか、グリコシル化が低下している）。グリコシル化を変更して、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を高めてもよい。このような炭水化物の改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変更することによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を行って、それによってその部位でのグリコシル化を除去してもよい。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大し得る。このようなアプローチは、例えば、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されている。

さらに、または代わりに、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体など、変化したタイプのグリコシル化を有する抗体を作製し得る。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。このような炭水化物の改変は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が変化した細胞は当該技術分野で記載されており、組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用して、それによってグリコシル化が変化した抗体を産生し得る。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号は、そのような細胞株で発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化も生じるバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている（またＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照のこと）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞株で発現された抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造が増加し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加することを示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を発現するように操作された細胞株を記載している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０，１９９９も参照のこと）。

別の態様では、ＡＤＣＣの低減が所望される場合、ヒト抗体サブクラスＩｇＧ４は、多くの以前の報告において、適度なＡＤＣＣのみを有し、ＣＤＣエフェクター機能をほとんど有しないことが示された（Ｍｏｏｒｅ Ｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．２０１０ ＭＡｂｓ，２：１８１－１８９）。一方では、天然のＩｇＧ４は、酸性緩衝液中または昇温などのストレス条件において安定性が低いことが見出された（Ａｎｇａｌ，Ｓ．１９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５－１０８；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：９２６６－９２７３；Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。低減されたＡＤＣＣは、抗体を、ＦｃγＲ結合またはＣ１ｑ結合活性を低減するまたは無効にする変更の組み合わせによって操作されたＩｇＧ４に作動可能に結合し、それによってＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能を低減または排除することによって達成され得る。生物学的薬物としての抗体の物理化学的特性を考慮すると、ＩｇＧ４のより望ましくない内在的特性の１つは、溶液中におけるその２つの重鎖の動的分離によって半抗体を形成することであり、これによって、「Ｆａｂアーム交換」と呼ばれるプロセスを介してインビボで生成される二重特異性抗体が導かれた（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．２００７ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４－１５７）。２２８位（ＥＵ番号付けシステム）におけるセリンのプロリンへの変異は、ＩｇＧ４重鎖分離に対して阻害性と見えた（Ａｎｇａｌ，Ｓ．１９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０：１０５－１０８；Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。ヒンジ及びγＦｃ領域のアミノ酸残基の一部は、Ｆｃγ受容体との抗体相互作用に影響を与えることが報告された（Ｃｈａｐｐｅｌ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９０３６－９０４０；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ，９：１１５－１１９；Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：２６１３－２６２４；Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ，２０００ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：４４３－４４６；Ａｒｎｏｌｄ Ｊ．Ｎ．，２００７ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ ｉｍｍｕｎｏｌ，２５：２１－５０）。さらに、ヒト集団において稀に生じるいくつかのＩｇＧ４アイソフォームはまた、異なる物理化学的特性を誘発し得る（Ｂｒｕｓｃｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，２５：３４９－５５；Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０５：９－１９）。低いＡＤＣＣ及びＣＤＣ不安定性を有するＴＩＧＩＴ抗体を生成するために、ヒトＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃ領域を改変し、多数の変更を導入することが可能である。これらの改変ＩｇＧ４ Ｆｃ分子は、配列番号８３～８８、米国特許第８，７３５，５５３号に開示され見出され得る。

抗体産生
抗ＴＩＧＩＴ抗体及びその抗原結合断片は、組換え発現、化学合成、及び抗体四量体の酵素消化を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の手段によって産生し得るのに対し、全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生成によって得ることができる。組換え発現は、当該技術分野で公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞等に由来し得る。

本開示はさらに、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の相補性決定領域を含む重鎖もしくは軽鎖の可変領域またはセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９、１４、または１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの態様では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１、１６、または２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。

本開示のポリヌクレオチドは、抗ＴＩＧＩＴ抗体の可変領域配列をコードし得る。それらはまた、抗体の可変領域と定常領域の両方をコードし得る。ポリヌクレオチド配列のいくつかは、例示された抗ＴＩＧＩＴ抗体のうちの１つの重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他のいくつかのポリヌクレオチドは、マウス抗体の１つの重鎖及び軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。

本開示において、抗ＴＩＧＩＴ抗体を生成するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることが意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗ＴＩＧＩＴ抗体鎖または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、誘導条件の制御下にある場合を除いて、挿入された配列の発現を防止するために使用される。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物体の培養物は、発現産物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列のために集団を偏らせることなく、非誘導条件下で増殖させ得る。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片の効率的な発現のために必要とされ、または所望され得る。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接リボソーム結合部位または他の配列を含む。加えて、発現の効率は、使用中の細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって高めることができる（例えば、Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照のこと）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増大し得る。

抗ＴＩＧＩＴ抗体鎖を保有及び発現するための宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉは、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な１つの原核宿主である。使用に適した他の微生物宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、及び種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主において、発現ベクターを作製してもよく、これは典型的には、宿主細胞（例えば、複製起点）に適合する発現制御配列を含有する。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系等、多数の様々な周知のプロモーターが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列によって発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するための、リボソーム結合部位配列等を有する。酵母などの他の微生物も、抗－ＴＩＧＩＴポリペプチドを発現するために使用してもよい。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞もまた使用してもよい。

他の態様では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本開示の抗ＴＩＧＩＴポリペプチドを発現及び産生する。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、または外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株のいずれであってもよい。これらには、任意の正常な致死または正常または異常な不死の動物またはヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨＥＫ２９３細胞、骨髄細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌し得る多数の好適な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、概して、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９８７において考察される。哺乳動物宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９－６８，１９８６を参照のこと）、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含んでもよい。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、ステージ特異的、及び／または調節可能（ｍｏｄｕｌａｔａｂｌｅ）または調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）であり得る。有用なプロモーターとしては、限定するものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰポリＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーター等）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当該技術分野において公知のプロモーター－エンハンサーの組み合わせが挙げられる。

検出及び診断方法
本開示の抗体または抗原結合断片は、限定するものではないが、ＴＩＧＴの検出のための方法を含む様々な用途において有用である。一態様では、抗体または抗原結合断片が、生体試料中のＴＩＧＩＴの存在の検出に有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。特定の態様では、生体試料は、細胞または組織を含む。他の態様では、かかる組織は、他の組織と比較して高レベルでＴＩＧＩＴを発現する正常な組織及び／または癌性組織を含む。

一態様では、本開示は、生体試料中のＴＩＧＩＴの存在の検出方法を提供する。特定の態様では、本方法は、生体試料と、抗ＴＩＧＩＴ抗体とを、抗原に抗体が結合することを許容する条件下で接触させることと、複合体が、抗体と抗原との間で形成されるか否かを検出することと、を含む。生体試料としては、限定するものではないが、尿または血液試料が挙げられる。

ＴＩＧＩＴの発現に関連する障害を診断する方法も含まれる。特定の態様では、この方法は、試験細胞を抗ＴＩＧＩＴ抗体と接触させることと；抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴポリペプチドへの結合を検出することによって、試験細胞におけるＴＩＧＩＴの発現のレベル（定量的または定性的のいずれか）を決定することと；試験細胞における発現のレベルを対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞または非ＴＩＧＩＴ発現細胞）におけるＴＩＧＩＴ発現のレベルと比較し、ここで対照細胞と比較した試験細胞中のＴＩＧＩＴ発現のレベルが高いほど、ＴＩＧＩＴの発現に関連する障害の存在を示すことと、を含む。

処置の方法
本開示の抗体または抗原結合断片は、限定するものではないが、ＴＩＧＩＴ関連障害または疾患の処置方法を含む様々な用途において有用である。一態様では、ＴＩＧＩＴ関連障害または疾患はがんである。

一態様では、本開示は、がんの処置方法を提供する。特定の態様では、この方法は、有効量の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片を必要とする患者に投与することを含む。がんとしては、限定するものではないが、乳癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫が挙げられる。

本発明の抗体または抗原結合断片は、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所処置で所望の場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期であるか、または長期であるかに部分的に依存して、任意の適した経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によってもよい。限定するものではないが、様々な時点での単回または複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。

本発明の抗体または抗原結合断片は、良好な医療行為と一致する様式で、製剤化され、投薬され、及び投与されるであろう。この文脈における考慮の要因には、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理、及び医療従事者に公知の他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択で、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、及び上で考察される他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量、投与経路により、または本明細書に記載される投薬量の約１～９９％、または適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量で、かつ任意の経路によって、使用される。

疾患の予防または処置のため、本発明の抗体または抗原結合断片の適切な投与量は、処置される疾患の種類、抗体の種類、その疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴及び抗体への応答、ならびに主治医の判断に応じて異なる。抗体は好適には、１回で、または一連の処置にわたって患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの抗体が、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に依存する、数日間またはより長い日数にわたる反復投与について、処置は、一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。かかる用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎に（例えば、患者が抗体の約２～約２０回、または例えば、約６回用量を受容するように）投与されてもよい。最初により高い負荷用量、続いて１つ以上のより低い用量を投与してもよい。しかし、他の投薬レジメンが有用である場合もある。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

併用療法
一態様では、本開示のＴＩＧＩＴ抗体は、他の治療剤、例えば、抗ＰＤ１抗体と併用してもよい。本開示のＴＩＧＩＴ抗体とともに使用し得る他の治療剤としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：化学療法剤（例えば、パクリタキセルまたはパクリタキセル剤（例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドミド、５－アザシチジン、イホスファミド、オキサリプラチン、ペメトレキセド二ナトリウム、シクロホスファミド、エトポシド、デシタビン、フルダラビン、ビンクリスチン、ベンダムスチン、クロラムビル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、ミトキサントロン、ピセトレキセトリウム二ナトリウム）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ＭＧＣＤ２６５、ＲＧＢ－２８６６３８）、ＣＤ－２０標的化剤（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、ＲＯ５０７２７５９、ＬＦＢ－Ｒ６０３）、ＣＤ５２標的化剤（例えば、アレムツズマブ）、プレドニソロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドミド、Ｂｃｌ－２阻害剤（例えば、オブレメセンナトリウム）、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＭＬＮ８２３７、ＴＡＫ－９０１）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ＣＤ－１９標的化剤（例えば、ＭＥＤＩ－５５１、ＭＯＲ２０８）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＡＢＴ－３４８）、ＪＡＫ－２阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ０１８４２４）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、テムシロリムス、エベロリムス）、ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ）、ＥＴ－Ａ受容体アンタゴニスト（例えば、ＺＤ４０５４）、ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲ－２）アゴニスト（例えば、ＣＳ－１００８）、ＨＧＦ／ＳＦ阻害剤（例えば、ＡＭＧ１０２）、ＥＧＥＮ－００１、ポロ様キナーゼ１阻害剤（例えば、ＢＩ６７２）。

本開示のＴＩＧＩＴ抗体は、他の治療剤、例えば、抗ＰＤ１抗体と併用してもよい。抗ＰＤ１抗体としては、限定するものではないが、米国特許第８，７３５，５５３号に開示されている抗体が挙げられる。メルク社が開示したペムブロリズマブ（旧名ＭＫ－３４７５）は、分子量約１４９ｋＤａのヒト化ＩｇＧ４－Ｋ免疫グロブリンであり、ＰＤ１受容体を標的とし、ＰＤ１受容体リガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の結合を阻害する。ペムブロリズマブは、転移性黒色腫及び転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の適応症について承認されており、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）及び難治性ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の処置について臨床研究中である。ニボルマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社によって開示されているもの）は、完全ヒトＩｇＧ４－Ｋモノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）は、米国特許第８，００８，４４９号及び国際公開第２００６／１２１１６８号に開示されている。ニボルマブは、黒色腫、肺癌、腎臓癌、及びホジキンリンパ腫の処置について承認されている。

薬学的組成物及び製剤
また、抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくは抗原結合断片、または抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくは抗原結合断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、医薬製剤を含む組成物も提供される。特定の実施形態では、組成物は、ＴＩＧＩＴに結合する１つ以上の抗体もしくは抗原結合断片、またはＴＩＧＩＴに結合する１つ以上の抗体もしくは抗原結合断片をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野で周知である、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤などの好適な担体をさらに含んでもよい。

本明細書に記載されるＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片の薬学的製剤は、所望される程度の純度を有するそのような抗体または抗原結合断片と、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体とを混合すること（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））によって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、これには以下を含むが、これらに限定されない：リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンコース、またはデキストリンを含む他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体としてはさらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの間質性薬物分散剤が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許第７，８７１，６０７号及び２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載される製剤を含み、後者の製剤は、ヒスチジン－アセテート緩衝液を含む。

持続放出製剤を調製し得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。

インビボ投与のために使用される製剤は、一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成され得る。

医薬組成物及びキット
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化される、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む組成物、例えば、薬学的に許容される組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、生理学的に適合性である任意のかつすべての溶媒、分散媒体、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。賦形剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適であり得る。

本明細書の組成物は、様々な形態であってもよい。これらとしては、例えば、液体溶液（例えば、注射及び注入溶液）、分散液または懸濁液、リポソーム、及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。好適な形態は、意図される投与様式及び治療的適用に依存する。典型的な好適な組成物は、注射液または注入液の形態である。１つの好適な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。いくつかの実施形態では、抗体は、静脈内の注入または注射によって投与される。特定の実施形態では、抗体は、筋肉内または皮下の注射によって投与される。

実施例１：抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の生成
抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、若干の変更を加えた従来のハイブリドーマ融合技術（ｄｅ Ｓｔ Ｇｒｏｔｈ ａｎｄ Ｓｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，１９８０ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１；Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ，２００７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７８：１）に基づいて生成した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイにおいて高い結合活性を有するｍＡｂを、さらなる特徴付けのために選択した。

免疫化及び結合アッセイ用のＴＩＧＩＴ組換えタンパク質
全長ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号１）をコードするｃＤＮＡは、そのＧｅｎＢａｎｋ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿１７３７９９）に基づいて、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）によって合成され、そこから購入された。配列番号１のアミノ酸（ＡＡ）１～１４１に対応する全長ヒトＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のコード領域を、ＰＣＲ増幅して、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインまたはヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのいずれかに融合されたＣ末端を有するｐｃＤＮＡ３．１ベースの発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングし、これにより、それぞれ、２つの組換え融合タンパク質発現プラスミド、ＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａ及びＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１を得た。ＴＩＧＩＴ融合タンパク質の概略図を図１に示す。組換え融合タンパク質の生産のために、ＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａ及びＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１プラスミドを２９３Ｇ細胞（自社開発）に一時的にトランスフェクトし、回転シェーカーを装備したＣＯ_２インキュベーターで７日間培養した。組換えタンパク質を含む上清を収集し、遠心分離によって除去した。ＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａ及びＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１は、プロテインＡカラム（カタログ番号：１７１２７９０１、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。ＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａタンパク質とＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１タンパク質の両方を、リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に対して透析し、少量のアリコートとして－８０℃の冷凍庫に保存した。

安定発現細胞株
全長ヒトＴＩＧＩＴ（ｈｕＴＩＧＩＴ）またはサルＴＩＧＩＴ（ｍｋＴＩＧＩＴ、アクセッション番号：ＸＭ＿００５５４８１０１．２）を発現する安定した細胞株を樹立するために、ＴＩＧＩＴ遺伝子（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａで合成）をレトロウイルスベクターｐＦＢ－Ｎｅｏ（カタログ：２１７５６１，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）にクローニングした。デュアルトロピックレトロウイルスベクターは、以前のプロトコールに従って生成した（Ｚｈａｎｇ Ｔ，ｅｔ ａｌ．２００５，Ｂｌｏｏｄ）。ｈｕＴＩＧＩＴ及びｍｋＴＩＧＩＴを含むベクターを、それぞれＪｕｒｋａｔ細胞及びＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に形質導入し、細胞株Ｊｕｒｋａｔ／ｈｕＴＩＧＩＴ及びＮＫ９２ＭＩ／ｍｋＴＩＧＩＴを生成した。高発現細胞株は、Ｇ４１８を含む培地での培養及びＦＡＣＳ結合アッセイによって選択した。

免疫化、ハイブリドーマ融合及びクローニング
８～１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ＨＦＫ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を、１０μｇのＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａ及び水溶性アジュバントを含む１００μＬの抗原混合物で腹腔内（ｉｐ）免疫した（カタログ：ＫＸ０２１００４１，ＫａｎｇＢｉＱｕａｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）。この手順を３週間後に繰り返した。２回目の免疫の２週間後、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって、マウス血清のＴＩＧＩＴ結合を評価した。血清スクリーニングの１０日後、最も高い抗ＴＩＧＩＴ抗体血清力価を有するマウスを、５０μｇのＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって追加免疫した。追加免疫の３日後、脾細胞を単離し、標準技術（Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ，１９７７ ３（２）：２３１－６）を使用して、マウス骨髄腫細胞株であるＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ）に融合させた。

ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる抗体のＴＩＧＩＴ結合活性の評価
ハイブリドーマクローンの上清は、最初に、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）３７８：３３－５２に記載されているように、いくつかの修正を加えた、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。簡単に説明すると、ＴＩＧＩＴ－ｈｕＩｇＧ１タンパク質を、９６ウェルプレートにコーティングした。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ：７０７６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）及び基質（カタログ：００－４２０１－５６，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して、波長４５０ｎｍで発色吸光度シグナルを生成し、これは、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して測定した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、上記のＮＫ９２ＭＩ／ｈｕＴＩＧＩＴ細胞またはＮＫ９２ｍｉ／ｍｋＴＩＧＩＴ細胞のいずれかを使用するＦＡＣＳによってさらに検証した。ＴＩＧＩＴ発現細胞（１０^５細胞／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清とともにインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ－６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ：Ａ０４７３、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎａ）と結合させた。フローサイトメーター（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して細胞の蛍光を定量した。

ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳスクリーニングの両方で陽性シグナルを示したハイブリドーマからの馴化培地を機能アッセイに供し、ヒト免疫細胞ベースのアッセイで良好な機能活性を持つ抗体を同定した（以下のセクションを参照のこと）。所望の機能活性を有する抗体をさらにサブクローニングして、特徴付けた。

ハイブリドーマのサブクローニングと無血清培地または低血清培地への適応
上述のＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及び機能アッセイによる一次スクリーニングの後、陽性ハイブリドーマクローンを限界希釈法によりサブクローニングした。各プレートからのＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳスクリーニングに基づいて３つの陽性サブクローンを選択し、機能アッセイによって特徴付けした。機能アッセイを通じて検証された上位の抗体サブクローンは、３％のＦＢＳを含むＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ：ＳＨ３０８０１．０２，Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）での増殖に適応された。

モノクローナル抗体の発現及び精製
抗体発現プラスミド（カタログ番号Ｒ７９００７，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一時的にトランスフェクトされたハイブリドーマ細胞または２９３Ｇ細胞を、ＣＤＭ４ＭＡｂ培地（カタログ：ＳＨ３０８０１．０２，Ｈｙｃｌｏｎｅ）またはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（カタログ：１２３３８０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかで培養し、ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で５～７日間インキュベートした。馴化培地を、遠心分離によって収集し、精製前に０．２２μｍ膜を通すことによって濾過した。製造業者のガイドに従って、上清を含むマウスまたは組換え抗体を、プロテインＡカラム（カタログ：１７１２７９０１，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、結合させた。通常、この手順により９０％以上の純度の抗体が得られた。プロテインＡアフィニティー精製した抗体を、ＰＢＳに対して透析するか、またはＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ：１７５３１８０１，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製して凝集体を除去した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。最終的な抗体調製物は、アリコートに分けて－８０℃の冷凍庫に保存した。

実施例２：ＴＩＧＩＴ抗体のクローニング及び配列分析
製造業者のプロトコールに基づいて、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡキット（カタログ：７４１０４，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マウスハイブリドーマクローンを収集し、全細胞ＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号：１８０８０－０５１）を使用して合成し、マウスｍＡｂの重鎖可変領域（Ｖｈ）及びカッパ鎖可変領域（Ｖｋ）をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅を、ＰＣＲキット（カタログ：ＣＷ０６８６，ＣＷＢｉｏ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を使用して実行した。Ｖｈ及びＶｋの抗体ｃＤＮＡクローニングに使用したオリゴプライマーは、以前に報告された配列（Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７：４６１）に基づいて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）によって合成された。次に、ＰＣＲ産物をｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（カタログ：Ｃ Ｂ１０１－０２、ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｃｈｉｎａ）にサブクローニングし、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）によって配列決定した。Ｖｈ及びＶｋ領域のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列決定結果から推定された。

マウスｍＡｂは、配列相同性を比較することによって分析され、配列類似性に基づいてグループ化された（図２Ａ～Ｂ）。相補的決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ及びＫａｂａｔ １９７０ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１－２５０）及びＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ １９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：２０９－２１２）システム（配列アノテーション及びＩＭＧＴウェブサイトにおけるインターネットベースの配列分析による）に基づいて定義された。代表的なトップクローンｍｕ１２１７（Ｖｈ及びＶｋ）のアミノ酸配列を表１に列挙した（配列番号９及び１１）。ｍｕ１２１７のＣＤＲ配列を表２に列挙した（配列番号３～８）。

実施例３：ＳＰＲによる精製マウス抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性測定
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにおいて高い結合活性を有し、ならびに細胞ベースのアッセイ（実施例１及び２に記載）において強力な機能活性を有するＴＩＧＩＴ抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ－２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＳＰＲアッセイによってその結合動態について特徴付けられた。簡単に説明すると、抗ヒトＩｇＧ抗体を活性化されたＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号：ＢＲ１００５３０，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に固定した。ヒトＦｃタグ付きＴＩＧＩＴを、チップ表面に流し、抗ヒトＩｇＧ抗体によって捕捉した。次に、精製マウス抗体の段階希釈（０．１２ｎＭ～１０ｎＭ）をチップ表面に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって、結合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算した。ｍｕ１２１７、ｍｕ１２５７、ｍｕ１２２６、及びｍｕ２４２を含む上位ｍＡｂの結合親和性プロファイルを、図３及び表３に示した。

実施例４：マウス抗ヒトＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ｍｕ１２１７のヒト化
ｍＡｂのヒト化及び操作
ｍｕ１２１７のヒト化については、ＩＭＧＴのヒト免疫グロブリン遺伝子データベースとの比較を実行することにより、ヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子でｍｕ１２１７ 可変領域のｃＤＮＡ 配列と高い相同性を共有する配列を検索した。ヒト抗体レパートリーに高頻度で存在し（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０６：２０２１６－２０２２１ ２００９）、ｍｕ１２１７との相同性が高いヒトＩＧＶＨ遺伝子及びＩＧＶＫ遺伝子を、ヒト化のテンプレートとして選択した。

ヒト化は、ＣＤＲグラフティング（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ ２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）によって実行して、ヒト化抗体（ｈｕ１２１７ｓ）は、社内で開発された発現ベクターを使用してヒトＩｇＧ１ｍｆフォーマットとして操作された。ヒト化の最初のラウンドでは、フレームワーク領域のマウスからヒトのアミノ酸残基への変異は、シミュレートされた３Ｄ構造によって誘導され、ＣＤＲの標準構造を維持するために構造的に重要なマウスのフレームワーク残基は、ヒト化抗体１２１７の最初のバージョン（ｈｕ１２１７－１－１、配列番号３、１３、５（重鎖ＣＤＲ）及び配列番号６、７、８（軽鎖ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ、配列番号１４のアミノ酸配列を有し、配列番号１５の塩基配列によりコードされる重鎖可変領域、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を有し、配列番号１７のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域を有する）で保持された。具体的には、ｍｕ１２１７Ｖκ（配列番号６～８）のＣＤＲを、１つのマウスフレームワーク残基（Ｖ_５８）を保持したヒト生殖系列可変遺伝子ＩＧＶκ３－１５のフレームワークに移植し、その結果、Ｈｕ１２１７－１－１（アミノ酸配列は配列番号１６、ヌクレオチド配列は配列番号１７）のヒト化Ｖκ配列が得られた。ｍｕ１２１７ＶｈのＨ－ＣＤＲ２（配列番号４）、Ｈ－ＣＤＲ１及びＨ－ＣＤＲ３（配列番号３及び５）のＮ末端を、２つのマウスフレームワーク（配列番号１０のＴ_２４及びＩ_３７）残基が保持されたヒト生殖系列可変遺伝子ＩＧＶＨ３－７のフレームワークに移植した。ｈｕ１２１７ヒト化バリアントでは、シミュレーションされた３Ｄ構造によれば、Ｎ末端半分のみが抗原結合に重要であると予測されたため、Ｋａｂａｔ Ｈ－ＣＤＲ２のＮ末端半分のみが移植された。Ｈｕ１２１７－１－１の得られたヒト化Ｖｈ配列のアミノ酸配列を配列番号１４に、及びヌクレオチド配列を配列番号１５にそれぞれ示す。

Ｈｕ１２１７－１－１は、簡単に適応できるサブクローニング部位を有する、それぞれＩｇＧ１ｍｆ（配列番号１８）およびカッパ鎖と呼ばれるヒトＩｇＧ１バリアントの定常領域を含む自社開発の発現ベクターを使用して、ヒト全長抗体フォーマットとして構築された。ｈｕ１２１７－１－１抗体の発現及び調製は、上記２つの構築物を２９３Ｇ細胞に同時トランスフェクションすることによって、及びプロテインＡカラム（カタログ：１７５４３８０２，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製することによって、達成された。精製した抗体を、ＰＢＳ中で０．５～５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、アリコートに分けて－８０℃の冷凍庫に保存した。

ｈｕ１２１７－１－１テンプレートに基づいて、Ｖκのフレームワーク領域に保持されているマウス残基を、Ｖκ及びＴ２４ＡのＶ５８Ｉ及びＩ３７ＶＶｈを含む、対応するヒト生殖系列残基に変換するいくつかの単一変異を作成した。得られたｈｕ１２１７－２Ａ－１（Ｔ２４Ａ）、ｈｕ１２１７－２Ｂ－１（Ｉ３７Ｖ）、及びｈｕ１２１７－１－２ａ（Ｖ５８Ｉ）はすべて、ｈｕ１２１７－１－１に対して同様の結合活性及び機能活性を有していた。すべてのヒト化変異は、特定の位置に変異を含むプライマーと部位特異的変異誘発キット（カタログ番号ＦＭ１１１－０２，ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を使用して作成された。望ましい変異は、配列分析によって確認された。これらのｈｕ１２１７由来のバリアント抗体は、前述のように結合アッセイ及び機能アッセイで試験された。

Ｈｕ１２１７抗体は、ＣＤＲ及びフレームワーク領域に変異を導入することによってさらに操作され、ヒトでの治療用途のために分子及び生物物理学的特性を改善した。機能的活性を維持しながら、アミノ酸組成、熱安定性（Ｔ_ｍ）、表面疎水性、及び等電子点（ｐＩ）を考慮する必要がある。

まとめると、ヒト化モノクローナル抗体のよく設計されたバージョン、ｈｕ１２１７－２－２（配列番号：３、５～８、１３、及び１９～２１）は、上記の変異プロセスに由来し、詳細に特徴づけられた。この結果、ｈｕ１２１７－２－２とｈｕ１２１７－１－１の両方が、結合親和性及び機能活性、ＴＩＧＩＴ媒介下流シグナル伝達の阻害などにおいて非常に類似していることが示された。

アフィニティー測定では、抗体を抗ヒトＦｃ表面によって捕捉し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づくアフィニティーアッセイに使用した。ＳＰＲにより決定された抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合プロファイルの結果を表４にまとめた。Ｈｕ１２１７－２－２及びｈｕ１２１７－１－１は、ｃｈ１２１７のものに近い、それぞれ０．４１５ｎＭと０．２６６ｎＭの平均解離定数で非常に類似した結合プロファイルを示した。

上に示したすべてのヒト化抗体は、健康なドナーから単離された一次ヒト免疫細胞に対する機能活性についても確認された（実施例７に記載）。

実施例５：天然のＴＩＧＩＴに対する異なるバージョンの１２１７の結合活性
生細胞上の天然のＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合活性を評価するために、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するようにＮＫ９２ｍｉ細胞を操作した。生きているＮＫ９２ｍｉ／ＴＩＧＩＴ細胞を９６ウェルプレートに播種し、抗ＴＩＧＩＴ抗体の一連の希釈物とともにインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、二次抗体として使用し、細胞表面に対する抗体結合を検出した。ヒト天然ＴＩＧＩＴへの用量依存的結合のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて用量反応データを４パラメータロジスティックモデルに適合させることによって決定した。図４Ａ～Ｂ及び表６に示すように、両方のヒト化１２１７抗体、ｈｕ１２１７－１－１及びｈｕ１２１７－２－２は、生細胞上の天然のＴＩＧＩＴに対して良好な結合親和性を示した。

実施例６：抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴとそのリガンドＰＶＲ及びＰＶＲ－Ｌ２との相互作用をブロックする
ＴＩＧＩＴは、ＣＤ２６６－ＰＶＲ相互作用と競合し得る、高い親和性（Ｋｄ：約１ｎＭ）でＰＶＲに結合する（Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：４８－５７）。

抗ＴＩＧＩＴ抗体がＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ及びＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ－Ｌ２相互作用をブロックし得るか否かを確認するために、高レベルのＰＶＲまたはＰＶＲ－Ｌ２を発現するようにＨＥＫ２９３細胞を操作した。得られた細胞株を、それぞれＨＥＫ２９３／ＰＶＲ及びＨＥＫ２９３／ＰＶＲ－Ｌ２と名付けた。可溶性ＴＩＧＩＴ（ＴＩＧＩＴ－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質）のＰＶＲまたはＰＶＲ－Ｌ２への結合をフローサイトメトリーによって測定した（図５Ａ）。ＴＩＧＩＴ－リガンド相互作用の遮断は、段階希釈した抗ＴＩＧＩＴ抗体を添加することによって定量的に測定された。図５Ｂに示すように、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、かつｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆと同じＶＨ配列及びＶＬ配列を有するヒト化バージョン）及びｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆは、それぞれ０．６４及び０．５５μｇ／ｍＬのＩＣ_５０で、用量依存的にＰＶＲへのＴＩＧＩＴ結合をブロックし得る。同様に、ＴＩＧＩＴ－ＰＶＲ－Ｌ２相互作用の遮断におけるｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１及びｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆのＩＣ_５０は、それぞれ０．２５及び０．１８μｇ／ｍＬである。

実施例７：抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＣＭＶ特異的ヒトＴ細胞の活性化
ＴＩＧＩＴ抗体の機能活性は、ヒトＣＭＶ ＰＰ６５ペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、４９５－５０３，ＨＬＡ－Ａ２．１制限）を認識する天然由来のＴ細胞を使用してさらに評価された（Ｂｏｅｃｋｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：１６７３－８０）。簡単に説明すると、ＨＬＡ－Ａ２．１^＋健常ドナー由来のＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ中でＰＰ６５ペプチド（純度＞９８％、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｈａｎｇｈａｉによって合成）を用いて１週間シミュレートした。ｐｐ６５でプライミングされたＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。アッセイの前に、標的細胞であるＨＣＴ１１６細胞（ＨＬＡ－Ａ２．１^＋、１０^４）をｐｐ６５ペプチド（５μｇ／ｍＬ）で３０分間パルスし、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはブランク対照（培地のみ）の有無のもとで、９６ウェルプレート中で一晩、同数のｐｐ６５感作ＰＢＭＣと共培養した。図６Ａ～Ｂに示すように、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１は、両方のドナーについて、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の細胞培養上清中へのＩＦＮ－γの分泌を用量依存的に促進した。

実施例８：抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＮＫ細胞媒介細胞毒性を増強した
ＴＩＧＩＴは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で比較的高いレベルで構成的に発現されることが公知であり、ＴＩＧＩＴとそのリガンドとの間の相互作用は、ＮＫ細胞媒介細胞毒性を阻害する（Ｗａｎｇ Ｆ，ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５：２８８６－９７；Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１７８５８－６３）。

ヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体がＮＫ媒介細胞毒性を促進し得るか否かを確認するために、ＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩを、以前に記載されたプロトコール（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：５９２７－５９３３）に従って、レトロウイルス形質導入によってエフェクター細胞としてＴＩＧＩＴ受容体とＤＮＡＭ－１受容体の両方を同時発現するように操作した（ＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ－ＤＮＡＭ－１）。ＰＶＲ発現肺癌細胞株ＳＫ－ＭＥＳ－１／ＰＶＲも同様に標的として樹立させた。

ＳＫ－ＭＥＳ－１／ＰＶＲ細胞に対するＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ－ＤＮＡＭ－１細胞の細胞毒性は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用したＬＤＨ放出アッセイによって測定した。簡単に説明すると、ＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ－ＤＮＡＭ－１細胞（８×１０^５）を、抗ＴＩＧＩＴ Ａｂ（０．００７～３０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ＳＫ－ＭＥＳ－１／ＰＶＲ細胞（２×１０^４）と、９６ウェルＶ底プレート中で５時間共培養した。ＬＤＨ放出アッセイ。特異的溶解は、次の方程式を使用して決定された：特異的溶解のパーセンテージ＝［（実験－エフェクターの自発性－標的の自発性）／（標的の最大値－標的の自発性）］×１００。結果は、抗ＴＩＧＩＴ抗体ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆが用量依存的にＮＫ細胞死滅を増強することを示した（ＥＣ_５０：０．１８５μｇ／ｍＬ）（図７Ａ～Ｂ）。

実施例９：抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＦｃγＲ媒介トロゴサイトーシスを介してＴＩＧＩＴ受容体の表面発現を減少し得る。
トロゴサイトーシスは、細胞表面分子がドナー細胞からアクセプター細胞に移動する現象である（Ｊｏｌｙ Ｅ，ｅｔ ａｌ．２００３ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｍａｃｈｌｅｎｋｉｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；Ｂｅｕｍ ＰＶ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｒｏｓｓｉ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｂｌｏｏｄ）。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を介した抗体誘導性トロゴサイトーシスは、細胞表面上の受容体の下方調節を引き起こす（Ｃａｒｌｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；Ｂｅｕｍ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。したがって、トロゴサイトーシスによる標的受容体のダウンレギュレーションは、シグナル伝達の減衰を引き起こし得る。これらの観察を考慮すると、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１が、ＦｃγＲ^＋細胞の存在下でＴＩＧＩＴ受容体のトロゴサイトーシスを誘導することが可能であり、その結果、表面発現が低下し得る。この可能性に対処するために、Ｊｕｒｋａｔ／ＴＩＧＩＴ細胞を、様々なＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８を含む）を発現するＨＥＫ細胞とともに、ビオチン標識ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔ（ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆ及び野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域と同じＶＬ及びＶＨ配列を含むヒト化抗体）またはｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆを用いて、一晩インキュベートした。ＴＩＧＩＴ受容体の表面発現は、ＳＡ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて決定した。図８に示すように、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆではなく、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１は、陰性対照ヒトＩｇＧ処理細胞と比較してＴＩＧＩＴ表面発現の有意な減少を引き起こし、これは、Ｊｕｒｋａｔ／ＴＩＧＩＴ細胞上の表面ＴＩＧＩＴの減少がＦｃγＲ結合依存性であることを示している。さらに、１０％ヒト血清（高レベルの内因性ＩｇＧを含む）の存在は、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１－またはＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８－を部分的に減少させ得るが、ＦｃγＲＩＩＢを介したＴＩＧＩＴ受容体のトロゴサイトーシスは減少させず、ＦｃγＲＩＩＢが、インビボでの抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（例えば、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔ）によるＴＩＧＩＴ表面発現を減少させる重要な役割を果たし得ることを示唆している。これらの観察は、以前の発見とも一致している（Ｇａｎｅｓａｎ ＬＰ，ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９：４９８１－８；Ｔａｙｌｏｒ ＲＰ，ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｂｌｏｏｄ １２５：７６２－６）。

実施例１０：抗ＴＩＧＩＴ抗体のＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能
抗ＴＩＧＩＴ抗体がヒト初代ＰＢＭＣにおいてＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘導する能力を、以下に記載するインビトロアッセイを使用して決定した。

ヒトＰＢＭＣを標的細胞として使用するＡＤＣＣ
ＴＩＧＩＴ抗体がＴＩＧＩＴ^＋Ｔ細胞でＡＤＣＣを誘導し得るか否かを決定するために、フローサイトメトリーに基づくＡＤＣＣアッセイを設定した。アッセイエフェクター細胞株であるＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞は、ＣＤ１６_Ｖ１５８（Ｖ１５８対立遺伝子）及びＦｃＲγｃＤＮＡを含む発現プラスミドを同時導入することによって、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ）から生成した。健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激して、ＴＩＧＩＴ発現を上方制御した。図９Ａに示すように、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及び制御因子Ｔ細胞（ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋）を含むＴ細胞はすべて、有意な量のＴＩＧＩＴを発現した。これらの活性化ＰＢＭＣ（３人の健康なドナー由来）を標的細胞として使用した。蛍光色素ＣＦＳＥ標識ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞（５×１０^４）を、ＴＩＧＩＴ抗体（ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆまたはｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔ、３０μｇ／ｍＬ）または対照抗体（陽性対照抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または陰性対照ヒトＩｇＧ、３０μｇ／ｍＬ）の存在下で、４０時間、同数の標的細胞と共培養した。ヒトＩｇＧ及びｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆと比較して、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔは、ＡＤＣＣを介してＴｒｅｇを中程度に減少させる可能性がある。しかし、総Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞では有意なＡＤＣＣ効果は観察されなかった（図９Ｂ）。

ヒトＰＢＭＣを標的細胞として使用するＣＤＣ
ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆ及びｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔがＣＤＣを引き起こすか否かは、事前に活性化されたヒトＰＢＭＣと健康なドナーからの新鮮な自己血清を使用して決定した。ＣＤＣによる細胞溶解は、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）によって測定した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣを、ＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）で３日間事前活性化した後、ＲＰＭＩ１６４０と自己血清（１５％）及び抗ＴＩＧＩＴまたは対照抗体（０．０１～１００μｇ／ｍＬ）中で、３７℃で一晩インキュベートした。ＣＤＣによる細胞死は、反応終了時の細胞溶解後に生細胞から放出されるＡＴＰの減少によって評価した。抗ＭＨＣ－Ｉ Ａ、Ｂ、Ｃを、陽性対照として使用した。蛍光の読み取りは、９６ウェル蛍光光度計（ＰＨＥＲＡ Ｓｔａｒ ＦＳ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して実行して、ＣＤＣ活性は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）の読み取り値から以下のように計算した：％ＣＤＣ活性＝［（ＲＦＵ試験－ＲＦＵバックグラウンド）／（全細胞溶解時のＲＦＵ－ＲＦＵバックグラウンド）］×１００。実験結果によって、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｍｆ及びｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１ｗｔの両方が、２人の異なるドナーから単離されたＰＢＭＣで検出可能なＣＤＣを持たないことが実証された。対照的に、陽性対照抗体である抗ＭＨＣ－Ｉは、有意なＣＤＣ活性を誘導する（図１０）。

実施例１１：Ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１のｐＨ依存性結合親和性
ｐＨがｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１の結合特性に影響を与えるか否かを調べるために、比較のためにｐＨ７．４及びｐＨ６．０のランニングバッファーで標的結合ＳＰＲ試験を実行した。抗体ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１を、ＣＭ５チップ（ＧＥ）に固定した。ＴＩＧＩＴ－ｈｉｓの段階希釈物を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０のランニングバッファーＨＢＳ中に固定されたｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１上に流した。

以下の表７に列挙した結果が示すように、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１は、ｐＨ７．４（生理的ｐＨ）で得られたデータと比較した場合、ｐＨ６．０（腫瘍微小環境のｐＨに類似した酸性ｐＨ）でヒトＴＩＧＩＴに対してより高い結合親和性（ＫＤ）及びより強い結合シグナル（Ｒｍａｘ）を示した。これらの結果によって、ｈｕ１２１７－２－２／ＩｇＧ１が腫瘍微小環境内のＴＩＧＩＴ陽性リンパ球をより選択的に標的としながら、末梢リンパ球の活性化に関連する潜在的な毒性が低い可能性があるので、腫瘍環境内のＴＩＧＩＴ陽性リンパ球を標的とする治療剤としての抗体の潜在的な利点が示される。

実施例１２：ｈｕ１２１７－２－２抗体の毒性学
抗体ｈｕ１２１７－２－２は、ＣＤ３＋ヒト末梢血単核細胞と比較して（ＥＣ５０はそれぞれ４８．８ｎｇ／ｍｌ対６３．２ｎｇ／ｍｌ）、ヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウス由来のＣＤ３＋脾細胞を用いたＴＩＧＩＴ受容体占有アッセイにおいて、匹敵する結合親和性を示した。さらに、ｈｕ１２１７－２－２は、毎週の腹腔内投与による０．４ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、ヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスにおいてＧＬ２６１腫瘍増殖の有意な阻害を示した。

ｈｕ１２１７－２－２の毒性及び安全性プロファイルは、ヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスにおける４週間の反復投与毒性研究及びカニクイザルにおける１３週間の反復投与毒性研究で特徴付けられた。ｈｕ１２１７－２－２は、皮下ＭＣ－３８腫瘍を有するヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスにおける４週間の反復投与研究でも評価された。カニクイザルは、ｈｕ１２１７－２－２の標的配列相同性及び種間ＴＩＧＩＴ結合活性に基づいて、毒性研究に関連する種と考えられた。

ｈｕ１２１７－２－２を、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇで２週間に１回、１３週間反復投与したサルでは明らかな毒性は認められなかった。サルの研究における毒物動態プロファイルによって、全身曝露が用量に比例し、性差はないと思われることが示された。サルでは、１３週間の投与期間にわたって蓄積は観察されなかった。臨床病理学または組織病理学に変化が観察されなかったので、免疫毒性は明らかではなかった。

非活性化末梢血単核細胞をｈｕ１２１７－２－２で処理した後のインビトロサイトカイン放出アッセイでは、ヒトＩｇＧと比較した場合、サイトカイン放出の有意な増大は観察されなかった。この結果、ｈｕ１２１７－２－２が急性サイトカイン放出症候群を引き起こす可能性が低いことが示される。

全体として、サルの毒性研究では明らかな毒性は認められなかった。ヒトまたはサルの組織では、予期せぬ組織交差反応性は見つからなかった。毒物動態プロファイルは、明らかな蓄積も性差も伴わずに、全身曝露における用量比例増大を示した。１３週間のサル毒性研究におけるｈｕ１２１７－２－２の無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は１００ｍｇ／ｋｇであった。

実施例１３：ｈｕ１２１７－２－２の臨床薬理学
合計１１人の患者を、ＢＧＢ－Ａ３１７を２００ｍｇの用量で組み合わせて、ｈｕ１２１７－２－２を、用量レベル５０ｍｇ（ｎ＝１）、１５０ｍｇ（ｎ＝３）、４５０ｍｇ（ｎ＝４）、及び９００ｍｇ（ｎ＝３）で用いて処置した。最大投与量は、ｈｕ１２１７－２－２を１８００ｍｇで、ＢＧＢ－Ａ３１７を２００ｍｇでＱ３Ｗで組み合わせたものであった。ｈｕ１２１７－２－２の血清濃度は、静脈内注入後に双指数関数的に減少し、ｈｕ１２１７－２－２の曝露（Ｃｍａｘ及びＡＵＣ）は、５０ｍｇから９００ｍｇまでほぼ用量比例して増大した（図１１）。

末梢ＴＩＧＩＴ受容体占有率データは、ｈｕ１２１７－２－２を５０ｍｇ（ｎ＝１）、１５０ｍｇ（ｎ＝３）、４５０ｍｇ（ｎ＝４）、及び９００ｍｇ（ｎ＝３）の用量で処置した１１人の患者について入手可能であった。最低用量の５０ｍｇを含む、試験したすべての用量レベルで、末梢血中のＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫ、及びＴｒｅｇ細胞で、完全なＴＩＧＩＴ受容体占有率（１００％）が観察された。

実施例１４：ｈｕ１２１７－２－２は、単独またはＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて、ＰＢＭＣアッセイにおいてＩＦＮ－γ分泌を促進する
ｈｕ１２１７－２－２とＢＧＢ－Ａ３１７の併用が単独療法よりも一次ヒト免疫細胞の活性化を高め得るか否かを確認するために、健康なドナー由来のＰＢＭＣを事前に刺激してＴＩＧＩＴ発現を上方制御し、エフェクター細胞として使用した。ＰＤ－Ｌ１及びＴ細胞エンゲージャー（ＯＳ８）陽性Ａ５４９細胞（Ａ５４９／ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１）を、標的細胞として使用した。事前活性化されたＰＢＭＣを、示された濃度のｈｕ１２１７－２－２及びＢＧＢ－Ａ３１７またはいずれかの抗体単独の存在下で、Ａ５４９／ＯＳ８－ＰＤ－Ｌ１及びＡ５４９／ＰＤ－Ｌ１の混合物と１８時間、共培養した。ＩＦＮ－γ産生はＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＦＮ－γ分泌を、Ｔ細胞活性化の読み取り値として使用した。この結果、ｈｕ１２１７－２－２によるＰＢＭＣの処置が用量依存的にＩＦＮ－γ産生を増加させることが示された。ｈｕ１２１７－２－２及びＢＧＢ－Ａ３１７の組み合わせは、ｈｕ１２１７－２－２またはＢＧＢ－Ａ３１７単独で見られた増大と比較してＩＦＮ－γ産生を有意に増強し、ＴＩＧＩＴとＰＤ１の複合遮断が活性化後のエフェクター細胞の枯渇を軽減できることを示しており、このデータは図１２にグラフで示されている。

実施例１５：ｈｕ１２１７－２－２は、マウス神経膠腫腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を減少させる
ｈｕ１２１７－２－２の抗腫瘍活性は、ヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスのＧＬ２６１マウス神経膠腫癌モデルでも試験された。ＧＬ２６１細胞（１×１０^７）をヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスの皮下に移植した。移植の３日後、マウスをランダムに４つの群に割り当て、示されているようにＤＰＢＳ（ビヒクル）またはｈｕ１２１７－２－２を用いて腹腔内に２９日間処置した。腫瘍容積を週に２回測定した。データは、各群の１２匹の動物の平均腫瘍容積±ＳＥＭとして表示される。図１３及び表８に示すように、ｈｕ１２１７－２－２の週１回（ＱＷ）投与は、用量依存的な抗腫瘍活性を誘導した。処置の２９日目（４回目の投与から７日後）に、ｈｕ１２１７－２－２は、試験したすべての用量（それぞれ、０．４、２、及び１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ）で有意なＴＧＩ（ＴＧＩの５６％、９４％及び１００％）を誘導した（表８）。

血液サンプル（約１００μＬ）を、ｈｕ１２１７－２－２の投与前及び最初の投与後２、８、２４、４８、９６、及び１６８時間後に収集した（時点ごとに３匹のマウス、各マウスは２時点以下使用した）。血清中のｈｕ１２１７－２－２の濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定され、各時点でのｈｕ１２１７－２－２の血清濃度は、用量反応データを５パラメータロジスティックモデルに当てはめることによって決定された。３つの用量（０．４、２、及び１０ｍｇ／ｋｇ）でのｈｕ１２１７－２－２の薬物動態プロファイルを、最初の注射後７日間特徴付け、及びｈｕ１２１７－２－２の用量依存性曝露（Ｃｍａｘ １回目の用量及びＡＵＣ０－１６８ｈ）を観察した（表９）。この処置は、研究全体を通じて動物の体重に大きな影響を与えなかった。

表９に関して、血液サンプル（約１００μＬ）を、ｈｕ１２１７－２－２の投与前及び最初の投与後２、８、２４、４８、９６、及び１６８時間後に収集した（時点ごとに３匹のマウス、各マウスは２時点以下使用した）。血清中のｈｕ１２１７－２－２の濃度はＥＬＩＳＡアッセイによって決定し、各時点でのｈｕ１２１７－２－２の血清濃度は、用量反応データを５パラメータロジスティックモデルに当てはめることによって決定した。

実施例１６：ヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスモデルにおけるＭＣ３８マウス結腸癌モデルにおけるｈｕ１２１７－２－２と抗ＰＤ１抗体の組み合わせ
ｈｕ１２１７－２－２と抗マウスＰＤ１（ｍｕＰＤ１）の組み合わせの抗腫瘍活性を、ヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスのＭＣ３８マウス結腸癌モデルで検討した。ＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０^６）をヒト化ＴＩＧＩＴノックインマウスの皮下に移植した。移植の７日後、マウスをランダムに４つの群に割り当て、示されているとおり、ビヒクル（ＤＰＢＳ）、ｍｕＰＤ１（１ｍｇ／ｋｇを腹腔内に５日ごとに１回（Ｑ５Ｄ））、ｈｕ１２１７－２－２（３ｍｇ／ｋｇを腹腔内にＱ５Ｄ）で、または組み合わせで処置した。

腫瘍容積を週に２回測定した。データは、１０匹の動物の平均腫瘍容積±ＳＥＭとして表される。ｐ値をスチューデントのｔ検定を用いて計算した。ｈｕ１２１７－２－２とｍｕＰＤ１の組み合わせは、いずれかの抗体単独（ｍｕＰＤ１単独については７３％、またはｈｕ１２１７－２－２単独については１１％）よりも高いＴＧＩ（１０２％）を示した（図１４及び表１０）。この処置は、研究全体を通じて動物の体重に有意な影響を与えなかった。

実施例１７：抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＰＤ１抗体の投与
ｈｕ１２１７－２－２の用量は５０ｍｇ～９００ｍｇの範囲であり、３週間に１回最大１８００ｍｇを、３週間に１回２００ｍｇの抗ＰＤ１抗体ＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて、進行中のＰｈ１／１ｂ研究で試験した。試験されたすべてのｈｕ１２１７－２－２用量レベルは、重大な安全性または耐容性の事象なしに用量制限毒性（ＤＬＴ）ウィンドウをクリアした。ｈｕ１２１７－２－２の曝露は、ほぼ用量に比例して増大した。したがって、ｈｕ１２１７－２－２の投与用量９００ｍｇを、第ＩＩ相の推奨用量として選択した。

この研究で試験されたすべての用量において、末梢血中の循環Ｔ細胞及びＮＫ細胞において完全なＴＩＧＩＴ受容体占有が観察された。上述のように、データによって、５０ｍｇで１００％の受容体占有率が達成されることが示された。ｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇ用量は、投与間隔全体にわたって組織内のＴＩＧＩＴ受容体の有効濃度及び飽和の可能性を完全に高めることが期待される。

この研究由来のｈｕ１２１７－２－２に関する薬物動態データは、ｈｕ１２１７－２－２曝露と患者の体重との間に有意な関係がないことを示し、したがって固定用量のｈｕ１２１７－２－２が最適であることを示している。ｈｕ１２１７－２－２抗体とＢＧＢ－Ａ３１７の併用は、ｈｕ１２１７－２－２の用量を９００ｍｇの固定量とし、ＢＧＢ－Ａ３１７を固定用量２００ｍｇで３週間に１回静脈内投与することを選択した。ＢＧＢ－Ａ３１７の用量は、以前のＢＧＢ－Ａ３１７研究における２～５ｍｇ／ｋｇの匹敵する安全性及び有効性プロファイルに基づいて選択された。

実施例１８：ＢＧＢ－Ａ３１７抗体と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２抗体
切除不能な局所進行性または転移性固形腫瘍患者において、化学療法の有無において、ＢＧＢ－Ａ３１７と併用したｈｕ１２１７－２－２の安全性／耐容性、薬物動態（ＰＫ）、及び予備的な抗腫瘍活性を検討するために第１相試験を開始した。

この研究に登録された患者は、ｈｕ１２１７－２－２（５０、１５０、４５０、または９００ｍｇ）とＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇとの併用で３週間に１回、漸増用量で処置された。すべての患者は、患者を治療から外すか用量を減らす必要があるような毒性を示さずに、用量制限毒性（ＤＬＴ）期間をクリアした。したがって、ｈｕ１２１７－２－２は、安全で耐容性が高いと考えられる。

実施例１９：限局期小細胞肺癌の処置における抗ＰＤ１抗体（ＢＧＢ－Ａ３１７）と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２抗体
ＢＧＢ－Ａ３１７は、単剤として、または化学療法と併用して、局所進行性または転移性の非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ、及びＥＳ－ＳＣＬＣを対象とした第２相試験で試験され、ＢＧＢ－Ａ３１７＋化学療法は抗がん活性を示した。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）患者１７人中１３人が、第一選択治療におけるＢＧＢ－Ａ３１７＋化学療法に反応した。局所進行性及び転移性非扁平上皮及び扁平上皮ＮＳＣＬＣに対する第一選択治療としてのＢＧＢ－Ａ３１７＋プラチナダブレット化学療法の２件の第３相試験では、主要評価項目として無増悪生存期間という肯定的な結果が示されている。ｈｕ１２１７－２－２抗体及びＢＧＢ－Ａ３１７抗体は重複しない抗がん機構を有しており、ＳＣＬＣの処置に対して相乗作用及び／または追加の活性を有する可能性がある。

実施例２０：限局期小細胞肺癌の処置におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体及び化学療法と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２抗体
新規の免疫療法の組み合わせとして、放射線療法と同時に投与される抗ＰＤ－Ｌ１＋抗ＴＩＧＩＴが、マウスモデルで評価されている（Ｇｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０１９；７：１６０－７１）。この実験では、抗ＰＤ－Ｌ１＋抗ＴＩＧＩＴ＋放射線療法による処置中の腫瘍反応を、単剤療法＋放射線療法または放射線療法単独のいずれかと比較した。ＣＴ２６モデルでは、放射線療法は抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＰＤ－Ｌ１療法と併用すると劇的に効果があり、完全奏効率は、３×８Ｇｙの低分割放射線療法における抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ－Ｌ１、及び放射線療法単独の場合はそれぞれ２／１０（２０％）、３／１０（３０％）、０／１０（０％）の奏功率と比較して９／１０（９０％）のマウスであった。１８×２Ｇｙの通常分割放射線療法と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＰＤ－Ｌ１の完全奏効率は、同じ分割ＲＴでの抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ－Ｌ１、及び放射線療法単独について、３／１２（２５％）、８／１２（２５％）、８／１２（６６．７％）、及び１／１０（１０％）のマウスと比較して７／１２（５８．３％）のマウスで観察された。ＳＣＬＣは、比較的高いＴＩＧＩＴ及びＰＶＲ発現を特徴とし、高いＰＶＲ発現は不良な予後と相関している（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８；１５３８－７４４５．ＡＭ２０１８－３６３７）。

ｈｕ１２１７－２－２及びＢＧＢ－Ａ３１７と化学放射線療法を組み合わせた新しい治療戦略は、標準治療として放射線療法と併用した化学療法しか未だにない限局期に特有のＳＣＬＣの現在の緩やかな改善を増強することを目指している。
この研究では、同時化学放射線療法を４サイクル組み合わせて、ＢＧＢ－Ａ３１７を２００ｍｇで３週間に１回静脈内投与した後、ＢＧＢ－Ａ３１７を２００ｍｇで３週間に１回静脈内投与する。

これは、ＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇを３週間に１回静脈内投与し、それに加えてｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇを３週間に１回静脈内投与し、同時化学放射線療法を４サイクル併用した後、ＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇを３週間に１回静脈内に投与し、それに加えてｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇを３週間に１回静脈内投与した場合と比較される。

好ましい化学療法レジメンは、最初の４サイクルで１日目にシスプラチン７５ｍｇ／ｍ２、ならびに１、２、及び３日目にエトポシド１００ｍｇ／ｍ２である。最初のサイクルの後、腎臓、血液、またはその他の毒性に応じて用量の調整が許可される。放射線療法は、Ｃ１Ｄ１の化学療法と同時に開始する必要があり、許容範囲は遅くとも化学療法を行うサイクル３の１日目と一致するようにする。推奨される総線量は３週間で４５Ｇｙ、または６．５週間で６０～７０Ｇｙであり、研究者の裁量による。予防的頭蓋照射は、地域の標準治療に従って、２週間にわたる総線量２５Ｇｙ（１日１０回に分けて２５Ｇｙ）として許可されている。このレジメンについては、以下の表１１で詳しく説明する。

実施例２１：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体と併用したｈｕ１２１７－２－２抗体
肺癌は最も一般的ながんであり、２０１８年には世界中で約２０９万人が新たに診断され、１７６万人が死亡しており、これはがんの中で最も高い発生率及び最も一般的ながん関連死亡率に相当する。この疾患は女性よりも男性に多く、男性のすべてのがんの１６．８％、女性のすべてのがんの８．８％を占めている。中国では、肺癌は男性と女性の両方においてがん関連死亡の主な原因であり、２０１５年の死亡者数は推定６１０，２００人、新規症例数は推定７３３，３００人である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１６；６６（２）：１１５－３２）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、肺の上皮細胞に由来し、全肺癌の８０％～８５％を占める。ＮＳＣＬＣには３つの主要な組織学的サブタイプがあり、全ＮＳＣＬＣの４０％を構成する腺癌、２５％を占める扁平上皮癌、及び全ＮＳＣＬＣの１０％を構成する大細胞癌である。

ＮＳＣＬＣ患者の予後は、がんが検出される段階に大きく依存するが、比較的不良である。肺癌の病期分類は、悪性腫瘍の腫瘍、リンパ節、及び転移（ＴＮＭ）分類、第７版（ｔｕｍｏｒ，ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ，ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（ＴＮＭ） Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）に従って世界中で行われている（Ｇｏｌｄｓｔｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ ２００７；２（８）：７０６－１４）。肺癌が初期の段階で診断されれば、手術または化学放射線療法によって治癒することが可能である。残念なことに、肺癌の症例は比較的遅い段階で発見されることがほとんどである。ＮＳＣＬＣ患者の約３分の１は、局所領域の縦隔リンパ節または器官の関与を含む、局所的に進行したステージＩＩＩの疾患を示す。ステージＩＩＩの疾患の患者の５年生存率は、３６％（ステージＩＩＩＡ）から１３％（ステージＩＩＩＣ）の範囲である。新たに診断されたＮＳＣＬＣ患者の５５％が遠位転移（ステージＩＶ）を有する。ステージＩＶＡの患者は、対側肺の病変、悪性胸水、及び悪性心嚢液貯留を呈するか、胸部の外側の単一の場所、例えば、遠位リンパ節または脳、肝臓、骨などの臓器に転移を示す。ステージＩＶＢの患者は、遠位リンパ節または臓器の複数の場所に伝播した疾患を示す。ステージＩＶのＮＳＣＬＣ患者の５年生存率は５％である（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ２０２０；７０（１）：７－３０）。扁平上皮ＮＳＣＬＣ患者には、ゲムシタビン、ビノレルビン、またはタキサンのいずれかを含むプラチナベースのダブレットを投与してもよい。非扁平上皮ＮＳＣＬＣ患者には、ペメトレキセドに基づいたカルボプラチンまたはシスプラチンとの併用化学療法が施される。単剤ペムブロリズマブは、ＫＥＹＮＯＴＥ ０２４治験（Ｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５（１９）：１８２３－３３）の結果に基づいて、腫瘍が高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現している（腫瘍比率スコア［ＴＰＳ］≧５０％）転移性ＮＳＣＬＣ患者に対する第一選択療法として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。この研究では、ペムブロリズマブは、プラチナベースの化学療法と比較して、６ヵ月のＯＳ率（８０．２％対７２．４％［９５％ＣＩ：０．４、０．９］）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ；１０．３ヵ月対６ヵ月［９５％ＣＩ：６．７、ＮＲ］）の有意な改善を示した。ペメトレキセド及びプラチナベースの治療法と組み合わせたペムブロリズマブも、ＫＥＹＮＯＴＥ ０２１（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；１７（１１）：１４９７－１５０８））の結果に基づいて、ＩＩＩＢ期またはＩＶ期の非扁平上皮ＮＳＣＬＣで、かつＥＧＦＲまたはＡＬＫゲノム異常のない患者に対する第一選択治療としてＦＤＡにより早期承認されている。

ＮＳＣＬＣでは、腫瘍浸潤リンパ球におけるＴＩＧＩＴ発現の上方制御が報告されている（Ｔａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７；７７：８５１－６１）。ＴＩＧＩＴ受容体単独の遮断、またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断との組み合わせは、機能的に「疲弊した」Ｔ細胞を救済することがインビトロ及びインビボの両方で示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１４；２６：９２３－３；Ｃｈａｕｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５：２０４６－５８）。マウスモデルでは、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＴＩＧＩＴ遮断は、いずれの単独療法よりも有意に優れた抗腫瘍効果を示した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ 前出；Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；２００：３０００－７）。

この治験では、ＥＧＦＲまたはＡＬＫゲノム異常のない局所進行性、切除不能、または転移性ＮＳＣＬＣを有する未治療のＰＤ－Ｌ１選択患者を対象に、ＢＧＢ－Ａ３１７と併用したｈｕ１２１７－２－２の投与を評価する。作用機序に基づいて、ｈｕ１２１７－２－２によるＴＩＧＩＴとＢＧＢ－Ａ３１７によるＰＤ１の複合遮断は、ＢＧＢ－Ａ３１７単独で観察されたものよりも有効性を向上させることが期待される。
ＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇを投与し、続いてｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇを各２１日サイクルの１日目に投与した（３週間に１回）。ＮＳＣＬＣ（扁平上皮）の場合、この用量で処置された患者の初期の読み出しでは、ベースラインからの病変変化が－１１．１で、安定した疾患（ＳＤ）が示された。

実施例２２：上咽頭癌の処置におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体と併用したｈｕ１２１７－２－２抗体
上咽頭癌（ＮＰＣ）は世界的に比較的まれであり、１２９，０７９人の新規症例が、２０１８年に診断されたがん全体のわずか０．７％を占め、新規症例の７０％超が東アジア及び東南アジアで発生しており、年齢標準化率（世界）は中国では１０万人当たり３．０である。流行地域の中で、中国では、２０１５年には女性よりも男性の方が発生率が高く、比率は約２．５対 １であった（Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１８；６８（６）：３９４－４２４ ａｎｄ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１６；６６（２）：１１５－３２）。

ＮＰＣの発生率と死亡率は、いくつかの流行地域で減少しているが、これはおそらくライフスタイルの変化と、放射線治療技術の改善、化学療法のより広範な適用、より正確な病気の病期分類を含む管理の進歩の結果である（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １３：２９８、２０１３；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ １５：８５６－８６１，２００６）。ＮＰＣは依然としてがんによる主な死亡原因であり、世界の死亡率は年間約７２，９８７例である（Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，前出）。分化の程度に応じて、ＮＰＣは、世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に基づいて３つの病理学的サブタイプに分類される。表面ケラチンを有する分化腫瘍はタイプＩと定義され、一方で、タイプＩＩ及びＩＩＩはそれぞれ非角化分化腫瘍および未分化腫瘍を指す。１９９１年に、ＩＩ型とＩＩＩ型とは非角化癌の単一カテゴリーに統合された。ＮＰＣが風土病である地域では、非角化サブタイプがほとんどの症例（＞９５％）を構成し、常にエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染と関連しているが、世界の他の地域ではＩ型疾患がより一般的である（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６５：２０４１－５４；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ａｎａｔ Ｐａｔｈ １９９７；４：７１－８４）。ＥＢＶ感染は、ＮＰＣの病因として最も広く研究されている。ＥＢＶにコードされたＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術に基づけば、ウイルスはすべての腫瘍細胞で排他的に検出されるが、正常な鼻咽頭上皮では検出されず、ＮＰＣの病因にはＥＢＶの活性化が必要であることが示唆されている（Ｐａｔｈｍａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９５；３３３：Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：５３６５－７０）。ＮＰＣは中国南部及び東南アジアの風土病である。標準的な第一選択治療は、プラチナを含む多剤化学療法である。しかし、第一選択療法を超える処置に関してはまだ合意に達していない。より効果的でかつ耐容性の高い新規薬剤に対する臨床上のニーズは依然として満たされていない。

前述したように、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、免疫抑制性の腫瘍微小環境から免疫細胞を救済する潜在的な機構を提供し、それによって効率的な抗腫瘍免疫応答を誘導する。研究では、ＴＩＧＩＴ経路がＰＤ１と連携してエフェクター腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抑制を最大化し、抗ＰＤ１療法に対する耐性を促進することが示された。

再発または転移性 ＮＰＣの第一選択に対する標準治療は、プラチナを含む多剤化学療法で構成される。しかし、プラチナ難治性／再発性または転移性ＮＰＣの患者にとって、第一選択以外の標準治療の選択肢はない。ニボルマブ、ペンブロリズマブ、カムレリズマブ、及びトリパリマブの単剤療法など、他の抗ＰＤ１抗体に関する最近の臨床研究では、二次治療または以降の治療設定の進行性ＮＰＣ患者において良好な臨床効果が実証されている（ＯＲＲ中央値、２０．５％～３４％；ＯＳ中央値、１６．５～１７．４か月；ＰＦＳ中央値、１．９～６．５か月）。以前の臨床治験におけるＮＰＣ患者の拡大コホートにおける単独療法としてのＢＧＢ－Ａ３１７の予備データも有望である（ＯＲＲ中央値：４３％、ＯＳ中央値、未到達；ＰＦＳ中央値、１２．４カ月）。しかし、現在の課題の１つは、ＰＤ１阻害が効果をもたらすのは難治性／再発または転移性のＮＰＣ患者の一部のみであり、この患者集団に対するより効果的な処置に対するニーズが満たされていないということである。

この治験では、患者は比較対照としてＢＧＢ－Ａ３１７＋ｈｕ１２１７－２－２、またはＢＧＢ－Ａ３１７単独のいずれかを投与される。患者は、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１に従って研究者が評価した疾患の進行、許容できない毒性、または臨床的利益の喪失のいずれかが先に起こるまで、ＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇ＋ｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇを３週間に１回静脈内投与される。

治験中、腫瘍評価は、毒性を管理するための用量遅延にかかわらず、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１に基づいて、最初の２４週間は６週間（±７日）ごと、１年目の残りの期間は９週間（±７日）ごと、その後は１２週間（±７日）ごとに行われる。ＢＧＢ－Ａ３１７とｈｕ１２１７－２－２との組み合わせのＰＫ特性を決定するために、血液サンプルをさまざまな時点で収集する。オプションの血液サンプルは、ベースライン時（サイクル１の１日目の投与前）、最初の腫瘍反応時（次のサイクルの１日目の投与前）、及び疾患進行後の処置終了（ＥＯＴ）訪問時に採取される（各時点について１０ｍＬ）。

予備的な臨床結果では、鼻咽頭癌患者にｈｕ１２１７－２－２をＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて投与した後、３６週間後に進行がみられなかったことが実証された。腫瘍病変（ＴＬ）サイズは、初回発症時は３１ｍｍであったが、３６週間の治療期間中に２３ｍｍまで退縮し、その結果、腫瘍サイズはベースラインから２５．８１％減少し、最下点からの変化はなかった。

実施例２３：食道癌の処置におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体と併用したｈｕ１２１７－２－２抗体
食道癌は、世界で７番目に多いがんであり、がんによる死亡原因の６番目に多いがんである。最も発生率が高い地域は、イラン北部から中央アジアの諸共和国を経て中国北部まで広がっている。食道癌の最も一般的な組織型は、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）であり、東ヨーロッパ及びアジアではさらに一般的である。食道癌と診断された患者の３分の２超が進行性または転移性疾患を患っており、生存期間中央値は８～１０か月、予想５年生存率は５％未満である。これらのデータは、効果の高い治療法が相対的に不足していることと相まって、食道癌全般、特にＥＳＣＣと診断された患者における大きな満たされていない医療ニーズを示している。

抗ＰＤ１療法は、ＥＳＣＣの二次治療として化学療法と比較して優れた有効性を示している。ＫＥＹＮＯＴＥ－１８１治験には、進行性疾患に対する全身治療を１回受けた後またはその後に進行した再発性局所進行性または転移性食道癌患者６２８人が登録され、ペムブロリズマブで処置された患者では化学療法と比較して主要評価項目であるＯＳに有意な改善が観察された（１０．３か月対６．７か月、ＨＲ、０．６２；９５％ＣＩ：０．４６～０．９０）。ＡＴＴＲＡＣＴＩＯＮ－３治験には、１つ以上のフルオロピリミジン及びプラチナベースのレジメンに不応性または不耐性である切除不能な進行性、再発性、または転移性のＥＳＣＣ患者４１９人が登録され、研究者が選択したタキサン化学療法と比較して、ニボルマブで処置された患者の主要エンドポイントＯＳの有意な改善が報告された（１０．９カ月対８．４カ月、ＨＲ、０．７７；９５％ＣＩ：０．６２～０．９６）。ＰＤ－Ｌ１発現レベルに関係なく、全体的な生存率の利点が観察された。

抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、免疫抑制性の腫瘍微小環境から免疫細胞を救済する潜在的な機構を提供し、それによって効率的な抗腫瘍免疫応答を誘導する。研究では、ＴＩＧＩＴ経路がＰＤ１と協力してエフェクターＴＩＬの抑制を最大化し、さらに抗ＰＤ１療法に対する耐性を促進もすることが示されている。上記の試験で説明されているように、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とするブロック抗体はＥＳＣＣの処置において顕著な結果を達成した。したがって、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＥＳＣＣにおける抗ＰＤ１療法の治療効果を有意に改善及び／または延長し得る。

第一選択の化学療法が奏効しなかった切除不能な局所進行性、再発性または転移性のＥＳＣＣ患者は、大きな満たされていない医療ニーズを持つ患者集団を代表している。したがって、この治験は、ＰＤ－Ｌ１発現陽性及び食道癌患者の処置において、ＢＧＢ－Ａ３１７＋ｈｕ１２１７－２－２の有効性と、単剤としてのＢＧＢ－Ａ３１７の有効性を比較するように設計されている。食道癌は、切除不能、局所進行、再発または転移性のＥＳＣＣである場合がある。

患者は、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１、許容できない毒性、または患者の離脱について治験責任医師が評価するまで、ＢＧＢ－Ａ３１７（２００ｍｇ）＋ｈｕ１２１７－２－２（９００ｍｇ）を３週間に１回静脈内投与される。患者は、各２１日サイクルの１日目にＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇを投与され（すなわち、３週間に１回）、その後、各２１日サイクルの１日目にｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇが投与される。

予備的な臨床結果では、食道癌患者にｈｕ１２１７－２－２をＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて投与した後、６週間後に進行がなかったことが示された。腫瘍病変（ＴＬ）のサイズは、最初の発症時には３８ｍｍであったが、治療期間中に２３ｍｍに退縮し、その結果、ベースライン及び最下点から３９．４７％減少した。

実施例２４：子宮頸癌の処置におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体と併用したｈｕ１２１７－２－２抗体
子宮頸癌は女性のがんの中で４番目に多いがんであり、女性ではがんによる死亡原因の第４位となっており、２０１８年には世界中で約５７万人が新たに診断され、３１１，０００人が死亡している。子宮頸癌の推定年齢標準化罹患率は、全世界で女性１０万人あたり１３．１人で、国によって大きく異なり、発生率は女性１０万人あたり２人未満から７５人までの範囲であった。中国とインドは合わせて世界の子宮頸癌の負担の３分の１以上を占めており、中国では症例１０６，０００人、及び死者４８，０００人、インドでは症例９７，０００人、死者６０，０００人となっている（Ａｒｂｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｇｌｏｂ Ｈｅａｌｔｈ．２０２０；８：ｅ１９１－ｅ２０３）。

再発または転移性子宮頸癌は、通常、一次処置完了後最初の２年以内に女性の１５～６１％で発生すると推定されている。第一選択のプラチナベースの治療後に進行した患者の場合、処置の選択肢は限られており、標準治療も確立されていない。単一の細胞増殖抑制剤では、限られた応答率及び限られた持続期間しか得られなかった。これによって、子宮頸癌及び／または転移性子宮頸癌の患者における満たされていない医療ニーズが大きいことが示される。

子宮頸癌の最も重大な原因は、持続的なパピローマウイルス感染である。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸部腫瘍の９９％、特にＨＰＶ１６及び１８などの発がん性サブタイプで検出される。ＨＰＶは、子宮頸癌の最も重要な病因として認識されており、したがって、ウイルスタンパク質は強力な免疫刺激物質であるので、子宮頸癌は免疫療法の魅力的な標的である。２０１８年６月には、ペムブロリズマブは、化学療法中または化学療法後に疾患が進行し、その腫瘍がプログラムされたデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を発現する子宮頸癌患者の処置に関して米国ＦＤＡから早期承認を受けた。

この適応症で報告されている抗ＰＤ１抗体の有望な抗腫瘍活性を考慮し、抗ＴＩＧＩＴ抗体が抗ＰＤ１療法の治療効果を向上し得るという科学的根拠を考慮すると、ｈｕ１２１７－２－２とＢＧＢ－Ａ３１７との組み合わせは、子宮頸癌の処置に有意な臨床上の利益をもたらし得る。

この治験は、子宮頸癌、転移性子宮頸癌、または以前に処置を受けた再発子宮頸癌の患者における、ＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２の投与を評価することである。治験の第１段階では、ＰＤ－Ｌ１の発現に関係なく子宮頸癌患者にｈｕ１２１７－２－２をＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて投与する。患者は、ｈｕ１２１７－２－２（３週間ごと（Ｑ３Ｗ）９００ｍｇ）とＢＧＢ－Ａ３１７（２００ｍｇのＱ３Ｗ）との併用、または単独療法としてのＢＧＢ－Ａ３１７（２００ｍｇのＱ３Ｗ）のいずれかの投与を受ける群に１：１の比率で無作為化される。第１段階の後、さらに多くの患者が募集される。これらの患者には、ｈｕ１２１７－２－２（９００ｍｇのＱ３Ｗ）とＢＧＢ－Ａ３１７（２００ｍｇのＱ３Ｗ）が組み合わせて投与される。

実施例２５：固形腫瘍の処置におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２抗体
ｈｕ１２１７－２－２は、固形腫瘍を対象とした治験でＢＧＢ－Ａ３１７と組み合わせて投与された。表１８は、ＢＧＢ－Ａ３１７の用量を２００ｍｇに維持しながら、ｈｕ１２１７－２－２の用量を変えて、ＢＧＢ－３１７と組み合わせてｈｕ１２１７－２－２を投与された七（７）人の患者の応答を示す。以下の症例では、腫瘍病変（ＴＬ）が併用療法下で退縮を示し、６例では疾患が安定（ＳＤ）となり、１人の患者は部分奏効（ＰＲ）を示した。一般に、併用治療後に腫瘍は退縮するか、進行しなかった。例えば、部分反応者である胃／胃食道接合部の患者は、ＴＬサイズ８４ｍｍを示したが、６週間の処置後、ＴＬサイズは５３ｍｍに減少し、ベースライン及び最低値から３６．９％のＴＬ減少が得られた。

実施例２６：用量漸増におけるＢＧＢ－Ａ３１７抗ＰＤ１抗体と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２抗体
第１相用量漸増研究は、標準治療が効果がない、耐えられない、または利用できない進行性、転移性、切除不能な固形腫瘍の患者を対象に実施された。患者は、サイクル１の１日目に単剤としてｈｕ１２１７－２－２の５０ｍｇの用量を静脈内（ＩＶ）投与され、サイクル１の８日目にＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇのＩＶ投与を受けた。これが耐容されれば、患者は、ｈｕ１２１７－２－２を１５０～９００ｍｇの用量範囲で４つの漸増用量で投与し、さらにＢＧＢ－Ａ３１７ ２００ｍｇを２９日目に連続投与し、その後中止まで３週間ごと（Ｑ３Ｗ）に投与した。鼻咽頭癌患者は、ｈｕ１２１７－２－２の１５０ｍｇ（Ｑ３Ｗ）とＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇ（Ｑ３Ｗ）の併用投与で、試験期間の最長である５４週間、安定したがんであった。ｈｕ１２１７－２－２の４５０ｍｇ（Ｑ３Ｗ）とＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇ（Ｑ３Ｗ）の併用の投与では、子宮癌患者と基底細胞癌の別の患者では安定したがんであった。これと同じ用量で、胃癌患者は部分反応を示した。最後に、ｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇ（Ｑ３Ｗ）とＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇ（Ｑ３Ｗ）の併用により、患者６例が安定したがん、２例が腎癌、１例が黒色腫、１例が肉腫、１例が膵臓癌、及び１例が唾液腺癌を生じた。この用量投与ではまた、中皮腫患者にも部分反応が１例あった。

実施例２７：肝細胞癌の処置のための、ＢＧＢ－Ａ３１７及びＢＡＴ１７０６抗体と組み合わせたｈｕ１２１７－２－２抗体
ＢＡＴ１７０６は、ベバシズマブ注射剤（ベバシズマブ注射剤、商品名 Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））と同様の生物学的製剤である。ベバシズマブは、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に高い親和性で結合する組換えヒト化免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）モノクローナル抗体である。ベバシズマブは、すべてのヒトＶＥＧＦ Ａアイソフォームに高い親和性で選択的に結合し得、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）及びＶＥＧＦ受容体 ２（ＶＥＧＦＲ－２）へのＶＥＧＦの結合をブロックし、それによってＶＥＧＦの生物活性を中和する。ベバシズマブは現在、がん患者の全生存期間と無増悪生存期間を延長する臨床効果が証明されている唯一の抗腫瘍血管新生薬である。いくつかのランダム化対照第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相研究では、標準化学療法とベバシズマブを併用した処置により、標準化学療法単独の使用と比較して、全生存期間、無増悪生存期間、及び全寛解率が統計的に有意に改善することが示されている。

比較のインビトロ薬力学的研究の結果によって、ＢＡＴ１７０６とベバシズマブの両方とも、文献報告と一致してＶＥＧＦとの特異的結合を示すことが示された。ＢＡＴ１７０６の生物学的活性は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖阻害試験を使用して測定された。その結果によって、ＢＡＴ１７０６がＨＵＶＥＣの増殖とベバシズマブと同様の用量依存関係を示し、両方ともＶＥＧＦに対して強力な中和効果を示すことが実証された。ＢＡＴ１７０６の生物活性は、（１．０±０．２）×１０４Ｕ／ｍｇの所定の範囲内でベバシズマブの生物活性に匹敵することが判明した。

いくつかのヒト癌モデル（ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、及び横紋筋肉腫）においてＢＡＴ１７０６とベバシズマブの抗腫瘍効果を比較した。ＮＣＩ－Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣ細胞を、非肥満糖尿病／重度複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）雌マウスに皮下接種し、ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルを確立した。動物を、各群が８匹の雌マウスで構成されている、次の５つの群に分けた。
ビヒクル対照群
ベバシズマブ５．０ｍｇ／ｋｇ群
ベバシズマブ０．５ｍｇ／ｋｇ群
ＢＡＴ１７０６ ５．０ｍｇ／ｋｇ群
ＢＡＴ１７０６ ０．５ｍｇ／ｋｇ群。
腫瘍を平均容積１２８ｍｍ^３まで増殖させた。その後、それに続く３週間の間、各週の１日目、３日目、及び５日目に尾静脈注射によって処置を施した。有効性は、腫瘍重量、腫瘍容積、及び相対的な腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）によって測定された。腫瘍の潜伏期間も観察されたが、統計的有意性は評価しなかった。この研究では、ビヒクル対照群と比較して腫瘍潜伏期間を評価するために使用された標的腫瘍重量は、ＢＡＴ１７０６とベバシズマブで同じ（６００ｍｍ３）であった。ＢＡＴ１７０６の５ｍｇ／ｋｇ及びベバシズマブの５ｍｇ／ｋｇの群の平均腫瘍容積は、投与終了１日後にビヒクル対照群と統計的に有意な差を示したが、ＢＡＴ１７０６の０．５ｍｇ／ｋｇ及びベバシズマブの０．５ｍｇ／ｋｇの群では示さなかった。腫瘍重量データは腫瘍容積データと一致した。注目すべきことに、ＢＡＴ１７０６とベバシズマブの対の用量（０．５または５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍容積及び腫瘍重量の結果は、統計的に異なっていなかった。ＢＡＴ１７０６の５ｍｇ／ｋｇ及びベバシズマブの５ｍｇ／ｋｇの相対ＴＧＩ（％）は、それぞれ ９４％及び９３％であった。０．５ｍｇ／ｋｇのＢＡＴ１７０６及び０．５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブの相対ＴＧＩ（％）は、それぞれ６７％及び６３％であった。要約すると、ＢＡＴ１７０６は、用量依存的にベバシズマブと同様の有効性を示した。

同様の結果が、ＳＫ－ＯＶ－３ヒト卵巣癌細胞異種移植モデルマウスモデル及び６７３ヒト横紋筋肉腫細胞異種移植マウスモデルでも見られ、ＢＡＴ１７０６は用量依存的にベバシズマブと同様の有効性を示した。両方の研究のすべての処置群で死亡または重篤な毒性の兆候は示されず、両方の抗体とも治療全体を通じて良好な耐容性を示した。

ニュージーランドで実施された第Ｉ相試験では、ＢＡＴ１７０６の安全性を評価し、健康な対象ではＥＵ－ベバシズマブとＵＳ－ベバシズマブとの間を比較した。合計１２５人の健康な対象が、ＢＡＴ１７０６、ＥＵ－ベバシズマブ、またはＵＳ－ベバシズマブという３つの治験薬のうち１つを９０分間のＩＶ注入として１ｍｇ／ｋｇで単回投与され、この研究結果により、１回のＢＡＴ１７０６のＩＶ注入は安全で耐容性が高く、注射部位の反応は軽度であることが明らかになった。

中国で実施された別の第Ｉ相試験（ＢＡＴ１７０６－００２－ＣＲ）でもＢＡＴ１７０６の安全性を評価し、健康な対象におけるベバシズマブ（欧州）と比較した。合計８０人の健康な対象に治験薬１ｍｇ／ｋｇを単回投与した（ＢＡＴ１７０６群の対象３９人、ベバシズマブ群の対象４１人）。研究の結果、両方の薬物が良好な安全性及び耐性特性を示したことが明らかになった。ニュージーランドまたは中国の研究では、どの対象についても抗薬物抗体陽性の結果は報告されなかった。

肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界的な主要な健康問題であり、報告されている肝癌症例全体の８５～９０％を占めている（ＨＣＣは、同じ意味で使用されることが多い用語である）（Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００７；１３２（７）：２５５７－７６）。世界保健機関のＧＬＯＢＯＣＡＮ ２０１２データベースによると、肝臓癌は同年６番目に多い種類のがんであり、世界中で７８２，０００人の新規症例が発生した；肝臓癌はまた、がん関連死亡率の２番目に多い原因でもあり、推定７４６，０００人の死亡の原因となっている（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１５；６５（２）：８７－１０８）。ほとんどのＨＣＣ症例（８０％超）は、東アジア及びサハラ以南のアフリカで発生しており、典型的な発生率は１００，０００人あたり２０人超である。中国だけで、世界中の新規ＨＣＣ症例とＨＣＣ関連死亡の約５０％を占めている（Ｔｏｒｒｅ、前出）。スペイン、イタリア、及びギリシャなどの南ヨーロッパ諸国では、ＨＣＣの発生率が比較的中程度（１０万人あたり約１０～２０人）である傾向がある一方、北米、南米、北欧、及びオセアニアではＨＣＣの発生率が比較的低い（１００，０００人あたり５人未満）（Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１２；１４２（６）：１２６４－７３）。

前述したように、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤の単独療法は、以前に処置したＨＣＣにおいて臨床的利点を示した（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０２０；２１（４）：５７１－８０）。しかし、一次治療のＨＣＣ患者においてはソラフェニブと比較して有意な改善は示されていない（Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１９；３０，（Ｓｕｐｐｌ ５）；ｖ８７４－ｖ７５）。ＨＣＣで報告されている抗ＰＤ－１抗体の有望な抗腫瘍活性を考慮し、ＴＩＧＩＴが抗ＰＤ－１療法の治療効果を改善し得ることを考慮すると、ｈｕ１２１７－２－２とＢＧＢ－Ａ３１７の組み合わせは、この適応症において有意な臨床上の利点をもたらし得る。

ＨＣＣ患者におけるベバシズマブの単剤活性が観察されている（Ｂｏｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１２；１７：１０６３－７２；Ｓｉｅｇｅｌ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；２６：２９９２－８）。ベバシズマブは、ＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせることで、他の腫瘍タイプにおいて免疫調節効果を示し、臨床上の利点及び優れた安全性プロファイルが期待できる（Ｗａｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１２６２４）。ＩＭｂｒａｖｅ１５０研究及びＯｒｉｅｎｔ３２研究の肯定的な結果によって、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤と抗血管新生剤を組み合わせることの相乗効果が実証される。

進行性ＨＣＣ患者の第一選択治療として、ＢＧＢ－Ａ３１７＋ＢＡＴ１７０６と併用したｈｕ１２１７－２－２の有効性及び安全性を検討する研究では、この研究に、２つの処置アームの１つに対して２：１の比率で無作為化された約９０人の患者が登録される。
Ａ群（ｎ＝６０）：ｈｕ１２１７－２－２の９００ｍｇを３週間ごとに１回静脈内投与（２１日周期で投与）＋ＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇを３週間ごとに１回静脈内投与（２１日周期で投与）＋ＢＡＴ１７０６の１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに１回静脈内投与（２１日サイクルで投与）。
アームＢ（ｎ＝３０）：ＢＧＢ－Ａ３１７の２００ｍｇを３週間ごとに１回静脈内投与（２１日サイクルで投与）＋ＢＡＴ１７０６の１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに１回静脈内投与（２１日サイクルで投与）。

上で開示したように、ＴＩＧＩＴを標的とすることは、免疫抑制性腫瘍微小環境から免疫細胞を救済する潜在的な機構を提供し、それによって効率的な抗腫瘍免疫応答を誘導する。研究では、ＴＩＧＩＴ経路がＰＤ－１と連携してエフェクター腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抑制を最大化し、同様に抗ＰＤ－１療法に対する耐性を促進することが示された。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を標的とする抗体は、ＨＣＣの処置で成果を上げているため、ｈｕ１２１７－２－２とＢＧＢ－Ａ３１７及びＢＡＴ１７０６とを組み合わせた処置によりＨＣＣの処置を有意に改善し得る。

Claims (29)

1. がんの処置方法であって、有効量の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与することを含む、前記方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合し、以下：
   （ｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）１、（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
   （ｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
   を含む、有効量の抗体またはその抗原結合断片を、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて対象に投与することを含む、前記方法。
3. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片が、以下：
   （ｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
   （ｉｉ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
   （ｉｉｉ）配列番号９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１１を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
   を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記抗ＰＤ１抗体が、ヒトＰＤ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、かつ以下：
   （ａ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ｄ）配列番号２８のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトＰＤ１に特異的に結合し、かつ配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗ＰＤ１抗体が、配列番号３５を含むＩｇＧ４定常ドメインを含む、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項１に記載の方法。
8. 前記抗ＰＤ１抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項１に記載の方法。
9. 有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記抗ＶＥＧＦ抗体が、ベバシズマブまたはＢＡＴ１７０６である、請求項９に記載の方法。
11. 前記がんが、乳癌、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫または肉腫からなる群から選択される、請求項１または請求項９に記載の方法。
12. 前記小細胞肺癌が、限局型小細胞肺癌である、請求項９に記載の方法。
13. 前記がんが、非小細胞肺癌である、請求項９に記載の方法。
14. 前記頭頸部癌が、鼻咽頭癌である、請求項９に記載の方法。
15. 前記食道癌が、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）である、請求項９に記載の方法。
16. 前記がんが、子宮癌である、請求項９に記載の方法。
17. 前記胃癌が、胃癌または胃食道接合部癌である、請求項９に記載の方法。
18. 前記子宮頸癌が、再発性または転移性子宮頸癌である、請求項９に記載の方法。
19. 前記皮膚癌が、基底細胞癌である、請求項９に記載の方法。
20. 前記がんが、膵臓癌である、請求項９に記載の方法。
21. 前記腎臓癌が、肝細胞癌である、請求項９に記載の方法。
22. 化学療法を施すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記化学療法が、化学放射線療法である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記抗ＰＤ１抗体が、３週間ごとに２００ｍｇ投与される、請求項１に記載の方法。
25. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、５０ｍｇ～９００ｍｇの範囲で投与される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに５０ｍｇ投与される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに１５０ｍｇ投与される、請求項２５に記載の方法。
28. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに４５０ｍｇ投与される、請求項２５に記載の方法。
29. 前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、３週間ごとに９００ｍｇ投与される、請求項２５に記載の方法。