KR20240029582A - 글루카나제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드 - Google Patents

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KR20240029582A
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Abstract

본 출원은 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

글루카나제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드 {Novel polypeptide having glucanase activity}
본 출원은 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
1,3-1,4-β-글루칸은 다양한 식물의 세포벽을 구성하는 다당류이며 특히 보리, 호밀, 수수, 쌀 및 밀과 같은 상업적 가치가 있는 곡물의 세포벽에 다량 존재한다. 하지만, 글루칸은 항영양인자의 요인으로써 동물들이 식물 기반 사료를 소화하고 흡수하는데 방해하는 역할을 한다. 특히 단위동물의 경우 이러한 항영양인자를 분해할 수 있는 글루카나제 (EC 3.2.1.73)의 부재로 글루칸을 분해하여 이용하기 어렵다.
따라서, 사료에 글루카나제를 첨가해 줌으로써 가축의 효율적인 영양섭취가 가능해지며 이를 위해 사료에 적합한 글루카나제 개발이 필요하다(Murphy P, Bello FD, O'Doherty JV, Arendt EK, Sweeney T, Coffey A (2012) Effects of cereal β-glucans and enzyme inclusion on the porcine gastrointestinal tract microbiota. Anaerobe 18(6):557-565). 한편 사료용 효소의 경우 고온 공정에서 견딜 수 있는 내열성이 필수적이다.
본 출원의 목적은 글루카나제 활성을 갖는 서열번호 4의 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 글루칸 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 글루칸과 반응시키는 단계를 포함하는, 글루칸의 분해 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는 사료 첨가제 조성물과 사료 성분을 혼합하는 단계를 포함하는, 사료제품의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 식품용 조성물; 식품 제조용 조성물; 세제 조성물; 방직용 조성물; 및 제지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 4의 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는, 글루카나제 활성을 갖는 서열번호 4의 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 글루카나제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드이다.
본 출원에서 "글루카나제"는 글루칸에서 2개의 글루코실 잔기를 연결하고 있는 글루코시드 결합을 분해할 수 있는 효소 활성을 의미한다. 글루카나제 활성의 비제한적인 예시로 D-글루코스 간의 베타-1,4 결합에 대한 엔도-셀룰라제 활성을 가지거나, 1,3- 및 1,4-결합을 포함하는 베타-D-글루칸의 (1,4)-베타―D-글루코시드 결합을 분해나는 리케니나제(licheninase 또는 lichenase) 활성을 들 수 있다. 일 구현예로서 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 EC 3.2.1.73 으로 분류되는 글루카나제에 상응하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 제공하는 글루카나제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드를 서열번호 4의 폴리펩티드로 정의하였으나, 서열번호 4의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원에서 제공하는 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드에 해당됨은 당업자에게 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다.
또한, 본 출원에서 제공하는 서열번호 4의 폴리펩티드와 기준(reference) 글루카나제 폴리펩티드의 서열을 정렬(alignment)함으로써, 기준 서열과 본 출원에서 제공하는 폴리펩티드의 서열을 비교하여, 글루카나제의 기준 서열에 본 출원에서 제공하는 폴리펩티드에 대응하는 변형을 도입함으로써 수득한 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드 역시 본 출원에서 제공하는 폴리펩티드의 범위에 포함된다. 이러한 기준 서열의 하나의 예시로, 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 상기 기준 서열은 변형을 도입하는 모서열(parent sequence)로 사용되거나, 열안정성 및/또는 내열성을 평가하는 대조군(control) 으로 사용될 수 있다.
기준 서열의 다른 하나의 예시로 야생형 글루카나제 서열을 사용할 수 있다. 야생형 글루카나제의 예시로는 Orpinomyces sp., Neocallimastix sp., Piromyces sp., 또는 Ruminococcus sp. 유래의 글루카나제를 들 수 있다. 야생형 글루카나제의 하나의 예시로, NCBI Sequence ID NO. O14412.1 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 출원에서 제공하는 서열번호 4의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 야생형 글루카나제의 폴리펩티드, 예를 들어 오르피노마이세스(Orpinomyces sp. )속 유래 야생형 글루카나제, 구체적으로는 NCBI Sequence ID NO. O14412.1의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 상이한 점에서, "야생형"에 대비되는 의미로 "변이형 폴리펩티드" 또는 "변이체"로도 지칭 할 수 있다.
또한, 서열번호 4의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 변이형 폴리펩티드 역시 본 출원에서 제공하는 폴리펩티드의 범위에 포함된다. 이러한 변형은 예를 들어 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거되는 변형을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 본 출원의 폴리펩티드는 서열번호 4의 폴리펩티드가 가지는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
일 구현에로, 본 출원에서 제공하는 글루카나제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드는 서열번호 4를 포함하거나, 서열번호 4로 필수적으로 구성되거나 서열번호 4로 구성된 것일 수 있다. 다른 구현예로, 본 출원에서 제공하는 신규 폴리펩티드는 글루카나제 활성을 갖는 신규 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 상동성 또는 동일성을 갖는 것일 수 있다. 또는 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서, "효소활성(enzymatic activity)"또는 "글루카나제 활성"은 적어도 하나의 촉매 활성(catalytic activity)을 나타낸다. 구체적으로는 kcat/Km으로 주로 표현되는 효소의 전환 효율일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
kcat는 효소가 기질로 완전히 포화되었을 때, 한 개의 효소에 의한 단위시간에 생성물로 전환하는 속도상수(catalytic constant)를 의미하며, 전환수(turnover number)라고도 칭해진다. Km은 반응속도가 최고값(Vmax)의 절반일 때의 기질 농도(substrate concenstration)이다.
효소 활성을 표현하는 방법의 예시로, 특이적 활성(specific activity; umol of converted substrate x mg -1 x min -1) 또는 volumetric activity (umol of converted substrate x mL -1 x min -1)등이 있다. 다만 효소활성을 정의하는 것은 전술한 내용에 제한되지 않고, 당업계에 알려진 내용을 토대로 정의하고 평가할 수 있다.
본 출원에서 효소 안정성(enzyme stability)이란, 효소 활성이 저장 또는 반응 시간 동안 보존되는 것을 의미한다. 이러한 안정성의 변화를 측정하기 위해, 최초 효소 활성을 정해진 조건 하에 0시간(time zero) (100%) 및 일정 시간 경과 후 (x%) 측정하여 비교함으로써, 효소활성이 상실되는 수준 내지는 효소 안정성을 표현할 수 있다.
효소 활성에 영향을 미치는 요소는, 예를 들어 pH, 열, 다른 물질(예를 들어, 산화제, 킬레이트제)의 존재 등이 있다.
본 출원에서 용어, “열안정성(thermal stability)”이란 특정 온도 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 폴리펩티드는 약 20℃ 내지 약 120℃ 범위에서 활성을 가질 수 있고, 구체적으로 약 60℃ 내지 약 100℃ 범위에서 활성을 가지는 것일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 50℃ 내지 80℃ 에서 활성을 갖는 것일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "내열성(thermal tolerance)"이란 단백질이 특정 온도, 예를 들어 고열 또는 극저온에 노출된 후 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 내열성을 갖는 단백질은 노출된 온도에서는 기능하지 않을 수 있으나, 최적 온도 환경으로 돌아오면 다시 기능을 가질 수 있다.
안정성의 증가는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이형 폴리펩티드와 비교하여, 높은 효소 활성 유지; 또는 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 증가를 포함한다. 본 출원에서, 야생형 글루카나제를 기준으로 안정성의 증가를 비교할 수 있고, 그 예로 서열번호 2의 글루카나제를 기준으로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2의 폴리펩티드에 비해 내열성 및 열안정성 중 선택되는 1 이상의 특성이 개선된 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 폴리펩티드는 50℃ 내지 80℃ 에서 적어도 20% 이상의 상대활성을 유지할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드가 가지는 특성은 사료, 제빵, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 활성, 개선된 활성일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 4의 폴리펩티드 및 이에 상응하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 다른 구현예로, 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또는 서열번호 3의 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.
원핵세포에서 통상 사용되는 벡터의 예로, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pDCM2 벡터 등을 사용할 수 있다.
진핵세포에서 사용되는 벡터의 일 예로서, 효모 발현 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp: integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp: episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp: replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp: yeast centromer plasmid)를 포함할 수 있다. 또한, 인위적 효모 염색체들(YACs: artificial yeast chromosomes)도 본 출원의 벡터로 이용이 가능하다. 구체적인 예로서, 이용 가능한 벡터는 pESCHIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 및 pYJ406를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물이다.
상기 미생물은 전술한 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체 및/또는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 핵산 구조체 또는 벡터는 염색체에 통합되거나, 또는 자가 복제되는 염색체외 벡터로 유지될 수 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포가 포함되며, 예를 들어, 상기 미생물은 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 다른 예로, 상기 미생물의 예시에는 진균 (Fungi), 세균(Bacteria)가 포함된다.
하나의 구현예로, 본 출원의 미생물은 에스케리키아 속 미생물일 수 있고, 에스케리키아 콜라이(대장균; Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티 (Escherichia albertii), 에스케리 키아 페르구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니 (Escherichia hermannii), 에스케리키아 불네리스 (Escherichia vulneris), 또는 에스케리키아 블랏태 (Escherichia blattae) 일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는 글루칸 분해용 조성물이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 글루칸과 반응시키는 단계를 포함하는, 글루칸의 분해 방법이다.
본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물은 글루칸을 함유하는 물질을 분해하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 글루칸 분해용 조성물은 본 출원의 폴리펩티드 외에, 자연적으로 발생한 물질 또는 자연적으로 비발생한(Non-naturally occurring) 물질을 더 포함할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 글루칸 분해용 조성물은 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백 등 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.
추가될 수 있는 물질의 예시는, 안정화제, 계면활성제, 빌더, 킬레이트제, 분산제, 효소, 효소 안정제, 촉매제, 활성화제, 담체, 합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 현탁화제, 색소, 향료, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 희석제, 윤활제, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는 사료 첨가제 조성물이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 사료 첨가제 조성물과 사료 성분을 혼합하는 단계를 포함하는, 사료제품의 제조 방법이다.
본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물은 하기 응용들 중 어느 하나로 사용될 수 있다:
a) 동물 사료원료에서의 첨가제; 및/또는
b) 동물용 사료 보충제; 및/또는
c) 곡물 기반 물질 (예를 들어, 이는 통곡물 또는 곡물의 일부일 수 있음)의 분해.
본 출원의 사료제품은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.
본 출원의 글루카나제는 식품, 제지, 펄프, 세제, 공업 폐기물 처리, 바이오 소재 및 바이오 에너지 등 다양한 산업 분야에 이용될 수 있다. 이러한 산업 분야에서의 응용에 대해서는 McCarthy TC, Lalor E, Hanniffy O, Savage AV, Tuohy MG, Comparison of wide-type and UV-mutant β-glucanase-producing strains of Talaromyces emersonii with potential in brewing applications, J Ind Microbiol Biotechnol, 2005; Chaari F, Belghith-Fendri L, Blibech M, Driss D, Ellouzia SZ, Sameh M, Ellouz-Chaabouni S, Biochemical characterization of a lichenase from Penicillium occitanis Pol6 and its potential application in the brewing industry, Process Biochem, 2014; 및 Maktouf S, Moulis C, Kamoun A, Chaari F, Chaabouni SE, Remaud-Simeon M, A laundry detergent compatible lichenase: statistical optimization for production under solid state fermentation on crude millet, Ind Crops Prod, 2013 등의 문헌이 참조될 수 있다.
본 출원의 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 또는 본 출원의 미생물을 포함하는, 식품용 조성물; 또는 식품 제조용 조성물이다. 일 예로, 글루카나제는 양조(맥주, 와인 등), 과일 주스의 제조에 이용될 수 있다. 글루카나제는 당화 과정에서 첨가되어 맥아즙 점도를 낮추고 여과 성능을 향상시키며 맥아 용해율을 높이고 맥주 탁도를 방지하고 맥주 품질을 안정화시키는 역할을 할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 또는 본 출원의 미생물을 포함하는, 세제 조성물이다. 세제 조성물은 직물, 접시 또는 단단한 표면과 같은 세척될 품목으로부터 원하지 않는 화합물을 제거하는 데 사용되는 조성물이다. 세제 조성물의 예시로, 섬유 세제, 직물 세제, 유리, 목재, 플라스틱, 세라믹 및 금속 조리대 및 창문과 같은 단단한 표면 세척 제제, 카페트 세척제, 오븐 세척제, 섬유 방향제, 섬유 유연제, 식기 세척 세제 등을 들 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 또는 본 출원의 미생물을 포함하는, 방직용 조성물이다. 본 출원의 글루카나제를 의복 제조를 위한 섬유의 가공에 사용할 수 있다. 이러한 가공은 표백, 염색 후 염료의 제거, 면 직물 혹은 면 혼방직물의 바이오폴리싱과 같은 가공을 포함한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 또는 본 출원의 미생물을 포함하는, 제지용 조성물이다. 본 출원의 글루카나제는 펄프 산업에서 폐수를 개선하거나, 잉크를 제거하거나 탈색에 사용될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 목적하는 용도에 사용하기 적합한 임의의 다른 효소를 더 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 목적하는 용도에 사용하기 적합한 양으로 본 출원의 글루카나제 또는 본 출원의 미생물을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 목적하는 용도에 사용하기 적합한 형태로 제공될 수 있다. 비제한적인 예시로, 상기 조성물은 바, 정제, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체 형태 일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법이다.
상기 배양은 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 숙주 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 숙주 세포를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 숙주 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 숙주 세포의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃ 내지 55℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 24 시간 내지 196 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 상기 배양단계에서 발현되는 본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 하나의 구현예로, 상기 배양단계에서 발현된 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이들에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 배지로부터 회수될 수 있다.
상기 회수 방법은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 폴리펩티드를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 숙주 세포로부터 본 출원의 폴리펩티드를 회수할 수 있다.
다른 하나의 구현예로, 배양단계에서 숙주 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드는 회수되지 않을 수 있다. 상기 구현예에서, 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포 자체를 폴리펩티드의 공급원으로 사용할 수 있다.
본 출원의 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 내열성 및 열안정성이 개선되어, 다양한 산업 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 오르피노마이세스 속 유래 글루카나제 기준 서열(서열번호 2)과 본 출원의 신규 글루카나제(서열번호 4)의 pH별 활성을 확인한 것이다.
도 2는 오르피노마이세스 속 유래 글루카나제 기준 서열(서열번호 2)과 본 출원의 신규 글루카나제(서열번호 4)의 온도별 활성을 확인한 것이다.
도 3은 오르피노마이세스 속 유래 글루카나제 기준 서열(서열번호 2)과 본 출원의 신규 글루카나제(서열번호 4)의 온도 변화에 따른 잔존 활성을 확인한 것이다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 글루카나제 활성을 가지는 단백질 생산
실시예 1-1. 주형(Template) 제작
오르피노마이세스(Orpinomyces) sp. PC-2 균주의 지노믹 DNA(Genomic DNA)에서 1,3-1,4-β-Glucanase에 해당하는 기준(Reference) 유전자를 대장균(E.coli)에서 발현하기 적합하도록 코돈 최적화하였다 (서열번호 1). 또한, 내열성 개선을 위해 서열번호 1을 주형으로 한 다중 점변이를 도입한 변이체 유전자를 코돈 최적화 하였다 (서열번호 3). 마지막으로 최적화된 유전자는 업체(Cosmogenetech co, Ltd.)를 통해 합성되었다.
기준 서열을 실험의 대조군(control)으로 사용하였으며, 합성된 대조군 및 변이체 유전자는 발현을 위해 pET28a 벡터로 각각(pET28-W, pET28-V) 클로닝 되었다.
실시예 1-2. 글루카나제 유전자를 가지는 형질전환체 제작 및 효소 발현
재조합 플라스미드 pET28-W와 pET28-V를 E.coli BL21으로 형질전환 하였다. 그리고 대조군 및 변이체를 생산하기 위해 LB 배지 5 ml에 형질전환체를 접종하였고 37℃에서 18시간 전 배양하였다. 본 배양을 위해 전 배양액 5 ml을 300 ml LB 배지에 접종하였고 37℃에서 배양하였다. 그리고, OD600 값이 0.4-0.6 사이일 때, 1M IPTG 120 ul를 넣어주고 12시간 추가로 배양하였다. 균체는 원심분리를 통해 회수되었으며 이는 lysis buffer(50mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM imidazole) 35ml에 재분산 되었다.
실시예 1-3. 글루카나제 활성을 가지는 단백질 정제
분산액 내의 균체는 초음파 분산기를 이용해 파쇄되었으며 원심분리를 통해 상등액인 조효소액을 확보하였다. 조효소액을 Ni-NTA resin(Qiagen, Cat no. 30230)에 흘려주어 흡착시킨 다음, washing buffer(lysis buffer 조성중 imidazole 농도만 20mM), Elution buffer(lysis buffer 조성에서 imidazole만 250mM)를 차례로 흘려주어 정제된 대조군과 변이체를 획득하였다.
실시예 2. 글루카나제 변이체 특성평가
실시예 2-1. 글루카나제 변이체 활성 측정
대조군과 변이체 특성 평가를 위해 50 ul의 1% 글루칸, 5 ul의 1M 버퍼, 적당량의 효소를 섞어주고 최종 볼륨 100 ul가 되도록 3차 증류수로 맞춰주었다. 그리고 이 혼합액을 잘 섞은 뒤 37도에서 반응하였고 생산된 환원당은 DNS법으로 측정하였다. DNS solution 제조법은 다음과 같다. 증류수 500ml이 포함된 비이커에 6.3g의 3,5-dinitrosalicylic acid(samchus, D1267)의 무게를 정확하게 측정하고 50 °C에 21g의 Sodium Hydroxide(Daejung, 7571-4400)을 첨가하고 300ml의 물에 Potassium sodium tartrate tetrahydrate(Daejung, 6618-4400)182g을 가열하여 용해 예비 용액에 Phenol(Sigma-Aldrich, P1037) 5g을 첨가하고, Sodium sulfite anhydrous(Daejung, 7634-4405) 5g을 첨가하여 용해 될 때까지 교반 한 후, 냉각 후 증류수로 1000ml로하여 여과하여 제조하였다.
실시예 2-2. 글루카나제 변이체 최적조건 평가
최적 pH 조건 평가를 위해 pH3-5 citrate 버퍼, pH 6-7 potassium phosphate 버퍼, pH 8-9 Tris-HCL 버퍼, pH10-12 glycine-NaOH 버퍼를 사용하였다. 그리고, 최적 온도 조건 평가를 위해 50mM sodium acetate pH 5.2를 버퍼로 사용하였으며 40, 50, 60, 70, 75, 80℃에서 각각 활성을 측정하였다.
글루카나제 변이체의 내열성 평가를 위해 적당량의 효소를 60, 70, 75, 80℃에서 각각 5분씩 방치한 후 37℃ 에서 활성평가 하였다.
실시예 3. 글루카나제 변이제 특성 평가 결과
실시예 3-1. 최적조건 평가
글루카나제의 최적조건 평가를 각 온도 그리고 pH별로 진행하였다. 평가결과, pH에 따른 상대활성은 대조군과 변이체 모두 pH5-7에서 높은 값을 나타내었다. 가장 높은 활성은 pH6에서 확인되었으며 알카리 조건에서 급격히 활성을 잃는 특징을 보였다(도 1).
하지만 온도 특성에서 두 효소의 차이가 극명히 나타났는데, 60도 까지는 유사한 특징을 보이나 70도에서 대조군은 4%의 활성만 남는 반면, 변이체는 70도에서 100%의 활성을 보였다. 또한, 변이체는 80도에서도 24%의 활성을 나타내었고 이를 토대로 변이체가 고온에서의 활성이 강화된 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3-2. 내열성 평가
글루카나제의 내열성 평가를 위해 정제된 대조군과 변이체를 60~80도까지 각각의 열조건에 방치 후, 37도에서 잔존 활성을 평가하였고 37도의 활성을 기준(100%)으로 활성을 평가하였다(도 3).
그 결과, 대조군은 60도 까지 81%의 활성이 남아있었지만 70도 이상에서는 모든 활성을 잃는 것으로 확인되었다. 반면에, 변이체의 경우 75도 까지 73%의 잔존 활성을 나타내었으며 70도 까지는 활성의 손실이 없는 것으로 확인되었다.
이를 통해, 본 출원의 신규 글루카나제가 내열성 및 열안정성이 개선된 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
서열
번호 		명칭 서열
1 Reference Glucanase GGGACTGCGTGGAACGGGAGCCATGATGTGATGGACTTCAATTATCATGAGAGTAATAGATTCGAGATGAGCAACTGGCCAAATGGAGAAATGTTTAACTGTAGATGGACTCCCAACAACGTTAAATTCGAAAATGGCAAGCTGAAGCTGACCATAGACCGGGACGGTTCGGGCTACACCTGTGGTGAGTACCGTACAAAGAACTATTATGGCTATGGGATGTTCCAGGTAAATATGAAACCCATCAAAAATCCCGGCGTCGTGTCTTCGTTCTTTACCTACACTGGTCCAAGCGATGGAACAAAATGGGATGAGATTGATATTGAGTTCCTGGGATATGATACAACTAAGGTCCAATTCAACTATTATACAAATGGTCAAGGCCATCACGAGCACATTCATTATTTGGGGTTCGACGCTTCTCAAGGATTTCACACATACGGGTTTTTTTGGGCTCGTAATTCGATAACTTGGTACGTCGATGGGACTGCAGTTTATACAGCTTATGATAACATACCCGATACACCGGGGAAGATCATGATGAATGCATGGAATGGAATAGGGGTCGATGATTGGCTGCGTCCTTTCAACGGCCGCACGAACATTTCCGCGTATTATGATTGGGTATCCTATGACGCTCCCCGCAAC
2 Reference Glucanase GTAWNGSHDVMDFNYHESNRFEMSNWPNGEMFNCRWTPNNVKFENGKLKLTIDRDGSGYTCGEYRTKNYYGYGMFQVNMKPIKNPGVVSSFFTYTGPSDGTKWDEIDIEFLGYDTTKVQFNYYTNGQGHHEHIHYLGFDASQGFHTYGFFWARNSITWYVDGTAVYTAYDNIPDTPGKIMMNAWNGIGVDDWLRPFNGRTNISAYYDWVSYDAPRN
3 Glucanase variant GCTACTGCGGTTAATACACCCTTTGTCGCTGATTTTAACTATCATGATAGCTCTCAGTGGGAAATGTCCAATTGGCCGAACGGCGAGATGTTCAACTGCCGTTGGACCCCGAATAACGTTAAATTCGAGAACGGCAAGCTCAAGTTGACCATTGACAGAGATGGCAGCGGTTACACCTGTGGTGAGTATCGTACTAAGAACTATTTCGGCTACGGCTACTACGAGGTTCGTATGAAACCGATTAAAAATCCAGGTGTAGTGAGCTCGTTCTTCACGTACACGGGTCCGTCTGATGGCACCAAATGGGACGAAATCGACATCGAATTTCTGGGTTATGATACCACCAAGGTTCAGTTTAATTATTATACCAACGGTCAGGGTGGTCATGAACATATTCATTATCTGGGTTTTGACGCAAGCCAAGATTTCCACACCTACGGCTTCTTTTGGGCGCGTAACAGCATCACCTGGTATGTGGACGGCACCGCGGTGTATACCGCGACTGATAACATTCCGGATACCCCGGGTAAGATCATGATGAACGCGTGGAACGGAATCGGTGTGGATGACTGGCTGCGCCCTTTTAACGGCCGTACCAATATTAGCGCGTATTACGAGTACGTTAAGTATTACCCGAATGGCAAC
4 Glucanase variant ATAVNTPFVADFNYHDSSQWEMSNWPNGEMFNCRWTPNNVKFENGKLKLTIDRDGSGYTCGEYRTKNYFGYGYYEVRMKPIKNPGVVSSFFTYTGPSDGTKWDEIDIEFLGYDTTKVQFNYYTNGQGGHEHIHYLGFDASQDFHTYGFFWARNSITWYVDGTAVYTATDNIPDTPGKIMMNAWNGIGVDDWLRPFNGRTNISAYYEYVKYYPNGN

Claims (14)

  1. 글루카나제 활성을 갖는, 서열번호 4의 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 폴리펩티드에 비해 내열성 및 열안정성 중 선택되는 1 이상의 특성이 개선된 것인, 폴리펩티드.
  3. 서열번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 서열번호 4의 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는, 미생물.
  5. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 글루칸 분해용 조성물,
  6. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 글루칸과 반응시키는 단계를 포함하는, 글루칸의 분해 방법.
  7. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 사료 첨가제 조성물.
  8. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는 사료 첨가제 조성물과 사료 성분을 혼합하는 단계를 포함하는, 사료제품의 제조 방법.
  9. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 식품용 조성물.
  10. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 식품 제조용 조성물.
  11. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 세제용 조성물.
  12. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 방직용 조성물.
  13. 서열번호 4의 폴리펩티드; 및 서열번호 4의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물; 중 1 이상을 포함하는, 제지용 조성물.
  14. 서열번호 4의 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 1 이상을 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 글루카나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법.
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