KR20090131991A

KR20090131991A - 글루칸 분해효소를 이용하여 헤마토코커스플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법

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Publication number: KR20090131991A
Application number: KR1020080058027A
Authority: KR
Inventors: 김소영; 조은아; 유지민; 인만진; 조경선; 최지혜; 채희정
Original assignee: 내추럴초이스 (주)
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2009-12-30

Abstract

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 추출에 있어서, 헤마토코커스 플루비알리스를 글루칸 분해효소, 바람직하게는 베타-글루카나제(β-glucanase)로 처리하는 단계를 포함하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법에 관한 것이다.

헤마토코커스 플루비알리스, 베타-글루카나제(β-glucanase), 아스타잔틴(astaxanthin)

Description

글루칸 분해효소를 이용하여 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법{Method of extraction for astaxanthin from Haematococcus pluvialis using glucanase}

의료수준의 향상, 고른 영양섭취에 의한 고령화 인구의 증가추세에 따른 현대인의 건강에 대한 관심 증가 및 삶의 질에 대한 인식변화와 더불어 노화억제와 질병치료에 영향을 미치는 기능성 식품과 천연물에 대한 관심이 높아지고 있다.

노화억제에 대한 기능성 물질로서 항산화 물질에 대한 관심이 증가되고 있다.

항산화 물질로서 지용성 비타민 E인 알파-토코페롤(α-tocopherol)이 널리 알려져 있으며, 이외에도 아스타잔틴(astaxanthin)이 있다.

알파-토코페롤에 비하여 항산화력이 550배에 해당하는 강력한 항산화 물질인 아스타잔틴(astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 갑각류, 조류 등의 해양생물에 존재하는 케토-카로티노이드(keto-carotenoid)로서 베타-카로틴(β-carotene)과 매우 유사한 구조를 지니고 있다(Shimidzu et al., Carotenoids as singlet oxygen quenchers in marine organisms. Fish. Sci., 62, 134-137. 1996).

아스타잔틴의 강력한 항산화활성은 구조의 C-4, C-4'에 위치한 옥소(oxo-) 그룹 때문이라고 보고되어 있고[Hong et al., Biological functions and production technology of carotenoids. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 27, 1279-1306. 1998], 아스타잔틴의 항산화 기작은 일중항 산소(singlet oxygen)를 제거하거나[During et al., β-carotene 15, 15-deoxygenase activity and cellular retinal-binding protein type II level are enhanced by dietary unsaturated triacylglycerols in rat intestines. J. Nutr., 128, 1614-1619. 1998], 자유라디컬 소거능[Jorgensen and Skibsted, Carotenoid scavenging radicals. Effect of carotenoid structure and oxygen partial pressure on antioxidative activity. Z. Lebensm. Unters Forsch., 196, 423-429. 1993; Naguib, Antioxidant activities of astaxanthin and related carotenoids. J. Agric. Chem., 48, 1150-1154. 2000], 과산화물 연쇄반응(peroxide chain reaction)을 정지시키는 것으로 알려져 있다[Lim et al., Antioxidant activity of xanthophylls on peroxyl radical-mediated phospholipid peroxidation. Biochim. Biophys. Acta, 1126, 178-184. 1992; Nakagawa et al., Inhibition by beta-carotene and astaxanthin of NADPH -dependent microsomal phospholipid peroxidation. J. Nutr. Sci. Vitamin, 43, 345-355. 1997].

아스타잔틴의 항산화 기작 중 일중항 산소의 제거에 의해 항암에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그 예로 아스타잔틴의 활성산소(oxygen radical) 제거에 의한 개시(cancer initiation)와 진행(propagation)의 과정을 감소시켜 난소암, 간암에 대한 예방효과 등이 보고된 바 있다[Chew et al., A comparison of the anticancer activities of dietary beta-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo. Anticancer Res., 19, 1849-1854. 1999; Jyonouchi et al., Antitumor activity of astaxanthin and its mode of action. Nutr. Cancer., 36, 59-65. 2000; Marnett, potential mediators of tumor initiation and promotion. Carcinogenesis, 8, 1365-1373. 1987].이 외에도 아스타잔틴의 항암효과에 대한 많은 연구결과가 보고되었다[Batieha, Serum micronutrients and the subsequent risk of cervical cancer in a population-based nested case-control cancer epidemiology. Biomarkers Prev., 2, 335-339 1993; Bertram, Cancer prevention by retinoids and carotenoids : proposed role of GAP junctional communication. In : Vitamins and minerals in the prevention and treatment of cancer. M. M. Jacobs, CRC Press, Boca Raton, 31-50. 1991]. 또한 아스타잔틴은 면역기능에 활성이 있는 것으로 알려져 있고[Bendich, Non vitamin a activity of carotenoids : immunoenhancement. Food Sci. Technol. Res., 2, 127-130 1991; Bendich, Carotenoids and the immune response. J. Nutr., 119, 112-115 1989; Bendich, Carotenoids and the immune system. In : Carotenoids Chemistry and Biology. N. I. Krinsky, Plenum Press, New York, 323-335 1990; Tomita et al., Preventive action of carotenoids on the development of lymphadenopathy and proteinuria in MRL-lpr/lpr mice. Autoimmunity, 16, 95-102 1993; Breimer, Molecular mechanisms of oxygen radical carcinogenesis and mutagenesis : the role of DNA base damage, Mol. Carcinog., 3, 188-197 1990; Yonouchi, Astaxanthin enhances in vitro antibody production to T-dependent antigens without facilitating polyclonal B-cell activation. Nutr. Cancer, 19, 269-280. 1993], 심장질환에 대한 치료효과가 보고되었다[Kritchevsky, β-Carotene, carotenoids and the prevention of coronary heart disease. J. Nutr., 129, 5-8 1999; Frei Cardiovascular disease and nutrient antioxidants : role of low-density lipoprotein oxidation. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 35, 83-98 1995]. 이 외에도 항염증 효과[Aghdassi and Allard, Breath alkanes as a marker of oxidative stress in different clinical conditions. Free Radic., Biol. Med. 28, 880-886 2000], 자외선 차단 효과[Lee, Carotenoid supplementation reduces erythema in human skin after simulated solar radiation exposure. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 223, 170-174 2000], 눈 기능과 관련된 효과[Snodderly, Evidence for portection against age-related macular degeneration by carotenoids andantioxidant vitamins. Am. J. Clin. Nutr., 62, 1448-1461 1995; Landrum, Analysis of zeaxanthin distribution within individual human retinas. Meth. Enzymol., 299, 457-467 1999], 간기능에 대한 영향[Gradelet, Dietary carotenoids inhibit aflatoxin B1-induced liver preneoplastic foci and DNA damage in the rat: role of the modulation of aflatoxin B1 metabolism. Carcinogenesis 19, 403-411 1998], 숙취효과[한국특허 제 10-0540498호] 등 여러 가지 다양한 기능성이 입증되면서 의약품이나 화장품, 식품 등의 소재로 활용이 기대되고 있는 물질이다.

기존에 상용화된 아스타잔틴은 화학적으로 합성하거나 갑각류나 미생물에서 추출하여 생산되고 있다. 화학적으로 합성된 아스타잔틴은 대부분 유리형태(free astaxanthin)로 생체 내에서 활성이 감소되고, 빛이나 온도에 대한 안정성이 낮아 사용에 제한이 있는 실정이다. 게, 새우 등의 갑각류로부터 추출에 의해 제조된 아스타잔틴도 높은 회분과 키틴 함량으로 사용이 제한되고 있고, 효모인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma)는 효모의 성장속도가 빠르고 별도의 색소 추출 과정을 필요로 하지 않는 다른 점에서 유리하지만, 아스타잔틴 함량이 0.15∼0.4％로 생산성이 낮고, 생체이용률이 낮은 3R, 3'R 형태(form)만을 생산하는 단점이 있어서 현재 식품으로 사용이 금지되어 있다. 반면 해양 녹조류인 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 아스타잔틴 함유량이 6-8％로 높은 편이고, 생체이 용율이 높은 3S, 3'S 아이소머(isomer) 형태의 아스타잔틴(astaxanthin)을 생산하는 천연공급원으로 알려져 있다[Guerin et al., applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol., 21, 210-216 2003; Stepnowski et al., Recovery of astaxanthin from seafood wastewater utilizing fish scales waste. Chemosphere, 54, 413-417 2004; Nageswara et al., Preparative isolation and characterization of some minor impurities of astaxanthin by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1076, 189-192 2005; Chumpokulwong et al., Ezymatic conversion of beta-carotene to astaxanthin by cell-extracts of green alga Haematococcus pluvialis. Biotechnol. Lett., 19, 443-446 1997].

헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)는 광합성 미생물 중의 하나인 녹색 단세포조류(unicellular green algae)로 휴면 단계에서 세포내부에 아스타잔틴을 다량 축적한다. 따라서, 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴을 추출하는 것은 세포벽을 깨고 내부에 있는 색소를 유리시켜야 하기 때문에 오랜 추출 시간을 필요로 하고 추출이 어렵다. 헤마토코커스 플루비알리스의 세포벽을 파괴하는 기술로는 임펙트 밀[미국특허 제4871551호], 균질기(homogenizers)[Yuan et al., Purification of trans-astaxanthin from a high-yielding astaxanthin ester-producing strain of the microalga Haematococcus pluvialis. Food Chem., 68, 443-448. 2000; Lignell, Method for increasing the production of/in breeding and production animals in the poultry industry. 1997, 미국특허 제5744502호]을 이용하는 기계적인 처리방법과 셀룰로오스 분해효소(cellulase), 헤 미셀룰로오스 분해효소(hemicellulase), 펙틴 분해효소(pectinase) 등의 세포벽을 분해하는 효소를 처리하거나 세포벽의 단백질 분해를 위해 단백질 분해효소(protease)를 사용하는 생물학적 처리방법[Lee, Process development for astaxanthin production by microalgae. Ministry of Maritime Affairs & Ficheries 2003]이 알려져 있다. 기계적인 처리법으로 세포벽을 파괴하여 카로티노이드 색소를 추출할 경우 낮은 색소 추출율과 높은 색소의 파괴율의 문제점이 있고, 균체를 직접적으로 에탄올, 아세톤 등의 유기용매로 추출하는 방법은 추출효율이 낮고 처리비용이 높아 실용화가 어려운 문제점이 있다.

근래에 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴을 추출하는 방법으로 이산화탄소(CO₂)를 이용한 초임계 추출방법, 마이크로웨이브(microwave)를 이용한 추출방법, 유기용매 추출법 등이 있다. 초임계 추출방법은 헤마토코커스 플루비알리스 조류를 배양한 후 건조, 분쇄한 것을 초임계유체를 이용하여 약 5∼10％의 함량을 가진 아스타잔틴 추출물을 얻는 방법[Lim et al., Extraction method of astaxanthin using supercritical fluid extraction. 2003, 한국특허 제 10-0465556]으로서 효율이 좋고 유기용매의 사용을 최소화할 수 있어서 화장품이나 의약품의 첨가제로 사용할 수 있으나 추출비용이 매우 높아 경제성이 매우 낮은 추출방법이다. 마이크로웨이브를 이용한 추출방법은 헤마토코커스 플루비알리스를 배양한 후 이를 물에 현탁시켜 마이크로웨이브 처리하고 용매를 이용하여 추출한 후 원심분리를 통해 농축하는 방법[Han et al., Process for extracting astaxanthin pigment from blue-green algae and extracted pigment thereof. 2000, 한국특허 제 10-0411364]으로서 대량생산이 어렵고, 조류를 현탁시키는 방법에도 많은 문제점을 수반한다. 현재 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴을 안정적으로 추출하기 위한 연구가 계속 시도되고 있다.

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출에 있어서, 헤마토코커스 플루비알리스를 글루칸 분해효소, 바람직하게는 베타-글루카나제로 처리하는 단계를 포함하여 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴 추출시 글루칸 분해효소(β-glucanase)의 사용은 글루칸 분해효소 처리 전과 비교하여 아스타잔틴 추출효율을 향상시킬 수 있다.

또한 본 발명에 의해 헤마토코커스 플루비알리스로부터 안정한 에스터(ester) 형태의 천연 아스타잔틴을 추출할 수 있다.

본 발명은 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스 타잔틴의 추출방법을 나타낸다.

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 추출에 있어서, 헤마토코커스 플루비알리스를 글루칸 분해효소로 처리하는 단계, 글루칸 분해효소로 처리된 헤마토코커스 플루비알리스를 유기용매로 추출하되 상기 유기용매 추출시 초음파 처리하는 단계를 포함하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법을 나타낸다.

상기에서 글루칸 분해효소는 베타-글루카나제(β-glucanase)를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용된 글루칸 분해효소(β-glucanase)는 글루칸을 분해하는 효소의 총칭으로 글루칸의 β-1,3 결합을 가수분해하고 올리고당 또는 글루코오스를 생성하며, 글루칸(β-glucan)에 작용하는 방법에 따라 엔도(endo)형과 엑소(exo)형으로 나뉘어질 수 있다. 글루칸분해효소는 사상균, 담자균, 세균 또는 효모 등의 미생물과 동물, 식물에 널리 존재하며, 효모의 세포벽 분해나 보리 글루칸의 분해에 이용되고 있다.

상기에서 글루칸 분해효소는 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 0.1∼5％의 베타-글루카나제로 헤마토코커스 플루비알리스를 처리할 수 있다.

상기에서 글루칸 분해효소는 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 0.1∼5％ 의 베타-글루카나제로 헤마토코커스 플루비알리스를 35∼40℃에서 30분∼60분 동안 처리할 수 있다.

상기에서 글루칸 분해효소로 처리한 헤마토코커스 플루비알리스를 아세톤, 에탄올, 주정 및 염화메틸렌과 메탄올이 1:3의 부피비로 혼합된 혼합용매의 군으로부터 선택된 어느 하나인 유기용매로 추출하되 상기 유기용매 추출시 초음파 처리를 동시에 실시할 수 있다.

상기에서 글루칸 분해효소로 처리한 헤마토코커스 플루비알리스를 아세톤, 에탄올, 주정 및 염화메틸렌과 메탄올이 1:3의 부피비로 혼합된 혼합용매의 군으로부터 선택된 어느 하나인 유기용매에 0.1∼1％(w/v)로 첨가하여 추출하되 상기 유기용매 추출시 초음파 처리를 동시에 실시할 수 있다.

상기 글루칸 분해효소로 처리한 헤마토코커스 플루비알리스를 초음파 처리시 초음파 처리는 30∼50kHz으로 30∼120분 동안 실시할 수 있다.

상기에서 글루칸 분해효소로 처리한 헤마토코커스 플루비알리스를 유기용매 및 초음파 처리 후 저주파 처리, 전기장 처리 및 자기장 처리의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단계를 추가로 더 실시할 수 있다.

상기 저주파 처리는 유기용매 및 초음파 처리된 헤마토코커스 플루비알리스에 5∼10kHz에서 1분∼30분 동안 저주파 처리를 실시할 수 있다.

상기 전기장 처리는 유기용매 및 초음파 처리된 헤마토코커스 플루비알리스에 5∼20kv에서 1분∼30분 동안전기장 처리를 실시할 수 있다.

상기 자기장 처리는 유기용매 및 초음파 처리된 헤마토코커스 플루비알리스에 5∼30가우스(Gauss)에서 1분∼30분 동안 자기장 처리를 실시할 수 있다.

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스 타잔틴(astaxanthin)의 추출시 글루칸 분해효소 및 유기용매 처리 후 쉐이킹(shaking) 및 원심분리(centrifuge) 후 동결건조(freeze drying)를 시켜 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴을 얻을 수 있다.

본 발명은 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 추출시 글루칸 분해효소 및 유기용매 처리 후 100∼300rpm으로 30∼60분 동안 쉐이킹(shaking) 및 3000∼3500rpm으로 5∼15분 동안 원심분리(centrifuge) 후 -80℃∼-10℃의 온도에서 동결건조(freeze drying)를 시켜 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴을 얻을 수 있다.

본 발명의 글루칸 분해효소를 이용하여 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법에 대해 조사한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 글루칸 분해효소를 이용하여 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법을 제공하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명의 내용을 실험예, 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 아스타잔틴 표준용액의 제조 및 함량 측정 방법

헤마토코커스 플루비알리스 내의 아스타잔틴의 함량을 측정하기 위해 시그마 사(Sigma, MO, USA)의 92％ 합성 아스타잔틴 시약(A9335 astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione, minimum 92％, CAS Number : 472-61-7)을 표준시약으로 사용하였다.

먼저 500㎖의 용적 플라스크에 상기 아스타잔틴 표준시약 50㎎을 취하고, 메탄올 100㎖을 가하여 30분간 40kHz의 초음파를 가하여 완전히 용해시켜 이를 표준용매로 사용한다. 표준용매를 2배씩 단계적으로 희석하여 12.5㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 3.125㎍/㎖, 1.56㎍/㎖, 0.78㎍/㎖의 농도로 표준용액을 제조하였다.

표준용액을 HPLC system(Agilent 1100, Agilent Technologies Inc., CA, USA)을 이용하여 컬럼은 Apollo C18(5μ, 4.6×250mm, Alltech Associates, IL, USA), 검출기는 UV 검출기(474nm)를 사용하여 유속 1㎖/min로 하고 오븐온도는 40℃, 이동상으로는 메탄올과 증류수를 95 : 5의 부피비율로 혼합한 용매를 사용하여 아스타잔틴 표준용액의 HPLC 크로마토그램을 얻었으며(도 1 참조), 상기 아스타잔틴 표준용액의 HPLC 크로마토그램를 분석하여 검량선을 작성하였다(도 2 참조). 검량선을 통하여 얻은 식을 이용하여 아스타잔틴 함량을 구한다. 결과는 다음과 같다.

Y(area) = 101.6X아스타잔틴 농도(concentration of astaxanthin) + 54

<실험예 2> 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴 함량 측정 실험

헤마토코커스 플루비알리스 내의 아스타잔틴의 함량을 구하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용한다.

헤마토코커스 플루비알리스에서 추출된 에스터(ester) 형의 아스타잔틴을 유리상태의 아스타잔틴으로 전환시키기 위해 헤마토코커스 플루비알리스 추출물을 다음과 같이 가수분해(hydrolysis)를 실시하였다. 아세톤을 용매로 하여 추출한 헤마토코커스 플루비알리스 추출물 1.5㎖을 취하여 2㎖의 0.05M Tris-HCl 완충용액(pH 7.0)과 혼합하여 37℃에서 2분 동안 예열시킨 후, 콜레스테롤 에스터라아제(cholesterol esterase)(3.4unit/㎖) 0.5㎖을 첨가하여 37℃ 항온수조에서 45분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate, Na₂SO₄) 0.44g과 석유에테르(petroleum ether) 4㎖을 첨가하여 30초 동안 교반한 후 원심분리(3200rpm, 10min)하여 석유에테르 층을 회수하였다. 회수된 층을 새로운 시험관으로 옮겨 헤마토코커스 플루비알리스 추출물 내의 용매를 휘발시켰다.

가수분해된 유리형의 헤마토코커스 플루비알리스 추출물을 메탄올에 용해시켜 실험예 1과 같은 방법으로 HPLC 분석을 수행하였다.

헤마토코커스 플루비알리스 원료에서 추출된 에스터(ester) 형의 아스타잔틴은 HPLC 상에서 분석되지 않아 유리(free) 형태로 전환시켜주기 위해 가수분해하였다. HPLC 분석 조건에 따라 분석한 결과 헤마토코커스 플루비알리스 추출물은 아스타잔틴 피크가 분석되지 않았고(도 3 참조), 유리(free) 형태로 전환시켜준 헤마토코커스 플루비알리스 추출물은 아스타잔틴 피크를 확인할 수 있었다(도 4 참조)

<실험예 3> 헤마토코커스 플루비알리스와 효모의 글루칸 함량 측정

추출에 사용된 헤마토코커스 플루비알리스 원료는 헤마토코커스 플루비알리스의 세포벽을 분해시킨 건조균체(Haematococcus pluvialis cracked cell) 상태로, 아스타잔틴 함량 1.5％의 Parry Nutraceutical사(India) 제품과 카로티노이드 생산균인 효모균 Rhodotorula glutinis(KCTC 7948) 균주를 한국균주은행(한국)로부터 분양받아 배양하여 건조균체를 사용하였고, 글루칸 함량을 측정하기 위해 Megazyme사의 kit(K-YBGL)를 사용하였다.

헤마토코커스 플루비알리스의 세포벽을 분해시킨 건조균체, 효모균 R. glutinis(KCTC 7948) 균주에 대한 글루칸 함량 측정 결과, 효모균의 경우에는 21％ 정도의 함량을 나타냈으나, 헤마토코커스 플루비알리스의 세포벽을 분해시킨 건조균체의 경우에는 기존에 조류의 글루칸 분석 사례가 없고, kit도 판매되지 않아 효모 분석용 kit로 분석하여 정확한 결과 값은 얻지 못하였으나, 대략 3.37％ 정도의 함량을 나타냈다(표 1 참조).

표 1. 헤마토코커스 플루비알리스와 효모의 글루칸 함량

시료	글루칸 함량 (％, 건조균체량 기준)
효모(R. glutinis)	21.00 ± 0.71
H. pluvialis	3.37 ± 0.77

<실시예 1> 효소처리에 의한 총 카로티노이드의 추출

글루칸 분해효소에 의해 총 카로티노이드 추출에 영향을 미치는지 알아보기 위해 헤마토코커스 플루비알리스 균체와 효모균인 R. glutinis(KCTC 7948) 건조 균 체를 추출원료로 하여 글루칸 분해효소 처리군과 글루칸 분해효소 무처리군의 총 카로티노이드 추출 함량을 비교하였다. 효모균의 경우 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용매의 영향도 함께 검토하였다.

총 카로티노이드 함량은 흡광계수 E = 2500으로 하여 흡광도 값을 측정하여 다음의 식으로 계산하였다.

실험결과, 글루칸 분해효소를 사용하여 전처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 헤마토코커스 플루비알리스 균체의 경우 약 1.3배 정도 카로티노이드 추출수율이 높아지는 것으로 나타났으며(표 2 참조), 효모균(R. glutinis)의 경우 약 1.7배 정도 카로티노이드 추출수율이 높아지는 것으로 나타났다(표 3 참조). 이상의 결과로 효모와 해양녹조류로부터 카로티노이드의 추출시 글루칸 분해효소를 사용한 경우, 효소를 사용하지 않은 경우와 비교하여 약 1.3∼1.7배 가량 추출수율을 높이는 것을 알 수 있었다.

표 2. 헤마토코커스 플루비알리스 균체의 카로티노이드 함량

전처리조건	카로티노이드 함량 (μg/g-H. pluvialis)
글루칸 분해효소 처리	1888.74 ± 38.48
글루칸 분해효소 무처리	1366.61 ± 29.45

표 3. 효모균(R. glutinis)의 카로티노이드 함량

전처리조건	카로티노이드 함량 (μg/g-yeasts)
글루칸 분해효소 처리	38.40 ± 2.40
글루칸 분해효소 무처리	22.40 ± 0.80
DMSO 처리	29.60 ± 0.36

<실시예 2> 효소와 용매 및 초음파 처리를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출

추출에 사용된 헤마토코커스 플루비알리스 원료는 헤마토코커스 플루비알리스의 세포벽을 분해시킨 건조균체(H. pluvialis cracked cell) 상태로, 아스타잔틴 함량 1.5％의 Parry Nutraceutical사(India) 제품을 사용하였다.

헤마토코커스 플루비알리스의 아스타잔틴 추출효율을 향상시키고자 용매추출법을 수행하기 전, 글루칸 분해효소를 이용하여 헤마토코커스 원료의 전처리를 실시하였다.

인산완충용액(pH 8)에 헤마토코커스 플루비알리스를 0.5％(w/v)의 비율로 현탁시킨 후, 다양한 상업용 글루칸 분해효소(β-glucanase)를 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 0∼5％로 각각 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소반응 종료 후, 원심분리로 침전물을 회수하였다. 침전물을 아세톤, 에탄올, 주정 및 염화메틸렌과 메탄올(1:3, v/v)의 혼합물에 각각 0.5％(w/v)의 농도로 첨가하고 40kHz으로 75분 동안 초음파 처리(Power sonic 510, Hwashin, Korea)한 후, 300rpm으로 30분 동안 교반하여 아스타잔틴을 추출하였다.

글루칸 분해효소 첨가량에 따른 아스타잔틴 추출효율 영향을 알아보기 위해 글루칸 분해효소의 함량을 달리하여 실험한 결과, 글루칸 분해효소를 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 3％ 이상 첨가하면 아스타잔틴의 추출량이 감소하였고, 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 2％ 첨가까지는 글루칸 분해효소 함량에 비례해서 아스타잔틴의 추출량이 증가하는 경향을 나타냈다. 아스타잔틴 추출시 글루칸 분해효소의 사용은 효소처리 전과 비교하여 아스타잔틴 추출효율을 30％ 이상 향상시킬 수 있음을 확인하였다(표 4 참조).

추출용매의 선정이 효소처리에 의한 추출율 향상에 미치는 영향을 검토하기 위해 효소처리 없는 추출공정에서 사용했던 4가지 용매(아세톤, 에탄올, 주정, 염화메틸렌과 메탄올(1:3, v/v) 혼합물)로 각각 추출한 다음 효소처리에 의한 추출효율에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 효소처리 없는 추출공정에서 선정했던 아세톤이 마찬가지로 가장 추출효율이 높음을 확인하였다(표 5 참조).

표 4. 글루칸 분해효소 투입 함량의 영향

글루칸 분해효소의 함량(％)	아스타잔틴 함량 (μg/g-H. pluvialis)
0.00	1644.23 ± 36.93
1.00	1893.16 ± 82.93
1.50	2124.87 ± 23.99
2.00	2495.70 ± 101.93
3.00	1688.06 ± 13.03
5.00	1646.54 ± 15.57

표 5. 글루칸 분해효소 처리 공정 후, 추출용매의 영향

추출용매	아스타잔틴 함량 (μg/g-H. pluvialis)
Acetone	2199.921 ± 21.9151
Dichloromethane:MeOH	1916.929 ± 64.07412
Ethanol	1816.535 ± 14.87064
Prethanol A	1096.89 ± 29.23246

<실시예 3>

헤마토코커스 플루비알리스 세포 내의 탄수화물 및 단백질을 분해하여 아스파잔틴 추출율 향상을 도모하고자 글루칸 분해효소 이외에 여러 가지 효소를 사용하여 추출실험을 실시한 결과, 용매 추출 전에 글루칸 분해효소(β-glucanase)를 이용하여 추출한 경우 추출율을 1.3배 향상시킬 수 있었다. 한편 다양한 당류 분해효소 중에서도 β-glucanase(Tunicase FN) 단일 효소 처리시 아스타잔틴 추출수율이 높음을 확인하였다(표 6 참조).

표 6. 효소 종류에 따른 아스타잔틴 추출수율

효소처리 조건	아스타잔틴 함량 (μg/g-H. pluvialis)
효소무처리구	593.21 ± 14.21
Ultraflo L(β-glucanase 외 4종)	1432.13 ± 53.06
Ceremix 6X MG(β-glucanase 외 4종)	1267.19 ± 109.90
Promozyme 400 L(pullulanases)	992.91 ± 80.97
Pectinex 100 L (Pectintranseliminase 외 4종)	1008.34 ± 79.56
Pentopan 500 BG(xylanase)	1676.80 ± 17.71
Tunicase FN(β-glucanase)	1737.87 ± 114.02

* Ultraflo L은 베타-글루카나제(β-glucanase) 외에 셀룰라제(cellulase), 자일라나제(xylanase), 펜노산나제(pentosanase), 아라바나제(arabanase) 등의 4종의 효소를 각각 동일한 중량비로 혼합한 효소를 사용하였다.

* Ceremix 6X MG는 베타-글루카나제(β-glucanase) 외에 셀룰라제(celulase), 프로테인나제(proteinase), 알파-아밀라제(alpha-amylase), 펜토산나제(pentosanase) 등의 4종의 효소를 각각 동일한 중량비로 혼합한 효소를 사용하였다.

* Pectinex 100L은 펙틴트랜스엘리미나제(Pectintranseliminase)외에 폴리갈락투로나제(polygalacturonase), 펙틴에스터라제(pectinesterase), 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제 (hemicellulase) 등의 4종의 효소를 각각 동일한 중량비로 혼합한 효소를 사용하였다.

<실시예 4> 저주파 처리를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출

추출에 사용된 헤마토코커스 원료는 헤마토코커스 플루비알리스의 세포벽을 분해시킨 건조균체(H. pluvialis cracked cell) 상태로, 아스타잔틴 함량 1.5％의 Parry Nutraceutical사(India) 제품을 사용하였다.

인산완충용액(pH 8)에 헤마토코커스 플루비알리스를 0.5％(w/v)의 비율로 현탁시킨 후, 글루칸 분해효소로소 베타 글루카나제(β-glucanase)를 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 2％로 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소반응 종료 후, 원심분리로 침전물을 회수하였다. 침전물을 아세톤에 0.5％(w/v)의 농도로 첨가하고 40kHz으로 75분 동안 초음파 처리(Power sonic 510, Hwashin, Korea)한 다음 300rpm으로 30분 동안 교반한 후 7.5kHz에서 10분 동안 저주파 처리를 실시하여 아스타잔틴을 추출하고 추출된 아스타잔틴의 함량을 아래의 표 7에 나타내었다.

<실시예 5> 전기장 처리를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출

인산완충용액(pH 8)에 헤마토코커스 플루비알리스를 0.5％(w/v)의 비율로 현 탁시킨 후, 글루칸 분해효소로소 베타 클루카나제(β-glucanase)를 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 2％로 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소반응 종료 후, 원심분리로 침전물을 회수하였다. 침전물을 아세톤에 0.5％(w/v)의 농도로 첨가하고 40kHz으로 75분 동안 초음파 처리(Power sonic 510, Hwashin, Korea)한 다음 300rpm으로 30분 동안 교반한 후 10kv에서 15분 동안 전기장 처리를 실시하여 아스타잔틴을 추출하고 추출된 아스타잔틴의 함량을 아래의 표 7에 나타내었다.

<실시예 6> 자기장 처리를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출

인산완충용액(pH 8)에 헤마토코커스 플루비알리스를 0.5％(w/v)의 비율로 현탁시킨 후, 글루칸 분해효소로소 베타 클루카나제(β-glucanase)를 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 2％로 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소반응 종료 후, 원심분리로 침전물을 회수하였다. 침전물에 아세톤을 0.5％(w/v)의 농도로 첨가하고 40kHz으로 75분 동안 초음파 처리(Power sonic 510, Hwashin, Korea)한 다음 300rpm으로 30분 동안 교반하고 15가우스(Gauss)에서 10분 동안 자기장 처리를 실시하여 아스타잔틴을 추출하고 추출된 아스타잔틴의 함량을 아래의 표 7에 나타내었다.

표 7. 대조구 및 실시예 4 내지 실시예 6의 아스타잔틴의 함량

항목	아스타잔틴 함량 (μg/g-H. pluvialis)
실시예 4	1876.536 ± 20.75
실시예 5	1891.929 ± 23.17
실시예 6	1877.535 ± 22.57
대조구*	1056.89 ± 23.26

*상기 표 7에서 대조구는 베타 클루카나제(β-glucanase), 초음파 처리 및 저주파 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법을 사용하여 아스타잔틴의 함량을 측정한 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의해 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 추출 효율을 증대시킬 수 있어 아스타잔틴의 생산을 향상시킬 수 있다.

도 1은 아스타잔틴 표준용액의 HPLC 크로마토그램이다.

도 2은 아스타잔틴의 HPLC 검량선이다.

도 3은 가수분해 전, 헤마토코커스 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.

도 4은 가수분해 후, 헤마토코커스 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.

Claims

헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)로부터 아스타잔틴(astaxanthin)의 추출에 있어서,

헤마토코커스 플루비알리스를 글루칸 분해효소로 처리하는 단계,

글루칸 분해효소로 처리된 헤마토코커스 플루비알리스를 유기용매로 추출하되, 상기 용매추출시 초음파 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법.
제1항에 있어서, 글루칸 분해효소는 베타-글루카나제(β-glucanase)인 것을 특징으로 하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법.
제1항에 있어서, 글루칸 분해효소는 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 0.1∼5％의 베타-글루카나제인 것을 특징으로 하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법.
제1항에 있어서, 글루칸 분해효소는 헤마토코커스 플루비알리스 중량 대비 0.1∼5％의 베타-글루카나제를 35∼40℃에서 30분∼60분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴 의 추출방법.
제1항에 있어서, 글루칸 분해효소로 처리한 헤마토코커스 플루비알리스를 아세톤, 에탄올, 주정, 염화메틸렌과 메탄올이 1:3의 부피비로 혼합된 혼합용매의 군으로부터 선택된 어느 하나의 유기용매에 0.1∼1％의 비율로 첨가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법.
제1항에 있어서, 초음파 처리는 30∼50kHz으로 30∼120분 동안 실시하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법.
제1항에 있어서, 글루칸 분해효소로 처리 및 유기용매로 처리된 헤마토코커스 플루비알리스를 저주파 처리, 전기장 처리 및 자기장 처리의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 처리가 추가로 더 실시되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루칸 분해효소를 이용한 헤마토코커스 플루비알리스로부터 아스타잔틴의 추출방법.