KR20240028416A - 핵산 올리고머를 함유하는 조성물 - Google Patents

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KR20240028416A
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스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 함유하는 안정적인 조성물, 그 제조 방법 및 당해 조성물로부터의 상기 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공한다.
식 (1)

(식 중, 기호는 명세서 내에 정의된 바와 같음.) 로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 니트릴계 유기 용매, 물 및 식 (3a) 내지 (3h) 로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물을 함유하는 첨가제를 함유하는 조성물은 안정적인 조성물이다.

Description

핵산 올리고머를 함유하는 조성물
본 발명은, 핵산 올리고머를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, 더 상세하게는 포스포로티오에이트를 함유하는 핵산 올리고머를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
최근, 핵산 올리고머의 의료 분야에 대한 응용에 관심이 높아지고 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산, 앱타머, 리보자임, 및 siRNA 등의 RNA 간섭 (RNAi) 을 유도하는 핵산 등을 들 수 있고, 이것들은 핵산 의약품으로 불리고 있다.
핵산 올리고머는, 고상 합성법에 의해 합성되는 것이 알려져 있으며, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머도 고상법으로 합성되는 유용한 화합물로서 알려져 있다 (특허문헌 1).
국제 공개 공보 제2017/068377호
포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머는, 그 제조 과정에서의 안정성이 문제가 되는 경우가 있다. 본 발명은, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 함유하는 안정적인 조성물, 그 제조 방법, 및 당해 조성물로부터의 상기 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는, 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 고상 합성법에 있어서의 포스포아미다이트법에 의해 생성되는, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머의 조 (粗) 생성물을 역상 크로마토그래피 처리에 의해 얻어지는 핵산 올리고머를, 알킬암모늄염, 니트릴계 유기 용매, 물, 및 어느 첨가제를 혼합하여 얻어지는 조성물이 안정화될 수 있음을 알아내었다. 따라서, 본 발명은, 당해 조성물, 그 제조 방법, 및 당해 조성물로부터의 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 이하의 양태를 포함하지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
1. 식 (1) :
(식 중,
BC 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이한 핵산 염기를 나타내고,
R 은, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 불소 원자, 또는 OQ 기를 나타내고,
Q 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 메틸기, 2-메톡시에틸기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸리덴기를 나타내고,
X 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (다만, 적어도 1 개의 X 는 황 원자를 나타낸다.),
Y 는, 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타내고,
G 는, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 알칼리 금속 이온, 수소 이온 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고, 그리고,
n 은, 식 (2) :
15≤n (2)
를 만족하는 정수이다.)
로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 니트릴계 유기 용매, 물, 및 첨가제를 함유하는 조성물이고, 그 첨가제가 하기 식 (3a) 내지 (3h) 로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물을 함유하는 첨가제인 것을 특징으로 하는 조성물.
식 (3a) : P(L1)3,
식 (3b) : P(OL1)3,
식 (3c) : P(L1)2(OL1),
식 (3d) : PL(OL1)2,
식 (3e) : PH(O)(OL1)2,
식 (3f) : PH(O)L1(OL1),
식 (3g) : (P(L1)2)2-L2,
식 (3h) :
,
(식 (3a) ∼ (3h) 의 각각에 있어서, L1 은 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―10 아릴기, 또는 C1―6 알킬기를 나타내고,
L2 는 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―14 아릴렌기, 또는 C1―6 알킬렌기를 나타내고, 그리고,
L3 은 C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―14 아릴렌기를 나타낸다.)
2. 첨가제가, 트리페닐포스핀, 아인산디에틸, 아인산트리에틸, 디에톡시페닐포스핀, 에톡시디페닐포스핀, 및 9,10-디하이드로-9-옥사-10-포스파페난트렌-10-옥사이드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인, 전항 1 에 기재된 조성물.
3. 상기 알킬암모늄염이, 모노알킬암모늄염 및 디알킬암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 알킬암모늄염인, 전항 1 내지 2 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
4. 상기 니트릴계 유기 용매가 아세토니트릴인, 전항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
5. 상기 식 (1) 에 있어서, R 이 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기인, 전항 1 ∼ 4 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
6. 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 조성물과, C1―4 알코올, 테트라하이드로푸란 및 디옥산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 혼합하여, 석출된 핵산 올리고머를 단리하는 것을 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
7. 고상 합성법으로 합성된 식 (1) 의 핵산 올리고머의 조생성물을 역상 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 얻어진 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 및 물을 함유하는 칼럼 용출액을 첨가제와 혼합하는 것을 포함하는, 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
본 발명에 따라, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 함유하는 안정적인 조성물, 그것을 사용한 상기 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법이 제공된다.
도 1 은, 포스포아미다이트법에 의한 핵산 올리고머의 합성의 예를 나타내는 도면이다.
상기 식 (1) 로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 니트릴계 유기 용매, 물, 및 첨가제를 함유하는 조성물이고, 그 첨가제가 디술파이드 결합을 갖는 화합물, 및 술파이드 결합을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물에 대해서 설명한다.
상기 식 (1) 에 있어서, BC 로 나타내는 핵산 염기 (이하, 「염기」 라고 기재하는 경우도 있다.) 는, 천연 또는 비천연의 핵산 염기여도 된다. 이러한 비천연의 핵산 염기로서는, 천연 또는 비천연의 핵산 염기의 수식 아날로그가 예시된다. 핵산 염기로서는, 전형적으로는 퓨린 화합물 및 피리미딘 화합물이 예시되고, 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호, 「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」, 858 ∼ 859 페이지, 크로슈비츠 제이 아이 (Kroschwitz J. I.) 편, John Wiley ＆ Sons, 1990, 및 잉글리쉬 등 (Englisch 등), Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30 권, p.613 에 개시된 핵산 염기가 예시된다.
구체적으로는, 예를 들어, 아데닌, 이소구아닌, 크산틴, 히포크산틴 및 구아닌 등의 퓨린 염기 ; 및, 시토신, 우라실 및 티민 등의 피리미딘 염기 등이 예시된다.
또한, BC 로 나타내는 핵산 염기로서는, 예를 들어, 2-아미노아데닌, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린 등의 아미노 유도체 ; 5-메틸우라실, 5-메틸시토신, 7-메틸구아닌, 6-메틸퓨린, 2-프로필퓨린 등의 알킬 유도체 ; 5-할로우라실 및 5-할로시토신 ; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신 ; 6-아자우라실, 6-아자시토신 및 6-아자티민 ; 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실 ; 8-할로화, 아미노화, 티올화, 티오알킬화, 하이드록실화 및 기타 8-치환 퓨린 ; 5-트리플루오로메틸화 및 기타 5-치환 피리미딘 ; 6-아자피리미딘 ; N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린 (2-아미노프로필아데닌을 포함한다) ; 디하이드로우라실 ; 3-데아자-5-아자시토신 ; 7-데아자아데닌 ; N6-메틸아데닌, N6,N6-디메틸아데닌 ; 5-아미노-알릴-우라실 ; N3-메틸우라실 ; 치환 1,2,4-트리아졸 ; 2-피리디논 ; 5-니트로인돌 ; 3-니트로피롤 ; 5-메톡시우라실 ; 우라실-5-옥시아세트산 ; 5-메톡시카르보닐메틸우라실 ; 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실 ; 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실 ; 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실 ; 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실 ; 3-메틸시토신 ; N4-아세틸시토신 ; 2-티오시토신 ; N6-메틸아데닌 ; N6-이소펜틸아데닌 ; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌 ; N-메틸구아닌 ; O-알킬화 염기 등이 예시된다.
R 이 OQ 기를 나타내고, Q 가 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸리덴기를 나타낼 때, 당해 구조는, 하기의 식 (3) 에 있어서 나타내는 LNA-1, LNA-2 및 LNA-3 의 구조로 나타내어진다.
(식 중, BC 는, 상기와 같은 핵산 염기를 나타낸다.)
Y 로 나타내는 수산기의 보호기로서는, 아미다이트법에 있어서 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 아미다이트 화합물에 대하여 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다. Y 로 나타내는 수산기의 보호기는, 바람직하게는 이하의 기이다.
(식 중, R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며 수소 또는 알콕시기를 나타낸다.)
상기 알콕시기로서는, 예를 들어 메톡시기가 예시된다.
식 (1) 의 핵산 올리고머의 사슬 길이는, n≥15 이다. 사슬 길이의 상한으로는, 예를 들어 n≤200 이 예시된다. 상기 핵산 올리고머에 있어서는, n 개 있는 X 의 적어도 1 개가 황 원자이고, X 가 전부 황 원자여도 된다. 예를 들어, n＝103 인 경우, 황 원자의 수는 6, 12 또는 20 이 예시된다.
식 (1) 의 핵산 올리고머는, 예를 들어, DNA 또는 RNA 올리고머, 혹은 이들 올리고머에 비천연형 핵산 염기를 포함하는 것이어도 된다. 상기 핵산 올리고머는, 전형적으로는 1 개 사슬의 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 상기 식 (1) 의 핵산 올리고머에 있어서, 치환기 R 은, 바람직하게는 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기이다. 상기 핵산 올리고머로서는, 치환기 R 이, 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기인 식 (1) 의 핵산 올리고머인 RNA 가 바람직하다. 더 상세하게는, 치환기 R 이 하이드록시기인 뉴클레오티드와 메톡시기인 뉴클레오티드의 양방을 포함하는 핵산 올리고머가 바람직하다.
상기 조성물 중의 핵산 올리고머의 농도는, 통상적으로 0.05 mg/mL ∼ 5 mg/mL 이고, 바람직하게는 0.05 mg/mL ∼ 1 mg/mL 이고, 보다 바람직하게는 0.1 mg/mL ∼ 0.5 mg/mL 이다.
상기 알킬암모늄염으로는, 통상적으로 모노알킬암모늄염, 디알킬암모늄염, 및 트리알킬암모늄염이 사용되며, 바람직하게는 모노알킬암모늄염 및 디알킬암모늄염, 보다 바람직하게는 디알킬암모늄염이 사용된다. 모노알킬암모늄염을 형성하는 모노알킬아민의 탄소수는, 바람직하게는 3 ∼ 10 이고, 보다 바람직하게는 4 ∼ 6 이고, 더욱 바람직하게는 헥실아민이다. 디알킬암모늄염을 형성하는 디알킬아민의 탄소수는, 바람직하게는 4 ∼ 10 이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 9 이다. 바람직한 디알킬아민은, 디 n-부틸아민이다. 트리알킬암모늄염을 형성하는 트리알킬아민은, 탄소수 6 ∼ 12 의 것이 바람직하고, 6 ∼ 9 의 것이 보다 바람직하고, 구체적으로는 트리에틸아민이 예시된다.
상기 모노알킬암모늄염, 디알킬암모늄염 및 트리알킬암모늄염을 형성하는 산으로는, 예를 들어, 탄산, 아세트산, 포름산, 트리플루오로아세트산 및 프로피온산이 예시된다.
상기 암모늄염의 농도로서는, 통상적으로 1 ∼ 200 mM 이고, 바람직하게는 5 ∼ 150 mM 이고, 보다 바람직하게는 20 ∼ 100 mM 이다.
상기 니트릴계 유기 용매로서는 아세토니트릴이 예시된다. 상기 조성물 중의 니트릴계 유기 용매의 양은 상기 조성물의 전체 질량당, 통상적으로 10 ∼ 70 ％ 이고, 바람직하게는 20 ∼ 60 ％ 이고, 보다 바람직하게는 30 ∼ 50 ％ 이다 (이상 ％ 는 전부 질량％ 를 나타낸다).
상기 조성물은 알코올계 유기 용매를 추가로 함유하고 있어도 된다. 알코올계 유기 용매로서는, C1―4 알코올이 예시되고, C1―3 알코올이 바람직하고, C1―2 알코올이 보다 바람직하고, 메탄올이 더욱 바람직하다. 상기 조성물 중의 알코올계 유기 용매의 양은, 그 조성물의 전체 질량당, 통상적으로 0 ∼ 20 ％ 이고, 바람직하게는 0 ∼ 15 ％ 이고, 보다 바람직하게는 0 ％ ∼ 10 ％ 이다 (이상 ％ 는 전부 질량％ 를 나타낸다).
물의 양은, 상기 성분의 농도 범위를 만족시키도록 밸런스를 맞추는 양이면 되고, 그 조성물의 전체 질량당, 통상적으로 90 ％ ∼ 30 ％ 이고, 바람직하게는 80 ％ ∼ 40 ％ 이고, 보다 바람직하게는 70 ％ ∼ 40 ％ 이다 (이상 ％ 는 전부 질량％ 를 나타낸다).
상기 식 (3a) 내지 (3h) 로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물에 대해서 설명한다.
L1 로 나타내는 C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―10 아릴기에 있어서의 C1―6 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 펜틸기 및 헥실기가 예시되고, 이러한 알킬기 중, C1―4 알킬기가 보다 바람직하고, C1―2 알킬기가 더욱 바람직하다. C1―6 의 알콕시기로서는, 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기, 및 헥실옥시기가 예시된다. C6―10 아릴기로서는, 페닐기, 1-나프틸기, 및 2-나프틸기가 예시되고, 페닐기가 바람직하다. C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환된 C6―10 아릴기로서는, 예를 들어 톨릴기, 메톡시페닐기가 예시된다.
식 (3a) 로 나타내는 구체적인 화합물로서는, 트리페닐포스핀이 예시된다.
L1 로 나타내는 C1―6 알킬기로서는, 상기와 동일한 기가 예시된다. 식 (3b) 로 나타내는 화합물의 구체예로서는, 예를 들어 아인산트리에틸이 예시된다.
식 (3c) 로 나타내는 화합물의 구체예로서는, 예를 들어 에톡시디페닐포스핀이 예시된다.
식 (3d) 로 나타내는 화합물의 구체예로서는, 예를 들어 디에톡시페닐포스핀이 예시된다.
식 (3e) 로 나타내는 화합물의 구체예로서는, 예를 들어 아인산디에틸이 예시된다.
식 (3f) 로 나타내는 화합물의 구체예로서는, 예를 들어 페닐포스핀산에틸이 예시된다.
L2 로 나타내는, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―14 아릴렌기로서는, 1,2-페닐렌기, 1,8-나프틸렌기, 및 1,6-비페닐렌기가 예시된다.
L2 로 나타내는, C1―6 알킬렌기로서는, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 펜틸렌기, 및 헥실렌기가 예시된다.
L3 으로 나타내는, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―14 아릴렌기로서는, 상기한 L2 에 관해서 예시된 것과 동일한 것이 예시된다.
식 (3g) 로 나타내는 구체적인 화합물로서는, 예를 들어 1,2-비스(디페닐포스피노)벤젠, 1,8-비스(디페닐포스피노)나프탈렌, 및 2,2'-비스(디페닐포스피노)비페닐이 예시된다.
식 (3h) 로 나타내는 화합물의 구체예로서는, 예를 들어 9,10-디하이드로-9-옥사-10-포스파페난트렌-10-옥사이드가 예시된다.
상기 첨가제의 농도로서는, 통상적으로 0.1 μM ∼ 100 mM 이며, 바람직하게는 1 mM ∼ 10 mM 이다.
본 발명의 조성물은, 통상적으로 고상 합성법으로 합성된 식 (1) 의 핵산 올리고머의 조생성물을, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 및 물을 함유하는 이동상을 사용한 역상 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 얻어진 칼럼 용출액에, 상기 첨가제를 첨가하여 얻어진다. 혹은, 미리 상기 첨가제를 함유하는 이동상을 사용함으로써, 역상 칼럼 크로마토그래피의 용리 분획으로서 본 발명의 조성물을 조제해도 된다. 여기에서, 상기 수용성 유기 용매란, 상기 니트릴계 수용성 유기 용매, 및 적절하게 통상적으로 유기 분야에서 알려진 친수성 유기 용매 (예를 들면, 상기 알코올계 유기 용매) 를 함유하는, 유기 용매를 의미한다.
역상 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어지는 용리 분획은, 일반적으로 핵산의 분리 분석에 사용하는 크로마토그래피의 조건 하에서, 파장 260 ㎚ 의 UV 흡수로 조성을 분석하여, 선택되고 수집된다. 수집된 분획으로부터 정제된 목적물인 소정량의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머가 얻어진다. 상기 분석법으로는, 예를 들어 비특허문헌 (Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press) 에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
상기 역상 칼럼 크로마토그래피의 충전제로서는, 소수성의 고정상이 되는 실리카 또는 폴리머로서, 예를 들어, 페닐기, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기 및 시아노프로필기에서 선택되는 어느 1 종 이상이 고정된 실리카 또는 폴리머가 예시된다. 이러한 충전제인 실리카 또는 폴리머로서는, 예를 들어, 입자경이 2 ㎛ 이상 혹은 5 ㎛ 이상인 것이 사용된다.
역상 칼럼 크로마토그래피의 이동상으로는, 예를 들어, 상기와 같은 농도 및 pH 의 암모늄염의 수용액을 포함하는 이동상 및 상기 수용성 유기 용매를 포함하고, 그 농도를 순차적으로 증대시키는 구배를 가하여 사용하는 이동상이 사용된다. 역상 칼럼 크로마토그래피의 온도는, 통상적으로 20 ∼ 100 ℃ 이고, 바람직하게는 30 ∼ 80 ℃ 이고, 보다 바람직하게는 40 ∼ 70 ℃ 이다. 본 발명의 조성물은, 전형적으로는 상기와 같은 역상 칼럼 크로마토그래피의 용리액 분획으로서 얻어진다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 보관 공정 후에, 핵산 올리고머를 단리 하기 위해서, 재침전 공정, 분액 공정, 한외 여과 공정, 탈보호 공정, 및 동결 건조 공정과 같은 후처리 공정에서 선택되는 단일 혹은 복수의 공정에 제공해도 된다. 보관 공정에서는, 불활성 가스를 사용함으로써 보관 용기 내의 분위기를 치환해도 된다. 불활성 가스로서는, 예를 들어, 질소 가스, 아르곤 가스, 및 헬륨 가스가 예시된다.
재침전 공정에서는, 안정화된 용액을, 빈용매와 접촉시키고, 핵산 올리고머를 석출시켜 단리할 수 있다. 필요하다면, 고액 분리한 상태로부터 액체부를 제거하고 나서, 여과 등에 의해 석출된 핵산 올리고머를 수집하여 단리해도 된다. 재침전 공정의 빈용매로서는, 산소 원자를 적어도 1 개 갖는 C1―C4 의 유기 용매 (예를 들어, C1―C4 알코올, 테트라하이드로푸란, 디옥산) 를 들 수 있다. 이러한 용매로서는, 에탄올 또는 이소프로판올이 바람직하다.
분액 공정에서는, 안정화된 용액에 아세트산 수용액 등의 산성 수용액, 물, 및 식염수 등 중의 적어도 1 종을 혼합하고, 추가로 물과 혼화되지 않은 유기 용매를 첨가함으로써 수층과 유기층으로 분액하고, 원하는 핵산 올리고머를 함유하는 수층을 취득할 수 있다.
한외 여과 공정에서는, 한외 여과막을 사용하여 보관 공정 후의 용액 중에 존재하는 핵산 올리고머를 원하는 분자량 이하의 저분자 성분과 분리할 수 있다.
핵산 올리고머의 5' 말단 부위에 보호기가 있는 경우에는, 이것을 탈보호하기 위해서, 보관 공정 후의 용액에 아세트산 수용액 등의 산성 수용액, 또는 아세트산 등의 산성 물질을 유기 용매에 용해한 용액을 혼합함으로써, 핵산 올리고머의 보호기를 탈보호할 수 있다.
동결 건조 공정에서는, 동결시킨 핵산 올리고머의 수용액을 감압함으로써 물을 승화시켜, 핵산 올리고머와 수분을 분리할 수 있다.
포스포아미다이트법에 의한 핵산 올리고머의 합성은, 공지된 방법 (예를 들어, 상기 일본 특허공보 제5157168호 또는 일본 특허공보 제5554881호에 기재된 방법) 에 따라서 핵산 신장 반응을 실시할 수 있다. 포스포아미다이트법에 의한 핵산 올리고머의 제조에 대해서는, 도 1 에 나타내는 스킴의 RNA 의 합성을 예로 들어, 이하에 나타내는 반응 경로 (예를 들어, 축합 반응, 산화, 탈보호) 를 참조하면서 핵산 올리고머의 제조 방법에 대해서 설명한다.
반응 경로를 나타내는 상기 화학식 중, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기이고, Tr 은 보호기이고, X 는, 상기 정의한 바와 같으며, SP 는 무기 다공질 담체의 뉴클레오시드 구조 이외의 부분을 각각 나타내고 있다.
뉴클레오시드 구조를 갖는 무기 다공질 담체 (Sp-Nu) 및 아미다이트 모노머 (Am-1) 의 뉴클레오시드를 구성하는 핵산 염기는, 상기와 같은 핵산 염기 또는 보호기에 의해 보호된 핵산 염기이다.
적합한 아미다이트 모노머 (Am-1) 의 예로서는, 하기 화학식 (Am-1') 로 나타내는 화합물에 있어서, R 이, 보호된 수산기를 나타낼 때, 구체적인 보호기로서는, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS) 기, 비스(2-아세톡시)메틸 (ACE) 기, (트리이소프로필실릴옥시)메틸 (TOM) 기, (2-시아노에톡시)에틸 (CEE) 기, (2-시아노에톡시)메틸 (CEM) 기, 파라-톨루일술포닐에톡시메틸 (TEM) 기, (2-시아노에톡시)메톡시메틸 (EMM) 기 등에 의해 보호된, TBDMS 아미다이트 (TBDMS RNA Amidites, 상품명, ChemGenes Corporation), ACE 아미다이트, TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, TEM 아미다이트 (Chakhmakhcheva 의 총설 : Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol.39, No.1, pp.1-21.), EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호에 기재) 등이 예시된다.
(식 중, R 은, 상기와 같은 기를 나타내고, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타낸다.)
[RNA 의 고상 합성]
무기 다공질 담체 (Sp-Nu) 의 Tr 기를 탈보호하여, 고상 담체 (Am-2) 를 얻는다. 그 후, 아미다이트 모노머 (Am-1) 과, 고상 담체 (Am-2) 를 축합 반응시켜, 반응 생성물 (Am-3) 을 얻는다. 그 후, 반응 생성물 (Am-3) 을 산화시켜, 생성물 (Am-4) 를 얻는다. 그 후, 생성물 (Am-4) 를 탈보호 (-Tr) 하여, 생성물 (Am-5) 를 얻는다. 이어서, 아미다이트 모노머 (Am-1) 과 생성물 (Am-5) 를 추가로 축합 반응시켜, 포스포디에스테르 결합을 신장시켜 간다. 이와 같이 신장된 올리고뉴클레오티드 사슬 말단의 5' 위치의 하이드록실기를, 원하는 서열이 되도록, 일련의 탈보호, 축합 반응, 산화의 사이클을 필요한 만큼 반복하고, 그 후, 고상 담체로부터 잘라냄으로써, 원하는 서열의 핵산 분자를 제조할 수 있다. 이러한 합성은, 포스포아미다이트법을 채용하는 핵산 자동 합성 장치 등을 사용하며 실시해도 된다. 여기서는, RNA 를 예로 들어 설명하지만, 리보뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 화합물에도 적용할 수 있는 것이다.
Tr 기를 탈보호하는 공정에서는, 고상 담체 상에 담지되는 RNA 사슬 말단의 5' 위치의 하이드록실기의 보호기를 탈보호한다. 보호기로서는, 트리틸계 보호기 (전형적으로는 4,4'-디메톡시트리틸기 (DMTr 기)) 가 사용된다. 탈보호는, 산을 사용하여 실시할 수 있다. 탈보호용 산으로는, 예를 들어, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로메탄술폰산, 메탄술폰산, 염산, 아세트산, 및 p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있다.
축합 공정에서는, 상기의 탈보호하는 공정에 의해 탈보호한 RNA 사슬 말단의 5' 위치의 하이드록실기에 대하여, 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 결합시켜, 포스파이트를 생성한다. 상기 뉴클레오시드 포스포아미다이트로서는, 5' 위치의 하이드록실기가 보호기 (예를 들어 DMTr 기) 에 의해 보호된 것을 사용한다.
또한, 축합 공정은, 상기 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 활성화하는 활성화제를 사용하여 실시할 수 있다. 활성화제로서는, 예를 들어, 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT), 1H-테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT), N-메틸벤즈이미다졸륨트리플레이트 (N-MeBIT), 벤즈이미다졸륨트리플레이트 (BIT), N-페닐이미다졸륨트리플레이트 (N-PhIMT), 이미다졸륨트리플레이트 (IMT), 5-니트로벤즈이미다졸륨트리플레이트 (NBT), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBT), 및 5-(비스-3,5-트리플루오로메틸페닐)-1H-테트라졸 (Activator-42) 등을 들 수 있다.
축합 공정 후에는, 적절하게 미반응의 5' 위치의 하이드록실기를 캡핑해도 된다. 캡핑은, 무수 아세트산-테트라하이드로푸란 용액, 페녹시아세트산 무수물/N-메틸이미다졸 용액 등의 공지된 캡핑 용액을 사용하여 실시할 수 있다.
산화 공정은, 상기 축합 공정에 의해 형성된 포스파이트를 산화시키는 공정이다. 산화 공정은, 산화제를 사용하여 실시할 수 있다. 산화제로서는, 요오드, m-클로로퍼벤조산, tert-부틸하이드로퍼옥사이드, 2-부타논퍼옥사이드, 비스(트리메틸실릴)퍼옥사이드, 1,1-디하이드로퍼옥시시클로도데칸, 및 과산화수소 등을 들 수 있다.
아인산트리에스테르기를 티오인산트리에스테르기로 변환하는 경우에는, 「산화제」 로서, 예를 들어, 황, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드 (Beaucage 시약), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ADTT), 5-페닐-3H-1,2,4-디티아졸-3-온 (POS), [(N,N-디메틸아미노메틸리덴)아미노]-3H-1,2,4-디티아졸린-3-티온 (DDTT), 및 페닐아세틸디술파이드 (PADS) 를 사용할 수 있다. 그 산화제는, 0.001 ∼ 2 M 의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 피리딘 또는 이것들의 임의의 비율의 2 종류 이상의 혼합 용매를 들 수 있다.
산화 공정은, 상기 캡핑 조작 후에 실시해도 되고, 반대로 산화 공정 후에 캡핑 조작을 실시해도 되고, 이 순번은 한정되지 않는다.
산화 공정 후에는, 탈보호 공정으로 되돌아가, 합성해야 할 핵산 올리고머의 뉴클레오티드 서열에 따라서, 상기 축합 반응, 산화, 탈보호의 일련의 공정을 반복함으로써, 원하는 서열을 갖는 RNA 를 합성할 수 있다.
원하는 서열을 갖는 핵산 올리고머의 합성이 완료된 후에는, 암모니아 또는 아민 화합물을 사용하여, 고상 담체로부터 RNA 사슬을 절단하여 회수한다.
여기서의 아민 화합물로는, 예를 들어, 메틸아민, 에틸아민, 이소프로필아민, 에틸렌디아민, 디에틸아민, 및 트리에틸아민 등을 들 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 핵산 올리고머의 사슬 길이는, 예를 들어 n≥60, n≥80 또는 n≥100, 그리고, n≤200 인 것이 예시된다. 바람직하게는, n≥60 이다. 구체적으로는, 예를 들어 n＝67, 100 또는 120 이다.
인산 보호기를 탈보호하는 공정은, 원하는 서열을 갖는 핵산의 합성이 완료된 후에는, 인산 부분의 보호기를 탈보호하기 위해서 아민 화합물을 작용시킨다. 아민 화합물로는, 예를 들어 기재되는 디에틸아민 등을 들 수 있다.
리보스의 2' 위치 또는 3' 위치의 수산기의 보호기가 있는 경우에는, 국제 공개 공보 제2006/022323호), 국제 공개 공보 제2013/027843호, 또는 국제 공개 공보 제2019/208571호에 기재된 방법에 따라서 제거할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
측정 방법
이하의 시험에서 사용한 각 측정 방법을 이하에 나타낸다.
(측정 방법 1 : RNA 의 순도의 측정 방법)
분취 후 용액 중의 RNA 의 순도의 측정은, HPLC 에 의해 실시하였다. 분취된 RNA 를 HPLC (파장 260 ㎚, 칼럼 DNAPacTM PA200, 4.0 ㎜ × 250 ㎜, 8.0 ㎛) 에 의해 각 성분으로 분리하고, 얻어진 크로마토그램의 피크의 총 면적값에 있어서의 주생성물의 피크의 면적값으로부터 RNA 의 순도를 산출하였다. HPLC 측정 조건을 하기 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00006
참고예 1
1. RNA 의 아미다이트법에 의한 고상 합성
이하에 나타내는 사슬 I 의 핵산 서열을 갖는 RNA 를 합성하였다. 당해 사슬은 103 염기 길이로 이루어진다.
상기 서열의 표기에 있어서, 뉴클레오티드 사이의 기호 * 는, 뉴클레오티드를 연결하는 인산 결합이, 포스포로티오에이트인 것을 나타낸다.
당해 RNA 는, 포스포아미다이트법에 의거하여, 핵산 합성기 (AKTA oligopilot plus100 GE 헬스케어사) 를 사용하며 3' 측에서 5' 측으로 합성하였다. 합성은 63 μmol 스케일로 실시하였다. 또한, 당해 합성에는 RNA 아미다이트로서, 각각 하기 식의 우리딘 EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재), 시티딘 EMM 아미다이트 (동 실시예 3 에 기재), 아데노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 4 에 기재), 및 구아노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 5 에 기재) 를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질티오-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 황화제로서 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온을 사용하고, 캡핑 용액으로서 무수 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다. 핵산 신장 종료 후 담체 상의 핵산에 디에틸아민 용액을 작용시킴으로써 인산 부분의 시아노에틸 보호기를 선택적으로 탈보호하였다. 여기서, EMM 은, (2-시아노에톡시)메톡시메틸기의 약호이다.
고상 합성 후의 고상 담체로부터의 잘라내기와 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하고, 잠시 정치 (靜置) 시킨 후에 고상 담체를 여과하고, 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 RNA 를, 주사용 증류수를 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해하였다.
2. RNA 의 분취 정제
하기 표 2 의 조건에서 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 다만, 정제 전에 칼럼 내에 이동상 A 를 유속 4.7 mL/min 으로 12.5 분간 통액한 후에 샘플을 첨가하였다. 유지 시간 94.2 분 ― 95.8 분까지를 분취하고, 얻어진 용액을 HPLC 로 분석하였다. 또, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 그 결과, 순도는 87.7 ％ 였다. 이 분취 정제된 RNA 용액을 사용하여 이하의 실시예 및 비교예의 실험을 실시하였다.
Figure pct00009
실시예 1
참고예 1 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 99 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액을 1 μL 혼합하여, 소정 농도의 시료를 조제하였다. 혼합 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온도 조절된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치시켰다. 정치 후, 인큐베이터에서 취출한 헤드 스페이스 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
트리페닐포스핀의 농도가, 3 mM (0.09 ％) 로 조제된 조성물은, 계산에 따르면, 이하의 조성을 갖는다. 물 : 63.79 ％, 아세토니트릴 : 34.87 ％, 디부틸아민 : 0.84 ％, 아세트산 : 0.39 ％ (디부틸암모늄아세트산으로서 1.23 ％), 핵산 농도 : 0.21 mg/mL (0.02 ％).
비교예 1
참고예 1 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 100 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온도 조절된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치시켰다. 정치 후, 인큐베이터에서 취출한 헤드 스페이스 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00010
1) 참고예 1 에서 조제한 핵산 (순도 87.7 ％) 을 60 ℃/8 시간 정치시킨 후의 핵산의 순도를 나타낸다.
2) 핵산의 유지율 (％)＝정치 후의 핵산 순도/정치 전의 핵산 순도
[참고예 2]
RNA 의 아미다이트법에 의한 고상 합성
이하에 나타내는 사슬 II 의 핵산 서열을 갖는 RNA 를 합성하였다. 당해 사슬은 67 염기 길이로 이루어진다.
상기 서열의 표기에 있어서, 뉴클레오티드 사이의 기호 * 는, 뉴클레오티드를 연결하는 인산 결합이, 포스포로티오에이트인 것을 나타낸다. 알파벳 Am, Um, Cm, Gm 은 2' 수산기가 메톡시기로 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다. 당해 RNA 는, 포스포아미다이트법에 의거하여, 핵산 합성기 (AKTA oligopilot plus100 GE 헬스케어사) 를 사용하며 3' 측에서 5' 측으로 합성하였다. 합성은 53 μmol 스케일로 실시하였다. 또한, 당해 합성에는 RNA 아미다이트로서, 우리딘 EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재), 시티딘 EMM 아미다이트 (동 실시예 3 에 기재), 아데노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 4 에 기재), 및 구아노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 5 에 기재) 와, 각각 하기 식의 우리딘 2'OMe 아미다이트, 시티딘 2'OMe 아미다이트, 아데노신 2'OMe 아미다이트, 및 구아노신 2'OMe 아미다이트를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질티오-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 황화제로서 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온을 사용하고, 캡핑 용액으로서 무수 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다. 핵산 신장 종료 후 담체 상의 핵산에 디에틸아민 용액을 작용시킴으로써 인산 부분의 시아노에틸 보호기를 선택적으로 탈보호하였다. 여기서, EMM 은, (2-시아노에톡시)메톡시메틸기의 약호이다.
고상 합성 후의 고상 담체로부터의 잘라내기와 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하고, 잠시 정치시킨 후에 고상 담체를 여과하고, 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 RNA 를, 주사용 증류수를 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해하였다.
RNA 의 분취 정제
하기 표 4 의 조건에서 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 다만, 정제 전에 칼럼 내에 이동상 A 를 유속 4.7 mL/min 으로 12.5 분간 통액한 후에 샘플을 첨가하였다. 유지 시간 66.7 분 ― 70.9 분까지를 분취하고, 얻어진 용액을 HPLC 로 분석하였다. 또, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 그 결과, 순도 94.2 ％ 였다. 이 분취 정제된 RNA 용액을 사용하여 이하의 실시예 및 비교예의 실험을 실시하였다.
[실시예 2]
참고예 2 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 99 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액을 1 μL 혼합하여, 트리페닐포스핀의 농도가 3 mM 인 시료를 조제하였다. 혼합 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온도 조절된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치시켰다. 정치 후, 인큐베이터에서 취출한 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
트리페닐포스핀의 농도가 3 mM (0.09 ％) 로 조제된 조성물은, 계산에 따르면, 이하의 조성을 갖는다. 물 : 62.02 ％, 아세토니트릴 : 33.06 ％, 메탄올 : 3.60 ％, 디부틸아민 : 0.82 ％, 아세트산 : 0.38 ％ (디부틸암모늄아세트산으로서 1.20 ％), 핵산 농도 : 0.31 mg/mL (0.03 ％)
[실시예 3]
실시예 2 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액 대신에 아인산디에틸의 아세토니트릴 용액을 사용하여 아인산디에틸의 농도를 3 mM (0.05 ％) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건에서 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 4]
실시예 2 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액 대신에 아인산트리에틸의 아세토니트릴 용액을 사용하여 아인산트리에틸의 농도를 3 mM (0.05 ％) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건에서 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 5]
실시예 2 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액 대신에 디에톡시페닐포스핀의 아세토니트릴 용액을 사용하여 디에톡시페닐포스핀의 농도를 3 mM (0.07 ％) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건에서 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 6]
실시예 2 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액 대신에 에톡시디페닐포스핀의 아세토니트릴 용액을 사용하여 에톡시디페닐포스핀의 농도를 3 mM (0.08 ％) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건에서 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 7]
실시예 2 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액 대신에 9,10-디하이드로-9-옥사-10-포스파페난트렌-10-옥사이드의 아세토니트릴 용액을 사용하여 9,10-디하이드로-9-옥사-10-포스파페난트렌-10-옥사이드의 농도를 3 mM (0.07 ％) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건에서 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[비교예 2]
참고예 2 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 100 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온도 조절된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치시켰다. 정치 후, 인큐베이터에서 취출한 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
1) 참고예 2 에서 조제한 핵산 (순도 94.2 ％) 을 60 ℃/8 시간 정치시킨 후의 핵산의 순도를 나타낸다.
2) 핵산의 유지율 (％)＝정치 후의 핵산 순도/정치 전의 핵산 순도
[참고예 3]
RNA 의 분취 정제
참고예 2 에서 얻어진 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시한 RNA 에 대해서, 하기 표 6 의 조건에서 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 다만, 정제 전에 칼럼 내에 이동상 A 를 유속 4.7 mL/min 으로 12.5 분간 통액한 후에 샘플을 첨가하였다. 유지 시간 91.7 분 ― 94.2 분까지를 분취하고, 얻어진 용액을 HPLC 로 분석하였다. 또, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 그 결과, 순도 95.1 ％ 였다. 이 분취 정제된 RNA 용액을 사용하여 이하의 실시예 및 비교예의 실험을 실시하였다.
[실시예 8]
참고예 3 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 99 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 첨가제 용액으로서 트리페닐포스핀의 아세토니트릴 용액을 1 μL 혼합하여, 트리페닐포스핀의 농도가 3 mM 인 시료를 조제하였다. 혼합 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온도 조절된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 14 시간 정치시켰다. 정치 후, 인큐베이터에서 취출한 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
트리페닐포스핀의 농도가 3.0 mM (0.09 ％) 로 조제된 조성물은, 계산에 따르면, 이하의 조성을 갖는다. 물 : 59.70 ％, 아세토니트릴 : 35.36 ％, 메탄올 : 3.84 ％, 헥실아민 : 0.61 ％, 아세트산 : 0.36 ％ (헥실암모늄아세트산으로서 0.97 ％), 핵산 농도 : 0.35 mg/mL (0.04 ％).
[비교예 3]
참고예 3 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 100 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온도 조절된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 14 시간 정치시켰다. 정치 후, 인큐베이터에서 취출한 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
1) 참고예 2 에서 조제한 핵산 (순도 95.1 ％) 을 60 ℃/14시간 정치시킨 후의 핵산의 순도를 나타낸다.
2) 핵산의 유지율 (％)＝정치 후의 핵산 순도/정치 전의 핵산 순도
[실시예 9] (분취 정제된 RNA 용액으로부터의 RNA 의 회수)
실시예 8 에 있어서 트리페닐포스핀의 농도가 3 mM 가 되도록 혼합하고, 60 ℃ 에서 14 시간 정치시킨 용액을 사용하여 이하의 처리를 하였다. 용액 60 μL 를 용량 15 mL 의 폴리프로필렌제 코니칼 튜브 (Corning 사) 에 넣고, 아세트산나트륨 수용액 (3M, pH＝5.2) 을 30 μL, 에탄올을 180 μL 추가하였다. 얻어진 슬러리 용액을 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하여, 상청액을 제거하였다. 계속해서 70 ％ 에탄올 수용액을 150 μL 넣고, 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하여, 상청액을 제거하는 조작을 2 회 반복하여 RNA 를 얻었다. 얻어진 RNA 를 물 60 μL 에 용해하고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 분획 중의 RNA 의 순도를 산출하면, 순도는 93.1 ％ 였다.
[비교예 4]
비교예 3 에 있어서 60 ℃ 에서 14 시간 정치시킨 용액을 사용하여 이하의 처리를 하였다. 용액 60 μL 를 용량 15 mL 의 폴리프로필렌제 코니칼 튜브 (Corning 사) 에 넣고, 아세트산나트륨 수용액 (3M, pH＝5.2) 을 30 μL, 에탄올을 180 μL 추가하였다. 얻어진 슬러리 용액을 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하여, 상청액을 제거하였다. 계속해서 70 ％ 에탄올 수용액을 150 μL 넣고, 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하여, 상청액을 제거하는 조작을 2 회 반복하여 RNA 를 얻었다. 얻어진 RNA 를 물 60 μL 에 용해하고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 분획 중의 RNA 의 순도를 산출하면, 순도는 83.0 ％ 였다.
본 발명의 방법에 따르면 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 안정화시켜, 효율적으로 제조할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열표의 서열 번호 1 및 2 는, 본 발명의 제조 방법에 따라서 제조되는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED <120> COMPOSITION CONTAINING NUCLEIC ACID OLIGOMER <130> S46012WO01 <150> JP 2021-112316 <151> 2021-07-06 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (100)..(102) <223> phosphorothioate derivative of uracil <220> <221> modified_base <222> (1)..(1), (3)..(3) <223> phosphorothioate derivative of adenosine <400> 1 nnnacucaau uuguaaaaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuun nnu 103 <210> 2 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4), (6)..(6), (14)..(14), (25)..(25), (37)..(37), (42)..(46) <223> am <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (7)..(7), (22)..(22), (41)..(41), (47)..(47), (55)..(55), (61)..(61), (63)..(63) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (29)..(29), (38)..(38), (53)..(54) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5), (39)..(40), (48)..(48), (62)..(62) <223> um <220> <221> modified_base <222> (23)..(23), (28)..(28) <223> phosphorothioate derivative of cytosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24), (27)..(27) <223> phosphorothioate derivative of uracil <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> phosphorothioate derivative of guanine <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methylguanosine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3), (64)..(64) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methylcytidine <220> <221> modified_base <222> (65)..(66) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methyluridine <400> 2 nnnnnnncaa guunaaauaa gnnnnnnnng uuaucannnn nnnnnnnngg cannnagucg 60 nnnnnnu 67

Claims (7)

  1. 식 (1) :

    (식 중,
    BC 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이한 핵산 염기를 나타내고,
    R 은, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 불소 원자, 또는 OQ 기를 나타내고,
    Q 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 메틸기, 2-메톡시에틸기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸리덴기를 나타내고,
    X 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (다만, 적어도 1 개의 X 는 황 원자를 나타낸다.),
    Y 는, 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타내고,
    G 는, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 알칼리 금속 이온, 수소 이온 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고, 그리고,
    n 은, 식 (2) :
    15≤n (2)
    를 만족하는 정수이다.)
    로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 니트릴계 유기 용매, 물, 및 첨가제를 함유하는 조성물이고, 그 첨가제가 하기 식 (3a) 내지 (3h) 로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물을 함유하는 첨가제인 것을 특징으로 하는 조성물.
    식 (3a) : P(L1)3,
    식 (3b) : P(OL1)3,
    식 (3c) : P(L1)2(OL1),
    식 (3d) : PL(OL1)2,
    식 (3e) : PH(O)(OL1)2,
    식 (3f) : PH(O)L1(OL1),
    식 (3g) : (P(L1)2)2-L2,
    식 (3h) :

    ,
    (식 (3a) ∼ (3h) 의 각각에 있어서, L1 은 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―10 아릴기, 또는 C1―6 알킬기를 나타내고,
    L2 는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하며, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―14 아릴렌기, 또는 C1―6 알킬렌기를 나타내고, 그리고,
    L3 은, C1―6 알킬기 및 C1―6 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6―14 아릴렌기를 나타낸다.)
  2. 제 1 항에 있어서,
    첨가제가, 트리페닐포스핀, 아인산디에틸, 아인산트리에틸, 디에톡시페닐포스핀, 에톡시디페닐포스핀, 및 9,10-디하이드로-9-옥사-10-포스파페난트렌-10-옥사이드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인, 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 알킬암모늄염이, 모노알킬암모늄염 및 디알킬암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 알킬암모늄염인, 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 니트릴계 유기 용매가 아세토니트릴인, 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식 (1) 에 있어서, R 이 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기인, 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물과, C1―4 알코올, 테트라하이드로푸란 및 디옥산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 혼합하여, 석출된 핵산 올리고머를 단리하는 것을 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
  7. 고상 합성법으로 합성된 식 (1) 의 핵산 올리고머의 조생성물을 역상 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 얻어진 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 및 물을 함유하는 칼럼 용출액을 첨가제와 혼합하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017068377A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Silence Therapeutics (London) Ltd Modified guide rnas, methods and uses

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
BRPI0514644A (pt) 2004-08-26 2008-06-17 Nippon Shinyaku Co Ltd composto fosforamidita, composto ácido ribonucléico, e método para produzir oligo-rna
KR101761103B1 (ko) 2011-08-25 2017-07-25 가부시키가이샤 보낙 글리코시드 화합물, 티오에테르의 제조방법, 에테르, 에테르의 제조방법, 글리코시드 화합물의 제조방법, 핵산의 제조방법
TW201726917A (zh) * 2015-12-28 2017-08-01 昭和電工股份有限公司 分離分析方法
WO2018141908A1 (en) * 2017-02-03 2018-08-09 Gene Signal International Sa Sterile formulation comprising a stable phosphorothioate oligonucleotide
WO2018212236A1 (ja) * 2017-05-16 2018-11-22 日産化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
JP7280248B2 (ja) 2018-04-24 2023-05-23 住友化学株式会社 アミダイト化合物及び該化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
EP3950698A4 (en) * 2019-03-28 2023-01-25 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING AN OLIGONUCLEOTIDE HAVING A PHOSPHOROTHIOATE SITE
WO2021024465A1 (ja) * 2019-08-08 2021-02-11 住友化学株式会社 核酸分子の製造方法
WO2021024467A1 (ja) * 2019-08-08 2021-02-11 住友化学株式会社 一本鎖ｒｎａの製造方法
EP4137501A4 (en) * 2020-04-14 2024-05-22 Sumitomo Chemical Company, Limited COMPOSITION WITH NUCLEIC ACID OLIGOMER

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017068377A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Silence Therapeutics (London) Ltd Modified guide rnas, methods and uses

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