KR20240022246A - 식물성 저분자 콜라겐 펩타이드를 유효성분으로 함유된 상처치유, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상세하게는 금화규로부터 콜라겐 펩타이드를 수득하고 이를 효소처리하여 식물성 저분자 콜라겐 펩타이드로 제조하는 제조방법에 관한 것이다. 식물성 저분자 콜라겐은 하이드록시프롤린을 함유하는 것을 특징으로하여 상처치유, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 확인할 수 있다. 본 발명은 식물성 저분자 콜라겐 유효성분으로 함유하여 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션을 포함하는 베이스 화장료 및 색조 화장료 적용이 유용하다
Description
본 발명은 식물성 저분자 콜라겐 펩타이드가 유효성분으로 함유된 상처치유, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 금화규로부터 콜라겐 펩타이드를 수득하고 이를 효소처리하여 저분자 콜라겐 펩타이드로 제조할 경우, 상기 효소처리된 저분자 콜라겐 펩타이드로부터 상처치유, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 확인함으로써, 이를 유효성분으로 함유하여 베이스 화장료 및 색조 화장료 적용에 유용한 상처치유, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물의 몸속에 가장 많이 들어 있는 섬유상 단배질로, 피부의 진피층과 결합조직의 주성분이다. 일반적으로 화장품에서 사용하는 콜라겐은 동물의 피부조직에서 추출한 것으로 분자량 약 10만 가량의 폴리펩타이드 사슬이 모인 나선 구조의 단백질을 말한다.
이러한 콜라겐의 주요성분은 프록시 옥시프롤린(하이드록시프롤린), 글리신, 글루탐산등으며, 그중에서도 다른 단백질에서는 존재하지 않는 옥시프롤린의 함량이 높아 이를 콜라겐의 주요 단백질로 지칭하고 있다.
현재 유통되는 콜라겐의 대부분은 돼지 또는 어류를 원료로 선택하여 제조된 동물성 단백질로 최근 동물 유래 소재의 안전성 문제들이 이슈로 나타나고 있다. 따라서, 이들 소재를 대체할 수 있는 안전한 소재의 개발이 필요한 실정이다.
금화규(Hibiseu smanihot)은 일년생 초본식물로 예로부터 오래전부터 약리 활성을 가진 소재로 사용하여 왔다. 금화규에 관한 국내의 기존 연구를 살펴보면, 면역력 강화, 항산화, 항염증 등의 효과가 있어 다양한 분야에 쓰이고 있다.
금화규 추출물을 활용한 선행문헌으로서, 특허문헌 1은 금화규 추출물을 활성성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 섬유아세포의 활성과 콜라겐 합성을 촉진시킴으로 주름을 완화시키고 개선하는 효과를 가진다고 보고 하고 있다.
금화규 추출물을 활용한 선행문헌으로서, 특허문헌 2은 금화규 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 특정 아미노산이 함유된 콜라겐의 제조방법에 대해 보고 하고 있다.
이처럼 금화규에 콜라겐 유사 아미노산이 존재하여 이를 활용하려는 시도가 이루어 지고 있지만, 명확한 성분의 규명이나 피부에서의 효능검증은 잘 이루어지지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 금화규 유래의 콜라겐 펩타이드의 성능을 극대화하기 위하여 노력한 결과, 금화규의 콜라겐을 추출하고 이를 효소처리하여 제조할 경우 많은 양이 하이드록시프롤린이 생성되어 우수한 상처치유, 항산화, 항염 및 주름 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다
저분자화 된 식물성 콜라겐을 유효성분으로 함유하는 상처치유, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 효소처리 된 식물성 콜라겐 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금화규로부터 식물성 콜라겐을 분리하고 효소처리를 통해 저분자화 한 유효성분으로 함유하는 상처치유, , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기의 제조방법에서 식물성 콜라겐의 추출은 금화규의 꽃을 pH 8~9의 알칼리 수용액에 분산시키는 단계와 산을 부가하여 pH 7로 중화하는 단계를 포함한다.
상기에서 효소는 금화규 자체에서 추출한 효소와 파파인, 파인애플로 이루어진 천연효소 조합을 통해 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 금화규 효소와 파파인 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이다.
가장 바람직하게는 상기 효소가 금화규 효소 및 파인 1:0.1 내지 1:0.5 중량비로 이루어진 혼합효소인 것이다.
상기의 제조방법에서, 상기 효소처리는 30 내지 37에서 30 내지 120분 동안 수행하여 식물성 저분자 콜라겐을 제조한다.
상기 화장료 조성물은 식물성 저분자 콜라겐을 총 중량에 대하여 0.1 내지 5중량% 함유된 것이며, 상기 저분자 식물성 콜라겐은 상처치유, 히스타민억제활성, DPPH 자유라디칼 소거능, NO (Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해능을 확인할 수 있다.
따라서, 상기 식물성 저분자 콜라겐 은 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션, 색조 화장료 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 유효성분으로 함유되어, , 항산화, 항염 및 주름개선용도에 유용한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 금화규에서 식물성 콜라겐을 추출하는 단계, 천연 효소 반응을 하는 단계를 통한 식물성 저분자 콜라겐 을 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상세하게는 금화규로부터 콜라겐 펩타이드를 수득하고 이를 효소처리하여 하이드록시프롤린이 다량으로 함유된 식물성 저분자 콜라겐 펩타이드로 제조하는 제조방법에 관한 것으로서, 식물성 저분자 콜라겐 부터 상처치유, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명은 식물성 저분자 콜라겐 유효성분으로 함유하여 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션을 포함하는 베이스 화장료 및 색조 화장료 적용이 유용하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3에 대한 하이드록시플롤린 함량 분석시험 결과이고,
도 2은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3에 대한 세포독성실험 결과이고,
도 3는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3 에 대한 DPPH 자유라디칼 소거능 결과이고,
도 4본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3 에 대한 NO 생성 저해능 결과이고,
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3 에 대한 엘라스타아제 저해능 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3에 대한 세포독성실험 결과이고,
도 3는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3 에 대한 DPPH 자유라디칼 소거능 결과이고,
도 4본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3 에 대한 NO 생성 저해능 결과이고,
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐, 일반 금화규 추출물 비교예 1, 금화규 유래 식물성 콜라겐 비교예 2, 효소 배합비율이 변경된 식물성 콜라겐 비교예3 에 대한 엘라스타아제 저해능 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
금화규 (Hibiseu smanihot)로부터 콜라겐 펩타이드를 수득하고 이를 효소처리한 식물성 저분자 콜라겐 펩타이드가 유효성분으로 함유된 상처치유, , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 식물성 저분자 콜라겐으로부터 상처치유, 히스타민 억제능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO (Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해능을 확인한 결과, 우수한 항산화, 항염 및 주름 개선 효과를 확인함으로써, 본 발명은 상기 식물성 저분자 콜라겐을 유효성분으로 함유하는 , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 식물성 콜라겐이라 함은 금화규에 꽃을 pH 8~9의 알칼리 수용액에 분산시키는 단계와 산을 부가하여 pH 7로 중화하는 단계를 통해 추출한 추출물을 의미한다.
상기 효소는 상기에서 효소는 금화규 자체에서 추출한 효소와 파파인, 파인애플로 이루어진 천연효소 조합을 통해 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 금화규 효소와 파파인 이루어진 군으로 이루어진 것이다. 상기 효소일 때, 롤린의 수득 증대를 통한 그로 인한 효능 증대까지 기대할 수 있어 바람직하다.
가장 바람직하게는 본 발명의 실시예에서는 금화규 효소 및 파인 1:0.1 내지 1:0.5 중량비로 처리하여 제조된 식물성 저분자 콜라겐을 설명하고 있다.
상기 식물성 콜라겐에 효소를 처리할 경우, 수율 증대를 통한 생산량 증대를 달성하기 위하여, 식물성콜라겐 100 중량부에 대하여, 효소 1 내지 2 중량부로 처리하는 것이 바람직하다.
이때, 일반 금화규 추출물 비교예 1은 히스타민억제효과, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능에서 현저히 낮은 활성을 보이며, 효소처리를 하지 않은 식물성 콜라겐 비교예 2의 경우에도, 히스타민억제효과 및 NO 생성 저해 효과가 실시예 1에 비하여 현저하게 낮은 활성을 가져 바람직 하지 않다.
상기 조건으로 효소 처리된 식물성 저분자 콜라겐으로부터, 히스타민 억제능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능 평가에서, 우수한 결과를 제시하고 있다.
따라서, 본 발명은 식물성 저분자 콜라겐을 유효성분으로 함유하여 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션을 포함하는 베이스 화장료에 바람직하고, 이외 색조 화장료에도 유용한 , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 함량은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 식물성 저분자 콜라겐은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 1.0 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 2.0 내지 10.0 중량%, 가장 바람직하게는 3.0 내지 5.0중량%로 함유되는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 금화규 식물성 저분자 콜라겐의 제조
금화규 꽃 1kg를 pH9의 수산화 나트륨 수용액에 넣고 교반하여 12시간 동안 추출한 후 필터하였다. 추출액은 구연산 수용액을 첨가하여 pH7로 중화 한 후 원심분리 및 필터하여 식물성 콜라겐을 분리하였다. 다음으로, 식물성 콜라겐을 저분자화 하기 위한 효소처리를 수행하였다. 상기 식물성 콜라겐 100g에 금화규 전초를 10g을 100ml 정제수에 넣은 후 교반 추출하여 에탄올로 침전하여 얻은 조효소액 1g과 파파야 분말 0.2g을 혼합하여 37에서 120분간 반응시켜 효소처리를 한 후 60도에서 30분간 처리하여 효소반응을 종료하였다. 이후, 이를 동결건조하여 저분자 콜라겐을 수득하였다.
<비교예 1> 금화규 추출물 제조
금화규 꽃 1kg을 정제수에 12시간 동안 추출하고 필터하여 감압농축 후 동결건조하여 추출물을 제조하였다.
<비교예 2> 금화규 식물성 콜라겐 제조
금화규 꽃 1kg를 pH9의 수산화 나트륨 수용액에 넣고 교반하여 12시간 동안 추출한 후 필터하였다. 추출액은 구연산 수용액을 첨가하여 pH7로 중화 한 후 원심분리 및 필터하여 식물성 콜라겐을 분리하고 이를 동결건조하여 식물성 콜라겐을 제조하였다.
<비교예 3> 효소 배합 조건이 변경 된 금화규 식물성 콜라겐 제조
효소 배합을 변경하여 수행한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되, 구체적으로, 파파야 분말과 파인애플 분말을 1g씩 혼합하여 120분 동안 반응 시켜 효소처리를 한 후 60도에서 30분간 처리하여 효소반응을 종료하였다. 이후, 이를 동결건조하여 콜라겐을 수득하였다.
<실험예 1> 콜라겐 구성 성분 분석
저분자 콜라겐의 함량은 콜라겐에 존재하는 지표성분인 하이드록시프롤린의 함량으로 측정하였다. 저분자 수준의 콜라겐 펩타이드의 측정은 콜라겐을 구성하는 성분인 하이드록시프롤린의 함량으로 확인하는 방법으로 검증하였다.
아미노산(Total amino acid) 분석은 Total amino acid composition & OH-Proline analysis방법을 적용하였고, 추출 및 전처리방법은 시료중 100μL를 취하여 PICO-tag 방법을 이용하여 hydrolysis 및 PITC labeling을 한 후 PITC labeling된 시료 400μL중에서 20μL을 취하여 HPLC에 loading 하여 크로마토그램을 얻었다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐 및 비교예 1~3에서 제조된 추출물에 대한 하이드록시플로린의(Hydroxy proline) 분석결과이다.
분석 결과 콜라겐의 주요성분인 하이드록시프롤린(Hydroxy proline)이 확인되어 식물성 콜라겐임이 확인되었으며, 실시예 1이 비교예보다 월등하게 높은 하이드록시 프롤린 함량을 가지고 있는 것으로 확인된 바 저분자화된 식물성 콜라겐으로 확인되었다.
<실험예 2> 세포독성 시험: WST assay
상기 실시예 1 및 비교예 1~3의 세포에 대한 자극성여부를 확인하기 위하여 대식세포(RAW 264.7)를 대상으로 세포독성실험을 수행하였다.
대식세포의 일종인 RAW 264.7cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신, 10% FBS(Fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24 웰 플레이트에 1.0×104cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 셀에 상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 각 농도별(0%, 0.5%, 1%, 2%, 4%)로 배지와 혼합한 다음, 각 웰에 1㎖씩 첨가한 후 37, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후 각 웰의 상등액만을 따로 취한 후 각 웰에 WST-1 에세이 용액(ez-cytox)을 첨가하여 배양기에서 2시간 반응시킨 후 ELISA reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 처리군(무처리군)과 비교하여 하기 수학식 1을 이용하여 산출하였다.
수학식 1
세포 생존율(%) = (시료 처리군의 흡광도 / 시료 무처리군의 흡광도) × 100
도 2은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 식물성 저분자 콜라겐 및 비교예 1~3에서 제조된 추출물에 대한 세포독성실험 결과를 도시한 것이다.
상기 결과, 대식세포(RAW 264.7)에 대한 세포생존율의 경우, 실시예 1 및 비교예 3추출물이 모든 농도조건에서도 세포 생존에 대한 독성을 나타내지 않아 화장품에 안전한 소재로 사용 가능함을 확인하였다.
<실험예 3> 상처 치유 효능 시험 : Wound healing assay
시예 및 비교예의 발효물을 이용하여 피부의 상처 치유효과를 확인하기 위하여 Wound healing assay를 수행하였다.
섬유아세포(Human fibroblast)를 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 12well plate dish에 배양하여 세포가 plate에 80% 이상 되도록 하였다. Tip을 이용하여 plate 바닥을 그어 균일한 너비로 선을 만들었다. PBS로 세척한 후 실시예 및 비교예를 포함한 세포 배양배지를 처리하였다. 상처 치유 시험은 현미경 배율 x100으로 12, 24, 48시간에서 세포의 이동성을 통하여 양단간 간격을 측정하여 확인하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 실시예의 상처 치유 활성이 우수한 것이 확인되었다.
| 구분 | Wound Healing (%) |
| 실시예1 | 98.1±0.5 |
| 비교예1 | 26.5±0.5 |
| 비교예2 | 60.5±1.2 |
| 비교예3 | 79.6±1.3 |
<실험예 4> 항산화 효능 시험: 자유라디칼 생성 저해 활성
상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 이용하여 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH의 자유라디칼 소거능 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 50(㎍/㎖)의 농도로 희석한 다음, 0.1M DPPH 250㎕(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합한 후 4에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 각 샘플을 96 웰 플레이트에 담아 ELISA 기록기를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 아스코르브산을 사용하였으며, 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 2를 이용하여 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 산출하였다.
수학식 2
자유라디칼 소거능(%)=[100-(시료처리군의 흡광도/시료무처리군의 흡광도×100)]
도 3는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 DPPH 자유라디칼 소거능 결과를 도시한 것이다. 그 결과, 비교예 1~4 대비 상기 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물의 경우, DPPH 자유라디칼 소거능이 현저하게 우수하고, 농도의존적으로 향상되어 항산화 효과가 우수함을 확인하였다.
<실험예 5> 항염 효능 시험: NO (Nitric oxide) 생성 저해 활성
상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물에 대한 항염증 활성도를 측정하기 위하여, 염증 유도반응에 의해 생성되는 NO의 농도를 측정하는 실험을 수행하였다.
대식세포의 일종인 RAW 264.7 셀을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(Fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24 웰 플레이크에 1.0×104 cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 셀에 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 50(㎍/㎖)농도로 배지와 혼합한 후, 각 웰에 1㎖씩 첨가하고 37, 5% CO2조건의 배양기에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후 각 웰의 상등액만을 따로 취한 후 각 웰에 NO 검출키트를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96웰 플레이트에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 10분 동안 반응시킨 후, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 4은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 NO (Nitric oxide) 생성 저해능 결과를 나타낸 것이다.
그 결과, 비교예 1~4 대비 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물에서 NO 생성 저해능이 현저하게 우수하였으며 농도의존적으로 향상되어 항염 효과가 우수함을 확인하였다.
<실험예 6> 주름 개선 시험: 엘라스테이즈 저해 활성
상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물에 대한 주름 개선 효과를 측정하기 위하여, 엘라스타아제 억제정도를 평가하였다. 상기 실시예 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 50(㎍/㎖)의 농도로 희석한 다음, 10mM Tris-HCl 버퍼(pH8.0)에 녹인 0.6 mM 농도의 기질(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, S4760, Sigma)과 Elastase from porcine pancreas Type ₃(E0258, Sigma) 0.4U/㎖를 혼합하여 25에서 5분 동안 반응시킨 후 96웰 플레이트에 담아 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 하기 수학식 3을 이용하여 산출하였다. 이때, 양성 대조군으로 올레오놀산(Oleanolic acid)를 사용하여 수행하였다.
수학식 3
엘라스테아제 저해활성(%) = 100-(시료처리군의 흡광도 / 시료무처리군의 흡광도 × 100)
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 엘라스타아제 저해능 결과를 도시한 것이다.
그 결과, 비교예 1~4 대비 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물에서 엘라스타아제 저해능이 우수하였으며, 추출물 농도에 비례하여 향상된 결과를 확인하였다.
<실험예 7> 주름 개선 시험: MMP-1 억제 및 PIP assay
실시예 및 비교예의 발효물을 이용하여 MMP-1(콜라겐분해효소) 억제와 PIP(Procollagen type 1 C-Peptide) 생성 정도를 평가하였다.
(1) MMP-1 억제
실시예 및 비교예의 발효물을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 주름 억제 활성을 확인하기 위하여, MMP-1에 대한 assay 실험을 진행하였다. UVA의 조사에 의하여 발현되는 MMP-1의 억제 활성을 Real-time PCR을 통하여 확인 하였으며, 샘플 처리 농도 별로 조제하여 처리함으로써 MMP-1의 억제 활성에 영향을 주는지 확인하였다.
| 구분 | MMP-1 저해 활성(%) |
| 양성 대조군 (EGCG) | 60.0±0.59 |
| 실시예 1 | 72.3±0.33 |
| 비교예 1 | 42.8±0.41 |
| 비교예 2 | 58.2±0.38 |
| 비교예 3 | 50.1±0.51 |
(2) Procollagen Type Ⅰ C-peptide(PIP) Assay
실시예 및 비교예의 발효물이 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 실시예 및 비교예의 발효물을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen TypeⅠC-peptide(PIP) kit인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 2시간동안 반응시켜 주었다. 그리고 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 1시간동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substrate solution (3,3',5,5'- Tetrametylbenzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 뒤, multi-reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
| 구분 | PIP 생성(%) |
| Control | 100±0.3 |
| 양성 대조군 (EGCG) | 171±2.4 |
| 실시예 | 166±2.0 |
| 비교예 1 | 100±2.2 |
| 비교예 2 | 130±3.1 |
| 비교예 3 | 136±2.7 |
Claims (5)
- 효소처리로 저분자화 된 금화규 유래 식물성 콜라겐을 유효성분으로 함유한 , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 제조방법.
- 제1항에 있어서, 식물성 저분자 콜라겐은 하이드록시프롤린을 함유하는 것을 징으로 하는 화장료 조성물
- 제1항에 있어서, 상기 효소는 금화규 유래 자체 효소와 파파인 효소를 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 식물성 저분자 콜라겐의 제조방법
- 제1항에 있어서, 식물성 저분자 콜라겐은 상처치유, DPPH 자유라디칼 소거능, NO (Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 가지는 것을 특징으로 하는 , 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 상기 식물성 저분자 콜라겐이 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션, 색조 화장료 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 유효성분으로 함유된 것을 특징으로 하는 상처치유, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
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| KR101783469B1 (ko) | 2015-09-07 | 2017-09-29 | 청양포포나무농장영농조합법인 | 금화규로부터 콜라겐을 추출하는 방법 |
| KR102431443B1 (ko) | 2019-12-20 | 2022-08-12 | 대구한의대학교산학협력단 | 금화규 추출물을 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물 |
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