KR20240015030A - E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 - Google Patents
E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240015030A KR20240015030A KR1020230096430A KR20230096430A KR20240015030A KR 20240015030 A KR20240015030 A KR 20240015030A KR 1020230096430 A KR1020230096430 A KR 1020230096430A KR 20230096430 A KR20230096430 A KR 20230096430A KR 20240015030 A KR20240015030 A KR 20240015030A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- flgm
- attenuated salmonella
- expression vector
- salmonella strain
- Prior art date
Links
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title claims abstract description 81
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 101150001815 flgM gene Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 101150000092 E5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 17
- 101150002054 galE gene Proteins 0.000 claims description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 11
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 11
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 11
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- -1 Rpur Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 5
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 4
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- 231100000416 LDH assay Toxicity 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 3
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010008951 Chemokine CXCL12 Proteins 0.000 description 2
- 102000006573 Chemokine CXCL12 Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009172 bursting Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 101150031509 rcsB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 101100510836 Bacillus caldolyticus lepB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100290087 Bacillus subtilis (strain 168) yvyI gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011678 Bacteroides fragilis (strain YCH46) eno gene Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101000870191 Catharanthus roseus Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101100173925 Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) fljL gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100018293 Clostridioides difficile pflE gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100495315 Dictyostelium discoideum cdk5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100126053 Dictyostelium discoideum impdh gene Proteins 0.000 description 1
- 101100399297 Dictyostelium discoideum limE gene Proteins 0.000 description 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100001013 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aah1 gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101100011800 Escherichia coli (strain K12) epmA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 101100070607 Haemophilus ducreyi (strain 35000HP / ATCC 700724) hgbA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100346221 Mus musculus Mpi gene Proteins 0.000 description 1
- 101001087092 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Phosphate-binding protein PstS 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710123586 Negative regulator of flagellin synthesis Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101100108623 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) algA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 1
- 101100406813 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) pagC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 108010063499 Sigma Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001455617 Sula Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100056949 Wolinella succinogenes (strain ATCC 29543 / DSM 1740 / LMG 7466 / NCTC 11488 / FDC 602W) ansA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 101150082095 ansB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 101150036359 clpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074451 clpP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043719 clpP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102296 clpP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096566 clpX gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150006779 crp gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 101150019250 dksA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 101150010879 flgK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064216 flgL gene Proteins 0.000 description 1
- 101150094936 fliD gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150114741 guaA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093309 guaAA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150085008 guaAB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035744 guaB gene Proteins 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 101150112623 hemA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150059304 hup gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043071 hupA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150081485 hypA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150026430 manA gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150052523 nadA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 101150110245 ompC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091444 ompR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 101150028857 phoP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150086617 phoQ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082349 pmi gene Proteins 0.000 description 1
- 101150087106 pncB gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 101150002399 poxA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150037928 recN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150033672 rfaY gene Proteins 0.000 description 1
- 101150012103 rfc gene Proteins 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 101150105615 sipC gene Proteins 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150005573 uvrA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060445 uvrB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073340 uvrD gene Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
- 101150075472 ycf27 gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주에 관한 것으로서, flgM 유전자; 및 E5 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된, 약독화 살모넬라 균주, 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주에 관한 것이다. 본 특허출원은 2022년 07년 25일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0092017호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
암은 세포의 증식 활동이 멈추지 않아 주변 조직으로 파고들어 정상세포를 파괴하는 것에 의해 결국에는 생명을 위협하는 질환이다. 노화에 의해 인체의 조절능력이 낮아짐에 따라 암에 취약해지게 되어, 고령화 사회에서 암은 전체 사망원인 중 부동의 1위를 차지하며 2위인 심장질환 사망률의 2배를 넘어섰다.
질병의 치료에 가장 효과적인 대응 체계는 면역력을 강화하는 것이나, 암세포는 외부 침입자가 아니기 때문에 인체의 면역반응을 유발하지 않고 회피한다. 특정 바이러스 또는 박테리아는 정상세포보다 암세포에 더 많이 감염되고, 감염된 박테리아가 면역세포의 공격대상이 될 수 있다. 이에 일부러 특정 바이러스 또는 박테리아를 감염시켜 인체 면역반응을 자극함으로써 암세포에 대항할 수 있도록 하는 항암치료 방법들이 제시되었다. 시겔라(Shigella), 콜레라균(Vibrioholera), 병원성 대장균(pathogenic E. coli)과 같은 감염성 세균들은 장관의 세포에 침투할 뿐, 면역반응을 일으키는 중요한 기관인 간과 비장에는 도달하지 못한다. 이와 대조적으로 살모넬라균은 림프절을 통하여 비장과 간에 침투하여 전신면역반응을 자극시킬 수 있다. 구체적으로, Leschner 등(J. Mol. Med. 2010, 88,763-773)은 CT26 종양을 갖는 마우스를 대상으로 형광을 나타내는 살모넬라균을 정맥주사로 감염시킨 후, 시간에 따른 감염 경로를 추적하였다. 그 결과 감염 직후에는 마우스의 혈액을 통해 전신이 감염된 것을 보여주었으며, 감염 20분 후에는 비장과 간에 살모넬라균이 축적되었으며, 24시간 후에는 종양 조직에만 살모넬라균이 집중적으로 축적되어 있음을 관측하였다.
하지만 살모넬라균은 식중독을 유발하는 대표적인 균으로 감염에 의해 패혈증을 유발하여 생명을 위협할 수 있으므로 직접적으로 암 치료에 사용하기에는 병원성이 너무 강하다. 미국 예일대학 연구팀은 살모넬라를 유전자 조작하면 종양을 공격하는 특성은 유지하면서 독성만 제거하여 약독화할 수 있으며, 상기 약독화된 살모넬라의 주입을 통해 면역 자극을 유도하여 종양을 억제할 수 있다고 발표하였다. 그러나 약독화된 살모넬라는 생존성이 낮고 면역유도능 역시 저하될 뿐 아니라 돌연변이로 인하여 약독화 균주가 야생형 살모넬라로 전환되어 패혈증을 일으킬 우려가 있다. 이에 더하여 연구개발자금의 부족 문제로 인하여 약독화된 살모넬라를 이용한 항암치료는 임상과정의 1단계에서 대부분 중단되거나 보류된 상태이다.
살모넬라와 같은 박테리아를 이용한 암 치료에 동반되어 발생할 수 있는 패혈증의 유발은 극복해야 할 매우 중요한 문제이며, 이에 더하여 면역반응의 자극 역시 활발하게 이루어질 수 있어야 한다. 이에 약독화 및 면역 활성화와 함께 항암치료에 도움이 되는 물질들을 추가로 발현 또는 억제시킬 수 있는 균주들을 개발하고, 이를 항암치료에 이용하고자 하는 연구들이 주를 이루고 있다. 등록특허 제10-0852687호는 약독화된 살모넬라 균주 내에 종양괴사인자 알파단백질 벡터를 형질도입한 종양괴사인자 알파를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물에 대해 게시하였으며, 공개특허 제10-2021-0123556호는 필라멘트 성장 조절로 면역반응을 유도하는 항암 살모넬라에 대해 게시하였다.
“E5”는 케모카인 수용체 4 (CXCR4) 및 그 리간드인 간질 세포 유래 인자(stromal cell derived factor 1: SDF-1) 및 CXCL12의 상호작용을 억제하는 길항제로 새로운 화학적 합성 펩타이드이다. CXCR4 및 CXCL12의 상호작용은 종양 세포의 생존과 증식을 매개하는 것으로 알려져 있으며 E5는 CXCR4/CXCL12의 축을 표적으로 한다.
이에 본 발명자들은 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 제조하고, 이의 우수한 암 치료 효과를 확인한 바, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
일 양상은 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 재조합 발현 벡터를 제공한다.
다른 양상은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 약독화 살모넬라 균주를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명은 flgM 유전자 및 E5 유전자가 직접 또는 링커를 통해 연결되어, flgM 및 E5의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 이하 본 명세서에서는 flgM 및 E5의 융합단백질을 “flgM-E5”라 한다.
본 명세서에서 용어 "flgM"은 박테리아의 3형 분비계에서 후기 편모 전사를 위해 필요한 RNA 중합효소를 동원하는 것을 담당하는 σ인자를 억제하는 단백질 (또는 이러한 단백질을 암호화하는 유전자)을 지칭한다. 상기 "3형 분비계"는 그람 음성균에 발달된 병원성 물질 전달 시스템을 의미한다. 이는, 숙주의 세포막을 통과하여 직접 세포질로 병원성 활성 단백질을 주입하는 주사기 형태의 기구(Mota LJ et al, Ann Med.(2005);37(4):234-249)로서, 다중 단백질 복합 구조체이다. 상기 3형 분비계에서, 세포막에 편모를 만들 수 있는 기본 구조인 후크(hook)-기저체(basal body)가 형성되는 동안, flgM 단백질은 세포질 내에 남아있으며, class III 유전자, 예를 들어 플라젤린 서브유닛 FliC 또는 고정자(stator) 단백질 MotAB의 전사를 방해하는 항-σ28 인자로서 작용한다. 이후, 후크-기저체 구조 완성 후, 동시에 플라젤라 분비 시스템 내 기질 특이성의 변화가 일어나고, 이로 인해 flgM은 후크의 중앙통로를 통해 세포 밖으로 분비되고, 이후 세포 내에서는 σ28-의존적 전사가 시작된다. 3형 분비계에서의 편모 형성 과정을 통한 flgM의 분비기작을 도 2에 나타내었다.
본 명세서에서 용어, "E5"은 22개의 아미노산 (GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD)으로 구성된 펩타이드로서, E5는 뮤린(murine) 유방암 세포주 4T1에 특이적으로 결합하여 CXCL12-유도 이동(CXCL12-induced migration)을 억제한다. E5의 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 정보를 수득할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명은 flgM 유전자와 분비하고자 하는 단백질인 E5 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하여, 균주의 3형 분비계를 통한 flgM의 분비와 함께 E5의 균주 외 분비를 가능하게 하였다.
본 명세서에서 용어, “flhDC”은 플라젤린 오페론 (operon) 유전자의 주된 조절자로 flgM 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터에 flhDC 유전자를 포함시킬 경우, flgM-E5의 발현량 또는 분비량을 증진시키는데 기여할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전자"는 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절 단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전적 구조물"은 목적하는 단백질의 유전 정보를 포함하는 집합체, 기능적 단위체, 또는 컨스트럭트를 지칭하며, 이는 최광의로 해석될 수 있다. 상기 유전적 구조물은 본 발명의 목적상, 약독화된 살모넬라 균주로부터 flgM-E5 융합 단백질의 분비를 증진시키기 위한 것으로서, 예를 들어, flgM 유전자, 링커 유전자, 및 E5 유전자가 작동가능하게 연결된 DNA 인서트를 지칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지일 수 있다. 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 마커는 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 히그로마이신(hygromycin) 및 제오신(zeocin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 선택 마커일 수 있다. 상기 벡터는 복제원점, 프로모터 등 복제 및/또는 카피수 조절에 관여하는 유전자를 포함할 수 있고, 제한효소 부위 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “폴리뉴클레오티드”는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자를 모두 포함함으로써, flgM-E5의 발현량 또는 분비량을 증진시키는데 기여할 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 발현 벡터는 flgM 유전자; 및 E5 유전자에 더하여 flhDC 유전자를 추가로 포함함으로써, flgM-E5의 발현능 또는 분비능이 증진된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유도성 프로모터"란 유도물질에 의해 연결된 유전자의 작동을 스위칭할 수 있는 프로모터로, 예를 들어 ara 프로모터, tac 프로모터, lac프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, T7 프로모터, pBAD 프로모터, Tet 프로모터, trc 프로모터, pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol 11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터, pagC 프로모터, hip 프로모터, ansB 프로모터 또는 pflE 프로모터 일 수 있다.
본 명세서에서 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의하여 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 뉴클레오티드 서열들이 연결된 것을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 상기 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자는 동일 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 ara 프로모터 일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자가 동일한 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절됨에 따라, flgM-E5의 발현능 또는 분비능이 증진된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flgM 유전자, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 E5 유전자, 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flhDC 유전자를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 flgM 유전자 및 상기 E5 유전자는 링커를 통하여 연결될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "링커"란 관심있는 단백질에 이종성 도메인(domain)을 연결하는 데 사용된 폴리펩타이드 사슬 또는 이를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 상기 링커 펩타이드는 2 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2 내지 40개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 5개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커 펩타이드는 예를 들어, (GlSm)n(l, m 및 n은 각각 ≥ 2), (GlSm)n-Hp-(GlSm)n (l, m 및 n은 각각 ≥ 1, H ≥ 6), (G4S)a(EAAAK)b(G4S)a(a, b는 1 내지 4의 정수), (G4S)p(EAAAK)q(p, q는 1 내지 4의 정수), (EAAAK)x(G4S)y(x, y는 1 내지 4의 정수), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, (GSSGGS)i(i는 1 내지 4의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD, EGKSSGSGSESKST, GSAGSAAGSGEF, (EAAAK)k(k는 1 내지 5의 정수), CRRRRRREAEAC, GGGGGGGG, GGGGGG, AEAAAKEAAAAKA, PAPAP, VSQTSKLTRAETVFPDV, PLGLWA, TRHRQPRGWE, AGNRVRRSVG, RRRRRRRR, GGSSHHHHHHSSGGGS, 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 링커 펩타이드는 GGSSHHHHHHSSGGGS 일 수 있다.
다른 양상은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 약독화 살모넬라 균주를 제공할 수 있다. 상기 약독화 살모넬라 균주에서, 언급된 용어 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어, "약독화"는 살아있는 병원체의 독성을 인위적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극하여 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 살모넬라의 약독화 초래 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 상기 약독화 살모넬라 균주는 aroA, aroC, aroD, aroE, asd, Rpur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp, cyp, phoP, phoQ, rfaY, dksA, hupA, sipC, clpB, clpP, clpX, pab, nadA, pncB, pmi, rpsL, hemA, rcsB, rfc, poxA, galU, cdt, pur, ssa, guaA, guaB, fliD, flgK, flgL, relA, 및 spoT로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능이 상실된 것일 수 있다. 생체 내 적용 시 야생형으로의 환원을 방지하고, 독성을 더욱 약화시키기 위하여 상기 유전자 중 둘 이상의 유전자 기능을 상실시킬 수 있다. 상기 약독화 살모넬라 균주는 종양 부위에 표적화되어 면역 반응을 유도하는 것에 의해 항암 활성을 갖는다.
일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환됨으로써, flgM-E5의 발현 및 분비 수준이 현저히 증진되었음을 확인하였으며, 이를 통해 상기 살모넬라 균주를 포함하는 제제를 개체에 투여한 경우, 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 asd, rcsB 및 galE 유전자가 상실된 살모넬라 균주일 수 있다. 더욱 구체적으로, 약독화 살모넬라 균주는 aroA, 및 aroD의 유전자의 기능도 추가로 상실되어 aroA, aroD, asd, rcsB 및 galE 유전자가 상실된 살모넬라 균주일 수 있다.
일 구체예에 따른 약독화 살모넬라 균주는, 약독화 유전자가 제2 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것일 수 있다. 즉, 특정 유전자가 제2 유도성 프로모터에 의해 기능 상실이 조절되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약독화 살모넬라 균주는 약독화 유전자 앞에 제2 유도성 프로모터를 추가로 포함하여 약독화가 스위칭되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 약독화 살모넬라 균주를 약독화된 상태로 개체 내에 주입하여 종양 부위에 표적화가 완료되면 상기 제2 유도성 프로모터의 작동에 의해 야생형(wild) 살모넬라로 돌려놓는 것에 의해 면역활성이 낮은 약독화 살모넬라에 비해 높은 면역활성을 유발하여 암 치료가 더욱 효과적으로 이루어질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 galE 유전자가 상실된 것일 수 있으며, 상기 galE 유전자의 기능 상실은 tetRA 프로모터에 의해 스위칭되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 약독화 살모넬라 균주를 약독화된 상태로 개체 내에 주입하여 종양 부위에 표적화시킨 후, doxycycline에 의해 상기 galE 유전자의 발현을 유도하여, 살모넬라 균주의 높은 면역 활성을 유발하는 것일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 galE 유전자의 기능 상실 조절을 galE:tetRA로 표현하였다.
일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주의 경우, asd, rcsB 및 galE 유전자의 기능이 상실된 것일 수 있으며, 이러한 약독화 살모넬라 균주는 우수한 flgM-E5의 발현 또는 분비능을 나타냄을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 E5 단백질에 대한 분비능이 향상된 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주는 항암 또는 암세포 독성을 갖는 펩타이드 성분을 단지 발현하는 것에 그치지 않고, 표적 영역에서 상기 발현된 펩타이드 성분의 분비를 가능하게 한 것으로서, 표적 항암 치료제로서의 효능을 발휘할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 E5 단백질에 대한 분비능이 향상된 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 약독화 살모넬라 균주를 형질전환 시 아라비노스 존재 하에 E5의 발현을 조절하고 제3형 분비계의 flgM를 사용하여 E5 단백질이 균주 외로 효과적으로 분비될 수 있도록 할 수 있다. 또한, flhDC도 동일 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되어 세포 외로 분비되는 E5의 발현량을 증가시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 수탁번호 KCTC15494BP로 수탁된 것인, 약독화 살모넬라 균주일 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에서, 언급된 용어 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "암 (cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적 (invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 (metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 상기 암을 예를 들어, 고형암일 수 있으며, 바람직하게는 살모넬라 균주의 암 표적화능이 발휘될 수 있는 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 종양이라면, 비제한적으로 확장 적용될 수 있다. 예를 들어 상기 암의 종류로는 췌장암, 대장암, 결장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 두경부암, 피부암, 자궁암, 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것 아니다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제로 이용하기 위하여, 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 투여되는 특정 조성물에 따라 부분적으로 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 따라 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서, 상기 조성물의 적합한 제형이 매우 다양하며, 예를 들어, 조성물은 비경구(즉, 근육내, 피내, 또는 피하) 투여 또는 비인두(즉, 비강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 비경구 투여용 제형은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 올레산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 비롯하여 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유를 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가물은 또한 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스 등으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 제제의 형태, 환자의 연령, 성별 및 상태, 증상의 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 일반적인 투여량은 0.001mg/kg·일~10g/kg·일이다.
또 다른 양상은, 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 암을 예방 또는 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암을 예방 또는 치료하는 방법에서, 언급된 용어 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스, 랫트, 말, 개, 고양이, 소, 염소, 또는 돼지일 수 있다.
상기 투여는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 예를 들어 점안 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있고, 구체적으로 점안 투여의 경로 등을 통해 목적하는 바에 따라 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 발현 벡터에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 경우, flgM-E5의 발현 및 분비가 현저하게 증진됨을 확인하였다.
또한, 일 양상에 따른 재조합 발현 벡터에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 제제를 투여한 경우, 우수한 항암 효과 및 안정성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 재조합 발현 벡터, 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주는 항암 조성물의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 3형 분비계를 이용한 flgM-E5의 세포 외 분비 과정을 개략적으로 나타낸 도이다
도 2는 제3형 분비계에서의 편모 형성 과정을 이용한 flgM 분비 기작을 간략하게 나타낸 도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+ 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18 플라스미드를 사용하여 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 단백질 분비 수준을 확인한 결과이다. 1, 2 레인은 전체 세포 배양액, 3, 4 레인은 펠렛, 및 5, 6 레인은 상층액에서 flgM-E5 단백질 분비 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주로부터 분비된 flgM-E5 융합 단백질의 활성을 평가한 것으로서, 마우스 유방암 세포주에 대한 항종양 효과를 확인한 도이다.
도 6은 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주로부터 분비된 flgM-E5의 CCK assay를 통해 암 세포 사멸 수준을 마우스 유방암 세포주에서 평가한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주로부터 분비된 flgM-E5의 LDH assay를 통해 암 세포 사멸 수준을 마우스 유방암 세포주에서 평가한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 종양 마우스 모델에 대한 처리 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 9는 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 마우스에 처리한 경우, 마우스 내 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
도 2는 제3형 분비계에서의 편모 형성 과정을 이용한 flgM 분비 기작을 간략하게 나타낸 도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+ 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18 플라스미드를 사용하여 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 단백질 분비 수준을 확인한 결과이다. 1, 2 레인은 전체 세포 배양액, 3, 4 레인은 펠렛, 및 5, 6 레인은 상층액에서 flgM-E5 단백질 분비 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주로부터 분비된 flgM-E5 융합 단백질의 활성을 평가한 것으로서, 마우스 유방암 세포주에 대한 항종양 효과를 확인한 도이다.
도 6은 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주로부터 분비된 flgM-E5의 CCK assay를 통해 암 세포 사멸 수준을 마우스 유방암 세포주에서 평가한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주로부터 분비된 flgM-E5의 LDH assay를 통해 암 세포 사멸 수준을 마우스 유방암 세포주에서 평가한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 종양 마우스 모델에 대한 처리 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 9는 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 마우스에 처리한 경우, 마우스 내 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: E5 분비를 위한 플라스미드의 제조
1-1. insert DNA의 제조
E5분비를 위한 플라스미드 제조를 위하여, flgM 유전자, 및 E5유전자가 연결된 유전적 구조물을 제조하였다.
구체적으로, 야생형 살모넬라의 flgM DNA 서열(flgM anti-sigma-28 factor FlgM [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2] Gene ID: 1252690, Locus tagSTM1172 NC_003197.2 (1257036..1257341, complement))과, E5 에 대한 코돈 최적화(살모넬라)를 통해 수득한 DNA 서열을 연결시켜, 일 실시예에 따른 유전적 구조물을 제작하였다. E5의 코돈 최적화를 위하여 E5의 22개 아미노산을 DNA로 치환하였고 앞에 ATG와 끝에 TAA를 삽입하였다.
구체적으로, 상기 flgM DNA 서열 및 E5 DNA 서열은 링커를 통하여 연결시켰고, flgM 유전자의 발현을 높이기 위해, flgM 유전자 앞에 15개의 샤인-달가노(shine dalgarno) 서열 (AGGAGGTTTGATCCT)을 삽입하였다. 또한, 클로닝을 위해 맨 앞에는 NheⅠ site를 삽입하고, E5의 종결 코돈 뒤에는 SacⅠ site를 삽입하였다. 한편, 본 실시예에서 주요한 구조물의 유전 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
상기 구조물을 이용하여 ㈜바이오닉스 유전자 합성 서비스를 통하여 flgM-linker-E5 (서열 번호 5)의 유전적 구조물을 수득하였다.
이후, flgM-linker-E5를 NheI과 SacI의 효소를 각각 10U 사용하여 37도에서 2시간 반응시켰다. 상기 반응산물을 전기영동 한뒤, Gel extraction kit(㈜ Qiagen)로 약 500bp의 DNA를 확인하여 flgM-linker-E5 insert를 수득하였다.
이후, flhDC insert DNA를 수득하기 위해, 야생형 살모넬라 LT2의 genomic DNA를 주형으로 하기 표 2의 flhD-sac1-F 및 flhC-Sal1-r 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 flhDC 유전자가 포함된 PCR 산물을 얻었다. 구체적인 PCR 조건은 다음과 같다; 10x buffer 5μl, 5xQ solution 10 μl, 2 mM dNTPs 7.5 μl, 20 μM flhD-sac1-f 프라이머 2.5μl, 20μM flhC-Sal1-r 프라이머 2.5 μl, Taq polymerase 1 μl, 10 ng/μl genomic DNA2 μl 및 물 19.5 μl을 혼합하여 Qiagen system을 사용하여, 95℃ 5분과, 30회의 94℃ 30초, 49℃ 30초, 72℃ 1분 반복과 그 후에 72℃ 10분의 조건에서 PCR을 진행하였다. PCR purification kit로 정제한 PCR fragment 1μg과 sacI과 SalI을 각각 10U를 37℃에서 2시간 반응시키고, 상기 반응 산물을 PCR purification kit로 정제하여 flhDC insert DNA (서열번호 3)를 제작하였다.
[표 2]
1-2. 플라스미드의 제조
이후, pBAD18 asd+ 플라스미드를 벡터로 사용하여, NheⅠ 및 SacⅠ 효소 각각 10U를 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 상기 반응 산물을 PCR purification kit로 정제하여 각각의 벡터 DNA를 얻었다. 상기 플라스미드 내에 삽입된 asd 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어질 수 있다. 이후, 각 벡터 DNA를 상기 flgM-linker-E5 insert DNA와 25℃에서 30분간 ligation시키고, DH5a 컴피턴트 세포에 형질전환시켰다. 이후, 상기 형질전환된 세포를 LB amp(ampicillin) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니의 후보군 6개를 선별하여 NheⅠ 및 SacⅠ 각각 10U와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 전기영동을 통해 약 500bp 밴드의 생성을 확인하였다. 또한, 상기 플라스미드에 대해 해당 후보군의 염기서열 분석을 실시하여, 상기 flgM, linker, 및 E5 유전자의 삽입을 확인하였다.
이후, 상기 플라스미드 각각 1μg을 sacⅠ 및 SalⅠ 10U와 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 상기 반응산물을 PCR purification kit로 정제하여 벡터 DNA를 완성하였다. 이후, 각 벡터 DNA를 상기 flhDC insert DNA와 25℃에서 30분 ligation 시킨 후 DH5a 컴피턴트 세포를 형질전환 시켰다. 형질전환된 세포를 LB amp 고체 배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니의 후보군 6개를 선별하여 sacⅠ 및 SalⅠ 10U와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 전기영동을 통해 band의 생성을 확인하였다. 해당 후보군의 염기서열 분석을 실시하여, flhDC 유전자의 삽입을 확인하였다.
이를 통하여, flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+ 플라스미드를 제조하였다.
실시예 2: flgM-E5을 분비하는 약독화 살모넬라 균주 제조
상기 실시예 1에서 제조된 플라스미드를 사용하여 약독화 살모넬라 균주 및 대장균을 형질전환시켰다. 약독화 살모넬라 균주의 후보군으로는 BRD509 asd galE:tetRA-(#1317), BRD509 asd rcsB galE:tetRA-(#1323) 균주를 사용하였으며 상기 균주들을 충남대로부터 분양받았다. BRD509 살모넬라 균주는 aroA 및 aroD의 유전자의 기능이 상실된 것이다. 대장균으로는 EcN균주(EcN =E.coli Nissle 1917)을 사용하였으며 전남대로부터 분양받았다.
이와 같이 형질전환된 균주의 유전자 및 균주의 정보는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
[표 3]
실시예 3: 단백질 발현 및 분비능 확인
일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 flgM-E5의 발현 및 분비능을 확인하기 위해, 하기와 같은 방법으로 단백질의 발현량을 웨스텃 블랏을 통해 측정하였다.
상기 형질전환된 각 균주의 단일 콜로니를 LB amp 액체배지에 접종한 후 37℃에서 12-16시간 진탕배양하였다. 이후 신선한 LB amp 액체배지에 OD600이 0.05가 되도록 희석한 후 37℃에서 2시간 진탕배양하였다. 진탕배양에 의해 OD600이 0.4-0.6이 되면 아라비노스(arabinose)를 0.2%(w/v)의 농도가 되도록 처리하여, 37℃에서 5시간 추가로 진탕배양시켰다.
그 후, 전체 세포 배양액(Whole cell) (1,2 레인) 1ml과 또 다른 1ml 배양액을 원심분리한 후 펠렛(3, 4 레인)과 상층액(5, 6 레인)을 분리하여 시료를 준비하였다. 아라비노스를 0.2%(w/v)(final)의 농도로 처리하지 않은 것(1,3,5 레인)과 처리한 것(2,4,6 레인)으로 나누고, 상기 균주들을 배양 후 배양액을 8000rpm으로 원심분리한 후 각각의 시료를 준비하였다. 상층액은 다시 0.2um 필터링으로 균을 완전히 제거하고 나노셉(nanosep)(OD010C35 3K omega)를 이용하여 농축하였다. 각각 얻어진 시료 50μl를 SDS sample buffer와 혼합하여 100℃ 히팅 블록(heating block)에 5분간 변성시킨 후, 5분간 13000rpm 4℃에서 원심분리 하고 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동을 하였다. 겔은 PVDF (polyvinylidene fluoride)를 이용해 트랜스퍼하여 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동시키고 멤브레인을 블로킹 버퍼를 이용해 실온에서 1시간동안 블로킹을 하였다. 그 후에 1차 항체 anti-his tag(SB194b, SouthernBiotech)를 사용하였고, 1/1000으로 희석하여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이후 멤브레인을 TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20)로 10분 간격으로 세 번 세척한 후, 마우스 항-마우스-IgG (#7076s, Cell signaling, Danvers, MA, USA) 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 TBST로 10분 간격으로 세 번 세척하고, ECL 버퍼를 이용해 X-ray 필름에 감광한 후, 현상하여 각각의 단백질 발현량을 확인하였다.
도 4에서, 2, 4, 및 6 레인은 아라비노스(최종 농도 0.2%(w/v))를 처리한 레인이며, 1,3 및 5 레인은 아라비노스를 처리하지 않은 레인이다. 또한, 1 및 2 레인은 전체 세포 배양액, 3 및 4는 펠렛, 및 5 및 6 레인은 상층액에 대한 결과이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 아라비노스가 처리된 2, 4 및 6 레인은 아라비노스가 처리되지 않은 1, 3 및 5레인보다 동일 농도에서 다량의 양의 flgM- E5이 발현되었다. 또한, EcN에서는 2 레인(전체 세포 배양액) 및 4 레인(펠렛)에서 다량의 flgM-E5가 분비되었으나, 6 레인(상층액)에서는 적은 양이 발견되었다. 따라서, #1323 균주에서 6 레인(상층액)에 가장 많은 flgM-E5을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 아라비노스에 의해 flgM-E5 발현이 조절되고, flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+/BRD509 asd rcsB galE:tetRA-(#1323) 균주가 세포를 터뜨리지 않으면서도 균주 세포 외 단백질 분비능이 가장 우수함을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 일 실시예에 따른 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+/BRD509 asd rcsB galE:tetRA-(#1323) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2023년 6월 29일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC15494BP(S-flgM-E5-flhDC-pBAD18-ASD+/#1323)를 부여받았다.
실시예 4: 유방암 세포주 에서의 E5의 세포 활성 평가
실시예 3에서 얻은 형질전환된 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+/BRD509 asd rcsB galE:tetRA-(#1323) 균주의 단일 콜로니를 LB amp 액체배지에 접종한 후 37℃에서 12-16시간 진탕배양하였다. 이후 신선한 LB amp 액체배지에 OD600이 0.05가 되도록 희석한 후 37℃에서 2시간 진탕배양하였다. 진탕배양에 의해 OD600이 0.4-0.6이 되면 아라비노스(arabinose)를 0.2%(w/v)의 농도가 되도록 처리하여, 37℃에서 5시간 추가로 진탕배양시켰다. 비교를 위해서 아라비노스를 처리하지 않은 비교군을 동일 조건에서 진탕배양시켰다. 배양액을 3000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 분리하고, 0.2μm 필터로 여과하여 균을 완전히 제거하였다. 이를 통해 flgM-E5 융합 단백질을 획득하였다.
한편, 4T1 마우스 유방암 세포주를 구입하여 각각의 세포들을 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 세포를 성장시키고 세포 수가 2 X 105 개 일 때 6-well에 세포를 시딩(seeding)하였다. 24시간 후, 상기 과정을 통해 상층액으로부터 얻은 융합 단백질 200μl를 처리하고, 이를 48시간 배양한 후 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 4T1 세포주에서 아라비노스를 처리하여, flgM-E5의 발현 또는 분비를 유도한 군(+)에서는 70% 이상 세포 수준이 감소됨을 확인하여 아라비노스를 처리하지 않은 군 (-) 및 PBS 처리한 군에 비교하여 유방암 세포주의 세포 활성을 현저하게 감소시켰다.
실시예 5: 유방암 세포주에서의 암 세포 사멸 유도 평가
암 세포 사멸 유도에 대한 효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 4의 배양액을 사용하여 4T1 마우스 유방암 세포주에 대한 CCK assay 및 LDH assay를 수행하였다. CCK assay(DogenBio:ez-500, EZ-Cytox)를 위해 상기 실시예 4의 배양액에 CCK solution을 50ul 처리한 뒤, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 후, 상기 배양액의 상층액 100ul를 플레이트에 옮기고 450nm microreader로 측정하였다. 본 실험은 신뢰성을 높이기 위해 triplicate로 진행하였다. 또한, LDH assay(DogenBio: EZ-LDH, DG-LDH500)를 위해 상기 배양한 세포주 상층액을 1000rpm에서 3분동안 원심분리하여 세포잔해를 제거하고 상층액 10ul과 LDH 용액 100ul를 혼합하여 실온에서 30분간 인큐베이션하고 450nm microreader로 측정하였다. CCK assay와 마찬가지로 실험은 triplicate로 진행하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 4T1 세포주에서 flgM-E5의 발현 또는 분비를 유도한 군(induction)은 PBS 또는 아라비노스를 처리하지 않은 군(uninduction)과 비교하여, 세포가 터져 사멸한 세포의 수준이 높음을 확인하였다.
상기 실시예 3 내지 실시예 5의 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주는 E5 고유의 세포 사멸능을 지닌 채로, 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되면서 제3형 분비계인 flgM과의 연결된 특유의 구조를 통해 그 분비능이 강화된 것임을 실험적으로 입증한 것이다.
실시예 6: 마우스 모델을 이용한 항암 효과 평가
6-1. 종양세포 이종이식된 마우스 모델 확립
본 실시예에서 실험 동물로는 20g 내외의 6 주령 BALB/c 암컷 마우스를 구입하여 사용하였다. 승인된 프로토콜에 따라 모든 동물에 대한 관리 및 실험, 안락사가 수행되었다. 미국 세포주 은행(ATCC)으로부터 murine 4T1 유방암 세포를 구입하여 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 시험관 내 배양된 4T1 종양세포를 수거한 후, 20μl PBS에 현탁시킨 다음 5×105개의 세포를 BALB/c 마우스의 우측 등에 피하 주사하여 종양세포를 이종 이식하였다. 약 2주 후 종양의 크기가 100mm3에 도달하면 flgM-linker-E5-flhDC-pBAD18-asd+/BRD509 asd rcsB galE:tetRA-(#1323) 균주를 PBS로 희석하여 약 2.5×107 CFU/mice용량으로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다 (0day).
6-2. 항암 효과 확인
이후, 상기 마우스를 대상으로 flgM-E5의 발현 또는 분비 유도를 위하여 L-아라비노스 80 mg/mice를 매일 복강내 주사하였고, 2일에 한번씩 마우스의 체중과 종양의 크기를 측정하여 기록하였다. 종양의 부피는 (종양 길이×종양 폭×종양 높이)/2의 식에 의해 계산하였으며, 동물실험 윤리위원회의 지침에 따라 종양 부피가 1,500 mm3이상이되면 안락사시켰다. 도 8은 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 종양 마우스 모델에 대한 처리 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주가 아라비노스에 의해 E5의 발현 또는 분비가 유도된 군 (induction)은 종양의 성장을 현저하게 억제시킴을 확인하였다.
이로부터, 일 실시예에 따른 형질전환된 약독화 살모넬라 균주는 항암 효과가 뛰어나 암의 치료를 위한 유효 성분으로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 상기 flgM 유전자; E5 유전자; 및 flhDC 유전자는 동일 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flgM 유전자, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 E5 유전자, 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flhDC 유전자를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 상기 flgM 유전자 및 상기 E5 유전자는 링커를 통하여 연결된 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1의 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 asd, rcsB 및 galE의 유전자의 기능이 상실된 것인, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 E5 단백질에 대한 분비능이 향상된 것인, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 수탁번호 KCTC15494BP로 수탁된 것인, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5의 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20220092017 | 2022-07-25 | ||
KR1020220092017 | 2022-07-25 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20240015030A true KR20240015030A (ko) | 2024-02-02 |
Family
ID=89706863
Family Applications (10)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020230096438A KR20240015038A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터루킨-21의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096431A KR20240015031A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | gvIA의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096433A KR20240015033A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터루킨-7 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096432A KR20240015032A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | mvIIA의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096434A KR20240015034A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | Stichodactyla 독소 분비를 위한 재조합 발현 벡터및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096436A KR20240015036A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터페론-β 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096439A KR20240015039A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터루킨-12의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096437A KR20240015037A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | Vc1 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096430A KR20240015030A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096435A KR20240015035A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 클로로톡신의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
Family Applications Before (8)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020230096438A KR20240015038A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터루킨-21의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096431A KR20240015031A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | gvIA의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096433A KR20240015033A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터루킨-7 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096432A KR20240015032A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | mvIIA의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096434A KR20240015034A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | Stichodactyla 독소 분비를 위한 재조합 발현 벡터및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096436A KR20240015036A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터페론-β 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096439A KR20240015039A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 인터루킨-12의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
KR1020230096437A KR20240015037A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | Vc1 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020230096435A KR20240015035A (ko) | 2022-07-25 | 2023-07-24 | 클로로톡신의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 약독화 살모넬라 균주 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (10) | KR20240015038A (ko) |
WO (5) | WO2024025298A1 (ko) |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5891680A (en) * | 1995-02-08 | 1999-04-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12 |
US6024961A (en) * | 1997-11-14 | 2000-02-15 | Washington University | Recombinant avirulent immunogenic S typhi having rpos positive phenotype |
US20040009150A1 (en) * | 2002-06-07 | 2004-01-15 | Nelson Andrew J. | Methods of treating cancer using IL-21 |
JP5591701B2 (ja) * | 2007-09-21 | 2014-09-17 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 強力なアポトーシス活性および抗腫瘍活性を示すターゲティング化インターフェロン |
HUE034119T2 (en) * | 2010-02-04 | 2018-01-29 | Morphotek Inc | Chlorotoxin polypeptides and conjugates and their use |
ES2861275T3 (es) * | 2012-05-30 | 2021-10-06 | Univ Utah Res Found | Composiciones y métodos para la expresión y la purificación de péptidos usando un sistema de secreción de tipo III |
KR101750007B1 (ko) * | 2014-10-01 | 2017-06-22 | 전남대학교 산학협력단 | 박테리아를 이용한 고형암 치료제 |
KR102246740B1 (ko) * | 2019-01-07 | 2021-04-30 | 충남대학교산학협력단 | 신규 살모넬라 균주 및 이를 포함하는 항암 면역증강용 약학 조성물 |
KR102224855B1 (ko) * | 2020-03-20 | 2021-03-08 | 충남대학교산학협력단 | 인디루빈을 생합성 분비하는 항암 살모넬라 및 이를 포함하는 항암 조성물 |
KR20210123556A (ko) * | 2020-04-03 | 2021-10-14 | 충남대학교산학협력단 | 필라멘트 성장 조절로 면역반응을 유도하는 항암 살모넬라 및 이를 포함하는 항암 조성물 |
-
2023
- 2023-07-24 KR KR1020230096438A patent/KR20240015038A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096431A patent/KR20240015031A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096433A patent/KR20240015033A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096432A patent/KR20240015032A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096434A patent/KR20240015034A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096436A patent/KR20240015036A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096439A patent/KR20240015039A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096437A patent/KR20240015037A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096430A patent/KR20240015030A/ko unknown
- 2023-07-24 KR KR1020230096435A patent/KR20240015035A/ko unknown
- 2023-07-25 WO PCT/KR2023/010736 patent/WO2024025298A1/ko unknown
- 2023-07-25 WO PCT/KR2023/010735 patent/WO2024025297A1/ko unknown
- 2023-07-25 WO PCT/KR2023/010767 patent/WO2024025312A1/ko unknown
- 2023-07-25 WO PCT/KR2023/010732 patent/WO2024025296A1/ko unknown
- 2023-07-25 WO PCT/KR2023/010771 patent/WO2024025315A1/ko unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20240015033A (ko) | 2024-02-02 |
KR20240015038A (ko) | 2024-02-02 |
WO2024025297A1 (ko) | 2024-02-01 |
KR20240015031A (ko) | 2024-02-02 |
KR20240015037A (ko) | 2024-02-02 |
WO2024025315A1 (ko) | 2024-02-01 |
KR20240015036A (ko) | 2024-02-02 |
KR20240015032A (ko) | 2024-02-02 |
WO2024025312A1 (ko) | 2024-02-01 |
WO2024025298A1 (ko) | 2024-02-01 |
KR20240015034A (ko) | 2024-02-02 |
KR20240015035A (ko) | 2024-02-02 |
KR20240015039A (ko) | 2024-02-02 |
WO2024025296A1 (ko) | 2024-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI830771B (zh) | 包含核酸及car修飾的免疫細胞的治療劑及其應用 | |
WO2015182574A1 (ja) | Reic遺伝子を発現する制限増殖型アデノウイルス | |
EP3741845A1 (en) | Recombinant vaccinia virus and pharmaceutical composition comprising same | |
EP3981880A1 (en) | Dna construct for diagnosing and treating cancer | |
EP2364361A1 (en) | Use of bacteria for the sensing and killing of cancer cells | |
KR20240015030A (ko) | E5의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된약독화 살모넬라 균주 | |
WO2024019378A1 (ko) | 코난토킨-g의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 | |
KR20240015029A (ko) | 카탈레이스 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로형질전환된 대장균 균주 | |
KR102555172B1 (ko) | Gm-csf의 분비를 위한 유전자 구조물 및 이에 의해 형질전환된 항암 재조합 균주 | |
KR20240013955A (ko) | 멜리틴 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 | |
US20220228165A1 (en) | DNA Construct for Diagnosing and Treating Cancer | |
WO2022006748A1 (en) | Genetically engineered live bacteria and methods of constructing the same | |
EP4242314A1 (en) | Salmonella strain for prevention and treatment of cancer and use thereof | |
US20220354904A1 (en) | Cancer therapy | |
KR20230027279A (ko) | 화학요법-유발성 독성을 완화하기 위한 내피 세포 | |
KR20230064561A (ko) | 이중 분비 시스템을 탑재한 항암 균주 | |
KR20230066249A (ko) | 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물 | |
KR20220084052A (ko) | 치료제로서의 gne | |
CA3226844A1 (en) | Cancer therapy with live attenuated bacteria | |
KR20230056961A (ko) | 이중 안전장치를 갖춘 ClyA 단백질을 분비하는 신규 항암 균주 |