KR20240015034A - Stichodactyla 독소 분비를 위한 재조합 발현 벡터및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 - Google Patents
Stichodactyla 독소 분비를 위한 재조합 발현 벡터및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주 Download PDFInfo
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Abstract
Shk 단백질의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주에 관한 것으로서, flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주, 및 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
Stichodactyla 독소의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주에 관한 것이다. 본 특허출원은 2022년 07년 25일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0092017호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
암은 세포의 증식 활동이 멈추지 않아 주변 조직으로 파고들어 정상세포를 파괴하는 것에 의해 결국에는 생명을 위협하는 질환이다. 노화에 의해 인체의 조절능력이 낮아짐에 따라 암에 취약해지게 되어, 고령화 사회에서 암은 2007년부터 10년째 전체 사망원인 중 부동의 1위를 차지하며 2위인 심장질환 사망률의 2배를 넘어섰다.
질병의 치료에 가장 효과적인 대응 체계는 면역력을 강화하는 것이나, 암세포는 외부 침입자가 아니기 때문에 인체의 면역반응을 유발하지 않고 회피한다. 특정 바이러스 또는 박테리아는 정상세포보다 암세포에 더 많이 감염되고, 감염된 박테리아가 면역세포의 공격대상이 될 수 있다. 이에 일부러 특정 바이러스 또는 박테리아를 감염시켜 인체 면역반응을 자극함으로써 암세포에 대항할 수 있도록 하는 항암치료 방법들이 제시되었다. 시겔라(Shigella), 콜레라균(Vibriocholera), 병원성 대장균(pathogenic E. coli)과 같은 감염성 세균들은 장관의 세포에 침투할 뿐, 면역반응을 일으키는 중요한 기관인 간과 비장에는 도달하지 못한다. 이와 대조적으로 살모넬라균은 림프절을 통하여 비장과 간에 침투하여 전신 면역반응을 자극시킬 수 있다. 구체적으로, Leschner 등(J. Mol. Med. 2010, 88, 763-773)은 CT26 종양을 갖는 마우스를 대상으로 형광을 나타내는 살모넬라균을 정맥주사로 감염시킨 후, 시간에 따른 감염 경로를 추적하였다. 그 결과 감염 직후에는 마우스의 혈액을 통해 전신이 감염된 것을 보여주었으며, 감염 20분 후에는 비장과 간에 살모넬라균이 축적되었으며, 24시간 후에는 종양 조직에만 살모넬라균이 집중적으로 축적되어 있음을 관측하였다.
하지만 살모넬라균은 식중독을 유발하는 대표적인 균으로 감염에 의해 패혈증을 유발하여 생명을 위협할 수 있으므로 직접적으로 암 치료에 사용하기에는 병원성이 너무 강하다. 미국 예일대학 연구팀은 살모넬라를 유전자 조작하면 종양을 공격하는 특성은 유지하면서 독성만 제거하여 약독화할 수 있으며, 상기 약독화된 살모넬라의 주입을 통해 면역 자극을 유도하여 종양을 억제할 수 있다고 발표하였다. 그러나 약독화된 살모넬라는 생존성이 낮고 면역유발능 역시 저하될 뿐 아니라 돌연변이로 인하여 약독화 균주가 야생형 살모넬라로 전환되어 패혈증을 일으킬 우려가 있다. 이에 더하여 연구개발자금의 부족 문제로 인하여 약독화된 살모넬라를 이용한 항암치료는 임상과정의 1단계에서 대부분 중단되거나 보류된 상태이다.
살모넬라와 같은 박테리아를 이용한 암 치료에 동반되어 발생할 수 있는 패혈증의 유발은 극복해야 할 매우 중요한 문제이며, 이에 더하여 면역반응의 자극 역시 활발하게 이루어질 수 있어야 한다. 이에 약독화 및 면역 활성화와 함께 항암치료에 도움이 되는 물질들을 추가로 발현 또는 억제시킬 수 있는 균주들을 개발하고, 이를 항암치료에 이용하고자 하는 연구들이 주를 이루고 있다. 등록특허 제10-0852687호는 약독화된 살모넬라 균주 내에 종양괴사인자 알파단백질 벡터를 형질도입한 종양괴사인자 알파를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는 항암 치료용 조성물에 대해 게시하였으며, 등록특허 제10-1750007호는 L-아스파라기나아제가 종양 사이트에서 선택적으로 발현될 수 있는 약독화 살모넬라 균주를 이용한 고형암 치료제에 대해 게시하였다.
Stichodactyla 독소(Stichodactyla toxin, ShK)은 태양 말미잘(Stichodactyla helianthus)로부터 유래하는 펩티드 독소이다. 이는 35개의 아미노산으로 구성된 염기성 펩티드이며, 이는 칼륨 채널(potassium channel)에 결합하여 K+ 이온의 세포내 유입을 차단하여 신경활동을 중단시키는 것으로 알려져있다.
이에 본 발명자들은 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 제조하고, 이의 우수한 암 치료 효과를 확인한 바, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
일 양상은 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 약독화 살모넬라 균주를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 flgM 유전자 및 Shk 유전자가 직접 또는 링커를 통해 연결되어, flgM 및 Shk의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 이하 본 명세서에서는 flgM 및 Shk의 융합단백질을 “flgM-Shk”라 한다.
본 명세서에서 용어,“flgM”은 박테리아의 3형 분비계에서 후기 편모 전사를 위해 필요한 RNA 중합효소를 동원하는 것을 담당하는 σ인자를 억제하는 단백질 또는 이러한 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다.
상기 “3형 분비계”는 그람 음성균에 발달된 병원성 물질 전달 시스템을 의미한다. 이는 숙주의 세포막을 통과하여 직접 세포질로 병원성 활성 단백질을 주입하는 주사기 형태의 기구(Mota LJ et al, Ann Med.(2005);37(4):234-249)로서, 다중 단백질 복합 구조체이다. 상기 3형 분비계에서, 세포막에 편모를 만들 수 있는 기본 구조인 후크(hook)-기저체(basal body)가 형성되는 동안, flgM 단백질은 세포질 내에 남아있으며, class III 유전자, 예를 들어 플라젤린 서브유닛 FliC 또는 고정자(stator) 단백질 MotAB의 전사를 방해하는 항-σ28 인자로서 작용한다. 이후, 후크-기저체 구조 완성 후, 동시에 플라젤라 분비 시스템 내 기질 특이성의 변화가 일어나고, 이로 인해 flgM은 후크의 중앙통로를 통해 세포 밖으로 분비되고, 이후 세포 내에서는 σ28-의존적 전사가 시작된다. 3형 분비계에서의 편모 형성 과정을 통한 flgM의 분비기작은 도 3에 나타낸 바와 같다.
일 구체예에서, 본 발명은 flgM 유전자와 분비하고자 하는 단백질인 Shk 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여, 균주의 3형 분비계를 통한 flgM의 분비와 함께 Shk의 균주 외 분비를 가능하게 하였다. 상기 놔의 유전 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스로부터 수득할 수 있다.
본 명세서에서 용어, “flhDC”는 플라젤린 오페론 (operon) 유전자의 주된 조절자로 flgM 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 flgM 유전자 및 Shk 유전자와 함께 flhDC 유전자를 추가로 포함함으로써, flgM- Shk의 발현능 또는 분비능 증진에 기여할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전자"는 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절 단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전적 구조물"은 목적하는 단백질의 유전 정보를 포함하는 집합체, 기능적 단위체, 또는 컨스트럭트를 지칭하며, 이는 최광의로 해석될 수 있다. 상기 유전적 구조물은 본 발명의 목적상, 약독화된 살모넬라 균주로부터 flgM- Shk의 분비를 증진시키기 위한 것으로서, 예를 들어, flgM 유전자, 링커 유전자, 및 Shk 유전자가 작동가능하게 연결된 DNA 인서트를 지칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, “벡터”는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지일 수 있다. 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 마커는 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 히그로마이신(hygromycin) 및 제오신(zeocin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 선택 마커일 수 있다. 상기 벡터는 복제원점, 프로모터 등 복제 및/또는 카피수 조절에 관여하는 유전자를 포함할 수 있고, 제한효소 부위 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 유전적 구조물을 벡터에 도입할 수 있도록 본 발명의 유전적 구조물 전단과 후단에 적절한 제한효소를 배치할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “폴리뉴클레오타이드”는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩티드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자를 모두 포함함으로써, flgM-Shk의 발현량 또는 분비량을 증진시키는데 기여할 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 발현 벡터는 flgM 유전자; 및 Shk 유전자에 더하여 flhDC 유전자를 추가로 포함함으로써, flgM- Shk의 발현능 또는 분비능이 증진된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "유도성 프로모터"란 유도물질에 의해 연결된 유전자의 작동을 스위칭할 수 있는 프로모터로, 예를 들어 ara 프로모터, tac 프로모터, lac프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, T7 프로모터, pBAD 프로모터, Tet 프로모터, trc 프로모터, pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol 11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터, pagC 프로모터, hip 프로모터, ansB 프로모터 또는 pflE 프로모터 일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 ara 프로모터 일 수 있다.
본 명세서에서 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의하여 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 뉴클레오티드 서열들이 연결된 것을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 상기 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자는 동일한 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 ara 프로모터 일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자가 동일한 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절됨에 따라, flgM-Shk의 발현능 또는 분비능이 증진된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flgM 유전자, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 Shk 유전자, 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flhDC 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 flgM 유전자 및 Shk 유전자는 링커를 통하여 연결될 수 있다.
본 명세서에서 용어,“링커”란 관심있는 단백질에 이종성 도메인(domain)을 연결하는 데 사용된 폴리펩티드 사슬 또는 이를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 상기 링커 펩티드는 2 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2 내지 40개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 5개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커 펩티드는 예를 들어, (GlSm)n(l, m 및 n은 각각 ≥ 2), (GlSm)n-Hp-(GlSm)n (l, m 및 n은 각각 ≥ 1, H ≥ 6), (G4S)a(EAAAK)b(G4S)a(a, b는 1 내지 4의 정수), (G4S)p(EAAAK)q(p, q는 1 내지 4의 정수), (EAAAK)x(G4S)y(x, y는 1 내지 4의 정수), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, (GSSGGS)i(i는 1 내지 4의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD, EGKSSGSGSESKST, GSAGSAAGSGEF, (EAAAK)k(k는 1 내지 5의 정수), CRRRRRREAEAC, GGGGGGGG, GGGGGG, AEAAAKEAAAAKA, PAPAP, VSQTSKLTRAETVFPDV, PLGLWA, TRHRQPRGWE, AGNRVRRSVG, RRRRRRRR, GGSSHHHHHHSSGG, GGSSHHHHHHSSGGLVPRGSH, 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 링커 펩티드는 GGSSHHHHHHSSGG일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 flgM 유전자 및 Shk 유전자는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터는, 상기 flgM 유전자 및 Shk 유전자가 상기 GGSSHHHHHHSSGG 링커 펩티드를 암호화하는 유전자 (서열번호 3)를 통해 연결됨으로써, flgM-Shk의 발현능 또는 분비능이 증진된 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 제공하는 것이다. 상기 약독화 살모넬라 균주에서, 언급된 용어 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어, "약독화"는 살아있는 병원체의 독성을 인위적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극하여 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 살모넬라의 약독화 초래 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 상기 약독화 살모넬라 균주는 aroA, aroC, aroD, aroE, asd, Rpur, rcsB, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp, cyp, phoP, phoQ, rfaY, dksA, hupA, sipC, clpB, clpP, clpX, pab, nadA, pncB, pmi, rpsL, hemA, rfc, poxA, galU, cdt, pur, ssa, guaA, guaB, fliD, flgK, flgL, relA, 및 spoT로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능이 상실된 것일 수 있다. 생체 내 적용 시 야생형으로의 환원을 방지하고, 독성을 더욱 약화시키기 위하여 상기 유전자 중 둘 이상의 유전자 기능을 상실시킬 수 있다.
상기 약독화 살모넬라 균주는 종양 부위에 표적화되어 면역 반응을 유도하는 것에 의해 항암 활성을 갖는다. 이에, 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주는 종양 부위에 표적화되어 flgM-Shk을 분비함으로써, 종양 세포에 대한 세포 사멸 효과를 나타내어 항암 효과를 갖는 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환됨으로써, flgM-Shk의 발현 및 분비 수준이 현저히 증진되었음을 확인하였다.
일 구체예에 따른 상기 약독화 살모넬라 균주는 aroA, aroD, 및 asd 유전자의 기능이 상실되거나, aroA, aroD, asd, 및 galE 유전자의 기능이 상실되거나, 또는 aroA, aroD, asd, rcsB, 및 galE 유전자의 기능이 상실된 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주의 경우, 상기 aroA, aroD, asd, rcsB, 및 galE 유전자의 기능이 상실된 균주인 경우, flgM-Shk의 발현능 및 분비능이 현저히 증진된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약독화 살모넬라 균주는, 약독화 유전자가 제2 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것일 수 있다. 즉, 특정 유전자의 기능 상실이 제2 유도성 프로모터에 의해 조절되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약독화 살모넬라 균주는 약독화 유전자 앞에 제2 유도성 프로모터를 추가로 포함하여 균주의 약독화가 스위칭되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 약독화 살모넬라 균주를 약독화된 상태로 개체 내에 주입하여 종양 부위에 표적화시킨 후, 상기 제2 유도성 프로모터의 작동에 의해 약독화 유전자의 발현을 유도하여, 높은 면역활성을 유발하여 암 치료가 더욱 효과적으로 이루어지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 galE의 유전자의 기능이 상실된 것일 수 있으며, 상기 galE 유전자의 기능 상실은 tetRA 프로모터에 의해 스위칭되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 약독화 살모넬라 균주를 약독화된 상태로 개체 내에 주입하여 종양 부위에 표적화시킨 후, 독시사이클린(doxycycline)에 의해 상기 galE 유전자의 발현을 유도하여, 살모넬라 균주의 높은 면역 활성을 유발하는 것일 수 있다. 본 명세서에서, 이와 같은 약독화 살모넬라 균주의 약독화 유전자의 발현 조절을 “galE:tetRA”로 표현하였다.
일 실시예에 따른 약독화 살모넬라 균주는 BRD509 asd rcsB galE:tetRA- 균주일 수 있으며, 이러한 약독화 살모넬라 균주는 우수한 flgM-Shk의 발현 또는 분비능을 나타냄을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 수탁번호 KCTC15508BP로 수탁된 것일 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에서, 언급된 용어 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "암 (cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 (aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적 (invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 (metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 상기 암은 예를 들어, 고형암일 수 있으며, 바람직하게는 살모넬라 균주의 암 표적화능이 발휘될 수 있는 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 종양이라면, 비제한적으로 확장 적용될 수 있다. 예를 들어 상기 암의 종류로는 두경부암, 피부암, 췌장암, 대장암, 결장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암, 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것 아니다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제로 이용하기 위하여, 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 “약학적으로 허용 가능한 담체”는 투여되는 특정 조성물에 따라 부분적으로 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 따라 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서, 상기 조성물의 적합한 제형이 매우 다양하며, 예를 들어, 조성물은 비경구(즉, 근육내, 피내, 또는 피하) 투여 또는 비인두(즉, 비강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 비경구 투여용 제형은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 올레산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 비롯하여 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유를 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가물은 또한 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스 등으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 제제의 형태, 환자의 연령, 성별 및 상태, 증상의 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 일반적인 투여량은 0.001mg/kg·일~10g/kg·일이다.
또 다른 양상은, 상기 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 암을 예방 또는 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 암을 예방 또는 치료하는 방법에서, 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 소, 염소, 또는 돼지일 수 있다.
상기 투여는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 예를 들어 점안 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있고, 구체적으로 점안 투여의 경로 등을 통해 목적하는 바에 따라 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 발현 벡터에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 경우, flgM-Shk의 발현 및 분비가 현저하게 증진됨을 확인하였다.
또한, 일 양상에 따른 재조합 발현 벡터에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 제제를 투여한 경우, 우수한 항암 효과 및 안정성을 나타냄을 확인하였다.
도 1은 Shk 펩티드와 칼슘 채널과의 결합 관계를 나타낸 나타낸 도이다.
도 2는 3형 분비계를 이용한 flgM-Shk의 균주 외 분비 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 3형 분비계 내에서 편모 형성 과정을 통한 flgM의 분비 기작을 간략하게 나타낸 도이다.
도 4는 flgM-linker-Shk-flhDC-pBAD18 asd+ 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 균주의 flgM-Shk 단백질 분비 수준을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다. 도 5의 (a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, 및 (c)는 실시예 1의 균주에 대한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 균주를 Fadu 세포주에 처리한 경우, 상기 균주의 세포 사멸 효과를 관찰한 결과이다. 도 6의 (a)는 비교예 1, 및 (b)는 실시예 1의 균주에 대한 결과이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
도 7은 일 실시예에 따른 균주를 Fadu 세포주에 처리한 경우, 상기 균주의 세포 사멸 효과를 CCK assay를 통해 확인한 결과이다. 도 7의 (a)는 비교예 1, 및 (b)는 실시예 1에 대한 결과이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
도 8은 일 실시예에 따른 균주를 Fadu 세포주에 처리한 경우, 상기 균주의 세포 사멸 효과를 LDH assay를 통해 확인한 결과이다. 도 8의 (a)는 비교예 1, 및 (b)는 실시예 1에 대한 결과이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
도 2는 3형 분비계를 이용한 flgM-Shk의 균주 외 분비 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 3형 분비계 내에서 편모 형성 과정을 통한 flgM의 분비 기작을 간략하게 나타낸 도이다.
도 4는 flgM-linker-Shk-flhDC-pBAD18 asd+ 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 균주의 flgM-Shk 단백질 분비 수준을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다. 도 5의 (a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, 및 (c)는 실시예 1의 균주에 대한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 균주를 Fadu 세포주에 처리한 경우, 상기 균주의 세포 사멸 효과를 관찰한 결과이다. 도 6의 (a)는 비교예 1, 및 (b)는 실시예 1의 균주에 대한 결과이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
도 7은 일 실시예에 따른 균주를 Fadu 세포주에 처리한 경우, 상기 균주의 세포 사멸 효과를 CCK assay를 통해 확인한 결과이다. 도 7의 (a)는 비교예 1, 및 (b)는 실시예 1에 대한 결과이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
도 8은 일 실시예에 따른 균주를 Fadu 세포주에 처리한 경우, 상기 균주의 세포 사멸 효과를 LDH assay를 통해 확인한 결과이다. 도 8의 (a)는 비교예 1, 및 (b)는 실시예 1에 대한 결과이다 (PBS: 대조군, uninduction: 아라비노스 비처리군, induction: 아라비노스 처리군).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Shk 분비를 위한 플라스미드 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 제조
1-1. Insert DNA의 제조
Shk 분비를 위한 플라스미드 제조를 위하여, flgM 유전자, 및 Shk 유전자가 연결된 유전적 구조물을 제조하였다.
구체적으로, 야생형 살모넬라의 flgM DNA 서열(flgM anti-sigma-28 factor FlgM [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2] Gene ID: 1252690, Locus tagSTM1172 NC_003197.2 (1257036..1257341, complement))과, Shk에 대한 코돈 최적화를 통해 수득한 DNA 서열을 링커를 통해 연결시켜 유전적 구조물을 제조하였다. 상기 flgM 유전자의 발현을 높이기 위해, flgM 유전자 앞에 샤인 달가노 서열을 삽입하였다, 또한, 클로닝을 위해 맨 앞에는 NheⅠ site(GCTAGC)를 삽입하고, Shk의 종결 코돈 뒤에는 SacⅠ site(GAGCTC)를 삽입하였다. ㈜바이오닉스 유전자 합성 서비스를 통하여 flgM, linker, 및 Shk를 포함하는 유전적 구조물을 제조하였으며, 상기 유전적 구조물에 NheⅠ 및 SacⅠ 효소를 각각 10U 처리하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 이를 전기영동한 뒤, Gel extraction kit((주)Qiagen)로 약 500bp (470bp) DNA를 확인하여 flgM-linker-Shk insert DNA를 수득하였다.
이후, flhDC insert DNA를 수득하기 위해, 야생형 살모넬라 LT2의 genomic DNA를 주형으로 하기 표 1의 flhD-sac1-F 및 flhC-Sal1-r 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 flhDC 유전자가 포함된 PCR 산물을 얻었다. 구체적인 PCR 조건은 다음과 같다; 10x buffer 5μl, 5xQ solution 10 μl, 2 mM dNTPs 7.5 μl, 20 μM flhD-sac1-f 프라이머 2.5μl, 20μM flhC-Sal1-r 프라이머 2.5 μl, Taq polymerase 1 μl, 10 ng/μl genomic DNA2 μl 및 물 19.5 μl을 혼합하여 Qiagen system을 사용하여, 95℃ 5분과, 30회의 94℃ 30초, 49℃ 30초, 72℃ 1분 반복과 그 후에 72℃ 10분의 조건에서 PCR을 진행하였다. PCR purification kit로 정제한 PCR fragment 1μg과 sacI과 SalI을 각각 10U를 37℃에서 2시간 반응시키고, 상기 반응 산물을 PCR purification kit로 정제하여 flhDC insert DNA (서열번호 5)를 제조하였다.
명명 | 서열 정보 | 서열번호 |
flhD-SAC1-f | gatcgatcgagctcaggaggtttgatcctatgggaacaatgcatacatccgagttgct | 6 |
flhC-Sal1-r | gatcgatcgtcgacttaaacagcctgttcgatctgttcatccagcagtt | 7 |
1-2. 플라스미드의 제조
이후, pBAD18 asd+ 플라스미드를 벡터로 사용하여, NheⅠ 및 SacⅠ 효소 각각 10U를 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 상기 반응 산물을 PCR purification kit로 정제하여 각각의 벡터 DNA를 얻었다. 상기 플라스미드 내에 삽입된 asd 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어질 수 있다. 이후, 각 벡터 DNA를 상기 flgM-linker-Shk insert DNA와 25℃에서 30분간 ligation시키고, DH5a 컴피턴트 세포에 형질전환시켰다. 이후, 상기 형질전환된 세포를 LB amp(ampicillin) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니의 후보군 6개를 선별하여 NheⅠ 및 SacⅠ 각각 10 U와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 전기영동을 통해 약 500bp 밴드의 생성을 확인하였다. 또한, 상기 플라스미드에 대해 해당 후보군의 염기서열 분석을 실시하여, 상기 flgM, linker, 및 Shk 유전자의 삽입을 확인하였다.
상기 플라스미드 각각 1μg을 sacⅠ 및 SalⅠ 10U와 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 상기 반응산물을 PCR purification kit로 정제하여 벡터 DNA를 완성하였다. 이후, 각 벡터 DNA를 상기 flhDC insert DNA와 25℃에서 30분 ligation 시킨 후 DH5a 컴피턴트 세포를 형질전환 시켰다. 형질전환된 세포를 LB amp 고체 배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니의 후보군 6개를 선별하여 SacⅠ 및 SalⅠ 10U와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 전기영동을 통해 band의 생성을 확인하였다. 해당 후보군의 염기서열 분석을 실시하여, flhDC 유전자의 삽입을 확인하였다.
이를 통하여, 일 실시예 및 비교예에 따른 flgM-Shk-flhDC-pBAD18-asd+ 플라스미드를 제조하였다.
한편, 본 실시예에서 주요한 구조물의 유전 정보는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
명명 | 서열 정보 | 서열번호 |
flgM | ATGAGCATTGACCGTACCTCACCTTTGAAACCCGTTAGCACTGTCCAGACGCGCGAAACCAGCGACACGCCGGTACAAAAAACGCGTCAGGAAAAAACGTCCGCCGCGACGAGCGCCAGCGTAACGTTAAGCGACGCGCAAGCGAAGCTCATGCAGCCAGGCGTCAGCGACATTAATATGGAACGCGTCGAAGCATTAAAAACGGCTATCCGTAACGGTGAGTTAAAAATGGATACGGGAAAAATAGCAGACTCGCTCATTCGCGAGGCGCAGAGCTACTTACAGAGTAAAAAA | 1 |
Shk | atgcgcagctgcattgataccattccgaaaagccgctgcaccgcgtttcagtgcaaacatagcatgaaatatcgcctgagcttttgccgcaaaacctgcggcacctgcTAA | 2 |
linker | GGCGGCAGCAGCCATCACCATCACCATCACAGCAGCGGCGGC | 3 |
flhDC | AGGAGGTTTGATCCTatgggaacaatgcatacatccgagttgctaaaacacatttatgacatcaatttgtcatatttactccttgcacagcgtttgatcgtccaggacaaagcatctgcgatgttccgcctcggtatcaacgaagagatggcaaacacactgggcgcgttgaccctgccgcagatggtcaaactggcggagacgaaccagttagtttgtcatttccggtttgacgatcatcagacgatcacccgtttgactcaggattcgcgcgtcgatgacttacagcagattcacacaggtatcatgctttcaacgcgtctgctcaatgaagtggacgatacggcgcgtaagaaaagggcatgaaagggcatgataatgagtgaaaaaagcattgttcaggaagctcgcgatatccagttggcgatggagttgattaatcttggcgctcgtctacaaatgctggaaagcgaaacacagctcagccgtggtcgcctcatcaggctgtacaaagaattacgcggtagcccgccgcctaaagggatgctgccattttcgacagactggtttatgacctgggagcaaaatattcatgcctccatgttctgcaacgcctggcaatttttactgaagaccggcttatgcagcggtgtggatgcggtgattaaagcttatcggctttatcttgagcagtgtccgcaaccgcctgaagggccgttgttggcgctgactcgcgcatggacgctggtgcgttttgttgaaagtgggttgcttgaattgtcgagctgtaactgctgcggtgggaactttattacccatgcgcatcagcccgtaggcagctttgcgtgtagtttatgccagccgccatcccgcgcagtaaaaagacgtaaactttcccgagatgctgccgatattattccacaactgctggatgaacagatcgaacaggctgtttaa | 5 |
1-3. flgM-Shk을 분비하는 약독화 살모넬라 균주 제조
상기 실시예 1-2의 플라스미드를 각각 약독화 살모넬라 균주에 대해 형질전환시켰다. 상기 약독화 살모넬라 균주로는: BRD509 asd- 균주 (#177), BRD509 asd galE:tetRA- 균주(#1317) 또는 BRD509 asd rcsB galE:tetRA- 균주(#1323)를 사용하였으며, 각각의 균주는 충남대학교로부터 분양받았다. 이와 같이 형질전환된 균주의 유전자 및 균주의 정보는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
실시예 1 | 비교예 1 | 비교예 2 | |
균주 | #1323 | #177 | #1317 |
본 발명자들은 일 실시예에 따른 flgM-Shk-flhDC-pBAD18-asd+/BRD509 asd rcsB galE:tetRA- 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2023년 7월 18일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC15508BP를 부여받았다 (S-flgM-Shk-flhDC-pBAD18-ASD+/#1323).
실험예 1. 단백질 발현 및 분비능 확인
일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주의 flgM-Shk의 발현 및 분비능을 확인하기 위해, 하기와 같은 방법으로 단백질의 발현량을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다.
구체적으로, 상기 형질전환된 각 균주의 단일 콜로니를 LB amp 액체배지에 접종한 후 37℃에서 12~16시간 진탕배양하였다. 이후 신선한 LB amp 액체배지에 OD600이 0.05가 되도록 희석한 후 37℃에서 2시간 진탕배양하였다. 이후, OD600이 0.4 내지 0.6 일 때, 아라비노스를 0.2% (w/v) (최종) 농도로 처리한 군을 시험군(+)으로, 아라비노스를 처리하지 않은 군을 대조군(-)으로 구분하였으며, 이를 37℃에서 5시간 추가로 진탕배양하였다. 이후, 상기 시험군 및 대조군의 시료를 전체 세포 배양액(whole cell), 펠렛(pellet) 및 상층액(supernatant)로 분리하였다. 상기 펠렛 및 상층액은 상기 전체 세포 배양액을 8000 rpm으로 원심분리하여 분리한 것이다. 또한, 상기 상층액은 다시 0.2μm 필터로 여과하여 균을 완전히 제거하고, pall사의 nanosep(OD010C35 3K omega)를 이용하여 농축하였다.
상기 전체 세포 배양액, 펠렛 및 상층액 시료 각각 50μl를 SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 웨스턴 블랏을 위한 샘플을 제조하였다. 각각의 샘플을 100℃ 히팅 블록(heating block)에 5분간 변성시킨 후, 5분간 13000rpm, 4℃에서 원심분리 하고 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동 하였다. 상기 겔은 PVDF (polyvinylidene fluoride)를 이용해 트랜스퍼하여 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동시켰으며, 상기 멤브레인을 blocking buffer를 사용하여 실온에서 1시간동안 blocking하였다. 이후, 1차 항체로 anti-his tag(SB194b, SouthernBiotech)를 1/1000으로 희석하여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이후 상기 멤브레인을 TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20)로 10분 간격으로 3회 세척한 후, mouse anti-mouse-IgG (#7076s, Cell signaling, Danvers, MA, USA) 2차 항체와 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 TBST로 10분 간격으로 3회 세척한 후, ECL 버퍼를 이용해 X-ray 필름에 감광한 후, 현상하여 각각의 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타낸 바와 같다. 도 5에서, 2, 4, 및 6 레인은 아라비노스(최종 농도 0.2% (w/v))를 처리한 시험군(+)이며, 1, 3, 및 5 레인은 아라비노스를 처리하지 않은 대조군(-)이다. 또한, 상기 도 5에서, 레인 1 및 2는 whole cell(W.C), 레인 3 및 4는 펠렛, 및 레인 5 및 6은 상층액(sup)에 대한 결과이다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일 실시예의 따른 균주의 경우, 균주를 제거한 상층액에서도 flgM-Shk 단백질의 높은 발현 및 분비 수준을 확인할 수 있었다. 또한, 일 실시예에 따른 균주는 flgM-Shk를 높은 수준으로 발현할 뿐만 아니라, 균주 외로 분비함을 확인하였다 (도 5의 (c)).
실험예 2. 항암 효과 확인
일 실시예에 따른 균주의 항암 효과를 확인하기 위해, 다음과 같이 실험을 수행하였다.
2-1. 종양 세포주 배양
인간 두경부암 세포주 Fadu를 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 Fadu 세포를 배양하였다. 상기 세포가 2 x 105 개 일 때, 6-well에 세포를 시딩하였다. 시딩 24시간 후에, 상기 실험예 1에서 수득한 상층액(flgM-Shk) 200ul를 처리한 후 48시간동안 배양하였다.
2-2. 종양 세포 사멸 효과 확인
도 6에 나타낸 바와 같이, 아라비노스 비처리군(uninduction)에 비해, 아라비노스 처리군(induction)의 경우 세포가 현저히 많이 비어있음을 확인하였는 바, 아라비노스에 의해 flgM-Shk의 발현을 유도한 경우 세포 사멸이 현저히 증가하였음을 확인하였다. 이에 따라, 일 실시예에 따른 균주를 처리한 경우, 세포 사멸 효과가 더욱 현저하게 나타남을 확인하였다 (도 6의 (b)).
이에 더해, 일 실시예에 따른 균주에 의한 종양 세포의 세포 사멸 정도를 측정하기 위해, 하기와 같이 DogenBio의 EZ-Cytox(ez-500) assay kit를 사용하여 CCK assay를 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2-1의 배양액에 CCK solution을 50ul 처리한 뒤, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액 100ul을 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 450nm microreader로 흡광도를 측정하여 세포 생존능(cell viability)을 확인하였다. 실험은 모두 3회 반복하여 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 아라비노스 처리에 의해 flgM-Shk의 발현을 유도한 경우(induction), 아라비노스 비처리군(uninduction)에 비해 세포사가 현저히 많이 일어났음을 확인하였다. 또한, 실시예 1의 균주를 처리한 경우, 세포 생존능이 현저히 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 일 실시예에 따른 균주를 포함하는 조성물을 종양 세포주에 처리함으로써 우수한 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인하였는 바, 일 실시예에 따른 균주의 우수한 암세포 사멸 효과를 확인하였다.
이에 더해, LDH assay는 DogenBio의 EZ-LDH (DG-LDH500) assay kit를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2-1의 배양액을 1000rpm으로 3분동안 원심분리하여 세포의 잔해를 제거한 뒤, 이와 같이 처리한 배양액 10ul에 LDH solution 100ul 처리한 뒤 30분간 인큐베이션하였다. 이후, 450nm microreader로 흡광도를 측정하여 LDH 방출을 측정하였다. 실험은 모두 3회 반복하여 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 아라비노스 처리에 의해 flgM-Shk의 발현을 유도한 경우(induction), 아라비노스 비처리군(uninduction)에 비해 LDH 방출량이 높게 나타남을 확인하였다. 이를 통해, 일 실시예에 따른 조성물 처리에 따라, 현저한 세포 사멸 효과가 나타날 뿐만 아니라, 이러한 세포 사멸이 세포막의 손상에 의한 것임을 알 수 있었는 바, 이는 세포의 내부 구성물질이 면역세포를 자극해 2차 항암면역효과를 유도하여, 더욱 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 상기 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 상기 flgM 유전자; Shk 유전자; 및 flhDC 유전자는 동일 유도성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flgM 유전자, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 Shk 유전자 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 flhDC 유전자를 포함하는 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 상기 flgM 유전자 및 상기 Shk 유전자는 링커를 통하여 연결된 것인, 재조합 발현 벡터.
- 청구항 1의 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 aroA, aroD, asd, rcsB 및 galE의 유전자의 기능이 상실된 것인, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 Shk 단백질에 대한 분비능이 향상된 것인, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약독화 살모넬라 균주는 수탁번호 KCTC15508BP로 수탁된 것인, 약독화 살모넬라 균주.
- 청구항 5의 약독화 살모넬라 균주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
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