KR20230066249A - 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물 Download PDF

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홍영진
유성환
딘 후이 누옌
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전남대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암, 특히 내성 및 단일 항암요법으로 치료가 어려운 암종에 있어서, 박테리아와 면역관문억제제를 병용 투여하여, 종양의 크기를 현저히 억제함으로써, 생존률을 개선하는 예방 또는 치료제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물{A Pharmaceutical composition for preventing or treating of cancer comprising Salmonella strain and immune check point inhibitor as an active ingredient}
발명은 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
면역학의 발전으로 면역관문억제제(immune check point inhibitor)가 개발되어 암 치료의 새로운 시대를 열었다. 하지만, 면역관문억제제에 효과적인 반응을 보이는 환자는 암종별로 다르며, 그 효과도 30% 미만으로 나타나기 때문에, 면역관문억제제의 치료 효과를 증진하고자 많은 연구가 진행되고 있다. 그 중에서 치료제로서 박테리아는 상당한 관심을 얻고 있다. 박테리아 단독요법은 치료가 완전하지 않을 수도 있지만, 항암제로의 변화, 항종양 유전자 또는 면역 원성 항원을 단독 또는 조합하여 치료효과를 높이는 방향으로 연구가 되고 있다.
개체에서 암이 발생될 때 혈관 형성과 세포 성장이 체내에서 매우 빠른 속도로 진행되어, 암 조직의 내부는 혈관 형성이 불완전하여 산소가 결핍된 환경이 조성되므로, 살모넬라 속 균주 또는 대장균과 같은 혐기성 박테리아가 증식하기에 매우 적합할 수 있다. 이에 따라, 현재 살모넬라(Salmonella) 속 균주와 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주와 같은 암을 표적할 수 있는 박테리아를 이용한 암 치료는 고형종양을 표적으로 하고 종양 내에서 증식할 수 있는 특정 박테리아의 기능에 의존하지만 종양용해 단백질 또는 리포터 단백질을 상기 박테리아에 도입하고, 이렇게 형질전환된 박테리아를 개체에 투여하는 경우 암 조직을 특이적으로 확인하거나, 정상 세포에 대해 독성을 나타내는 부작용을 최소화하여 암을 치료할 수 있다.
따라서 본 발명은 고형암의 예방 또는 치료제 개발의 문제를 해결하기 위해 고안된 것으로, 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학조성물은 생체 내 시스템에서 생존율을 향상시키는 효과가 있으므로, 암 치료 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명자들은 내성 및 단일 항암요법으로 치료가 어렵고 효율적인 치료 방법이 없는 암의 신뢰도 높은 예방 및 치료용 조성물을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 암에 선택적으로 작용하는 살모넬라 균주 및 PD-L1을 포함한 면역관문억제제의 병용요법으로 종양 성장이 현저하게 억제 및 개선됨을 확인하였다. 이로써, 암에 대한 새롭고, 효율적인 치료 방법과 조성물을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 살모넬라 균주 및 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitors)를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명자들은 내성 및 단일 항암요법으로 치료가 어렵고 효율적인 치료 방법이 없는 암의 신뢰도 높은 예방 및 치료용 조성물을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 암에 선택적으로 작용하는 살모넬라 균주 및 PD-L1을 포함한 면역관문억제제의 병용요법으로 종양 성장이 현저하게 억제 및 개선됨을 확인하였다. 이로써, 암에 대한 새롭고, 효율적인 치료 방법과 조성물을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서에서 용어 "살모넬라(Salmonella)"는 장내세균과의 살모넬라속에 속하는 프로테오박테리아의 일종이다. 막대 모양의 세균으로 직경 약 0.7 ~ 1.5μm, 길이 약 2 ~ 5μm 정도의 크기로 주로 사람이나 동물의 소화관에 서식한다.
본 명세서에서 용어"면역관문(immune checkpoint)"은 자기-관용을 유지하고 손상을 야기하는 과도한 면역 반응으로부터 조직을 보호하는 세포내 신호전달 체계를 의미한다. 면역관문 단백질은 면역 관문을 조절하는 세포막 단백질로서 면역세포의 분화, 증식, 활성을 억제할 수 있으며, 구체적으로 이들은 활성화된 T 세포에서 발현되어 T 세포의 증식, 사이토카인 분비 및 세포독성을 감소시키고, T 세포의 과도한 활성을 억제한다. 일부 면역관문은 종양세포가 환자의 면역반응을 회피하는 주요 메커니즘 중 하나로 작용한다. 이에, 용어 "면역관문 억제용 조성물(a composition for immune checkpoint inhibition)" 또는 "면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 암 면역 요법의 한 형태로 우리 몸의 면역시스템을 이용해 선택적으로 암세포를 공격하도록 유도하는 원리다. 면역관문 단백질의 발현 또는 활성을 차단함으로써 T 세포 활성을 강화하여 항 종양 면역반응을 촉진하는 항암 성분 또는 항암 보조제 성분을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “암”은, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 학문적으로는 신생물이라고 명명되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환으로, 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 상당수의 암이 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자 (oncogenes)와 종양억제유전자 (tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 용인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이, 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어"예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어"치료"란, 본 발명의 상기 유효성분을 이용하여 암으로 인해 발생된 증상이 호전되거나, 개체가 이롭게 되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, "치료"는 치료의 부재에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, "치료"는 질병 진행의 억제, 일시적으로 질병 진행의 늦춤을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 질병의 진행을 영원히 정지시키는 것과 관련이 있다. 당업자에 의해 이해된 바와 같이, 특정 질병 상태를 향상시키는 동안 치료가 치료된 환자에서 반대의 결과, 즉 치료에 의해 영향을 받는 모든 이점보다 큰 결과를 초래한다면 결과는 유익하지 않거나 바람직하지 않을 수도 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 항암제와 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어"치료"또는"치료제"는"치료 보조"또는"치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "약학조성물"은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어"투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 의미하고, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 포함하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 치료용 약학조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 목적하고자 하는 암의 치료를 위해 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법, 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 약학조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료적 유효량"은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에"예방적 유효량"을 포함하는 의미이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조성물은 병용투여 된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀브린(Salmonella. dublin), 살모넬라 타이피수이스(Salmonella. typhisuis), 살모넬라 더비 (Salmonella. derby), 및 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum) 로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체적으로는 상기 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)"는 인간을 포함한 영장류의 장관 내에 서식하는 장내 세균과를 의미하며, 외독소로 알려진 사이토라이신(cytolysin)을 분비한다. 이렇게 분비되는 사이토라이신은 약 34 kDa의 분자량을 가지는 세포독성 단백질로서 사람을 포함한 영장류의 장 내에서 적혈구를 파괴하는 용혈작용 및 정상세포의 막에 기공을 형성시켜 세포의 용해를 유발시켜 심각한 혈관 염증과 국소조직의 괴사로 인해 사망에까지 이르게 한다고 알려져 있다. 하지만, 최근 연구결과에서는 살모넬라 엔테리카에서 분리 및 정제된 사이토라이신이 체내 장관에 존재하는 암 조직에 특이적으로 반응하여 암 조직의 사멸을 유도하여 차세대 항암 치료제로써 주목받고 있다. 따라서 세포 독성 물질인 사이토라이신을 분비하는 유전자가 형질전환된 박테리아는 암 조직 표적용 항암 치료제로서의 활용 가능성이 매우 높을 수 있다.
본 발명에 따르면 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포가 포함될 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스 또는 살모넬라(Salmonella) 속 균주 등의 박테리아 세포, 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포, CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T 세포, 보우 멜라노마 세포, HT-1080 세포, BHK 세포(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK 세포(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6 세포(인간 망막 세포)와 같은 동물 세포, 및 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 균주는 혐기성 균주, 예를 들면 살모넬라 속 균주, 클로스트리듐(Clostridium) 속 균주, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주 및 대장균 속 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수스(Salmonella choleraesuis) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 균주는 약독화된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "약독화"는 미생물을 환자에 투여하는 경우 독성 및 다른 부작용 등을 감소시킬 수 있도록 유전자 등에 변형을 가한 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 균주가 살모넬라 속 균주인 경우에는, 약독화를 위하여 aroA, aroC, aroD, aroE, Rpur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp, cyp, phoP, phoQ, rfaY, dksA, hupA, sipC, clpB, clpP, clpX, pab, nadA, pncB, pmi, rpsL, hemA, rfc, poxA, galU, cdt, pur, ssa, guaA, guaB, fliD, flgK, flgL, relA 및 spoA로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 변형을 가한 것일 수 있으나, 이에 제한된 본 발명의 상기 유전자에 변형을 가하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 유전자의 결실 또는 파괴하는 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들면, 상기 결실 및 파괴 방법은 상동성 재조합, 화학적 변이유발, 조사 변이유발 또는 트랜스포존 변이유발 등과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 균주는 혐기성 균주가 증식하기에 매우 적합한 혈관 형성이 불완전하여 산소가 결핍된 환경인 암 조직의 내부를 표적하기 때문에, 이와 같은 균주 내에 실시간으로 이미징이 가능한 리포터 단백질과 항암 단백질이 동시에 균형적으로 발현될 수 있는 재조합 벡터가 도입되어 있는 경우 암을 매우 효과적으로 진단과 동시에 치료할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역관문억제제는 Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4(CTLA-4), Programed cell death protein 1(PD-1), Programmed death-ligand 1(PD-L1), KIR, LAG3, CD137, OX40, CD47, CD276, CD27, 및 GITR 로 구성된 군으로부터 선택된다.
구체적으로는, 상기 면역관문억제제는 Programmed death-ligand 1(PD-L1)이다.
본 발명에서 용어 "Programmed death-ligand 1(PD-L1)"은 암세포의 표면이나 조혈세포에 있는 단백질을 의미한다. CD274, B7-H1라고도 명칭하며, 암세포의 표면에 있는 단백질인 PD-L1, PD-L2가 T세포의 표면에 있는 단백질인 PD-1과 결합하면, T세포는 암세포를 공격하지 못한다. 면역항암제는 T세포의 PD-1 수용체에 달라붙어 암세포의 회피 기능을 억제한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 암은 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 암에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조성물은 암의 성장 억제 또는 암 전이를 억제한다.
본 명세서에서 용어 “암 전이”는 암이 원발한 기관이나 부분으로부터 거리상으로 분리되어 있는 다른 곳으로 옮겨가는 성질을 의미한다. 전이성 암은 전이하려는 성질을 가진 암 또는 전이가 이루어진 암이다. 특히 상기 전이성 암은 간, 폐, 뼈, 림프절 또는 복강으로 전이되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 전이성 암은 치료가 어렵고, 처음 치료과정 보다 진행 양상 및 치료가 복잡할 수 있다.
본 발명에서 상기 “암 재발”은 치료 후 암을 발견할 수 없다가 일정 기간이 지난 후 다시 발견되는 것을 의미한다. 재발성 암은 상기와 같이 암의 재발이 일어난 결과 생긴 암을 의미한다. 암이 재발할 경우 절제가 어려운 경우가 많고, 절제가 가능한 경우에도 상당한 규모의 수술을 할 수밖에 없을 수 있다. 또한, 항암 치료 및 방사선 치료에도 제한이 있을 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 살모넬라는, 조절 단백질을 암호화하는 유전자; 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터; 상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제1 프로모터 및 제2 프로모터; 및 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터의 하류에 항암 단백질을 암호화하는 유전자; 사이토카인을 암호화하는 유전자; 케모카인을 암호화하는 유전자; 면역 조절자(Immune modulator)를 암호화하는 유전자; 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드; 및 리포터 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 벡터로 형질전환된 살모넬라일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "사이토카인"이란, 면역 세포가 분비하는 단백질로서, 본 발명의 상기 사이토카인은 숙주 면역 반응을 조절하여 질환과 관련된 세포, 예를 들면 암 세포의 사멸을 유도할 수 있는 암 면역 요법에 사용될 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 IFN-alpha2, IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-12일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "케모카인"이란, 조직 사이의 세포 이동과 조직 내의 세포의 위치 및 상호 작용을 조절하는 역할을 하는 것으로서, 백혈구를 종양 미세 환경으로 유도하여 질환, 예를 들면 암에 대한 숙주 반응을 중재할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 CXCR3, CCR5 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "면역 조절자"란, 개체가 갖고 있는 고유의 면역 체계를 활용하여 다양한 치료가 가능하도록 하는 것으로서, 면역 세포를 활성화시켜 질환과 관련된 세포, 예를 들면 암 세포의 사멸을 유도할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항암 단백질"이란, 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 펩티드로서, 예를 들면 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes), 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein) 및 플라겔린으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 별도의 프로모터에 의해 발현되는 하나의 조절 단백질에 의해 동시에 유도될 수 있기 때문에, 제2 프로모터의 하류에 조절 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 경우와 비교하여, 숙주 세포; 또는 숙주 세포 내에서 제1 프로모터 및 제2 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 암호화되는 단백질 간의 발현 수준이 균형을 이룰 수 있다. 이와 같이 상기 DNA 컨스트럭트를 이용하는 경우에는 진단과 치료가 동시에 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, "DNA 컨스트럭트"는, 숙주 균주 또는 세포에 형질전환을 통해 도입되는 경우 목적하는 단백질 등이 발현될 수 있도록 하는 구조체로서, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자뿐만 아니라, 상기 유전자가 발현될 수 있도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소인 프로모터에 해당하는 염기 서열 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 "프로모터"란, 숙주 균주 또는 세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 상류 영역에 존재하는 염기 서열로서, 전사가 개시되도록 하기 위하여 RNA 폴리머라제(RNA Polymerase)가 결합될 수 있는 상기 DNA 컨스트럭트의 특정 부위의 염기 서열을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조절 단백질은 TetR 단백질이고, 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 OXB1 프로모터이며, 상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제1 프로모터는 tetA 프로모터이며, 상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제2 프로모터는 tetR 프로모터이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 시스-작용 인자(cis-acting element) 또는 트랜스-작용 인자(trans-acting element)에 의해 상기 조절 단백질의 발현이 조절된다.
본 발명의 상기 조절 단백질의 발현 조절은 시스-작용 인자(cis-acting element, Cis-regulatory elements; CRE) 또는 트랜스-작용 인자(trans-acting element, Trans-regulatory elements; TRE)에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 "조절" 내지 "발현 조절"은 특정 유전자의 전사 및 번역이 활성화 또는 억제되는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 시스-작용 인자는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site; RBS), 5'-비 번역 영역(5'-Untransrated Region; 5'-UTR), 전사 인자 결합 부위(transcription factor binding site) 및 종결자(terminators)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "리보솜 결합 부위(ribosome binding site; RBS)"는 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence; SD sequence)이라고도 하며, DNA에 담겨 있는 유전 정보가 전령 RNA(mRNA)로 전사된 후, 번역(translation)이 일어나기 위해서는 이 mRNA에 리보솜(ribosome)이 결합해야 하는데 이때 리보솜이 효과적으로 결합할 수 있도록 mRNA 상에 존재하는 짧은 서열을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "5'-비 번역 영역(5'-Untransrated Region; 5'-UTR)"은 5' 지역에서 mRNA의 아미노산으로 번역되는 부분인 코딩 부분 (coding region)의 양 쪽에 위치하는 번역이 되지 않는 부분으로, 진화 과정에서 불필요하게 버려지는 부분(junk)로 여겨졌으나, 유전자 발현 조절에 큰 역할을 하는 것으로 알려졌다.
본 명세서에서 용어"전사 인자 결합 부위(transcription factor binding site)"는 근처의 특정 유전자를 켜거나 끄는 역할을 하는 DNA 부위이다. 상기 전사 인자 결합 부위는 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 사일렌서(silencer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전사 인자 결합 부위는, 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터; 인핸서(enhancer); 및 사일렌서(silencer);로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 상기 인핸서는 원핵과 진핵 생물 모두에서 발견되는 서열로, 일반적으로 50 내지 1500 bp의 영역을 가지고 상기 근처 유전자의 출발지로부터 상류 또는 하류에 위치하여 상기 전사인자 결합을 유도한다.
본 발명의 상기 사일렌서는 인핸서와 동일한 메커니즘을 유지하고 인핸서의 길항작용을 한다. 상기 사일렌서에 결합하는 전사 인자는 리프레서(repressor)이다. 상기 인핸서와 상기 사일렌서는 서로 근접한 영역에 존재하는 것일 수 있거나, 동일 영역에 전사 인자가 다른 영역인 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 약한 프로모터(weak promoter)이다.
본 발명의 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 대부분의 숙주 균주 또는 세포의 환경 조건 및 발달 상태 등에서 활성이 유도될 수 있는 프로모터라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 약한 프로모터(Weak promoter)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약한 프로모터"란, 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 전사된 전사체(Transcript)의 발현 수준이 1 Х 10-2 이하, 바람직하게는 1 Х 10-3 이하로 발현되도록 유도하는 프로모터로서, 위와 같이 전사체의 발현 수준을 1 Х10-3 이하로 발현되도록 하는 프로모터라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 E. coli σ70 프로모터; E. coli σS 프로모터; E. coli σ32 프로모터; B. subtilis σA 프로모터; B. subtilis σB 프로모터; 살모넬라 유래 프로모터인 K112706 또는 K112707; 박테리오파지 T7 프로모터; 박테리오파지 SP6 프로모터; 효모(yeast) 유래 프로모터; 진핵세포 유래 프로모터인 I712004 또는 K076017; OXB1 프로모터; 및 식물 유래 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 E. coli σ70 프로모터는 I14018, I14033, I14034, I732021, I742126, J01006, J23103, J23109, J23112, J23113, J23117, J23119, J23150, J23151, J44002, J48104, J56015, J64951, K088007, K119000, K119001, K1330002, K137029, K137030, K137031, K137032, K137085, K137086, K137087, K137088, K137089, K137090, K137091, K1585100, K1585101, K1585102, K1585103, K1585104, K1585105, K1585106, K1585110, K1585113, K1585115, K1585116, K1585117, K1585118, K1585119, K2486171, K256002, K256018, K256020, K256033, K292000, K823007, K823010, K823013, M13101, M13102, M13103, M13104, M13105, M13106, M13108, M13110, M31519, R1074, R1075 및 S03331으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 E. coli σS 프로모터는 J45992 또는 J45993일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 E. coli σ32 프로모터는 J45504, K1895002 또는 K1895003일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 B. subtilis σA 프로모터는 K143012, K143013, K823000, K823002 및 K823003으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 B. subtilis σB 프로모터는 K143010, K143011 또는 K143013일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 박테리오파지 T7 프로모터는 I719005, J34814, J64997, K113010, K113011, K113012, K1614000, R0085, R0180, R0181, R0182, R0183, Z0251, Z0252 및 Z0253으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 박테리오파지 SP6 프로모터는 J64998일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 효모 유래 프로모터는 I766557, J63005, K105027, K105028, K105029, K105030, K105031, K122000, K124000, K124002, K319005, M31201, K2365040, K2365036, K2365041, K2365042, K2365032, K2365051, K2365514, K2365515 및 K2365516으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 식물 유래 프로모터는 PLPR0203, PLPR0210, PLPR0177, PLPR0193, PLPR0507, PLPR0422, PLPR0228, PLPR0226, PLPR0223, PLPR0040, PLPR0465, PLPR0232, PLPR0205, PLPR0247, PLPR0328, PLPR0525, AtREG383, AtREG415, AtREG416, OsREG438, OsREG443, OsREG501, PpREG186, PpREG194 및 PpREG197으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약한 프로모터는 서열번호 4로 표시되는 OXB1 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상 상기 약한 프로모터의 하류에 조절 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결되는 경우에는, 상기 제1 프로모터 또는 제2 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 경우와 비교하여, 조절 단백질을 억제하는 물질을 투여하였을 때에만 특이적으로 상기 제1 및 제2 프로모터의 하류에 존재하는 유전자의 전사가 일어날 수 있도록 조절할 수 있다.
본 발명의 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 조절 단백질을 암호화하는 유전자를 기준으로 -35 부위의 염기 서열은 서열번호 2이고, -10 부위의 염기 서열은 서열번호 3인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약한 프로모터는 상기 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 전사된 전사체(Transcript)의 발현 수준이 1 Х10-2 이하일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 트랜스-작용 인자는 전사 인자, 앱타머(aptamer), sRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA; asRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 전사 인자는 상기 전사 인자 결합 부위와 결합하여 특정 유전자를 켜거나 끄는데 도움이 되는 단백질이다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)”는 리보스위치(riboswitch)의 일부분으로, 특정 표적분자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 혹은 펩타이드(Peptide) 물질을 통칭하며, 상기 앱타머는 펩타이드 앱타머 또는 핵산 앱타머일 수 있다. 상기 리보스위치는 유전자의 발현을 조절하는 mRNA의 일종으로, glmS 리보스위치, FMN 리보스위치, Cobalamin 리보스위치 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 sRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA; asRNA)는 특정 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 외줄 RNA(single-stranded RNA)을 뜻한다. 특정 단백질을 표현하는 전령 RNA(messenger RNA; mRNA)인 sense RNA에 상보적으로 결합하여, 결국 해당 단백질 발현을 조절한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 항암 단백질은 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes), 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 용어 "종양억제 단백질"이란, 정상 세포에 존재하면서 기능을 유지하지만, 그 기능이 상실된 경우에는 정상세포가 무분별한 세포의 분열 및 성장이 유도되어 암 세포로 전환되도록 하는 기능을 하는 유전자로서, 예를 들면, RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질, CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편은 암 세포의 표면 또는 세포질에 특이적으로 발현 수준이 높은 단백질인 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체로서, 예를 들면, 유방암 또는 위암 세포에 특이적으로 발현 수준이 높은 HER2 등에 특이적인 항체와 같은 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 항체는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이라면, 항체의 일부인 경우라도 포함될 수 있고, 모든 종류의 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 또한, 인간화 항체 등의 특수 항체가 포함될 수 있고, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2, Fv 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "항체"란, 본 발명의 상기 암 항원을 암호화하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 얻은 뒤에 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "혈관신생 억제제"란, 암 세포 주변에서 새로운 혈관이 생성되는 것을 억제하여 암 세포의 사멸을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 단백질 또는 화합물을 의미한다. 바람직하게 상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin), 및 단백 분해효소 억제 단백질 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "암 항원"이란, 암 세포에서는 발현되지만 정상세포에서는 거의 발현되지 않는 단백질을 항원으로 하여, 이를 통해 항 종양 면역반응을 유도함으로써 암 세포의 직접 또는 간접적 사멸을 유도할 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 상기 암 항원은 바람직하게는 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein; AFP), 혈관내피성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2; VEGFR2), 서비빈(Survivin), 레구메인(Legumain), 전립선 암 특이적 항원(Prostate cancer specific antigen; PCSA) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 용어 "독소 단백질"이란, 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 단백질로서, 예를 들면, 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-alpha(Tumour necrosis factor-alpha; TNF-alpha), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토라이신 A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 종양억제 단백질은 RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질 및 CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 종양억제 단백질에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 및 단백 분해효소 억제 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 혈관신생 억제제에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
서열번호 1: ClyA protein
10 20 30 40 50
MIMTGIFAEQ TVEVVKSAIE TADGALDLYN KYLDQVIPWK TFDETIKELS
60 70 80 90 100
RFKQEYSQEA SVLVGDIKVL LMDSQDKYFE ATQTVYEWCG VVTQLLSAYI
110 120 130 140 150
LLFDEYNEKK ASAQKDILIR ILDDGVKKLN EAQKSLLTSS QSFNNASGKL
160 170 180 190 200
LALDSQLTND FSEKSSYFQS QVDRIRKEAY AGAAAGIVAG PFGLIISYSI
210 220 230 240 250
AAGVIEGKLI PELNNRLKTV QNFFTSLSAT VKQANKDIDA AKLKLATEIA
260 270 280 290 300
AIGEIKTETE TTRFYVDYDD LMLSLLKGAA KKMINTCNEY QQRHGKKTLF
EVPDV
서열번호 2: -35 promoter
TTCGCG
서열번호 3: -10 promoter
ATGCATAAT
서열번호 4: OXB1 promoter
AAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGCTATCGAGTTGTGAACCGATCCATCTAGCAATTGGTCTCGATCTAGCGATAGGCTTCGATCTAGCTATGTAGAAACGCCGTGTGCTCGATCGCCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 암, 특히 내성 및 단일 항암요법으로 치료가 어려운 암종에 있어서, 박테리아와 면역관문억제제를 병용 투여하여, 종양의 크기를 현저히 억제함으로써, 생존률을 개선하는 예방 또는 치료제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 살모넬라균과 면역관문억제제를 병용요법을 위한 실험 스케줄을 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 살모넬라 및 면역관문억제제를 병용투여시 종양크기의 변화로 항암 효과를 나타내는 그래프결과이다.
도 1c는 본 발명의 일 실험예에 따른, 살모넬라 및 면역관문억제제를 병용투여시 생존율을 나타내는 결과이다.
도 1d는 본 발명의 일 실험예에 따른, 병용요법으로 제거된 마우스에 다시 종양을 심어 종양크기의 변화를 나타내는 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실험예에 따른, CT26 세포 종양 이식 후, 다시 종양을 심기 위한 실험 스케줄을 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 병용요법으로 제거된 마우스에 다시 종양을 심어 종양크기의 변화를 나타내는 그래프결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실험예에 따른, MC38 세포 종양 이식 후, IgG, Anti-PD-L1, CNC018+IgG 및 CNC018+anti-PD-L1을 각각 주입하고, 종양의 크기변화를 나타낸 그래프결과이다.
도 3b는 본 발명의 일 실험예에 따른, MC38 세포 종양 이식 후, IgG, Anti-PD-L1, CNC018+IgG 및 CNC018+anti-PD-L1을 각각 주입하고, 생존율을 나타낸 그래프결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실험예에 따른, MC38 세포 종양 이식 후, IgG, Anti-PD-L1, SL△ppGpp+IgG 및 SL△ppGpp +anti-PD-L1을 각각 주입하고, 종양의 크기변화를 나타낸 그래프결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실험예에 따른, MC38 세포 종양 이식 후, IgG, Anti-PD-L1, SL△ppGpp+IgG 및 SL△ppGpp +anti-PD-L1을 각각 주입하고, 생존율을 나타낸 그래프결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실험예에 따른, MC38 세포 종양 이식 후, 다시 종양을 심기 위한 실험 스케줄을 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 일 실험예에 따른, MC38 세포 종양 이식 후, CNC018 및 SL△ppGpp가 전 처리된 마우스에 다시 종양을 심어 종양크기의 변화를 나타내는 그래프결과이다.
도 6a는 본 발명의 일 실험예에 따른, 종양 이식 후, 병용요법을 하였을 때, 마우스 비장(spleen) 크기의 변화를 나타내는 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 종양 이식 후, 병용요법을 하였을 때, 마우스 비장(spleen) 무게 변화를 나타내는 결과이다.
도 7a는 본 발명의 일 실험예에 따른, 종양 이식 후, 병용요법에 의한 memory CD8+ T 세포의 활성화를 나타내는 결과이다.
도 7b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 종양 이식 후, 병용요법에 의한 memory CD4+ memory T 세포의 활성화를 나타내는 결과이다.
도 8a는 본 발명의 일 실험예에 따른, 병용요법에 의한 IFN-γ에 특이적인 CD4+ T 세포의 활성화를 나타내는 결과이다.
도 8b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 병용요법에 의한 IFN-γ에 특이적인 CD8+ T 세포의 활성화를 나타내는 결과이다.
도 9a는 본 발명의 일 실험예에 따른, 병용요법에 의한 폐에 암 전이 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 병용요법에 의한 폐에 암 전이 억제 효과를 확인한 그래프결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 본 발명의 일 실험예에 따른, 마우스에 병용요법에 의한 간에 암 전이 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10b는 본 발명의 일 실험예에 따른, 마우스에 병용요법에 의한 간에 암 전이 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] 암 세포주 및 배양 조건
CT26 결장암 세포주인 CRL-2638 및 HB-8064(ATCC, 미국)와 쥐의 대장 선암종 세포주인 MC38(Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 미국 및 전남대학교, 한국)을 실험에 사용하였다.
10% 우태아혈청(Fetal bovine serum;FBS) 및 1% 의 페니실린-스트렙토 마이신이 포함된 고 포도당 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium) 배지(카탈로그 번호: #LM 001-05, 웰진, 한국)을 사용하여, 5% CO2배양기에서 37℃ 의 조건으로 상기 세포들을 배양하였다.
[준비예 2] 플라스미드가 도입된 살모넬라 균주제작
살모넬라 균주는 ppGpp가 결핍되어 있는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium; S.typhimurium)인 SL△ppGpp(ΔrelA, ΔspoT)와 CNC018(ΔrelA, ΔspoT, ΔSPI1, ΔSPI2)을 사용하였다.
살모넬라 균주에 제작한 플라스미드를 전기청공법(Electroporation)을 이용하여 형질전환 한 뒤, 100㎍/ml의 엠피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지를 이용하여 상기 형질전환된 각각의 균주를 밤새 배양하였다. 그 뒤, 상기 배양액을 엠피실린이 포함된 새로운 LB 배지를 사용하여 1:100의 비율로 희석하고, 200rpm 및 37℃의 조건으로 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균주 펠렛을 수득하고 PBS 버퍼를 이용하여 세척한 후 실험에 사용하였다.
[준비예 3] 실험동물 모델준비
20 내지 30g 무게에 해당하는 5 ~ 6 주령의 C57BL/6 및 BALB/C 쥐(오리엔트컴퍼니, 한국)를 사용하였다. 상기 준비예 1의 MC38 또는 CT26을 상기 쥐의 옆구리에 피하 주사하여, 종양 동물 모델을 구축하였다.
상기 종양 동물 모델의 영상화 및 종양 크기의 평가를 위해, 마취를 위해서는 2% 이소플루란(Isoflurane)을 사용하였으며, 수술 시에는 200mg/kg의 케타민(Ketamine) 및 10mg/kg의 실라신(Xylasine)을 사용하였다.
상기 종양 크기(mm3)의 평가는 (길이 Х 높이 Х 너비)/2를 이용하여 계산될 수 있도록 하였으며, 동물 모델의 종양 크기가 1500mm3이상인 경우에는 동물 모델을 안락사 시켰다.
[실험예 1] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여 항암 효과 확인(1)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한 항암 효과를 확인하기 위하여, 도 1a와 같은 방법으로 in vivo 실험을 실시하였다. CT26 종양 마우스 모델에 각 약물들을 주입 후, 10일차에 균주를 정맥으로 주입하였다.
PBS, anti-PD-L1, CNC018-IgG, CNC018-anti-PD-L1-anti-CALR, 및 CNC018-anti-PD-L1 주입후, 종양의 크기 변화를 확인할 수 있었다(도 1b).
약독화된 살모넬라 균주 및 anti-PD-L1를 병용 투여했을 때, 종양크기가 대조군인 PBS 대비 현저하게 개선된 것을 나타내었으며, 마우스의 생존율 또한 매우 개선되었다(도 1c). 또한, 도 1d에는 병용요법으로 종양이 제거된 마우스에 91일차에 다시 종양을 심어 종양크기의 변화를 살펴본 결과, 대조군(naive 마우스) 대비 종양크기의 변화가 매우 미미함을 확인한 바, 종양의 재발에도 CNC018-anti-PD-L1가 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여 항암 효과 확인(2)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, 항암 효과를 확인하기 위하여, 특히, 병용 요법으로 종양이 제거된 마우스에 다시 종양을 심었을 때 암 재발 억제효과를 확인하기 위하여, 도 2a와 같은 실험방법으로 in vivo 실험을 실시하여 종양 내의 SL△ppGpp-anti-PD-L1 및 CNC018-anti-PD-L1의 CT26 세포주에 대한 성장 억제 효과를 확인하였다. CT26 마우스 모델에 약독화된 살모넬라 균주를 1x107 CFU로 정맥 투여하고, 대조군에는 투여하지 않은 실험을 실시하여, 종양의 크기를 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 나타난 것처럼, SL△ppGpp-anti-PD-L1 및 CNC018-anti-PD-L1를 전 처리 투여한 경우 대조군에 비하여 종양 억제 능력이 현저하게 상승한 것을 확인한 바, SL△ppGpp-anti-PD-L1 및 CNC018-anti-PD-L1의 항암 및 재발 억제 효과를 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여 항암 효과 확인(3)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, 항암 효과를 확인하기 위하여, in vivo 실험을 실시하여 MC38 종양 내의 IgG, anti-PD-L1, CNC018-IgG, 및 CNC018-anti-PD-L1를 주입 후 종양크기 및 마우스 생존율을 확인했다. 그 결과, CNC018-anti-PD-L1를 병용투여한 마우스에서 종양 억제 능력이 대조군인 IgG에 비하여 현저하게 높은 결과를 보였고, 이로써, 마우스 생존율 또한 매우 상승한 결과를 나타내었다(도 3a 및 3b).
도 3a는 그룹당 6마리를 실험에 이용했으며, Tukey의 다중 비교 검정(Tukey’s multiple comparisons test)을 사용한 이원분산 분석(two-way ANOVA)를 사용했다(****P<0.0001). 도 3b는 그룹당 6마리 마우스를 실험에 이용했으며, MC38-종양이 있는 생쥐에 대한 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curves)을 사용했다 **P=0.0016 (CNC018 + anti-PD-L1 vs IgG or CNC018 + IgG; **P=0.0033, CNC018 + anti-PD-L1 vs Anti-PD-L1)) log-rank (Mantel-Cox test))
[실험예 4] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여 항암 효과 확인(4)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, 항암 효과를 확인하기 위하여, in vivo 실험을 실시하여 MC38 종양 내의 IgG, anti-PD-L1, SL△ppGpp-IgG, 및 SL△ppGpp-anti-PD-L1를 주입 후 종양크기 및 마우스 생존율을 확인했다. 그 결과, SL△ppGpp-anti-PD-L1를 병용투여한 마우스에서 종양 억제 능력이 대조군인 IgG에 비하여 현저하게 높은 결과를 보였고, 이로써, 마우스 생존율 또한 매우 높은 결과를 나타내었다(도 4a 및 4b).
도 4a는 그룹당 6마리를 실험에 이용했으며, Tukey의 다중 비교 검정(Tukey’s multiple comparisons test)을 사용한 이원분산 분석(two-way ANOVA)를 사용했다(***P=0.0002, ****P<0.0001). 도 4b는 그룹당 6마리 마우스를 실험에 이용했으며, MC38-종양이 있는 생쥐에 대한 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curves)을 사용했다(**P=0.0016 (CNC018 + anti-PD-L1 vs IgG or CNC018 + IgG; **P=0.0084, CNC018 + anti-PD-L1 vs Anti-PD-L1), *P=0.0432 log-rank (Mantel-Cox test))
[실험예 5] 살모넬라 균주의 항암 효과 확인
살모넬라 균주의 항암 효과를 확인하기 위하여, 특히, 종양이 제거된 마우스에 다시 종양을 심었을 때 암 재발 억제효과를 확인하기 위하여, 도 5a 실험방법으로 in vivo 실험을 실시하여 종양 내의 SL△ppGpp-anti-PD-L1 및 CNC018-anti-PD-L1의 MC38 세포주에 대한 성장 억제 효과를 확인하였다. MC38 마우스 모델에 약독화된 살모넬라 균주를 1x107 CFU로 정맥 투여하고, 대조군에는 투여하지 않은 실험을 실시하여, 종양의 크기를 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 나타난 것처럼, SL△ppGpp 및 CNC018를 전 처리 투여한 경우 대조군인 native 마우스에 비하여 종양 억제 능력이 현저하게 상승한 것을 확인한 바, SL△ppGpp-anti-PD-L1 및 CNC018-anti-PD-L1의 항암 및 재발 억제 효과를 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여 후 비장(spleen) 변화 확인
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, 비장 변화를 확인하기 위하여, PBS, CNC018-IgG, 및 CNC018-anti-PD-L1를 주입 후 마우스의 비장크기 변화 및 비장무게를 확인했다(도 6). 음성 대조군으로 CNC018-anti-PD-L1-anti-CD4, CNC018-anti-PD-L1-anti-CD8, 및 CNC018-anti-PD-L1-anti-CD4-anti-CD8를 사용했다.
도 6에 나타난 것처럼, CNC018-anti-PD-L1 병용요법으로 사용했을 때, 비장 크기 및 무게가 가장 적은 변화를 확인함으로써, 생체 안정성이 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여에 의한 종양 특이적 기억 T 세포 활성화 확인(1)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, T 세포의 활성화를 확인하기 위하여, PBS, CNC018-IgG, 및 CNC018-anti-PD-L1를 주입 후 종양 특이적 기억 T 세포(tumor-specific memory T cell)의 활성화를 확인했다. 실험 결과, 대조군 PBS 대비 Effector memory CD4+ T 세포, 및 Effector memory CD8+ T 세포 모두 병용투여한 군에서 유의한 증가를 나타냈다(도 7a 및 7b).
[실험예 8] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여에 의한 종양 특이적 기억 T 세포 활성화 확인(2)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, T 세포의 활성화를 확인하기 위하여, PBS, CNC018-IgG, 및 CNC018-anti-PD-L1를 주입 후 종양 특이적 기억 T 세포(tumor-specific memory T cell)의 활성화를 확인했다. 5x105 비장세포와 2.5x105 조사된(irradiated) CT26 암세포와 12시간 동안 공동 배양했다. 자극 후, 5시간 동안 세포내 단백질 수송 과정을 차단하기 위해 브레펠딘 A(brefeldin A)를 함유하는 골지플러그(Golgiplug)(1μl/ml)를 첨가하였다. 인터페론-감마(IFNγ)의 세포내 염색은 FAC 분석에 의해 수행되었다.
도 8a 및 도 8b에 나타난 것처럼, 대조군 PBS 대비 IFNγ+CD4+ T 세포, 및 IFNγ+CD8+ T 세포 모두 병용투여한 군에서 유의한 증가를 나타냈다.
[실험예 9] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여에 의한 암 전이 억제 효과 확인(1)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, 암 전이 억제 효과를 확인하기 위하여, IgG, anti-PD-L1, CNC018-anti-PD-L1 isotype, CNC018-anti-PD-L1, 및 CNC018-anti-PD-L1 isotype-anti-CSF1R을 주입하고, 폐에서 전이결절을 확인하였다(도 9).
도 9b에 나타난 것처럼, CNC018-anti-PD-L1로 병용투여한 군에서 대조군 IgG 대비 종양이 폐로 전이되지 않음을 확인할 수 있어서, 병용투여의 종양 전이 억제효과가 현저히 유의한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 10] 살모넬라 균주와 면역관문억제제 병용투여에 의한 암 전이 억제 효과 확인(2)
살모넬라 균주와 면역관문억제제인 anti-PD-L1의 병용투여로 인한, 암 전이 억제 효과를 확인하기 위하여, in vivo 실험을 실시하여 종양 내의 병용투여로 인한 HepG2-Luc 세포주에 대한 성장 억제 효과를 확인하였다.
Luciferase를 발현하는 HepG2-Luc 세포주를 준비하여, 상기 HepG2-Luc 세포주를 주입한 마우스 모델을 준비하였다. 이후 IgG, CNC018-IgG, CNC018-anti-PD-L1, CNC018-anti-Asialo, 및 CNC018를 투여하고, 상기 종양의 위치를 촬영하여 도 10a에 나타내었고, 간으로 전이가 된 Total Flux양을 확인한 결과, CNC018-anti-PD-L1 병용투여한 군에서 대조군 IgG 대비 현저하게 억제효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 10b).
도 10에 나타난 것처럼, CNC018-anti-PD-L1 병용투여한 경우 대조군에 비하여 종양이 간으로 전이되지 않음을 확인할 수 있어, CNC018-anti-PD-L1 병용투여의 종양 전이 억제효과가 현저한 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예 일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry Foundation of Channam National University CNCURE <120> A Pharmaceutical composition for preventing or treating of cancer comprising Salmonella strain and immune check point inhibitor as an active ingredient <130> PDPB214542k01 <150> KR 10-2021-0151691 <151> 2021-11-05 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClyA protein <400> 1 Met Ile Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Ser Ala Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asp Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val 50 55 60 Gly Asp Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu 65 70 75 80 Ala Thr Gln Thr Val Tyr Glu Trp Cys Gly Val Val Thr Gln Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Ile Leu Leu Phe Asp Glu Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser 100 105 110 Ala Gln Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys 115 120 125 Leu Asn Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn 130 135 140 Asn Ala Ser Gly Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ser Gln Leu Thr Asn Asp 145 150 155 160 Phe Ser Glu Lys Ser Ser Tyr Phe Gln Ser Gln Val Asp Arg Ile Arg 165 170 175 Lys Glu Ala Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Val Ala Gly Pro Phe 180 185 190 Gly Leu Ile Ile Ser Tyr Ser Ile Ala Ala Gly Val Ile Glu Gly Lys 195 200 205 Leu Ile Pro Glu Leu Asn Asn Arg Leu Lys Thr Val Gln Asn Phe Phe 210 215 220 Thr Ser Leu Ser Ala Thr Val Lys Gln Ala Asn Lys Asp Ile Asp Ala 225 230 235 240 Ala Lys Leu Lys Leu Ala Thr Glu Ile Ala Ala Ile Gly Glu Ile Lys 245 250 255 Thr Glu Thr Glu Thr Thr Arg Phe Tyr Val Asp Tyr Asp Asp Leu Met 260 265 270 Leu Ser Leu Leu Lys Gly Ala Ala Lys Lys Met Ile Asn Thr Cys Asn 275 280 285 Glu Tyr Gln Gln Arg His Gly Lys Lys Thr Leu Phe Glu Val Pro Asp 290 295 300 Val 305 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -35 promoter <400> 2 ttcgcg 6 <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -10 promoter <400> 3 atgcataat 9 <210> 4 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXB1 promoter <400> 4 aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa 60 ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta gaaacgccgt gtgctcgatc 120 gcctgacgct ttttatcgca actctctact gttgcttcaa cagaacatat tgactatccg 180 gtattacccg gc 192

Claims (20)

  1. 살모넬라 균주 및 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitors)를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 병용투여 되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 듀브린(Salmonella. dublin), 살모넬라 타이피수이스(Salmonella. typhisuis), 살모넬라 더비 (Salmonella. derby), 및 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 약학조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역관문억제제는 Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4(CTLA-4), Programed cell death protein 1(PD-1), Programmed death-ligand 1(PD-L1), KIR, LAG3, CD137, OX40, CD47, CD276, CD27, 및 GITR로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상을 포함하는 것인, 약학조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 면역관문억제제는 Programmed death-ligand 1(PD-L1)인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 암의 성장 억제 또는 암 전이를 억제하는 것인 약학조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 살모넬라는,
    조절 단백질을 암호화하는 유전자;
    상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터;
    상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제1 프로모터 및 제2 프로모터; 및
    상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터의 하류에 항암 단백질을 암호화하는 유전자; 사이토카인을 암호화하는 유전자; 케모카인을 암호화하는 유전자; 면역 조절자(Immune modulator)를 암호화하는 유전자; 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드; 및 리포터 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 벡터로 형질전환된 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 조절 단백질은 TetR 단백질이고,
    상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 OXB1 프로모터이며,
    상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제1 프로모터는 tetA 프로모터이며,
    상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제2 프로모터는 tetR 프로모터인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    시스-작용 인자(cis-acting element) 또는 트랜스-작용 인자(trans-acting element)에 의해 상기 조절 단백질의 발현이 조절되는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 시스-작용 인자는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site; RBS), 5'-비 번역 영역(5'-Untransrated Region; 5'-UTR), 전사 인자 결합 부위(transcription factor binding site) 및 종결자(terminators)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 전사 인자 결합 부위는, 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터; 인핸서(enhancer); 및 사일렌서(silencer);로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 약한 프로모터(weak promoter)인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 약한 프로모터는 상기 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 전사된 전사체(Transcript)의 발현 수준이 1 Х10-2 이하인 것인, DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  16. 제 11 항에 있어서,
    상기 트랜스-작용 인자는 전사 인자, 앱타머(aptamer), sRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA; asRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  17. 제 9 항에 있어서,
    상기 항암 단백질은 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes), 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 종양억제 단백질은 RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질 및 CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 및 단백 분해효소 억제 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 살모넬라인 것인, 약학조성물.
KR1020220048063A 2021-11-05 2022-04-19 살모넬라 균주 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물 KR20230066249A (ko)

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