CN117729929A - 使用减毒活菌的癌症治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及一种包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、预防、减少、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同；及其方法。

Description

使用减毒活菌的癌症治疗
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及一种在受试者中预防、治疗或抑制肿瘤疾病发展的方法。
背景技术
随着我们对与癌症形成和进展相关的潜在机制的理解不断提高，癌症治疗领域不断发展出新疗法。目前，经诊断患有癌症的患者有多种治疗选择，包括手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法。然而，尽管癌症患者有多种治疗方案可选择，但很大一部分患者会复发、仍然难以治疗或出现导致治疗中断的毒副作用。因此，仍然需要新型、有效和安全的癌症治疗策略。
在肿瘤学领域已经采用的一种治疗方法是使用包含减毒活菌的组合物。例如，在膀胱癌领域已至少部分成功的一种治疗策略是使用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)进行膀胱内免疫疗法。然而，虽然BCG治疗取得了一些临床成功，但据估计，接近90％的患者会出现某种不良副作用，从膀胱炎到败血症和死亡，并且由于给药方案要求高(每周连续6次膀胱内灌注)，在某些情况下患者的依从性较低。此外，尽管BCG被用于与其他疗法联合使用以努力提高疗效，但这些联合疗法未能改善上述副作用。
已经尝试分别开发包含减毒重组细菌和/或减毒肿瘤靶向细菌(包括减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium))的组合物，以抑制实体瘤癌症的生长或减少其体积，例如WO03/063593(Vion Pharmaceuticals)；US2007/0298012(I.King和L.M.Zheng)；WO2009/098246(Aeterna Zentaris GmbH)；WO2006/076678(Univ.John Hopkins)。伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)菌株也被提议用于肿瘤学领域，例如用于治疗膀胱癌(见WO2014/180929)。Zhou等人(Nature Reviews Cancer,18:12:727-743,2018)公开了用于抗癌的工程化肿瘤靶向细菌，并且Chorobik等人(Acta Biochimica Polonica,60:3:285-297,2013)公开了沙门氏菌(Salmonella)是癌症的一种可能的治疗方法。然而，这种方法仍然存在许多挑战，包括次优水平的抗癌活性。
因此，在癌症领域仍然非常需要新的治疗策略。具体来说，仍然需要在那些反应积极的个体中提高所述治疗效果的方法。与此同时，对于那些对所述治疗产生耐药性的个体来说，非常需要能够显示出持续疗效的方法。最后，还需要一种能提高患者依从性的治疗策略。
发明内容
本发明提供了一种通过给药均包含减毒活菌的第一和第二组合物来治疗、预防和/或预防受试者中肿瘤疾病复发的有效方法。发明人出人意料地发现，与使用包含减毒活菌的单一组合物治疗受试者相比，这种组合得到更有效的疗法，即实现了协同或加性效应。据信，当将第二组合物局部给药于肿瘤疾病部位时，通过给予第一组合物的减毒活菌观察到的全身性修饰，与针对所述减毒活菌产生的全身免疫记忆相结合，可以通过增强先天免疫应答和效应记忆细胞募集的旁观者效应(bystander effect)来增强第二组合物的减毒活菌的抗肿瘤活性。
因此，在第一方面，本发明提供了一种包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、预防、减少、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同，其中第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内、皮内或皮下递送，以刺激该受试者的全身免疫应答，并与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病的部位。
在第二方面，本发明提供了一种治疗、预防、减少、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病的方法，其中该方法包括同时、单独或依次给药于受试者，(i)包含减毒活菌的第一组合物和(ii)包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同；其中，第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内、皮内或皮下递送，以刺激受试者的全身免疫应答，并与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病的部位。
附图说明
图1A显示了原位小鼠MB49膀胱癌症模型中皮下全身和局部给药伤寒沙门氏菌的时间表的示意图。S.c,皮下。IVES，膀胱内。
图1B显示了通过皮下全身和局部给药伤寒沙门氏菌治疗的小鼠的生存率。C57BL/6小鼠皮下注射ZH9进行治疗，或不进行治疗，将MB49肿瘤细胞接种至膀胱，并用ZH9或PBS对照进行膀胱内(ives)治疗。在100天内监测生存情况。该图综合了5项独立研究的结果。统计数据采用对数秩(log-rank)(Mantel-Cox)检验。**p<0.01。****p<0.0001。
图2显示了健康小鼠皮下全身和局部给药伤寒沙门氏菌后流式细胞术分析的时间表。S.c,皮下。IVES，膀胱内。
图3A-3C显示了健康小鼠皮下全身和局部给药(ives)伤寒沙门氏菌后24小时和7天中性粒细胞(图3A)、CD4+T细胞(图3A)、单核细胞(图3B)、CD8+T细胞(图3B)、交叉呈递树突状细胞(图3C)和天然杀伤细胞(图3C)数量的变化。单个数据点代表n＝2(膀胱内ZH9治疗)或n＝3(膀胱内PBS治疗)小鼠的细胞池，并且2个独立实验，每个实验n＝4个池，合并。线条表示组平均值。示出的树突状细胞群定义为CD11b+Ly6G-CD11c+Ly6C+CD103+。所示统计数据为Sidak后验单因素方差分析(one-way ANOVA)。
图4显示了在同系皮下MC38小鼠结肠癌模型中，口服全身给药鼠伤寒沙门氏菌，然后局部(肿瘤内(intra-tumoural))给药伤寒沙门氏菌的时间表示意图。IT，肿瘤内。
图5A和5B显示了与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发(systemic priming)并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗后1天(图5A)和7天(图5B)肿瘤浸润CD8 T细胞、CD4 T细胞和调节性T细胞(Treg)的数量。N＝3或4只小鼠/组/时间点。条形图为平均值±S.E.M。
图6显示了与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗后1天和7天肿瘤内和外周CD8 T细胞增殖情况。N＝4只小鼠/组/时间点。条形图为平均值±S.E.M。
图7显示了与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗后1天和7天肿瘤内和外周CD4 T细胞增殖情况。N＝4只小鼠/组/时间点。条形图为平均值±S.E.M。
图8显示了与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗的小鼠CD8 T细胞的功能潜力。N＝4只小鼠/组/时间点。条形图为平均值±S.E.M。
图9显示了与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗的小鼠CD4 T细胞的功能潜力。N＝4只小鼠/组/时间点。条形图为平均值±S.E.M。
具体实施方式
为了更容易地理解本发明，首先定义某些术语。在整个具体实施方式中列出了附加的定义。
如本文所用，术语“减毒”在本发明的上下文中，是指改变微生物以降低其致病性，使其对宿主无害，同时保持其活力。该方法通常用于疫苗的开发，因为其能够在保持可接受的安全性特征的同时激发高度特异性免疫应答。这类疫苗的开发可能涉及多种方法，实例包括但不限于：在体外条件下使病原体传代直至丧失毒力，化学诱变和基因工程技术。这样的减毒微生物优选是活的减毒微生物，尽管也公开了非活的减毒微生物。
如本文所用，术语“失活突变”是指对特定基因或与该基因相关的基因启动子的天然遗传密码子的修饰，例如通过改变核苷酸密码子或删除核苷酸的部分或添加非编码核苷酸或非天然核苷酸，使得特定基因适当地不被转录或翻译，或者被表达成非活性蛋白质，使该基因的天然功能丧失或降低到无法测量的程度。因此，基因的突变使该基因的功能或该基因编码的蛋白质的功能失活。
如本文所用，术语“免疫疗法”是指旨在调节免疫系统应答的任何疗法，例如通过抗体或免疫细胞，或通过刺激、抑制或以其他方式调节免疫系统的药物或其他试剂。这些包括免疫调节剂、影响免疫系统的药物或物质；包括但不限于抗体(例如，抗肿瘤抗原抗体)、抗体的表位结合部分、抗体-药物偶联物(包括细胞毒性偶联物)、放射剂、其他肿瘤靶向试剂、溶瘤病毒、细胞因子、趋化因子、干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、调节免疫应答的药物或其他试剂，以及与靶细胞相互作用、识别或结合的免疫细胞或工程细胞。
如本文所用，术语“免疫系统的细胞组分”是指免疫细胞，如淋巴细胞，如T淋巴细胞和B淋巴细胞、γ-δT细胞和NK细胞，其可以识别特异性抗原，如朊病毒、病毒、细菌、酵母、真菌、寄生虫、肿瘤相关或肿瘤特异性抗原，或与特定疾病、病症或病况相关的其他抗原。我们所指的其他免疫细胞包括白细胞，其可以是粒细胞或无粒细胞。免疫细胞的实例包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。该定义也包括树突状细胞、小胶质细胞和其他抗原呈递细胞。
如本文所用，术语“非天然细菌(bacterium)或细菌(bacteria)”是指经过基因修饰或“工程化”，使其相对于天然存在的细胞发生改变的细菌(原核)细胞。例如，这种遗传修饰可以是将额外的遗传信息并入细胞中，修饰现有遗传信息或实际上删除现有遗传信息。这可以通过例如将重组质粒转染到细胞中或直接对细菌基因组进行修饰的方式来实现。另外，可以通过化学诱变的方式对细菌细胞进行基因修饰，例如，以实现减毒，其方法将是本领域技术人员所熟知的。因此，术语“非天然细菌(bacterium)或细菌(bacteria)”可指重组修饰和非重组修饰的细菌菌株。
如本文所用，术语“重组”、“重组菌株”或“重组细菌”可互换使用，并且在本发明的上下文中，是指经过基因工程使得细菌DNA通过引入新的DNA而改变的细菌菌株。重组DNA方法通常涉及通过载体(例如质粒)引入新的DNA。这些方法是本领域技术人员所熟知的。使用重组细菌菌株可以赋予细菌菌株有利的特性，例如延长活性，在受试者中引起更强的免疫应答，或引入所需分子。
如本文所用，术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原提呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致癌细胞的选择性损伤、破坏或从人体中消除。
如本文所用，术语“全身免疫应答”和“全身免疫”可互换使用，是指遍布受试者全身的针对诱导剂的广泛免疫应答，以及广泛的非特异性免疫激活，而不是局部的、空间受限的应答。这种应答涉及免疫应答的不同细胞之间的复杂相互作用，例如，淋巴细胞、抗原提呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子，并且在本发明的上下文中被认为是激发受试者的免疫系统，使得当将第二组合物局部给药于肿瘤疾病的部位时，受试者对包含减毒活菌的第二组合物应答性更强。因此，可以通过分析各种不同的免疫细胞类型来测量和量化“全身免疫应答”，包括但不限于中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)和天然杀伤细胞。测量这些效应的方法是本领域技术人员所熟知的，例如流式细胞术。“全身免疫应答”也可以通过抗体的存在来测量和量化，包括但不限于IgG和IgA同型抗体。测量这些抗体的方法是本领域技术人员所熟知的，例如ELISA。因此，第一组合物可作用为激发(与“调节(condition)”、“提高”、“放大”、“增强”、“改善”、“增进”或“促进”交替使用)受试者的免疫应答，随后给药该受试者第二组合物。
如本文所用，术语“局部”和“局部给药”可互换使用，并且在本发明的上下文中是指将第二组合物给药于受试者的方式。相应地，包含减毒活菌的第二组合物可给药于肿瘤疾病内/上/周围。例如，第二组合物可直接给药于肿瘤疾病，例如通过肿瘤内注射，或给药时使第二组合物与肿瘤的组织/表面接触，例如通过腹膜内、胸膜内、膀胱内、瘤周给药。因此，术语“局部”可指与所述肿瘤疾病的直接和间接接触，例如，局部灌注、肿瘤内注射、瘤周注射、胸膜内、膀胱内和/或腹膜内注射。因此，在受试者中由此产生的免疫应答也被认为是肿瘤疾病部位的局部免疫应答，也就是说，它不是用本发明的第一组合物所产生的广泛的全身免疫应答。
术语“肿瘤”、“癌症”、“恶性肿瘤”和“瘤形成”可互换使用，并且是指其生长、增殖或生存大于正常对应细胞的生长、增殖或生存的细胞或细胞群，例如细胞增殖性或分化性疾病。通常，其生长不受控制。术语“恶性肿瘤”是指对附近组织的侵袭。术语“转移”是指肿瘤、癌症或瘤形成扩散或散播到受试者体内的其他部位、位置或区域，其中这些部位、位置或区域与原发肿瘤或癌症不同。
术语“有效量”或“药学有效量”是指提供所需生物学或治疗结果的药剂的足够量。该结果可以是疾病的一种或多种体征、症状或病因的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或生物系统的任何其他所需改变。就癌症而言，有效量可以包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速度(例如抑制肿瘤生长)或防止或延迟其他不需要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟癌症或肿瘤的发育、或延长其生存或诱导其稳定的量。
在一些实施方案中，治疗有效量是足以预防复发或延迟复发的量。治疗有效量可以在一次或多次给药中给予。药物或组合物的治疗有效量可导致以下一种或多种结果：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓并优选地阻止癌细胞向外周器官的浸润；(iv)抑制(即在一定程度上减缓，优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
例如，对于肿瘤的治疗，“治疗有效量”可诱导肿瘤相对于基线测量缩小至少约5％，例如至少约10％，或约20％，或约60％或更多。该基线测量可以来自未经治疗的受试者。
治疗性化合物的治疗有效量可减小肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够根据诸如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定该量。
术语“治疗”或“疗法”是指给予活性药物的目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响病症(例如疾病)、病症的症状，或预防或延迟疾病的症状、并发症、生化指标的发作，或以统计学显著的方式阻止或抑制疾病、病症或病况的进一步发展。
如本文所用，术语“受试者”旨在包括人和非人动物。优选受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法特别适用于治疗患有可以通过增强免疫应答来治疗的病症的人类患者。在一个具体实施方案中，所述方法特别适用于体内癌症的治疗。
如本文所用，术语“并行给药”或“并行”或“同时”是指在同一天给药。术语“依次给药”或“依次”或“单独”是指在不同的日期给药。
如本文所定义，“同时”给药，包括第一组合物和第二组合物彼此在约2小时或约1小时或更短的时间内，甚至更优选地同时的给药。
如本文所定义，“单独”给药，包括第一组合物与第二组合物相隔约12小时以上、或约8小时、或约6小时或约4小时或约2小时的给药。
如本文所定义，“依次”给药，包括第一组合物和第二组合物分别以多个等分试样和/或剂量和/或在不同场合的给药。第一组合物可以在第二组合物的给药之前和/或之后给药于患者。
可选项(例如“或”)的使用应理解为可选项的一个、两个或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”应理解为指任何列举或列举组分中的“一个或多个”。
如本文所用，“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，“约”可表示根据本领域实践，在1或大于1的标准偏差内。或者，“约”可表示至多20％的范围。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另有说明，否则“约”的含义应假定在该特定值的可接受误差范围内。
本发明提供了一种通过使用多剂量(即至少两剂量)减毒活菌来预防和/或治疗受试者体内肿瘤疾病的有效方法，其中所述剂量通过不同的给药途径给药，以有效激活受试者的免疫系统以对抗肿瘤疾病。
因此，在第一方面，本发明提供了一种包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、预防、减少、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同，其中第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内或皮下递送，以刺激该受试者的全身免疫应答，并与该第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病的部位。
因此，设想第一组合物的减毒活菌作为受试者免疫系统的“激发”剂，引起全身免疫应答，以及当进一步局部给予第二组合物的减毒活菌时，受试者免疫系统随后能够产生更有效的先天免疫应答以及对肿瘤疾病的有效适应性应答的能力。
包含减毒活菌的第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内、皮内或皮下递送。适用于这些递送途径的制剂对本领域技术人员来说是显而易见的。第一组合物可以优选地是液体冷冻制剂，或通过诸如冷冻干燥的方法进行冻干，并适当地储存在例如小袋中，以便随后再水化和给药。或者，第一组合物可以被分配到肠溶包衣胶囊中。对于包封制剂，优选地将冻干的第一组合物与胆汁吸附树脂(如消胆胺)混合，以提高从胶囊释放到小肠时的生存率(进一步详细信息，见WO 2010/079343)。第一组合物的特定配方可根据多种因素而变化，例如，给药途径或目标患者人群(即幼儿、青少年或成人)。第一组合物也可以配制成包含任何其他合适的佐剂、稀释剂或赋形剂。合适的佐剂、稀释剂或赋形剂包括但不限于：磷酸氢二钠、大豆蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化铵、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、蔗糖、无菌盐水和无菌水。
设想在本发明中可以使用任何能够在受试者中产生所需免疫应答的减毒活菌，或减毒活菌的组合。在一个优选实施方案中，第一和/或第二组合物的减毒活菌可以是革兰氏阴性菌。用于本发明的革兰氏阴性菌的实例包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)、莫拉菌(Moraxella)、幽门螺杆菌(Helicobacter)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、蛭弧菌(Bdellovibrio)、军团菌(Legionella)、衣原体(Chlamydia)和耶尔森氏菌(Yersinia)。通过革兰氏鉴别染色技术，可以很容易地识别和区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中革兰氏阴性菌不保留结晶紫染色。
优选地，第一和/或第二组合物的减毒活菌可以是沙门氏菌属。本发明中使用的沙门氏菌种的实例是肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)和邦戈尔沙门氏菌(Salmonellabongori)。肠炎沙门氏菌可进一步细分为不同的血清型(serotype)或血清变型(serovar)。用于本发明的所述血清型或血清变型的实例是肠炎伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaTyphi)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica Paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica Paratyphi B)、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaParatyphi C)、肠炎鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica Typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica Enteritidis)。在一个优选实施方案中，减毒活菌可以是肠炎伤寒沙门氏菌血清变型(Salmonella enterica serovar Typhi)和/或肠炎鼠伤寒沙门氏菌。
第一和第二组合物的减毒活菌可以是相同的减毒活菌或不同的减毒活菌。因此，本文公开了根据本发明的减毒活菌的各种不同的组合。在一个优选实施方案中，第一和第二组合物的减毒活菌是相同种类的。在最优选实施方案中，第一和第二组合物的减毒活菌均为肠炎沙门氏菌种。
第一组合物的减毒活菌和第二组合物的减毒活菌可以包含基因修饰的非天然细菌。如本领域技术人员所理解的，基因可以通过本领域许多众所周知的方法发生突变，例如与靶向目标基因的重组质粒进行同源重组，在这种情况下，将与靶基因同源的工程基因掺入适当的核酸载体(例如质粒或噬菌体)中，将其转染到目标细胞中。然后将同源工程基因与天然基因重组，以取代它或使它突变，从而实现所需的失活突变。这种修饰可能在基因的编码部分或任何调控部分，如启动子区域。如本领域技术人员所理解的，任何适当的基因修饰技术可用于使目标基因突变，例如CRISPR/Cas系统，例如CRISPR/Cas 9。
因此，本领域技术人员将熟知用于基因工程细菌菌株的许多方法和技术。这些技术包括通过染色体整合或通过引入稳定的常染色体自复制遗传元件将异源基因引入细菌所需的技术。用于基因修饰(也称为“转化”或“工程化”)细菌细胞的实例性方法包括噬菌体感染、转导、偶联、脂质体转染或电穿孔。关于分子和细胞生物化学中这些方法和其他方法的一般性讨论可以在标准教科书中找到，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版(Sambrook et al.,HaRBor Laboratory Press 2001)；Short Protocols inMolecular Biology，第4版(Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons 1999)；ProteinMethods(Bollag et al.,John Wiley&Sons 1996)；在此通过引用的方式纳入本说明书。
因此，第一组合物和第二组合物都可以包含其基因构成以某种形式改变的细菌，例如，通过基因工程或通过化学诱变，以诱导改变，例如突变、添加或删除。第一组合物和/或第二组合物可以进行基因修饰，使得第一组合物和第二组合物包含细菌的重组菌株。或者，第一组合物和/或第二组合物可以包含非重组细菌菌株。第一组合物和第二组合物可以包含如上所述经基因修饰的相同减毒活菌，或者第一组合物和第二组合物可以包含经基因修饰的两种不同的细菌菌株(可以在同一属内，也可以不在同一属内)。或者，第一组合物可以包含重组细菌菌株，第二组合物可以包含非重组细菌菌株，反之亦然。
设想可以使用能够根据本发明诱导受试者的全身免疫应答的任何细菌。因此，本文公开了作为第一组合物的一部分能够诱导全身免疫应答的任何减毒活菌，并且本文公开了作为第二组合物的一部分诱导局部免疫应答的任何减毒活菌。在一个优选实施方案中，可以使用任何减毒的、非致病性的肠炎伤寒沙门氏菌血清变型或肠炎鼠伤寒沙门氏菌血清变型(Salmonella enterica serovar Typhimurium)菌株。在另一个优选实施方案中，第一或第二组合物的减毒活菌可以选自Ty21a、CVD 908-htrA、CVD 909、Ty800、ZH9(也称为“M01ZH09”)、ZH9PA、x9633、x639、x9640、x8444、DTY88、MD58、WT05、ZH26、SL7838、SL7207、VNP20009、A1-R或其任何组合。第一组合物和第二组合物的减毒活菌可以是相同的，例如第一和第二组合物可以包含Ty21a、CVD 908-htrA、CVD 909、Ty800、ZH9、ZH9PA、x9633、x639、x9640、x8444、DTY88、MD58、WT05、ZH26、SL7838、SL7207、VNP20009或A1-R。或者，第一和第二组合物的减毒活菌可以是不同的，例如，第一组合物可以是Ty21a，第二组合物可以是CVD908-htrA、CVD 909、Ty800、ZH9、ZH9PA、x9633、x639、x9640、x8444、DTY88、MD58、WT05、ZH26、SL7838、SL7207、VNP20009或A1-R等。在一个优选实施方案中，第一或第二组合物中的至少一种减毒活菌是伤寒沙门氏菌ZH9。例如，第一组合物的减毒活菌可以是鼠伤寒沙门氏菌MD58，第二组合物的减毒活菌可以是伤寒沙门氏菌ZH9。在进一步优选实施方案中，第一和第二组合物的减毒活菌相同。在一个最优选实施方案中，第一和第二组合物的减毒活菌均为伤寒沙门氏菌ZH9。
因此，其中第一和/或第二组合物包含基因修饰的非天然细菌，优选地所述基因修饰的非天然细菌来源于沙门氏菌属，进一步优选地所述沙门氏菌属可以包含沙门氏菌毒力岛-2(Salmonella Pathogenicity Island 2，SPI-2)基因中的减毒突变和/或第二基因中的减毒突变。优选地，基因修饰的非天然细菌来源于沙门氏菌属，并且包括SPI-2基因中的减毒突变和第二基因中的减毒突变。这种减毒活沙门氏菌微生物的合适基因和细节如WO2000/68261所述，该申请的全文在此通过引用的方式纳入本说明书。
SPI-2基因可以是ssa基因。例如，本发明包括ssaV、ssaJ、ssaU、ssaK、ssaL、ssaM、ssaO、ssaP、ssaQ、ssaR、ssaS、ssaT、ssaD、ssaE、ssaG、ssaI、ssaC和sah中的一种或多种中的减毒突变。优选地，减毒突变在ssaV或ssaJ基因中。更优选地，减毒突变在ssaV基因中。
该基因工程沙门氏菌微生物还可以在第二基因中包含减毒突变，其可以位于或不位于SPI-2区域。该突变可能位于SPI-2区域之外，并且与芳香族化合物的生物合成有关。例如，本发明可以包括aro基因中的减毒突变。在一个优选实施方案中，aro基因为aroA或aroC。更优选地，aro基因是aroC。
当基因工程沙门氏菌微生物包含双减毒突变时，两个突变都可以在SPI-2基因中，或者两个突变都可以在第二基因中，该基因可能位于或不位于SPI-2区域。优选地，基因工程沙门氏菌微生物包括ssaV基因和aro基因的减毒突变，更优选地，其中aro基因为aroC。
该基因工程微生物可以进一步包括一个或多个基因盒。这些基因盒可用于递送另外的分子，以支持基因修饰的非天然细菌作为免疫系统激发剂(primer)和/或刺激剂的功能。
在另一个实施方案中，该基因工程微生物可以衍生自沙门氏菌微生物，并且可以包括选自pltA、pltB、cdtB和ttsA中一个或多个基因中的失活突变，并且进一步包括选自aroA和/或aroC和/或ssaV中的一个或多个基因中的减毒突变。优选地，减毒突变在aroC和ssaV中。所述基因和突变的细节如WO 2019/110819所述，该申请的全文在此通过引用的方式纳入本说明书。
本发明提供了包含本文公开的减毒活菌的第一和第二组合物，其可用于预防和/或治疗肿瘤疾病和/或与肿瘤疾病相关的继发性疾病。在一个实施方案中，肿瘤疾病可以是实体癌和/或血液学恶性肿瘤。瘤形成、肿瘤和癌症包括良性、恶性、转移性和非转移性类型，并包括瘤形成、肿瘤或癌症的任何阶段(I、II、III、IV或V)或级别(G1、G2、G3等)，正在进展、恶化、稳定或缓解的瘤形成、肿瘤、癌症或转移。
根据本发明可以治疗的癌症包括但不限于膀胱、血液、骨骼、骨髓、大脑、乳房、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的细胞或肿瘤。此外，癌症具体可为以下组织学类型，但不限于以下类型：恶性肿瘤；癌；未分化的癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性大肠息肉病；固体癌；恶性类癌瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化型癌(nonencapsulating sclerosingcarcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌(apocrineadenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌(ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；塞尔托利氏细胞癌(Sertoli cell carcinoma)；恶性间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合肿瘤；苗勒混合肿瘤(Mullerianmixed tumour)；肾母细胞瘤；肝母细胞癌；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性勃勒纳瘤(Brennertumour,malignant)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性甲状腺肿样卵巢瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮细胞瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质型软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤(fibrillary astrocytoma)；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(Hodgkin'sdisease)；霍奇金病(Hodgkin's)；副肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥散性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他特定非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；血浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；以及毛细胞白血病。
优选地，实体癌和/或血液学恶性肿瘤可以是选自以下的癌症：前列腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、间皮瘤、甲状腺癌、黑色素瘤、癌、头颈癌、皮肤癌或肉瘤。更优选地，该肿瘤疾病可能与选自膀胱癌、肺癌、间皮瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、头颈癌或乳腺癌的癌症相关。在一个优选实施方案中，所述肿瘤疾病是结直肠癌或膀胱癌。在一个最优选实施方案中，所述肿瘤疾病是膀胱癌。
若所要预防和/或治疗的肿瘤疾病是膀胱癌时，该膀胱癌可以是非肌层浸润性膀胱癌或肌层浸润性膀胱癌。非肌层浸润性膀胱癌的定义是由包含在膀胱内膜内的癌细胞组成的任何膀胱癌，是最常见的类型。肌层浸润性膀胱癌的定义是癌细胞已经扩散到膀胱内膜之外并因此浸润到周围膀胱肌肉的任何膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌不太常见，但扩散到身体其他部位的几率更高。
当膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌时，所述膀胱癌可称为移行细胞(尿路上皮)癌(transitional cell(urothelial)carcinoma，TCC)。TCC约占膀胱癌的95％，因此，本发明的第一和第二组合物的减毒活菌可优选地用于预防和/或治疗TCC。TCC可进一步分为两种亚型：乳头状癌和扁平状癌。因此，在另一个实施方案中，本发明的第一和第二组合物的减毒活菌可优选地用于预防和/或治疗乳头状癌和/或扁平状癌。本发明还可能适合的替代膀胱癌包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌和/或肉瘤。
在一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者中的肿瘤疾病，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中，第一组合物被配制用于口服递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病部位，其中第一和第二组合物的减毒活菌是伤寒沙门氏菌血清变型(Salmonella serovarTyphi)ZH9菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者的膀胱癌，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于口服递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于局部给药于膀胱，其中第一和第二组合物的减毒活菌为伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者中的TCC，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于口服递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于局部给药于膀胱，其中第一和第二组合物的减毒活菌为伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者中的肿瘤疾病，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于皮下递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于膀胱内给药于肿瘤疾病部位，并且其中第一和第二组合物的减毒活菌是伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者的膀胱癌，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于皮下递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于膀胱内给药于膀胱，其中第一和第二组合物的减毒活菌为伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者中的肿瘤疾病，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于口服递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第一组合物的减毒活菌为鼠伤寒沙门氏菌血清变型(Salmonella serovar Typhimurium)MD58菌株，第二组合物的减毒活菌为伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者的结直肠癌，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于口服递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第一组合物的减毒活菌为鼠伤寒沙门氏菌血清变型MD58菌株，第二组合物的减毒活菌为伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
设想第一和第二组合物的不同递送途径，即第一组合物通过口服、静脉内、鼻内、胸膜内、皮内或皮下给药以实现全身效果，而第二组合物通过局部给药于肿瘤疾病部位，以这样一种方式相互补充，从而可以有效地预防和/或治疗受试者中的肿瘤疾病。具体地说，与单独给予第一或第二组合物中的一种相比，这种组合以更特异、更有针对性和更有效的方式激活受试者体内免疫系统的抗肿瘤活性。
如上所述，第二组合物用于局部给药于受试者的肿瘤疾病部位(例如膀胱)。因此，第二组合物可以以任何形式给药，其中第二组合物被认为是在肿瘤疾病的紧密接近的范围内。如本文所用，术语“紧密接近”是指肿瘤疾病周围一定距离的范围或区域。例如，在一个实施方案中，术语“紧密接近”可指从肿瘤疾病的边界延伸出10mm的范围或区域。在另一个实施方案中，术语“紧密接近”可指从肿瘤疾病的边界延伸出5mm的范围或区域。在另一实施方案中，术语“紧密接近”可指从肿瘤疾病的边界延伸出2.5mm的范围或区域)。第二组合物与肿瘤疾病部位的给药距离将允许第二组合物的生物效应(例如，各种免疫细胞类型的募集和激活)对所讨论的肿瘤疾病产生影响，同时对位于身体不相关区域的组织产生最小影响/无影响。因此，第二组合物可直接给药于肿瘤组织，或给药于肿瘤疾病紧密接近的周围组织。另外，第二组合物可以给药于肿瘤组织或周围组织“内”或“上”。因此，术语“局部给药”是指减毒活菌可以与肿瘤疾病接触或与紧邻的周围组织接触以产生所需效果的任何情况。
优选地，第二组合物可通过局部灌注、腹膜内、胸膜内、膀胱内、瘤周注射或肿瘤内注射来给药，其中“灌注”是指将第二组合物引入相关解剖部位，并在那里停留特定时间，然后被排出、排空或取出；“腹膜内”是指将第二组合物注射到受试者的腹膜中；“胸膜内”是指将第二组合物注射到受试者的胸膜或胸膜腔中；“膀胱内”是指通过导管向膀胱内注射或灌注；“瘤周注射”是指将第二组合物注射在肿瘤疾病部位周围；“肿瘤内注射”是指将第二组合物直接注射到受试者的肿瘤疾病中。可以理解，第二组合物的具体给药方法可以取决于所要治疗的肿瘤疾病，例如，所要治疗的肿瘤疾病的位置和类型。例如，如果希望治疗大表面积的体腔，例如受试者的胸膜腔，那么通过灌注给药可能是最合适的。或者，如果肿瘤疾病位于腹膜腔内(例如卵巢癌)，通过腹膜内注射给药可能是最合适的。更进一步地，如果要预防和/或治疗的肿瘤疾病是血液学恶性肿瘤，则需要注意的是，肿瘤内注射可能不是首选的给药方法。
在所要预防和/或治疗的肿瘤疾病是膀胱癌的情况下，优选地，第二组合物可以通过膀胱内灌注给药，也称为膀胱灌注、膀胱内治疗或膀胱内疗法。这样的给药方法是指第二组合物可通过导管输送至膀胱的方式。如前所述，由于与口服或肠外给药相比，这种方法减少了全身副作用，因此被认为是“局部的”。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者的膀胱癌，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同。其中第一组合物被配制用于口服或皮下递送以刺激受试者的全身免疫应答，并与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于通过膀胱内灌注给药。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、减少、抑制、预防复发或控制受试者的膀胱癌，该受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，其中第一组合物被配制用于口服或皮下递送以刺激受试者的全身免疫应答，并与第二组合物同时、单独或依次给药，其中第二组合物用于通过膀胱内灌注给药，其中第一和第二组合物的减毒活菌是伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株。
本发明的第一组合物旨在于受试者中产生全身免疫应答。因此，本发明的第一组合物可以是疫苗或疫苗组合物。这些术语可互换使用，并且是指生物制剂，其中受试者对所述生物制剂产生免疫应答，从而对特定传染病(例如，由沙门氏菌属引起的疾病)提供自动获得性免疫。在本发明的上下文中，疫苗可以含有类似于致病菌的试剂或“外来”试剂，该致病菌是所述细菌的弱化或杀死形式；或细菌蛋白、胶囊、DNA或RNA的任何部分或片段。这种外来试剂会被疫苗接受者的免疫系统识别，然后免疫系统会摧毁所述试剂，并形成针对这种细菌的“记忆”，从而产生一种持久的保护，防止未来来自相同或类似病毒的细菌感染。通过该疫苗接种途径，包括本发明的那些疫苗组合物，设想一旦接种疫苗的受试者再次遇到与所述受试者接种疫苗所针对的相同细菌或细菌分离物，个体的免疫系统可以因此识别所述细菌或细菌分离物，并激发对感染更有效的防御。由于疫苗而在受试者中诱导的自动获得性免疫本质上可以是体液和/或细胞性质的。因此，在其中第一和第二组合物相同的实施方案中，本发明的第一组合物不仅可以诱导增强对第二组合物的非特异性先天免疫应答的全身免疫应答，而且还可以赋予受试者获得对第一组合物的减毒活菌的自动免疫的额外益处。
第一组合物可与第二组合物同时、单独或依次给药于需要该组合物的受试者。在不受理论约束的情况下，认为在给予第二组合物之前给予第一组合物允许在给予第二组合物之前有效地激发受试者的免疫系统，从而产生更有效的预防或治疗策略。因此，虽然可能存在第一和第二组合物彼此快速连续给药或同时给药的一些情况，但优选地，将在给予第二组合物的减毒活细菌之前，先向受试者给予第一组合物的减活细菌。
向受试者给予的第一组合物的减毒活菌的量足以引起受试者的全身免疫应答，从而有效地激发受试者的免疫系统，以在肿瘤疾病的局部部位接受第二组合物，从而使受试者的免疫系统能够在用这两种组合物联合治疗时对癌症或肿瘤产生有效的免疫应答。通过给予该组合物引发的免疫应答本身可以具有治疗水平，或具有亚治疗水平，需要随后给予第二组合物才能发挥治疗效果。
设想包含减毒活菌的第一和第二组合物可以间隔两周至少给药一次或至少两次。第一组合物可在给予第二组合物之前、期间或之后给药。优选地，第一组合物的至少一次给药将发生在第二组合物的给药之前，这样的给药可以发生在第二组合物的给药之前至少一周。可以设想，根据治疗方案，可以重复给予第一和第二组合物。第一和/或第二组合物的减毒活菌的给药剂量可以是104至1012CFU，其中CFU是集落形成单位。例如，合适的剂量可能介于104和105CFU、104和106CFU、104和107CFU、104和108CFU、104和109CFU、104和1010CFU、104和1011CFU、104和1012CFU、105和106CFU、105和107CFU、105和108CFU、105和109CFU、105和1010CFU、105和1011CFU、105和1012CFU、106和107CFU、106和108CFU、106和109CFU、106和1010CFU、106和1011CFU、106和1012CFU、107和108CFU、107和109CFU、107和1010CFU、107和1011CFU、107和1012CFU、108和109CFU、108和1010CFU、108和1011CFU、108和1012CFU、109和1010CFU、109和1011CFU、109和1012CFU、1010和1011CFU、1010和1012CFU，或1011和1012CFU之间。
众所周知，肿瘤疾病的病因是多方面和多样化的，往往产生包括多种疗法的预防和治疗策略，以达到最佳效果。因此，本发明可涉及将第一和/或第二组合物的减毒活菌与其他已知的癌症疗法联合使用。优选地，第一和/或第二组合物的减毒活菌可以与免疫疗法、放射疗法、化学疗法或抗癌剂联合给药。如本文所用，术语“抗癌剂”是指有效杀死癌细胞、阻止癌细胞分裂或有助于防止癌细胞复发的任何药剂，但不认为是免疫疗法、放射疗法或化学疗法。
在一个优选实施方案中，第一和/或第二组合物的减毒活菌可以与免疫疗法联合给药。优选地，所述免疫疗法可以包括检查点抑制剂、抗原特异性T细胞、过继性T细胞疗法、治疗性抗体、癌症疫苗或任何其他工程化细胞免疫疗法。
“检查点抑制剂”是一种作用于表面蛋白的试剂，其表面蛋白是TNF受体或B7超家族的成员，或其他成员，包括结合负性共刺激分子的试剂。这类检查点抑制剂的实例包括但不限于CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、TIGIT、VISTA、LAG-3和/或它们各自的配体，包括PD-L1。
当免疫疗法包含检查点抑制剂时，检查点抑制剂可直接针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG3、TIM3、BTLA、VISTA或TIGIT。在一个优选实施方案中，检查点抑制剂可直接针对CTLA-4、PD-1或PD-L1。在某些情况下，阻断剂可能是伊匹单抗(ipilimumab)(靶向CTLA-4)、纳武单抗(nivolumab)(/>靶向PD-1)、派姆单抗(pembrolizumab)(靶向PD-1)、阿特珠单抗(atezolizumab)(/>靶向PD-L1)、西米普利单抗(cemiplimab)(/>靶向PD-1)或德瓦鲁单抗(durvalumab)(/>靶向PD-L1)。
术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、CD279和“PD1”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、异构体、物种同源物，以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可在GenBank登录号NP 005009.2下找到。
术语“PD-L1”、“PDL1”、“程序性死亡配体1”、CD274和“程序性细胞死亡1”可互换使用，并被认为包括人PD-L1的变体、异构体和物种同源物，以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-L1序列可在GenBank登录号NP 054862.1下找到。
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CD152”和“CTLA-4抗原”可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、异构体、物种同源物，以及与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。完整的CTLA-4序列可在GenBank登录号NP_005205.2下找到。
术语“LAG-3”、“LAG3”、CD223和“淋巴细胞活化基因3”可互换使用，包括人LAG-3的变体、异构体和物种同源物，以及与LAG-3具有至少一个共同表位的类似物。完整的LAG-3序列可在GenBank登录号NP_002277.4下找到。
术语“TIM-3”、“TIM3”、“HAVCR2”、“甲型肝炎病毒细胞受体2”、CD366和“T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3)”可互换使用，包括人TIM-3的变体、异构体和物种同源物，以及与TIM-3具有至少一个共同表位的类似物。完整的TIM-3序列可在GenBank登录号NP_116171.3下找到。
术语“BTLA”、“B和T淋巴细胞弱化因子”和“CD272”可互换使用，包括人BTLA的变体、异构体和物种同源物，以及与BTLA具有至少一个共同表位的类似物。完整的BTLA序列可在GenBank登录号NP_861445.4下找到。
术语“VISTA”、“V-集免疫调节受体(V-set immunoregulatory receptor)”、“B7H5”、“B7-H5”、“PD-1H”和“T细胞活化的V结构域Ig抑制因子”可互换使用，包括人VISTA的变体、异构体和物种同源物，以及与VISTA具有至少一个共同表位的类似物。完整的VISTA序列可在GenBank登录号NP_071436.1下找到。
术语“TIGIT”、“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”、“WUCAM”和“Vstm3”可互换使用，包括人TIGIT的变体、异构体和物种同源物，以及与TIGIT具有至少一个共同表位的类似物。完整的TIGIT序列可在GenBank登录号NP_776160.2下找到。
PD-L1/PD-1信号通路是癌症免疫逃避的主要机制，原因有几个。首先，也是最重要的是，这一途径参与了外周中发现的活化的T效应细胞免疫应答的负调控。其次，PD-L1在癌症微环境中上调，而PD-1在活化的肿瘤浸润性T细胞中也上调，从而可能增强抑制的恶性循环。第三，该途径通过双向信号传导复杂地参与先天和适应性免疫调节。这些因素使得PD-1/PD-L1复合物成为癌症操纵免疫应答和促进自身进展的中心点。因此，肿瘤能够激活抑制性免疫检查点分子途径，导致免疫系统受到抑制，癌细胞继续无阻碍地生长。在T细胞活化后，CTLA-4被转运到表面，在那里它与CD28竞争与抗原呈递细胞(APC)上相同的配体，导致抑制CD28以及随后抑制T细胞的活化和增殖。靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4旨在阻止这些事件的发生。
当免疫疗法包括抗原特异性T细胞时，抗原特异性T细胞可能是过继性T细胞疗法的结果。术语“过继性细胞疗法”是指任何涉及将细胞转移/给药到受试者(优选人类)体内的疗法。该细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，该细胞通常来源于免疫系统，目的是改善免疫功能。过继性细胞疗法可以包括但不限于CAR-T细胞疗法(嵌合抗原受体T细胞)、TIL疗法(肿瘤浸润淋巴细胞)和iPSC衍生的疗法(诱导多能干细胞)。特别设想的是，过继性T细胞疗法可以是CAR-T细胞疗法。在某些情况下，CAR-T细胞疗法将直接针对抗原CD19，其存在于B细胞衍生的癌症中。因此，这种疗法可能特别适合于B细胞衍生的癌症，如急性淋巴细胞白血病(ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在其他情况下，CAR-T细胞疗法将直接针对肿瘤相关抗原(TAAs)，因此更适合治疗实体瘤。这类抗原的实例包括但不限于CD133、CD138、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPC3、HER2、HerinCAR-PD1、MSLN、MG7、MUC1、LMP1、PSMA和PSCA。这些技术将为本领域技术人员所知，读者可参阅题为“过继性细胞疗法：当前形势(Adoptive cellular therapies:the current landscape)”的综述以获取更多信息(Rohaan et al.2019,Virchows Arch.474(4):449-461)。
如果免疫疗法包含治疗性抗体，则所述治疗性抗体可以针对癌症或肿瘤。本文所述的术语“治疗性抗体”包括产生治疗效果的完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。这种治疗性抗体可以针对上述检查点抑制剂分子，或者包括针对共刺激分子靶点的激动性抗体，如ICOS(诱导性T细胞共刺激/CD278)、GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体/TNFRSF18/CD357/AITR)、4-1BB(CD137)、CD27和CD40。在某些情况下，可能希望受试者同时接受两种类型的治疗性抗体。
治疗性抗体可以是单克隆抗体，甚至更优选的是人源化或人单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指具有单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定的表位表现出单一的结合特异性和亲和力。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。术语“人源化抗体”是指将来自另一哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列移植到人类框架序列上的抗体。可以在人类框架序列内进行额外的框架区域修饰。
获得这种单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。治疗性抗体可以阻断癌细胞中的异常蛋白质，附着在癌细胞上的特定蛋白质上，或者与细胞毒性分子(如抗癌药物)偶联。该细胞毒性分子将癌细胞标记给免疫系统，这样异常细胞就可以随后被免疫系统的细胞组分靶向并摧毁。在某些情况下，单克隆抗体也可以是检查点抑制剂。例如，伊匹单抗纳武单抗/>和派姆单抗/>都是单克隆抗体，也是检查点抑制剂。在其他情况下，单克隆抗体可以是针对共刺激分子靶点的激动性抗体，如ICOS(诱导型T细胞共刺激/CD278)、GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体/TNFRSF18/CD357/AITR)、4-1BB(CD137)、CD27和CD40。用于治疗癌症的非检查点抑制剂单克隆抗体包括但不限于曲妥珠单抗(trastuzumab)/>贝伐单抗(bevacizumab)西妥昔单抗(cetuximab)/>帕尼单抗(panitumumab)利妥昔单抗(rituximab)(/>和/>)、阿仑单抗(alemtuzumab)/>奥法木单抗(ofatumumab)/>吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)/>和本妥昔单抗(brentuximab vedotin)
免疫疗法可以包括癌症疫苗。癌症疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗，优选地，该疫苗是治疗性疫苗。使用癌症疫苗可以训练免疫系统识别并摧毁癌细胞呈递的抗原。这类疫苗还可以包含佐剂，以帮助进一步增强应答。
免疫疗法可以包括任何其他工程化细胞免疫疗法。在本发明的上下文中，“任何其他工程化细胞免疫疗法”是指经设计为调节受试者的免疫系统或免疫应答以提供与癌症预防或治疗相关的有利结果的方式进行工程化的任何细胞类型。这类细胞的实例包括但不限于天然杀伤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、干细胞和树突状细胞。
在第二方面，本发明提供了一种治疗、预防、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病的方法，其中该方法包括同时、单独或依次给予受试者，(i)包含减毒活菌的第一组合物和(ii)包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同，其中第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内、皮内或皮下递送，以刺激受试者的全身免疫应答，并与第二组合物同时、单独或依次给药，并且其中第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病的部位。
因此，本发明提供了一种治疗、预防、抑制、防止复发或控制受试者的肿瘤疾病的方法，其中所述方法包括用于本文所述用途的减毒活菌。
因此，本发明的方法可用于减少或抑制原发性肿瘤或癌症向其他部位的转移，或在远离原发性肿瘤或癌症的其他部位形成或建立转移性肿瘤或癌症，从而抑制或减少肿瘤或癌症的复发或肿瘤或癌症的进展。因此，本发明提供了对给定受试者的病况的可检测或可测量的改善，例如减轻或改善与细胞增殖性或细胞超增殖性疾病、瘤形成、肿瘤或癌症或转移的存在相关的一种或多种不良(身体)症状或后果，即治疗益处或有益效果。
因此，本发明的方法是一种组合疗法，包括给予两种组合物，其特征如上所述。这样的组合有可能在受试者中引起强效和持久的免疫应答，从而产生增强的治疗益处。
治疗益处或有益效果是指病况或病理的任何客观或主观，短暂、暂时或长期的改善，或与细胞增殖或细胞过度增殖性疾病(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移)相关或由其引起的不良症状的发作、严重程度、持续时间或频率的减少。它可以提高生存率。例如，当一种或多种相关病理、不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率增加或部分减少，或细胞增殖或细胞过度增殖性疾病(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移)的一种或多种生理、生化或细胞表现或特征受到抑制或逆转时，可实现根据本发明的治疗方法的满意的临床终点。因此，治疗益处或改善可以是，但不限于破坏靶标增殖细胞(例如，瘤形成、肿瘤或癌症，或转移)，或消融与细胞增殖或细胞过度增殖性病症(如瘤形成、肿瘤或癌症，或转移)相关或由其引起的一种或多种、大多数或全部病理、不良症状或并发症。然而，治疗益处或改善不一定是治愈或完全破坏所有靶标增殖细胞(例如瘤形成、肿瘤或癌症，或转移)或消融与细胞增殖或细胞过度增殖性病症(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移)相关或由其引起的全部病理、不良症状或并发症。例如，肿瘤或癌细胞团的部分破坏，或通过抑制肿瘤或癌症的进展或恶化来稳定肿瘤或癌团、大小或细胞数量，可以降低死亡率并延长寿命，即使只有几天、几周或几个月，即使肿瘤或癌团、大小或细胞的一部分或大部分仍然存在。
治疗益处的具体非限制性实例包括减少瘤形成、肿瘤或癌症或转移体积(大小或细胞团)或细胞数量，抑制或防止瘤形成、肿瘤或癌症体积的增加(例如稳定)，减缓或抑制瘤形成、肿瘤或癌症的进展、恶化或转移，或抑制瘤形成、肿瘤或癌症的增殖、生长或转移。
一种发明方法可能不会立即生效。例如，治疗后可能会增加瘤形成、肿瘤或癌细胞数量或团，但随着时间的推移，随后给定受试者中肿瘤细胞团、大小或细胞数量可能会最终稳定或减少。
与瘤形成、肿瘤、癌症和转移相关的其他可被抑制、减轻、减少、延迟或预防的不良症状和并发症包括，例如，恶心、食欲不振、嗜睡、疼痛和不适。因此，与细胞增殖性疾病相关或由其引起的不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率的部分或完全降低或减少，受试者生活质量和/或幸福感的改善，如改善的精力、增加的食欲、改善的心理健康，都是治疗益处的特定非限制性实例。
因此，治疗益处或改善也可以包括被治疗受试者生活质量的主观改善。在另一个实施方案中，一种方法延长或加长受试者的寿命(生存)。在另一个实施方案中，一种方法改善受试者的生活质量。
治疗益处还可以包括预防瘤形成、肿瘤、癌症和转移的复发，例如，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症和转移已经通过手术或化学消融。
本发明可适用于对先前的预防和/或治疗策略具有难治性的个体。所谓“难治性”，我们指的是对治疗无效的任何肿瘤性疾病。还设想本发明可能适用于之前对先前治疗具有低应答、中等应答或高应答的个体。
第一和第二组合物通常以组合物的形式给予受试者，该组合物包含有效量的减毒活菌，例如伤寒沙门氏菌血清变型ZH9菌株，并进一步包括药学上可接受的载体/佐剂/稀释剂或赋形剂。短语“药学上”和“药学上可接受”是指当给药于动物(诸如例如人，视情况而定)时不会产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。这种制剂将为本领域技术人员所知。此外，对于动物(例如人)给药，应理解制剂应符合无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准(如适用)。
如本文所用，“药学上可接受的载体/佐剂/稀释剂/赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等类似材料及其组合，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329)。实例包括但不限于磷酸氢二钠、大豆蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化铵、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、蔗糖、硼酸盐缓冲液、无菌盐水溶液(0.9％ NaCl)和无菌水。
第一和/或第二组合物还可以包含用于增强免疫应答的附加组分。这些附加组分的实例包括但不限于：铝盐(例如氢氧化铝、氧化铝和磷酸铝)、油佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，霉菌酸酯基佐剂(mycolate-based adjuvant)(如海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)))、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(例如胞壁质、粘肽或糖蛋白，如N-Opaca，胞壁酰二肽[MDP]或MDP类似物))、蛋白聚糖(如从肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)中提取)、链球菌制剂(如OK432)、胞壁酰二肽、免疫刺激复合物(EP 109 942、EP 180 564和EP 231 039中公开的“Iscoms”)、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(如miglyol)、植物油(如花生油)、脂质体、多元醇、Ribi佐剂系统(参见例如GB-A-2 189 141)、维生素E、卡波醇、干扰素(例如IFN-α、IFN-γ或IFN-β)、白细胞介素，特别是那些刺激细胞介导的免疫的因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21)或趋化因子(例如CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL5、CCL2、CX3CL1)。
参考以下非限制性实施例进一步描述本发明：
实施例
实施例1
采用体外侵袭实验、流式细胞术染色检测细胞内沙门氏菌共同抗原(CSA-1)和碘化丙啶检测细胞死亡，研究了ZH9与尿路上皮癌细胞的相互作用。在小鼠原位同系MB49膀胱肿瘤模型中建立ZH9对膀胱肿瘤生长的治疗效果。荷瘤动物接受膀胱内单剂量ZH9或OncoTice BCG治疗，并通过对数秩(Mantel-Cox)试验评估长期生存比较。在对健康小鼠进行治疗后，对分离的小鼠膀胱进行染色，通过流式细胞术对局部免疫应答进行分析。
在MB49肿瘤接种2天后用单剂量ZH9治疗的小鼠，与两次均是载体治疗的动物(中位生存期49.5天vs.31天，p＝0.003)和BCG治疗的动物(中位生存期49.5天vs.27.5天，p<0.001)相比，显示出显著的生存益处。即使在肿瘤接种后4天治疗的更严格的模型中，ZH9也显示出显著的疗效(中位生存期为30天，载体组为20.5天(p＝0.003)，BCG组为23.5天(p＝0.025))。存活的经ZH9治疗的动物，与天然对照不同，对进一步膀胱接种MB49肿瘤细胞有抵抗力，这表明ZH9治疗产生了持久的抗肿瘤免疫效果(100％vs.31.5％，中位生存期45天，p＝0.01)。在体外，对人(UMUC3、T24、RT4、5637)和小鼠(MB49)尿路上皮癌细胞进行细胞内流式细胞术检测，表明ZH9在暴露1h后24h侵袭并诱导所有类型细胞死亡。在体内，ZH9单次膀胱内治疗产生了强烈的细胞免疫应答，其特征是在第7天单核细胞、NK细胞、CD4+和CD8+T细胞和树突状细胞的强募集，具有活化的交叉呈递(Ly6C+，CD103+)表型，在所有情况下，比用相同剂量的BCG单次治疗后的强度更大且持续时间更长。
因此，在原位膀胱癌模型中，减毒活沙门氏菌菌株ZH9在标准治疗中表现出明显的生存优势，可能是通过直接杀死肿瘤细胞并诱导强烈的细胞免疫应答，因此表明ZH9在膀胱癌中具有显著的治疗潜力。
实施例2
用皮下伤寒沙门氏菌预先全身激发提高了局部膀胱伤寒沙门氏菌治疗的疗效
本文所述研究的目的是评估在膀胱内(ives)ZH9治疗之前使用减毒伤寒沙门氏菌ZH9进行皮下(s.c.)激发对非肌层浸润性膀胱癌模型中小鼠生存水平的影响(见图1A)。
如下所述，本申请的发明者出人意料地表明，同时接受全身和局部伤寒沙门氏菌治疗的小鼠生存率提高。
材料与方法
小鼠细胞
MB49细胞系(由瑞典乌普萨拉大学A.Loskog教授提供)来源于雄性C57Bl/6小鼠中致癌物诱导的尿路上皮癌(Summerhayes,Journal of The National Cancer Institute,62(4):1017-1023,1979)。通过用编码萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转染产生荧光素酶表达(MB49-luc)(由瑞士洛桑联邦理工学院D.Trono教授提供)。
MB49原位膀胱肿瘤模型
采用7至10周龄雌性C57Bl/6野生型小鼠(Charles River)，所有实验均按照瑞士法律并经瑞士沃州兽医局(Cantonal Veterinary Office of Canton de Vaud,Switzerland)批准进行。在深度麻醉的小鼠中建立膀胱肿瘤，这些小鼠使用Introcan24Gx3/4导管(Braun，Melsungen，Germany)进行尿道插管。先用100μl 22％乙醇预处理15分钟，再灌注在50μl中的50万个MB49-luc细胞。在腹膜内(I.P)注射D-荧光素(Promega,L8220,150μg/g体重)15分钟后，在Xenogen成像系统(Xenogen/IVIS Caliper LifeScience，由cellular imaging facility,CIF/UNIL,Lausanne,Switzerland提供)中通过生物发光监测MB49-luc肿瘤的生长。100％的小鼠长出了膀胱肿瘤。MB49-luc肿瘤的生物发光监测对于评估前3周的肿瘤建立和生长非常有效，然而，随后经常出现生长肿瘤不受控制的发光损失(Jurczok et al.,BJU International,101(1):120-124,2008)，需要通过触诊、血尿和小鼠整体健康状况进行额外监测。当达到批准的终止条件时处死小鼠。
细菌的制备
根据需要在PBS中制备减毒伤寒沙门氏菌菌株(ZH9)的稀释液，以实现3×107CFU/50μl，用于膀胱内灌注，以及1×107CFU/100μl，用于皮下注射。
膀胱内的治疗
如上所述，通过导尿术注入50μl体积的细菌悬液。细菌悬液在膀胱中的滞留时间为1小时，直到小鼠从麻醉中醒来后自发排尿。在这种严格的环境下，在第5天(膀胱内肿瘤细胞灌注后4天)进行单次膀胱内治疗-灌注。在第5天，通过生物发光检测肿瘤。
在100天内监测生存率。该结果反映了五项独立的研究，证明了上述结果的可重复性。
结果
在研究结束时，与接受膀胱内PBS治疗的小鼠相比，接受ZH9至膀胱的局部给药(膀胱内)的小鼠生存率高(p<0.01)。除了膀胱内给药ZH9外，还接受皮下给药ZH9的小鼠生存率更高(p<0.01)(见图1B)。统计数据采用对数秩(Mantel-Cox)检验。同时全身和局部膀胱给药沙门氏菌的进行治疗的小鼠终末生存率为77％，对比单独局部膀胱ZH9给药为43％，对比局部膀胱PBS治疗为26％。
实施例3
使用皮下注射伤寒沙门氏菌的全身激发增强了膀胱对局部伤寒沙门氏菌治疗的期望的免疫应答
本文所述研究的目的是通过流式细胞术评估在局部膀胱内给药伤寒沙门氏菌菌株(ZH9)之前，接受用伤寒沙门氏菌菌株(ZH9)皮下全身激发的小鼠的膀胱中的免疫细胞浸润水平(见图2)。
如下所述，本发明的发明人出人意料地表明，全身激发增加了膀胱中骨髓和淋巴免疫应答的峰值幅度和寿命，并且非期望的中性粒细胞炎症没有增强。
材料和方法
将雌性C57BL/6小鼠在第-35天和第-14天通过皮下注射1×107CFU伤寒沙门氏菌ZH9或PBS对照进行处理。在第1天，将小鼠通过静脉注射3×107CFU伤寒沙门氏菌ZH9或PBS对照进行处理。在治疗后的指定时间点(24小时和第7天)，收获膀胱组织并用胶原酶/分散酶/DNA酶消化(见图2)。生成单细胞悬液，对细胞进行染色，进行流式细胞术分析。
细菌的制备
根据需要在PBS中制备减毒伤寒沙门氏菌菌株(ZH9)的稀释液，以实现3×107CFU/50μl，用于膀胱内灌注，以及1×107CFU/100μl，用于皮下注射。
膀胱内的治疗
采用7至10周龄雌性C57Bl/6野生型小鼠(Charles River)，所有实验均按照瑞士法律并经瑞士沃州兽医局批准进行。在深度麻醉的小鼠中进行膀胱内灌注，这些小鼠使用Introcan 24Gx3/4型导管(Braun,Melsungen,Germany)进行尿道插管。灌注50μl体积的细菌悬浮液。在膀胱中的滞留时间约为1小时，直至小鼠从麻醉中醒来自行排尿。
膀胱的制备
采用CO2吸入法处死小鼠，收集膀胱。在DL-二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol)(Sigma Merck KGaA)中切碎，使用1mg/mL胶原酶/分散酶(Roche,Basel,Switzerland)和0.1mg/mL DNA酶I(Sigma Merck KGaA)与20％胎牛血清(Gibco,MA,USA)消化，获得单细胞悬浮液。将回收的细胞进行免疫染色。
免疫染色和流式细胞术分析
所用的单克隆抗小鼠抗体有：抗-CD3-PE(17A2)、抗-CD3-PerCP/Cy5.5(17A2)、抗-Ly6G-PE/Cy7(1A8)、抗-Ly6C-AF700(HK1.4)、抗-CD8-APC/Cy7(53-6.7)、抗-CD103-PcBlue(2E7)、抗-CD11b-FITC(M1/70)、抗-XCR1-APC(ZET)(Biolegend)、抗-CD4-APC(RM4-5)、抗-CD8-PE(53-6.7)(BD Biosciences)、抗-CD11c-PE-eF610(N418)、抗-CD45-FITC(30-F11)、抗-CD45-PerCP/Cy5.5(30-F11)、抗-CD11b-AF700(M1/70)、抗-CD335-eF450(29A1.4)(eBioscience，Thermo Fisher Scientific，MA,USA)。采用以下同型对照：大鼠IgG2a，κ同型对照-APC-Cy7(RTK2758)，大鼠IgG2a，κ同型对照-APC(RTK2758)(Biolegend)，Arm仓鼠IgG同型对照-PE-eF610(eBio99Arm)(eBioscience)。
通过LIVE/DEAD Aqua可固定死细胞染色试剂盒(live/dead fixable aqua deadcell stain kit)(Invitrogen Thermo Fisher Scientific,MA，USA)排除死细胞。分别使用Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter,Nyon,Switzerland)和FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)进行细胞采集和分析。
结果
当在膀胱内灌注ZH9之前先皮下注射ZH9激发时，免疫过滤显著增加(见图3A、3B和3C)。这在灌注后7天尤为明显。膀胱内灌注后7天，使用ZH9激发的T细胞和NK细胞明显增加，而髓系细胞的变化较小。膀胱内灌注ZH9后7天，使用ZH9激发的CD4+和CD8+T细胞均显著增加(见图3A和3B)。使用ZH9激发的中性粒细胞未发生变化，而单核细胞显著增加，特别是在膀胱内灌注ZH9后24小时(见图3A和3B)。
实施例4
使用口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发增强了对局部伤寒沙门氏菌治疗的期望的细胞免疫应答
本文所述研究的目的是确定在使用鼠伤寒沙门氏菌菌株(MD58)口服全身激发，联合使用伤寒沙门氏菌菌株(ZH9)局部肿瘤内治疗后，荷瘤小鼠(在小鼠结肠癌模型中)中T细胞数量、表型和功能的变化。
材料与方法
细菌细胞的制备
根据需要在PBS中制备减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株(MD58)的稀释液，以达到1×109CFU/100μl，用于经口灌胃。根据需要在PBS中制备减毒伤寒沙门氏菌菌株(ZH9)的稀释液，以达到1×107CFU/40μl，用于肿瘤内注射。
MC38结肠癌模型
所有实验均采用7至14周龄雌性C57BL/6小鼠。MC38结肠癌细胞系购自Kerafast,Inc.，并在注射前保持在指数生长阶段。细胞通过胰蛋白酶化制备，在纯培养基中洗涤，并通过自动细胞计数器计数活细胞。在植入肿瘤细胞之前，先使用1-2％异氟烷(isoflurane)麻醉每只小鼠，并对注射区域进行剃毛和清洁。使用27G注射器在小鼠后侧(rear flank)皮下注射在200μL无血清培养基中的6x105 MC38细胞。定期监测肿瘤负荷，使其不超过Prokarium内政部许可的水平。小鼠先使用口服鼠伤寒沙门氏菌治疗(在MC38接种前7天)，然后使用伤寒沙门氏菌肿瘤内治疗(在MC38接种后14天)，或单独使用伤寒沙门氏菌肿瘤内治疗(在MC38接种后14天)(见图4)。在伤寒沙门氏菌肿瘤内治疗后1天和7天，评估鼠伤寒沙门氏菌的口服全身激发对T细胞浸润、表型和功能状态的影响。
组织分离和流式细胞术
切除肿瘤和脾脏，并使用过滤器和注射器柱塞进行机械分离。然后通过70μm细胞过滤器过滤裂解液，并裂解红细胞。另外使用35％Percoll溶液处理肿瘤以去除细胞碎片。将细胞颗粒重悬于适当的缓冲液中，用于下游分析。对于流式细胞术分析，先使用LIVE/DEAD Aqua可固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher)去除死细胞，然后用以下单克隆抗体进行染色：抗-CD90.2(53-2.1；Biolegend)、抗-CD4(RM4-5；Thermo Fisher)、抗-CD8α(53-6.7；Biolegend)、Foxp3(FJK-16s；Thermo Fisher)、IFNγ(XMG1.2；Biolegend)和Ki-67(16A8；Biolegend)。分别使用ATTUNE NXT细胞仪(Thermo Fisher)和FlowJo软件(TreeStar)进行细胞采集和分析。
肿瘤浸润性CD8+和CD4+T细胞数量的评估
7至9周龄雌性C57BL/6小鼠使用1×109CFU鼠伤寒沙门氏菌MD58/os(PO，“口服”)免疫，或不进行治疗。7天后，在所有小鼠皮下接种6×105MC38(结肠)肿瘤细胞。14天后，所有小鼠接受肿瘤内(IT)剂量为1×107CFU的伤寒沙门氏菌ZH9。IT治疗后第1天和第7天取肿瘤和脾脏，n＝3或4只小鼠/组/时间点。肿瘤被机械分离、过滤，并在Attune NXT细胞仪上通过流式细胞术分析单细胞悬浮液。对细胞表面标记物进行染色，然后进行固定/透化，然后对细胞内分子进行染色。指示的T细胞群通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+，然后是CD4、CD8或CD4和Foxp3进行门控。将绝对细胞计数标准化为每个肿瘤的重量。
肿瘤中和周围T细胞增殖的评估
7至9周龄雌性C57BL/6小鼠使用1×109CFU鼠伤寒沙门氏菌MD58/os(PO，“口服”)免疫，或不进行治疗。7天后，在所有小鼠中皮下接种6×105MC38(结肠)肿瘤细胞。14天后，所有小鼠接受肿瘤内(IT)剂量为1×107CFU的伤寒沙门氏菌ZH9。IT治疗后第1天和第7天取肿瘤和脾脏，n＝4只小鼠/组/时间点。肿瘤被机械分离、过滤，并在Attune NXT细胞仪上通过流式细胞术分析单细胞悬浮液。对细胞表面标记物进行染色，然后进行固定/透化，然后对细胞内分子进行染色。CD8 T细胞通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+和CD8+进行门控。CD4 T细胞通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+、CD4+和Foxp3-进行门控。增殖T细胞被定义为Ki-67+，并表示为总CD8 T细胞的百分比。
CD8+和CD4+T细胞功能电位的评估
7至9周龄雌性C57BL/6小鼠使用1×109CFU鼠伤寒沙门氏菌MD58/os(PO，“口服”)免疫，或不进行治疗。7天后，在所有小鼠中皮下接种6×105MC38(结肠)肿瘤细胞。14天后，所有小鼠接受肿瘤内(IT)剂量为1×107CFU的伤寒沙门氏菌ZH9。IT治疗后第1天和第7天取肿瘤和脾脏，n＝4只小鼠/组/时间点。肿瘤被机械分离、过滤，并在Attune NXT细胞仪上通过流式细胞术分析单细胞悬浮液。对细胞表面标记物进行染色，然后进行固定/透化，然后对细胞内分子进行染色。CD8 T细胞通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+和CD8+进行门控。CD4 T细胞通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+、CD4+和Foxp3-进行门控。增殖T细胞被定义为Ki-67+，并表示为总CD8 T细胞的百分比。为了评估细胞因子的生产能力，在带布雷菲德菌素A的细胞活化混合物(Cell Activation Cocktail with Brefeldin A)(Biolegend；423303)存在下，在37℃下刺激细胞4小时。刺激后，对细胞进行表面标记物染色，然后进行固定/透化，然后对细胞内分子进行染色。CD8 T细胞通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+和CD8+进行门控。IFNγ+CD8 T细胞表示为总CD8 T细胞的百分比。CD4 T细胞通过FSC/SSC、单线、活力染料-、CD90+、CD4+和Foxp3-进行门控。IFNγ+CD4 T细胞表示为总CD4 T细胞的百分比。功能电位是用T细胞激化混合物(PMA+离子霉素+布雷菲德菌素A)刺激后能够产生IFNγ的T细胞的百分比来测量的。
结果
与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗后，发现肿瘤浸润性CD8和CD4 T细胞数量增加，但调节性T细胞(Treg)数量没有增加(见图5A和5B)。此外，与单独肿瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗后，显示肿瘤中和周围的T细胞增殖增加，这表明激活了全身和局部适应性免疫系统(见图6和7)。与单独瘤内治疗相比，口服鼠伤寒沙门氏菌全身激发并联合肿瘤内伤寒沙门氏菌治疗的小鼠中，CD8和CD4细胞的功能潜力也显示出增加(见图8和9)。
本文公开的实施例证明了沙门氏菌的全身给药接着沙门氏菌的局部给药，增强了沙门氏菌局部给药的效果。发明人还证明，与沙门氏菌单独局部给药相比，沙门氏菌全身给药和局部给药的组合诱导了更强的免疫应答，可能会驱动抗肿瘤活性。此外，发明人在此证明了本文所举例说明的效果在多种沙门氏菌菌株、多种全身和局部给药模式以及多种癌症模型中都可以看到。

Claims (19)

1.一种包含减毒活菌的第一组合物，其用于治疗、预防、减少、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病，所述受试者正在或打算被给予包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同；
其中，所述第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内、皮内或皮下递送，以刺激受试者的全身免疫应答，并且与所述第二组合物同时、单独或依次给药；和
其中，所述第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病的部位。
2.根据权利要求1所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一和/或第二组合物的减毒活菌是革兰氏阴性菌，优选地，其中所述减毒活菌是沙门氏菌属。
3.根据权利要求1或2所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一和/或第二组合物的减毒活菌是肠炎沙门氏菌，优选地，其中所述减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌血清变型和/或肠炎鼠伤寒沙门氏菌血清变型。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物的减毒活菌和/或所述第二组合物的减毒活菌包括基因修饰的非天然细菌。
5.根据权利要求4中任一项所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述基因修饰的非天然细菌来源于沙门氏菌属，并且包括沙门氏菌毒力岛-2(SPI-2)基因中的减毒突变和/或第二基因中的减毒突变；优选地，所述基因修饰的非天然细菌来源于沙门氏菌属，并且包括沙门氏菌毒力岛-2(SPI-2)基因中的减毒突变和第二基因中的减毒突变。
6.根据权利要求5所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述SPI-2基因是ssaV基因，所述第二基因是aro基因。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述肿瘤疾病是实体癌和/或血液学恶性肿瘤。
8.根据权利要求7所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述实体癌和/或血液学恶性肿瘤是选自以下的癌症：前列腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、脑癌、间皮瘤、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、癌、头颈癌、皮肤癌或肉瘤，优选地，其中所述肿瘤疾病与选自膀胱癌、肺癌、间皮瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、头颈癌或乳腺癌的癌症相关，更优选地，其中所述肿瘤疾病与选自膀胱癌或结直肠癌的癌症相关。
9.根据权利要求7或8所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述肿瘤疾病是膀胱癌，优选地，其中所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌或肌层浸润性膀胱癌。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第二组合物通过局部灌注、腹膜内、胸膜内、膀胱内、瘤周注射或肿瘤内注射给药。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物是疫苗。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物的减毒活菌在第二组合物的减毒活菌之前给药于所述受试者。
13.根据权利要求1至12所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一和/或第二组合物的减毒活菌与免疫疗法、放射疗法、化学疗法或抗癌剂联合给药，优选地，其中所述免疫疗法包括检查点抑制剂、抗原特异性T细胞、过继性T细胞疗法、治疗性抗体、癌症疫苗或任何其他工程化细胞免疫疗法。
14.根据权利要求1至13所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物的减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌，并且所述第二组合物的减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌。
15.根据权利要求14所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物的减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌血清变型ZH9，并且所述第二组合物的减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌血清变型ZH9。
16.根据权利要求1至13所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物的减毒活菌是肠炎鼠伤寒沙门氏菌血清变型，并且所述第二组合物的减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌血清变型。
17.根据权利要求16所述的用于所述用途的减毒活菌，其中所述第一组合物的减毒活菌是肠炎鼠伤寒沙门氏菌血清变型MD58，并且所述第二组合物的减毒活菌是肠炎伤寒沙门氏菌血清变型ZH9。
18.一种治疗、抑制、预防复发或控制受试者的肿瘤疾病的方法，其中所述方法包括同时、单独或依次给药于所述受试者，(i)包含减毒活菌的第一组合物和(ii)包含减毒活菌的第二组合物，所述细菌与第一组合物的细菌相同或不同；
其中，所述第一组合物被配制用于口服、静脉内、鼻内、皮内或皮下递送以刺激受试者的全身免疫应答，并且用于与所述第二组合物同时、单独或依次给药；和
其中，所述第二组合物用于局部给药于肿瘤疾病的部位。
19.根据权利要求18所述的治疗、抑制或控制受试者的肿瘤疾病的方法，其中所述方法包括根据权利要求1至17所述的用于所述用途的减毒活菌。
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