KR20220084052A - 치료제로서의 gne - Google Patents

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다니엘 다비쉬
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Abstract

본 발명은 살아있는 유기체에서 UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제 효소(GNE)를 발현하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 조성물의 사용을 포함하는 질환 상태의 치료에 관한 것이다.

Description

치료제로서의 GNE
본 발명은 GNE 근육병증과 같은 시알산 생합성과 관련된 질병에 대한 약제학적 치료제 분야에 관한 것이다.
유전성 봉입체 근육병증(HIBM)은 심각한 신체적 무능력을 유발하는 젊은 성인 발병 진행성 골격근 소모 장애이다. 현재 HIBM에 대한 효과적인 치료법은 없다. HIBM은 GNE 유전자의 돌연변이로 인한 상염색체 열성 질환이다. GNE 유전자는 이기능성 효소 UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제(GNE/MNK)를 인코딩한다. 이것은 세포 시알산 생산의 처음 두 반응을 촉매하는 핵심 속도 제한 효소이다. 감소된 시알산 생성은 결과적으로 알파-디스트로글리칸(α-DG), 신경 세포 부착 분자(NCAM) 또는 네프릴리신과 같은 중요한 근육 단백질을 비롯한 다양한 당단백질의 시알화 감소로 이어지거나 강글리오사이드(예: GM3) 합성효소와 같은 다른 유전자의 발현 변경으로 이어진다. 이것은 차례로 근육 퇴행으로 이어진다. HIBM은 테두리 액포가 있는 원위 근육병증, 노나카 근육병증, 대퇴사두근을 보존하는 액포 근육병증, 봉입체 근육병증 2형(IBM2 또는 HIBM2), 또는 GNE 근육병증으로도 알려져 있다.
본 명세서에서 GNE 펩티드 또는 이의 치료학적 활성 단편에 대해 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 아미노산 작제물(들)을 세포 내로 전달하는 것을 손상시키는 대상체의 세포에서 UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제 효소(GNE) 펩티드를 발현시키는 방법이 개시되며, 여기서 서열 또는 서열들이 본 발명에 기술되어 있고, 대상체의 세포 내로 전달시 작제물은 세포 시알산 함량 및/또는 농도를 증가시키거나 변경시킨다.
또한, 다음을 포함하는 치료학적 생성물을 전달하는 방법이 개시된다: a) 대상체의 사지에 정맥내 접근을 생성하는 단계; b) 정맥내 접근 지점보다 대상체의 몸통에 더 가까운 지점에 지혈대 또는 혈관 폐색을 적용하는 단계; c) 단일 또는 다중 용량의 치료학적 조성물을 정맥내 접근을 통해 사지로 도입하는 단계로서, 여기서 조성물은 조성물의 혈관외유출을 위한 혈관내 압력을 증가시키기에 충분한 부피이고; 여기서, 조성물은 GNE 효소 또는 이의 치료 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 단백질(또는 펩티드 또는 폴리펩티드) 분자(들)를 포함하고, 여기서 이러한 분자의 예시적인 서열(들)은 본 발명에서 설명된다.
추가로, 하나 이상의 GNE 펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 핵산 또는 아미노산 서열을 적어도 포함하는 작제물로 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, 세포에서 GNE 펩티드를 전달 또는 생성함으로써 시알산 생합성을 증가시키는 방법이 개시된다. 여기서 GNE 펩티드는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에서는 시알산 생합성의 핵심 효소(UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라제/N-아세틸만노사민 키나제, GNE)의 DNA 코딩 영역을 전달함으로써 생물학적 시스템에서 시알산의 생산을 증가시키기 위한 유전자 치료 방법 및 조성물을 개시한다. 증가된 세포 시알산 생성 또는 향상된 GNE 기능의 이점을 얻을 질병 상태에는 GNE 근육병증, 유전성 봉입체 근육병증(HIBM) 또는 테두리 액포가 있는 원위 근육병증(DMRV)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
도 1은 본 명세서에 기재된 H002-GNE 발현 벡터의 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 본 명세서에 기재된 H002M-GNE 발현 벡터의 다이어그램을 나타낸다.
도 3은 GNE 이소폼 및 알로스테릭 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 시알산 생합성에 대한 알로스테릭 도메인 R266Q 변이의 효과를 나타낸다.
도 5는 동물 대상체의 처리된 근육군에서 정량적 실시간 PCR에 의한 약물 벡터의 막대 그래프를 나타낸다.
도 6은 동물 대상체에서 치료 전후의 혈장 시알산 농도의 상대적 백분율 변화의 막대 그래프를 나타낸다.
도 7은 위약 대조군(그룹 1) 및 처리된(그룹 2) 동물 대상체에서의 약물 벡터 존재의 정량적 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
본 명세서에서는 시알산 생합성의 핵심 효소(UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라제/N-아세틸만노사민 키나제, GNE)의 DNA 코딩 영역을 전달함으로써 생물학적 시스템에서 시알산의 생산을 증가시키기 위한 유전자 치료 방법 및 조성물을 개시한다. 증가된 세포 시알산 생성 또는 향상된 GNE 기능의 이점을 얻을 질병 상태에는 GNE 근육병증, 유전성 봉입체 근육병증(HIBM) 또는 테두리 액포가 있는 원위 근육병증(DMRV)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 방법 및 조성물은 또한 인간 세포 또는 조직으로부터 비인간 시알산(예: N-글리콜릴뉴라미네이트, Neu5Gc)을 감소시키거나 제거하는 것과 관련된다. 비-인간 시알산은 다양한 인간 질병에 기여할 수 있으며, 비인간 시알산의 세포 수준의 장기간 감소는 이러한 질병 과정을 예방 및 치료하는 데 유익한 것으로 입증될 수 있다(WO/2010/030666)(Varki 2009). 아세틸뉴라미네이트(Neu5Ac)의 세포 생산 증가는 비인간 시알산의 세포 함량을 감소시킬 수 있다.
HBM에 의해 개인적으로 영향을 받은 본 발명자는 수년에 걸쳐 시험관 내 연구를 통해 여러 유전자 치료 벡터를 개발하고 검증하였다. 다년간의 의학 연구와 다양한 생체 내 전달 방법 및 벡터에 대한 데이터 평가를 통해 "Bier Block"으로 알려진 절차와 유사하고 우아하고 쉬운 전달 방법(투여 경로, ROA)이 선택되었다. Bier Block은 100년 넘게 의료 현장에서 안전하게 사용되어 왔다(dos Reis 2008). ROA는 투여된 유전자 요법 조성물의 개선된 형질감염 효능의 추가 이점과 함께 이전에 기술되지 않은 특정 변형을 사용하여 발명가에 의해 수정되었다.
아래에 설명된 바와 같이, 특정 질병 과정, 벡터 및 (투여 경로의 조합은 현재까지 설명된 다른 어떤 경로보다 많은 이점이 있다. 이러한 장점을 통해 실제 의료용(인간 피험자) 및 수의학적 사용(동물 피험자)으로 쉽게 번역할 수 있다. 본 명세서에 기재된 벡터는 생물학적 유기체에서 비의학적 용도로도 사용될 수 있다.
여기에는 약리학적 제품의 성분과 동물 또는 인간 환자(예: HIBM에 걸린 환자)의 골격근 또는 기타 기관(예: 간)에 약리학적 제품을 전달하는 방법이 개시되어 있다. 약리학적 제품은 GNE 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 비변형 또는 변형된 형태, 및/또는 GNE 뉴클레오티드의 비변형 또는 변형된 형태에 의해 암호화되는 재조합 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 방법은 (1) 표적 기관 시스템, 기관/조직 그룹 또는 신체 영역의 혈관 분리를 달성하기 위한 주요 혈관(동맥, 정맥 및/또는 림프계)의 외부 또는 내부 폐색, 및 (2) 혈관(예를 들어, 정맥내) 접근을 이용한 치료 조성물의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 신체 기관/조직/영역(표적 기관)은 투여되는 조성물에 노출되는 반면, 다른 실시양태에서 신체 기관/조직/영역은 조성물에 대한 노출로부터 보호된다.
치료 유전자(GNE)의 설명 및 개선
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 치료 제품 또는 조성물은 폴리뉴클레오티드(DNA) 분자인 반면, 다른 실시양태에서는 폴리펩티드(단백질, 단백질 단편, 아미노산 서열, 펩티드, 폴리펩티드) 분자이다. 일부 실시양태에서, 선형 또는 원형의 폴리뉴클레오타이드 분자는 GNE 단백질, 또는 GNE 단백질의 변형된 형태, 또는 이들 중 하나의 치료 단편 펩티드, 즉, 생물학적 시스템 내에서 생물학적으로 활성이 되는 이들을 암호화하는 코딩 서열 외에 다양한 요소를 함유할 수 있다.
GNE 단백질의 이러한 변형된 형태 또는 단편은 본 명세서에 기재된 아미노산 서열, 또는 예를 들어 도 3에 기재된 이의 생물학적 활성 도메인 또는 단편, 또는 본 명세서에 개시된 서열과 상당한 유사성을 보유할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 치료 방법은 일반적으로 "유전자 요법"으로 알려져 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 분자의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 치료 방법은 일반적으로 "효소 대체 요법(ERT)"으로 알려져 있고, GNE 단백질, 또는 GNE 단백질의 변형된 형태, 또는 이의 단편, 즉, 또는 생물학적 시스템 내에서 활성이 되는 이들의 투여를 포함한다.
GNE 유전자는 시알산 생산의 핵심 효소(UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라제/N-아세틸만노사민 키나제 또는 GNE 효소)를 암호화한다. 몇 가지 질병 상태는 GNE의 증가된 발현으로부터 이익을 얻을 수 있다. 가장 주목할만한 것은 GNE 근육병증, 유전성 봉입체 근육병증(HIBM), 또는 IBM2 또는 HIBM2로 알려진 독특한 형태 중 하나, 또는 테두리 액포가 있는 원위 근육병증(DMRV)으로 알려진 심각하게 쇠약해지는 진행성 근육 소모 장애이다.
GNE 효소 성분 또는 도메인(예: 10개 이상의 순차적 아미노산 시리즈)은 GNE 유전자의 원하는 기능을 향상시키고 원하지 않는 기능을 감소 또는 제거하기 위해 재조합될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 유기체에서 다량의 시알산(NeuAc) 생산이 필요한 경우 GNE 유전자의 에피머라제 도메인을 최적화하여 알로스테릭 억제 도메인 기능을 제거하거나 감소시킬 수 있다. ManNAc의 인산화를 효율적으로 수행할 수 있는 다른 효소와 같이 과잉 ManNAc 키나제 활성을 갖는 유기체 및 동물에서, GNE 키나제 도메인을 감소 또는 제거하여 생물학적 시스템에서 크기, 최소 유효 용량 및/또는 최대 허용 용량을 줄일 수 있다.
GNE 효소, 또는 이의 다양한 성분 또는 도메인이 시알산 생산 외에 세포 기능을 갖는 것으로 알려져 있지만(Hinderlich, Salama et al. 2004; Broccolini, Gliubizzi et al. 2005; Krause, Hinderlich et al. 2005; Salama , Hinderlich et al. 2005, Penner, Mantey et al. 2006, Wang, Sun et al. 2006, Amsili, Shlomai et al. 2007, Amsili, Zer et al. 2008, Kontou, Weidemann et al. et al. 2009; Paccalet, Coulombe et al. 2010), 중요한 세포 분자의 과소시알화는 인간 질병 과정에서 중요한 역할을 한다(Huizing, Rakocevic et al. 2004; Noguchi, Keira et al. 2004; Saito, Tomimitsu et al. 2004, Tajima, Uyama et al. 2005, Ricci, Broccolini et al. 2006, Galeano, Klootwijk et al. 2007, Sparks, Rakocevic et al. 2007, Nemunaitis, Maples et al. 2010).
경구 시알산 임상 시험: 6g/일(2g TID)에서 시알산 연장 방출(아세뉴라믹산 연장 방출, Ace-ER)을 사용한 경구 약물의 임상 3상 위약 대조 시험이 2017년에 완료되었다(Clinicaltrials.gov 프로토콜 NCT02377921). 경구용 시알산 치료제 개발은 충분한 효능 입증 부족으로 제약사 후원으로 중단됐다. 효능 부족은 골격근에 충분한 시알산을 전달할 수 없기 때문에 발생하였다고 믿어진다. 2상 시험에서 12g/일의 고용량은 효능의 감지 가능한 개선 없이 더 높은 위장 부작용을 초래하였다(Clinicaltrials.gov 프로토콜 NCT01830972).
경구 ManNAc 임상 시험: N-아세틸만노사민(ManNAc)을 6g/일(3g BID) 및 12g/일(6g BID) 용량으로 사용한 경구 약물의 임상 2상 공개 라벨 시험이 현재 2017-2018년에 진행 중이다(Clinicaltrials.gov 프로토콜 NCT02346461). 결과는 아직 발표되지 않았다. ManNAc 경구 투여는 골격근의 시알산 함량을 증가시키는 데 있어 경구 Ace-ER보다 훨씬 좋지 않을 수 있다는 것이 당업자에 의해 가장 잘 알려져 있다.
따라서, ManNAc 제품의 시알산을 경구 투여하는 것보다 더 효율적으로 골격근 시알산 함량을 증가시킬 수 있는 약리학적 제품의 개발이 크게 필요하다.
NeuAc 및 NeuGc 시알산의 유형: 생물학적 시스템에서 시알산 및 NeuAc/NeuGc 비율을 증가시키는 것은 인간 대상체에서 알려진 몇 가지 이유로 필요하다. 포유동물은 (1) N-아세틸뉴라민산(NANA 또는 Neu5Ac) 및 (2) N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc)의 두 가지 다른 시알산 분자를 생성한다. CMP-NANA는 CMP-NANA 수산화효소(CMAH)에 의해 CMP-Neu5Gc로 전환된다. 다른 영장류 및 포유동물(소 포함)과 달리 인간은 CMAH의 Alu 매개 불활성화 돌연변이로 인해 Neu5Gc가 유전적으로 결핍되어 있다(Chou, Hayakawa et al. 2002). 따라서 Neu5Ac는 인간이 생산하는 유일한 시알산이며 많은 인간이 Neu5Gc에 대한 항체를 생산한다(Tangvoranuntakul, Gagneux et al. 2003). 인간 조직 및 세포에서 발견되는 NeuGc는 식품 또는 세포 배양 배지에서 유래하는 것으로 여겨진다. 인간은 NeuGc에 대한 항체를 생산하여 잠재적으로 만성 염증 및 만성 염증이 중요한 요인으로 여겨지는 다양한 일반적인 질환(예: 암, 죽상동맥경화증, 자가면역 장애)에 기여한다(Hedlund, Padler-Karavani et al. 2008; Varki 2009). NeuGc는 또한 용혈성 요독 증후군(HUS)과 같은 인간 질병을 촉진할 수 있다. HUS의 주요 원인은 시가 독성 대장균(STEC) 감염이다. 고독성 시가 독소 서브틸라제 세포독소(SubAB)는 NeuGc에서 종결되는 글리칸에 대한 결합을 선호한다(Lofling, Paton et al. 2009). 이 정보는 NeuGc가 일부 감염원에 대한 인간의 감수성을 증가시킬 수 있다는 우려를 증가시킨다.
따라서, 식품에서 NeuAc(인간 시알산)의 함량을 증가시키고 육류 및 유제품에서 발견되는 NeuGc의 비율을 감소시키는 것이 요망된다. 이를 달성하기 위한 잠재적으로 효과적인 방법은 인간 또는 동물 식품(예: 우유, 육류, 유제품 및 기타 동물성 제품)으로 사용되는 생물학적 시스템 또는 유기체에서 GNE 발현을 증가시키고 CMAH 발현을 감소 또는 제거하는 것이다. CMAH는 유전적 또는 대사적 기술에 의해 감소될 수 있으며, 이는 CMAH 녹아웃 또는 녹다운 동물을 생산하기 위한 동물의 유전적 변형, 폴리뉴클레오티드 기술(억제 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 표현됨)에 의한 CMAH 효소 발현 감소, 또는 대사 기질 유사체에 의한 CMAH 효소 억제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. NeuGc는 또한 NeuGc를 NeuAc로 전환시키는 효소의 과발현에 의해 생물학적 시스템에서 감소될 수 있다.
몇 가지 예외를 제외하고 식물은 일반적으로 시알산을 생산하지 않는다. GNE 및 기타 시알산 경로 효소는 식물, 채소 및 과일 작물에서 식품의 시알산을 증가시키는 데 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 요소(예: 프로모터, 인핸서, 반복 요소)의 변형, 추가 및/또는 제거를 사용하여 다양한 조직/기관 또는 발달 단계에서 발현을 향상시킬 수 있으며, 이는 약리학, 식품 및 화장품 산업을 포함하나 이에 제한되지 않는 생명공학의 다양한 분야에서 요구될 수 있다.
개시된 발현 벡터 요소는 도 1 및 도 2에 도시되어 있다. 개시된 벡터 크기 및 특징 요소는 코딩된 GNE 효소의 생체내 발현을 상당히 개선한다. 벡터는 최소의 원핵생물 또는 박테리아 게놈 서열을 포함한다. 벡터는 높은 포유동물 세포 발현을 지시하는 키메라 CMV 프로모터(도 1) 또는 MCK와 같은 조직 특이적 프로모터(도 2)를 포함한다. 키메라 CMV 프로모터는 강력한 CMV 프로모터와 엑손 1의 시작, 5' 스플라이스 수용체 부위를 포함하는 HTLV-IR 서열, 토끼 β 글로빈 인트론을 기반으로 하는 합성 3' 수용체 부위, 그리고 세린-아르기닌이 풍부한(SR) 단백질 결합 부위(GAAGAAGAC의 3개 사본)로 구성된 엑손 2 스플라이싱 인핸서를 포함하여, RNA 내보내기를 개선한다(Lavigueur et al. 1993). 벡터는 또한 GNE에 대한 시작 코돈의 상류에 엑손 2 코작 서열을 포함한다. CMV 프로모터의 하류에 있는 HTLV-1R 영역의 사용은 CMV 프로모터 기반 벡터와 비교하여 마우스 및 비인간 영장류에서 발현 및 암호화된 단백질을 증가시킨다(Barouch et al. 2005). 다른 요소에는 합성 진핵생물 mRNA 리더와 폴리A 서열이 벡터에 포함되어 있어 인간 또는 동물 게놈과의 DNA 서열 상동성을 추가로 제한하여 숙주 염색체에 영구적인 통합 가능성을 감소시킨다. 벡터는 또한 공통 Kozak 번역 개시 서열 및 ATG 시작 코돈을 인코딩한다. 벡터는 염색체 역선택 마커(SacB)의 발현을 녹다운하는 150bp 안티센스 RNA(RNA-OUT)를 발현하는 무항생제 자당 선택 마커를 포함한다(Luke et al., 2009). SacB는 자당이 있을 때 독성이 있는 레반수크라제를 암호화한다. 따라서, 플라스미드 선택은 자당 함유 배지에서 이루어지며 항생제를 사용하지 않고 벡터 제품의 제조 및 규모 확대가 가능한다. 추가로, 설명된 벡터는 최대 2.4g/L의 pDNA 발효 수율로 벡터 생산물의 고수율 제조를 가능하게 하는 생산적인 열 유도성 미니-기점 복제를 포함한다. 벡터 요소 및 기능은 DNA 백신 벡터 구성(FDA 2007)에 관한 미국 식품의약국(FDA) 규제 지침을 준수하도록 설계되었다.
골격근은 쉽게 접근할 수 있고 혈관이 많은 중요한 조직이기 때문에 치료적 가치가 있는 단백질을 생산하는 공장으로 사용될 수 있다((Lu, Bou-Gharios et al. 2003; Ratanamart and Shaw 2006)에서 검토). 실제로, 기능성 치료 단백질은 골격근에 의해 합성될 수 있고 혈우병, 폼페병, 파브리병, 빈혈, 폐기종 및 가족성 고콜레스테롤혈증과 같은 장애와 관련된 병리를 완화하기에 충분한 양으로 혈액 순환으로 분비될 수 있음이 입증되었다. 골격근에서 재조합 단백질을 발현하는 능력은 또한 Duchenne 및 사지 거들 근이영양증과 같은 신경근 장애의 치료에 중요한 문제이다. 이러한 장애는 필수 근육 단백질을 생성하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 그러한 장애에 대한 한 가지 잠재적인 치료법은 돌연변이된 유전자의 정상적이고 기능적인 사본을 근육에 도입하는 것을 목적으로 하는 유전자 전달이다.
따라서, 한 측면에서, 시알산을 과잉 생산 및 분비하기 위한 단백질 공장으로서 근육을 활용하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 혈장에서 Neu5Ac 생합성을 증가시키고 세포로부터 Neu5Gc 농도를 감소시킨다.
치료 제품의 설명 및 개선
일부 실시양태에서, 치료제는 폴리뉴클레오티드인 반면, 다른 실시양태에서 치료제는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단백질에 대한 전장 코딩 영역, 단백질의 도메인에 대한 코딩 영역, 또는 단백질 단편에 대한 코딩 영역을 포함할 수 있는 DNA 분자이며, 이는 단백질의 인식 및 확인된 도메인보다 짧다. 따라서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 길이가 적어도 15개 염기쌍의 올리고머에서 단백질에 대한 전장 코딩 영역을 포함하는 DNA 분자에 이르기까지 다양할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 전장 단백질, 예를 들어 효소 또는 수용체인 반면, 다른 실시양태에서 폴리펩티드는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 단백질 단편은 전장 단백질의 인식 및 확인된 도메인에 상응하는 반면, 다른 실시양태에서 폴리펩티드는 단백질의 인식 및 확인된 도메인보다 더 짧다. 따라서, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드는 길이가 5개 이상의 아미노산의 올리고머에서 전장 단백질까지의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 단편은 치료 활성 단백질 단편이다. "치료학적으로 활성인 단백질 단편"은 생리학적 조건에서 단백질 단편이 야생형 GNE 단백질과 동일한 생화학적 활성(예: 동일한 반응 또는 반응을 촉매함)을 갖지만 다른 속도로 기능을 수행할 수 있음을 의미한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 분자인 반면, 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 원형 DNA 분자이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 원하는 생물학적 시스템에서 GNE 유전자를 발현할 수 있는 원형 DNA(플라스미드, 미니-플라스미드, 미니서클)이다. 본 출원에 기술된 벡터는 크기 감소, 박테리아 서열 함량 감소, 무항생제 선택, 그리고 세포 형질도입 및 발현 개선을 포함하는 이점이 거의 없다. 당업자에게 공지된 다른 유사한 벡터가 또한 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 선형이든 원형이든, 폴리뉴클레오티드 치료 제품은 네이키드 DNA로서 투여되거나, 다른 분자와 조합되어 다양한 양이온성 또는 음이온성 입자를 생성하거나, 다른 약리학적 제제(예: 부형제, 혈관 확장제, 진통제 등)와 함께 공동 투여되거어 치료의 효과를 극대화하고 환자의 불편함을 최소화한다. 폴리뉴클레오티드 대신에 명시된 전달 또는 ROA를 사용하여 다른 약리학적 제품을 투여할 수 있다.
순 양성 제타 전위가 폴리뉴클레오티드의 보다 효율적인 세포 진입인 시험관내 연구와 달리, 골격근의 생체내 형질도입은 순 음전하를 갖는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 더 효율적인 것으로 보인다(PCT WO/2004/062368).
한 구체예에서, 근육 특이적 프로모터는 이식유전자에 대한 숙주 면역 반응의 기회를 감소시키고 이식유전자의 근육내 발현의 지속시간을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 골격 플라스미드 요소는 근육 특이적 발현을 허용하도록 변경될 수 있다. 골격근에서 유전자 전달 후 높은 수준의 장기간 재조합 단백질 발현을 달성하는 능력은 많은 질병 상태에서 요구된다. 이것은 근육에 특정한 프로모터와 인핸서를 사용하여 달성할 수 있다.
몇 가지 다른 근육 특이적 프로모터가 지금까지 설명되었다. 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터 및 절단된 버전은 사용되는 가장 일반적인 근육 특이적 프로모터이다(Hauser, Robinson et al. 2000; Yuasa, Sakamoto et al. 2002; Sun, Zhang et al. 2005; Sebestyen, Hegge et al. 2007; Wang, Li et al. 2008). 합성 C5-12 프로모터 및 유사한 프로모터는 이식유전자의 높은 발현을 유도하면서 근육 특이적이라는 약속을 보여준다(Li, Eastman et al. 1999). 이 C5-12 프로모터는 AAV 벡터의 유비쿼터스 CMV 프로모터와 유사한 발현 수준을 유도한다(Gonin, Arandel et al. 2005). C5-12는 MCK 인핸서(E-Syn 프로모터)를 첨가하여 추가로 개선할 수 있다(Wang, Li et al. 2008). 하이브리드-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7) 프로모터도 근육에서 높은 발현을 위해 사용되었다(Salva, Himeda et al. 2007). 데스민 프로모터는 또한 최근에 근육 세포에서 높은 수준의 발현을 할 수 있거나 유도할 수 있는 근육 특이적 프로모터로 설명된다(Pacak, Sakai et al. 2008; Talbot, Waddington et al. 2010). 트로포닌 유전자와 같은 유전자의 상류 인핸서 요소(USE, USEx3/ΔUSEx3)도 근육 특이적 프로모터를 개발하기 위한 유망한 후보이다(WO 2008124934 20081023; B lain, Zeng et al. 2010).
본 명세서에 개시된 바와 같이, GNE-암호화 서열 및/또는 이와 함께 사용되는 연관된 전달 비히클은 특정 세포 유형, 예를 들어 근육 세포, 근육 조직 등을 향해 표적화될 수 있다. 예를 들어, GNE 코딩 서열과 관련된 프로모터는 특정 조직 또는 발달 단계에서만 GNE를 발현하도록 만들 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 생물학적 혼합물 또는 특정 세포 유형에 결합하고 들어가도록 설계된 특정 생물학적 입자를 생성하기 위해 다른 분자, 화합물 또는 생물학적 모이어티(예: 단백질/탄수화물/지질 함유 분자, 부분 또는 전체 항체 분자, 부분 또는 전체 사이토카인 분자, 바이러스 캡시드)와 함께 패키징될 수 있다. 이러한 결합 또는 친화도는 DNA가 세포로 흡수되는 것을 촉진할 수 있다. 근육으로의 전달을 위해, 특히 음이온(최종 조성, ROA 또는 대상체의 살아있는 유기체와 관련된 pH에서 음의 순 분자 전하 또는 제타 전위를 가진), 비리포솜, DNA 함유 입자가 적합한다. 그러나 양이온성(최종 조성, ROA 또는 대상체의 살아있는 유기체와 관련된 pH에서 양의 순 분자 전하 또는 제타 전위를 가진), 리포솜 및 생물학적 혼합물 또는 입자를 함유하는 기타 DNA도 손상된 세포벽이 있는 근육병증으로의 흡수에 적합한다. 일부 실시양태에서, 모이어티를 표적화하는 이러한 단백질, 탄수화물 및/또는 지질 함유 분자는 미생물, 식물, 미생물 또는 합성 화합물(예를 들어, 항체, 사이토카인, 렉틴, 기타 큰 또는 작은 분자)이나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, GNE 핵산 번역은 증가된 GNE 활성 또는 시알산을 필요로 하는 표적 조직 또는 기관으로 제한될 수 있다. 음이온 또는 양이온 입자는 표적 조직(들), 질병 상태(들) 및 원하는 치료 결과(들)에 따라 보다 유리한 효능 및 안전성/독성 프로파일을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 생성물은 하기 요소를 포함한다: 1) 선택 및 성장 과정의 목적을 위해 박테리아에서 활성인 박테리아 제어 요소, 2) 치료 유전자 생성물 또는 재조합 단백질의 발현 목적을 위해 진핵 또는 포유동물 세포에서 활성인 진핵 제어 요소, 및 3) 치료 유전자 생성물 또는 재조합 유전자인 GNE 코딩 영역. 일부 실시양태에서, 원핵생물/박테리아 선택 마커는 항생제 내성(예: 카나마이신 내성), 또는 비항생제 또는 무항생제(본 명세서에 개시된 벡터에 존재하는 RNA-OUT)에 기초한다. 다른 구체예에서, 다른 요소는 효율적인 플라스미드 생산을 위해 사용된다(예를 들어, 본 명세서에 개시된 벡터에 묘사된 미니-기점). 추가 실시양태에서, 진핵생물 프로모터, 인핸서, 인트론 또는 기타 요소는 벡터에 의해 코딩되는 치료 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 효율적인 전사 및 번역을 위해 사용된다.
세계보건기구(WHO), 미국 식품의약국(FDA) 또는 유럽 의약품 평가청(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, EMEA)과 같은 규제 기관에서는 항생제 내성의 잠재적 확산을 최소화하기 위해 항생제 내성에 기반하지 않은 원핵생물 선별 마커를 선호한다(Williams, Carnes et al. 2009).
플라스미드 DNA를 사용하는 근거: 치료 유전자를 발현하기 위해 네이키드 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 임상적으로 사용하는 것은 GNE 근육병증, HIBM 또는 IBM2로 인한 근육 질환을 치료하기 위한 유망한 접근 방식이다. Naked DNA는 유전자 치료 비히클로서 우수한 안전성 기록을 가지고 있으며 동일한 피험자에 반복 투여하면 더 높은 발현 수준을 달성할 수 있다(Hagstrom, Hegge et al. 2004; Wolff, Lewis et al. 2005; Wolff, Budker et al. 2005; Herweijer and Wolff 2007; Braun 2008; Duan 2008; Zhang, Wooddell et al. 2009). ROA에 따라, 설치류나 영장류의 골격근에 전달된 pDNA는 근섬유에 유지되어 수개월 동안 암호화된 유전자 산물을 발현한다(Danko, Fritz et al. 1993; Danko, Williams et al. 1997; Sebestyen, Hegge et al. 2007). 세포성 또는 체액성 면역을 유도할 수 있는 AAV(Adeno-Associated Virus) 및 기타 바이러스 벡터와 달리(Yuasa, Yoshimura et al. 2007; Mingozzi, Meulenberg et al. 2009), pDNA는 일반적으로 벡터에 대한 면역 반응을 유도하지 않으며(Hagstrom , Hegge et al. 2004; Romero, Braun et al. 2004; Glover, Lipps et al. 2005; Wolff, Budker et al. 2005), 이는 동일한 대상체에서 반복 투여를 가능하게 한다. 또한, 바이러스 또는 기반 벡터에 비해 pDNA는 대량 생산에 비교적 저렴하고 수개월 동안 안정적으로 유지된다(Walther, Stein et al. 2003; Urthaler, Ascher et al. 2007; Voss 2007).
관리 경로(ROA). 전달의 설명 및 개선
전달 ROA(유체역학적 주입 또는 유체역학적 사지 정맥, HLV 주입)의 바람직한 실시양태는 주요 혈관(동맥, 정맥 및/또는 림프계)의 외부 또는 내부 폐색에 이어 약물 유체의 신속한 혈관내(정맥내 또는 동맥내) 주입을 포함한다. 유체역학적 주입의 한 실시양태에서, 외부 지혈대를 사람 또는 동물 대상체의 사지에 놓고, 치료 제품은 특정 시간 또는 체적 유량(일반적으로 1-5 ml/초)으로 특정 용적(일반적으로 지혈대 아래 또는 말단의 사지 용적의 30-50%)을 사용하여 말초 정맥내 접근을 사용하여 투여된다. 이것은 내부 중요 장기에 대한 노출을 줄이고 필요한 유효 용량을 줄이고 및/또는 마취제, 항생제 또는 화학요법제와 같은 약리학적 화합물의 원하는 효과/용량을 최대화하기 위해, 100년 이상 안전하고 효과적으로 사용되어 온 "정맥 국소 마취" 또는 "비어 차단"으로 알려진 일반적으로 사용되는 의료 절차와 유사한다. Bier Block은 팔 또는 손 수술에서 정맥 국소 마취(전신 마취의 필요성 제거)를 유도하는 데 사용되었다(dos Reis 2008; Vlassakov 및 Bhavani 2010). 유사한 방법이 특정 사지에 화학요법 화합물을 투여하기 위해 "격리 사지 주입(Isolated Limb Infusion)" 또는 "격리 사지 관류(Isolated Limb Perfusion)"라는 이름으로 종양학에서 사용되며, 이는 용량을 줄이고 내부 장기에 노출될 수 있다(Kroon and Thompson 2009). 사지에 지혈대를 대는 것은 심각한 외상 후 출혈을 줄이거나 노출 후 독소(예: 독사 및 기타 동물에게 물린 경우)에 대한 내부 장기의 노출을 줄이는 데 효과적으로 사용되었다.
동일하거나 매우 유사한 전달을 사용하여 유전자 요법 또는 생물학적 제제를 투여할 때 전달 방법은 "유체역학적(hydrodynamic)", "경정맥(transvenular)", "경정맥(transvenous)", "경혈관(transvascular)", "혈관(vascular)", "역행(retrograde)", "사지 정맥", "말초 정맥", "정맥내", "혈관내", "역행", "유출", "고압", "가압", "고립 사지", "혈관 격리", "혈관 폐색" , "혈류 폐색" 또는 이들의 조합을 비롯한 여러 이름으로 의학 문헌에 설명되어 있다(Su, Gopal et al. 2005; Sebestyen, Hegge et al. 2007; Vigen, Hegge et al. 2007; Zhang, Wooddell et al. 2009; Haurigot, Mingozzi et al. 2010; Hegge, Wooddell et al. 2010; Powers, Fan et al. 2010). 특정 우려에도 불구하고 개(canine)(dog) 연구(Haurigot, Mingozzi et al. 2010)에 따라 혈관 폐색 절차를 수행한 후 정맥염 후 증후군 또는 시술 후 혈관병증은 언급되지 않았다.
본 명세서에 개시된 일부 실시양태에서, 전달 방법이 개선되었다. 같은 부피의 사람과 동물의 사지는 다양한 비율의 근육과 비근육 조직(예: 지방 또는 흉터)으로 구성될 수 있다. 근육은 종종 혈관이 더 많고 지질이나 흉터 조직보다 더 많은 혈류가 필요하다. 따라서, 특정 부피를 사용하여 치료제를 투여하는 것은 개인의 사지에서 치료제의 최적 분포를 제공하지 않을 수 있다. 근육/비근육 조직이 더 높은 사지는 동일한 치료 효과를 얻기 위해 더 많은 주입량이 필요할 수 있다. 혈관내(또는 주입 라인) 압력 및 주입 기간을 기반으로 주입을 제어하면 표적 사지에 치료제의 개선된 분포를 전달할 수 있다. 본 발명에 기초하여, 하기 변형은 인간 대상체에서 임상적 사용을 위해 명백하지 않고, 보다 효과적이며, 보다 실용적이고, 합리적으로 안전한 방식으로 본 명세서에 기재된 "유체역학적 주입"에 의해 이 ROA를 개선한다:
1) 인간 환자의 경우 특정 압력의 지혈대를 325-450 mmHg에 배치한다. 이 압력 범위는 당업자에 의해 과도한 것으로 간주되며, 대부분의 연습 압력은 유사한 절차에 대해 140-325 mmHg 범위의 수축기 혈압보다 약간 높다.
2) 주입된 유체 조성물의 효과적인 역행성 혈관외유출을 위해, 정맥내 접근 부위는 사람 팔의 경우 손목 주위 또는 손등 쪽, 및/또는 사람 다리의 경우 발목 또는 발등 쪽 주위의 원위 정맥에 있어야 한다.
3) 일반적으로 지혈대 압력보다 낮은 특정 혈관 내(또는 주입 라인) 압력을 달성하기 위해 주입 유체 흐름의 급격한 증가(예: 지혈대 압력이 320 mmHg로 유지되는 경우 주입 라인 내강내 압력은 300-320 mmHg로 유지됨). 이러한 압력은 상대적으로 상당한 안전 문제로 인해 당업자에 의해 고려되지 않는다. 최근 간행물에서는 주입 라인 압력이 300 mmHg를 초과하지 않는 것으로 간주한다(Fan, et, al, 2015).
4) 주입액 유속 및/또는 유속 압력을 제어하여 주입 라인 압력을 유지함으로써 효과적인 혈관외유출이 달성된다. 이는 이전 간행물에서 당업자가 혈관 확장제 또는 혈관 확장제(예: 파파베린 또는 히스타민) 또는 기타 약물을 약리학적 조성물에 추가하여 조성물의 보다 효과적인 혈관외유출을 달성하는 것을 고려한다는 것을 보여주기 때문에 이는 당업자에게 명백하지 않다(Gruntman , et, al, 2015).
5) 특정 시간 동안 주입 라인 압력 유지(사람 팔의 경우 5-10분, 사람 다리의 경우 12-20분). 더 짧거나 더 긴 기간을 유지하는 것은 ROA의 효과를 크게 변경하지 않으며 임상적으로 부작용의 가능성을 불필요하게 증가시킬 수 있다. 이는 선행 임상 경험을 기반으로 하고 최근 관련 간행물(Fan, et. al., 2015)에 의해 명백하듯이, 숙련가는 제안된 혈관 폐색의 더 긴 기간 및 더 낮은 압력을 선택할 가능성이 높기 때문에 당업자에게 명백하지 않다.
6) 1과 2에서 설명한 매개변수를 안전하게 달성하기 위해 특별히 설계된 장치를 사용한다. 이러한 장치는 설정된 지혈대 압력에 따라 주입 라인의 유속과 압력을 자동으로 제어할 수 있다. 안전을 위해 이러한 장치는 주입 라인 압력의 급격한 강하, 주입 라인 내의 기포 또는 주입할 유체가 들어 있는 용기 내의 유체 레벨과 같은 매개변수가 감지되면 자동으로 주입을 중지한다(0 mL/초의 유속).
혈관 폐색 부위의 원위 또는 근위의 혈관 투여 부위를 선택함으로써 표적 기관, 조직 또는 신체 부위를 노출시키거나 보호할 수 있다.
ROA "유체역학적 주입(Hydrodynamic Infusion)" 전달 사용 근거: DNA 백신 접종 시험에 일반적으로 사용되지만 근육내(IM) 접근 방식으로 전달된 pDNA는 사지 또는 전신에 치료제를 전달해야 하는 근육 질환에는 비효율적이다(Jiao, Williams et al. 1992). 정맥 주사(IV) 플라스미드는 간에서 빠르게 제거된다(Liu, Shollenberger et al. 2007). 그러나, Bier Block, Hydrodynamic limb vein (HLV) 또는 Isolated Limb Infusion 전달과 유사한 ROA와 결합하여, 위에서 설명한 바와 같이 말단 사지 정맥에 정맥내(IV) 투여된 pDNA는 비인간 영장류를 비롯한 소형 및 대형 동물에서 전체 사지의 골격근을 효과적이고 균일하게 형질감염시킬 수 있다(Hagstrom, Hegge et al. 2004).
여기에 설명된 유체역학적 주입에 의한 이 ROA는 가역적인 미세혈관 손상을 일으킬 가능성이 있다(Toumi, Hegge et al. 2006; Vigen, Hegge et al. 2007). 단일 용량은 장기간 유전자 발현을 유발할 수 있으며, 반복 투여의 용이함은 유체역학적 주입에 의한 ROA를 인간 환자의 사지에 GNE 이식유전자를 전달하는 데 적합하게 만든다. 지혈대를 사용하여 팔이나 다리의 혈류를 일시적으로 차단하고 플라스미드 DNA 용액을 빠르게 정맥 주사한다. 이것은 폐색된 영역 내의 압력을 상승시켜 인접 근섬유로 유전자 비히클의 현저하게 효율적인 이동(또는 유출)을 유도한다. 혈류는 5-20분 내에 정상으로 회복되며 돌이킬 수 없거나 지속적인 부작용이 없다. 유사한 고압 정맥 주사 접근법이 채택되고 있으며 DNA 및 가능한 다른 잠재적인 치료 분자를 다양한 기관에 전달하기 위해 채택되고 있다(Al-Dosari, Knapp et al. 2005; Arruda, Stedman et al. 2005; Wolff, Lewis et al. 2005; Herweijer and Wolff 2007; Toromanoff, Cherel et al. 2008, Powers et al. 2010, Fan et al. 2015).
GNE 근육병증 또는 HIBM은 다음과 같은 이유로 유체역학적 주입에 의해 기재된 ROA를 사용하여 기재된 발현 벡터를 포함하는 의약품으로 치료할 이상적인 희귀 장애의 예이다:
낮은 GNE 발현은 치료적일 수 있다: GNE 유전자는 상대적으로 작아 골격근에서 낮은 수준으로 발현되는 단백질 효소로 기능한다. 적은 양의 야생형 발현 또는 매우 적은 양의 GNE 시알루리아 형태의 발현은 현저하게 효과적이거나 심지어 치유적임이 입증될 수 있다. 또한, GNE의 상대적으로 낮은 발현을 허용하는 과형성 형태의 GNE 유전자를 사용하여 상당한 치료 이점으로 해석하는 것이 가능하다. 이것은 기능적으로 의미 있는 치료 이점을 실현하기 위해 상대적으로 많은 양의 디스트로핀(또는 절단된 미니 디스트로핀)이 필요한 Duchenne' 또는 Becker 근이영양증과 같은 다른 근육 질환과 뚜렷한 대조를 이룬다. 또한, 의약 제조를 위해 과활성 또는 과형성 GNE, 또는 이의 제약상 허용되는 염, 또는 이들 중 어느 하나를 함유하는 제약 조성물의 사용은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체의 치료에 현저하게 효과적이고 안전할 것이다. 이러한 과형성 GNE는 폴리뉴클레오티드(예: DNA) 또는 폴리펩티드(예: 단백질 효소)의 형태일 수 있다.
사지 치료만으로도 충분하고 의미 있는 치료법이 될 수 있다: GNE 근육병증은 처음에 팔과 다리의 말단 근육에 영향을 미친다. 몸통 근육은 질병 경과의 후반부에 임상적으로 영향을 받는다. 심장과 폐를 포함한 생명 기관은 대부분의 환자에서 임상적으로 영향을 받지 않는다. 근육 퇴화를 중단하여 팔과 다리 기능을 안정화함으로써 환자(GNE 근육병증을 앓는 인간)는 삶의 질 향상과 독립 상실의 의미 있는 지연으로부터 이익을 얻을 수 있다. 환자는 더 오래 활동적이고 독립적인 상태를 유지할 수 있다.
이식유전자에 대한 숙주 면역 반응은 가능성이 낮다. 알려진 환자의 99% 이상이 야생형과 하나의 아미노산이 다른 GNE 단백질을 발현한다(미스센스 돌연변이). 또한, GNE는 아미노산 수준에서 생쥐와 남성 간에 98% 상동성을 갖는 진화적으로 보존된 효소이다. 따라서 숙주 면역 반응 또는 GNE 도입 유전자에 대한 중화 항체 생성 가능성은 최소화된다. GNE를 크레아틴 키나제(CK)와 같은 근육 특이적 프로모터와 결합하면 숙주 항체 반응의 기회가 추가로 감소한다(Fabre, Bigey et al. 2006). 또한, 유체역학적 주입의 ROA는 바람직하지 않은 숙주 면역 반응의 가능성을 더욱 감소시킨다(Toromanoff et. al.2010).
유익한 방관자 또는 원거리 효과에 대한 가능성: 근섬유 내에서 디스트로핀(대형 구조 단백질)의 발현이 주사 부위에만 도움이 되는 것으로 보이는 영양실조증과 달리, GNE 근육병증에서는 Neu5Ac(소분자, 9탄소당)가 근섬유의 제한적이거나 제한된 영역 내에 남아 있지 않을 가능성이 있다. 하나의 근섬유에 의해 생성된 Neu5Ac는 이웃하는 근섬유에 도움이 될 것이다. 다음 데이터는 이 가설을 추가로 뒷받침한다: (a) Sia 결핍 마우스 모델은 혈청에 존재하는 Neu5Ac를 사용할 수 있다(Malicdan, Noguchi et al. 2009) (b) 저시알화된 세포는 성장 배지에 ManNAc가 보충된 후 재시알화되었다(Schwarzkopf, Knobeloch et al. 2002) 및 (c) GlcNAc가 아닌 5mM ManNAc 또는 Neu5Ac를 배지에 추가하면 1차 DMRV(또는 GNE 근육병증) 섬유아세포 또는 근관의 시알산 함량이 대조군의 60-75%에서 정상 수준으로 회복되었다(Noguchi, Keira et al. 2004). 방관자 효과 및 원거리 효과 가능성은 단일 환자 시험에서 관찰되었다(Nemunaitis, Maples et al. 2010). 환자는 팔뚝의 GNE-리포플렉스 근육 주사(Extensor Carpi Radialis Longus, ECRL)를 받았다. 강도의 일시적인 증가, 재조합 GNE(rGNE) 발현 및 세포 표면 시알산의 증가가 주사 부위 및 인접한 구획 근육에서 관찰되었다. 원거리 근육 그룹(승모근 및 대퇴사두근)이 왼쪽 ECRL rGNE 이식유전자 발현 및 증가된 시알릴화와 관련하여 일시적으로 개선되었다는 놀라운 관찰에 따라 원거리 효과의 가능성도 제안되었다(Nemunaitis, Maples et al. 2010).
안전/독성학
이용 가능한 정보에 기초하여, 본 명세서에 개시된 벡터는 GNE 근육병증 환자에서 사용하기에 안전하고 효과적인 것으로 예상된다. 일반적으로 유전자 치료 매개체로서 음전하를 띤(음의 제타 전위) 플라스미드 DNA 벡터는 우수한 안전성 기록을 가지고 있다. AAV와 같은 대부분의 바이러스 벡터와 달리 유체역학적 주입 ROA에 의해 동일한 대상체에 전달된 플라스미드 DNA 벡터의 반복 투여는 더 높은 발현 수준을 달성할 수 있다(Hagstrom, Hegge et al. 2004; Wolff, Lewis et al. 2005; Wolff, Budker et al. 2005; Herweijer 및 Wolff 2007; Braun 2008; Duan 2008; Zhang, Wooddell et al. 2009).
GNE 플라스미드의 안전성: GNE-플라스미드를 사용한 설치류 독성 연구는 현재 진행 중이다. 예비 데이터는 네이키드 플라스미드가 이미 인간 환자에게 투여된 GNE-리포플렉스보다 훨씬 더 안전한 것으로 입증될 것임을 시사한다(Phadke, Jay et al. 2009; Nemunaitis, Maples et al. 2010). 우리는 최근 12마리의 마우스(균주 B6; FBV 혼합 근친 교배, 4-10개월령의 수컷 6마리와 암컷 6마리)에 대해 14일 기간의 사전 GLP 독성 연구를 수행하였다. 수컷과 암컷 마우스를 동등하고 무작위로 실험군과 대조군으로 나누었다. 실험군은 IV 꼬리를 통해 투여된 고용량 GNE 플라스미드(0.1m1 생리식염수에 현탁된 0.6mg)를 투여받았고, 대조군은 0.1mL 생리식염수만을 투여받았다. 그룹은 1) 14일 동안 매일 투여, 2) 격일 투여, 3) 주 1회 마우스 2마리(암컷 1마리, 수컷 1마리)의 3가지 투여 빈도 그룹으로 추가로 나누어졌다. 모든 동물은 실험에서 살아남았다. 체중, 온도, 음식 및 물 섭취량, CBC 혈액 검사(투약 1일차 및 부검 15일차에 수행)를 포함한 모든 측정 매개변수에 대해 실험군과 대조군 사이에 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 뇌, 폐, 심장, 간, 신장, 비장, 위, 내장, 방광, 생식기, 림프절 및 근육을 포함한 12개 기관에 대해 실험군과 대조군 사이에 육안적 병리학에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 1일 인간 등가 용량(HED)은 120mg 이었고, 최대 14일 총 HED는 1440mg 이었다..
개시된 GNE 발현 벡터의 안전성: 네이키드 플라스미드 GNE 벡터(순 음의 제타 전위를 가짐)와 비교하여, GNE-리포플렉스 형태는 훨씬 더 독성이 있다. 리포플렉스를 생성하기 위해 플라스미드 벡터를 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤(GNE-리포플렉스)로 구성된 양이온성 리포솜(순 양의 제타 전위 보유)에 캡슐화하였다. 일반적으로 당업자는 리포플렉스 입자에 대한 비교적 강한 순 양의 제타 전위가 효과적인 세포 형질도입을 위해 필요하다고 생각한다(Takeuch et. al. 1996). 벡터는 BALB/c 마우스에 주입되었고, GNE-리포플렉스의 단일 정맥내(IV) 주입은 100g(0.1mg) 용량에서 동물의 33%에서 치명적이었고, 40g 코호트에서 일시적인 독성을 나타내는 동물의 작은 비율이 있었다(Phadke, Jay et al. 2009). 2010 ASGCT 컨퍼런스(Phadke, Jay et al. 2010)에서 발표된 포스터를 기반으로, Balb/c 마우스에서 GNE-리포플렉스의 다중 주사 투여에 대한 최대 허용 용량은 (1) 주사당 20g(인간 등가 용량(HED) = 5.2 mg), 또는 (2) 80g의 누적 용량(HED = 20.8 mg) 이었다. 진행 중인 용량 증량 시험에서 환자는 1-3개월 간격으로 여러 차례 주입(0.4, 0.4, 1.0 mg)을 받았으며, 각 주입 후 12시간 이내에 일시적인 등급 1, 2 빈맥과 발열이 관찰되었다. 환자의 간 기능 검사도 일시적으로 상승된 것으로 보고되었지만, 정확한 수치는 초록에 보고되지 않았다(Nemunaitis, Jay et al. 2010).
유체역학적 주입에 의한 투여 경로(ROA)의 안전성: 유체역학적 전달 방법의 잠재적인 부작용은 현재 연구를 위해 제안된 두 배의 지혈대 압력에서 인간이 아닌 영장류에서 연구되었다. 절차는 비가역적이거나 오래 지속되는 부작용 없이 안전한 것으로 결정되었다(Vigen, Hegge et al. 2007; Hegge, Wooddell et al. 2010). ROA 시술은 100년 넘게 안전하고 효과적으로 사용되어 온 국소마취 및 외과적 항상성에 사용되는 Bier Block과 유사한다. 주된 차이점은 ROA 유체역학적 주입에서는 방혈이 필요하지 않으며, 유체역학적 사지 정맥(HLV) 주입에서는 절차 기간이 일반적으로 15분이라는 것이다(Hegge, Wooddell et al. 2010). 인간이 아닌 영장류에 대한 조직학적 연구에 따르면, HLV 절차는 일시적인 근육 부종을 유발했지만 심각한 근육 손상은 발생하지 않았다(Hagstrom, Hegge et al. 2004; Toumi, Hegge et al. 2006). 인간이 아닌 영장류의 T2 강조 MRI 이미지에서도 절차가 일시적인 근육 부종을 유발했지만 구획 증후군과 같은 지속적인 근육 교란은 없었음을 보여주었다(Vigen, Hegge et al. 2007). 인간이 아닌 영장류에서 자기공명 혈관조영술은 모세혈관 투과성에 대한 일시적인 효과와 일치하는 혈관 효과를 나타내었지만 우려되는 장기적 이상은 아니다(Vigen et al., 2007). 이러한 초기 연구는 본 발명에서 설명하는 것보다 훨씬 더 높은 지혈대 압력(700 mmHg)을 사용하여 수행되었다. 또한 이 연구에서는 사지 부피의 45-50% 주입 부피가 사용되었으며, 인간 피험자에 대해 주입/사지 부피를 40% 미만으로 수정하고 있다. 추가로, 본 명세서에 기재된 발현 벡터는 근육 세포벽의 감소된 완전성으로 인해 정상 근육보다 더 효과적으로 근병성 섬유에 들어가고, 따라서 감소된 압력 및 주입 부피를 정당화할 것이다.
요약하면, pDNA를 사용한 HLV 전달 방법은 비인간 영장류에서 효과적이고 안전한 것으로 입증된 성숙한 기술로 간주되며, 임상 치료 시험에서 테스트할 준비가 되었다(Wells 2004; Al-Dosari, Knapp et al. 2005; Herweijer 및 Wolff 2007). 유사한 투여 절차를 사용하여 근이영양증을 앓고 있는 성인 환자의 체적 확대 연구는 University of North Carolina, Chapel Hill에서 진행 중이다(Powers, Fan et al. 2010, Fan et. al. 2015). 이 접근 방식의 주요 단점은 주요 내부 혈관(예: 수술, 복강경 또는 경피 풍선 폐색)을 일시적으로 고정하는 침습적 방법 없이 횡격막, 심장 및 몸통/목 근육을 쉽게 형질감염시킬 수 없다는 것이다. 이 단점은 많은 근이영양증에 중요하지만, GNE 근육병증이나 HIBM에 영향을 받는 환자에게는 거의 중요하지 않다. 많은 HIBM 환자는 노년까지 살며, 그들의 심장과 폐는 Duchenne 근이영양증과 같은 다른 근육 소모 질병만큼 임상적으로 심각하게 영향을 받는 것으로 보고되지 않았다. 따라서, 사지 골격근에 GNE 이식유전자를 전달하기 위한 본 명세서에 기술된 발현 벡터의 HLV 전달은 신체적 독립성의 상실을 지연시킬 수 있고 많은 환자에게 상당한 희망을 제공할 수 있는 GNE 근육병증에 대한 매력적인 치료 옵션이다.
GNE-암호화 서열 및 관련 조성물은 임의의 통상적인 비독성 제약상 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제제의 pH는 제제화된 조성물 또는 이의 전달 형태의 안정성을 향상시키기 위해 제약상 허용되는 산, 염기 또는 완충제로 조정될 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유지성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 사용할 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매체로 사용된다. 이를 위해 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 부드러운 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 주사제의 제조에 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, Plasma-Lyte® 담체는 특히 비경구 주사를 위해 GNE-암호화 서열을 전달하기 위해 사용될 수 있다(Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, Illinois). Plasma-Lyte®는 정맥내 투여에 사용할 수 있는 멸균된 비발열성 등장액이다. 각 100mL 용량에는 526mg의 염화나트륨, USP(NaCl); 글루콘산나트륨(C6H11NaO7) 502mg; 368mg의 아세트산 나트륨 삼수화물, USP(C2H3NaO2^H2O); 37mg의 염화칼륨, USP(KCI); 및 30mg의 염화마그네슘, USP(MgCl2>>6H2O)이 포함되어 있다. 여기에 항균제는 포함되어 있지 않다. pH는 바람직하게는 수산화나트륨으로 약 7.4 (6.5 내지 8.0)로 조정된다.
본 발명의 발현 벡터를 전달하기 위해 사용되는 주사 가능한 제형은 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 멸균수, 사용 전 Plasma-Lyte® 또는 기타 멸균 주사 가능 매체에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다.
시스템 내에서 치료적 GNE 효소의 발현을 연장하기 위해(또는 이의 효과를 연장하기 위해), 피하 또는 근육내 주사로부터 조성물의 흡수를 늦추는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 수용성이 불량한 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성할 수 있다. 그 다음, 조성물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라질 수 있으며, 이는 차례로 결정 크기 및 결정 형태에 따라 달라질 수 있다.
대안적으로, 비경구 투여된 GNE-암호화 서열의 지연된 흡수는 오일 비히클에 조성물을 용해 또는 현탁시킴으로써 달성될 수 있다. 주사 가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체에서 발현 벡터의 마이크로캡슐 또는 마이크로캡슐화 매트릭스를 형성함으로써 제조될 수 있다. 중합체에 대한 발현 벡터 물질의 비율 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 발현 벡터 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 있다. 전술한 바와 같이, 데포 주사 가능한 제형은 또한 근육 조직과 같은 표적 신체 조직과 양립할 수 있는 리포솜(또는 심지어 마이크로에멀젼)에 발현 벡터를 포획함으로써 제조될 수 있다.
시스템에서 시알산의 생산을 조절하는 방법에 더하여, 본 발명은 시스템에서 GNE 효소를 발현시키는 방법을 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에 따르면, 시스템(예를 들어, 인간 환자의 근육 세포)은 변이를 갖는 GNE를 코딩하는 발현 벡터(예를 들어, GNE-R263Q)를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 예를 들어 돌연변이된 GNE-암호화 서열을 보유하는 세포 또는 근육 조직을 제공하는 것을 포함한다. GNE 암호화 서열은 예를 들어, 본 명세서에 기재된 발현 벡터를 사용하여 비경구 주사를 통해 이러한 시스템에 전달될 수 있다.
본 발명의 추가적인 관련 구현예에 따르면, 질병의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다. 이러한 방법은 일반적으로 치료적 유효량의 GNE-암호화 폴리뉴클레오티드 또는 유효량의 GNE 단백질(또는 폴리펩티드) 효소를 환자에게 제공하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, GNE 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 분자는 바람직하게는 나노입자 및 리포플렉스, 글리코플렉스, 리포솜, 글리코솜 또는 기타 나노입자(들)의 담체와 관련하여 환자에게 전달되고, 비경구 투여 경로용 조성물을 제형화하기 위한 Plasma-Lyte®와 같은 담체 또는 Advance로 제형화된다. 분명하지 않지만 유용한 실시양태에서, 조성물의 pH에서 약물 벡터 나노입자는 순 음의 제타 전위를 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제 효소(GNE)를 인코딩하는 적어도 폴리뉴클레오티드(DNA) 분자 또는 적어도 폴리펩티드 분자, 또는 이의 치료 활성 단백질 단편을 포함하는 약리학적 제품 또는 조성물이 제공되며, 여기서 상기 분자는 GNE의 알로스테릭 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이 또는 변이를 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 키나제 효소(GNE) 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 DNA 분자가 제공되며, 여기서 상기 분자는 GNE의 알로스테릭 도메인 내에서 적어도 하나의 돌연변이 또는 변이를 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, 증가된 시알산 생산으로부터 이익을 얻는 질병 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위해, 본 명세서에 기재된 서열(예를 들어, SEQ ID NO 1 또는 2)을 갖거나 본 명세서에 기재된 아미노산 서열(예를 들어, SEQ ID NO 3 내지 17 중 임의의 하나 이상)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 용도가 제공된다.
"치료학적으로 활성인 단편" 또는 "생물학적으로 활성인 단편"이라는 문구는 개선되거나 증가된 시알산 함량을 유도하고/하거나 검출 가능한 개선에 관계없이 질병 상태의 개선을 유도하는 방식으로 생물학적 시스템 또는 세포 내에서 활성 수준을 유지하는 단백질 또는 DNA 단편을 지칭한다. "치료학적 유효량"이라는 문구는 적절한 이익 대 위험 비율로 충분한 수준의 GNE 효소를 발현하거나 제공하기에, 표적 세포에서 시알산 생산을 증가시키기에, 및/또는 달리 치료, 예방 및/또는 환자의 질병 영향을 개선시키기에 충분한 양의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드(본 발명에 의해 개시됨)를 지칭한다. 그러나, 본 발명의 치료 및 관련 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다.
본 명세서에 기술된 방법의 장점 중 하나는 폴리뉴클레오티드가 전신 투여와 대조적으로 환부에 직접 투여되기 때문에 투여되는 치료학적 유효량이 이전에 기술된 방법보다 적다는 것이다. 따라서, 본 방법은 이전에 설명된 방법과 관련된 많은 부작용을 줄이거나 제거한다.
특정 환자에 대한 특정 치료 유효 용량 수준은 환자 장애의 중증도를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다: 사용된 특정 GNE-암호화 서열의 활성; 사용된 전달 비히클; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 사용된 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도; 치료 기간; 사용된 특정 GNE-인코딩 서열과 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 요인.
환자의 상태가 호전되면 필요한 경우 GNE-암호화 제품의 유지 용량을 투여할 수 있다. 후속적으로, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는 증상의 함수로서, 증상이 원하는 수준으로 완화되었을 때 개선된 상태가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 시스템에서 GNE를 발현하기 위한 신규 조성물이 제공된다. 조성물은 바람직하게는 GNE-암호화 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, GNE-암호화 핵산 서열은 프로모터, 종결 서열 등과 같은 다양한 전사 조절 요소를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 조성물의 비제한적인 예는 본 명세서에 기재된 발현 벡터를 포함한다(도 1 및 2). 따라서 본 발명의 다른 구체예와 관련하여 기술된 바와 같이, GNE-암호화 핵산 서열은 리포솜 또는 지질 나노입자와 같은 시스템으로의 전달을 위한 적절한 비히클 내에 배치되거나 이에 연결될 수 있다. 또한, 이러한 구현예에 따르면, 전달 비히클은 선택적으로 근육 세포 또는 근육 조직과 같은 표적 세포 또는 조직을 인식하고 이에 결합할 수 있는 제제로 장식될 수 있다.
실시예
실시예 1 - CHO-Lec3 세포에서 외인성 GNE의 발현
다음 예에서는 인간 cDNA에서 여러 GNE 발현 벡터를 생성하였다. 세 가지 다른 GNE 형태, 야생형, M712T 및 R266Q가 GNE 결핍 세포(Lec3 세포)에서 강력하게 발현되었다. 모든 효소는 별개의 효소 활성에도 불구하고 유사한 단백질 발현 수준을 나타내었다. 하기에서 알 수 있는 바와 같이, 형질감염된 GNE 발현 세포주는 형질감염되지 않은 세포보다 훨씬 더 많은 시알산을 생성하였다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 돌연변이를 유발하는 질환을 갖는 GNE 서열을 포함하는 발현 벡터(예를 들어, p. M712'T 또는 p. M743T)는 시알산 생산 또는 질병 치료에 사용하기 위해 적절한 효능과 안전성, 및 합리적인 위험 대비 이익을 제공할 것이다.
방법론
첫 번째 절차:
GNE 클로닝. GNE cDNA를 포함하는 모 벡터는 Daniel Darvish(HIBM Research Group, Encino, CA)에 의해 제공되었으며, 야생형의 GNE 클론, p. M712T 돌연변이, 및 p. R266Q(R266Q 돌연변이체)을 포함하였다. 본 명세서에 개시된 목적지 발현 벡터를 사용하였다. 서브클로닝 벡터인 pDrive(Qiagen, Valencia, CA)1을 사용하여 GNE 클론을 모 벡터에서 목적지인 대상 벡터로 셔틀하였다.
GNE cDNA 삽입물(야생형 및 M712T)은 환자 전혈에서 분리된 RNA의 역전사에 의해 생성되었다. R266Q 이소폼(isoform)은 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 표준 돌연변이유발 PCR 기술을 사용하여 생산되었다. 그런 다음 cDNA를 5' 꼬리에 필요한 효소 인식 부위를 포함하는 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 증폭한 다음, T4 결찰(Invitrogen)에 의해 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 이어서, 적격 E. coli 세포(Invitrogen)를 발현 벡터로 형질전환시켰다.
양성 GNE 클론(GNE 클론 삽입물을 포함하는 발현 벡터)을 2g 트립톤(또는 동물성 제품이 없는 대두 펩톤), lg 효모 추출물, H2O로 176mL 까지의 QS, 및 60mL의 50% 수크로스를 포함하는 6% 수크로스 선택 배지에서 37℃에서 E. Coli 숙주 박테리아에서 밤새 성장시켰다(0.2마이크론으로 필터 멸균). Qiagen(캘리포니아주 발렌시아) HiSpeed Plasmid Maxi 키트는 제조사 프로토콜에 따라 사용되었다. 대안으로는, 제조업체 프로토콜에 따라 SOC 매체를 사용할 수 있다.
세포 배양: GNE-결핍 CHO-Lec3 세포를 4mM L-글루타민 및 10% 열 불활성화, 소 태아 혈청이 보충된 -MEM 배지에서 5% CO2에서 37℃에서 성장시켰다. 일시적 형질감염을 위한 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 1x106개 세포로 플레이팅하고 밤새 성장시켰다. Lec3 세포는 계대당 2.5% 만큼 FBS를 감소시켜 감소된 혈청 상태로 이유하였다.
일시적 형질감염: Lec3 세포를 OptiMEM(Invitrogen, Carlsbad CA)에서 웰당 DNA:지질 복합체로 6시간 동안 형질감염시킨 다음, 배지를 정상 -MEM 성장 배지로 교체하고 세포를 밤새 배양하였다. DNA:지질 복합체는 제조사의 프로토콜에 따라 4㎍ DNA + 10 ㎕ 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 혼합하여 형성되었다. 형질감염 24시간 후, 세포를 트립신 소화에 의해 수확하고 후속 웨스턴 블롯 또는 효소/당 분석 전에 PBS로 1회 세척하였다.
시알산 정량: 티오바르비투르산 방법에 의한 막 결합 시알산의 정량을 위해 약 4 x 106 세포를 사용하였다. 세포를 물에 재현탁시키고 25 게이지 바늘을 통해 20회 통과시켜 용해시키고 원심분리하였다. 상청액을 브래드포드 단백질 추정에 사용하고 나머지 펠렛을 100 μL 2M 아세트산에 재현탁하고 800C에서 1시간 동안 인큐베이션하여 글리코컨쥬게이트 결합 시알산을 방출하였다. 137μL의 과요오드산 용액(57mM H2SO4 중 2.5 mg/ml)을 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 50μL의 아비산나트륨 용액(0.5M HCl 중 25 mg/ml)을 첨가하고 튜브를 황갈색이 완전히 제거되도록 세게 흔든다. 이 단계 후에, 100 μL의 2-티오바르비투르산 용액(NaOH를 사용하여 pH 9.0으로 조정된 71 mg/ml)을 첨가하고 샘플을 7.5분 동안 100℃로 가열하였다. 용액을 1 ml의 부탄올/5% 12M HCl로 추출하고 상을 원심분리에 의해 분리하였다. 유기상의 흡광도는 549 nm에서 측정되었다. 시알산의 양은 시알산 nmol/단백질 mg으로 측정하였다.
두 번째 절차:
다음 절차는 위에서 설명한 절차에 대한 대체 절차이다.
세포 배양 및 생물학적 분석 테스트: Lec3 CHO 세포를 초기에 10% 소태아혈청(FBS)을 함유하는 MEM 배지(Invitrogen)에서 성장시키고, 0% FBS가 될 때까지 2.5% 감소할 때까지 -MEM FBS 배지의 후속 계대를 받고, 형질전환 이전에 트립신 처리하였다. 4세트의 형질감염을 2.0 x 106 CHO 세포, 2.5mL의 Freestyle Media(Invitrogen), 500μL의 Opti-MEM(Invitrogen), 10μL의 리포펙타민(Invitrogen) 및 4μg의 DNA(벡터 세트가 없는 경우 제외함)를 사용하여 3중으로 준비하였고, 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 준비된 세트에는 GNE-야생형, GNE-M712T, GNE-R266Q, 빈 벡터 및 벡터 배지가 없는 발현 벡터가 포함되었다. 세포를 형질감염 48시간 후에 수집하고, PBS로 세척하고, 용해 완충액에 재현탁시켰다. 시알산 함량은 수정된 버전의 Leonard Warren 방법(Warren 1959)을 사용하여 검출하고 UBV-Vis 모듈을 사용하여 549 nm에서 NanoDrop-1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)로 측정하였다. 표준 곡선은 알려진 시알산 농도로 생성되었으며 흡광도와 시알산 농도 사이의 명확한 선형 연관성을 나타내었다.
GNE 클론: 테스트된 GNE cDNA 클론에는 인간 야생형 cDNA와 2개의 인간 돌연변이 cDNA가 포함되었다. 돌연변이체에는 M712T GNE 결핍 클론과 R266Q 시알루리아 클론이 포함되었다. 시알루리아는 GNE의 CMP-시알산 결합 부위의 점 돌연변이로 인해 피드백 억제 및 시알산의 대량 생산 손실로 이어지는 인간 질병이다. GNE cDNA는 제한 분해 클로닝에 의해 원래 벡터에서 발현 벡터로 서브클로닝되었다. GNE 삽입물이 올바른 방향에 있는지 확인하기 위해 방향성 제한 효소 분해에 의해 클론을 스크리닝하였다. 복제 과정 동안 돌연변이가 발생하지 않았는지 확인하기 위해 양성 클론을 두 방향으로 시퀀싱하였다. 생성된 크로마토그램을 GenBank(수탁 번호 NM_005467)의 GNE 서열과 비교했으며, 야생형은 돌연변이를 나타내지 않은 반면, M712T 및 R266Q 클론은 예상되는 점 돌연변이만 포함하였다. 양성 GNE 클론은 maxi prep 플라스미드 정제 절차를 사용하여 규모를 조정하고 돌연변이가 발생하지 않았는지 확인하기 위해 다시 시퀀싱하였다. 이 DNA 스톡은 모든 후속 실험에 사용되었다.
GNE mRNA 정량화: 세포를 10% 혈청에서 성장시키고 24시간 동안 일시적으로 형질감염시켜, 발현된 재조합 GNE RNA의 양을 정량화하였다. 총 RNA를 추출하고 RT-qPCR을 수행하여 외인성 GNE 전사체의 단편을 증폭하였다. 연속 희석액을 사용하여 형질감염된 Lec3 세포에서 발현된 GNE의 농도가 4.1 pg/㎕와 동일한지 확인하였다. qPCR의 동적 범위는 5 ng 내지 5 fg 였으며, 대조군(형질감염되지 않은) CHO-Lec3 세포에서는 GNE mRNA 산물이 검출되지 않았다(형질감염되지 않은 세포에 대한 cT 값은 42 주기보다 크고 5 fg 미만임). 따라서, 형질전환된 Lec3 세포에서 재조합 GNE mRNA 발현이 검출된 반면, 형질전환되지 않은 세포는 검출할 수 없는 양의 GNE mRNA를 가졌다.
시알산 분석: 형질감염된 Lec3 세포는 또한 세포 표면 시알산 발현에 대해 테스트되었다. 1.5-3.0배 더 많은 양이 있는 R266Q GNE로 형질감염된 Lec3 세포를 제외하고 모든 Lec3 샘플은 대략 6.0 nmol/mg 막 결합 시알산을 가졌다. R266Q GNE는 GNE의 피드백 억제가 부족하고 세포 내 시알산의 과잉 생산을 일으키는 것으로 알려져 있다. 야생형(wt)과 M712T GNE 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
GNE 벡터의 비교: 두 벡터의 시알산 생산을 비교하는 형질감염 연구는 서로 잘 연관되어 있다. 벡터가 작을수록 시알산의 생산이 상당히 더 높은 것으로 나타났다. 본 발명에 기술된 가장 작은 벡터는 우리가 개발하거나 테스트한 이전 벡터보다 훨씬 더 높은 시알산 생산을 보여주었다.
예비 고용량 플라스미드 독성: 우리는 12마리의 마우스(균주 B6; FBV 혼합 근친 교배, 4-10개월령의 수컷 6마리 및 암컷 6마리)에 대해 14일 기간의 사전 GLP 독성 연구를 수행하였다. 수컷과 암컷 마우스를 동등하고 무작위로 실험군과 대조군으로 나누었다. 마우스 모델에서 최대 가능 용량(MFD)은 주사당 600 μg 이었다. 제한은 플라스미드의 용해도(6 ㎍/㎕) 및 주사당 총 부피(100 μL)를 기반으로 하였다. 30g의 마우스 무게와 70kg의 인간 체중을 고려하면, 600 ㎍의 마우스 용량에 대한 인간 등가 용량(HED)은 113.82 mg이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실험군은 꼬리 정맥에 의한 Ⅳ를 통해 고용량 GNE 플라스미드(0.1ml 생리식염수에 현탁된 0.6mg)를 투여받았고, 대조군은 0.1ml 생리식염수를 받았다. 1) 14일 동안 매일 투여, 2) 격일 투여, 및 3) 주 1회로 마우스 2마리(암컷 1마리, 수컷 1마리)의 3가지 투여 빈도 군으로 그룹을 추가로 나누었다. 모든 동물은 실험에서 살아남았다. 체중, 체온, 음식 및 물 섭취, CBC 혈액 검사(1일 및 15일에 수행)를 포함한 모든 측정 매개변수에 대해 실험군과 대조군 사이에 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 15일째 부검 후, 뇌, 폐, 심장, 간, 신장, 비장, 위, 내장, 방광, 생식기, 림프절 및 근육을 포함한 12개 기관에 대해 실험군과 대조군 사이에 육안적 병리학에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
전임상 GLP 독성 및 생물 분포 연구
약리학 및 독성학, 두 동물 종의 안전성 연구: 우리는 미국 FDA의 사전 IND 회의 권장 사항에 따라 두 종에 대한 동물 연구를 수행하였다. 연구는 GLP 지침에 따라 수행되었다. 정맥 주사(마우스에서 2.5 mg/ml) 및 HLV 투여(개에서 0.7 mg/ml)는 명백한 독성이나 사망을 일으키지 않았으며, 이는 NOAEL(No observable Adverse Effects Level) 용량이 인간 피험자에 사용하기 위해 제안된 용량의 두 배보다 크다는 것을 나타낸다. 비글견 연구에서 총 5 마리의 동물 피험자가 포함되었다(정상 식염수를 투여받은 위약 대조군에서 2마리, 플라스미드를 투여받은 약물 그룹에서 3마리). 각 개는 생리 식염수 또는 0.7 mg/ml 벡터 조성물의 40% 사지 부피로 4개의 사지 모두에 HLV 치료를 받았다. 30일 연구 시작 시에 개에게 1회 투여하였다.
마우스 연구에는 총 96명의 동물 피험자가 포함되었으며, 아래 표에 요약된 바와 같이, 그 중 48 마리는 독성학, 48 마리는 플라스미드 생체분포에 대해 연구되었다.
각 마우스는 생리 식염수 또는 2.5 mg/ml 벡터 약물 조성물의 500 uL BID 꼬리 정맥 주사를 받았다. 마우스는 30일 중 0일 및 7일 연구일에 투여되었다.
Figure pct00003
약리 및 약물 분포: 외부 지혈대로 사지를 분리하지 않고 DNA 플라스미드(pDNA) 벡터를 정맥 주사하면 빠르게 분해된다. 간은 네이크드 DNA의 제거를 담당하는 주요 기관이다(Feng Liu et al. 2007). 전 세계의 여러 그룹에서 설치류의 정맥 플라스미드 투여에 대한 연구를 발표했는데, pDNA가 몇 분 안에 빠르게 분해되고 어떤 조직/기관에서도 치료 유전자의 효과적인 발현으로 이어지지 않는다는 결론을 내렸다(Feng Liu et al. 2007; Hisazumi et al. 2004, N Kobayashi et al. 2001, Du Clos et al. 1999, Yoshida et al. 1996, Gauthier, Tyler, and Mannik 1996, Kawabata, Takakura, Hashida 1995, Emlen과 Burdick 1988, 1988 Emlen 1978).
비글견 생체분포 하위 연구: 이 연구의 목적은 HLV 전달 방법에 의해 Beagle 개의 네 다리 모두에 단일 처리 후 분포를 평가하는 것이었다. 선택된 조직으로의 약물 벡터 활성 모이어티 분포는 부검 후에 확인되었다. 테스트 항목(약물 벡터)의 전사는 각 피험자의 5개 조직(처리된 대퇴사두근, 비처리된 척추주위 골격근, 간, 폐 및 신장)에서 인간 GNE(h-GNE) mRNA의 실시간 검출과 함께 역-전사효소 정량적 PCR에 의해 테스트되었다. 전사체(GNE의 mRNA)는 약물 처리 그룹의 모든 동물(3/3)에서 처리된 사지 골격근에서 양성인 것으로 나타났고, 위약 대조군의 동물 모두(0/2)에서 음성인 것으로 나타났다(도 5). 생체분포 하위 연구에서 우리는 혈장 시알산이 기준선에서 크게 변경되었음을 발견했다(도 6). 처리되지 않은 골격근(척수주위)은 모든(5/5) 동물에서 음성이었다. 약물 치료 그룹 내에서, 폐는 동물의 2/3, 간은 동물의 2/3, 폐와 간 모두 동물의 1/3에서 양성이었다(도 7). 혈장 시알산 함량은 치료 후 2일째에 측정되었으며, 모든 그룹 2 동물에서 치료 관련 증가가 지속적으로 나타났다. 투여 전 및 30일 시점에서 혈장 시알산의 추가 테스트는 이러한 발견을 확인하였으며, 대조군 동물과 비교하여 30일에서 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다(p=0.092).
마우스 플라스미드 생체분포 하위 연구: 이 연구의 목적은 수컷 및 암컷 마우스에 정맥내 투여된 최대 가능 용량(MFD) 또는 그 부근에서 시험 물품(약물 벡터)의 생체분포 및 독성을 평가하는 것이었다. 시험 물품 농도(2.5 mg/ml)는 연구 0일 및 7일에 꼬리 정맥으로 12시간마다(BID) 0.5m1의 부피로 주입되었다. 8일, 15일 및 30일에 동물을 안락사시키고 조직을 조달하였다. 조직에는 주사 부위(꼬리), 골격근(사두근), 생식선, 뇌, 간, 신장, 폐, 심장, 비장 및 림프절이 포함되었다. 분포된 플라스미드는 시험 물품(약물 벡터)의 CMV-프로모터 영역에 결합하는 프라이머를 사용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 모든 조직에서 테스트되었다. 희생 제8일의 꼬리 및 근육 조직과 희생 제15일의 꼬리 조직 외에, 시험 물품에 대해 양성인 다른 조직은 없었다. 처리 1일 후인 8일째에 희생된 마우스 중에서 9/10 꼬리(4 암컷, 5 수컷) 및 6/10 골격근(3 암컷, 3 수컷) 조직이 시험 물품에 대해 양성이었다. 마지막 용량 주입 후 8일째인 15일째에 희생된 마우스 중 3/10 꼬리(2 암컷, 1 수컷)가 시험 물품에 대해 양성이었다. 분석된 골격근 조직은 대퇴사두근에서 유래하였다. 마지막 용량 주입 후 23일째인 30일에 시험 물품 플라스미드 DNA는 분석된 어떤 조직에서도 검출되지 않았다. 꼬리 정맥이 주사에 사용되었기 때문에 15일째에 검출된 플라스미드 DNA는 주사 후 1주일 동안 지속된 고농축 플라스미드 용액의 혈관외유출에서 비롯된 것일 수 있다. 30일째에 꼬리가 양성으로 테스트되지 않았기 때문에 혈관외 플라스미드는 주사 후 1-3주 사이에 제거될 가능성이 높다. 흥미롭게도 6/10 마리의 마우스가 7일째 주사 후 1일째인 희생 8일째에 대퇴사두근의 벡터에 대해 양성 반응을 보였다. 플라스미드의 빠른 꼬리 정맥 주사가 간에서 전사를 유발할 수 있지만(Budker et al. 2006), 이 연구에서 사용된 매우 고용량 플라스미드의 느린 꼬리 정맥 주사가 마우스의 골격근에서 전사를 유발할 수 있는지는 알려지지 않았다. 이 연구에 기초하여, IV 투여된 고용량 약물 벡터는 마우스에 주사 후 수일 내지 3주 이내에 제거된다.
독성학 통합 요약: 두 종의 GLP 안전성/독성학 연구에서, 마우스의 최대 가능 용량(MFD) 정맥내 약물 벡터(꼬리-정맥으로 2.5 mg/ml) 및 비글견s의 약물 벡터의 고용량 HLV 투여(0.7 mg/ml, 사지 부피의 40%로 처리된 4개의 사지 모두)는 독성이나 사망을 일으키지 않았다. 이러한 연구는 두 경로에 의한 "NOAEL(no observed adverse effect level)" 용량이 제안된 인간 사용 용량(0.3-0.5 mg/ml, 사지 부피의 25-34%)의 두 배 이상일 것임을 시사한다.
비글견 GLP 독성 연구 요약: 이 GLP 연구의 주요 목적은 수컷 및 암컷 비글견s에서 단일 주입 정맥내(HLV 주입) 용량 후 시험 물품(약물 벡터)의 잠재적 독성을 평가하는 것이었다. 따라서 우리는 인간 피험자에 대해 제안된 임상적으로 관련된 용량의 두 배 이상인 비교적 높은 용량을 선택하였다. 모든 동물 피험자는 생존했으며, 시험 물품에 기인한 주목할만한 독성은 없었다. 총 5마리의 비글견이 등록되었다. 2마리의 개(수컷 1마리, 암컷 1마리)가 위약 대조군에 등록되었다. 3마리의 개(암컷 2마리, 수컷 1마리)가 약물 처리군에 등록되었다. 1일째에, 각 개의 4개 사지 모두에 생리 식염수(위약 대조군, 0.0 mg/ml의 약물 벡터 투여) 또는 시험 물품 용액(약물 처리군, 0.7 mg/ml 약물 벡터 투여) 주입을 통해 유체역학적 사지 정맥(HLV) 투여 경로를 사용하여 처리하였다. 사지 용적의 40%(0.4 ml/ml 사지 용적)를 아래의 투여 절차에 따라 지혈대 배치 원위부에 정맥내 주입하였다.
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모든 동물은 치료 후 회복되었고, 마지막 사지를 치료한 후 몇 시간 이내에 정상적으로 모든 4개의 사지를 사용하기 시작하였다. 살아있는 기간 동안 동물의 사망률과 이환율을 매일 관찰하였다. 혈액 샘플은 용량 투여 전(0일) 및 1일(투여 후 4시간), 2일, 7일, 14일, 22일 및 30일(부검 전)에 한 번 수집되었다. 심전도(심박수 및 파형 간격(RR, PR, QRS, QT 및 QTcV))를 용량 투여 전 및 29일에 모든 동물에 대해 수행하였다. 예정된 종료(30일째)에 동물을 안락사시키고 조직 수집 및 보존과 함께 완전한 부검을 수행하였다. 분석을 위해 다음 조직을 보냈다: 주사 부위, 골격근 처리된 사지 및 처리되지 않은 부위(예: 등), 생식선, 뇌, 간, 신장, 폐, 심장, 비장, 골수, 주사(사지) 겨드랑이 림프절과 관련됨 및 근육을 포함하는 주사 부위 주변의 피하 조직, 그리고 육안적 병변이 있는 기타 모든 조직. 조직을 파라핀 왁스에 묻혀 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
비글견 독성학 결론: 비글견 연구의 결과에 기초하여, 0 mg/ml(그룹 1) 또는 0.7 mg/ml(그룹 2)에서 수컷 및 암컷 비글견의 모든 사지에 약물 벡터 용액 0.1 cc/sec의 속도로 단일 주입 정맥내(HLV 기법) 투여는 이 연구 과정 동안 양호하였다. 투여량 및 치료 매개변수에서 표적 기관 독성의 치료 관련 해부학적 병리 징후가 확인되지 않았다. 비글 연구의 결과에 기초하여, 수컷 및 암컷 비글견의 모든 사지에서 사지 부피의 40%로 투여된 단일 HLV 용량(그룹 1 대조군의 경우 0 mg/ml, 또는 그룹 2의 경우 0.7 mg/ml)은 이 연구 과정(30일) 동안 양호하였다. 이 용량 수준(0.7 mg/ml) 및 주입 속도(0.1 ml/초)에서 표적 기관 독성의 임상 및/또는 해부학적 병리 징후가 확인되지 않았다.
마우스 GLP 독성 연구 요약: 이 30일 연구의 목적은 연구 0일 및 7일에 꼬리 정맥으로 1일 2회 정맥내 투여할 때 약물 벡터의 최대 가능 용량(MFD)을 평가하는 것이었다. 마우스에서 MFD는 용해도/점도 및 주사된 총 부피에 의해 제한되었다. 총 30일 연구의 0일과 7일에 꼬리 정맥 BID로 각 주사 볼루스를 0.5m1 투여하였다. 마우스 그룹 2 및 3은 2.5 mg/ml의 시험 물품 약물 용량을 받았고, 그룹 1 및 4는 위약 대조군으로서 생리 식염수만 받았다. 주입은 60초에 걸쳐 0.5m1의 속도로 비교적 느렸다. 느린 주입 속도는 5-10초에 걸쳐 더 높은 부피(1-2 ml) 및 더 낮은 농도(<0.5 mg/ml)의 빠른 주입에 의해 수행되는 마우스 간의 형질도입을 피하기 위한 것이었다(Herrero et al. 2011; G Zhang, Budker 및 Wolff 1999). 살아있는 기간 동안 동물의 사망률과 이환율을 매일 관찰하였다. 예정된 종료 날짜에 동물을 안락사시키고 혈액 및 조직 수집 및 보존과 함께 상세한 부검을 수행하였다. 각 희생일에 임상 혈액 검사(CBC, 간/신장 기능 검사)를 수행하였다. 지정된 프로토콜에 따라 주사 부위, 생식선, 뇌, 간, 신장, 폐, 심장, 비장, 림프절 및 골격근을 포함하여 10개의 조직을 채취하였다. 그룹 1 및 2 동물의 조직을 파라핀 왁스에 묻혀 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
마우스 독성학 결론: 이 연구의 결과에 기초하여, 치료는 일반적으로 수컷 및 암컷 CD-1 마우스에 의해 잘 용인되었다. 감소된 간세포 공포증은 8일째 부검에서 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 관찰되었고, 15일째에 암컷 마우스에서 단일 발생이 관찰되었다. 그러나 이러한 변화는 퇴행성 또는 괴사성 간세포 손상을 동반하지 않았으며, 병리학자에 의해 불리한 것으로 간주되지 않았다. 지정된 용량 수준 및 요법에서 표적 기관 독성의 임상 및/또는 해부학적 병리 징후가 확인되지 않았다.
마우스 임상 관련 및 최대 가능 용량(MFD) 계산. 이 섹션에서는 독성 연구를 위해 2.5 mg/ml의 약물 벡터 농도를 선택하는 이유를 설명한다. 설치류 모델에서, 플라스미드 최대 가능 용량(MFD)은 전체 플라스미드 용량이 아니라 IV 용액의 높은 부피 및/또는 유체 점도에 의해 제한된다. 인간-마우스 등가 용량 계산은 아래 표에 나열되어 있다.
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사지 근육에 대한 HLV 전달에서 최적 용량 범위는 75-400 ug/g 근육이다(Christine Ilse Wooddell et al. 2011). 540 ug/g 근육(2.5 mg/ml)의 고용량으로 주사된 쥐는 감소된 벡터 발현을 보여 "일부 근육 손상을 일으킨 것으로 보인다"(Christine Ilse Wooddell et al. 2011). 유사하게 마우스에서 플라스미드의 발현은 1,000 ug/g 근육보다 많은 용량에서 눈에 띄게 낮았다(Christine Ilse Wooddell et al. 2011). 70kg의 인간은 7-10kg의 하지 제지방 근육량을 가지고 있다(Fuller, Laskey, and Elia 1992; Kaysen et al. 2005). 540 ug/g 근육의 고용량은 사지 부피의 40%가 2,300ml일 때 대략 2.35 mg/ml로 해석된다. 75 ug/g 근육량의 제안된 최소 용량은 동일한 인간에서 0.3 mg/ml 플라스미드 농도로 해석된다. 이 정보에 기초하여 임상적으로 관련된 용량 범위는 0.3-2.3 mg/ml의 pDNA 농도일 것이다. 따라서, 마우스에서 2.5 mg/ml의 임상적으로 가장 적절한 용량의 플라스미드/식염수 농도를 테스트하기로 선택하였다.
마우스 용량 지침: 이 섹션에서는 독성 연구를 위해 최대 IV 볼루스 용량을 500uL로 선택하는 이유를 설명한다. 이 용량은 또한 최종 용액의 점도와 마우스 모델에 안전하게 주입할 수 있는 총 부피로 인해 MFD일 가능성이 높다. 마우스의 급성 정맥 주사의 경우 용량은 최대 200uL로 권장된다(Wolfensohn and Lloyd 2003).
Figure pct00006
2.5ml의 높은 부피가 유체역학적 간 형질감염을 달성하기 위해 빠르게(7-10초) 주입되었다(G Zhang, Budker, and Wolff 1999; F Liu, Song, and Liu 1999). Ringer 용액 대신 생리 식염수를 사용하면 마우스 사망률이 40%가 된다(G Zhang, Budker, and Wolff 1999). 총 혈액량과 심박출량을 초과하여 일시적인 우측 울혈성 심부전(G Zhang, Budker, and Wolff 1999) 및 간 독성(마우스 절반의 간세포의 8.2%가 괴사)을 유발할 수 있기 때문에, 1ml를 초과하는 주입은 극단적인 것으로 간주된다. 이러한 효과는 간 형질전환을 위해 간의 급격한 부종이 필요한 경우에 바람직한다(Naoki Kobayashi, Nishikawa, and Takakura 2005). 따라서, 임상적으로 관련된 최고 용량 및 MFD 플라스미드/식염수 주입을 위해 우리는 마우스에서 500uL의 볼루스 부피를 선택하였다.
약물 벡터 제조 및 체외 생체 활성
제조 사양: H002 벡터는 임상 연구를 위한 GMP(Good Manufacturing Practice)에 따라 제조된다. H002는 여기에 설명된 최종 사양으로 제조된, 임상 사용에 적합한 규모 확대 및 정제를 포함하는 공정을 사용하여 생산된다.
Figure pct00007
살아있는 생물학적 유기체에서 5 EU/kg/hr 미만의 내독소 투여를 달성하기 위해 최종 조성 내독소 수준은 0.5 EU/mg 미만이다. 잔류 박테리아 숙주 게놈 DNA는 정량적 PCR에 의해 1.3% 미만인데, 이는 HLV 투여 경로에 의해 투여될 때 더 높은 수준이 잠복 괴사를 유발하는 것으로 의심되기 때문이다(Wooddell et. al. 2012).
체외 생체 활성: GNE는 시알산(Sia) 생합성의 속도 제한 효소이다. 이 효소는 612-753개의 아미노산을 포함하는 여러 동형으로 모든 포유동물(인간 포함)에 의해 발현된다. GNE에는 (1) 에피머라제 도메인 (2) 키나제 도메인 및 (3) 알로스테릭 음성 피드백(억제) 도메인의 세 가지 기능적 도메인이 있다. GNE의 생물학적 활성은 GNE 활성이 결핍된 세포주를 사용하여 확인되었으며, 세포 시알산 생산을 증가시키는 것으로 나타났다(Jay et al. 2008). H002 벡터의 생물학적 활성은 내인성 Gne 활성의 부족으로 인해 시알산을 생성할 수 없는 포유동물 세포의 형질감염에 의해 결정되었다(Jay et al. 2008). 플라스미드는 2.5% 소태아혈청(FBS)에서 배양된 GNE 결핍 세포에서 강력한 시알산 생산을 보여주었다(Jay et al. 2008). 이러한 결과는 시알산 함유 FBS 배지에서 세포의 이유(weaning)를 포함하여, 분석에 적합한 최적화된 배양 환경을 사용하여 연속적으로 반복되었다.
약제학적 조성물의 안정성, 보관 및 저장 수명: H002 벡터는 -80C에서 보관할 때 13개월 이상 동안, 4C에서 보관할 때 최대 4개월 동안 안정적으로 유지되며, 이는 pDNA 벡터와 유사하다(Walther et al. 2003). 초나선형 또는 공유 폐쇄형 원형(ccc) 형태의 pDNA는 4C에서 보관할 때 4개월 후에 개방형 원형(oc) 형태로 분해된다. H002 벡터에 대한 특정 안정성 연구는 유사한 크기 및 농도의 다른 pDNA와 유사하다. 환자당 충분한 양의 H002 벡터를 제작할 수 있으며 제작 후 1~3개월 이내에 사용이 가능하다. H002 벡터는 -80C 온도에서 저장되고 인간 또는 동물에서 사용하기 전에 실온에서 해동될 수 있다.
AAV 벡터
본 발명의 다른 실시양태에서, 약물 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV), 또는 보다 구체적으로, 세포 표면 시알산 함량이 감소된 골격근과 같이, 증가된 시알산 또는 GNE 활성을 필요로 하는 조직 및 기관의 효과적인 형질도입에 필요한 특이적 특징을 가진 재조합 AAV(rAAV, 여기서 AAV는 AAV 또는 rAAV를 의미하는 데 사용됨)이다. 대부분의 AAV 벡터는 효과적인 세포 형질도입을 위해 적절한 양의 시알산의 존재를 필요로 한다.
시알산 대신 갈락토스를 필요로 하는 특정 AAV 혈청형(Bell et. al. 2012) 및 하이브리드 또는 키메라 글리칸-결합 AAV 벡터(Shen et. al. 2013-2014)는 세포 표면 시알산의 필요 없이 세포에 들어갈 수 있고 형질감염될 수 있는데, 이는 GNE 근육병증과 같은 질병에 대한 효과적인 유전자 요법 또는 효소 대체 요법의 개발에 중요할 것 같다. 시알산은 글리코칼릭스를 구성하는 글리칸의 가장 흔한 말단 당이다. 이 말단 시알산은 종종 갈락토스를 덮고, 적절한 양의 시알산이 부족한 질병 상태에서 시알산 대신 갈락토스가 노출된다.
AAV 캡시드에서 중요하고 갈락토스 결합 부위를 구성하는 아미노산은 Asp-271, Asn-272, Tyr-446, Asn-470, (선택적으로 Ala-472, Val-473,) 및 Trp-503을 포함한다. 이것은 시알산 대신 갈락토오스에 결합할 수 있도록 하는 AAV 캡시드에 대한 아미노산 요구 사항이다. 특정 위치에 있는 이러한 아미노산은 20면체 3중 대칭축 주위의 돌출부의 기저부에서 분자 포켓을 형성하는 갈락토스 결합을 가능하게 하는 데 필요하다(Bell et. al. 2012, Shen et. al. 2013-2014). AAV9는 필요한 아미노산 잔기를 포함하는 분자 포켓을 가지고 있기 때문에, 세포 표면 글리칸에서 말단 시알산을 효소로 제거하면 세포 유형에 관계없이 AAV9 형질도입이 증가하고 시알산 결핍 세포에서 갈락토실화된 글리칸의 재시알릴화는 AAV 형질도입을 부분적으로 차단한다(Shen et. al. 2011).
GNE 근육병증 또는 시알산 세포 표면 함량이 낮은 기타 질병을 효과적으로 치료하려면 AAV9에서 발견되는 것과 유사한 분자 포켓이 필요하며, 따라서 서열 "Asp-Asn-(173*Xaa, 173개의 아미노산을 의미)-Tyr-(23*Xaa)-Asn-Xaa(선택적으로 Ala-Val)-(29*Xaa)-Trp" 에서 서로 관련된 위치에 있는 유사한 아미노산 잔기를 포함하는 20면체 3중 대칭축 주위의 돌출부의 기저부에 포켓을 형성한다. 이들 아미노산 서열은 SEQ ID 19에 의해 기술된다. 우리의 예비 연구 데이터는 전술한 아미노산 서열을 포함하는 AAV 벡터와 도 1 및 2와 SEQ ID 1 및 2 (AAV-H002 벡터로 지칭됨)에 의해 기술된 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 AAV 벡터를 보여주며, 이는 저(hypo)-시알릴화된 또는 저(under)-시알릴화된 포유동물 세포에서 더 높은 형질감염 속도 및 더 높은 시알산 생산을 제공한다. 예비 연구 데이터에 기초하여, 저-시알릴화된 포유동물 세포는 AAV-H002 벡터에 의해 형질감염될 때보다 다른 AAV 벡터(상기 아미노산 서열 결여)에 의해 형질감염될 때 더 낮은 형질감염 속도 및 더 낮은 시알산 생산을 나타낸다. 본 발명의 한 실시양태에서, AAV-H002 벡터는 증가된 시알산 생합성을 필요로 하거나 그로부터 이익을 얻을 수 있는 GNE 근육병증 및 기타 질병을 치료하는 데 효과적일 것이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 제조에 AAV-H002를 사용하거나 최종 제품 제형에 AAV-H002 벡터를 포함하는 약리학적 조성물은 유리하거나 합리적인 위험-이득 포트폴리오를 나타내거나 넓은 치료 범위를 나타낼 것으로 예상된다. GNE-리포플렉스와 달리(Phadke et. al. 2009, Nemunaitis et. al. 2011), 주사당 8.0-20.0 mg의 용량에서 용량 제한 독성을 나타내지만, AAV-H002를 사용하거나 포함하는 약리학적 조성물의 언급된 실시양태는 임상적으로 관련된 용량 제한 독성을 나타내지 않을 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 최대 가능 용량(MFD) 또는 최대 허용 용량(MTD)과 같은 고용량에서도, 언급된 약리학적 조성물은 유리하거나 합리적인 위험-이득 포트폴리오를 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 제조에 AAV-H002를 사용하거나 최종 제품 제형에 AAV-H002 벡터를 포함하는 약리학적 조성물은 현재까지 알려진 임의의 다른 조성물보다 살아있는 유기체 내에서 더 높은 형질도입 및 시알산 생산을 야기한다.
다른 실시형태에서, AAV12는 시알산-독립적 또는 HSPG-비의존적 기전에 대해 아직 알려지지 않았지만 상이한 기전을 갖는데 사용될 수 있지만, AAV2와 유사하게, AAV12의 세포 진입은 수용체-매개 세포내이입에 의해 매개될 가능성이 있고, 엔도솜으로부터의 방출은 엔도솜 산성화를 필요로 한다(Schmidt et. al. 2008). 본 발명의 한 구체예에서, AAV12는 본 명세서에서 개시된 적어도 하나의 GNE 발현 벡터(도 1 및 2)를 포함한다. GNE 발현 벡터를 포함하는 이러한 AAV12 벡터(AAV12-H002 벡터로 지칭됨)는 저시알릴화된 세포를 형질감염시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, AAV12-H002 벡터는 증가된 시알산 생합성을 필요로 하거나 그로부터 이익을 얻을 수 있는 GNE 근육병증 및 기타 질병을 치료하는 데 효과적일 것이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제조에 AAV12-H002를 사용하거나 최종 제품 제형에 AAV12-H002 벡터를 포함하는 약리학적 조성물은 유리하거나 합리적인 위험-이득 포트폴리오를 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명의 한 측면에서, 최대 가능 용량(MFD) 또는 최대 허용 용량(MTD)과 같은 고용량에서도, AAV12-H002를 사용하거나 포함하는 약리학적 조성물은 유리하거나 합리적인 위험-이득 포트폴리오를 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 제조에 AAV12-H002를 사용하거나 최종 제품 제형에 AAV12-H002 벡터를 포함하는 약리학적 조성물은, 세포 진입에 대해 시알산 의존성인 또 다른 AAV 벡터를 사용하거나 포함하는 다른 조성물보다 살아있는 유기체 내에서 더 높은 치료적 유전자 도입 및 더 높은 시알산 생산을 야기한다.
AAV를 전달하기 위해 ROA 유체역학적 주입을 사용하는 것에 대한 추가의 중요한 임상 이점은 면역 독성이 감소되고 치료적 이식유전자의 장기간 발현이 있다는 것이다. AAV 벡터를 사용하여, RI(Regional Intravenous)라고 하는 HLV 유사 전달은 IM 전달에 비해 상당한 이점이 있는 것으로 나타났으며(Toromanoff et al. 2008), 인간이 아닌 영장류에서 면역 독성 가능성이 감소한다. AAV 벡터의 IM 투여 경로는 면역독성 및 유전적으로 변형된 근섬유의 파괴와 일관되게 연관되는 반면, 본 명세서에서 ROA 유체역학적 주입에 설명된 HLV-유사 전달은 AAV 벡터를 사용하여 이식유전자의 안정적인 발현을 허용한다(Toromanoff et al. 2010). 본 발명의 다른 측면에서, 상기 기재된 제약 조성물의 유체역학적 주입 ROA(제조에서 AAV-H002 또는 AAV12-H002를 사용하거나 AAV-H002 또는 AAV12-H002를 포함하는)는 면역 독성 또는 치료 효과 제한과 같이 유해하거나 원하지 않는 숙주 면역 반응의 기회를 감소시킨다. 본 발명의 다른 실시양태에서, ROA 유체역학적 주입의 임상적 사용은 숙주 면역 관용의 보다 효과적인 유도를 가능하게 하여 이전에 AAV-H002 또는 AAV12-H002에 노출된 대상체에게 재투여를 가능하게 할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 동일한 대상체의 재투여는 치료적 GNE 효소의 발현에서 부가적인 순차적 증가를 유도한다(즉, 각각의 용량은 바람직하지 않은 숙주 면역 반응으로 인해 효과가 없거나 역효과를 유발하는 대신 치료 효과를 증가시킨다).
아래 표는 다양한 AAV 캡시드 혈청형에 대해 확인된 수용체 결합 부위를 설명한다(Srivastava 2016, Santiago-Ortiz et. al. 2015, Naso et. al. 2017, Mietzsch et. al. 2014, Bell et. al. 2012, Vandenberghe et. al. 2009, Quinn et. al. 2011, Schmidt et. al. 2008).
Figure pct00008
요약 설명
본 명세서에 기술된 본 발명은 기술된 ROA 유체역학적 주입에 의해 표적 조직 또는 기관에서 더 높은 발현 수준을 달성하기 위해 동일한 대상체에서 반복 투여를 허용하면서, 임상 효능, 허용 가능한 안전성에 대한 가능성이 높은 약제학적 조성물의 개발 및 제조를 개시, 교시 및 가능하게 한다. 본 발명에서, 우리는 효과적이고 안전한 약리학적 제품 또는 조성물의 개발을 가능하게 하기 위해 ROA 유체역학적 주입의 특정 변형을 개시, 교시 및 가능하게 하는 것 외에도 약물 벡터의 중요한 특징 및 요소를 개시하였다.
본 명세서에서 본 발명의 설명 및 명세서 전반에 걸쳐, 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 조성물 또는 생성물 또는 작제물의 맥락에서 핵산 또는 아미노산 "서열"과 같은 단어는 이러한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자를 포함하는 조성물, 생성물 또는 작제물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 약리학적 또는 약학적 조성물 또는 제품, 약제, 약물, 치료 조성물 또는 제품 및 이와 유사한 단어는 진료소 또는 병원과 같은 의료 시설에서 인간 또는 동물 대상체에 투여를 위한 조성물(유전자 치료 벡터 또는 효소 대체 요법과 같은)을 참조하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 본 발명의 설명 및 명세서 전반에 걸쳐, 달리 명확하게 언급되지 않는 한, "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(include)"와 같은 단어, 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)" 또는 "포함한다(includes)" 또는 "포함하는(including)"과 같은 변형은 명시된 특징 또는 정수의 포함을 의미하지만 다른 특징 또는 정수 또는 특징 또는 정수 그룹의 제외를 의미하지는 않는다.
본 발명의 예시적인 실시예가 여기에서 설명되었지만, 본 발명은 설명된 것으로 제한되지 않으며, 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 당업자에 의해 다양한 다른 변경 또는 수정이 이루어질 수 있다. 본 발명은 이해를 명료하게 하기 위해 예시 및 예의 방식으로 일부 상세하게 설명되었으며, 따라서 본 명세서에서 구체적으로 언급되지 않은 다른 변경 또는 수정이 이루어질 수 있음을 당업자에게 교시한다. 따라서, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 기재된 특정 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태를 나타내며 예시적이며 본 발명의 범위에 대한 제한을 의도하지 않는다. 다른 목적, 측면 및 실시예는 본 명세서를 고려할 때 당업자에게 떠오를 것이며, 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상 내에 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상을 벗어남이 없이 본 명세서에 개시된 본 발명에 대해 다양한 치환 및 수정이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 여기에 적절하게 예시적으로 설명된 본 발명은 본질적으로 여기에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 또는 제한 또는 제한 없이 실시될 수 있다. 여기에 적절하게 예시적으로 설명된 방법 및 프로세스는 단계의 다른 순서로 실행될 수 있으며, 여기에 또는 청구범위에 표시된 단계의 순서로 반드시 제한되지는 않는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 이러한 항체의 복수(예를 들어, 항체 용액 또는 일련의 항체 제제) 등을 포함한다. 어떠한 상황에서도 특허가 여기에 구체적으로 공개된 특정예 또는 실시예 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석될 수 없다. 어떠한 경우에도 특허는 심사관이나 특허상표청의 기타 공무원 또는 직원이 한 진술에 의해 제한되는 것으로 해석될 수 없다. 단, 그러한 진술이 신청자가 답변서에 명시적으로 채택한 자격이나 유보가 없는 경우는 예외이다.
사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시 및 설명된 기능 또는 그 일부의 등가물을 배제할 의도는 없지만 다음과 같이 인식된다. 청구된 바와 같은 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능함을 알 수 있다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 수정 및 변형은 당업자에 의해 의지될 수 있고, 그러한 수정 및 변형은 다음으로 고려되는 것으로 이해될 것이다. 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있어야 한다.
본 발명은 여기에서 광범위하고 일반적으로 설명되었다. 일반 개시 내용에 속하는 더 좁은 종 및 하위 속 그룹 각각은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 여기에는 절제된 재료가 여기에 구체적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 속에서 주제를 제거하는 단서 또는 부정적인 제한이 있는 본 발명의 일반적인 설명이 포함된다.
다른 실시예는 다음 청구범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 당업자는 본 발명이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 관점에서도 설명된다는 것을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Darvish, Daniel <120> GNE AS A THERAPEUTIC AGENT <130> H002 <140> US 16/574,644 <141> 2019-09-18 <150> US 62/732,931 <151> 2018-09-18 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3838 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (2301)..(2303) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (2310)..(2312) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ccgcctaatg agcgggcttt tttttggctt gttgtccaca accgttaaac cttaaaagct 60 ttaaaagcct tatatattct tttttttctt ataaaactta aaaccttaga ggctatttaa 120 gttgctgatt tatattaatt ttattgttca aacatgagag cttagtacgt gaaacatgag 180 agcttagtac gttagccatg agagcttagt acgttagcca tgagggttta gttcgttaaa 240 catgagagct tagtacgtta aacatgagag cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg 300 ctgatccacg ttgtggtaga attggtaaag agagtcgtgt aaaatatcga gttcgcacat 360 cttgttgtct gattattgat ttttggcgaa accatttgat catatgacaa gatgtgtatc 420 taccttaact taatgatttt gataaaaatc attaggtacc ccggctctag ttattaatag 480 taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (266)..(266) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Met Glu Lys Asn Gly Asn Asn Arg Lys Leu Arg Val Cys Val Ala Thr 1 5 10 15 Cys Asn Arg Ala Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Pro Ile Met Phe Gly Ile 20 25 30 Lys Thr Glu Pro Glu Phe Phe Glu Leu Asp Val Val Val Leu Gly Ser 35 40 45 His Leu Ile Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Tyr Arg Met Ile Glu Gln Asp 50 55 60 Asp Phe Asp Ile Asn Thr Arg Leu His Thr Ile Val Arg Gly Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Ala Met Val Glu Ser Val Gly Leu Ala Leu Val Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Val Leu Asn Arg Leu Lys Pro Asp Ile Met Ile Val His Gly Asp 100 105 110 Arg Phe Asp Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ser Ala Ala Leu Met Asn Ile 115 120 125 Arg Ile Leu His Ile Glu Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Ile Asp Asp 130 135 140 Ser Ile Arg His Ala Ile Thr Lys Leu Ala His Tyr His Val Cys Cys 145 150 155 160 Thr Arg Ser Ala Glu Gln His Leu Ile Ser Met Cys Glu Asp His Asp 165 170 175 Arg Ile Leu Leu 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Leu Tyr Phe Lys Asn Leu Ser Lys Arg Asn Lys Gln Ile Met 20 25 30 Glu Lys Asn Gly Asn Asn Arg Lys Leu Arg Val Cys Val Ala Thr Cys 35 40 45 Asn Arg Ala Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Pro Ile Met Phe Gly Ile Lys 50 55 60 Thr Glu Pro Glu Phe Phe Glu Leu Asp Val Val Val Leu Gly Ser His 65 70 75 80 Leu Ile Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Tyr Arg Met Ile Glu Gln Asp Asp 85 90 95 Phe Asp Ile Asn Thr Arg Leu His Thr Ile Val Arg Gly Glu Asp Glu 100 105 110 Ala Ala Met Val Glu Ser Val Gly Leu Ala Leu Val Lys Leu Pro Asp 115 120 125 Val Leu Asn Arg Leu Lys Pro Asp Ile Met Ile Val His Gly Asp Arg 130 135 140 Phe Asp Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ser Ala Ala Leu Met Asn Ile Arg 145 150 155 160 Ile Leu His Ile Glu Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Ile Asp Asp Ser 165 170 175 Ile Arg His Ala Ile Thr Lys Leu Ala His Tyr His Val Cys Cys Thr 180 185 190 Arg Ser Ala Glu Gln His Leu Ile Ser Met Cys Glu Asp His Asp Arg 195 200 205 Ile Leu Leu Ala Gly Cys Pro Ser Tyr Asp Lys Leu Leu Ser Ala Lys 210 215 220 Asn Lys Asp Tyr Met Ser Ile Ile Arg Met Trp Leu Gly Asp Asp Val 225 230 235 240 Lys Ser Lys Asp Tyr Ile Val Ala Leu Gln His Pro Val Thr Thr Asp 245 250 255 Ile Lys His Ser Ile Lys Met Phe Glu Leu Thr Leu Asp Ala Leu Ile 260 265 270 Ser Phe Asn Lys Arg Thr Leu Val Leu Phe Pro Asn Ile Asp Ala Gly 275 280 285 Ser Lys Glu Met Val Xaa Val Met Xaa Lys Lys Gly Ile Glu His His 290 295 300 Pro Asn Phe Arg Ala Val Lys His Val Pro Phe Asp Gln Phe Ile Gln 305 310 315 320 Leu Val Ala His Ala Gly Cys Met Ile Gly Asn Ser Ser Cys Gly Val 325 330 335 Arg Glu Val Gly Ala Phe Gly Thr Pro Val Ile Asn Leu Gly Thr Arg 340 345 350 Gln Ile Gly Arg Glu Thr Gly Glu Asn Val Leu His Val Arg Asp Ala 355 360 365 Asp Thr Gln Asp Lys Ile Leu Gln Ala Leu His Leu Gln Phe Gly Lys 370 375 380 Gln Tyr Pro Cys Ser Lys Ile Tyr Gly Asp Gly Asn Ala Val Pro Arg 385 390 395 400 Ile Leu Lys Phe Leu Lys Ser Ile Asp Leu Gln Glu Pro Leu Gln Lys 405 410 415 Lys Phe Cys Phe Pro Pro Val Lys Glu Asn Ile Ser Gln Asp Ile Asp 420 425 430 His Ile Leu Glu Thr Leu Ser Ala Leu Ala Val Asp Leu Gly Gly Thr 435 440 445 Asn Leu Arg Val Ala Ile Val Ser Met Lys Gly Glu Ile Val Lys Lys 450 455 460 Tyr Thr Gln Phe Asn Pro Lys Thr Tyr Glu Glu Arg Ile Asn Leu Ile 465 470 475 480 Leu Gln Met Cys Val Glu Ala Ala Ala Glu Ala Val Lys Leu Asn Cys 485 490 495 Arg Ile Leu Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Gly Arg Val Asn Pro Arg 500 505 510 Glu Gly Ile Val Leu His Ser Thr Lys Leu Ile Gln Glu Trp Asn Ser 515 520 525 Val Asp Leu Arg Thr Pro Leu Ser Asp Thr Leu His Leu Pro Val Trp 530 535 540 Val Asp Asn Asp Gly Asn Cys Ala Ala Leu Ala Glu Arg Lys Phe Gly 545 550 555 560 Gln Gly Lys Gly Leu Glu Asn Phe Val Thr Leu Ile Thr Gly Thr Gly 565 570 575 Ile Gly Gly Gly Ile Ile His Gln His Glu Leu Ile His Gly Ser Ser 580 585 590 Phe Cys Ala Ala Glu Leu Gly His Leu Val Val Ser Leu Asp Gly Pro 595 600 605 Asp Cys Ser Cys Gly Ser His Gly Cys Ile Glu Ala Tyr Ala Ser Gly 610 615 620 Met Ala Leu Gln Arg Glu Ala Lys Lys Leu His Asp Glu Asp Leu Leu 625 630 635 640 Leu Val Glu Gly Met Ser Val Pro Lys Asp Glu Ala Val Gly Ala Leu 645 650 655 His Leu Ile Gln Ala Ala Lys Leu Gly Asn Ala Lys Ala Gln Ser Ile 660 665 670 Leu Arg Thr Ala Gly Thr Ala Leu Gly Leu Gly Val Val Asn Ile Leu 675 680 685 His Thr Met Asn Pro Ser Leu Val Ile Leu Ser Gly Val Leu Ala Ser 690 695 700 His Tyr Ile His Ile Val Lys Asp Val Ile Arg Gln Gln Ala Leu Ser 705 710 715 720 Ser Val Gln Asp Val Asp Val Val Val Ser Asp Leu Val Asp Pro Ala 725 730 735 Leu Leu Gly Ala Ala Ser Met Val Leu Asp Tyr Thr Thr Arg Arg Ile 740 745 750 Tyr <210> 16 <211> 648 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (263)..(263) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (266)..(266) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 16 Met Glu Lys Asn Gly Asn Asn Arg Lys Leu Arg Val Cys Val Ala Thr 1 5 10 15 Cys Asn Arg Ala Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Pro Ile Met Phe Gly Ile 20 25 30 Lys Thr Glu Pro Glu Phe Phe Glu Leu Asp Val Val Val Leu Gly Ser 35 40 45 His Leu Ile Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Tyr Arg Met Ile Glu Gln Asp 50 55 60 Asp Phe Asp Ile Asn Thr Arg Leu His Thr Ile Val Arg Gly Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Ala Met Val Glu Ser Val Gly Leu Ala Leu Val Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Val Leu Asn Arg Leu Lys Pro Asp Ile Met Ile Val His Gly Asp 100 105 110 Arg Phe Asp Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ser Ala Ala Leu Met Asn Ile 115 120 125 Arg Ile Leu His Ile Glu Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr Ile Asp Asp 130 135 140 Ser Ile Arg His Ala Ile Thr Lys Leu Ala His Tyr His Val Cys Cys 145 150 155 160 Thr Arg Ser Ala Glu Gln His Leu Ile Ser Met Cys Glu Asp His Asp 165 170 175 Arg Ile Leu Leu Ala Gly Cys Pro Ser Tyr Asp Lys Leu Leu Ser Ala 180 185 190 Lys Asn Lys Asp Tyr Met Ser Ile Ile Arg Met Trp Leu Gly Asp Asp 195 200 205 Val Lys Ser Lys Asp Tyr Ile Val Ala Leu Gln His Pro Val Thr Thr 210 215 220 Asp Ile Lys His Ser Ile Lys Met Phe Glu Leu Thr Leu Asp Ala Leu 225 230 235 240 Ile Ser Phe Asn Lys Arg Thr Leu Val Leu Phe Pro Asn Ile Asp Ala 245 250 255 Gly Ser Lys Glu Met Val Xaa Val Met Xaa Lys Lys Gly Ile Glu His 260 265 270 His Pro Asn Phe Arg Ala Val Lys His Val Pro Phe Asp Gln Phe Ile 275 280 285 Gln Leu Val Ala His Ala Gly Cys Met Ile Gly Asn Ser Ser Cys Gly 290 295 300 Val Arg Glu Val Gly Ala Phe Gly Thr Pro Val Ile Asn Leu Gly Thr 305 310 315 320 Arg Gln Ile Gly Arg Glu Thr Gly Glu Asn Val Leu His Val Arg Asp 325 330 335 Ala Asp Thr Gln Asp Lys Ile Leu Gln Ala Leu His Leu Gln Phe Gly 340 345 350 Lys Gln Tyr Pro Cys Ser Lys Ile Tyr Gly Asp Gly Asn Ala Val Pro 355 360 365 Arg Ile Leu Lys Phe Leu Lys Ser Ile Asp Leu Gln Glu Pro Leu Gln 370 375 380 Lys Lys Phe Cys Phe Pro Pro Val Lys Glu Asn Ile Ser Gln Asp Ile 385 390 395 400 Asp His Ile Leu Glu Thr Leu Ser Ala Leu Ala Val Asp Leu Gly Gly 405 410 415 Thr Asn Leu Arg Val Ala Ile Val Ser Met Lys Gly Glu Ile Val Lys 420 425 430 Lys Tyr Thr Gln Phe Asn Pro Lys Thr Tyr Glu Glu Arg Ile Asn Leu 435 440 445 Ile Leu Gln Met Cys Val Glu Ala Ala Ala Glu Ala Val Lys Leu Asn 450 455 460 Cys Arg Ile Leu Gly Val Gly Ile Gly Gly Gly Ile Ile His Gln His 465 470 475 480 Glu Leu Ile His Gly Ser Ser Phe Cys Ala Ala Glu Leu Gly His Leu 485 490 495 Val Val Ser Leu Asp Gly Pro Asp Cys Ser Cys Gly Ser His Gly Cys 500 505 510 Ile Glu Ala Tyr Ala Ser Gly Met Ala Leu Gln Arg Glu Ala Lys Lys 515 520 525 Leu His Asp Glu Asp Leu Leu Leu Val Glu Gly Met Ser Val Pro Lys 530 535 540 Asp Glu Ala Val Gly Ala Leu His Leu Ile Gln Ala Ala Lys Leu Gly 545 550 555 560 Asn Ala Lys Ala Gln Ser Ile Leu Arg Thr Ala Gly Thr Ala Leu Gly 565 570 575 Leu Gly Val Val Asn Ile Leu His Thr Met Asn Pro Ser Leu Val Ile 580 585 590 Leu Ser Gly Val Leu Ala Ser His Tyr Ile His Ile Val Lys Asp Val 595 600 605 Ile Arg Gln Gln Ala Leu Ser Ser Val Gln Asp Val Asp Val Val Val 610 615 620 Ser Asp Leu Val Asp Pro Ala Leu Leu Gly Ala Ala Ser Met Val Leu 625 630 635 640 Asp Tyr Thr Thr Arg Arg Ile Tyr 645 <210> 17 <211> 612 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (153)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 17 Met Ile Glu Gln Asp Asp Phe Asp Ile Asn Thr Arg Leu His Thr Ile 1 5 10 15 Val Arg Gly Glu Asp Glu Ala Ala Met Val Glu Ser Val Gly Leu Ala 20 25 30 Leu Val Lys Leu Pro Asp Val Leu Asn Arg Leu Lys Pro Asp Ile Met 35 40 45 Ile Val His Gly Asp Arg Phe Asp Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ser Ala 50 55 60 Ala Leu Met Asn Ile Arg Ile Leu His Ile Glu Gly Gly Glu Val Ser 65 70 75 80 Gly Thr Ile Asp Asp Ser Ile Arg His Ala Ile Thr Lys Leu Ala His 85 90 95 Tyr His Val Cys Cys Thr Arg Ser Ala Glu Gln His Leu Ile Ser Met 100 105 110 Cys Glu Asp His Asp Arg Ile Leu Leu Ala Gly Cys Pro Ser Tyr Asp 115 120 125 Lys Leu Leu Ser Ala Lys Asn Lys Asp Tyr Met Ser Ile Ile Arg Met 130 135 140 Trp Leu Gly Ser Lys Glu Met Val Xaa Val Met Xaa Lys Lys Gly Ile 145 150 155 160 Glu His His Pro Asn Phe Arg Ala Val Lys His Val Pro Phe Asp Gln 165 170 175 Phe Ile Gln Leu Val Ala His Ala Gly Cys Met Ile Gly Asn Ser Ser 180 185 190 Cys Gly Val Arg Glu Val Gly Ala Phe Gly Thr Pro Val Ile Asn Leu 195 200 205 Gly Thr Arg Gln Ile Gly Arg Glu Thr Gly Glu Asn Val Leu His Val 210 215 220 Arg Asp Ala Asp Thr Gln Asp Lys Ile Leu Gln Ala Leu His Leu Gln 225 230 235 240 Phe Gly Lys Gln Tyr Pro Cys Ser Lys Ile Tyr Gly Asp Gly Asn Ala 245 250 255 Val Pro Arg Ile Leu Lys Phe Leu Lys Ser Ile Asp Leu Gln Glu Pro 260 265 270 Leu Gln Lys Lys Phe Cys Phe Pro Pro Val Lys Glu Asn Ile Ser Gln 275 280 285 Asp Ile Asp His Ile Leu Glu Thr Leu Ser Ala Leu Ala Val Asp Leu 290 295 300 Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Ala Ile Val Ser Met Lys Gly Glu Ile 305 310 315 320 Val Lys Lys Tyr Thr Gln Phe Asn Pro Lys Thr Tyr Glu Glu Arg Ile 325 330 335 Asn Leu Ile Leu Gln Met Cys Val Glu Ala Ala Ala Glu Ala Val Lys 340 345 350 Leu Asn Cys Arg Ile Leu Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Gly Arg Val 355 360 365 Asn Pro Arg Glu Gly Ile Val Leu His Ser Thr Lys Leu Ile Gln Glu 370 375 380 Trp Asn Ser Val Asp Leu Arg Thr Pro Leu Ser Asp Thr Leu His Leu 385 390 395 400 Pro Val Trp Val Asp Asn Asp Gly Asn Cys Ala Ala Leu Ala Glu Arg 405 410 415 Lys Phe Gly Gln Gly Lys Gly Leu Glu Asn Phe Val Thr Leu Ile Thr 420 425 430 Gly Thr Gly Ile Gly Gly Gly Ile Ile His Gln His Glu Leu Ile His 435 440 445 Gly Ser Ser Phe Cys Ala Ala Glu Leu Gly His Leu Val Val Ser Leu 450 455 460 Asp Gly Pro Asp Cys Ser Cys Gly Ser His Gly Cys Ile Glu Ala Tyr 465 470 475 480 Ala Ser Gly Met Ala Leu Gln Arg Glu Ala Lys Lys Leu His Asp Glu 485 490 495 Asp Leu Leu Leu Val Glu Gly Met Ser Val Pro Lys Asp Glu Ala Val 500 505 510 Gly Ala Leu His Leu Ile Gln Ala Ala Lys Leu Gly Asn Ala Lys Ala 515 520 525 Gln Ser Ile Leu Arg Thr Ala Gly Thr Ala Leu Gly Leu Gly Val Val 530 535 540 Asn Ile Leu His Thr Met Asn Pro Ser Leu Val Ile Leu Ser Gly Val 545 550 555 560 Leu Ala Ser His Tyr Ile His Ile Val Lys Asp Val Ile Arg Gln Gln 565 570 575 Ala Leu Ser Ser Val Gln Asp Val Asp Val Val Val Ser Asp Leu Val 580 585 590 Asp Pro Ala Leu Leu Gly Ala Ala Ser Met Val Leu Asp Tyr Thr Thr 595 600 605 Arg Arg Ile Tyr 610 <210> 18 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 15 Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile 20 25 30 Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe 35 40 45 Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile 50 55 60 Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr 65 70 75 80 Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro 85 90 95 Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu 100 105 110 Asn Asp Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu 115 120 125 Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser 130 135 140 Tyr Glu Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr 165 170 175 Leu Ser Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys 180 185 190 Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr 195 200 205 Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr 210 215 220 Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Asp Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe 245 250 255 Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg 260 265 270 Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val 275 280 285 Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr 290 295 300 Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly 305 310 315 320 Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met 325 330 335 Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp Gly Ser Gln Ala Val 340 345 350 Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu 355 360 365 Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Asn Val Pro 370 375 380 Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn 385 390 395 400 Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Lys Thr Ile Asn Gly 405 410 415 Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser 420 425 430 Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg 435 440 445 Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe 450 455 460 Ala Trp 465 <210> 19 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(175) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (177)..(199) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (204)..(232) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 19 Asp Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Ala Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp 225 230

Claims (16)

  1. 적어도 GNE를 코딩하는 DNA 분자 또는 이의 치료 단편을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하고,
    벡터 캡시드는 SEQ ID 18 또는 SEQ ID 19의 아미노산 서열을 포함하는 것인 대상체를 치료하는 방법.
  2. 적어도 SEQ ID 1 또는 2의 DNA 분자 백본을 포함하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고,
    인간 유전자 삽입체는 GNE 또는 이의 치료 단편을 코딩하는 것인 대상체를 치료하는 방법.
  3. SEQ ID 1 또는 2로 표시되는 DNA 분자를 포함하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 순 음전하를 갖는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 순 음전하를 갖는 것인 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 유전자 치료 벡터인 것인 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    GNE는 알로스테릭 도메인 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 하나 이상의 진핵생물 인핸서를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물의 투여 이후에, 상기 대상체는 시알산 함량의 증가를 경험하는 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 대상체는 GNE를 코딩하는 유전자에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 대상체의 사지 또는 사지들에 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물의 투여 이후에, 상기 대상체는 시알릴화의 개선을 경험하는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물의 투여 이후에, 상기 대상체는 근육 기능의 개선을 경험하는 것인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 대상체는 근육 소모 장애를 앓고 있는 것인 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 대상체는 GNE 관련 근육병증, 유전성 봉입체 근육병증(HIBM), IBM2, 또는 테두리 액포가 있는 원위 근육병증(DMRV)으로 진단되는 것인 방법.
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