KR20240006130A

KR20240006130A - 알파-글루코시다아제 저해 활성이 높은 고추의 선발을 위한 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240006130A
Application number: KR1020220082746A
Authority: KR
Inventors: 이준대
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2022-07-05
Filing date: 2022-07-05
Publication date: 2024-01-15

Abstract

본 발명은 InDel (insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 InDel 조성물, 서열번호 3의 염기서열 중 SNP (single nucleotide polymorphism) 위치인 986번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추를 선발하기 위한 SNP 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

알파-글루코시다아제 저해 활성이 높은 고추의 선발을 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for selection of Capsicum annuum with high alpha-glucosidase inhibitory activity and uses thereof}

본 발명은 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성이 높은 고추의 선발을 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린 분비, 인슐린 작용 또는 이 둘의 결함으로 인한 고혈당증으로 특징지어지는 대사 질환의 그룹이다. 당뇨병의 만성적인 고혈당은 당뇨병성 신경병증, 망막병증, 심혈관 질환 등과 관련이 있다. 인슐린 비의존성 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes)의 치료는 탄수화물의 가수분해 분열을 방해하고 포도당 흡수를 지연시키는 것이다. α-글루코시다아제 억제제(α-glucosidase inhibitor)는 소화기관에서 α-글루코시다아제와 α-아밀라아제의 활성을 억제하여 혈당 수치를 낮추는 데 사용되어 왔다.

몇몇 고추(Capsicum annuum L.) 추출물이 α-글루코시다아제에 대해 높은 활성 억제 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 과피(pericarp), 태좌(placenta), 줄기에서 추출한 다양한 고추 추출물의 α-글루코시다아제 억제 활성(α-glucosidase inhibitory activity, AGI 활성)을 조사한 결과, 과피와 태좌 추출물에서 AGI 활성이 높게 나타났다. 또한, 고추 잎 추출물은 α-글루코시다아제와 α-아밀라아제 모두에 대해 시험관내 억제 활성을 보여주었다. 고추 열매의 AGI 활성은 유전자형에 따라 달라진다. 식물의 AGI 활성은 플라보노이드, 알칼로이드, 테르페노이드, 안토시아닌, 글리코사이드, 페놀 화합물 등과 같은 다양한 2차 대사물과 관련이 있다. 그러나, 아직까지 고추의 AGI 활성과 관련된 특정 화합물들은 밝혀지지 않았다.

한편, 한국공개특허 제2018-0065785호에는 '루테인 및 베타카로틴 함량이 높은 고추 판별용 마커'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2020-0001159호에는 '고추 과피의 신미 정도를 판별하기 위한 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '알파-글루코시다아제 저해 활성이 높은 고추의 선발을 위한 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고추에서 α-글루코시다아제 억제 활성(이하, AGI 활성) 조절과 관련된 QTL (Quantitative Trait Locus) 정보를 기반으로 후보 유전자를 식별하고, 후보 유전자에 위치한 다형성 정보(SNP 또는 InDel)를 사용하여 분자마커를 개발하고자 하였다.

본 발명자는 AGI 활성 관련 QTL인 qAGI5.1 및 qAGI7.1에서 각각 칼콘 합성효소 2(chalcone synthase 2)와 쿠마로일 전이효소 1-유사 단백질(coumaroyl transferase 1-like protein)을 암호화하고 있는 CA05g17040 및 CA07g13040 유전자를 식별하였고, 상기 각 유전자에 대해 AGI 고활성 고추와 AGI 저활성 고추의 유전 정보를 비교하여 CA05g17040 유전자에서 1 bp InDel 다형성 및 CA07g13040 유전자에서 SNP 변이를 확인하였다. 그 후, 각 다형성 정보에 기반하여 2개의 HRM (High Resolution Melting) 마커를 개발하고 F₂ 분리집단에 적용한 결과, AGI 활성이 유전형 정보에 따라 구별될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 InDel (Insertion/Deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열 중 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 위치인 986번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추를 선발하기 위한 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 InDel 또는 SNP 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추 선발용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추를 선발하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추를 선발하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추의 선발 방법을 제공한다.

기존의 AGI 활성 분석법은 식물체를 분석에 사용될 시료 채취가 가능할 때까지 재배해야 한다는 어려움이 있었으나, 본 발명에서 개발된 분자마커를 이용하면 유묘기에 DNA를 추출하여 AGI 고활성 개체를 조기에 선발할 수 있으므로, AGI 고활성 고추 신품종 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 개발한 분자마커를 이용한 HRM 분석 결과(좌) 및 AGI 활성 분석 결과(우)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 InDel (Insertion/Deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 InDel 조성물을 제공한다.

InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나(insertion) 없어져(deletion) 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 서열번호 1의 염기서열은 칼콘 합성효소 2(chalcone synthase 2)를 암호화하는 CA05g17040 유전자의 서열로, 상기 서열번호 1의 357번째 염기 G가 결손된 서열이 서열번호 2의 염기서열이다. 서열번호 1의 염기서열을 동형으로 가지는 고추는 AGI 활성이 높은 것으로 확인되었으며, 서열번호 2의 염기서열을 동형으로 가지는 고추는 AGI 활성이 낮은 것이 특징이다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 염기서열 중 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 위치인 986번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(C. annuum)를 선발하기 위한 SNP 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 서열번호 3의 염기서열 중 986번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드는, 바람직하게는 10 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 SNP는 고추의 AGI 활성에 영향을 미치는 매우 안정적인 유전자 마커이다. 본 발명의 SNP 마커를 고추의 AGI 고활성 선발에 사용할 수 있는 것은, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는, 쿠마로일 전이효소 1-유사 단백질(coumaroyl transferase 1-like protein)을 암호화하는 고추 CA07g13040 유전자의 염기서열 중 986번째 염기가 C 또는 T로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 서열번호 3의 986번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP에서 C/C 동형접합 유전자형을 가지는 고추는 AGI 활성이 높은 고추 자원으로, T/T 동형접합 유전자형을 가지는 고추는 AGI 활성이 낮은 고추 자원으로 판단할 수 있다. 이 SNP에서 T/C 이형접합 유전자형을 가지는 고추는 중간 수준의 AGI 활성을 가지는 고추 자원으로 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명에 따른 InDel 조성물 및 SNP 조성물에 있어서, 상기 고추(C. annuum)는 바람직하게는 고추(Capsicum annuum L.) 또는 파프리카(C. annuum var. angulosum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 InDel 또는 SNP 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(C. annuum) 선발용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추 선발용 마이크로어레이는 본 발명의 InDel 또는 SNP 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다.

본 발명에서 용어 "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

본 발명에서 용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 폴리뉴클레오티드가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막 (예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산을 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티프 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(C. annuum)를 선발하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 1 bp 염기 결손 다형성을 보다 정확하게 탐지할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드 서열에서 InDel 다형성 부위를 확인할 수 있도록 개발된 것이며, 상기 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티프 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열 중 986번째 뉴클레오티드인 SNP 변이를 확인할 수 있도록 디자인되었다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 각 프라이머 세트는 바람직하게는 HRM (High Resolution Melting)용 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "HRM"은 전기영동 없이 유전형질을 검정하는 분석방법으로, SNP를 이용한 PCR 기반의 분석 기법으로 SNP 형태에 따라 형광시료가 감소하는 양상을 해리곡선(melting curve)으로 나타내어 유전형을 구분하는 방법이다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 4, 5, 7 및 8 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 4 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 4, 5, 7 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, HRP (horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소 (예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 비오틴(biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(C. annuum)를 선발하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티프 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것으로, 상세한 설명은 전술한 것과 같다. 또한, 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 시 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(C. annuum)의 선발 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 고추 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 선발 방법에서 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 HRM (High resolution melting) 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 RT-PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다. 또한, 증폭 산물을 검출하는 방법 중 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추 선발 방법에 있어서, 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브를 통해 증폭된 산물이 서열번호 1의 유전자형으로 확인될 경우, 해당 고추를 AGI 활성이 높은 고추 자원으로 선발할 수 있다. 서열번호 1의 유전자형을 동형으로 가지는 고추는 서열번호 2의 유전자형을 동형으로 가지는 고추에 비해 AGI 활성이 약 10% 이상 높다. 또한, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 통해 증폭된 산물이 서열번호 3의 986번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP에서 C/C 동형접합 유전자형을 가지는 경우 AGI 활성이 높은 고추로, T/T 동형접합 유전자형을 가지는 경우 AGI 활성이 낮은 고추로 판단할 수 있다. 이 SNP에서 T/C 이형접합 유전자형을 가지는 고추는 중간 수준의 AGI 활성을 가지는 고추 자원으로 판단할 수 있다.

본 명세서에서, AGI 고활성 고추는 α-글루코시다아제(1 unit·㎖^-1)에 대한 활성 저해 활성을 기질인 p-니트로페닐 글루코피라노사이드(p-nitrophenyl glucopyranoside)를 이용하여 측정한 값 기준으로 설명할 수 있으며, 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 조건에서는 상기 측정값이 70% 이상인 경우를 AGI 고활성 고추로 판단할 수 있고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 조건에서는 상기 측정값이 50% 이상인 경우를 AGI 고활성 고추로 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료

96개의 고추 개체로 구성된 F₂ 분리집단을 2018년 12월에 파종한 후 2019년 10월까지 전라북도 완주시 농촌진흥청 국립원예특작과학원 온실에서 재배하였다. 상기 집단은 AGI (α-glucosidase inhibitors) 활성이 낮은 세포질-웅성불임 모계 계통 'M5'와 고추 재배종인 '원기 1호'에서 유래한 AGI 활성이 높은 부계 계통 'AG13-3'의 교배에서 얻어진 한국형 고추(C. annuum) '114-1' F₁을 자가 수분하여 구축하였다. F₂ 집단의 각 개체들로부터 잎 10 g을 채취하여 일부는 이 등(Korean J. Breed. Sci. 2017, 49, 119-128)의 방법을 이용하여 DNA를 추출하는데 사용하였으며, 또 다른 일부는 추출물을 제조하여 AGI 활성 분석에 사용하였다. 채취한 잎은 오염 물질을 제거하기 위해 세척한 후 55℃에서 24시간 동안 건조시켰으며, 건조된 샘플을 분말로 분쇄하여 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.

2. AGI 활성 분석

AGI 활성은 효소-기질 상호작용에 의해 분석되었는데, 효모(Saccharomyces cerevisiae) 유래 α-글루코시다아제 효소(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 및 p-니트로페닐 글루코피라노사이드(p-nitrophenyl glucopyranoside, pNPG)(Sigma-Aldrich)가 사용되었다. 아카보스(Acarbose, Sigma-Aldrich)를 AGI 활성의 대조군으로 사용하였다. α-글루코시다아제 활성에 미치는 고추 추출물의 억제 효과는 Kim 등(Korean J. Hortic. Sci. 2018, 36(3), 444-450)이 설명한 방법을 사용하여 측정되었으며, 엽록소의 간섭을 배제하기 위해 일부 수정되었다. 수정된 방법은 다음과 같다.

먼저, 건조된 고추 잎 250 ㎎과 70% 에틸알코올 2 ㎖를 혼합하고 55℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후, 추출물을 PD-10 컬럼(GE Healthcare, USA)을 통해 여과하였으며, 여과된 추출물 1 ㎖는 진공 원심분리기 증발기 CVE-2200 (선일아이라, 한국)을 사용하여 농축하였다. 건조된 펠릿을 20 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.9) 500 ㎕에 용해시켰다. 용해된 펠릿은 PVDF 주사기 필터(현대마이크로, 한국)를 사용하여 여과하였다. 각 시료는 3회 추출하였으며, 건조된 시료는 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.

AGI 활성은 고추 잎 추출물 50 ㎕을 사용하여 분석되었으며, 200 ㎕의 α-글루코시다아제(1 unit·㎖^-1)를 첨가하고 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 후 400 ㎕의 기질(20 mM phosphate buffer에 용해된 3.0 mM pNPG)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 총 반응 부피는 650 ㎕이었으며, 혼합물은 37℃에서 20분간 배양되었다. 마지막으로 0.1 M Na₂CO₃ 4.35 ㎖를 첨가하여 반응을 종료시키고, 흡광도를 측정하였다. 405 nm 파장에서의 흡광도 값은 마이크로플레이트 분광광도계(Epoch, BioTek Instruments, Inc., USA)을 사용하여 측정하였으며, 미반응 추출물 시료 50 ㎕에 Na₂CO₃ 4.95 ㎕를 첨가하여 제조한 대조 검체의 흡광도 값을 측정한 후 다음 식을 이용하여 AGI 활성을 계산하였다.

3. HRM 분석

HRM 분석은 LightCycler 96 시스템(Roche, Switzerland)을 사용하여 수행하였으며, 융해곡선(melting curve)은 High-Resolution Melt software v11 (Roche)을 사용하여 분석하였다. CA05g17040-InDel-HRM-F 및 CA05g17040-InDel-HRM-R 프라이머 세트는 CA05g17040-InDel-HRM-probe와 함께 혼합(표 1)한 후 표 2의 조건으로 증폭 및 분석을 수행하였으며, CA07g13040-HRM-F 및 CA07g13040-HRM-R 프라이머 세트는 표 3의 조건으로 반응물을 제조한 뒤 표 4의 조건으로 증폭 및 분석을 실시하였다.

CA05g17040-InDel-HRM marker PCR mixture

Components	Volume
DNA	2 ㎕
HS Prime LP pre-mix (SYTO9용, 2X) ((주)제넷바이오)	10 ㎕
정방향 프라이머 (10 pmole)	0.1 ㎕
역방향 프라이머 (10 pmole)	0.5 ㎕
Luna probe (10 pmole)	1 ㎕
SYTO9 (0.05 mM) (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd.)	1 ㎕
TDW	5.4 ㎕

CA05g17040-InDel-HRM marker PCR condition

	Step	Temperature	Time	Cycles
	Initial denaturation	95℃	300 sec	1
PCR	Denaturation	95℃	20 sec	45
	Annealing	68~55℃ touch down	20 sec
	Extension	72℃	20 sec
HRM		95℃	60 sec
		40℃	120 sec
		97℃	1 sec
HRM은 40℃-97℃까지 0.2℃씩 온도를 증가시키면서 SYTO9 형광 측정

CA07g13040-HRM marker PCR mixture

Components	Volume
10× PCR Buffer (TransGene Biotech Co., Beijing, China)	2 ㎕
dNTPs (2.5 mM)	1 ㎕
DNA	2 ㎕
정방향 프라이머 (10 pmole)	1 ㎕
역방향 프라이머 (10 pmole)	1 ㎕
SYTO9 (0.05 mM)	0.5 ㎕
Taq polymerase (TransGene Biotech Co.)	0.1 ㎕
TDW	5.4 ㎕

CA07g13040-HRM marker PCR condition

	Step	Temperature	Time	Cycles
PCR	Pre-denaturation	95℃	300 sec	39
	Denaturation	95℃	10 sec
	Annealing	60℃	30 sec
	Extension	72℃	20 sec
	Pre-incubation	95℃	300 sec	1
HRM		95℃	60 sec	1
		40℃	60 sec
		65℃	1 sec
		97℃	1 sec
HRM은 65℃-97℃까지 0.2℃씩 온도를 증가시키면서 SYTO9 형광 측정

실시예 1. 고추 AGI 활성 관련 후보 유전자 선정

본 발명자는 이전 연구(Genes 2020, 11:1116)에서 고추 잎 및 과실을 이용한 GBS (Genotyping-By Sequencing) 분석을 통해 고추의 AGI 활성을 조절하는 QTL (Quantitative trait locus)을 분석하였었고, 8가지 후보 QTLs(qAGI5.1, qAGI5.2, qAGI7.1, qAGI8.1, qAGI9.1, qAGI9.2, qAGI11.1, qAGI12.1)을 확인하였으며, 이 중 3가지 QTLs(qAGI5.1, qAGI7.1, qAGI12.1)이 후보 유전자 감별 대상으로 선정되었다. 참조서열로 C. annuum cv. CM334 v1.6 Pepper Genome Platform (http://peppergenome/snu.ac.kr/)을 사용하였다.

qAGI5.1은 5번 염색체의 227,812,258 bp와 231,508,632 bp 사이에 위치했으며, 여기서 칼콘 합성효소 2(chalcone synthase 2)를 코드하는 3개의 후보 유전자(CA05g17030, CA05g17040, CA05g17060)가 확인되었다. qAGI7.1의 영역은 7번 염색체에서 215,893,235 bp에서 220,887,009 bp까지 다양했으며, 여기서 4개의 후보 유전자(CA07g12950, CA07g12980, CA07g13030, CA07g13040)가 확인되었다. 이들 중 3개의 유전자는 MYB 관련 단백질을 암호화하며, CA07g13040은 쿠마로일 전이효소 1-유사 단백질(coumaroyl transferase 1-like protein)을 암호화하는 것으로 확인되었다. qAGI12.1은 12번 염색체에 위치하였으며 해당 부위에서 CA12g18010이 확인되었고, CA12g18010은 플라보노이드 생성효소와 연관된 4-쿠마레이트-CoA 연결효소 유사 단백질(4-coumarate-CoA ligase-like protein)을 암호화하는 것으로 확인되었다.

실시예 2. AGI 고활성 고추 선발을 위한 분자마커 개발

본 발명에서는 AGI 고활성 고추 자원을 선발할 수 있는 분자지표를 개발하고자, AGI 활성이 높은 고추 자원과 AGI 활성이 낮은 고추 자원에서 상기 실시예 1의 후보 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. DNA 시퀀싱은 마크로젠(한국)에 의뢰하여 Sanger 시퀀싱 분석법으로 수행하였다.

AGI 고활성 및 저활성 고추 자원의 선택은 25 mM 농도의 아카보스(Acarbose)를 이용하여 측정한 AGI 활성값을 중위값으로 높고, F₂ 분리집단 96 개체의 AGI 활성값을 정렬하여 최하위 및 최상위의 5개체를 각각 AGI 저활성 및 AGI 고활성 고추 자원으로 선발하여 사용하였다. 선발된 각 고추 개체의 잎에서 게놈 DNA를 추출한 뒤 상기 실시예 1에서 확인한 8개 후보 유전자 서열을 비교 분석하였다. 그 결과, 칼콘 합성효소 2(chalcone synthase 2)를 암호화하는 CA05g17040 유전자 서열에서 1 bp 염기 결손 변이가 확인되었으며, 쿠마로일 전이효소 1-유사 단백질(coumaroyl transferase 1-like protein)을 암호화하는 CA07g13040 유전자 서열에서 SNP 변이가 확인되었다(표 5).

InDel 및 SNP 다형성 뉴클레오티드 정보

	염기서열 (5'→3')
CA05g17040_chs+	ATGTACTACGTAACTCCAACACGACCCTCAATCAAACGACTCATGATGTACCAACAAGGTTGGTTTGCTGGTGGAACCGTTATCCGACTAGCAAAGGACTTAGCTGAAAACAACAAGGGAGCTCGAGTCCTTGTTGTTTGCTTAGAAATAACTGCAGTTACTTTTCGTGGCCCAAGTGATACACACTTAGATAGTATGGTTGGACAAGCGCTCTTTGGTGATGGGACAGCTGCACTCATTGTAGGTTCTAATCCATTACCAGGAGTTGAAAAACCTTTGTTTGAGCTTGACTCTGCGGCCCAAACACTTCTCCCTAACAGCAAGGGCGCTATAGATGGTCACCTTCATGAAGCTGG[G]CTTACATTTCACTTACTCAAAGATGATCCTGGATTGATCTCAAAGAACATTGAGAAGAGTTTGATAGAAGCATTCCAACCATTGGGGATTTCTAATTGGAACTCTATCTTTTGGATTGCTCACCCCGGTGGGCCAGCAATCCTGGACCAAGTTGAATTAAAGTTGGGCCTAAAGCCCAAAAAACTCTGGGCTACTAAGAAAGTCTTGAGTGACTATGAAAACATGTCTAGTGCTTGTGTTCTCTTAATTTTGGATGAAATTAGAAAGGCTTCAGTCAAAGAAGGGTTTAGTAGTACTGGTGAAGGCCTTGATTGGGGTGTACTTTTTGGATTTAGACCTGGGCTTACGGTTGAGACTGTTGTGCTCCATAGTGTGTCTACTTAA (서열번호 1)
CA05g17040_chs-	ATGTACTACGTAACTCCAACACGACCCTCAATCAAACGACTCATGATGTACCAACAAGGTTGGTTTGCTGGTGGAACCGTTATCCGACTAGCAAAGGACTTAGCTGAAAACAACAAGGGAGCTCGAGTCCTTGTTGTTTGCTTAGAAATAACTGCAGTTACTTTTCGTGGCCCAAGTGATACACACTTAGATAGTATGGTTGGACAAGCGCTCTTTGGTGATGGGACAGCTGCACTCATTGTAGGTTCTAATCCATTACCAGGAGTTGAAAAACCTTTGTTTGAGCTTGACTCTGCGGCCCAAACACTTCTCCCTAACAGCAAGGGCGCTATAGATGGTCACCTTCATGAAGCTGG[-]CTTACATTTCACTTACTCAAAGATGATCCTGGATTGATCTCAAAGAACATTGAGAAGAGTTTGATAGAAGCATTCCAACCATTGGGGATTTCTAATTGGAACTCTATCTTTTGGATTGCTCACCCCGGTGGGCCAGCAATCCTGGACCAAGTTGAATTAAAGTTGGGCCTAAAGCCCAAAAAACTCTGGGCTACTAAGAAAGTCTTGAGTGACTATGAAAACATGTCTAGTGCTTGTGTTCTCTTAATTTTGGATGAAATTAGAAAGGCTTCAGTCAAAGAAGGGTTTAGTAGTACTGGTGAAGGCCTTGATTGGGGTGTACTTTTTGGATTTAGACCTGGGCTTACGGTTGAGACTGTTGTGCTCCATAGTGTGTCTACTTAA (서열번호 2)
CA07g13040	ATGGCACATACACAGCAAGTTAAACTTCTTGAATGTTGCCAAGTCTCTCCACCAACAGGTTCAATTCCATCAACTACTTTACCATTAACATTCTTGGACATACCTTGGCTTCTTTTTCCACCAAGTCAACCACTTTTTTTCTATGATTTCCCTCACACAACTTCTCATTTCAAACAAACCATTTTATCCAATTTCAAGATTTCACTTTCTTTAACACTCCAATACTATTTCCCTTTAGTAGGTAATTTAATAATTCCACCACAACCATCTAAGCCAAAAATTACCTACACCTCAGGAGACTCTGTTACATTAACCATAAAAGAGTCTACGTATGATTATTATAACCATCTTTTAATCCATCATCAGAAGGGTGTTCAAGATTTTCACCAATTAGTACCTCATTTGCCACAAATTGGTGAATTGTTACATGTGGACCAAGAGTTAAAGTACTCACTTTTGGCTGTTCAAATTACTATATTTCCTAATTGTGGTGTTTCTATTGGATTCTCCAAACGTCACGTGGTGGCTGATGAAAGAACATCTAACAATTTCTTGAAGACGTGGGCAGGTATTTTTAGAAATGGACTAGAATTGTACTTGCCTGTGTTGAACAAGAATTTGCCATACTGTGATAGGTCAATAATTCGTGACACCAATGGGGTTGAACCAATCATGTGGAACCAAAAAAATGTGCCAAAATTGGCAAATGGCAATTTTAGTGACATGGTAAGATCCACATTTGTAATGGGTCGACCCGACATGGAGGTGATCAATGGGTGGATCATATCACGGTCCAAGAAACTATTCGGGTCAGCCCAGTTGCTCCTTTCGCCCTATGTGGTGACATGTTCATTTATTTGGGTGTGTTGGTTGAAAGCTAACATGGACAACATTGAAGATACAATTGACAAAACGGAGCCCCATTACTTCGGTTTTATAGCGGGTGGTATAACCCGGTTGGGTTACCCGGTACCGATTAGTTATG[C/T]AGGTAATTGCATTGCATTTGGTAGAGCAATGGCAAGGAGAAATGAATTATTGGGAGAAAATGGTATACTTTTTGCTGCGAAGACAATTGGTGATACCATCAAGGAATTGAATAGGAATGTGTTGGGTCGGGTTGAAAATTGGATGTCCGATTGGAAAGTGTTTAATGGGTCGGGGCTCCATATGACGGTAACCGGGTCTCCGAAAGTGGATCTTTACTCGTTGGATTTCGGGTGGGGCCGACCCAAAATGATTGAAGAAATATCAATAGATAAAACAGGTGATGTATCTCTATGTGAGAGTAGAGACATGAGTGGTGGAATAGAGGTTGGTTTGGCTCTTCCATTGGCCAAAATGGAAGCCTTTAATGTTTTCTATAATGAAGGTCTCAAAAATCTTCACTGA (서열번호 3)
*서열번호 3은 SNP 다형성 위치에서 C 염기를 기준으로 작성.

본 발명자는 상기 다형성 변이를 확인할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다(표 6). 1 bp 염기 결손 변이의 경우 일반적인 HRM 분석에서 정확하게 탐지되지 않는 문제가 발생하여, Luna probe를 추가로 디자인하였다.

AGI 고활성 고추 선발을 위한 분자마커

프라이머	염기서열 (5'→3')	서열번호
CA05g17040-InDel-HRM-F	ACCTTTGTTTGAGCTTGACTCTG	4
CA05g17040-InDel-HRM-R	CAATGTTCTTTGAGATCAATCCAG	5
CA05g17040-InDel-HRM-probe	CTTCATGAAGCTGGGCTTACATTTCACTTACTCAA	6
CA07g13040-HRM-F	AGCCCCATTACTTCGGTTTT	7
CA07g13040-HRM-R	TTTCTCCTTGCCATTGCTCT	8

실시예 3. 개발된 분자마커를 이용한 고추의 AGI 활성 분석

표 6의 분자마커를 이용하여, F₂ 분리집단 96개체를 대상으로 유전자형 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 CA05g17040-InDel-HRM 마커를 이용한 경우, CA05g17040 유전자 서열 내 G 염기 결손이 없는 유전자형(chs+)을 동형으로 가지는 고추들이 G 염기 결손 유전자형(chs-)을 동형으로 가지는 고추들에 비해 AGI 활성이 10% 이상 높은 것을 알 수 있었다. 또한, CA07g13040-HRM 마커를 이용한 경우, CA07g13040 유전자의 986번째 위치에서 C/C의 유전자형을 가지는 고추들이 동일 염기 위치에서 T/T의 유전자형을 가지는 고추들에 비해 AGI 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다.

Claims

InDel (insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 InDel 조성물.
서열번호 3의 염기서열 중 SNP (single nucleotide polymorphism) 위치인 986번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 SNP 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 InDel 또는 SNP 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum) 선발용 마이크로어레이.
서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티프 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 프라이머 세트 조성물.
제4항에 있어서, 상기 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추를 선발하기 위한 프라이머 세트 조성물.
제4항 또는 제5항의 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)를 선발하기 위한 키트.
제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제4항 또는 제5항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 알파-글루코시다아제 저해 고활성 고추(Capsicum annuum)의 선발 방법.
제8항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 HRM (High resolution melting) 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 선발 방법.