KR20240004245A - 기능이 향상된 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법 및 조성물 - Google Patents

기능이 향상된 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20240004245A
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룬체 슈
프레데리코 루레이로 칼라보
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Abstract

본 개시내용은 향상된 기능을 갖는 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. DGKα 및 DGKζ로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하기 위해 면역세포로 분화할 수 있는 줄기 또는 전구세포를 변형시키고, 상기 줄기 또는 전구세포를 향상된 면역세포로 분화하도록 유도하는 방법이 본원에 개시된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 면역세포 또는 줄기세포 뿐만 아니라 치료학적 치료에서의 면역세포의 용도도 본원에 개시된다.

Description

기능이 향상된 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2021년 2월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 63/147,933 및 2021년 8월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 63/236,828에 기초한 우선권 주장 출원으로서, 이 문헌들의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
개시 분야
[0002] 본 발명은 향상된 기능을 갖는 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 DGKα 및 DGKζ로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 기능을 억제하기 위해 면역세포로 분화할 수 있는 줄기 또는 전구세포를 변형시키고, 상기 줄기 또는 전구세포를 향상된 면역세포로 분화하도록 지시하는 방법에 관한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 면역세포 또는 줄기세포 뿐만 아니라 치료학적 치료에서의 면역세포의 용도도 본원에 개시되어 있다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
[0003] 2022년 1월 27일에 생성된 8KB의 39095WO_SequenceListing.txt로 명명된 ASCII 텍스트 파일의 서열 목록이 본원에 참조로 포함된다.
[0004] 본 명세서에서 어떠한 선행 출판물(또는 그로부터 파생된 정보) 또는 공지의 사실에 대해 언급하였다 해서, 해당하는 선행 출판물(또는 그로부터 파생된 정보) 또는 공지 사실이 본 명세서와 관련된 기술 분야에 있어 일반적인 지식의 일부를 형성한다고 인정하는 것이 아니고, 인정되어서도 아니된다.
[0005] 악성 종양 또는 암은 통제되지 않는 방식으로 성장하고 정상 조직을 침범하며 종종 전이되어 원래 조직에서 멀리 떨어진 부위로 성장한다. 일반적으로 암은 악성 형질전환이라는 잘 이해되지 않은 과정을 거친 하나 또는 소수의 정상 세포에서 유래한다. 암은 신체의 거의 모든 조직에서 발생할 수 있다. 암종이라고 불리는 상피 세포에서 파생된 암은 가장 흔한 종류의 암이다. 육종은 섬유아세포, 근육세포, 지방세포 등의 세포에서 발생하는 간엽조직의 악성종양이다. 림프 조직의 고형 악성종양은 림프종이라 칭하고, 림프구 및 기타 조혈 세포의 골수 및 혈액 매개 악성종양은 백혈병이라 칭한다.
[0006] 암은 산업화된 국가에서 사망의 3대 원인 중 하나이다. 감염병 치료와 심혈관 질환 예방이 지속적으로 개선되고 평균 기대 수명이 늘어남에 따라 암은 이들 국가에서 가장 흔한 치명적인 질병이 될 가능성이 높다. 따라서 암을 성공적으로 치료하려면 환자를 죽음에 이르지 않게 하면서 모든 악성 세포를 제거하거나 파괴해야 한다. 이를 달성하는 이상적인 방법은 종양 세포와 정상 세포 대응물을 구별하는 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것이다.
[0007] 면역치료(Immunotherapy)는 최근 등장한 새로운 치료 분야로서, 신체 자체의 면역 체계를 이용한다. 이 치료법은 살아있는 유기체에서 얻거나 실험실에서 생산된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포 등의 세포를 이용할 수 있는데, 이들 세포는 강화되어 환자의 체내로 주입됨으로써, 암, 감염 및 기타 질병과 싸우는 것을 면역 체계를 보조할 수 있다. 현재 여러 유형의 면역요법이 개발되고 있다.
[0008] 이러한 치료법 중 일부는 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 비호지킨 림프종(NHL)과 같은 질병에서 종양 세포를 죽이는 데 매우 효과적인 것으로 밝혀진 키메라 항원 수용체(CAR-T 세포)를 발현하는 T 세포를 사용한다. B 세포 항원 CD19를 표적으로 하는 승인된 제품은 CAR 유전자 구조를 환자 유래("자가") T 세포에 도입하여 생산된다(Kershaw 외, Gene-engineered T cell for cancertherapy, Nat Rev Cancer, 2013, 13(8): 525-41). 다발성 골수종과 같은 기타 혈액학적 악성 종양에 대한 B 세포 성숙 항원(BCMA)과 같은 다른 혈액 세포 마커를 표적으로 하는 추가적인 자가 유래 제품이 개발 중에 있다(Sadelain 외, Therapeutic T cell Engineering, 2017, Nature, 545(7655): 423-431).
[0009] 다른 치료법에서는 혈액학적 악성종양에 대해 NK 세포를 성공적으로 사용하였다. 치료 효과를 높이기 위해 NK 및 CAR-NK 세포에 유전자 편집 도구가 적용되었다. IL-15 및 IL-2와 같은 사이토카인의 자율 분비 또는 막 결합 발현은 NK 세포 확장 및 지속성을 향상시킬 수 있다(Nagashima 외, Stable transduction of the interleukin-2 gene into human natural killer cell lines and their phenotypic and functional characterization in vitro and in vivo, Blood, 1998년 5월 15일, Vol.91(10), pp.3850-61; Hoyos 외, Engineering CD19-specific T lymphocytes with interleukin-15 and a suicide gene to enhance their anti-lymphoma/leukemia effects and safety, Leukemia, Jun 2010, Vol.24(6), pp.1160-70; Imamura 외, Autonomous growth and increased cytotoxicity of natural killer cells expressing membrane-bound interleukin-15, Blood, 14 August 2014, Vol.124(7), pp.1081-8). 주로 T 세포에서 연구된 면역 체크포인트를 표적으로 삼는 것은 NK 세포에서도 유망한 결과를 보여주었다. NK 세포 체크포인트 수용체인 TIGIT를 녹아웃시키는 것은 NK 세포 고갈을 예방하고 항종양 활성을 촉진시키는 것으로 나타났다(Zhang 외, Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity, Nature Immunology, Jul 2018, Vol.19(7), pp.723-73). 더욱이, A2AR, TGFβ R2와 같은 종양 미세환경(TME)으로부터의 면역억제성 사이토카인 수용체의 유전자 파괴는 TME로부터의 억제를 중화시키고 NK 세포 이펙터 기능을 회복시키는 것으로 나타났다(Wang 외, SMAD4 promotes TGF-β-independent NK cell homeostasis and maturation and antitumor immunity, The Journal of clinical investigation, 01 November 2018, Vol.128(11), pp.5123-5136; Rouce 외, The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia, Leukemia, Apr 2016, Vol.30(4), pp.800-811; Young 외, A2AR Adenosine Signaling Suppresses Natural Killer Cell Maturation in the Tumor Microenvironment, Cancer research, 15 February 2018, Vol.78(4), pp.1003-1016).
[0010] T 세포 및 CAR-T 세포와 비교하여 NK 세포 및 CAR-NK 세포 기반 치료법은 (1) 특히 사이토카인 방출 증후군 및 이식편 대 숙주 질환과 같은 잠재적으로 생명을 위협하는 부작용과 관련하여 더 나은 안전성 (2) 세포독성 활성에 영향을 미치는 다중 메커니즘, 및 (3) '기성품(off-the-shelf)' 제조에 대한 높은 가능성과 같은 여러 가지 이점을 제공한다(Xie 외, CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer, EBioMedicine, September 2020, Vol.59; Liu 외, Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors, The New England journal of medicine, February 6, 2020, Vol.382(6), pp.545-553).
[0011] 세포 기반 면역요법은 혈액 기반 암에 대한 임상 시험에서 인상적인 결과를 보인 반면, 고형 종양 치료에서는 비슷한 결과가 나오지 않았다. 종양 부위에 대한 제한된 접근, 종양 미세환경의 면역억제 특성 및 고형 종양 특이적 표적 항원의 부족을 포함하여 고형 종양에서 효능이 상대적으로 부족한 데에는 여러 가지 이유가 있다.
[0012] 또한, 투여된 CAR-세포의 지속성 부족 및 "고갈"은 지속적으로 관찰되는 한계이다(Newick 외, CAR T Cell Therapy for Solid Tumours, Annu Rev Med, 2017, 68: 139-152).
[0013] CTLA-4, PD-1 또는 LAG-3와 같은 억제 수용체는 CAR-T 세포의 활성화를 약화시키고 T 세포 고갈을 가속화할 수 있다. PD-1이 게놈 편집에 의해 파괴된 후 T 세포의 향상된 항종양 활성이 예상되었다(Liu 외, CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells, Cell Res, 2017, 27(1): 154-157). 그러나 T 세포 상의 PD-1의 제거는 또한 고갈에 대한 민감성을 증가시키고, 수명을 감소시키며, 항종양 효과를 개선시키지 못할 수 있다(Odorizzi 외, Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells, J Exp Med, 2015, 212(7): 1125-37). 이러한 이유로 면역세포의 유전자 편집이 항종양 활성을 향상시킬지 여부를 사례별로 평가할 필요가 있다.
[0014] 가공된 면역세포는 분명히 암에 대항하는 잠재적인 무기이므로 이를 수치적으로 생성, 확장 및 유지하는 것이 과제 중 하나이다. 면역세포는 조혈줄기세포(HSC)에서 생성되고, 조혈줄기세포는 다시 만능줄기세포(PSC)로부터 생성된다. 따라서 PSC 기술은 이론적으로 PSC가 무한한 재생 가능한 세포 공급원을 제공하기 때문에 매우 유망한 기술이다.
개시내용의 요약
[0015] 본 발명은 유전자 편집 및 인간 PSC와 같은 세포를 조혈 줄기세포 유사 세포 및 궁극적으로 기능적 면역세포로 분화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 여기서 이러한 면역세포는 동등한 유전자 편집되지 않은 면역세포에 비해 이점을 갖는다. 당업자는 하나 이상의 중복되지 않는 세포 유전자를 삭제하면 정상적인 세포 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있고 실제로 세포를 생존 불가능하거나, 기능을 하지 못하게, 또는 줄기세포의 경우, 기능성 세포로 분화하지 못하게 할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 iPSC에서 DGKα 및/또는 DGKζ 유전자의 유전적 녹아웃(KO)을 개시하고, 놀랍게도 DGK KO iPSC가 생존 가능하고 DGK KO 면역세포, 특히 NK 및 T 세포로 분화될 수 있음을 입증한다. 더욱이, DGK KO NK 세포는 시험관내 및 생체내에서 완전한 기능을 하며 실제로 DGK KO가 없는 NK 세포에 비해 우수한 기능을 나타낸다. 마찬가지로, iPSC 유래 DGK KO T 세포는 시험관내에서 완전히 기능하며 DGK KO가 없는 T 세포와 비교할 때 향상된 기능을 나타낸다.
[0016] 한 측면에서, 향상된 기능을 갖는 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법은 DGKα 및 DGKζ로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 유전자의 기능을 억제하도록 줄기세포를 변형시키는 단계를 포함하되; 이렇게 변형된 줄기세포는 변형된 줄기세포의 표적 유전자 억제를 유지하고 향상된 활성을 포함하는 줄기세포 유래 면역세포로 분화할 수 있다.
[0017] 일부 구현예에서, 줄기세포는 유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells) 또는 배아 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 만능 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 전-HSC, 혈액생성 내피(HE) 또는 조혈 줄기세포(HSC) 또는 HSC 유사 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 삼중 동형접합성 HLA 일배체형 공여자로부터 유래된다.
[0018] 일부 구현예에서, 이 방법은 표적 유전자의 두 대립유전자 모두가 억제된 생성된 변형된 줄기세포를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
[0019] 일부 구현예에서, 방법은 (i) 본원에서 생성된 변형된 줄기세포 또는 이들로부터 생성된 클론 세포를 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포를 얻는 단계; (ii) 중배엽 세포를 조성물과 접촉시켜 CD34+ 세포를 얻는 단계; 및 (iii) CD34+ 세포를 조성물과 접촉시켜 줄기세포 유래 면역세포를 얻는 단계를 포함한다.
[0020] 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKα이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKζ이다. 일부 구현예에서, DGKα 유전자 및 DGKζ 유전자 두 가지 모두 표적 유전자이다.
[0021] 일부 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 다능성 전구세포, 림프 전구세포(예를 들어, 공통 림프계 전구세포), 초기 흉선 전구세포, 전 T 세포 전구세포, 전 NK 전구세포, T 전구세포, NK 전구세포, 골수 전구세포(예컨대 공통 골수 전구세포), T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 단핵구로부터 선택된다.
[0022] 일부 구현예에서, 면역세포는 CD2, CD5, CD7, CD4, CD8a, CD8b, CD3, TCRαβ 및 TCRγδ로부터 선택된 마커 중 적어도 하나를 발현하는 T 세포이다.
[0023] 일부 구현예에서, 면역세포는 CD56+ 및 CD45+를 발현하는 NK 세포이다.
[0024] 일부 구현예에서, 표적 유전자 기능의 억제는 유전자 편집 시스템에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas, TALEN 및 ZFN으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0025] 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 한다.
[0026] 일부 구현예에서 CRISPR/Cas 시스템은 Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas12, Cas13, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, CasX, CasY, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 및 Csf4로 구성된 군으로부터 선택되는 가이드 RNA 의존성 뉴클레아제를 이용한다.
[0027] 일부 구현예에서, 변형된 줄기세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 줄기세포는 CAR을 발현한다.
[0028] 일부 구현예에서, 본 방법에 의해 생산된 면역세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 본 방법에 의해 생산된 면역세포는 CAR을 발현한다.
[0029] 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성된 면역세포는 하나 이상의 표적 항원을 인식한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 면역세포는 종양 표적 또는 감염원 표적을 인식한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 TAG-72, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD47, 엽산 수용체 알파(FRα), BCMA, 메소텔린, Muc1로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0030] 추가 측면에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 면역세포가 본원에 제공된다.
[0031] 또 다른 측면에서, DGKα 및 DGKζ로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 유전자의 기능이 억제되는 변형된 세포가 본원에서 제공되며, 이 변형된 세포는 변형된 세포의 유전자 억제를 유지하고 향상된 활성을 갖는 면역세포로 분화될 수 있다.
[0032] 일부 구현예에서, 변형된 세포는 배아 줄기세포, 제대 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 세포는 조혈 내피 세포, 조혈 전구세포(progenitor cell), 조혈 선구세포(precursor cell), 조혈 줄기세포 또는 조혈 유사 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형된 세포는 삼중 동형접합성 HLA 일배체형 공여자로부터 유래된다.
[0033] 일부 구현예에서, 표적 유전자의 두 가지 대립유전자 모두가 억제된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKα이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKζ이다. 일부 구현예에서, DGKα 및 DGKζ 유전자는 두 가지 모두 표적 유전자이다.
[0034] 일부 구현예에서, 변형된 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 세포는 CAR을 발현한다.
[0035] 또 다른 측면에서, 표적 유전자의 서열을 편집할 수 있는 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하며, DGKα 및 DGKζ 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 유전자의 기능을 억제하도록 세포를 변형시키기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 한다.
[0036] 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5,Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas12, Cas13, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5,Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1,Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, CasX, CasY, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2,Csf3, 및 Csf4로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함한다.
[0037] 추가 측면에서, 대상체에게 본원에 개시된 면역세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 감염, 자가면역 장애, 장기 섬유증 또는 자궁내막증이다.
[0038] 이 특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 도면이 하나 이상 포함되어 있다. 컬러 도면이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 필요한 수수료를 지불하고 요청하면 관청에서 제공된다.
[0039] 도 1. iPSC 유전자 편집 및 단일 세포 복제의 개략도. CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용하여 TAG-72 CAR을 녹인(KI: knock-in)하거나(특허 PCT/AU2020/050800 및 WO2017/088012에 설명된 대로) 또는 iPSC에서 DGK 유전자(DGKα 및/또는 DGKζ)를 녹아웃(KO: knock-out)하거나 또는 CAR iPSC 클론에서 DGK 유전자(DGKα 및/또는 DGKζ)를 녹아웃하였다. iPSC가 다시 정상적으로 성장할 때까지 전기천공에 의해 iPSC 또는 CAR iPSC 클론이 복구되도록 하였다. 이는 일반적으로 전기천공 후 4~6일 이후에 발생한다. 80% 콜로니 컨플루언시에 도달하면 iPSC를 단일 세포 분류 전 11일까지 확장시켰다(I 상). 형질감염되지 않은 iPSC를 야생형이라고 한다. 하기 실시예에서, I 상 종료 시 편집된 iPSC 또는 CAR iPSC 클론을 사전 분류된(전-sorted) 것으로 칭한다. iPSC의 단일 세포 분류는 FACSAria TM Fusion 세포 분류기를 사용하여 수행되었으며 단일 세포로부터의 콜로니 형성은 9~12일 동안 진행되었다. 그 후, 필요한 세포 수에 도달할 때까지 클론을 확장하고(II 상) 클론 iPSC의 정확성과 순도를 결정하기 위해 유전자 분석을 수행하였다. II 상 말기의 iPSC는 하기 실시예에서, 단일 세포 클론이라 칭한다.
[0040] 도 2A-2C. CRISPR/Cas9는 iPSC의 DGKα 유전자의 오픈 리딩 프레임에 삽입 및 결실(인델: indel)을 도입한다. DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 표적 서열을 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA) 형성된 리보핵단백질(RNP)을 iPSC에 형질감염시키고 CRISPR 편집 추론(ICE) 분석을 통해 인델(indel) 빈도를 평가하였다. (A) DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA 형질감염된 iPSC("편집된 샘플")(SEQ ID NO: 17) 및 형질감염되지 않은 iPSC("대조군 샘플")(SEQ ID NO: 18)로부터의 Sanger 시퀀싱 트레이스를 도시한다. 편집된 샘플은 형질감염되지 않은 대조군 샘플과 달리 절단 부위 하류의 염기가 이질적으로 혼합되어 있음을 보여준다. 대조군 샘플의 검정색 밑줄 친 영역은 가이드 서열을 나타내고 수평 붉은색의 밑줄 친 점선 영역은 연관된(프로토스페이서 인접 모티프) PAM 사이트이다. 두 트레이스의 검은색 수직 점선은 절단 부위를 나타낸다. (B) DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA RNP 형질감염된 iPSC로부터의 게놈 DNA에서 각각의 편집된 서열(정규화)의 기여도의 상대적 백분율. 인델 +1: SEQ ID NO: 19; 인델 0: SEQ ID NO: 20; 인델 -1: SEQ ID NO: 21; 인델 -8: SEQ ID NO: 22; 인델 -11: SEQ ID NO: 23; 인델 -11: SEQ ID NO: 24; 인델 -2: SEQ ID NO: 25; 인델 -11: (SEQ ID NO: 26); 인델 -2: SEQ ID NO: 27. (C) DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA RNP 형질감염된 iPSC의 전체 편집된 집단에서의 인델 크기 분포. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 시프트를 나타내거나 길이가 21bp를 초과하는 인델의 비율이다. 피어슨 상관 계수에 의해 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다.
[0041] 도 3A-3B. DGK 유전자의 CRISPR/Cas9 편집은 여러 iPSC 계통에서 성공적으로 매개된다. DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 gRNA 표적화 표적 서열 및 DGKζ 유전자(SEQ ID NO: 11)의 gRNA 표적화 표적 서열 형성된 RNP를 서로 다른 세포 유형으로부터 전달된 두 개의 상이한 iPSC 세포주에 형질감염시켰으며, 두 개의 독립 컴퍼니로부터의 상이한 방법을 이용하여(iPSC 세포주 1 (A) 또는 iPSC 세포주 2 (B)), DGKα 또는 DGKζ 단일 KO(DGKα KO 또는 DGKζ KO iPSC) 또는 DGKα 및 DGKζ 이중 KO(DGKαζ KO iPSC)를 생성한다. iPSC 세포주 1은 iPSC 재프로그래밍 인자의 에피솜 전달을 사용하여 단핵 세포로부터 파생되었다. iPSC 세포주 2는 제대혈 분획에서 얻은 세포에서 파생되었으며 iPSC 인자의 센다이 바이러스 전달을 사용하여 재프로그래밍되었다. DGKα 및 DGKζ 유전자의 KO 효율은 ICE를 사용하여 분석되었다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 시프트를 나타내거나 길이가 21bp를 초과하는 인델의 비율이다. 피어슨 상관 계수에 의해 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다.
[0042] 도 4A-4D. gRNA는 단일 세포 클론에서 DGK 유전자의 성공적인 CRISPR/Cas9 편집을 매개한다. DGKα 유전자의 gRNA 표적화 표적 서열 및 DGKζ 유전자의 gRNA 표적화 표적 서열(각각 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 11) 형성된 RNP를 iPSC에 형질감염시키고 DGKα KO (A), DGKζ KO (B) 및 DGKαζ KOs DGKα 인델% (C) 및 DGKζ 인델% (D)를, 다양한 단일 세포 클론에서 ICE를 사용하여 분석하였다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 시프트를 나타내거나 길이가 21bp를 초과하는 인델의 비율이다. 99%~100%의 프레임 외 인델 백분율을 갖는 iPSC 단일 세포 클론들을 단일 세포 클론 후보로 선택하였다. 클론 명칭은 유전자 이름 뒤에 숫자가 오는 방식으로 정한다.
[0043] 도 5A-5B. 형질감염되지 않은(야생형), DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC 및 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 01의 DGK 유전자에서 gRNA 절단 부위의 Sanger 시퀀싱 트레이스. RNP 형질감염 후 염기 믹스를 DGK KO 사전 분류된 iPSC 게놈의 절단 부위 하류에 도입하였다. 분류 및 단일 세포 클로닝 후, 하나의 티민(T) 삽입(+1)이 있는 단일 세포 iPSC 클론(DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 01)이 DGK KO 사전 분류된 iPSC로부터 확인되었으며 이는 DGKα(A) 및 DGKζ(B) 유전자의 절단 부위 하류에 있는 염기 믹스를 제거함으로써 입증된다. 대조군 샘플의 검은색 밑줄이 그어진 영역은 가이드 서열을 나타내고 수평 붉은색 점선 밑줄이 그어진 영역은 관련 PAM 사이트이다. 두 트레이스의 검은색 수직 점선은 절단 부위를 나타낸다. (A)에는 다음 서열이 도시되어 있다: 형질감염되지 않은(야생형) iPSC: SEQ ID NO: 28; DGKα 및 DGKζ RNP 형질감염된 벌크 iPSC: SEQ ID NO: 29; DGKα 및 DGK ζ RNP 공동 형질감염된 iPSC 단일 세포 클론: SEQ ID NO: 30. (B)에는 다음 서열이 표시된다: 형질감염되지 않은(야생형) iPSC: SEQ ID NO: 31; DGKα 및 DGKζ RNP 형질감염된 벌크 iPSC: SEQ ID NO: 32; DGKα 및 DGK ζ RNP 공동 형질감염된 iPSC 단일 세포 클론: SEQ ID NO: 33.
[0044] 도 6. TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론에서 DGK 유전자의 CRISPR/Cas9 편집이 성공적으로 매개된다. TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론은 도 1에 기술된 바와 같이 생성되었다. 이어서, DGKα 유전자의 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA 및 DGKζ 유전자의 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA (각각 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 11) 형성된 RNP를 3개의 서로 다른 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론(TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론 B11, C4 및 D7)에 형질감염시켜 TAG-72 CAR 클론/DGKαζ KO iPSC를 생성하였다. TAG-72 CAR 클론/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC에서 DGKα 및 DGKζ 유전자 KO의 KO 효율을 ICE를 사용하여 개별적으로 분석하였다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 시프트를 나타내거나 길이가 21bp를 초과하는 인델의 비율이다. 피어슨 상관 계수에 의해 계산된 R2 값은 인델 백분율의 신뢰도를 나타낸다.
[0045] 도 7. TAG-72 CAR/DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론의 성공적인 생성. TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론은 도 1에 기술된 바와 같이 생성되었다. 이어서, DGKα 유전자의 gRNA 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA 및 DGKζ 유전자의 gRNA 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA(각각 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 11) 형성된 RNP를 TAG-72 CAR iPSC 단일세포 클론 B11에 형질감염시켜 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론(1-12)을 생성하였다. DGKα 및 DGKζ 유전자의 KO 효율은 ICE를 사용하여 개별적으로 분석되었다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 시프트를 나타내거나 길이가 21bp를 초과하는 인델의 비율이다. 프레임 외 인델 백분율이 99%~100%인 클론들을 단일 세포 클론 후보로 선택하였다. 숫자 1-12는 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론을 나타내고 강조 표시된 것은 성공적인 KO를 나타낸다.
[0046] 도 8A-8B. iPSC에서 DGKα 및/또는 DGKζ의 유전자 결실은 iPSC 만능성에 영향을 미치지 않는다. 이는 (A) 콜로니 형태학(눈금 막대 = 1mm) 및 (B) 만능 마커 TRA-1-60 및 SSEA-4의 표면 발현을 특징으로 한다. iPSC에서 DGK 이소형의 TAG-72 CAR KI, 단일 유전자(DGKα 또는 DGKζ) 및 이중 유전자(DGKαζ) KO는 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 수행되었다. 만능 줄기세포 마커(TRA-1-60 및 SSEA-4)는 유세포 분석법으로 분석되었으며, 여기서 히스토그램(도 8B)은 모든 살아있는 세포에 대한 각 다능성 마커의 발현을 나타낸다(PI를 통한 죽은 세포, 파편 및 이중선은 게이트 아웃된다). 양성 항체 염색을 강조하기 위해 염색되지 않은 대조군이 히스토그램에 포함되어 있다.
[0047] 도 9A-9B. DGKα 및/또는 DGKζ의 유전자 결실 및 iPSC로의 TAG-72 CAR 삽입은 비형질감염(NT) 대조군과 비교하여 iPSC의 성장에 영향을 미치지 않는다. 그래프는 iPSC 확장의 시간 경과를 나타낸다. (A) 각 대립유전자 KO 간의 직접 비교. (B) 두 개의 상이한 CAR iPSC 단일 세포 클론에서 수행된 DGKαζ KO; 두 가지 모두 형질감염되지 않은 iPSC(NT) 계통과 관련됨. (A): 파란색 선(NT)은 형질감염되지 않은 iPSC를 나타낸다. 붉은색 선(DGKα)은 DGKα KO iPSC 단일 세포 클론 16을 나타낸다. 녹색 선(DGKζ)은 DGKζ KO iPSC 단일 세포 클론 02를 나타낸다. 보라색 선은 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 24를 나타낸다. (B): 파란색 선(NT)은 형질감염되지 않은 iPSC를 나타낸다. 붉은색 선 TAG-72 CAR(클론 D7)은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론 D7(DGK a및/또는 DGK zKO 없음)을 나타낸다. 녹색 선 TAG-72 CAR 클론/DGKαζ KO(클론 D7)는 사전 분류된 TAG-72 CAR 클론 D7/DGKαζ KO iPSC를 나타낸다.
[0048] 도 10. iPSC에서 iNK로의 분화 방법 모식도. iPSC는 1상에서 리프팅되어 혈액생성/조혈 계통으로 분화되었다. 그런 다음 CD34+ 세포는 2상에서 림프 전구세포로 분화되어 3상에서는 iNK 세포로 지향된다.
[0049] 도 11A-11B. TAG-72 CAR KI 및 DGK 유전자 KO는 iPSC의 CD34+ 세포로의 분화에 영향을 미치지 않는다. iPSC에서 DGK 이소형의 TAG-72 CAR KI, 단일 유전자(DGKα 또는 DGKζ) 또는 이중 유전자(DGKαζ) KO는 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 수행되었다. 이후 iPSC를 CD34+ 세포로 분화하고 유세포 분석으로 분석하였다. 대표적인 유세포 분석 플롯은 TAG-72 CAR의 부재 (A) 또는 존재 (B) 하에서 CD34+ 세포의 집단 빈도를 보여준다. A: iPSC(비형질감염)는 비형질감염 iPSC에서 유래된 CD34+ 세포를 나타낸다; DGKα KO(클론 16)는 DGKα KO iPSC 단일 세포 클론 16에서 유래된 CD34+ 세포를 나타내고; DGζ KO(클론 07)는 DGKζ KO iPSC 단일 세포 클론 07로부터 유래된 CD34+ 세포를 나타내며; DGKαζ KO(클론 24)는 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 24로부터 유래된 CD34+ 세포를 나타낸다. B: iPSC(비형질감염)는 이 실험에서 비형질감염 iPSC로부터 유래된 CD34+ 세포를 나타낸다. TAG-72 CAR(클론 D7)은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론(클론 D7)으로부터 유래된 CD34+ 세포를 나타내고; 사전 분류된 TAG-72 CAR(클론 D7)/DGKαζ KO는 사전 분류된 TAG-72 CAR 클론 D7/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC로부터 유래된 CD34+ 세포를 나타낸다. CD34의 세포 표면 발현에 대한 히스토그램 표현은 배양 중인 살아있는 세포에 대한 것이다. 죽은 세포, 파편 및 더블릿은 게이트 아웃되었다. 양성 항체 염색을 강조하기 위해 염색되지 않은 대조군(파란색)이 히스토그램에 포함되어 있다.
[0050] 도 12A-12B. CRISPR/Cas9는 TAG-72 CAR이 있거나 없는 iNK에서 DGK 유전자의 KO를 중재한다. TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론은 도 1에 설명된 바와 같이 생성되었다. DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 표적 서열을 표적화하는 gRNA 및 DGKζ 유전자(SEQ ID NO: 11)의 표적 서열을 표적화하는 gRNA 형성된 RNP를 사용하여 TAG-72 CAR 클론/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC를 생성하였다 (A). 유사하게, 도 1(B)에 기술된 바와 같이 DGKα 유전자(SEQ ID NO: 3)의 표적 서열을 표적화하는 gRNA 및 DGKζ 유전자(SEQ ID NO: 11)의 표적 서열을 표적화하는 gRNA 형성된 RNP를 사용하여 DGKαζ KO iPSC를 생성하고 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론을 형성하였다. 그런 다음 TAG-72 CAR 클론 D7/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC 및 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 24를 iNK 세포로 분화시켰다. iNK 세포에서 DGKα 및 DGKζ 유전자의 KO 효율을 ICE를 사용하여 분석하였다. 프레임 외 인델 백분율은 프레임 시프트를 나타내거나 길이가 21bp를 초과하는 인델의 비율이다.
[0051] 도 13. TAG-72 CAR KI 및 DGK 유전자 KO는 iPSC당 생성된 iNK 세포의 수에 영향을 미치지 않는다. iPSC에서 DGK 이소형의 TAG-72 CAR KI, 단일 유전자(DGKα 또는 DGKζ) 또는 이중 유전자(DGKαζ) KO는 이전에 설명한 대로 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 수행되었다. 그런 다음 iPSC를 iNK 세포로 분화하였다. 비형질감염된 iPSC에서 생성된 iNK 세포의 기준 수율과 비교하여, CAR 작제물을 포함하거나 포함하지 않은 KO iPSC 단일 세포 클론으로부터 분화된 iNK 세포(CD56+ 세포)의 대표적인 수율을 2-5개의 샘플에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타낸다, 즉, 임의의 유전자 편집 샘플에서 대표 수율 점수 1은 이 샘플이 형질감염되지 않은 iPSC에서 나온 것과 동일한 수의 iNK 세포를 생성했음을 나타낸다. 따라서 유전자 편집은 iNK 수율에 아무런 영향을 미치지 않는다. iNK(비형질감염)는 비형질감염 iPSC에서 유래된 iNK를 나타낸다; iNK DGKα KO는 DGKα KO iPSC 단일 세포 클론에서 파생된 iNK를 나타낸다; iNK DGKζ KO는 DGKζ KO iPSC 단일 세포 클론에서 유래된 iNK를 나타낸다; iNK DGKαζ KO는 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론으로부터 유래된 iNK를 나타낸다; iNK TAG-72 CAR은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론으로부터 유래된 iNK를 나타내며; iNK TAG-72 CAR/DGKαζ KO는 사전 분류된 TAG-72 CAR 클론/DGKαζ K iPSC로부터 유래된 iNK를 나타낸다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 통계는 모든 그룹에 걸쳐 수행되었다. 유의미한 차이는 확인되지 않았다.
[0052] 도 14A-14B. TAG-72 CAR KI 및 DGK 유전자 KO는 iNK의 표현형을 변경하지 않는다. iPSC에서 DGK 이소형의 TAG-72 CAR KI, 단일 유전자(DGKα 또는 DGKζ) 또는 이중 유전자(DGKαζ) KO는 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 수행되었다. 그런 다음 iPSC를 iNK 세포로 분화하고 표현형을 유세포 분석으로 평가하였다. TAG-72 CAR의 부재(A) 또는 존재(B)에서 KO iPSC와 구별된 iNK의 대표적인 표현형 분석. 유세포 분석을 위해 죽은 세포, 파편 및 더블릿을 게이트 아웃하고 각 히스토그램이 배양의 모든 살아있는 세포를 나타낸다. NK 수용체 CD56, CD45, NKp46, NKG2D, Nkp44 및 2B4에 대한 양성 항체 염색을 강조하기 위해 염색되지 않은 대조군(파란색)이 히스토그램에 포함되어 있다. iNK(비형질감염)는 비형질감염 iPSC에서 유래된 iNK를 나타내고; iNK DGKα KO(클론 16)는 DGKα KO iPSC 단일 세포 클론 16으로부터 유래된 iNK를 나타내며; iNK DGKζ KO(클론 07)는 DGKζ KO iPSC 단일 세포 클론 07로부터 유래된 iNK를 나타내고; iNK DGKαζ KO(클론 24)는 DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 24로부터 유래된 iNK를 나타내며; iNK TAG-72 CAR(클론 D7)은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론 D7로부터 유래된 iNK를 나타내고; iNK TAG-72 CAR(클론 D7)/DGKαζ KO(사전 분류)는 TAG-72 CAR 클론 D7/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC로부터 유래된 iNK를 나타내며; iNK TAG-72 CAR(클론 C4)은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론 C4로부터 유래된 iNK를 나타내고; iNK TAG-72 CAR(클론 C4)/DGKαζ KO(사전 분류)는 TAG-72 CAR(클론 C4)/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC로부터 유래된 iNK를 나타낸다.
[0053] 도 15A-15C. TAG-72 CAR KI 및 DGK 유전자 KO는 OVCAR-3 종양 세포에 대한 iNK 세포 세포독성을 향상시킬 뿐만 아니라 동일한 세포에 반복적으로 노출된 후 생존/수명을 향상시킨다. iPSC에서 DGK 이소형의 TAG-72 CAR KI 및 이중 유전자(DGKαζ) KO는 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 수행되었다. 그런 다음 iPSC를 iNK 세포로 분화하고 OVCAR-3 세포에 대한 세포독성을 실시간 세포 모니터링 시스템(xCELLigence®)을 사용하여 구하였다. iNK 세포의 생존/수명은 반복 항원 노출 분석에서 평가되었다. DGKαζ KO가 있거나 없는 TAG-72 CAR iNK 세포의 세포독성 기능은 72시간에 걸쳐 OVCAR-3 세포의 사멸 효율로 표시된다 (A). 살해 효율은 처리되지 않은 OVCAR-3 대조군에 비해 처리 후 남은 OVCAR-3 세포의 비율로 계산되었다. 또한, OVCAR-3 세포에 미리 노출된 iNK 세포의 세포독성 기능을 xCELLigence를 사용하여 평가하고 20시간에 걸쳐 표준화된 세포 지수로 제시하였다 (B). 표준화된 세포 지수는 제조업체의 권장 사항에 따라 계산되었다. (C) OVCAR-3 세포에 대한 72시간 반복 노출 후 배양물에 남아 있는 iNK 세포의 수도 표시된다. iNK TAG-72 CAR(클론 C4)은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론(클론 C4)으로부터 유래된 iNK 세포를 나타내고; iNK TAG-72 CAR(클론 C4)/DGKαζ KO(사전 분류)는 TAG-72 CAR(클론 C4)/DGKαζ KO 사전 분류된 iPSC로부터 유래된 iNK 세포를 나타내고; iNK TAG-72 CAR(클론 D7)은 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론 D7로부터 유래된 iNK 세포를 나타내고; iNK TAG-72 CAR(클론 D7)/DGKαζ KO(사전 분류)는 TAG-72 CAR(클론 D7)/DGKαζ K 사전 분류된 iPSC로부터 유래된 iNK 세포를 나타낸다.
[0054] 도 16A-16B. DGKαζ KO iNK 세포는 형질감염되지 않은 iNK 대조군에 비해 향상된 살해 능력을 나타낸다. (A) xCELLigence® 실시간 세포 모니터링 시스템으로 측정한 DGKαζ KO 및 형질감염되지 않은 iNK 세포에 대한 24시간에 걸친 정규화된 세포 지수(CI) 판독값. 오차 막대 = SEM, NGM = OVCAR-3 세포의 정상적인 성장 배지. (B) 증식 촉진 마커 Ki67의 발현은 azOVCAR-3 세포로 120시간 동안 반복된 항원 자극 후에 DGK KO iNK 세포에서 증가되거나 정상적인 NK 성장 조건 하에 배양물에 방치된다. 반복된 항원 자극 120시간 종료 시 유동 세포 계측법으로 측정한 Ki67+ CD56+ 양성 세포의 비율. 오차 막대 = SEM.
[0055] 도 17. iNK 세포에 DGKαζ KO를 포함시키면 형질감염되지 않은 iNK 세포(DGKαζ KO가 없는 iNK 세포)와 비교하여 생체내에서 종양 크기를 줄이고 피하 운반 노드 스키드 감마(NSG) 마우스의 생존을 연장하는 기능적 이점을 제공한다. 난소암(OVCAR-3) 종양. iNK 세포(DGKαζ KO가 있거나 없음)에 14일 간격으로 3x106 개의 세포를 주입하였다. 점선은 각 iNK 주입이 수행된 시기를 나타낸다. iNK 세포는 주입 전 7일 동안 NK 성장 배지에서 시험관내에서 회수되었다. 생체내 실험 동안 사이토카인 지원은 함께 투여되지 않았다. (그룹당 n=4마리의 마우스).
[0056] 도 18A-18C. DGKαζ 유전자 결실은 iNK를 TGFβ 면역 억제에 대해 저항성으로 만든다. (A) 시험관내에서 난소암 세포(OVCAR-3)를 표적으로 하는 DGKαζ K가 있거나 없는 iNK 세포를 10 ng/mL의 TGFβ 첨가 여부에 관계없이 배양 배지에서 xCELLigence를 통해 세포독성 기능에 대해 평가하였다. (B) xCELLigence® 실시간 세포 모니터링 시스템으로 측정한 표준화된 세포 지수(CI) 판독값은 2:1(이펙터:표적) 비율에서 TGFβ 첨가가 형질감염되지 않은 iNK 세포 기능을 억제했지만 DGKαζ KO를 포함하는 세포에서 iNK 기능은 억제하지 않았음을 보여주었다. xCELLigence 곡선은 평균 + 표준 편차(n=3)를 나타낸다. (C) DGKαζ KO가 있거나 없는 TAG-72 CAR(클론 D7) iNK 세포를 xCELLigence를 통해 100 ng/mL의 TGFβ를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양 배지에서 시험관내에서 난소 암 세포(OVCAR-3)에 대한 세포독성 기능을 평가하였다. xCelligence® 곡선은 평균 + 표준 편차(n=3)를 나타낸다.
[0057] 도 19. TGFβ R1/2 유전자 편집은 iPSC의 만능성 손실과 자발적 분화를 초래한다. iPSC 콜로니 형태를 RNP 형질감염 후 광학 현미경으로 검사하였다. 형질감염되지 않은(NT) iPSC와는 대조적으로, TGFβR1 및 TGFβR2 우성 음성 녹아웃 iPSC 콜로니는 표적 형질감염 후 자발적인 분화를 나타냈다.

[0058] 도 20A-20C. 유전자 편집된 iNK 세포의 표현형 및 기능에 대한 시험관내 특성 분석. (A) 생체내 투여 전 다양한 iNK 이펙터 집단의 유세포 분석. CAR 및 NK 표면 수용체 발현은 CD45+ CD56+ 이중 양성 모집단의 백분율로 반영된다. (B) DGKα KO(비-클론 유래)(n=2)를 갖는 향상된 TAG-72 CAR iPSC 계통으로부터 생성된 iNK 세포에서 수행된 인델 %를 특징으로 하는, DGKα 및 ζ 유전자의 ICE 분석. (C) iNK 기능적 살해 분석: 이펙터를 1:2 및 1:1의 E:T 비율로 OVCAR-3 표적 세포에 첨가하고 xCELLigence® 시스템을 사용하여 20시간 동안 모니터링하였다. NCI = 정규화된 세포 지수.
[0059] 도 21A-21E. TAG-72 CAR 및 TAG-72 CAR/DGKαζ iNK 세포의 생체내 기능. (A, B) 두 번의 독립적인 실험에서 얻은 루시퍼라제 표지 OVCAR-3 종양 세포를 보유한 면역 저하 NSG 마우스의 대표적인 생물발광 이미지(BLI). 이미지는 표시된 대로 동결-해동된 NK 세포 투여 후 여러 시점을 반영한다. (C) 각 마우스 그룹에 대한 -1일 기준선 BLI 판독값(각 그룹에 대한 중앙 BLI로 표시됨)을 기준으로 한 시간 경과에 따른 플럭스 단위(광자/초)의 배수 변화로 플롯된 종양 부담의 정량화. (D, E) 치료 후 각 시점에서 개별 마우스 BLI 신호(기준선에 대한 배수 변화로 표시)를 보여주는 히스토그램. n = 그룹당 4-5마리의 마우스, 3번의 독립적인 실험. 오차 막대는 각 그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다.
[0060] 도 22A-22C. TAG-72 CAR + DGKαζ로 유전자 편집된 iPSC는 iT 세포로 분화되었다. (A) TIDE 분석에 의한 TAG-72 CAR iPSC에서 DGKα 및 DGKζ의 인델 효율. (B) 편집되지 않은 iT 세포를 TAG-72 CAR + DGKαζ iT 세포(비-클론 유래)와 비교하는, T 세포 마커 및 CAR 발현의 유세포 분석. (C) iT(비편집) 및 난소암 세포주 OVCAR-3(TAG-72를 발현함)를 표적으로 하는 TAG-72 CAR + DGKαζ KO iPSC로부터 분화된 iT 세포와 비교한, 건강한 공여자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 분획으로부터 단리된 T 세포의 세포독성 기능 분석.
[0061] 도 23A-23C. TGFβ 존재 하에서 TAG-72 CAR iT/DGK bαζ KO 세포의 시험관내 기능. (A) 시험관내에서 iT 세포 기능에 대한 TGFβ 사전 컨디셔닝의 영향을 평가하기 위해 구현된 방법론의 모식도. (B-C) iT 세포 시험관내 세포독성 분석: 이펙터 ± TGFβ(B: 10 ng/mL, C: 100 ng/mL)를 1:1의 E:T 비율로 OVCAR-3 표적에 첨가하고 실시간 세포 모니터링 시스템인 xCELLigence®를 사용하여 40시간 동안 모니터링하였다. TAG-72 CAR-iT/DGKαζ KO 세포(보라색)의 기능을 iT(비형질감염) 대조군(회색)과 비교하였다. 표적 세포 단독 ± TGFβ(청색)를 동시에 유지하고 모니터링하여 이펙터가 없는 경우 OVCAR-3 세포주의 성장 동역학을 제공하였다. 데이터는 이펙터 세포를 추가한 시점으로 정규화되어 임의 단위인 정규화된 세포 지수로 표시된다. 각 데이터 포인트는 기술적 삼중 항목의 평균 ± SD를 나타낸다.
상세 설명
[0062] 본 명세서 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 그 밖의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것이 아니다.
[0063] 명세서 및 청구범위를 통해 "a" 및 "an"이라는 용어는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 간주되어야 하며, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 "둘 이상"을 제외하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
[0064] 본 명세서에 사용된 "핵산 작제물"은 일반적으로 인공적으로 또는 재조합적으로 구성되거나 만들어진 핵산 분자를 의미하며, 또한 핵산 벡터로서 상호교환적으로 지칭된다. 예를 들어, 핵산 작제물은 세포에서 전사하고자 하는 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 만들어질 수 있으며, 일부 경우에는 원하는 기능의 RNA 분자(예컨대 안티센스 RNA, siRNA, miRNA 또는 gRNA)를 생산하기 위해, 그리고 다른 경우에는 관심 단백질(예컨대 Cas 단백질)로 번역되는 mRNA를 생성하기 위해 만들어질 수 있다. 핵산 작제물에서 관심 대상 뉴클레오타이드 서열은 5' 조절 영역(예를 들어, 이종 프로모터와 같은 프로모터) 및/또는 3' 조절 영역(예를 들어, 이종 3' UTR과 같은 3' 비번역 영역(UTR))에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산 작제물은 원형(예컨대 플라스미드) 또는 선형 형태일 수 있고, 통합 핵산일 수 있으며(예컨대 렌티바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있음) 또는 에피솜(예컨대 플라스미드)으로 남아 있을 수 있다.
[0065] "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값으로부터 ±10%의 변동으로 이해되어야 한다.
[0066] "생체외(ex vivo)" 라는 용어는 세포가 살아있는 유기체로부터 제거되어 유기체 외부(예컨대 시험관 내)에서 증식되는 과정을 의미한다.
[0067] "생체내(in vivo)" 라는 용어는 유기체(예를 들어 동물, 식물 및/또는 미생물) 내에서 발생하는 사건을 의미한다.
[0068] 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
일반적인 설명
[0069] 향상된 기능을 갖는 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법이 본원에 개시된다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 줄기세포에서 하나 이상의 선택된 유전자를 절제하면 줄기세포가 면역세포로 분화하는 능력을 방해하지 않는다는 것이 본원에서 입증되었다. 또한 이러한 변형된 줄기세포에서 생성된 면역세포는 향상된 지속성, 시험관내 항종양 활성 및 TGFβ의 면역억제 효과에 대한 저항성을 포함한다는 것도 입증된 바 있다. 따라서, 줄기세포에서 하나 이상의 선택된 유전자의 기능을 억제함으로써 방법이 제공된다. 또한, 본 줄기세포를 NK 세포, T 세포 등의 면역세포로 분화시키는 방법도 제공된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 변형된 줄기세포 및 생성된 면역세포뿐만 아니라 치료학적 치료에서 면역세포의 용도가 본원에 개시된다.
원천 세포
[0070] 본 명세서에 사용된 "원천 세포(sourse cell)"는 재프로그래밍 또는 분화에 의해 "파생 세포(derived cell)"로 전환되는 세포를 의미한다. 본 명세서에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 원천 세포의 예에는 줄기세포가 포함된다.
[0071] "줄기세포"라는 용어는 특정 유전적 구성을 고려할 때 여러 계통의 방향으로 발달하여 새로운 유기체를 형성하거나 어떤 유기체의 조직 또는 세포 집단을 재생시킬 가능성을 나타내는 모든 세포를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따라 활용되는 줄기세포는 둘 이상의 계통을 따라 분화할 수 있는 임의의 적합한 유형일 수 있으며, 이의 예로는 배아 줄기세포(ESC), 성체 줄기세포, 제대 줄기세포, 조혈 줄기세포(HSC), 전구세포(progenitor cell), 선구세포(precursor cell), 만능 세포, 다능성 세포 또는 역분화 체세포(예컨대 유도된 만능 줄기세포)를 들 수 있지만 이에 국한되지 않다. "만능"이라 함은 대상 줄기세포가 자가 재생되고 분화하여 특히 3개의 배엽층(외배엽, 내배엽 및 중배엽) 중 어느 하나의 세포를 형성할 수 있음을 의미한다.
[0072] 일부 구현예에서, 원천 세포는 또한 적어도 하나의 동형접합성 HLA 일배체형을 발현한다. 일부 구현예에서, 원천 세포는 주요 이식 항원이고 좋기로는 집단의 상당한 비율, 예를 들어 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 17%, 적어도 20% 또는 그 이상에 의해 발현되는 적어도 하나의 동형접합성 HLA 일배체형을 발현한다. 동형접합성 HLA 일배체형이 지배적인 MHC I 또는 MHC II HLA 유형(조직 거부 측면에서)에 해당하는 경우, 이러한 세포를 사용하면 치료 요법의 맥락 상 본 발명의 세포를 받은 더 넓은 집단에서 조직 거부 문제가 크게 감소할 것이다. 다른 구현예에서, 원천 세포는 하나 이상의 HLA 항원, 예를 들어 2개, 3개 또는 그 이상의 HLA 항원과 관련하여 동형접합성일 수 있다. 관심 대상 HLA 항원은 예를 들어 HLA A1, B8, C7, DR17, DQ2 또는 HLA A2, B44, C5, DR4, DQ8 또는 HLA A3, B7, C7, DR15, DQ6 중에서 선택될 수 있다.
[0073] 일부 구현예에서, 원천 세포는 억제된 유전자와 관련하여 동형접합성이다.
[0074] 일부 구현예에서, 원천 세포는 본원에서 확인된 하나 이상의 유전자에서 유전적으로 변형되어 유전적으로 변형된 원천 세포로부터 분화된 표적 세포에서 변형된 유전자(들)의 기능이 억제된다.
[0075] 일부 구현예에서, 원천 세포는 또한 CAR(즉, 키메라 항원 수용체)을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형되기도 한다. CAR을 인코딩하는 핵산은 γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입, CRISPR-Cas9, TALEN 또는 ZFN 매개 유전자 편집과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 원천 세포에 도입될 수 있다(Themeli 외, Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy, Nat Biotechnol, 2013, 31(10): 928-33; Sadelain 외, Therapeutic T cell engineering, 2017, Nature, 545: 423-431; Eyquem 외, Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection, 2017, Nature, 543: 113-17).
iPSC
[0076] iPSC는 일반적으로 체세포에서 직접 생성된다. iPSC는 원칙적으로 혈액 및 피부 세포의 단핵구를 비롯한 모든 유핵 세포에서 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC는 완전히 분화된 T 세포로부터 생성될 수 있으며; 또는 TCR의 재배열을 시작하거나 심지어 완료하고 관심 있는 항원 특이성을 나타내는 흉선세포와 같은 선구 T 세포로부터 유래한다. 다른 구현예에서, iPSC는 관심 항원 결정자(예컨대 종양 항원 결정자)에 대한 TCR(예컨대 재배열된 TCR 유전자)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 형질감염된다. 일 구현예에서, iPSC는 재배열된 TCR, 좋기로는 재배열된 αβ TCR을 발현하는 세포로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 재배열된 γδ TCR을 발현한다. 본 발명의 iPSC를 생성하는 데 사용하기에 적합한 세포의 예에는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NKT 세포, 흉선세포 또는 다른 형태의 전구 T 세포가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
[0077] 성숙 또는 분화된 세포(T 세포 또는 선구 T 세포 등)로부터 iPSC를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, iPSC는 특정 세트의 만능성 관련 유전자 또는 "재프로그래밍 인자"를 체세포 유형에 도입하여 파생될 수 있다. 일반적으로 사용되는 재프로그래밍 인자 세트(야마나카 인자라고도 함)는 Oct4 (Pou5f1), Sox2, c-Myc, 및 Klf4 유전자이다. 이 조합은 iPSC 생산에 사용되는 가장 일반적인 조합일 수 있지만 각각의 인자들은 관련 전사 인자, miRNA, 소분자 또는 계통 지정자와 같은 관련 없는 유전자로 기능적으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 시스템을 사용한 Oct 3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 형질감염에 따른 iPSC 유도가 달성되었으며, 이는 렌티바이러스 시스템을 사용한 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 형질감염을 통해서도 달성되었다. 전사 인자의 전자 세트는 야마나카 인자로 알려져 있고 후자는 일반적으로 톰슨 인자로 알려져 있다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 기본 재프로그래밍 인자 발현 벡터에 대한 광범위한 변형이 이루어졌으며 효율성을 증가시키고 그렇지 않으면 재프로그래밍된 iPSC 게놈에 통합될 수 있는 벡터 서열을 최소화하거나 제거하기 위해, 새로운 전달 방식이 설계되었다. 이들 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Cre-Lox 매개 이식유전자 절제를 이용한 단일 카세트 재프로그래밍 벡터, 및 아데노바이러스 또는 센다이 바이러스와 같은 비통합 바이러스에 의한 재프로그래밍을 포함하지만 이에 국한되지는 않다. 대안적으로, 재프로그래밍 인자를 단백질로 발현하는 것은 도입된 벡터 DNA가 생식계열로 통합되지 않은 iPSC를 생성하는 수단을 제공한다. 비-바이러스 재프로그래밍 방법도 개발되었다. 이의 비제한적인 예로는 다음을 들 수 있다: mRNA Transfection (Warren et al (2010)), miRNA Infection/Transfection Subramanyam et al (2011); PiggyBac (Kaji et al (2009); Woltjen et al (2009)); Minicircle Vectors (Narsinh et al (2011)); and Episomal Plasmids (Chuo et al (2011)). 재프로그래밍 효율을 향상시키기 위해 다양한 소분자가 업계에 나타났으며, 이의 예로는 다음 표에 나열된 것을 들 수 있다.
iPSC 재프로그래밍 효율성을 높이는 화합물
[0078] 일부 구현예에서, 원천 세포는 파생된 만능 줄기세포(iPSC)이다. 일부 구현예에서 iPSC는 에피솜 또는 센다이 바이러스 형질전환에 의해 유래된다.
[0079] 일부 구현예에서 iPSC는 SSEA-4 및 TRA-1-60에 대해 > 98% 양성이다.
[0080] 일부 구현예에서, 대상 원천 세포는 다능성 줄기세포와 비교하여 면역세포를 향해 더욱 분화되는 세포이다.
[0081] 일부 구현예에서, 줄기세포는 비-바이러스 방법을 사용하여 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC는 비-바이러스 방법, 예를 들어 CRISPR/Cas 편집 시스템을 사용하여 변형될 수 있다.
[0082] 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 비-바이러스 편집 시스템, 예를 들어 CRISP R-Cas9를 사용하여 iPSC에 도입될 수 있다.
[0083] 일부 구현예에서, 유전 물질의 녹아웃(KO: Knocking-Out)는 비-바이러스 편집 시스템, 예를 들어 CRISP R-Cas9를 사용하여 iPSC에서 조작 될 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC에서 DGKα 및/또는 DGKζ 유전자의 KO는 비-바이러스 편집 시스템, 예를 들어 CRISP R-Cas9를 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, iPSC는 DGKαζ 유전자의 이중 KO를 포함하며, 이에 대한 유전자 조작은 비-바이러스 편집 시스템(예컨대 CRISP R-Cas9)을 사용하여 수행된다.
[0084] 일부 구현예에서, iPSC 원천 세포는 DGKαζ 유전자(DGKαζ KO iPSC)의 발현을 억제하도록 유전적으로 변형 된다.
[0085] 일부 구현예에서, iPSC 원천 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형되며, 여기서 상기 수용체는 항원 결정기에 대한 항원 인식 모이어티를 포함하고, 상기 항원 결정기는 종양 관련 항원 TAG-72(TAG-72 CAR iPSC)의 그것이다.
[0086] 일부 구현예에서, iPSC 원천 세포는 DGKαζ 유전자의 발현을 억제하고 TAG-72 CAR(TAG-72 CAR/DGK KO iPSC)을 추가로 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 이러한 유전적으로 변형된 iPSC는 만능성 및 배양물에서 증식되는 능력을 유지한다.
[0087] 일부 구현예에서, iPSC 원천 세포는 CD34+ 세포로 분화할 수 있다. 일부 구현예에서, DGK KO iPSC 및/또는 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC 두 가지 모두 CD34+ 혈액생성(hemogenic) 전구세포로 분화될 수 있다.
[0088] 일부 구현예에서, iPSC 원천 세포는 CD45+ CD56+ NK 세포로 분화할 수 있다. 일부 구현예에서, DGK KO iPSC 및/또는 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC는 정상적인 NK 자극 수용체를 발현하는 성숙한 NK 세포로 분화될 수 있다.
[0089] 일부 구현예에서, iPSC 원천 세포는 전구 T 세포로 분화할 수 있다. 일부 구현예에서, DGK KO iPSC 및/또는 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC는 두 가지 모두 주로 CD8+ 표현형을 갖는 성숙한 CD3+ T 세포로 분화할 수 있다. 일부 구현예에서, DGK KO iPSC 및/또는 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC는 두 가지 모두 TCR αβ 또는 TCRγδ를 발현하는 성숙한 CD3+ T 세포로 분화할 수 있다.
[0090] 일부 구현예에서, CAR은 비-바이러스 편집 시스템, 예를 들어 CRISP R-Cas9를 사용하여 iPSC에 도입된다. 일부 구현예에서, 생성된 유전적으로 편집된 iPSC는 CD34+ 세포 및/또는 전구 T 세포로 분화할 수 있다.
[0091] 일부 구현예에서, iPSC 유래 CD34+ 세포는 NK 세포(iNK 세포)로 분화할 수 있다. 일부 구현예에서, DGK KO iPSC 유래 CD34+ 세포 및/또는 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC 유래 CD34+ 세포는 두 가지 모두 분화 과정의 효율성에 유의미한 영향을 주지 않으면서 NK 세포로 분화할 수 있다.
[0092] 일부 구현예에서, iPSC 및/또는 TAG-72 CAR iPSC에서 단일 DGKα/ DGKζ 또는 이중 DGKαζ KO는 분화 후 상기 iPSC 유래 NK 세포 및/또는 TAG-72 CAR iPSC 유래 NK 세포의 정상적인 표현형에 영향을 미치지 않는다.
[0093] 일부 구현예에서, iPSC 및/또는 TAG-72 CAR iPSC의 단일 DGKα/DGKζ 또는 이중 DGKαζ KO는 분화 후 T 상기 iPSC 유래 T 세포 및/또는 TAG-72 CAR iPSC 유래 T 세포의 정상적인 표현형에 영향을 미치지 않는다.
중배엽 세포(Mesoderm cells)
[0094] 배아 발달 동안 세 가지 주요 세포 집단(일차 배엽층), 즉 중배엽, 외배엽 및 내배엽이 나타난다. 이러한 세포 집단은 낭배형성(gastrulation)이라는 과정을 통해 형성되며 이 과정에 따라 각 일차 생식 세포층은 특정 세트의 세포 집단과 조직을 생성한다. 예를 들어 중내배엽 또는 중배엽 집단은 심장, 혈관 및 혈액 세포(예컨대 면역세포)를 생성한다.
[0095] 면역세포를 형성하기 위해 중배엽 세포는 여러 분화 단계로 유도되며, 이들 분화 단계 각각은 혈액생성 내피(HE), 조혈 줄기세포(HSC), 전구세포 및 면역세포로 분류될 수 있는 뚜렷한 잠재력/표현형을 가진 세포의 하위 집단으로 표시된다. 각 분화 단계는 예를 들어 다른 세포 유형이 될 가능성을 제한하는 유전자 발현을 변경하여 해당 세포를 그의 최종 세포 유형에 더 가깝게 이동시킨다.
[0096] 일부 구현예에서, 대상 원천 세포는 면역세포로 분화할 수 있는 중배엽 세포이다.
조혈 계통 세포(Hematopoietic lineage cells)
[0097] "조혈 계통 세포"라는 용어는 중배엽 세포(만능 세포로부터 얻을 수 있음)로부터 분화된 임의의 세포로 이해되어야 하며, 예를 들어 HE, 전-HSC 및 HSC 및 전구세포(예컨대 다능 전구세포, 림프구 세포, 예컨대 공통 림프례 전구세포, 초기 흉선 전구세포, 전 T 세포 전구세포, 전 NK 전구세포, T 전구세포, NK 전구세포, 및 골수 전구세포, 예를 들어 총 골수 전구세포)가 이에 포함된다. "HE/HSC"라는 용어는 본원에서 조혈 계통 세포의 하위 클래스를 지칭한다. HE/HSC는 골수성(예컨대 대식세포 및 단핵구)과 림프성 세포 유형(예컨대 B 세포, T 세포 또는 NK 세포)을 모두 생성할 수 있는 CD34+ 줄기세포이며 HE, 전-HSC 및 HSC를 포함한다. iCD34+ 세포는 iPSC에서 분화된 CD34+ 발현 세포를 나타낸다.
[0098] 배아 발생 과정에서 다능성 중배엽 세포는 내피 세포 계통으로 분화된다. HE는 조혈 잠재력을 획득하고 내피에서 조혈로의 전환이라는 과정에서 다계통 조혈 줄기 및 전구세포를 발생시키는 이 계통의 하위 집합이다. 내피 세포의 혈액생성 특정화 및 혈액생성 내피로부터 HSC의 생성으로 이어지는 과정은 여전히 논란이 분분하다.
[0099] HSC는 이론적으로 조혈 과정을 통해 림프계 및 골수계 계통의 모든 혈액 세포가 될 수 있는 능력을 가진 혈액 줄기세포이다. HSC는 성인 골수, 말초혈, 제대혈에서 발견될 수 있다. HSC는 확립된 기술을 통해 골수, 말초혈 및 제대혈에서 수집할 수 있으며 일반적으로 CD34+ 발현과 관련이 있다.
[00100] 일부 구현예에서, 인간 HSC는 CD34+ CD38- CD90+ CD45RA-인 것으로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서 인간 HSC는 CD34+CD43+CD45+로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서 인간 HSC는 CD34+CD133+로 정의될 수 있다.
[00101] HSC가 만능 줄기세포로부터 유래된 경우, 흔히 iHSC(유도 조혈 줄기세포)라고 한다.
[00102] "전-HSC(전-HSC)"는 HE 세포로부터 분화되었지만 전형적인 HSC 마커를 발현하지 않는 세포, 예를 들어 CD34를 발현하는 CD45-세포로 이해되어야 한다.
[00103] 일부 구현예에서, 만능 줄기세포(예컨대 iPSC)로부터 배양된 세포로서, 배양시 면역세포로 일부 분화를 겪었으나 면역세포로 완전히 분화되지 않은 세포가 원천 세포로서 사용된다.
[00104] 일부 구현예에서, 면역세포로 분화할 수 있는 조혈 계통 세포가 원천 세포로서 사용된다. 일부 구현예에서 조혈 계통 세포는 아직 조혈 줄기세포(HSC)로 분화되지 않았으며, 예를 들어 조혈 내피(HE) 또는 전-HSC이다. 일부 구현예에서 이 조혈 계통 세포는 HSC이다.
[00105] 일부 구현예에서 대상 원천 세포는 골수 전구세포, 예를 들어 공통 골수 전구세포이다.
[00106] 일부 구현예에서, 대상 원천 세포는 림프 전구세포, 예를 들어 다분화성 전구세포, 공통 림프계 전구세포, 초기 흉선 전구세포, 전-T 세포 전구세포, 전-NK 전구세포, T 전구세포, NK 전구세포이다(갈렌 외, The unfolded protein response governs integrity of the haemopoietic stem cell pool during stress, Nature, 2014, Vol.510(7504), p.268). 일부 구현예에서, 대상 원천 세포는 흉선세포와 같은 미성숙 T 세포 또는 미성숙 NK 세포이다.
파생 세포(Derived cells)
[00107] 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 줄기세포 유래 면역세포에는 면역세포로 분화할 수 있는 조혈 계통 세포 및 면역세포가 포함된다. 줄기세포 유래 면역세포의 예로는 HE, 전-HSC, HSC, 다능성 전구세포, 림프계 전구세포, 예를 들어 공통 림프계 전구세포, 초기 흉선 전구세포, 전-T 세포 전구세포, 전-NK 전구세포, T 전구세포, NK 전구세포, 공통 골수 전구세포와 같은 골수 전구세포 및 면역세포를 들 수 있다.
[00108] 본원에 사용된 "면역세포"는 포유동물 면역계의 세포, 예를 들어 림프구(T 세포, B 세포 및 NK 세포), 호중구 및 단핵구(대식세포 및 수지상 세포 포함) 및 포유동물 면역체계의 세포로부터 유래된 세포주를포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[00109] 본 발명은 분화를 통해 생산된 줄기세포 유래 면역세포의 기능이 향상된 것을 제공하는 것을 목적으로 한다. "향상된 기능"이란, 대조군 면역세포(즉, 변형 또는 조작이 없는 면역세포)와 비교시, 본원에 개시된 변형 또는 조작의 결과로 제공되는 면역세포가 향상된 활성(예컨대 세포독성), 증식, 생존, 지속성, 면역억제 효과에 대한 내성(예컨대 TGFβ 억제) 및/또는 침윤을 나타냄을 의미한다. 면역세포의 세포독성은 일반적으로 수용체 기반 메커니즘을 통해 표적 세포를 죽이는 면역세포의 능력을 의미한다.
[00110] 일부 구현예에서, 본 방법에 따른 줄기세포 유래 면역세포는 줄기세포 또는 다른 더욱 분화된 세포(예컨대 줄기세포에서 배양되고 분화된 세포)로부터 분화될 수 있다.
[00111] 일부 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 NKT 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 NK 세포이다. 다른 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 대식세포 또는 대식세포 계통 세포(예를 들어 단핵구, 수지상 세포)이다.
T 세포
[00112] "T 세포"에 대한 언급은 T 세포 수용체를 포함하는 임의의 세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 이와 관련하여, T 세포 수용체는 α, β, γ 또는 δ 사슬 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, NKT 세포는 또한 T 세포 수용체를 발현하므로 표적 항원 특이적 NKT 세포도 본 발명에 따라 생성될 수 있다(그리고 T 세포의 정의에 포함되는 것으로 이해된다). 본 발명은 T 세포의 임의의 특정 서브클래스로 제한하려는 의도는 아니지만, 일 구현예에서 대상 T 세포는 α/β TCR 이량체를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ 킬러 T 세포, 또는 NKT 세포이다. 본 발명을 임의의 하나의 이론 또는 작용 방식으로 제한하지 않고, CD8+ T 세포는 세포독성 세포로도 알려져 있다. 적응 면역 체계의 주요 부분인 CD8+ T 세포는 주로 감염된 세포를 표적으로 삼아 파괴하기 위해 세포 내 환경을 스캔한다. 세포내 내용물에서 파생된 작은 펩타이드 단편은 처리되어 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서 제시되는 세포 표면으로 운반된다. 그러나 CD8+ T 세포는 단순히 바이러스 감염에 반응하는 것 이상으로 암을 포함한 손상되거나 비정상적인 세포를 모니터링하고 제거함으로써 추가적인 수준의 면역 감시 기능도 제공한다. MHC I 제시 펩티드의 CD8+ T 세포 인식은 일반적으로 세포독성 과립 또는 림포카인의 방출 또는 FAS/FASL 상호작용을 통한 세포사멸 경로의 활성화로 이어져 대상 세포를 파괴한다. 반면, CD4+ T 세포는 일반적으로 MHC 클래스 II의 맥락에서 항원 제시 세포에 의해 제시된 펩타이드를 인식하여 B 세포 및/또는 CD8+ T 세포 면역 반응을 조절하도록 설계된 사이토카인을 방출한다. 세포독성 활성을 갖는 CD4+ T 세포도 다양한 면역 반응에서 관찰되었다. 더욱이, CD4+ CAR-T 세포는 시험관내에서 CD8+ CAR-T 세포와 동등한 세포독성을 나타냈고, 심지어 더 긴 항종양 활성에 대해 생체내에서 CD8+ CAR-T 세포보다 성능이 더 뛰어났다(예를 들어, Wang 외, Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity, JCI Insight, 2018, 3(10):e99048; Yang 외, TCR engagement negatively affects CD8 but not CD4 CAR T cell expansion and leukemic clearance, Science Translation Medicine,　2017 Nov, 22; 9(417), eaag1209).
[00113] 일부 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 세포독성 면역세포, 예를 들어 세포독성 림프구이다.
[00114] 일부 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 림프 계통 세포이다. 일부 구현예에서 림프 계통 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ 킬러 T 세포, 또는 NKT 세포이다.
[00115] 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 줄기세포 유래 T 세포는 시험관내에서 항종양 활성을 입증한다. 일부 구현예에서, iPSC 유래 TAG-72 CAR/DGKαζ K T 세포는 시험관내에서 난소암 세포주에 대해 표적 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, TAG-72 CAR/DGKαζ KO T 세포는 형질감염되지 않은 iPSC 유래 T 세포 및 PBMC로부터 단리된 형질감염되지 않은 T 세포와 비교하여 인간 난소암 세포주(OVCAR-3)의 향상된 사멸을 나타낸다.
[00116] 일부 구현예에서, iPSC 유래 T 세포는 종양의 면역억제 미세환경에서 기능을 유지한다. 일부 구현예에서, iPSC 유래 DGKαζ KO T 세포는 예를 들어 종양 미세환경에서 면역억제의 핵심 매개체 중 하나인 TGFβ의 존재 하에 OVCAR-3 세포에 대한 시험관내 세포독성 기능을 유지하는 이러한 세포에 의해 입증되는 바와 같이, 종양의 억제 효과에 대해 감소된 민감성을 갖는다.
[00117] NK 세포 자연 살해 T 세포(NKT 또는 T/NK 세포라고도 함)는 반-불변 (semi-invariant) T 세포 수용체(TCRαβ) 및 일반적으로 자연 살해 세포와 관련된 표면 항원을 발현하는 특수 T 세포 집단이다. NKT 세포의 TCR은 MHC I 유사 분자 CD1d에 의해 제시된 당지질 항원을 일반적으로 인식한다는 점에서 독특하다. 대부분의 NKT 세포는 불변 TCR 알파 사슬과 소수의 TCR 베타 사슬 중 하나를 발현한다. I형 NKT 세포에 존재하는 TCR은 일반적으로 항원 알파-갈락토실세라마이드(α-GalCer)를 인식한다. 이 그룹 내에서 CD4+CD8- 세포, CD4-CD8+ 세포 및 CD4-CD8- 세포를 포함하여 식별가능한 하위 집단이 확인되었다. II형 NKT 세포(또는 비불변(noninvariant) NKT 세포)는 더 넓은 범위의 TCR α 사슬을 발현하고 알파-GalCer 항원을 인식하지 않다. NKT 세포는 염증을 촉진하거나 내성을 포함한 면역 억제를 유도하는 등 여러 가지 반대 효과를 갖는 사이토카인을 생성한다. 결과적으로 이들은 항균 및 항바이러스 면역 반응에 기여하고 종양 관련 면역감시를 촉진하며 자가면역 질환의 발병을 억제하거나 촉진할 수 있다. 자연살해세포와 마찬가지로 NKT 세포도 퍼포린, Fas, 및 TNF 관련 세포독성을 유발할 수 있다. 따라서, T 세포에 대한 언급은 NKT 세포에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[00118] 자연 살해(NK) 세포는 선천성 면역 체계의 일부를 형성하는 일종의 세포독성 림프구이다. NK세포는 바이러스에 감염된 세포에 빠르게 반응해 감염 후 약 3일 정도에 작용하고 종양 형성에도 반응한다. 일반적으로 T 세포와 같은 면역세포는 감염되거나 변형된 세포 표면에 존재하는 주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 감지하여 사이토카인 방출을 유발하고 표적 세포의 용해 또는 세포사멸을 초래한다. 그러나 NK 세포는 항체나 MHC가 없을 때 스트레스를 받는 세포를 인식하는 능력이 있어 훨씬 빠른 면역 반응을 가능하게 한다. MHC I 마커가 없거나 정상 수준보다 낮은 유해 세포는 T 세포와 같은 다른 면역세포에 의해 감지 및 파괴될 수 없기 때문에 이 역할은 특히 중요하다. NKT 세포와 대조적으로, NK 세포는 TCR 또는 CD3을 발현하지 않지만 일반적으로 표면 마커 CD16(FcγRIII) 및 CD56을 발현한다. 일부 구현예에서, 줄기세포 유래 면역세포는 NK 세포이다.
[00119] 일부 구현예에서, 향상된 기능을 갖는 줄기세포 유래 NK 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, iPSC 유래 DGKαζ KO NK 세포는 표적 암 세포와의 시험관내 연장된 공동 배양에서 각각의 형질감염되지 않은(이하 '비형질감염된'이라고도 함) iPSC 유래 NK 대조군 세포에 비해, 향상된 기능성 및 생존 기간을 나타낸다. iPSC 유래 NK 세포의 생존 및 세포독성 항종양 기능 향상에 대한 DGKαζ K의 중요성이 본원에서 확립되었다.
[00120] 일부 구현예에서, iPSC 유래 TAG-72 CAR/DGKαζ KO NK 세포는 시험관내에서 종양 세포의 향상된 사멸을 나타낸다(편집되지 않은 iPSC 유래 NK 세포 및 건강한 성인 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분획으로부터 단리된 NK 세포에 비해).
[00121] 일부 구현예에서, 향상된 증식 능력을 갖는 줄기세포 유래 NK 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 형질감염되지 않은 iPSC 유래 NK 세포에 비해 향상된 증식 능력을 나타내는 iPSC 유래 DGKαζ KO NK 세포가 본원에 개시된다.
[00122] 일부 구현예에서, iPSC 유래 NK 세포는 종양의 면역억제 미세환경에서 기능을 유지한다. 일부 구현예에서, 종양의 억제 효과에 대해 감소된 민감성을 갖는 iPSC 유래 DGKαζ KO NK 세포가 본원에 제공되며, 이는 예를 들어 종양 미세환경에서 면역억제의 핵심 매개체 중 하나인 TGFβ의 존재 하에 시험관내 세포독성 기능을 유지하는 이러한 세포에 의해 입증된다.
[00123] 일부 추가 구현예에서, 종양의 면역억제 미세환경에서 기능을 유지하는 iPSC 유래 TAG-72/DGKαζ KO NK 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 iPSC 유래 TAG-72/DGKαζ KO NK 세포는 면역억제성 미세환경을 나타내는 조건 하에서 종양 세포, 예를 들어 OVCAR-3 세포주의 사멸을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 iPSC 유래 TAG-72/DGKαζ KO NK 세포는 TGFβ 존재 하에 시험관내 세포독성 기능을 유지한다.
[00124] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 줄기세포 유래된 NK 세포는 생체내에서 항종양 활성을 입증한다. 종양 보유 마우스를 iPSC 유래 DGKαζ KO NK 세포로 처리하면 편집되지 않은(형질감염되지 않은) iPSC 유래 NK 세포를 사용한 처리에 비해, 사이토카인 공동 투여 유무에 관계없이 종양 크기가 감소하고 생존율이 향상된다는 것이 본원에 개시되어 있다.
[00125] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 줄기세포 유래 TAG-72 CAR/DGKαζ K NK 세포는 생체내에서 연장된 항종양 활성을 입증한다. iPSC 유래 TAG-72 CAR/DGKαζ KO NK 세포로 종양 보유 마우스를 치료하면, PBMC-NK 세포, 편집되지 않은(형질감염되지 않은) iPSC 유래 NK 세포, 또는 TAG-72 CAR iPSC 유래 NK 세포와 비교하여 평균 종양 부담이 더 낮아지고 장기 효능이 우수한 것으로 나타났다.
억제하고자 하는 유전자
[00126] 본 개시내용에 따르면, 본원에서 확인된 하나 이상의 유전자의 기능을 억제하도록 원천 세포를 변형시키고, 상기 변형된 원천 세포를 줄기세포 유래 면역세포로 분화시킴으로써 향상된 기능을 갖는 줄기세포 유래 면역세포가 생성될 수 있다.
[00127] 본 명세서에 사용된 "유전자 기능의 억제"는 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성이 궁극적으로 감소되거나 제거되는 것을 의미한다. 따라서, 유전자의 기능은 유전자의 게놈 DNA 서열에 대한 조작 또는 변형(예컨대 유전자의 파괴로 이어짐)의 결과로서, mRNA 억제(예컨대 수준 감소)의 결과로서, 또는 (예를 들어, 전사 또는 번역을 억제함으로써 mRNA의 수준 또는 기능을 감소시킴), 또는 단백질을 억제한 결과로서(예를 들어, 단백질의 수준 또는 활성을 감소시킴으로써) 억제될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제 정도는 변형된 세포에서 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 변형되지 않은 세포에서의 단백질의 수준 및/또는 활성과 비교시, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상이다.
[00128] 본 개시내용에 따르면, 그 기능이 억제될 유전자는 DGKα 및 DGKζ로 구성된 군으로부터 선택된다.
DGKα 및 DGKζ
[00129] 디아실글리세롤 키나아제(DGK)는 디아실글리세롤(DAG)을 포스파티드산(PA)으로 인산화시키는 효소이다. 여기에는 여러 가지 이소형이 있으며 그 중 두 가지인 DGKα와 DGKζ는 면역세포와 강력한 기능적 연결을 가지고 있다. T 및 NK 세포 두 가지 모두에서, DAG는 활성화 및 기능의 주요 전달자 중 하나이며, DGKα 및 DGK ζ는 DAG 의존성 활성화를 감소시킬 수 있는 새로운 종류의 면역 "체크 포인트"로 작용한다 (Riese 외, Diacylglycerol Kinases (DGKs): Novel Targets for Improving T Cell Activity in Cancer, Frontiers in cell and developmental biology, 2016, Vol.4, pp.108; Noessner, DGK-α: A Checkpoint in Cancer-Mediated Immuno-Inhibition and Target for Immunotherapy, Frontiers in cell and developmental biology, 2017, Vol.5, pp.16). DAG는 단백질 키나아제 C(PKC) 및 Ras 활성화 단백질(RasGRP1)과 같은 CD3 신호전달에 관여하는 필수 단백질과 상호 작용한다. 따라서, DGK의 활성화는 세포외 신호 관련 키나아제 1/2(ERK1/2)를 포함하는 TCR 원위 분자의 하향조절을 초래하는 것으로 여겨진다. DGKα와 DGKζ는 T 세포와 NK 세포에서 우세하게 발현되며, 이들의 발현과 활성화가 서로 다른 방식으로 조절되기 때문에 이들의 기능이 완전히 중복되는 것으로 보이지는 않다.
[00130] 본 발명에 따르면, DGKα 및 DGKζ 유전자 중 적어도 하나의 기능이 억제된 줄기세포는 여전히 분화가 가능하며, 변형된 줄기세포로부터 분화된 줄기세포 유래 면역세포는 향상된 기능을 갖는다.
유전자 기능 억제
[00131] 유전자 기능의 억제는 다양한 접근법, 예를 들어 유전자 편집, 예를 들어 RNA 간섭 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 통한 번역 억제, 또는 단백질 생성물을 직접적으로 길항하는 항체 또는 소분자와 같은 화합물의 사용을 통해 달성될 수 있다.
유전자 편집을 통한 억제
[00132] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자의 게놈 서열을 변형시키는 유전자 편집 시스템의 사용을 통해 달성된다.
[00133] 유전자 편집 시스템은 일반적으로 뉴클레아제와 결합된 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 포함한다. DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산은 유전자의 표적 영역에 특이적으로 결합하거나 혼성화하고, 뉴클레아제는 유전자의 표적 영역에서 하나 이상의 이중 가닥 절단 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 절단을 만든다. 표적화된 영역은 유전자의 코딩 영역, 예를 들어 코딩 영역의 N-말단 부분 근처의 엑손(예를 들어 첫 번째 또는 두 번째 엑손)일 수 있다. 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 NHEJ(비동종 말단 결합) 또는 HDR(상동성 지향 복구)과 같은 세포 복구 프로세스를 통해 복구될 수 있다. 일부 경우에, 복구 과정은 삽입, 결실, 미스센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이(예를 들어, 이중 대립유전자 프레임시프트 돌연변이 포함)를 도입하여 유전자의 파괴 및 유전자 기능의 억제를 초래한다.
[00134] 유전자 편집 시스템의 예로는 DNA 결합 단백질과 뉴클레아제, 예커대 ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 TALEN(TAL-Effector Nuclease), 또는 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 핵산(CRISPR)/Cas 시스템과 같은 RNA-가이드된 뉴클레아제를 포함하는 융합체가 포함된다. 그러나, 본 발명은 이러한 유형의 유전자 편집 시스템으로 제한되어서는 안 된다. 오히려, 당업계에 공지되어 있거나 확인될 임의의 유형의 억제제를 사용하여 유전자의 기능을 억제할 수 있다.
ZFP 및 TALEN
[00135] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 엔도뉴클레아제에 융합된, 하나 이상의 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성화제 유사 단백질(TAL)과 같은 DNA 결합 단백질을 포함하는 유전자 편집 시스템을 활용하여 달성된다. 이의 예로는 ZFN, TALE 및 TALEN이 있다.
[00136] ZFP 및 TAL의 DNA 결합 도메인은 관심 대상 표적 DNA 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 하나 이상의 아미노산을, 사전 결정된 DNA 서열에 대한 결합을 지시하도록 변형시킬 수 있다. 합리적인 설계에 대한 기준은 예를 들어 미국 특허 6,140,081, 미국 특허 6,453,242, 미국 특허 6,534,261, WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 02/016536, WO 03/016496 및 US 공개 번호 20110301073 A1에 설명되어 있다.
[00137] 일부 구현예에서, DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 ZFP의 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. ZFP 또는 그 도메인은 하나 이상의 "징크 핑거"(아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 영역)를 통해 서열 특이적인 방식으로 DNA에 결합한다. 자연 발생 ZFP의 서열 특이성은 징크 핑거 인식 나선의 특정 위치에서 아미노산을 치환함으로써 변경될 수 있다. 또한, 많은 조작된 유전자 특이적 징크 핑거가 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어 Sigma-Aldrich(미국 미주리주, 세인트 루이스)와 제휴하여 Sangamo Biosciences(미국 캘리포니아주 리치몬드)가 개발한, 징크 핑거 작제를 위한 CompoZr 플랫폼 참조). 따라서, 일부 구현예에서, ZFP는 본원에서 억제되는 것으로 확인된 유전자 내의 표적 서열에 결합하도록 조작된다. 일반적인 표적 서열에는 엑손, 코딩 서열의 N-말단 영역 근처 영역(예컨대 첫 번째 엑손, 두 번째 엑손) 및 5' 조절 영역(프로모터 또는 인핸서 영역)이 포함된다. ZFP는 엔도뉴클레아제 또는 DNA 절단 도메인과 융합되어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성한다. DNA 절단 도메인의 예에는 IIS형 제한 효소의 DNA 절단 도메인이 포함된다.
[00138] 일부 구현예에서, ZFN은 ZFN을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드, mRNA 또는 바이러스 벡터)의 형질감염을 통해 세포(예를 들어, 줄기세포) 내로 도입된다. 그런 다음 ZFN은 작제물의 세포에서 발현되어 표적 유전자의 편집 및 파괴를 유도한다. 일부 구현예에서, ZFN은 단백질 형태로 세포 내로 도입된다.
[00139] 일부 구현예에서, DNA-결합 단백질은 전사 활성인자 유사 단백질 이펙터(TALE) 단백질과 같은 자연 발생 또는 조작된 전사 활성인자 유사 단백질(TAL) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 US 20110301073 A1을 참조할 것. TALE DNA 결합 도메인은 하나 이상의 TALE 반복체를 포함하는 폴리펩티드로서, 각각의 반복체는 길이가 33-35 아미노산이고 1 또는 2개의 DNA-결합 잔기를 포함한다. TAL 반복체의 위치 12 및 13에 있는 HD 서열은 시토신(C)에, NG는 T에, NI는 A에, NN은 G 또는 A에 대한 결합을 유도하는 것으로 나타났다. US 20110301073 A1 참조. 일부 구현예에서, TALE는 억제되도록 본원에서 확인된 유전자 내의 관심 대상 표적 DNA 서열에 대한 특이성을 갖는 TAL 반복의 어레이를 갖도록 설계될 수 있다. 맞춤형으로 설계된 TALE 어레이는 또한 Cellectis Bioresearch(프랑스 파리), Transposagen Biopharmaceuticals(미국 켄터키주 렉싱턴) 및 Life Technologies(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 통해 상업적으로 입수할 수 있다. 일부 구현예에서, TAL DNA 결합 도메인은 엔도뉴클레아제에 융합되어 TALE-뉴클레아제(TALEN)를 형성하며, 이는 억제되도록 본원에서 확인된 유전자 내의 핵산 표적 서열을 절단한다.
[00140] 일부 구현예에서, TALEN은 TALEN을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드, mRNA 또는 바이러스 벡터)의 형질감염을 통해 세포(예를 들어, 줄기세포) 내로 도입된다. 그런 다음 TALEN은 작제물의 세포에서 발현되어 표적 유전자의 편집 및 파괴를 유도한다. 일부 구현예에서, TALEN은 단백질 형태로 세포 내로 도입된다.
CRISPR/카스
[00141] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 유전자 편집을 위한 CRISPR("Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"의 약어)/Cas("CRISPR-associated nuclease"의 약어) 시스템을 활용하여 달성된다. CRISPR/Cas는 쉽게 이용 가능한 시약 및 프로토콜로 당업계에 잘 알려져 있다(Mali 외, RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9, Science, Feb 15, 2013, Vol.339(6121), p.823(4); Hsu 외, Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering, Cell, 05 June 2014, Vol.157(6), pp.1262-1278; Jiang 외, RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems, Nature Biotechnology, 2013, Vol.31(3), p.233; Anzalone 외, Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature, December 2019, Vol.576(7785), pp.149-157; Komor 외, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 2016, Nature 533: 420-424; Gaudelli 외, Programmable base editing of A● to G●C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature, 2017, Vol.551(7681), p.464). 예시적인 CRISPR/Cas 유전자 편집 프로토콜은 문헌 [Jennifer Doudna, and Prashant Mali, CRISPR-Cas: A Laboratory Manual, 2016 (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4) and Ran, 외, Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, Nature Protocols, 2013, Vol.8(11), p.2281]에 설명되어 있다.
[00142] CRISPR/Cas 시스템은 일반적으로 두 가지 구성 요소, 즉: (1) 본 명세서에서 CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 Cas 단백질(예컨대 Cas9, Cas12 또는 기타 대체 뉴클레아제라고도 함)이라고도 하는 RNA 의존성 DNA 뉴클레아제; 및 (2) crRNA("CRISPR RNA") 및 tracrRNA("트랜스활성화 crRNA")를 포함하는 이중 RNA, 또는 단일 사슬 전장 가이드 RNA를 포함하고, 상기 뉴클레아제를 게놈의 표적 부위로 보내는 표적 서열을 포함하는 짧은 비-코딩 "가이드 RNA"를 포함한다. 가이드 RNA(gRNA)는 표적 부위로 뉴클레아제를 지향시키는데 여기서 뉴클레아제는 표적 부위의 DNA에서 이중 가닥 파손(DSB)을 일으킨다. 생성된 DSB는 NHEJ(Non-Homologous End Joining) 경로와 HDR(Homology Directed Repair) 경로의 두 가지 일반 복구 경로 중 하나에 의해 복구된다. NHEJ 복구 경로는 가장 활동적인 복구 메커니즘으로 DSB를 신속하게 복구할 수 있지만 DSB 부위에서 작은 뉴클레오타이드 삽입 또는 삭제(Indel)가 자주 발생하여 프레임시프트 돌연변이가 발생하여 비기능적인 유전자 산물이 생성되는 경우가 많다. HDR 경로는 효율성이 떨어지지만 충실도가 높다. CRISPR 엔도뉴클레아제에 파손 영역에 상동적인 DNA 주형이 제공되면, HDR을 통해 상동 DNA 주형을 사용하여 이중 가닥 파손이 복구된다. HDR 경로를 이용하면 RNP와 함께 대규모 유전자 삽입물을 세포에 삽입할 수 있다.
[00143] 관심 대상 유전자의 표적 부위를 표적화하는 서열을 포함하는 gRNA 서열의 설계 또는 선택은 관련 기술분야에 설명되어 있다. 표적 부위에는 조절 영역의 서열(예컨대 프로모터 및 인핸서) 및 코딩 영역 내의 서열(예컨대 엑손, 예를 들어 5' 말단 근처의 엑손, 또는 단백질의 특정 도메인 또는 영역을 인코딩하는 엑손)이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 바로 5' 위치에 기초하여 선택된다.
[00144] 가이드 서열은 표적 서열(표적 부위의 뉴클레오타이드 서열)과 상보성을 갖는 표적 서열을 포함하도록 설계된다. 가이드 서열과 표적 서열 사이의 혼성화를 유발하고 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있는 한, 완전한 상보성이 반드시 요구되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적 서열과 표적 서열 사이의 상보성 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상(예를 들어, 100% 또는 완전히 상보적)이다.
[00145] 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75 개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열의 길이는 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25 또는 20개 뉴클레오타이드 이하이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열의 표적화 서열 부분은 길이가 약 20개 뉴클레오타이드이다. 표적 상보성의 더 짧은 영역(< 20개 뉴클레오타이드)을 갖는 절단형 gRNA가 향상된 표적 특이성과 함께 효과적인 것으로 설명되었다(예를 들어, Fu 외, Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs, Nature Biotechnology, 2014, Vol.32(3), p.279). 따라서, 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열의 길이는 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열은 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보적이다. 가이드 RNA의 표적화 서열이 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보적이지 않은 일부 구현예에서, 게놈 내 PAM 서열에 가까운 표적화 서열 부분(시드(seed) 영역으로도 지칭됨)은 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보적이다. 즉, 가이드 서열의 뉴클레오타이드 5'(즉, 비-시드 영역)의 일부 변형이 허용된다. 예를 들어, 가이드 서열은 표적 서열의 적어도 17개의 뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 시드 영역을 갖는, 적어도 17개 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오타이드 길이)의 표적화 부분을 포함하도록 디자인될 수 있다.
[00146] 특정 유전자의 표적 서열의 예를 표 1에 나타내었다.제공된다.
[00147] 일부 구현예에서, 가이드 서열은 17-20개 뉴클레오타이드의 표적화 서열을 포함하며, 시드 영역(표적 서열의 3' 부분)의 적어도 17개 뉴클레오타이드는 표적 서열의 적어도 17개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 표적 서열의 3' 말단으로부터 17개 뉴클레오타이드까지에 대해 완전히 상보적이다.
표 1
[00148] CRISPR 게놈 편집을 위한 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용 가능하며, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에서 유전자의 구성적 엑손에 예시적인 sgRNA 표적 서열을 제공한다(예를 들어 GenScript 및 Massachusetts Institute of Technology에서 제공하는 gRNA 데이터베이스 참조; 또는 Sanjana 외, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening, Nature Methods, 2014, Vol.11(8), p.783 참조). 일부 구현예에서, gRNA 서열은 비표적 유전자에 대한 표적외 결합이 최소인 서열이거나 이를 포함한다.
[00149] 본 명세서에서 사용하기에 적합한 Cas 단백질 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제의 예에는 Cpf1(Zetsche 외, Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell (Cambridge), 22 October 2015, Vol.163(3), pp.759-771), Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12라고도 함), Cas12, Cas13, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, CasX, CasY, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 또는 Csf4, 또는 이의 기능적 유도체(즉, 자연 발생 CRISPR 엔도뉴클레아제의 돌연변이 형태 또는 유도체, 예컨대 자연 발생 형태의 RNA 의존성 엔도뉴클레아제 활성을 실질적으로 유지하는 그의 단편). 예를 들어 US20180245091A1 및 US20190247517A1 참조. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9, 예를 들어 S. pyogenes, S. aureus 또는 S. pneumoniae 유래의 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 SwissProt 데이터베이스에 수탁 번호 Q99ZW2로 제공된 아미노산 서열을 갖는 S. pyogenes로부터의 Cas9 단백질이다. CRISPR-Cas9 이후에 확인된 다수의 Cas 단백질은 바람직한 특징을 제공한다. 예를 들어, CRISPR-Cas12는 얼기설기한 절단(staggered cut)을 생성하여 에피게놈(유전자가 켜지거나 꺼지도록 지시할 수 있는 화합물)을 편집할 수 있다. Cas13은 DNA 대신 RNA를 표적으로 삼아 유전자 발현에 영향을 미친다. CRISPR-CasX는 Cas9보다 작으며 유전자 편집뿐만 아니라 유전자 발현을 제어하는 데에도 사용할 수 있다. CasY는 Cas9와 매우 유사하게 작용하지만 완전히 다른 단백질 구조로 구성되어 있어 다양한 조건에서 기능할 수 있다.
[00150] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 CRISPR 매개 유전자 편집을 통해 달성되며, 이는 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 제1 핵산, 및 본원에서 억제될 것으로 확인된 유전자의 표적 서열에 특이적인 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 제2 핵산을 세포(예컨대 만능 줄기세포, iPSC, HE, HSC 또는 전구세포)에 도입하는 것을 포함한다. 이들 2 가지 핵산은 하나의 핵산 작제물(또는 벡터)에 포함되거나 다른 작제물들(또는 벡터들)에 제공되어 세포에서 Cas 단백질과 gRNA의 발현을 달성할 수 있다. 세포에서 Cas 뉴클레아제와 gRNA이 발현되면 표적 서열에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하여 DNA 절단이 유도된다.
[00151] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 gRNA와 Cas 뉴클레아제 사이의 조합 또는 복합체를 세포에 도입하는 것을 포함하는 CRISPR 매개 유전자 편집을 통해 달성된다. 일부 구현예에서 Cas 단백질/gRNA 조합 또는 복합체는 예를 들어 전기천공, 입자총, 인산칼슘 형질감염, 세포 압축 또는 압착, 리포솜, 나노입자, 미세주입, 네이키드 DNA 플라스미드 전달, 단백질 형질도입 도메인 매개된 형질도입 또는 바이러스 매개 (레트로바이러스 및 렌티바이러스와 같은 통합 바이러스 벡터 및 아데노바이러스, AAV, HSV, 백시니아와 같은 비통합 바이러스 벡터 포함) 형질도입을 통해 전달될 수 있다.
[00152] 사용된 특정 유전자 편집 방법에 관계없이, 유전자 서열이 변형되었고 유전자 기능이 억제되었는지 확인하기 위해, 예를 들어 Southern 및 Northern 블로팅, RT-PCR을 포함한 PCR, 핵산 서열분석을 통해 DNA 또는 mRNA를 검사함으로써, 또는 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)을 통해 특정 단백질 또는 펩타이드의 존재 또는 활성을 검출함으로써 다양한 분석을수행할 수있다.
[00153] 일부 구현예에서, DGKα 및 DGKζ 유전자 중 적어도 하나의 기능은 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 이들 유전자 중 적어도 하나의 초기 엑손에 인델(들)을 도입함으로써 억제되며, 이는 이들 유전자 중 적어도 하나에 프레임-시프트 돌연변이(들)을 초래하여, 기능성 단백질이 편집된 유전자로부터 번역되지 않도록 한다. 일부 구현예에서, 두 유전자의 기능은 CRISPR/Cas9를 사용하여 두 유전자의 초기 엑손에 인델을 도입함으로써 억제되며, 그 결과 기능성 단백질이 편집된 유전자로부터 번역되지 않도록 두 유전자에 프레임-시프트 돌연변이가 발생한다. 일부 구현예에서, 2개의 유전자 중 1개 또는 2개의 유전자의 억제는 또 다른 유전자의 억제와 조합하여 수행된다.
[00154] CRISPR/Cas 시스템은 니카아제(Nickase: 예컨대 CAS9 니카아제) 및 고충실도 효소(High Fidelity Enzymes)를 사용하여 이중 가닥 절단이나 공여자 DNA 없이 사용할 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Anzalone, A 외, Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature, December 2019, Vol.576(7785), pp.149-157; Komor 외, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, Nature, 2016, 533: 420-424; Gaudelli 외, Programmable base editing of A●T to G●C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature, 2017, Vol.551(7681), p.464)] 참조.
mRNA 수준 또는 기능의 감소 또는 제거를 통한 억제
[00155] 일부 구현예에서, 유전자 기능의 억제는 `유전자로부터 전사된 mRNA의 수준 또는 기능을 감소시키거나 제거함으로써, 즉 mRNA의 억제에 의해 달성된다. 유전자 편집 시스템을 통한 억제와 달리 mRNA 억제는 일시적이다.
[00156] 일부 구현예에서, mRAN의 억제는 예를 들어 안티센스 핵산, 리보자임, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), miRNA(마이크로RNA) 또는 이의 전구체, 또는 세포에서 전사되어 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이의 전구체를 생성할 수 있는 핵산 작제물의 사용을 통해 달성가능하다.
[00157] 안티센스 - 안티센스 기술은 잘 알려진 방법이다. 안티센스 RNA는 내인성 mRNA의 전체 길이 또는 일부에 상보적이고 내인성 mRNA와 이중체를 형성함으로써 내인성 mRNA로부터의 번역을 차단하는 RNA 분자이다. 안티센스 RNA는 합성적으로 만들어져서 관심 대상 세포(예컨대 줄기세포)에 도입하거나, 외인적으로 도입된 핵산 작제물로부터 전사를 통해 관심 대상 세포에서 만들어 관심 대상 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 RNA가 관심 대상 유전자의 전장 mRNA에 상보적일 필요는 없다. 그러나 안티센스 RNA는 표적 mRNA와 이중체를 형성하고 표적 mRNA에 기초한 번역을 차단하기에 충분한 길이여야 한다. 전형적으로 안티센스 RNA는 적어도 15개 뉴클레오타이드, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서 안티센스 RNA의 길이는 500, 400, 300, 200, 100, 75 또는 50개 뉴클레오타이드 이하이다.
[00158] 리보자임 - 리보자임(즉, 촉매 RNA)은 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 이루고 특정 위치에서 포스포디에스테르 골격을 절단하여 표적 RNA를 기능적으로 비활성화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제 6,423,885호, 5,254,678호, 및 Perriman 외, Effective ribozyme delivery in plant cells, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, June 20, 1995, Vol.92(13), pp.6175-6179 참조. 리보자임은 합성으로 만들어지고 관심 대상 세포(예컨대 줄기세포)에 도입되거나, 외인적으로 도입된 핵산 구조로부터 전사를 통해 관심 대상 세포에서 만들어질 수 있다.
[00159] RNAi(RNA 간섭) - RNAi를 통한 유전자 발현 또는 번역의 억제는 당업계에 알려져 있으며 siRNA("작은 간섭 RNA"의 경우), shRNA("짧은 헤어핀 RNA"의 경우) 및 miRNA("microRNA"의 경우). siRNA와 shRNA는 RNA 간섭 경로에 관여하고 특정 유전자의 발현을 방해하는 것으로 알려져 있다. siRNA는 작은(일반적으로 20-25개의 뉴클레오타이드 길이) 이중 가닥 RNA이며 표적 mRNA(즉, 관심 대상 유전자에서 전사된 mRNA)와 상동성이거나 상보적인 서열 또는 표적 mRNA의 일부를 포함하도록 설계될 수 있다. shRNA는 리보뉴클레아제 DICER에 의해 절단되어 siRNA를 생성한다. 표적 유전자의 서열이 주어지면, siRNA 또는 shRNA는 합성되어 관심 대상 세포(예컨대 줄기세포)에 도입되거나 또는 그러한 RNA를 인코딩하는 외인적으로 도입된 핵산 작제물로부터 관심 대상 세포(예컨대 줄기세포)에서 만들어질 수 있다. miRNA는 또한 비단백질 인코딩 유전자로부터 전사된 긴 전구체로부터 처리되어 표적 mRNA와의 부정확한 염기쌍을 통해 번역을 방해하는 작은 RNA 분자(일반적으로 약 21-22개의 뉴클레오타이드)이다. miRNA 또는 이의 전구체(pri-miRNA 또는 pre-miRNA)는 합성적으로 만들어져서 관심 대상 세포(예컨대 줄기세포)에 도입되거나 또는 miRNA 또는 이의 전구체를 인코딩하는 외인적으로 도입된 핵산 작제물로부터의 관심 대상 세포(예컨대 줄기세포)에서 만들어질 수 있다.
[00160] 일부 구현예에서, mRNA의 억제는 효소적으로 불활성인 뉴클레아제인 Cas 분자가 관심 대상 유전자를 표적으로 하는 gRNA와 조합하여 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 변형된 버전을 사용하여 달성될 수 있다. 표적 부위는 유전자의 5' 조절 영역(예컨대 프로모터 또는 인핸서 영역)에 있을 수 있다. 일부 구현예에서 Cas 분자는 DNA 절단 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이를 포함하는 효소적으로 불활성인 Cas9 분자이다(예를 들어 WO2015/161276 참조). 일부 구현예에서, 효소적으로 불활성인 Cas9 분자는 전사 억제인자 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다.
다른 수단을 통한 억제
[00161] 본 발명은 예컨대 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 활성을 직접 억제하는 화합물(예컨대 소분자, 항체 등)을 세포(예컨대 줄기세포)에 도입함으로써, 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준 또는 활성을 감솟키는 것을 포함하는, 유전자의 기능을 억제하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법을 포함한다.
CAR
[00162] 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택된 유전자를 억제하도록 변형된 세포(예를 들어 줄기세포) 역시도 키메라 항원 수용체(또는 "CAR")를 인코딩하는 핵산을 함유하도록 변형되었다.
[00163] 일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 선택된 유전자의 기능을 억제하기 위해 세포가 변형되기 전, 동시에 또는 그 후에 세포 내로 도입될 수 있다. 억제가 일시적인(예를 들어, 안티센스 RNA 또는 RNAi를 통해) 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 좋기로는 억제를 달성하기 위해 세포가 변형되기 전에 세포 내로 도입된다. 억제가 영구적인(예를 들어, 유전자 편집을 통해) 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 억제를 달성하기 위해 변형되는 세포 이전, 동시에 또는 이후에 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 DSB 도입 후 유전자 편집의 표적 부위에 HDR에 의해 삽입을 허용하도록 설계된다. 즉, 유전자는 CAR 인코딩 핵산의 녹인 또는 삽입에 의해 파괴된다.
[00164] 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택된 유전자를 억제하도록 변형된 세포(예컨대 줄기세포)로부터 유래된 세포(예컨대 조혈 계통 세포 또는 면역세포) 역시도, 키메라 항원 수용체(또는 "CAR")를 인코딩하는 핵산을 함유하도록 변형되었다.
[00165] 용어 "키메라 항원 수용체"("CAR": "인공 T 세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 및 "키메라 면역수용체"로도 알려짐)는 항원 인식 모이어티를 면역세포에 이식하는 조작된 수용체에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 일반적으로 CAR은 서로 작동가능하게 연결된 면역세포에서 자연적으로 발현되는 수용체의 세포내/세포질 신호전달 도메인, 표적 항원에 특이적인 항원 인식 모이어티, 및 막관통 도메인으로 구성된다. "작동가능하게 연결된"이라 함은, 항원 인식 모이어티가 표적 항원에 결합시, 세포내 신호전달 도메인을 통해 신호가 유도되어 CAR을 발현하는 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 활성화하여 그의 이펙터 기능이 활성화될 수 있도록, 개별 도메인들이 서로 연결됨을 의미한다.
[00166] CAR의 항원 인식 모이어티는 표적 항원의 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 수용체의 세포외 부분이다. 항원 인식 모이어티는 일반적으로 scFv이지만 이에 국한되지는 않다.
[00167] CAR의 세포내 도메인은 면역세포의 자연 발생 수용체의 1차 세포질 신호전달 서열, 및/또는 면역세포의 자연 발생 수용체의 2차 또는 공동자극 서열을 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 서열을 들 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터의 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 공동자극 신호전달 서열과 조합하여 CD3 제타로부터의 세포질 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 적합한 보조자극 분자의 예에는 CD27, CD28, 4-lBB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, TIM3, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 등이 포함된다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다.
[00168] CAR의 막관통 도메인은 일반적으로 막을 가로지르는 전형적인 소수성 알파 나선 이며 임의의 막 결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우 도메인은 막 결합 또는 막관통 단백질에서 파생될 수 있다. 예를 들어, 막관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 IgG4와 같은 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성적일 수 있으며, 이 경우 이는 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다.
[00169] "표적 항원"이라는 용어는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 수용체 발현 면역세포에 의해 표적으로 삼으려는 세포에 의해 발현되는 임의의 단백질성 또는 비단백질성 분자에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 표적 항원은 "자가" 분자(환자의 신체에서 발현되는 분자) 또는 비자가 분자(예컨대 감염성 미생물로부터의)일 수 있다. 본 명세서에 언급된 표적 항원은 자연적으로 T 또는 B 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 분자로 국한되지 않으며; 오히려 "표적 항원"은 표적화하고자 하는 임의의 단백질성 또는 비단백질성 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면에 발현된다. 표적 항원은 표적 세포에 의해서만 발현될 수 있거나 비표적 세포에 의해서도 발현될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 비자가 분자, 또는 표적화하고자 하는 세포에 의해서만 발현되거나 정상 세포에 비해 상당히 더 높은 수준으로 표적화하고자 하는 세포에 의해 발현되는 분자이다. 표적 항원의 비제한적 예에는 다음이 포함된다: 분화 항원 예컨대 MART-1/MelanA(MART-I), gplOO(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양 특이적 다계통 항원 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; MUC1 및 MUC16과 같은 과발현된 당단백질; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; 과발현된 당단백질 예컨대 MUC1 및 MUC16; 과발현된 배아 항원 예컨대 CEA; 과발현된 종양 유전자 및 돌연변이된 종양 억제 유전자 예컨대 p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전좌에 기인하는 독특한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원 예컨대 Epstein Barr 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 그 밖의 종양 관련 항원으로는 엽산 수용체 알파(FRa), EGFR, CD47, CD24, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl 85erbB2, pl80erbB-3, cMet, nm-23Hl, PSA, CA 19-9, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27. 29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG-72, TLP, TPS, PSMA, 메소텔린, 또는 BCMA를 들 수 있다.
[00170] 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 관련 항원, 특히 단백질, 당단백질 또는 비단백질 종양 관련 항원이다.
[00171] 일부 구현예에서, 표적 항원은 CD47, 엽산 수용체 알파(FRα) 및 BCMA로 구성된 군으로부터 선택된다.
[00172] 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 관련 항원, 예를 들어 종양 관련 항원 TAG-72이다.
[00173] 다른 구현예에서, 표적 항원은 표면 단백질, 예를 들어 CD24이고, 또 다른 구현예에서는 종양 표적화에 사용될 수 있는 표면 단백질, 예를 들어 CD19 또는 CD20이다.
[00174] 일부 구현예에서, 원천 세포는 키메라 항원 수용체("CAR")를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 수용체는 항원 결정기에 대한 항원 인식 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 원천 세포는 적어도 하나의 CAR을 발현한다.
[00175] 다른 구현예에서, 파생 세포는 키메라 항원 수용체("CAR")를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 수용체는 항원 결정기에 대한 항원 인식 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 유래된 세포는 적어도 하나의 CAR을 발현한다.
[00176] 당업자는 유전적 변형(예를 들어, 키메라 항원 수용체("CAR")을 인코딩하는 핵산 분자의 도입)이 세포 내로 도입되는 메커니즘은 당업자에게 잘 알려져 있고 이해되는 임의의 적합한 형태를 취할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 유전 물질은 일반적으로 발현 작제물의 사용을 통해 세포에 편리하게 도입된다.
[00177] CAR은 플라스미드 DNA 또는 mRNA의 형질감염; γ-레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함하는 바이러스 벡터의 형질도입; 및 CRISPR-Cas9, TALEN 또는 ZFN 매개 유전자 편집을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
분화 방법
[00178] 본 발명은 일반적으로 줄기세포, 특히 iPSC를 변형하고, 이를 향상된 활성을 포함하는 줄기세포 유래 면역세포로 추가로 분화시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
[00179] 원천 세포(예컨대 만능 줄기세포)를 면역세포(예컨대 T 세포 또는 NK 세포)로 분화하는 방법은 관련 기술 분야에 알려져 있다(Li 외, Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Anti-tumor Activity, Cell Stem Cell, 2018, 23(2): 181-192 e5; Themeli 외, Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy, Nat Biotechnol, 2013, 31(10): 928-33; Maeda 외, Regeneration of CD8αβ T Cells from T cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity, Cancer Res, 2016, 76(23): 6839-6850).
[00180] 이들 방법은 일반적으로 3가지 주요 단계를 따른다: 1) PSC로부터 CD34+ 세포의 생성 및 확장, 2) CD34+ 세포로부터 전구/면역세포의 분화, 및 3) 전구/면역세포의 확장.
만능 세포의 준비
[00181] 일부 구현예에서 PSC는 중배엽 세포로의 분화 이전에 제조 및/또는 분류될 수 있다. 선택 과정은 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 마커를 기반으로 할 수 있다.
[00182] iPSC를 생성하기 위해, 배아 유사 형태학, 재프로그래밍 후 이식유전자 침묵, 알칼리성 포스파타제 분석을 통한 다능성 평가 또는 TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog 및 Oc4와 같은 만능 및 리뉴얼 마커의 탐지에 기초하여, 세포를 특징화시킨다. 분화 잠재성은 배아체 형성 및/또는 기형종 형성에 의해 모니터링된다. 핵형 분석, 동일성 매칭 및 불임도 역시도 일반적으로 평가된다(Huang 외, Human iPSC banking: barriers and opportunities, Journal of Biomedical Science, Oct 28, 2019, Vol.26(1)).
[00183] 인간 iPSC 유지 및 준비를 위해 다양한 방법이 사용되며 여기에는 불활성화된 쥐 배아 섬유아세포(MEF) 세포를 이용한 피더 세포 의존적 배양, MEF 조건화된 배지를 사용한 iPSC 배양, iPSC로부터 배아체 생성 및 무혈청 및 무피더 확장 배지 또는 MEF 조건화 배지를 이용한 기질 의존성 증식이 포함된다. iPSC는 효소적 또는 기계적 계대 방법을 사용하여 계대된다. 일반적으로 이는 콜로니가 너무 크거나 조밀해지거나 분화가 증가할 때 수행된다. 최적의 iPSC 콜로니는 정의된 가장자리와 콜로니 전체에 걸쳐 균일한 형태를 갖는 것으로 관찰된 콜로니이다.
[00184] TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nucleases) 및 CRISPR/Cas9는 PSC의 게놈 편집에 가장 일반적으로 사용된다. 일반적으로 TALE 어레이 또는 CRISPR 가이드 RNA는 클로닝 벡터를 사용하여 설계되고 클로닝된다. 단일 세포 인간 PSC는 상기 벡터로 형질감염되거나 형질도입되며 표적 세포는 형광 리포터를 통해 FACS로 선택하거나 선택 마커를 통해 항생제 섹션으로 선택할 수 있다. 농축 후 1~2주 후에 게놈 DNA 분석과 표적 클론 복구 및 확장을 위해 PSC를 선택하고 확장한다. 두 가지 유전자 편집 접근법 모두 녹인 및/또는 녹아웃 iPSC 계통을 생성하는 데 사용되었다(Hendricks 외, Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions, Cell stem cell, 07 January 2016, Vol.18(1), pp.53-65).
[00185] 일부 구현예에서 iPSC는 Accutase 등을 이용하여 용액 중 단일 세포로서 접착 상태로 리프팅된 다음, 특정 유전자 KO에 대한 가이드 RNA 및/또는 관심 대상 유전자 부위에서 세포에 녹인하기 원하는 서열을 함유하는 플라스미드의 존재 하에 전기천공된다.
[00186] 일부 구현예에서, 유전자 편집 후, iPSC는 NK 세포로의 분화와 같은 기능적 연구에서 임의의 추가 조작 또는 시험 전에 안정화되도록 방치되고 정상 배양으로 복귀된다.
만능 줄기세포로부터 CD34+ 세포의 생성 및 확장
[00187] 당업계의 대부분의 방법은 PSC를 중배엽 세포로 분화시키는 것으로 시작된다. 그 후 동시에 확장될 수 있는 HE/HSC로 중배엽 세포를 분화시킨다.
[00188] PSC 분화 방법은 배아체(EB) 형성, 피더 세포 공동 배양, 2차원 세포외 기질 코팅 배양 및 전사 인자 형질도입을 사용한 프로그래밍 또는 재프로그래밍을 포함하는 다양한 접근법을 따를 수 있다(Lim 외, Hematopoietic cell differentiation from embryonic and induced pluripotent stem cells Stem cell　research & therapy, 18 June 2013, Vol.4(3), pp.71; Tajer et al., Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells for Therapeutic Purposes: Lessons from Development and the Niche, Cells, 18 February 2019, Vol.8(2)). 이러한 방법으로 조혈 전구세포를 생산할 수 있다. 혈액생성 내피(HE) 세포가 다능성 HSC의 새로운 생산에 기여하는 일시적인 중간체임을 시사하는 증거가 점점 많아지고 있다.
[00189] PSC 분화의 3차원 EB는 생체내 배아 발달을 모방하므로 PSC의 조혈 분화를 위해 EB 형성을 사용하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 여기에는 자발적인 EB 형성, 행잉-드롭 EB 형성 및 스핀-EB 형성이 포함된다. 조혈 계통을 특이적으로 유도하기 위해, 조혈 사이토카인 및 성장 인자의 존재 하에 조혈 발달을 지원하는 기능을 하는 메틸셀룰로오스 배양 배지로 EB의 단일 세포 현탁액을 옮긴다. Spin EB 방법을 기반으로 HSC로 분화하는 데는 배양 4~11일이 걸릴 수 있다.
[00190] 피더 공동 배양은 적절한 배양 배지에서 조혈 계통의 발달을 지원하기 위해 PSC와 함께 피더 세포 층을 배양하는 방법이다. HE/HSC를 얻기 위해 간질 세포 공동배양이 사용된다. OP9 간질 세포, 대동맥-생식선-중신 영역에서 유래된 간질 세포, 태아 간 유래 간질 세포 및 S17 및 M210과 같은 골수 유래 간질 세포, AFT04 간질 세포는 공동 배양에 사용되는 예시적인 세포주이다. 간질 세포 공동 배양 방법은 일반적으로 동물에서 유래하며 혈청 의존적이거나 독립적일 수 있다.
[00191] 콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 세포외 기질로 코팅된 접시의 2차원 배양은 PSC를 분화하기 위한 단층 배양으로 사용된다. 인간 피브로넥틴 또는 콜라겐 IV를 사용하는 기질은 주로 조혈 전구세포를 생성하는 데 활용된다. PSC는 또한 라미닌, 콜라겐 I, 엔탁틴 및 헤파린-황산 프로테오글리칸과 같은 기질 성분뿐만 아니라 성장 인자 및 기타 정의되지 않은 여러 화합물의 존재 하에 중배엽 세포로 분화된다. 이들 중배엽 세포는 조혈 칵테일 배양 배지에 의한 치환 후 조혈 세포를 유도할 수 있다.
[00192] HE/HSC로의 PSC 분화를 위해서는 조혈 칵테일 배양 배지에 여러 가지 세포 외인성 요인이 필요하다. 화학 물질, 사이토카인 및 성장 인자의 조합에는 bFGF, BMP4, Activin A, SB431542, DKK, CHIR99021, VEGF, IL-6, IGF-1, IL-11, SCF, EPO, TPO, IL-3 및 FLT3-L이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
[00193] HE/HSC로의 내피 세포의 직접적인 프로그래밍 또는 재프로그래밍을 통한 전사 인자 전달은 PSC에서 HSC로의 분화에 사용되었다. 전사 인자의 비제한적인 예로는 ERG, HOXA5, HOXA9, HOXA10, LCOR, RUNX1, SPI1, FOSB, GFI1, ETV2 및 GATA2를 들 수 있다.
[00194] 조혈 칵테일은 CD34+ 세포/HSC를 확장하는 데 사용된다. 여기에는 전술한 내용이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. CD34+ 세포의 확장을 위해 조혈 칵테일 상용 키트도 사용할 수 있다.
[00195] HSC/CD34+ 세포 확장을 위해 위에서 언급한 사이토카인/성장 인자와 함께 다른 소분자, 단백질 및 화학 물질도 사용할 수 있다. 여기에는 테트라에틸렌펜타민, HOXB4, 프로스타글란딘 E2, Stemreginin 1, UM729, UM171, Notch 리간드, 안지오포이에틴 유사 5, IGFBP2, 플레이오트로핀, 발프로산 및 히스톤 데아세틸라제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제의 소분자 억제제가 포함되며 이에 국한되지 않는다. 3차원 나노섬유 스캐폴드 역시도 HSC 확장에 사용되었다.
림프성/골수성 계통 세포로의 HE/HSC의 분화
[00196] 골수 외에도 HSC/CD34+ 조혈세포 전구세포(HSC)의 주요 공급원은 혈액이다. 구체적으로, 이들은 말초혈이나 제대혈로부터 분리할 수 있다. iPSC 세포주는 또한 이러한 세포의 공급원이기도 한다. HSC/CD34+ 조혈 전구체의 농축은 항-CD34 면역자기 입자/비드를 사용하여 수행할 수 있다.
[00197] CD34+ 전구체는 다양한 사이토카인, 성장 인자 및/또는 소분자를 포함하는 확장 칵테일을 사용하여 분화 및 확장될 수 있다. 마커 발현의 항체 염색 및 유세포 분석을 사용하여 분화 성공을 모니터링한다. 조혈 잠재력은 클론 생성 집락 형성 단위 분석에 의해 모니터링된다. 관련 조혈 유전자 발현은 PCR, 전사체 분석 또는 기타 분자 생물학 기반 방법을 통해 모니터링된다. NOD/SCID 마우스와 같은 동물에서 생착을 테스트할 수 있다.
[00198] 사이토카인과 성장 인자 조합은 HSC를 면역세포로 분화시키는 데 사용된다. 예를 들어, EB를 갖는 NK 세포의 생성을 위해, EL081D2와 같은 피더 세포의 존재 또는 부재 하에, IL-3, SCF, IL-15 및 FLT3-L이 IL-2, IL-15 및 IL-7과 함께 사용된다.
[00199] 림프구 투입을 유도하기 위해 Notch 리간드 Delta-유사-1(OP9-DLL1) 또는 OP9-DLL4를 발현하는 OP9 세포주를 SCF, FLT3L 및 IL-7 또는 IL-15의 존재 하에서 활용하여 CD34 농축 또는 스핀 EB 형성 없이 NK 세포를 생성하였다.
[00200] PSC/HSC에서 유래된 NK 세포의 확장은 막 결합 IL-5 및 4-1BB 리간드가 있는 K562와 같은 피더 세포를 사용하여 수행할 수 있다. NK 세포 확장에 사용되는 다른 세포주에는 막 결합 IL-21 인공 항원 제시 세포가 포함된다. HSC를 NK 세포로 분화하는 데 StemSpan™ NK 세포 생성 키트(STEMCELL Technologies)와 같은 상용 키트를 사용할 수 있다.
[00201] FLT3L, IL-7 및 IL-2 존재 하의 OP9 및 OP9-DLL1 배양 후 항-CD3 항-CD28로의 후속 자극도 T 세포를 유도할 수 있다. HSC를 T 세포로 분화하기 위한 상용 키트(예컨대 StemSpan™ T 세포 생성 키트(STEMCELL Technologies))도 사용할 수 있다.
[00202] 단핵구 및 대식세포는 예를 들어 SC17 세포주 또는 스핀 EB 방법과 IL-3, CSF-1 및 M-CSF 존재 하의 후속 배양을 사용하는 간질 세포 기반 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
변형된 세포의 약학적 조성물 및 치료적 용도
[00203] 추가 측면에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 세포, 즉 하나 이상의 선택된 유전자의 기능이 억제된 변형된 세포 및 이들로부터 유래된 세포를 함유하는 조성물이 본원에 제공된다.
[00204] 일부 구현예에서, 본원에서 생산된 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 약학적으로 허용되는 담체에는 용매, 분산 매질, 등장화제 등이 포함된다. 담체의 예에는 오일, 물, 식염수 용액, 겔, 지질, 리포솜, 수지, 다공성 매트릭스, 보존제 등 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 입양 세포 치료와 같은 환자에게 투여하기 위해 전형적으로 단위 투여량 주사 가능한 형태(용액, 현탁액, 유제)로 제조되고 제제화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 시간 방출, 지연 방출 및 지속 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다.
[00205] 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는데 효과적인 양, 예를 들어 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 개시된 변형된 세포를 약 100만 내지 약 1000억 개의 세포, 예를 들어 적어도 100만, 500만, 1,00만 2,500만 5,000만 개의 세포, 최대 약 10억, 50억, 100억, 200억, 300억, 400억, 500억, 600억, 700억, 800억, 900억 또는 1000억 개의 세포의 양으로 포함한다.
[00206] 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 화학요법제와 같은 또 다른 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다.
[00207] 또 다른 측면에서, 입양 세포 요법에서의 치료 방법 및 용도와 같은, 본원에 개시된 변형된 세포의 방법 및 용도가 본원에 제공된다.
[00208] 일부 구현예에서, 방법은 질병 또는 상태를 갖고 있거나 질병 또는 상태가 발생할 위험이 있는 대상체에게 본원에 개시된 변형된 세포 또는 본원에 개시된 변형된 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
[00209] 일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 신생물성 질환(즉, 암), 또는 미생물 또는 기생충 감염(예컨대 HIV, STD, HCV, HBV, CMV 또는 항생제 내성 박테리아), 또는 자가면역 질환(예컨대 류마티스 관절염(RA), 제1형 당뇨병, 전신홍반루푸스(SLE), 염증성 장질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식)이다.
[00210] 일부 구현예에서, 신생물성 상태에는 중추신경계 종양, 망막모세포종, 신경모세포종, 소아 종양, 두경부암(예를 들어 편평세포암), 유방암 및 전립선암, 폐암(소세포폐암 및 비소세포폐암 모두), 신장암(예컨대 신세포 선암종), 식도위암, 간세포암종, 췌담도 종양(예컨대 선암종 및 섬 세포 종양), 대장암, 자궁경부암 및 항문암, 자궁 및 기타 생식기 암, 요로암(예컨대 요관 및 방광)), 생식세포 종양(예컨대 고환 생식세포 종양 또는 난소 생식세포 종양), 난소암(예컨대 난소 상피암), 알려지지 않은 원발성 암종, 인간 면역결핍 관련 악성 종양(예컨대 카포시 육종), 림프종, 백혈병, 악성 흑색종, 육종, 내분비 종양(예컨대 갑상선), 중피종 및 기타 흉막 또는 복막 종양, 신경내분비 종양 및 카르시노이드 종양이 포함된다
[00211] 일부 구현예에서, 본 방법은 예를 들어, 예컨대 암 치료 맥락에서 종양 성장 및/또는 전이를 억제함으로써, 또는 바이러스 감염 치료의 맥락에서 바이러스 부하 및/또는 확산을 감소시킴으로써, 병태의 치료, 즉 병태의 감소 또는 개선, 또는 병태의 임의의 하나 이상의 증상의 감소 도는 개선을 유도한다. "치료"라는 용어가 반드시 완전한 회복을 의미하는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 방법은 병태의 예방, 즉 병태의 예방, 발병 위험의 감소 또는 발병의 지연을 유도한다. 마찬가지로, "예방"은 반드시 피험자가 궁극적으로 질병에 걸리지 않을 것이라는 의미는 아니다.
[00212] 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어 환자는 포유동물, 전형적으로 인간과 같은 영장류이다.
[00213] 일부 구현예에서, 세포 또는 세포를 포함하는 조성물은 비경구로 투여된다. 본원에서 사용된 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여를 포함한다.
[00214] 파생 세포 또는 파생 세포를 포함하는 조성물의 원하는 투여량은 조성물의 단일 투여, 다중 투여, 또는 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다. 치료 또는 예방 효능은 치료 대상의 주기적인 평가를 통해 모니터링할 수 있다.
[00215] 일부 구현예에서, 원천 세포는 대상체로부터 단리된 세포로부터 생성된 후, 본원에 개시된 방법에 따라 변형되고(하나 이상의 유전자의 기능을 억제함), 추가로 분화된 후 동일한 대상체에 투여된다.
[00216] 일부 구현예에서, 입양 세포 요법은 동종 이식에 의해 수행되며, 여기서 원천 세포는 세포 요법을 받을 대상체(수혜 대상체)와 다른 공여자 대상체의 세포로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 공여자 및 수혜자 대상체는 동일한 HLA 클래스 또는 상위유형을 표현한다.
실시예
[00217] 다음 실시예에서는 종양 치료 기능이 향상된 줄기세포 유래 면역세포를 생성하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 사용하여 두 개의 DGK 유전자를 제거하는 것을 제한 없이 설명한다. 유전자 편집 효율성은 게놈 DNA 서열 분석 기반 정량화를 통해 조사하였다. iPSC는 아큐타제를 사용하여 단일 세포로서 리프팅한 다음 특별히 설계된 가이드 RNA가 포함된 Cas9 뉴클레아제 복합체를 이러한 iPSC에 형질감염시켜 면역 조절 유전자를 제거하였다. 그런 다음 iPSC를 CD34+ 세포로 분화하였다. CD34+ 세포는 iNK 세포로 추가로 분화되었다. 세포독성은 시험관내에서 모니터링되었다.
실시예 1 - TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론의 생성
[00218] iPSC와 같은 줄기세포는 조혈 줄기세포(HSC) 및 면역세포를 비롯한 다양한 세포 유형으로 무제한적으로 자가 재생 및 분화할 수 있다. T 세포 및 NK 세포와 같은 면역세포는 이미 암 치료를 위해 iPSC에서 생성되어오고 있다(Li 외, Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Anti-tumor Activity, Cell Stem Cell, 2018, 23(2): 181-192 e5; Themeli et al., Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy, Nat Biotechnol, 2013, 31(10): 928-33; Maeda et al., Regeneration of CD8αβ T Cells from T cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity, Cancer Res, 2016, 76(23): 6839-6850). CAR-T 또는 CAR-NK 세포는 유사한 방법에 따라 렌티바이러스 CAR 형질도입 iPSC로부터 유래될 수 있다. TAG-72 CAR iPSC를 생성하기 위해, TAG-72 CAR 발현 카세트를, 본원에 참조 통합된 WO2017/088012 및 PCT/AU2020/050800에 설명된 대로 비-바이러스 CRISPR/Cas9 유전자 녹인 방법을 통해 AAVS1 안전한 항구(safe harbor) 부위에 도입하였다. TAG-72 CAR 양성 iPSC를 분류하여 정제된 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론을 생성하였다(도 1). iPSC 표면에서의 CAR 발현을 FLOW 세포측정으로 특징화시켰다.
단일 세포 클로닝
[00219] 단일 세포 클로닝을 위해, 먼저 96웰 플레이트를 PBS 중 CellAdhere™ Laminin-521로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. TAG-72 CAR iPSC를 분류하고 1세포/웰의 평균 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. Accutase®를 사용하여 형질감염된 iPSC를 단일 세포로서 리프팅한 후 필요에 따라 관련 항체 칵테일로 염색하기 위해 계수하고 세척 및 재현탁하였다. 세포를 BD FACSAria TM Fusion으로 분류하기 전에 4℃에서 15분 동안 염색하였다. 프로피디움 요오다이드(Propidium iodide: PI) 염색을 이용하여 죽은 세포를 배제시켰다. 세포를 게이트하여 잔해물, 더블릿 및 죽은 세포를 제거한 후 96웰 플레이트로 분류하였다. 플레이트를 즉시 37℃ 세포 인큐베이터에 48시간 동안 배치하고 세포가 계대 배양에 적합한 경우 매일 배지 교체를 수행하였다.
실시예 2 - DGK KO iPSC(사전 분류된 단일 세포 클론) 생성
[00220] DGKα와 DGKζ는 두 가지 모두 여러 개의 전사체를 갖는다. DGKα 및 DGKζ의 모든 주요 이소형을 제거하기 위해, DGKα 유전자 및 DGKζ 유전자를 표적으로 삼도록 가이드된 RNA 목록을 설계하였다(표 1). 따라서 프레임 외 인델이 오픈 리딩 프레임(ORF)의 초기 엑손에 도입되어 DGKα 및 DGKζ의 번역을 방해할 수 있다.
[00221] CRISPR DGKα 및/또는 DGKζ 유전자 이중 녹아웃 iPSC를 생성하기 위해, 대표적인 gRNA(SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11)에 의해 형성된 RNP 복합체를 Lonza 4D-NucleofectorTM 시스템을 사용하여 iPSC에 형질감염시켰다. 먼저, 12웰 플레이트를 PBS 중 CellAdhere™ Laminin-521(STEMCELL Technologies)로 코팅하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. iPSC는 형질감염 전 2시간 동안 RevitaCellTM 보충제(Life Technologies)가 포함된 mTeSR PlusTM 배지(STEMCELL Technologies)와 함께 사전 배양되었다. RNP는 전장 가이드 RNA(gRNA)를 Lonza P3 완충액 및 Cas9와 결합하여 제조되었다. 이어서, RNP 혼합물을 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후 Accutase®(Life Technologies)를 사용하여 iPSC를 단일 세포로 들어올리고 전기천공을 위해 반응당 1x106 세포를 얻었다. 유전자 녹아웃 iPSC를 생성하기 위해 Lonza P3 완충액과 RNP 혼합물의 세포를 PCR 튜브에 결합하였다. 유전자 녹인 iPSC를 생성하기 위해 Lonza P3 완충액의 세포를 RNP 혼합물 및 공여자 DNA와 결합하였다. RNP 혼합물이 포함된 세포를 전기천공을 위해 Lonza 4D-NucleofectorTM에 로딩하였다. 그 후, CloneRTM 배지와 함께 mTeSR PlusTM를 반응물에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, 세포를 CloneRTM 배지와 함께 mTeSR PlusTM 중 Laminin-521 사전 코팅된 플레이트에 첨가하였다. mTeSR Plus TM를 사용한 일일 배지 교체는 72시간 동안 수행되었으며 ~80% 컨플루언시(전기천공 후 6-7일)에 도달하면 세포를 계대배양하였다. 이 단계 종료시 세포를 DGK KO 사전 분류된 iPSC라고 한다.
[00222] RNP 형질감염 및 확장 후, 유전자 편집의 정량 분석을 위해 iPSC에서 게놈 DNA를 추출하였다. 유전자 편집 효율성은 ICE(Inference of CRISPR Edits) 분석법을 사용하여 분석되었다(Hsiau 외, Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. bioRxiv, 2018, 10.1101/251082(251082). DGKα gRNA (SEQ ID NO: 3) iPSC 형질감염된 샘플로부터의 DGKα 유전자 편집 효율성 분석을 ICE 분석의 대표적인 결과로서 여기에 나타내었다(도 2A-2C). 또한 DGKα gRNA(SEQ ID NO: 3) 및 DGKζ gRNA(SEQ ID NO: 11)은 다중 iPSC 계통에 인델을 도입할 수 있는 것으로 나타났다(도 3A-3B).
[00223] CRISPR DGKα 및 DGKζ 유전자를 생성하기 위해서는 단일/이중 녹아웃 iPSC 및 단일 세포 클로닝 두 단계가 요구된다(도 1). 첫째, I상은 iPSC의 전기천공 및 그 회수를 포함한 CRISPR/Cas9 유전자 편집, 이어서 형질전환 iPSC의 확장으로 구성된다. II상은 단일 세포 분류와 후속되는 클론 iPSC 확장을 포함하는 형질감염된 iPSC의 단일 세포 클로닝으로 구성된다.
단일 세포 클로닝
[00224] 단일 세포 클로닝을 위해 먼저 96웰 플레이트를 PBS에 용해된 CellAdhere™ Laminin-521로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. DGKα(SEQ ID NO: 3) 및/또는 DGKζ(SEQ ID NO: 11) RNP 형질감염된 iPSC를 분류하고 1 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다(예컨대 5~9일). 형질감염된 iPSC는 Accutase®를 사용하여 단일 세포로서 리프팅하고, 이어서, 필요한 경우 관련 항체 칵테일로 염색하기 위해 계수, 세척 및 재현탁하였다. 세포를 BD FACSAriaTM Fusion으로 분류하기 전에 4℃에서 15분 동안 염색하였다. PI 염색을 이용하여 죽은 세포를 배제하였다. 세포를 게이트하여 잔해물, 더블릿 및 죽은 세포를 제거한 후 96웰 플레이트로 분류하였다. 플레이트를 즉시 37℃ 세포 인큐베이터에 48시간 동안 배치하고 세포가 계대배양에 적합할 때까지 매일 배지 교체를 수행하였다. 단일 세포 클로닝 후, Sanger 시퀀싱 및 ICE 분석을 사용하여 단일 세포 클론의 유전자형을 분석하였다. 99% 내지 100% 사이의 프레임 외 빈도를 갖는 단일 세포 클론을 KO iPSC 단일 세포 클론으로 선택하였다(도 4A-4D). 이들 선택된 클론의 유전자형을 야생형 Sanger 시퀀싱 추적과 추가로 비교하였다. DGKα 및 DGKζ RNP 공동 형질감염된 iPSC의 DGK 이중 유전자 KO 클론(DGKαζ KO iPSC 단일 세포 클론 01)의 대표적인 유전형 분석 결과가 표시된다. 사전 분류된 DGKα 및 DGKζ RNP 공동 형질감염된 iPSC를 단일 세포 클로닝 후 정제하였으며, 이는 절단 부위 하류의 이종 염기 혼합물을 제거하고, 형질감염되지 않은(야생형) 세포와 비교시 단일 클론에서 티민(T) 삽입(+1)을 확인함으로써 입증되었다 (도 5A-5B). 요약하면, 이러한 결과는 DGKα gRNA 및 DGKζ gRNA가 DGK 유전자에 인델을 도입할 수 있고 프레임-시프트 돌연변이 iPSC를 효율적으로 결과시켜, DGK KO iPSC를 생성할 수 있음을 입증하였다.
[00225] TGFβ는 전신 면역 억제를 발휘하고 숙주의 면역 감시를 억제하며 종양의 면역 억제 미세 환경의 주요 요인 중 하나로 간주된다. 배아 줄기세포에서 TGFβ 수용체의 녹아웃 및 TGFβ 신호전달의 직접적인 억제는 다능성의 상실을 초래한다(Watabe and Miyazono, Roles of TGF-β family signaling in stem cell renewal and differentiation, Cell Research, Jan 2009, Vol.19(1), pp.103-15). 본 발명자들은 CRISPR/CAS9 기술을 사용하여 우성 음성 TGFβ1 및 TGFβR2 iPSC를 생성하였다(본원에 참조로 포함된 특허 PCT/AU2020/051243에 설명됨). 그러나 iPSC에서 TGFβR1 및 TGFβR2 우성 음성 돌연변이는 다능성을 상실하고 유전자 편집 후 자연적으로 분화되기 시작하였다(도 19). 이 결과는 iPSC에서 유전자 녹아웃 또는 TGFβ 수용체의 직접적인 억제가 면역세포 치료를 위한 원천 세포를 생성할 수 없음을 가리킨다.
실시예 3 - TAG-72 CAR 클론/DGK KO 사전 분류된 iPSC 및 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC 단일 세포 클론의 생성
[00226] 사전 분류된 TAG-72 CAR 클론/DGK KO iPSC를 생성하기 위해, 먼저 실시예 1에 설명된 대로 TAG-72 CAR iPSC 단일 세포 클론을 생성하였다. 그런 다음 대표적인 gRNA에 의해 형성된 RNP 복합체를, 실시예 2에 설명된 Lonza 4D-NucleofectorTM 시스템을 사용하여 TAG-72 CAR iPSC에 형질감염시켰다. ICE 분석 결과, DGKα gRNA 및 DGKζ gRNA가 DGK 유전자에 인델을 도입할 수 있고 높은 빈도로 TAG-72 CAR iPSC에서 프레임-시프트 돌연변이를 일으킬 수 있는 것으로 나타났다(도 6). 또한, 실시예 2에 언급된 방법을 사용하여 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC 단일 세포 클론을 유도할 수도 있다(도 7).
실시예 4 - DGK KO iPSC 단일 세포 클론 및 TAG-72 CAR 클론/DGK KO 사전 분류된 iPSC의 CD34+ 세포로의 분화
[00227] 유도된 만능 줄기세포(iPSC)와 같은 줄기세포는 무한히 자가 재생이 가능하며 조혈줄기세포(HSC), 면역세포 등 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있다.
[00228] CD34+ 세포는 미국 특허 9,260,696 B2(Kaufman, Knorr), Li 등 (Stem Cell, 23 (2018) 181-197)에 기술된 것과 같은 다양한 공개 방법 또는 STEMdiffTM Hematopoietic Kit(STEMCELL Technologies)와 같은 시판 배양 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 이들 방법의 한 변형에서, iPSC의 CD34+ 조혈 전구세포로의 분화를 유도하는 것은 AggreWell™400 6-웰 플레이트(STEMCELL Technologies)를 사용하는 배아체(EB: Embryoid Body) 형성을 통해 촉진된다. AggreWell™ 플레이트를 부착 방지 헹굼 용액(STEMCELL Technologies)으로 전처리하고 사용하기 전에 따뜻한 mTeSR PlusTM으로 한 번 세척할 수 있다. 그런 다음 RevitaCellTM 보충제가 포함된 mTeSR PlusTM를 웰당 2.5 mL씩 추가한다. iPSC 배양체를 70% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 증식시키며, 이때 Accutase®를 사용하여 iPSC를 단일 세포로 분리하고 AggreWell™ 플레이트에 재접종한 다음, 웰당 총 5 mL로 배지를 mTeSR PlusTM 및 RevitaCellTM Supplement로 덮는다. 그런 다음 AggreWell™ 플레이트를 100xg에서 3분간 원심분리하여 세포를 각 마이크로웰로 흡인하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양한다. 배양 기간 후, 혈청학적 피펫으로 배지를 제거하고 웰당 STEMdiff™ 조혈 배지 A(STEMCELL Technologies) 5 mL를 첨가한다. 이는 혈액생성 사양의 제0일을 나타낸다. 제2일에, 2.5 mL의 배지 A를 제거하고 이를 새로운 배지 A 2.5 mL로 교체하는 절반 배지 교체를 수행한다. 제3일에는 배지 A를 제거하고 이를 5 mL의 STEMdiff™ 조혈 배지 B(STEMCELL Technologies)로 교체하는 완전한 배지 교체를 수행한다. 제5일에는, 각 웰의 표면에 배양 배지를 단단히 피펫팅하여 EB를 제거하여 EB를 수집한다. 현탁액을 40μm 필터에 통과시킨다. 그런 다음 필터를 뒤집고 필터 표면에 수집된 EB를 2.5 mL의 배지 B로 세척하여 새로운 50 mL 플라스틱 튜브에 넣는다. 그런 다음 EB를 2.5 mL의 배지 B에 있는 비조직 배양 처리된 6웰 플레이트의 웰에 뿌린다. 제7일에는 웰당 2.5 mL의 배지 B를 첨가한다. 제9일과 제11일에는 위에 설명된 대로 배지 B를 사용하여 배지 절반을 교체한다. 제12일에, 부착성 및 비부착성 세포 분획을 모두 수집하고 제조업체의 지침에 따라 MicroBead 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD34+ 세포를 분류한다.
[00229] TAG-72 KI, DGK KO 및 클로닝은 상기 실시예에 설명된 대로 수행되었다. 이어서 iPSC 단일 세포 클론 및 TAG-72 CAR 클론/DGK KO 사전 분류된 iPSC의 DGK KO를 CD34+ 세포로 분화시켰다. 생성된 CD34+ 세포의 분류 순도 및 혈액생성 전구체 프로파일을, CD34 발현에 대한 유세포 분석을 통해 결정하였다. DGK KO iPSC 또는 TAG-72 CAR/DGK KO iPSC에서 지정된 혈액생성 전구세포의 유세포 분석 결과, 형질감염되지 않은 대조군과 유사한 CD34 발현을 보여주며, 이는 DGK KO 단독 또는 TAG-72 CAR KI 및 DGK KO의 조합이, iPSC의 CD34+ 조혈 전구체로의 분화에는 영향을 미치지 않음을 가리킨다(도 11A-11C).
실시예 5 - DGK KO CD34+(TAG-72 CAR 존재 또는 부재)의 iNK 세포로의 분화
[00230] iNK 세포는 미국 특허 9,260,696 B2(Kaufman, Knorr), Li 등(Stem Cell, 23 (2018) 181-197)에 기술된 것과 같은 다양한 공개 방법 또는 시판되는 배양 시스템 StemSpan™ NK Cell Generation Kit(STEMCELL Technologies)을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 방법의 한 가지 변형예에서, DGK KO iPSC 단일 세포 클론 또는 사전 분류된 TAG-72 CAR 클론/DGK KO iPSC로부터 유래된 분류된(예를 들어 실시예 4에 기술된 바와 같이) CD34+ 조혈 전구세포를 StemSpan™ 림프 전구세포 확장 배지(STEMCELL Technologies)에 포함된 StemSpan™ 림프 분화 코팅 물질(STEMCELL Technologies)로 코팅된 플레이트에 재잡정다. 이는 NK 세포 사양의 제0을 의미한다. 제3일에는 배양 용기에 한 부피(one volume)의 확장 배지를 추가한다. 제7일과 제10일에 새로운 확장 배지를 사용하여 절반 배지 교체를 수행한다. 제14일에 비부착성 림프 전구세포를 수집하고 300xg에서 5분간 원심분리한다. 그런 다음 1μM UM729가 보충된 StemSpan™ NK 세포 분화 배지에 세포를 재현탁한다. 제17일에, 한 부피의 NK 분화 배지를 배양 용기에 첨가한다. 제21일과 제24일에 신선한 NK 분화 배지를 사용하여 배지 절반을 교체하였다. NK 세포로의 분화는 제28일에 완료된다. IL-15, FLT3 및 IL-7을 포함한 사이토카인 조합이 포함된 배지를 보충하면 NK 세포 분화 효율이 향상될 수 있다.
[00231] DGK KO CD34+(TAG-72 CAR 존재 또는 부재)를 iNK 세포로 분화시키고 DGK KO, NK 세포 표현형 및 NK 세포 기능에 대해 분석하였다. ICE 분석 결과, iNKs ±TAG-72 CAR이 그들의 모 DGK KO iPSCs ± TAG-72 CAR과 필적할만한 비율로 α 및 ζ 유전자좌 두 가지 모두에서 인델을 보유하는 것으로 확인되었다(도 12A-12B). 또한, TAG-72 CAR KI가 있거나 없는 iPSC에서 단일 또는 이중 유전자 DGK KO는 분화 과정에서 얻은 NK 세포의 수율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 13). NK 세포 마커 CD56, CD45, NKp46, NKG2D, NKp44 및 2B4에 대한 유세포 분석 결과, 형질감염되지 않은 iNK와 형질전환 iNK 사이에 비슷한 발현 수준이 나타났으며, 이는 TAG-72 CAR KI의 존재 또는 부재 하에서 단일 또는 이중 DGK KO가 iNK 세포의 표현형에 영향을 미치지 않음을 가리킨다(도 14A-14B).
실시예 6 - TAG-72 CAR KO iNK 세포 및 KO iNK 세포의 시험관내 기능
[00232] 실시간 세포 모니터링 시스템(xCELLigence®)을 사용하여 시험관내에서 iNK 세포의 살해 효율을 확인하였다. 10,000/100μL의 표적 세포(예컨대 난소암 세포주 OVCAR-3)를 20% 송아지 태아 혈청 및 소 인슐린이 보충된 배양 배지(예컨대 RPMI-1640 기본 배지)에 재현탁하고, xCELLigence® 시스템과 호환되는 Real Time Cell Analysis 미세역가 ePlate에 디포짓하였다. 세포 부착을 허용하기 위해 표적 세포를 37℃, 5% CO2에서 3-20시간 동안 유지하였다. 표적 세포의 부착 후, TAG-72 CAR 또는 DGKαζ KO가 있거나 없는 iNK 이펙터 세포를 1:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 첨가하였다. 모든 공동배양은 최소 20시간 동안 최적의 성장 조건에서 유지되었다. 전체적으로 세포 임피던스가 모니터링되었다: 임피던스의 감소는 표적 세포 분리 및 궁극적으로 세포 사멸을 나타낸다. D실시예 1, 2 및 3에 기술된 바와 같이 TAG-72 CAR 삽입 유무에 관계없이 iPSC 클론에서 GKαζ KO를 수행하였다. 그런 다음 이들 세포를 서열분석하고 iNK 세포로 분화시켰다. TAG-72 CAR 및 DGKαζ KO가 있거나 없는 iNK 세포를 1:1의 이펙터 대 표적 비율로 OVCAR-3 세포를 표적으로 하는 xCELLigence® 분석(상기 설명된 바와 같음)에 배치하여 OVCAR-3 세포에 대한 장기간 노출에 앞서 기준선 iNK 기능을 평가하였다. 항원 노출 분석을 위해 OVCAR-3 세포(ATCC 권장사항에 따라 루틴하게 배양됨)를 12웰 플레이트에 웰당 8x104 세포로 접종하고 6시간 동안 방치하여 플레이트에 부착시켰다. 이어서, 8x105 iNK 세포를 OVCAR-3 함유 웰에 넣고 총 72시간 동안 방치하여 배양하였다. 24시간마다(즉, 공동 배양 24시간, 48시간 및 72시간에) iNK 세포 및 죽은 OVCAR-3 세포를 포함하는 배양액의 비부착성 분획을 수집하고 300xg에서 10분간 원심분리한 후 신선한 iNK 배양 배지로 재현탁하고, 손길이 닿지 않은 OVCAR-3 세포가 들어 있는 웰에 넣는다. iNK에 의해 살해되지 않은 잔류 OVCAR-3 세포(즉, 남은 부착 분획)를 트립신-EDTA 용액을 사용하여 효소적으로 탈착하고 MUSE® 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. 이들 세포수를 이용하여 도 15A에 도시된 바와 같이 iNK 사멸 효율을 계산하였다. 전술한 바와 같이, xCELLigence®를 사용하여 항원 노출 분석이 끝난 후 iNK 세포의 세포독성 기능을 평가하였다.
[00233] CAR KI 및 DGKαζ KO를 갖는 iNK 세포는 시험관 내에서 OVCAR-3 종양 세포에 대해 향상된 장기 세포독성 기능을 나타냈다(도 15A). CAR과 함께 DGKαζ K를 포함시키는 효과는 암 세포주에 대한 반복 노출 72시간 후에 밝혀졌다. 이들 데이터는 iNK 세포에서 기능적 이점을 제공하는 iPSC에 DGKαζ KO를 포함하는 신규 기능을 입증하였다(도 15A). OVCAR-3에 대한 반복 노출 72시간 후, 표적 세포를 제거하는 데 걸리는 시간이 기준선(약 5시간)에 비해 증가하였다(15-20시간)(도 15B). 그러나, 살해능 평가 전 72시간 동안 OVCAR-3 세포에 노출된 iNK 세포의 기능을 비교한 결과, TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK의 기능이 개선된 것으로 나타났다(도 15B). 추가로, 연장된 항원 노출 분석에서 살아남은 iNK 세포의 총 수는 각각의 대응하는, 형질감염되지 않은 iNK 대조군과 비교하여 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 클론에서 개선되었다(도 15C). 종합하면, 이러한 결과는 DGKαζ KO가 iNK 생존 및 종양 세포에 대한 세포독성 기능 향상에 중요하다는 것을 가리키는 것이다.
실시예 7 - DGKαζ KO iNK 세포의 시험관내 기능
[00234] 실시예 6에서 이미 전술한 바와 같이, 실시간 세포 모니터링 시스템(xCELLigence®)을 사용하여 시험관내에서 iNK 세포의 살해 효율을 구하였다. 장기간 항원 노출 분석을 위해, OVCAR-3 세포(ATCC 권장 사항에 따라 루틴하게 배양됨)를 48웰 플레이트에 웰당 2.5x104 세포로 접종하고 4-5시간 동안 방치하여 플레이트에 부착시켰다. 이어서 5x105 iNK 세포(E:T 20:1)를 OVCAR-3 웰에 넣고 24시간 동안 배양되도록 방치하였다. 24시간 후, 유일한 생존 세포로서 iNK 세포를 함유하는 배양물의 비부착성 분획을 수집하고, 300g에서 10분간 원심분리한 후, 새로운 iNK 배양 배지에 재현탁시키고, Guava® MUSE® 세포 분석기를 사용하여 계수하였다. 그런 다음 이들 남은 iNK를, 4시간 전에 새로 접종된 OVCAR-3 세포가 들어 있는 새로운 웰에 넣었다. iNK에 의해 살해되지 않은 잔류 OVCAR-3 세포를 트립신-EDTA를 통해 리프팅하고 Guava® MUSE® 세포 분석기를 사용하여 계수하였다. 이 과정을 총 5일 동안 각 24시간 간격으로 반복하였다. 항원 노출 분석이 끝난 후 iNK 세포를 xCELLigence® 분석에 배치하여 OVCAR-3 세포에 대한 노출 120시간 후 iNK 세포독성 기능의 효과를 입증하였다. 실험 종료점에서, iNK 세포 샘플에 대해서도 유세포 분석을 실시하여 증식성 핵 마커인 Ki67의 발현을 평가하였다.
[00235] DGKαζ KO가 있는 iNK 세포는 시험관내에서 OVCAR-3 종양 세포에 대해 향상된 장기 세포독성 기능을 나타냈다 (도 16A). 120시간의 반복된 항원 노출 후, DGKαζ KO iNK 세포는 xCELLigence® 분석에 의해 입증된 바와 같이, 형질감염되지 않은 iNK 세포에 비해 향상된 살해 능력을 입증하였다 (도 16A). 이들 데이터는 iNK 세포에서 기능적 이점을 제공하는 iPSC에서 DGKαζKO를 포함하는 신규 기능을 입증한다(도 16A). 더욱이, 반복된 항원 노출 후 유세포 분석은 비-형질감염된 iNK에 비해 DGKαζ KO iNK에서 증식성 마커 Ki67을 발현하는 세포의 비율이 증가했음을 시사했다(도 16B). 증가된 Ki67 발현 경향은 DGKαζ KO iNK의 향상된 증식 능력을 암시한다.
[00236] 종양 미세환경의 iNK 세포에서 DGK KO의 기능적 이점을, TGFβ의 존재 하에 실시예 6에 기술된 시험관내 세포독성 기능 분석을 통해 모델링하였다. 일반적인 현상으로서, 고형 종양 미세환경에는 다양한 면역 체크포인트 억제제와 TGFβ와 같은 수용성 인자가 집중적으로 침투하여 종양 탈출과 면역세포에 대한 저항성을 유발한다(Alsina-Sanchis, Elisenda et al., TGF Controls Ovarian Cancer Cell Proliferation, International journal of molecular sciences, 2017-07-30, Vol.18 (8), p.1658). 예를 들어, 이전 연구에서는 TGFβ가 다중 신호전달 경로를 통해 자연 살해 세포 기능을 억제하고 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)와 같은 NK 활성화 수용체의 하향 조절을 초래할 수 있음을 보여주었으며(Yang, Li 외 리뷰, TGF-β and immune cells: an important regulatory axis in the tumor microenvironment and progression, 2010, Vol.31 (6), p.220-227) 여기서는 살해 능력이 손상되었다. 표준 NK 배양 배지 또는 10 ng/mL의 TGFβ가 보충된 배지에서 2:1의 이펙터 대 표적 비율로 OVCAR-3에 대해 표적화된 형질감염되지 않은 iNK 세포 및 DGKαζ KO iNK 세포의 반응을 도 18A-18B에 나타내었다. OVCAR-3 세포 성장을 분석 내 내부 대조군으로서 TGFβ가 있거나 없는(iNK 세포 없음) 배양 배지 단독에서 모니터링되었다. 이 연구에서, iNK 세포에 DGKαζ KO를 포함시키면 TGFβ가 보충된 TGFβ 내에서 감소된 살해 반응을 보인 형질감염되지 않은 iNK 세포와 비교하여, OVCAR-3 세포에 대한 세포 독성 기능에 대해 TGFβ가 갖는 억제 효과를 피하거나 저항할 수 있었다. 직접적인 TGFβ KO는 자발적 분화를 일으키지 않고는 iPSC에서 수행될 수 없기 때문에(도 19에 도시됨), TGFβ 관련 경로 내에서 억제 효과를 최소화하여 iNK 세포의 하류 이점을 가능하게 하는 DGKαζ KO의 능력은 iPSC 및 iNK 세포에서 DGKαζ KO의 새로운 이점을 입증한다.
[00237] DGKαζ KO의 기능적 이점은 TAG -72 CAR과 조합하여 시험관내에서 추가로 평가되었다. 이 분석에서, DGKαζ KO가 있거나 없는 TAG-72 CAR(클론 D7) iNK 세포는 더 까다로운 조건 하에서 OVCAR-3 세포에 대한 xCELLigence® 분석에서 이펙터 세포로 사용되었으며, 여기서 이펙터 대 표적 비율은 1:5로 감소되었고, NK 배지의 TGFβ 보충은 100 ng/mL로 증가되었다. 도 18C에 나타난 바와 같이, 이펙터 세포에 대한 TGFβ의 면역 억제 영향은 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 세포보다 TAG-72 CAR iNK 세포에서 더 컸다. 100 ng/mL의 양으로 TGFβ 첨가하자 OVCAR-3 세포에 대한 TAG-72 CAR iNK 세포의 세포독성 기능기 제거되었다. 동일한 조건 하에서, TAG-72 CAR/ DGKαζ KO iNK 세포독성은 TGFβ 첨가에 따라 약간만 감소하였다. 이러한 데이터는 TAG-72 CAR iNK 세포가 내인성 종양 미세환경의 측면을 모방하는 TGFβ를 비롯한 면역억제 인자에 민감하다는 것을 뒷받침한다. iPSC 세포에의 DGKαζ KO의 포함 및 분화 후 iNK 세포를 통한 하류 유지는 OVCAR-3 세포에 대한 iNK 세포독성 기능에 대한 TGFβ의 영향을 감소시킨다.
실시예 8 - DGKαζ KO iNK 세포의 생체내 기능
[0238] 이 모델에서는, 대략 1x107개의 인간 유래 TAG-72 양성 OVCAR-3 암 세포를 6주 내지 10주령 마우스의 옆구리에 피하 주사하여 인간 종양 세포주를 NSG 마우스의 옆구리에서 성장시켰다. 6~7주 내에 주사 부위에 완전히 형성된 ~100mm3 종양이 발생하였다. 일단 종양이 이 크기에 도달하면 치료를 위해 그룹을 무작위로 나누었다. 편집되지 않은(즉, 형질감염되지 않은) iPSC 공급원 또는 DGKαζ KO iPSC 세포로부터 유래된 iNK 세포를 주사당 1 x 106 NK 세포로 마우스에 정맥내 투여하였다. 주입 전에 iNK 세포를 정상적인 NK 확장 조건에서 7일 동안 시험관내에서 배양하였다. 외인성 사이토카인은 iNK 세포와 함께 마우스에 공동 투여되지 않았다. iNK 세포 주입 후 종양 부피, 체중 및 임상 점수를 모니터링하였다. 동물윤리 승인 규정에 따라 종양 크기가 800mm3 내지 >1000mm3이고 유의한 체중 감소 또는 낮은 임상 점수를 가진 마우스를 선별하였다.
[00239] 인간 사이토카인의 투여는 NSG 마우스에서 인간 NK 세포 생존 및 기능을 지원하는 것으로 입증되었다. 그러나 이 연구에서는 인간 사이토카인이 iNK 세포와 공동 투여되지 않았으며 iNK 세포는 여전히 항종양 활성을 나타냈다. DGKαζ KO를 포함하는 iNK 세포로 처리된 마우스는 이 분석을 통해 여러 시점 동안 종양 크기가 감소한 것으로 나타났으며 생존율의 개선을 보여주었다(도 17).
실시예 9 - TAG-72 CAR 및 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 세포의 시험관내 및 생체내 특징화
[00240] 생체내 투여에 앞서, 이펙터 세포 제제를 최적화된 시험관내 분석 세트에 의해 사전 평가하였다. 여기에는 NK 세포 순도의 유세포 분석, 관련 NK 자극 수용체의 표현형 특성 분석, TAG-72 CAR 발현, DGKαζ KO 상태 및 시험관내 OVCAR-3 사멸 활성이 포함되었다.
[00241] TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 세포의 유세포 분석 결과, 높은 비율의 이중 양성 CD45+ CD56+ 세포가 입증되었는데, 이는 NK 세포의 상대적으로 순수한 집단을 시사한다(도 20A). 이러한 이중 양성 TAG-72 CAR/DGKαζ KO 세포 중 60% 이상이 TAG-72 CAR을 발현했으며, 이는 CAR 보유가 제조 및 편집 공정(허용 가능한 범위 내)에 의해 영향을 받지 않았음을 시사한다. NK 자극 수용체 NKG2D, NKp46 및 2B4와 초기 활성화 마커 CD69 역시도 TAG-72 CAR/DGKαζ KO 세포에서 유의한 수준으로 발현되었으며 발현은 TAG-72 CAR iNK에서 관찰된 것과 유사하였다(도 20A). xCELLigence® 임피던스 기반 기술을 사용한 기능 평가에서는 TAG-72 CAR/DGKαζ K iNK 세포가 편집되지 않은 iNK 및 건강한 성인 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 NK 세포에 비해, 이펙터:표적의 두 가지 비율 1:2과 1:1 모두에서 OVCAR-3 세포 살해를 향상시키는 것으로 나타났다(도 20C는 1:2 비율을 보여주며, 1:1 비율에 대한 데이터는 제시되지 않음). 또한, TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK는 TAG-72 CAR 단독 iNK과 비교시 유사한 살해 능력을 보여주었다. Synthego가 개발한 ICE 도구를 사용하여 DGKα 및 DGKζ 인델 효율을 분석하였다(도 20B). 그 결과 DGKα 및 DGKζ 유전자좌에 대해 각각 약 60% 및 75%의 인델 효율이 입증되었으며, 이는 시험관내(도 20A-20C) 및 생체내(도 21A-21E) 두 가지 모두에서 관찰된 세포독성 효과가 DGKαζ 유전자 KO를 포함하는 세포에 의해 크게 매개되었음을 시사한다.
[00242] 루시퍼라제 기반 생물발광 영상화(BLI) 이종이식 모델을 사용하여 상기 실시예 4 및 5에 설명된 대로 생성된 TAG-72 CAR 및 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 세포의 생체내 효능을 구하였다. OVCAR-3 인간 난소암 세포주는 표적 항원 TAG-72의 알려진 발현, NSG 마우스로의 OVCAR-3 세포의 효율적인 생착 및 시험관내 TAG-72 CAR 및/또는 TAG-72 CAR DGKαζ KO iNK 세포에 대한 OVCAR-3 세포의 민감성을 기반으로 이종이식편으로 선택되었다 (실시예 6 참조). 실험 세부사항은 다음과 같다: 이펙터 세포 투여 4일 전(제-4일), 8주령 암컷 면역저하 NSG 마우스에 2x105 루시퍼라제 표지된 OVCAR-3 세포를 복강내(ip) 주사하였다. NK 세포 투여 하루 전(제-1일), AMI-HTX 동물 이미저(Spectral Instruments Imaging)를 사용하여 기준선 종양 부담에 대해 마우스를 측정하고 유사한 루시퍼라제 발현 그룹에 배치하였다. 제0일에, 1x107 개의 냉동 보관된 iNK 세포를 해동하고 마우스에 복강내 주사하였다. 인간 iNK 이펙터 세포의 생존 및 확장을 지원하기 위해 실험의 첫 3주 동안 모든 그룹에는 2~3일마다(21일 동안) 1x104 U의 인터루킨(IL)-2를 투여하고 및/또는 10ng의 IL-15(7일 동안)를 투여하였다. 종양 부담은 연구가 끝날 때까지(84일) BLI에 의해 매주 모니터링되고 정량화되었다.
[00243] 이 모델에서, TAG-72 CAR iNK 또는 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 세포로 처리된 마우스는 84일의 관찰 기간 동안 PBS, PBMC-NK 대조군 및 편집되지 않은 iNK 처리된 마우스에 비해 종양 부담이 측정가능하게 더 낮은 것으로 나타났다(도 21A-C). 제70일부터, 종양 세포의 성장을 반영하는 생물발광 신호의 점진적인 증가가 TAG-72 CAR iNK로 처리된 마우스에서는 관찰되었으나 TAG-72 CAR/DGKαζ KO iNK 처리된 마우스 에서는 관찰되지 않았다(도 21C). 개별 시점의 분석 결과, TAG-72 CAR 단독 iNK에 비해 일관되게 더 낮은 평균 종양 부담에 의해 반영되는 바와 같이, iNK에 DGKαζ KO를 포함하는 것이 탁월한 장기적인 생체내 효능을 초래했음을 암시하는 강한 경향을 드러냈다(도 21D, E).
실시예 10 - DGK KO CD34 + (TAG-72 CAR가 있거나 없음)의 iT 세포로의 분화
[00244] iT 세포는 다양한 공개된 방법을 이용하여, 예컨대 델타 유사 리간드 1(DLL1)을 발현하는 유전적으로 편집된 마우스 간질 지지 세포(OP9)(Themeli 외, Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy, Nat Biotechnol., Oct 2013, Vol 31(10), pp. 928-933) 또는 델타 유사 리간드 4(DLL4)(Flippe 외, Rapid and Reproducible Differentiation of Hematopoietic and T Cell Progenitors From Pluripotent Stem Cells, Front. Cell Dev. Biol., 20 Oct 2020, Vol 8, Article 577464), 또는 현탁액 내 지지 구조에 결합된 노치 리간드 신호전달(US20200399599A1, Method for generating cells of the T cell lineage)을 사용하거나, IL-7, FLT3, SCF와 같은 사이토카인의 존재 하, 또는 시판되는 배양 시스템 STEMdiffTM T Cell Kit(STEMCELL Technologies)을 이용함으로써 생성될 수 있다.
[00245] iPSC 공급원은 편집되지 않았거나 DGKαKO, DGKζ KO, DGKαζ KO 또는 CAR 녹인 조합 중 적어도 하나를 함유할 수 있으며, 정제되지 않은 대량 유전자 편집 집단으로부터 유래되거나, 강화된 집단이거나 또는 클론 유래될 수 있다. 이들 iPSC 공급원은 CD34+ 세포로 분화된다. 사전-분류된 CD34+ 세포를 StemSpanTM Lymphoid Progenitor Expansion Medium (STEMCELL Technologies) 중 StemSpanTM Lymphoid Differentiation Coating Material (STEMCELL Technologies)로 코팅된 플레이트에 재접종한다. 이는 T 세포 분화 제0일을 의미한다. 14일 후, 매주 2회 배지 교체를 수행하여 전구 T 세포를 수집하고 권장 기간 동안 StemSpanTM T Cell Progenitor Maturation Medium (STEMCELL Technologies)에 배치한다. T 세포를 수집한 다음 CD8 SP T 세포 성숙 배지(STEMCELL Technologies) 중 Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads (Thermo Fisher) 또는 ImmunoCultTM Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator (STEMCELL Technologies)를 이용하여 T 세포를 활성화시켜 주로 CD8+ 표현형을 갖는 성숙한 CD3+ T 세포를 생성한다.
[00246] TAG-72를 표적으로 하는 CAR 작제물을 먼저 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 iPSC의 안전한 항구 유전자좌에 녹아웃한 다음, DGKα 및 DGKζ 두 가지 모두fmf CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃시켰다(실시예 1-2에 설명된 대로). 유전자 편집 후 세포를 클로닝하고 CAR의 DGKαζ KO 및 동형접합체 KI를 분화를 위해 선택하였다(실시예 3 참조). TAG-72 CAR iPSC 농축 계통의 인델 효율은 DGKα의 경우 90%, DGKζ의 경우 99%였다(도 22A). 이들 iPSC 계통은 iT 세포로 성공적으로 분화되었으며, 여기서 진정한(bona fide) T 세포에 대한 홀마크 마커는 유세포 분석을 통해 특성화되었다(도 22B). 중요한 것은, TCRαβ 및 TCRγδ와 함께 CD3+를 공동 발현하는 세포 집단이 CAR 및 DGKαζ KO 유무에 관계없이 동등한 수준으로 얻어졌다는 것이다. 이는 iPSC에 DGKαζ KO를 포함해도 iPSC가 iT 세포로 발달하는 것을 차단하지 않는다는 발견을 뒷받침한다. CAR과 CD3의 공동 발현은 iT 세포가 명시적으로 CAR을 유지한다는 것을 추가로 확인시켜 준다.
[00247] 도 22C에 도시된 바와 같이, iPSC 유래 TAG-72 CAR + DGKαζ K iT 세포는 시험관내에서 xCELLigence®를 통해 나타난 바와 같이 TAG-72 발현 난소암 세포주 OVCAR-3에 대한 표적 CAR 매개 활성을 나타낸다. 이와 반대로, OVCAR-3 대조군과 비교하여, 형질감염되지 않은 iT 세포 및 CAR 작제물 없이 PBMC로부터 단리된 T 세포는 동등한 기능을 나타내지 않다. 가장 중요한 점은 DGKαζ KO 및 CAR KI 유전자 편집을 사용하여 iPSC 클론에서 파생된 iT 세포에서 강력한 세포독성 기능이 유지된다는 것으로 이는 DGKαζ KO가 있는 기능성 CAR iT 세포를 입증한다.
실시예 11 - TGFβ 존재 하에 TAG-72 CAR/DGK KO iT 세포의 시험관내 기능
[00248] iT 세포는 실시예 10에 설명된 대로 생성될 수 있다.
[00249] 종양 미세환경 내 iT 세포에서 DGK KO의 기능적 이점을 도 23A에 도시된 바와 같이 TGFβ 존재 하에 시험관내 세포독성 기능 분석(앞서 실시예 7에 개괄된 바와 같음)을 사용하여 모델링하였다. 간단히 말해서, DGKαξ KO 및 CAR이 있거나 없는 iT 세포를, 실시간 세포 모니터링 시스템(xCELLigence®)을 사용하기 전 최소 8시간 동안 최적의 성장 배지에서 0 ng/mL, 10 ng/mL 또는 100 ng/mL TGF로 사전 컨디셔닝하여 시험관내에서 iT 세포의 살해 효율을 구한다. 10,000/100μL의 표적 세포(예컨대 난소암 세포주 OVCAR-3)를 20% 송아지 태아 혈청 및 소 인슐린이 보충된 배양 배지(예컨대 RPMI-1640 기본 배지)에 재현탁하고 xCELLigence® 시스템과 호환되는 Real Time Cell Analysis 미세역가 ePlate에 디포짓하였다. 세포 부착을 허용하기 위해 표적 세포를 37℃, 5% CO2에서 3-10시간 동안 유지하였다. 표적 세포의 부착 후, TAG-72 CAR 및 DGKαζ KO가 있거나 없고, TGFβ에 노출되거나 노출되지 않은 iT 이펙터 세포를 1:1의 E:T로 첨가하였다. 모든 공동 배양은 최소 40시간 동안 최적의 성장 조건 ± TGFβ에서 유지되었다. 또한, 표적 세포 단독 ± TGFβ를 병행하여 유지하였다. 전체적으로 세포 임피던스를 15분 간격으로 모니터링하였으며; 임피던스의 감소는 표적 세포 탈착 및 궁극적으로 세포 사멸을 나타낸다.
[00250] TGFβ 사전 컨디셔닝의 부재 하에, 세포독성 기능을 iT(형질감염되지 않음) 세포에서 관찰하였다(도 23B 및 도 23C, 닫힌 기호)). 여기서 정규화된 세포 지수 0으로 표시되는, 거의 완전한 표적 세포 사멸이 모니터링 40 시간 이내에 관찰된다. 이와 대조적으로, 10 ng/mL TGFβ(도 23B) 또는 100 ng/mL TGFβ(도 23C)로 iT(형질감염되지 않음) 세포를 사전 컨디셔닝하고 유지한 경우 시험관내 세포독성 기능이 감소되었다. 시험관내 세포 독성에 대한 TGFβ의 이러한 억제 효과는 DGKαξ KO가 있는 TAG-72 CAR-iT 세포에서는 관찰되지 않았는데, 이는 DGKαξ의 결실(녹아웃)이 이들 세포를, iT 세포의 세포독성 기능에 대한 TGFβ의 억제 효과에 덜 민감하게 만들었음을 가리킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Cartherics Pty. Ltd. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED IMMUNE CELLS WITH ENHANCED FUNCTION <130> 39095WO <150> 63/236,828 <151> 2021-08-25 <150> 63/147,933 <151> 2021-02-10 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 tatcctacag atgatgcgag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 ctctcaagct gagtgggtcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 cagcactagc agtggcacgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 agacccagca gcactagcag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 gagattgact atgatggcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 gctctgtctc tcaagctgag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 cagccactcg catcatctgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 gctcagacac atcccaatcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 taggaaagcc atcaccaagt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 acgagcactc accagcatcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 ctaggagtca gcgacatatg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 gcagaagtcc ccggacacgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 gttcgagacc aacgtgtccg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 cggggacttc tgctacgttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 ccgctctgac tcgctgcacg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 ccccgtgcag cgagtcagag 20 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgttgcc gctgctagtg ctgctggttc 60 tgaaaa 66 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgtgcca ctgctagtgc tgctgggtct 60 ggagat 66 <210> 19 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 tgggtccggg ctggggccac caccgntgcc actgctagtg ctgctgggtc tggagatggt 60 gagtaggaga gactt 75 <210> 20 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 tgggtccggg ctggggccac caccgtgcca ctgctagtgc tgctgggtct ggagatggtg 60 agtaggagag acttt 75 <210> 21 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 tgggtccggg ctggggccac caccggccac tgctagtgct gctgggtctg gagatggtga 60 gtaggagaga cttt 74 <210> 22 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 tgggtccggg ctggggccac caccgctagt gctgctgggt ctggagatgg tgagtaggag 60 agacttt 67 <210> 23 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 23 tgggtccggg ctggggccac caccggtgct gctgggtctg gagatggtga gtaggagaga 60 cttt 64 <210> 24 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 tgggtccggg ctggggccac tgctagtgct gctgggtctg gagatggtga gtaggagaga 60 cttt 64 <210> 25 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 25 tgggtccggg ctggggccac cactgccact gctagtgctg ctgggtctgg agatggtgag 60 taggagagac ttt 73 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 26 tgggtccggg ctggggccac cgctagtgct gctgggtctg gagatggtga gtaggagaga 60 cttt 64 <210> 27 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 tgggtccggg ctggggccac caccgccact gctagtgctg ctgggtctgg agatggtgag 60 taggagagac ttt 73 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 28 tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgtgcca ctgctagtgc tgctgggtct 60 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 29 tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgttgcc actgctagtg ctgctgggtc 60 <210> 30 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 30 tcaagctgag tgggtccggg ctggggccac caccgttgcc actgctagtg ctgctgggtc 60 tg 62 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 31 agcaagccca tcccgtggct aggagtcagc gacatatggg gagcacatct ggttcgagac 60 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 32 agcaagccca tcccgtggct aggagtcagc gacattatgg ggagcacatc tggttcgaga 60 <210> 33 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 33 agcaagccca tcccgtggct aggagtcagc gacattatgg ggagcacatc tggttcgaga 60 c 61 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 34 ctcgatggtg aatgacagtg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 35 gcttctgctg ccggttaacg 20

Claims (39)

  1. 기능이 향상된 줄기세포 유래 면역세포를 생성하는 방법으로서,
    (I) DGKα 및 DGKζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 유전자의 기능을 억제하도록 줄기세포를 변형시키는 단계
    를 포함하되;
    상기 변형된 줄기세포는 변형된 줄기세포의 표적 유전자 억제를 유지하고 향상된 활성을 포함하는 줄기세포 유래 면역세포로 분화할 수 있는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 줄기세포는 유도된 만능 줄기세포(iPSC) 또는 배아줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 만능 줄기세포인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 줄기세포는 전-HSC, 혈액생성 내피(HE) 또는 조혈 줄기세포(HSC)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 줄기세포는 삼중 동형접합 HLA 일배체형 공여자로부터 유래되는, 방법.
  5. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (I)에서 얻은 변형된 줄기세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하되, 여기서 표적 유전자의 두 대립유전자가 모두 억제되는, 방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    (i) 단계 (I)에서 얻은 변형된 줄기세포 또는 이로부터 생성된 클론 세포를 조성물과 접촉시켜 중배엽세포를 얻는 단계;
    (ii) 중배엽 세포를 조성물과 접촉시켜 CD34+ 세포를 얻는 단계; 및
    (iii) CD34+ 세포를 조성물과 접촉시켜 줄기세포 유래 면역세포를 얻는 단계
    를 더 포함하는, 방법.
  7. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKα인, 방법.
  8. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKζ인, 방법.
  9. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, DGKα 유전자 및 DGKζ 유전자 두 가지 모두가 억제되는, 방법.
  10. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포 유래 면역세포는 만능 전구세포, 공통 림프계 전구세포, 초기 흉선 전구세포, 전-T 세포 전구세포, 전-NK 전구세포, T 전구세포, NK 전구세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 공통 골수 전구세포, 대식세포 및 단핵구로부터 선택되는, 방법.
  11. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 면역세포는 CD2, CD5, CD7, CD4, CD8a, CD8b, CD3, TCRαβ 및TCRγδ로부터 선택된 마커 중 적어도 하나를 발현하는 T 세포인, 방법.
  12. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 면역세포는 CD56+ 및 CD45+를 발현하는 NK 세포인, 방법.
  13. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자의 기능 억제는 유전자 편집 시스템에 의해 달성되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas, TALEN 및 ZFN으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는. 방법.
  17. 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR/Cas 시스템은 Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas12, Cas13, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, CasX, CasY, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 가이드 RNA 의존성 뉴클레아제를 이용하는, 방법.
  18. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 줄기세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하도록 추가로 변형되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 변형된 줄기세포는 CAR을 발현하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 면역세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하도록 변형되는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 면역세포는 CAR을 발현하는, 방법.
  22. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생성된 면역세포는 하나 이상의 표적 항원을 인식하는, 방법.
  23. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 면역세포는 종양 표적 또는 감염원 표적을 인식하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 표적 항원은 TAG-72, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD47, 엽산 수용체 알파(FRα), BCMA, 메소텔린, Muc1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된, 면역세포.
  26. 변형된 세포로서, DGKα 및 DGKζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 유전자의 기능이 억제되고, 상기 변형된 세포는 상기 변형된 세포의 유전자 억제를 유지하고 향상된 활성을 포함하는 면역세포로 분화할 수 있는 것인, 변형된 세포.
  27. 제26항에 있어서, 세포는 배아 줄기세포, 제대 줄기세포 및 유도된 만능줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포인, 변형된 세포.
  28. 제26항에 있어서, 세포는 혈액생성 내피 세포, 조혈 전구세포, 조혈 선구세포, 조혈 줄기세포 또는 조혈 유사 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 세포.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 삼중 동형접합성 HLA 일배체형 공여체로부터 유래된 것인, 변형된 세포.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자의 두 대립유전자 모두가 억제되는, 변형된 세포.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKα인, 변형 세포.
  32. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 DGKζ인, 변형된 세포.
  33. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, DGKα 및 DGKζ 유전자 두 가지 모두가 억제되는, 변형 세포.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 변형된 세포.
  35. 제34항에 있어서, 변형된 세포는 CAR을 발현하는, 변형된 세포.
  36. DGKα 및 DGKζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 유전자의 기능을 억제하도록 세포를 변형시키는 조성물로서: 표적 유전자의 서열을 편집할 수 있는 가이드 RNA-뉴클레아제 복합체를 포함하되, 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하는, 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 뉴클레아제는 Cpf1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas12, Cas13, Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5,Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1,Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, CasX, CasY, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2,Csf3, 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함하는, 조성물.
  38. 제25항에 따른 면역세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 병태를 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 병태는 암, 감염, 자가면역 장애, 장기 섬유증, 또는 자궁내막증인 방법.
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