JP2024506067A - 増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法および組成物 - Google Patents

増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2024506067A
JP2024506067A JP2023548215A JP2023548215A JP2024506067A JP 2024506067 A JP2024506067 A JP 2024506067A JP 2023548215 A JP2023548215 A JP 2023548215A JP 2023548215 A JP2023548215 A JP 2023548215A JP 2024506067 A JP2024506067 A JP 2024506067A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
car
gene
ipscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023548215A
Other languages
English (en)
Inventor
ニコラス ボイド，
アラン オズボーン トラウンソン，
フイミン カオ，
マシュー ジェームス ティーデマン，
リチャード ボイド，
ランチェ シュー，
フレデリコ ロウレイロ カルハベウ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cartherics PtyLtd
Toolgen Inc
Original Assignee
Cartherics PtyLtd
Toolgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cartherics PtyLtd, Toolgen Inc filed Critical Cartherics PtyLtd
Publication of JP2024506067A publication Critical patent/JP2024506067A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01107—Diacylglycerol kinase (2.7.1.107)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

本開示は、増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法に関する。ＤＧＫαおよびＤＧＫζから選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害する免疫細胞に分化することができる幹細胞または前駆細胞を改変し、その幹細胞または前駆細胞の増強された免疫細胞への分化を導くための方法が本明細書に開示される。本明細書では、本方法によって作製される免疫細胞または幹細胞、ならびに治療的処置における免疫細胞の使用も開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１０日に出願された米国仮出願第６３／１４７，９３３号および２０２１年８月２５日に出願された同第６３／２３６，８２８号からの優先権の利益を主張するものであり、これらの仮出願の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
開示の分野
本開示は、増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法に関する。より具体的には、免疫細胞に分化することができる幹細胞または前駆細胞を改変して、ＤＧＫαおよびＤＧＫζから選択される少なくとも１つの遺伝子の機能を阻害し、その幹細胞または前駆細胞の増強された免疫細胞への分化を誘導する方法が本明細書に開示される。本明細書では、本方法によって作製される免疫細胞または幹細胞、ならびに治療的処置における免疫細胞の使用も開示される。
配列表の参照による組み込み
２０２２年１月２７日に作成された８ＫＢの３９０９５ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における任意の先行する刊行物（またはそれに由来する情報）、または既知の任意の事項への言及は、その先行する刊行物（またはそれに由来する情報）または既知の事項が、本明細書が関係する活動分野における共通の一般知識の一部を形成することの自認または承認または任意の形態の示唆として解釈されるべきではない。
悪性腫瘍またはがんは、制御されない様式で増殖し、正常組織に侵入し、しばしば転移し、起源の組織から離れた部位で増殖する。一般に、がんは、悪性形質転換と呼ばれるあまり理解されていないプロセスを受けた１つまたはほんの少数の正常細胞に由来する。がんは、体内のほとんどすべての組織から生じ得る。癌腫と呼ばれる上皮細胞由来のものは、最も一般的な種類のがんである。肉腫は、線維芽細胞、筋肉細胞、および脂肪細胞などの細胞から生じる間葉組織の悪性腫瘍である。リンパ系組織の固形悪性腫瘍はリンパ腫、ならびにリンパ球および他の造血細胞の骨髄および血液由来の悪性腫瘍は、白血病と呼ばれる。
がんは、先進工業国における３つの主要な死因の１つである。感染症の治療および心血管疾患の予防は継続的に改善され、その平均余命は長くなっているため、がんがこれらの国において最も一般的な致死的疾患になる可能性が高い。したがって、がんの治療を成功させるには、患者を死亡させることなく全ての悪性細胞を除去または破壊する必要がある。これを達成するための理想的な方法は、腫瘍の細胞とそれらの正常な細胞性対応物とを識別する腫瘍に対する免疫応答を誘導することである。
免疫療法は、身体自身の免疫系を使用する、最近登場した新しい治療領域である。この処置は、生きている生体から得られるか、または実験室で産生される、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞などの細胞を使用してもよく、これらは、増強されており、患者の身体に注入されて、がん、感染症および他の疾患と戦うその免疫系を助ける。数種類の免疫療法が現在開発されている。
これらの処置のいくつかは、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの疾患において腫瘍細胞を死滅させるのに非常に有効であることが示されているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を発現するＴ細胞を使用する。Ｂ細胞抗原ＣＤ１９を標的とする承認された製品は、ＣＡＲ遺伝子構築物を患者由来（「自己」）Ｔ細胞に導入することによって産生される（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１３， １３（８）： ５２５－４１）。多発性骨髄腫などの他の血液悪性疾患のための、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）などの他の血液細胞マーカーを標的とする追加の自家製品が開発中である（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ， ５４５（７６５５）： ４２３－４３１）。
他の処置として、血液系悪性腫瘍に対してＮＫ細胞が成功裏に使用されている。その治療効果を増強するために、遺伝子編集ツールがＮＫ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞に適用されている。ＩＬ－１５およびＩＬ－２のようなサイトカインの自己分泌または膜結合発現は、ＮＫ細胞の増殖および持続性を改善し得る（Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ， Ｂｌｏｏｄ， １５ Ｍａｙ １９９８， Ｖｏｌ．９１（１０）， ｐｐ．３８５０－６１； Ｈｏｙｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ａｎｄ ａ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２０１０ Ｊｕｎ， Ｖｏｌ．２４（６）， ｐｐ．１１６０－７０； Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５， Ｂｌｏｏｄ， １４ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４， Ｖｏｌ．１２４（７）， ｐｐ．１０８１－８）。主にＴ細胞において研究された免疫チェックポイントの標的化は、ＮＫ細胞においても有望な結果を示した。ＮＫ細胞のチェックポイント受容体であるＴＩＧＩＴのノックアウトは、ＮＫ細胞疲弊を防止し、抗腫瘍活性を促進することが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＩＧＩＴ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌ ２０１８， Ｖｏｌ．１９（７）， ｐｐ．７２３－７３）。さらに、Ａ２ＡＲ、ＴＧＦβＲ２などの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）からの免疫抑制性サイトカインの受容体の遺伝子破壊は、ＴＭＥからの阻害を中和し、ＮＫ細胞エフェクター機能を回復させることが示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＳＭＡＤ４ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＴＧＦ－ｂｅｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＮＫ ｃｅｌｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ０１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１８， Ｖｏｌ．１２８（１１）， ｐｐ．５１２３－５１３６； Ｒｏｕｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＴＧＦ－ｂｅｔａ／ＳＭＡＤ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｂ－ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， Ａｐｒ ２０１６， Ｖｏｌ．３０（４）， ｐｐ．８００－８１１； Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａ２ＡＲ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ， １５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１８， Ｖｏｌ．７８（４）， ｐｐ．１００３－１０１６）。
Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞と比較すると、ＮＫ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞ベースの処置は、（１）特にサイトカイン放出症候群および移植片対宿主病のような潜在的に生命を脅かす有害事象に関してより高い安全性、（２）細胞傷害活性をもたらすための複数の機構、および（３）「既製の」製造のための高い実現可能性などのいくつかの利点を提示する（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．， ＣＡＲ－ＮＫ ｃｅｌｌｓ： Ａ ｐｒｏｐｏｓａｂｌｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ， ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０２０， Ｖｏｌ．５９； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ＣＡＲ－Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＣＤ１９－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６， ２０２０， Ｖｏｌ．３８２（６）， ｐｐ．５４５－５５３）。
細胞ベースの免疫療法は、血液のがんに対する臨床試験において印象的な結果を示しているが、固形腫瘍の処置において同様の結果は得られていない。固形腫瘍における有効性の相対的な欠如には複数の理由があり、例えば、腫瘍部位への限定的なアクセス、腫瘍微小環境の免疫抑制性の性質、および固形腫瘍特異的標的抗原の欠如が挙げられる。
加えて、投与されるＣＡＲ細胞の持続性の欠如と「枯渇」は、一貫して観察される限界である（Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ，２０１７，６８：１３９－１５２）。
ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、またはＬＡＧ－３のような抑制性受容体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を弱め、Ｔ細胞疲弊を加速し得る。ＰＤ－１がゲノム編集によって破壊された後、Ｔ細胞の抗腫瘍活性の改善が予想された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１７，２７（１）：１５４－１５７）。しかしながら、Ｔ細胞上のＰＤ－１の除去はまた、疲弊に対する感受性を増加させ、寿命を短縮し、抗腫瘍効果を改善することができない可能性がある（Ｏｄｏｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＤ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０１５，２１２（７）：１１２５－３７）。これらの理由から、免疫細胞における遺伝子編集が抗腫瘍活性を増強するか否かをケースバイケースで評価する必要がある。
遺伝子操作された免疫細胞は明らかにがんに対する潜在的な武器であり、したがって、課題の１つは、それらを数値的に生成し、拡大培養し、保持することである。免疫細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から順次作製される造血幹細胞（ＨＳＣ）から作製される。したがって、ＰＳＣ技術は、理論的にはＰＳＣが無限の再生可能な細胞源を提供するので、非常に有望な技術である。
Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１３， １３（８）： ５２５－４１ Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ， ５４５（７６５５）： ４２３－４３１ Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ， Ｂｌｏｏｄ， １５ Ｍａｙ １９９８， Ｖｏｌ．９１（１０）， ｐｐ．３８５０－６１ Ｈｏｙｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ａｎｄ ａ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２０１０ Ｊｕｎ， Ｖｏｌ．２４（６）， ｐｐ．１１６０－７０ Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５， Ｂｌｏｏｄ， １４ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４， Ｖｏｌ．１２４（７）， ｐｐ．１０８１－８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＩＧＩＴ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌ ２０１８， Ｖｏｌ．１９（７）， ｐｐ．７２３－７３ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＳＭＡＤ４ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＴＧＦ－ｂｅｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＮＫ ｃｅｌｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ０１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１８， Ｖｏｌ．１２８（１１）， ｐｐ．５１２３－５１３６ Ｒｏｕｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＴＧＦ－ｂｅｔａ／ＳＭＡＤ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｂ－ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， Ａｐｒ ２０１６， Ｖｏｌ．３０（４）， ｐｐ．８００－８１１ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａ２ＡＲ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ， １５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１８， Ｖｏｌ．７８（４）， ｐｐ．１００３－１０１６ Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．， ＣＡＲ－ＮＫ ｃｅｌｌｓ： Ａ ｐｒｏｐｏｓａｂｌｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ， ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０２０， Ｖｏｌ．５９ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ＣＡＲ－Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＣＤ１９－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６， ２０２０， Ｖｏｌ．３８２（６）， ｐｐ．５４５－５５３ Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ，２０１７，６８：１３９－１５２ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１７，２７（１）：１５４－１５７ Ｏｄｏｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＤ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０１５，２１２（７）：１１２５－３７
本発明は、ヒトＰＳＣなどの細胞を遺伝子編集し、造血幹細胞様細胞に分化させ、最終的に機能的免疫細胞に分化させるための組成物および方法に関し、そのような免疫細胞は、同等の遺伝子編集されていない免疫細胞を上回る利点を有する。１つまたは複数の非冗長細胞遺伝子を欠失させることは、正常な細胞機能に有意に影響を及ぼす可能性があり、実際に、細胞を生存不能にするか、非機能的にするか、または幹細胞の場合には、機能的細胞に分化できなくする可能性があることは、当業者には理解されるであろう。本発明は、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζ遺伝子の遺伝子ノックアウト（ＫＯ）を開示し、驚くべきことに、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣが生存可能であり、ＤＧＫ ＫＯ免疫細胞、特にＮＫ細胞およびＴ細胞に分化することができることを実証している。さらに、ＤＧＫ ＫＯ ＮＫ細胞は、インビトロおよびインビボで完全に機能的であり、実際、ＤＧＫのＫＯを有さないＮＫ細胞よりも優れた機能を示す。同様に、ｉＰＳＣ由来のＤＧＫ ＫＯ Ｔ細胞は、インビトロで完全に機能的であり、また、ＤＧＫのＫＯを有さないＴ細胞と比較した場合、改善された機能を示す。
一態様では、増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成する方法が本明細書で提供される。この方法は、ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の機能を阻害するように幹細胞を改変することを含み、改変幹細胞は、改変幹細胞の標的遺伝子阻害を保持し、増強された活性を含む幹細胞由来免疫細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞からなる群より選択される多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、プレＨＳＣ、造血内皮（ＨＥ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）またはＨＳＣ様細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、三重ホモ接合性（ｔｒｉｐｌｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）ＨＬＡハプロタイプドナーに由来する。
いくつかの実施形態では、本方法は、標的遺伝子の両方の対立遺伝子が阻害されている、作成された改変幹細胞を選定する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｉ）本明細書で生成される改変幹細胞、または改変幹細胞から生成されるクローン細胞を組成物と接触させて中胚葉細胞を得る工程、（ｉｉ）中胚葉細胞を組成物と接触させてＣＤ３４＋細胞を得る工程、および、（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋細胞を組成物と接触させて幹細胞由来免疫細胞を得る工程を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子はＤＧＫαである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子はＤＧＫζである。いくつかの実施形態では、ＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子の両方が標的遺伝子である。
いくつかの実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、多能性前駆細胞、リンパ系前駆細胞（例えば、リンパ系共通前駆細胞）、初期胸腺前駆細胞、プレＴ細胞前駆細胞、プレＮＫ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、骨髄系前駆細胞（例えば、骨髄系共通前駆細胞）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび単球から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ３、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδから選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現するＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ５６＋及びＣＤ４５＋を発現するＮＫ細胞である。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の機能の阻害は、遺伝子編集システムによって達成される。いくつかの態様では、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、およびＺＦＮからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～配列番号１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的とする。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択されるガイドＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを利用する。
いくつかの実施形態では、改変幹細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むようにさらに改変されている。いくつかの態様において、改変幹細胞はＣＡＲを発現する。
いくつかの態様では、本方法によって産生される免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むように改変されている。いくつかの態様では、本方法によって産生される免疫細胞はＣＡＲを発現する。
いくつかの実施形態では、本方法によって産生される免疫細胞は、１つまたは複数の標的抗原を認識する。いくつかの実施形態において、本方法によって産生される免疫細胞は、腫瘍標的または感染性因子標的を認識する。一部の実施形態では、標的抗原は、ＴＡＧ－７２、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＢＣＭＡ、メソテリン、Ｍｕｃ１からなる群から選択される。
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって産生される免疫細胞が本明細書で提供される。
別の態様では、ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の機能が阻害されている改変細胞であって、改変細胞の遺伝子阻害を保持し、増強された活性を含む免疫細胞に分化することができる改変細胞が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、胚性幹細胞、臍帯幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群より選択される幹細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、造血性内皮細胞、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、造血始原細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、造血幹細胞または造血様幹細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、改変された細胞は、三重ホモ接合性ＨＬＡハプロタイプドナーに由来する。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子の両方の対立遺伝子が阻害される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子はＤＧＫαである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子はＤＧＫζである。一部の実施形態では、ＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子の両方が標的遺伝子である。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、改変細胞はＣＡＲを発現する。
別の態様では、ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の機能を阻害するように細胞を改変するための組成物であって、標的遺伝子の配列を編集することができるガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含み、ガイドＲＮＡが、配列番号１～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、組成物が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、対象における状態を処置する方法であって、対象に本明細書に開示される免疫細胞を投与することを含む方法である。いくつかの実施形態は、状態は、がん、感染症、自己免疫障害、器官の線維症、または子宮内膜症である。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。
ｉＰＳＣ遺伝子編集および単一細胞クローニングの概略図。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（参照により本明細書に組み込まれる特許ＰＣＴ／ＡＵ２０２０／０５０８００およびＷＯ２０１７／０８８０１２に記載）をｉＰＳＣにノックイン（ＫＩ）またはＤＧＫ遺伝子（ＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζ）をノックアウト（ＫＯ）し、またはＣＡＲ ｉＰＳＣクローンにＫＯ ＤＧＫ遺伝子（ＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζ）をノックアウトした。ｉＰＳＣまたはＣＡＲ ｉＰＳＣクローンを、ｉＰＳＣが再び正常に増殖するまで、エレクトロポレーションから回復させた。これは、典型的には、エレクトロポレーション後４～６日を超えた任意の時点である。８０％のコロニーコンフルエントに達すると、ｉＰＳＣを１１日目まで拡大培養（ｅｘｐａｎｄ）させた後、単一細胞選別（第Ｉ相）を行った。トランスフェクトされていないｉＰＳＣを野生型と称する。第Ｉ相の終了時の編集されたｉＰＳＣまたはＣＡＲ ｉＰＳＣクローンは、以下の実施例において予備選別（ｐｒｅ－ｓｏｒｔｅｄ）されたものと称される。ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎセルソーターを使用してｉＰＳＣの単一細胞選別を行い、単一細胞からのコロニー形成を９～１２日間進行させた。その後、必要な細胞数に達するまでクローンを拡大培養させ（第ＩＩ相）、遺伝分析を行い、クローンｉＰＳＣにおける精度および純度を決定した。第ＩＩ相の終わりのｉＰＳＣを、以下の実施例において単一細胞クローンと称する。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫα遺伝子のオープンリーディングフレームに挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）および欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）（インデル）を導入する。ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）形成リボ核タンパク質（ＲＮＰ）をｉＰＳＣにトランスフェクトし、インデルの頻度をＩｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）分析によって評価した。（Ａ）ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的化するｇＲＮＡのＲＮＰトランスフェクトｉＰＳＣ（「編集試料」）（配列番号１７）、および非トランスフェクトｉＰＳＣ（「対照試料」）（配列番号１８）からのサンガー配列決定トレースを示す。編集試料は、非トランスフェクト対照試料とは対照的に、切断部位の下流の不均一な塩基の混合を示す。対照試料の黒色下線領域はガイド配列を表し、水平方向の赤色点線下線領域は関連する（プロトスペーサー隣接モチーフ）ＰＡＭ部位である。両方のトレース上の垂直黒色点線は、切断部位を表す。（Ｂ）ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的化するｇＲＮＡのＲＮＰトランスフェクトｉＰＳＣからのゲノムＤＮＡにおける各編集配列（標準された）の寄与率の相対パーセンテージ。インデル＋１：配列番号１９；インデル０：配列番号２０；インデル－１：配列番号２１；インデル－８：配列番号２２；インデル－１１：配列番号２３；インデル－１１：配列番号２４；インデル－２：配列番号２５；インデル－１１：（配列番号２６）；インデル－２：配列番号２７。（Ｃ）ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的化するｇＲＮＡのＲＮＰトランスフェクトｉＰＳＣの全編集集団におけるインデルサイズの分布。アウトオブフレームインデルパーセンテージは、フレームシフトを示すか、または２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。 ＤＧＫ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集は、いくつかのｉＰＳＣ株において成功裏に媒介される。ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的化するｇＲＮＡおよびＤＧＫζ遺伝子の標的配列（配列番号１１）を標的化するｇＲＮＡの形成されたＲＮＰを、異なる細胞型由来の、また２つの独立した会社から提供される異なる方法を使用して送達された２つの異なるｉＰＳＣ株：ｉＰＳＣ株１（Ａ）またはｉＰＳＣ株２（Ｂ）にトランスフェクトして、ＤＧＫαもしくはＤＧＫζ単一のＫＯ（ＤＧＫαＫＯもしくはＤＧＫζＫＯ ｉＰＳＣ）、またはＤＧＫαとＤＧＫζの二重のＫＯ（ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ）を生成した。ｉＰＳＣ株１は、ｉＰＳＣリプログラミング因子のエピソーム送達を使用して単核細胞に由来した。ｉＰＳＣ株２は、臍帯血画分から得られた細胞に由来し、ｉＰＳＣ因子のセンダイウイルス送達を用いてリプログラムされた。ＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子のＫＯ効率を、ＩＣＥを使用して分析した。アウトオブフレームインデルパーセンテージは、フレームシフトを示すか、または２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。 ｇＲＮＡは、単一細胞クローンにおけるＤＧＫ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を成功裏に媒介する。ＤＧＫα遺伝子の標的配列を標的化するｇＲＮＡおよびＤＧＫζ遺伝子の標的配列を標的化するｇＲＮＡ（それぞれ配列番号３および配列番号１１）の形成されたＲＮＰをｉＰＳＣにトランスフェクトし、ＤＧＫαのＫＯ（Ａ）、ＤＧＫζのＫＯ（Ｂ）、およびＤＧＫαζのＫＯ ＤＧＫαのインデル％（Ｃ）およびＤＧＫζのインデル％（Ｄ）の効率を、異なる単一細胞クローンにおいてＩＣＥを用いて分析した。アウトオブフレームのインデルパーセンテージは、フレームシフトを示すか、または２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。９９％～１００％のアウトオブフレームのインデルパーセンテージを有するｉＰＳＣ単一細胞クローンを、単一細胞クローン候補として選択した。クローン名は、遺伝子名とそれに続く数字として示される。 非トランスフェクト（野生型）で、ＤＧＫαζのＫＯ予備選別ｉＰＳＣおよびＤＧＫαζのＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン０１でのＤＧＫ遺伝子中のｇＲＮＡ切断部位のサンガー配列決定トレース。ＲＮＰトランスフェクション後、塩基の混合物を、ＤＧＫ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣゲノム中の切断部位の下流に導入した。選別および単一細胞クローニングの後、１つのチミン（Ｔ）挿入（＋１）を有する単一細胞ｉＰＳＣクローン（ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン０１）を、ＤＧＫα（Ａ）およびＤＧＫζ（Ｂ）遺伝子における切断部位の下流の塩基の混合を除去することによって証明されるＤＧＫ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣから同定した。対照試料の黒色下線領域はガイド配列を表し、水平方向の赤色点線下線領域は関連するＰＡＭ部位である。両方のトレース上の垂直方向の黒色点線は、切断部位を表す。（Ａ）において、以下の配列が示される。非トランスフェクト（野生型）ｉＰＳＣ：配列番号２８；ＤＧＫαおよびＤＧＫζのＲＮＰトランスフェクトバルクｉＰＳＣ：配列番号２９；ＤＧＫαおよびＤＧＫζのＲＮＰ共トランスフェクトｉＰＳＣ単一細胞クローン：配列番号３０。（Ｂ）において、以下の配列が示される。非トランスフェクト（野生型）ｉＰＳＣ：配列番号３１；ＤＧＫαおよびＤＧＫζのＲＮＰトランスフェクトバルクｉＰＳＣ：配列番号３２；ＤＧＫαおよびＤＧＫζＲＮＰの共トランスフェクトｉＰＳＣ単一細胞クローン：配列番号３３。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンにおけるＤＧＫ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集が成功裏に媒介される。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを、図１に記載されるように生成した。続いて、ＤＧＫα遺伝子の標的配列を標的とするｇＲＮＡおよびＤＧＫζ遺伝子の標的配列を標的とするｇＲＮＡ（それぞれ配列番号３および配列番号１１）の形成されたＲＮＰを、３つの異なるＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローン（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンであるＢ１１、Ｃ４およびＤ７）にトランスフェクトして、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫαζのＫＯ ｉＰＳＣを生成した。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫαζのＫＯ事前選別ｉＰＳＣでのＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子のＫＯ効率を、ＩＣＥを使用して個々に分析した。アウトオブフレームのインデルパーセンテージは、フレームシフトを示すか、または２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。ピアソン相関係数によって計算されたＲ２値は、インデルパーセンテージの信頼度を示す。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンの成功裏の生成。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを、図１に記載されるように生成した。続いて、ＤＧＫα遺伝子の標的配列を標的とするｇＲＮＡおよびＤＧＫζ遺伝子の標的配列を標的とするｇＲＮＡ（それぞれ配列番号３および配列番号１１）の形成されたＲＮＰを、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンＢ１１にトランスフェクトし、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン（１～１２）を生成した。ＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子のＫＯ効率を、ＩＣＥを用いて個別に分析した。アウトオブフレームのインデルパーセンテージは、フレームシフトを示すか、または２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。９９％～１００％のアウトオブフレームのインデルパーセンテージを有するクローンを、単一細胞クローン候補として選択した。番号１～１２は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを表し、強調されたものは、成功したＫＯを表す。 ｉＰＳＣにおけるＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζの遺伝子欠失は、ｉＰＳＣ多能性に影響を及ぼさない。これは、（Ａ）コロニー形態（スケールバー＝１ｍｍ）、ならびに（Ｂ）多能性マーカーＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－４の表面発現によって特徴付けられた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を使用して、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫアイソフォームのＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩ、単一遺伝子（ＤＧＫαまたはＤＧＫζ）および二重遺伝子（ＤＧＫαζ）ＫＯを実施した。多能性幹細胞マーカー（ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ－４）をフローサイトメトリーによって分析し、ここで、ヒストグラム（図８Ｂ）は、全ての生細胞上の各多能性マーカーの発現を表す（ＰＩ、デブリおよびダブレットを介した死細胞はゲートアウトした）。非染色の対照は、陽性抗体染色を強調するためにヒストグラムに含まれている。 ＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζの遺伝子欠失ならびにＴＡＧ－７２ ＣＡＲのｉＰＳＣへの挿入は、非トランスフェクト（ＮＴ）対照と比較して、ｉＰＳＣの増殖に影響を及ぼさない。グラフは、ｉＰＳＣの拡大培養の時間経過を表す。（Ａ）各対立遺伝子のＫＯ間の直接比較。（Ｂ）２つの異なるＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンに対して行われたＤＧＫαζのＫＯ；両方とも非トランスフェクトｉＰＳＣ（ＮＴ）株に関する。（Ａ）：青色線（ＮＴ）は非トランスフェクトｉＰＳＣを表し；赤色線（ＤＧＫα）はＤＧＫαのＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン１６を表し；緑色線（ＤＧＫζ）はＤＧＫζのＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン０２を表し；紫色線はＤＧＫαζのＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン２４を表す。（Ｂ）：青色線（ＮＴ）は、非トランスフェクトｉＰＳＣを表し；赤色線ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンＤ７（ＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζのＫＯを含まない）を表し；緑色線ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫαζ ＫＯ（クローンＤ７）は、予め選別されたＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローンＤ７／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣを表す。 ｉＰＳＣからｉＮＫへの分化方法の概略図。ｉＰＳＣを取り出し（ｌｉｆｔ）、第１相において造血／造血系統に分化させた。次いで、ＣＤ３４＋細胞は、第２相においてリンパ系前駆細胞に分化し、第３相においてｉＮＫ細胞に誘導した。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩ及びＤＧＫ遺伝子ＫＯは、ＣＤ３４＋細胞へのｉＰＳＣの分化に影響を与えない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を使用して、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫアイソフォームのＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩ、単一遺伝子（ＤＧＫαもしくはＤＧＫζ）または二重遺伝子（ＤＧＫαζ）ＫＯを実施した。その後、ｉＰＳＣをＣＤ３４＋細胞に分化させ、フローサイトメトリーによって分析した。代表的なフローサイトメトリープロットは、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）におけるＣＤ３４＋細胞の集団頻度を示す。Ａ：ｉＰＳＣ（非トランスフェクト）は、非トランスフェクトｉＰＳＣに由来するＣＤ３４＋細胞を表し；ＤＧＫαＫＯ（クローン１６）は、ＤＧＫαＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン１６に由来するＣＤ３４＋細胞を表し；ＤＧζＫＯ（クローン０７）は、ＤＧＫζＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン０７に由来するＣＤ３４＋細胞を表し；ＤＧＫαζ ＫＯ（クローン２４）は、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン２４に由来するＣＤ３４＋細胞を表す。Ｂ：ｉＰＳＣ（非トランスフェクト）は、この実験における非トランスフェクトｉＰＳＣに由来するＣＤ３４＋細胞を表す；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローン（クローンＤ７）に由来するＣＤ３４＋細胞を表す；ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）／ＤＧＫαζ ＫＯ事前選別は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローンＤ７／ＤＧＫαζ ＫＯ事前選別ｉＰＳＣに由来するＣＤ３４＋細胞を表す。ＣＤ３４の細胞表面発現のヒストグラム表示は、培養中の生細胞上にある。死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。非染色の対照（青色）は、陽性抗体染色を強調するためにヒストグラムに含まれる。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを有するおよび有さないｉＮＫにおけるＤＧＫ遺伝子のＫＯを媒介する。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを、図１に記載されるように生成した。ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的化するｇＲＮＡおよびＤＧＫζ遺伝子の標的配列（配列番号１１）を標的化するｇＲＮＡの形成されたＲＮＰを使用して、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫαζ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣを生成した（Ａ）。同様に、ＤＧＫα遺伝子の標的配列（配列番号３）を標的とするｇＲＮＡおよびＤＧＫζ遺伝子の標的配列（配列番号１１）を標的とするｇＲＮＡの形成されたＲＮＰを使用して、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣを作製し、図１（Ｂ）に記載のようにＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを形成した。次いで、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローンＤ７／ＤＧＫαζ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣおよびＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン２４をｉＮＫ細胞に分化させた。ｉＮＫ細胞におけるＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子のＫＯ効率を、ＩＣＥを使用して分析した。アウトオブフレームインデルパーセンテージは、フレームシフトを示すか、または２１ｂｐ長を超えるインデルの割合である。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩおよびＤＧＫ遺伝子ＫＯは、ｉＰＳＣ当たりに生成されるｉＮＫ細胞の数に影響を与えない。ｉＰＳＣにおけるＤＧＫアイソフォームのＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩ、単一遺伝子（ＤＧＫαもしくはＤＧＫζ）または二重遺伝子（ＤＧＫαζ）ＫＯを、以前に考察されたようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を使用して実施した。次いで、ｉＰＳＣをｉＮＫ細胞に分化させた。非トランスフェクトｉＰＳＣから生成されたｉＮＫ細胞のベースライン収量と比較した、ＣＡＲ構築物を含むＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンおよびＣＡＲ構築物を含まないＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンから分化したｉＮＫ細胞（ＣＤ５６＋細胞）の代表的な収量は、２～５個の試料からの平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。すなわち、遺伝子編集された試料のいずれかにおいて代表的な収率スコアである１は、この試料が、非トランスフェクトｉＰＳＣに由来するものと同じ数のｉＮＫ細胞を生成したことを示し、したがって、遺伝子編集は、ｉＮＫ収率に影響を及ぼさない。ｉＮＫ（非トランスフェクト）は、非トランスフェクトｉＰＳＣに由来するｉＮＫを表し；ｉＮＫ ＤＧＫαＫＯは、ＤＧＫαＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンに由来するｉＮＫを表し；ｉＮＫ ＤＧＫζＫＯは、ＤＧＫζＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンに由来するｉＮＫを表し；ｉＮＫ ＤＧＫαζ ＫＯは、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンに由来するｉＮＫを表し；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲは、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンに由来するｉＮＫを表し；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯは、予備選別されたＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣに由来するｉＮＫを表す。全ての群にわたって一元配置ＡＮＯＶＡ統計を行った。有意差は確認されなかった。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩおよびＤＧＫ遺伝子ＫＯは、ｉＮＫの表現型を変化させない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を使用して、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫアイソフォームのＴＡＧ－７２ ＣＡＲのＫＩ、単一遺伝子（ＤＧＫαもしくはＤＧＫζ）または二重遺伝子（ＤＧＫαζ）のＫＯを実施した。次いで、ｉＰＳＣをｉＮＫ細胞に分化させ、表現型をフローサイトメトリーによって評価した。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）でのＫＯ ｉＰＳＣから分化したｉＮＫの代表的な表現型分析。フロー分析のために、各ヒストグラムが培養中の全ての生細胞を表すように、死細胞、デブリおよびダブレットをゲートアウトした。非染色の対照（青色）は、ＮＫ受容体ＣＤ５６、ＣＤ４５、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ４４および２Ｂ４についての陽性抗体染色を強調するためにヒストグラムに含まれている。ｉＮＫ（非トランスフェクト）は、非トランスフェクトｉＰＳＣに由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＤＧＫαＫＯ（クローン１６）は、ＤＧＫαＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン１６に由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＤＧＫζＫＯ（クローン０７）は、ＤＧＫζＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン０７に由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＤＧＫαζ ＫＯ（クローン２４）は、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン２４に由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンＤ７に由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）／ＤＧＫαζ ＫＯ（予備選別）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローンＤ７／ＤＧＫαζ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣに由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＣ４）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンＣ４に由来するｉＮＫを表す；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＣ４）／ＤＧＫαζ ＫＯ（予備選別）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＣ４）／ＤＧＫαζ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣに由来するｉＮＫを表す。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩおよびＤＧＫ遺伝子のＫＯは、ＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞に対するｉＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、同時に、同じ細胞への反復曝露後の生存／寿命を増強する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を使用して、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫアイソフォームのＴＡＧ－７２ ＣＡＲのＫＩおよび二重遺伝子（ＤＧＫαζ）のＫＯを実施した。次いで、ｉＰＳＣをｉＮＫ細胞に分化させ、リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を使用して決定した。ｉＮＫ細胞の生存／寿命を、反復抗原曝露アッセイにおいて評価した。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫ細胞の細胞傷害機能は、ＤＧＫαζのＫＯありおよびＫＯなしで、７２時間にわたるＯＶＣＡＲ－３細胞の死滅効率として示される（Ａ）。死滅効率は、未処理ＯＶＣＡＲ－３対照に対する、処理後に残存するＯＶＣＡＲ－３細胞の割合として計算した。加えて、ＯＶＣＡＲ－３細胞に予め曝露されたｉＮＫ細胞の細胞毒性機能を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して評価し、２０時間にわたるＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘとして提示した（Ｂ）。Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘを、製造業者の推奨に従って計算した。（Ｃ）ＯＶＣＡＲ－３細胞への７２時間の反復曝露後の培養物中に残存するｉＮＫ細胞の数も示す。ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＣ４）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローン（クローンＣ４）に由来するｉＮＫ細胞を表し；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＣ４）／ＤＧＫαζ ＫＯ（予備選別）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＣ４）／ＤＧＫαζ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣに由来するｉＮＫ細胞を表し；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンＤ７に由来するｉＮＫ細胞を表し；ｉＮＫ ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）／ＤＧＫαζ ＫＯ（予備選別）は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）／ＤＧＫαζ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣに由来するｉＮＫ細胞を表す。 ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞は、非トランスフェクトｉＮＫ対照と比較して改善された殺傷能力を示す。（Ａ）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）リアルタイム細胞モニタリングシステムによって測定された、ＤＧＫαζ ＫＯおよび非トランスフェクトｉＮＫ細胞についての２４時間にわたるＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）読み取り値。エラーバー＝ＳＥＭであり、ＮＧＭ＝ＯＶＣＡＲ－３細胞の標準的な増殖培地。（Ｂ）増殖促進マーカーＫｉ６７の発現は、ＯＶＣＡＲ－３細胞による１２０時間の反復抗原刺激後にＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞上で増加するか、または正常なＮＫ増殖条件下で培養したままにする。１２０時間の反復抗原刺激の終わりにフローサイトメトリーによって決定されたＫｉ６７＋ＣＤ５６＋陽性細胞の割合。エラーバー＝ＳＥＭ。 ｉＮＫ細胞へのＤＧＫαζ ＫＯを含むことで、皮下卵巣がん（ＯＶＣＡＲ－３）腫瘍を有するｎｏｄ－ｓｋｉｄ－ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスの腫瘍サイズの縮小および生存の延長において、非トランスフェクトｉＮＫ細胞（ＤＧＫαζ ＫＯを含まないｉＮＫ細胞）と比較してインビボで機能的利点がもたらされる。ｉＮＫ細胞（ＤＧＫαζのＫＯありおよびＫＯなし）を、１４日間隔で３×１０６細胞を注入した。点線は、各ｉＮＫ注入がいつ行われたかを表す。ｉＮＫ細胞をインビトロでＮＫ増殖培地において回収した後、７日間注入した。インビボ実験の間、サイトカインサポートは同時投与されなかった。（ｎ＝マウス４匹／群）。 ＤＧＫαζ遺伝子欠失は、ｉＮＫにＴＧＦβ免疫抑制に対する耐性を与える。（Ａ）インビトロで卵巣がん細胞（ＯＶＣＡＲ－３）に対して標的化されたＤＧＫαζのＫＯを有するｉＮＫ細胞およびＤＧＫαζのＫＯを有さないｉＮＫ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの添加を有するまたは有さない培養培地におけるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを介して、それらの細胞傷害性機能について評価した。（Ｂ）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）リアルタイム細胞モニタリングシステムによって測定されたＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）読み取り値は、２：１（エフェクター：標的）比で、ＴＧＦβの添加が非トランスフェクトｉＮＫ細胞機能を阻害したが、ＤＧＫαζ ＫＯを含有する細胞においてｉＮＫ機能を抑制しなかったことを実証した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ曲線は、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。（Ｃ）ＤＧＫαζのＫＯを有する、または有さないＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）ｉＮＫ細胞を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを介して１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの添加ありまたはなしの培養培地中で、インビトロで卵巣がん細胞（ＯＶＣＡＲ－３）に対するそれらの細胞傷害機能について評価した。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（登録商標）曲線は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。 ＴＧＦβＲ１／２遺伝子編集は、ｉＰＳＣの多能性および自発的分化の喪失をもたらす。ｉＰＳＣコロニーの形態を、ＲＮＰトランスフェクション後に光学顕微鏡によって調べた。非トランスフェクト（ＮＴ）ｉＰＳＣとは対照的に、ＴＧＦβＲ１およびＴＧＦβＲ２ドミナントネガティブノックアウトｉＰＳＣコロニーは、標的化トランスフェクション後に自発的分化を示した。
ＴＧＦβＲ ＫＯ ｇＲＮＡ
遺伝子編集されたｉＮＫ細胞の表現型および機能のインビトロ特徴付け。（Ａ）インビボ投与前の異なるｉＮＫエフェクター集団のフローサイトメトリー分析。ＣＡＲおよびＮＫ表面受容体発現は、ＣＤ４５＋ ＣＤ５６＋ 二重陽性集団のパーセンテージとして反映される。（Ｂ）ＤＧＫαζ ＫＯ（非クローン由来）を有する濃縮されたＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ株から生成されたｉＮＫ細胞に対して実施されたインデル％によって特徴付けられるＤＧＫαおよびζ遺伝子座のＩＣＥ分析（ｎ＝２）。（Ｃ）ｉＮＫ機能的死滅アッセイ：エフェクターを１：２および１：１のＥ：Ｔ比でＯＶＣＡＲ－３標的細胞に添加し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムを使用して２０時間モニターした。ＮＣＩ＝Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ。 ＴＡＧ－７２ ＣＡＲおよびＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζｉＮＫ細胞のインビボ機能。（Ａ、Ｂ）２つの独立した実験からのルシフェラーゼ標識ＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞を有する免疫無防備状態のＮＳＧマウスの代表的な生物発光画像（ＢＬＩ）。画像は、示されるように、凍結融解されたＮＫ細胞の投与後のいくつかの時点を反映する。（Ｃ）マウスの各群についての－１日目のベースラインＢＬＩ読み取り値（各群についてのＢＬＩ中央値として示される）に対する、経時的なフラックス単位（光子／秒）の倍数変化としてプロットされた腫瘍負荷の定量化。（Ｄ、Ｅ）処置後の各時点での個々のマウスＢＬＩシグナル（ベースラインに対する倍率変化としてプロット）を示すヒストグラム。ｎ＝４～５匹のマウス／群、３回の独立した実験。エラーバーは、各群の平均値±ＳＥＭを表す。 ｉＴ細胞に分化したＴＡＧ－７２ ＣＡＲ＋ＤＧＫαζで遺伝子編集されたｉＰＳＣ。（Ａ）ＴＩＤＥ分析による、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣにおけるＤＧＫαおよびＤＧＫζのインデル効率。（Ｂ）非編集ｉＴ細胞をＴＡＧ－７２ ＣＡＲ＋ＤＧＫαζｉＴ細胞（非クローン由来）と比較する、Ｔ細胞マーカーおよびＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析。（Ｃ）卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ－３（ＴＡＧ－７２を発現する）ＴＡＧ－７２を発現する）に対して標的化されたＴＡＧ－７２ ＣＡＲ＋ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣから分化したｉＴ細胞と比較した、健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分から単離されたＴ細胞の細胞傷害性機能分析。 ＴＧＦβの存在下でのＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＴ／ＤＧＫαζ ＫＯ細胞のインビトロ機能。（Ａ）インビトロでのｉＴ細胞機能に対するＴＧＦβのプレコンディショニングの影響を評価するために実施された方法論の概略図。。（Ｂ～Ｃ）ｉＴ細胞インビトロ細胞傷害性アッセイ：エフェクター±ＴＧＦβ（Ｂ：１０ｎｇ／ｍＬ、Ｃ：１００ｎｇ／ｍＬ）をＯＶＣＡＲ－３標的に１：１のＥ：Ｔ比で添加し、リアルタイム細胞モニタリングシステムｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）を使用して４０時間モニタリングした。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－ｉＴ／ＤＧＫαζ ＫＯ細胞（紫色）の機能を、ｉＴ（非トランスフェクト）対照（灰色）と比較した。標的細胞単独±ＴＧＦβ（青色）を並行して維持およびモニターし、エフェクターの非存在下でのＯＶＣＡＲ－３細胞株の増殖動態を提供した。データをエフェクター細胞の添加時間に対して正規化し、任意単位であるＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘとして提示する。各データ点は、技術的３連の平均値±ＳＤを表す。
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の排除を意味しないことが理解される。
本明細書および特許請求の範囲を通して、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味するものと解釈されるべきであり、文脈が明確に別様に指示しない限り、「２つ以上」を除外するものと解釈されるべきではない。
「核酸構築物」は、本明細書で使用される場合、一般に、人工的にまたは組換えにより構築または作製される核酸分子を指し、核酸ベクターとも互換的に呼ばれる。例えば、核酸構築物は、細胞において転写されることが所望される目的のヌクレオチド配列を含むように作製され得、いくつかの例において、所望の機能のＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を産生し、他の例において、目的のタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）に翻訳されるｍＲＮＡを産生する。核酸構築物中の目的のヌクレオチド配列は、５’調節領域（例えば、異種プロモーターなどのプロモーター）、および／または３’調節領域（例えば、異種３’ＵＴＲなどの３’非翻訳領域（ＵＴＲ））に作動可能に連結され得る。核酸構築物は、環状（例えば、プラスミド）または直鎖状の形態であってもよく、組込み型核酸（すなわち、宿主細胞、例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの染色体に組み込まれ得る）であってもよく、またはエピソーム（例えば、プラスミド）のままであってもよい。
「約」または「およそ」という用語は、所与の値から±１０％の変動として理解されるべきである。
用語「エクスビボ」は、細胞が生きている生体から取り出され、生体外で（例えば、試験管中で）増殖されるプロセスである。
「インビボ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、および／または微生物）内で起こる事象を指す。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
一般的な説明
本明細書では、機能が増強された幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法が開示される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いた幹細胞における１つまたは複数の選択された遺伝子の除去は、免疫細胞に分化する幹細胞の能力を破壊しないことが本明細書において実証されている。これらの改変幹細胞から生成される免疫細胞は、増強された持続性、インビトロでの抗腫瘍活性およびＴＧＦβの免疫抑制効果に対する耐性を含むことも実証されている。従って、幹細胞における１つまたは複数の選択された遺伝子の機能を阻害することによる方法が提供される。さらに、これらの幹細胞を、ＮＫ細胞およびＴ細胞などの免疫細胞に分化させる方法が提供される。また、本明細書に開示されるのは、本方法によって改変幹細胞および生成された免疫細胞、ならびに治療的処置における免疫細胞の使用である。
供給源細胞
「供給源細胞（ｓｏｕｒｃｅ ｃｅｌｌ）」は、本明細書で使用される場合、リプログラミングまたは分化によって「派生細胞（ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ）」に変換される細胞を指す。本明細書に開示される方法における使用に適した供給源細胞の例としては、幹細胞が挙げられる。
「幹細胞」という用語は、その特定の遺伝的構成が与えられれば複数の系統の方向に発達し、次いで新しい生体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）を形成するか、または生体の組織もしくは細胞集団を再生する可能性を示す任意の細胞を指すものとして理解されるべきである。本発明に従って利用される幹細胞は、２つ以上の系統に沿って分化することができる任意の適切なタイプのものであってもよく、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、臍帯幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞、始原細胞、多能性細胞、多分化能細胞、または脱分化体細胞（人工多能性幹細胞など）を含むが、これらに限定されない。「多能性」とは、主題の幹細胞が自己再生および分化して、とりわけ、外胚葉、内胚葉および中胚葉である３つの胚葉のいずれか１つの細胞を形成することができることを意味する。
いくつかの実施形態において、供給源細胞はまた、少なくとも１つのホモ接合性ＨＬＡハプロタイプを発現する。いくつかの態様において、供給源細胞は、主要な移植抗原であり、好ましくは集団のかなりの割合、例えば集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、またはそれ以上によって発現される、少なくとも１つのホモ接合性ＨＬＡハプロタイプを発現する。ホモ接合性ＨＬＡハプロタイプが優性ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ ＨＬＡ型（組織拒絶に関して）に対応する場合、このような細胞の使用は、処置レジメンの状況において本発明の細胞を受容するより広い集団において、組織拒絶に関する問題を有意に減少させる。他の実施形態では、供給源細胞は、２つ以上のＨＬＡ抗原、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上のＨＬＡ抗原に関してホモ接合性であり得る。目的のＨＬＡ抗原は、例えば、ＨＬＡ Ａ１、Ｂ８、Ｃ７、ＤＲ１７、ＤＱ２、またはＨＬＡ Ａ２、Ｂ４４、Ｃ５、ＤＲ４、ＤＱ８、またはＨＬＡ Ａ３、Ｂ７、Ｃ７、ＤＲ１５、ＤＱ６から選択することができる。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、阻害された遺伝子に関してホモ接合性である。
いくつかの態様において、供給源細胞は、遺伝的に改変された供給源細胞から分化した標的細胞における改変遺伝子の機能が阻害されるように、本明細書において特定された１つまたは複数の遺伝子において遺伝的に改変されている。
一部の実施形態では、供給源細胞はまた、ＣＡＲ（すなわち、キメラ抗原受容体）をコードする核酸を含むように遺伝子改変されている。ＣＡＲをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法、例えば、γ－レトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ媒介遺伝子編集（Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１３， ３１（１０）： ９２８－３３； Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ， ５４５： ４２３－４３１； Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ＣＡＲ ｔｏ ｔｈｅ ＴＲＡＣ ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ， ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ， ５４３： １１３－１７）によって、供給源細胞中に導入され得る。
ｉＰＳＣ
ｉＰＳＣは、通常、体細胞から直接生成される。ｉＰＳＣは、原則として、例えば血液および皮膚細胞からの単核細胞を含む任意の有核細胞から誘導され得る。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、完全に分化したＴ細胞から；または前駆体Ｔ細胞（胸腺細胞など）から生成されてもよく、前駆体Ｔ細胞は、それらのＴＣＲの再配列を開始しているか、またはさらに完了しており、目的の抗原特異性を示す。別の実施形態では、ｉＰＳＣは、目的の抗原決定基（例えば、腫瘍抗原決定基）に対するＴＣＲ（例えば、再構成されたＴＣＲ遺伝子）をコードする１つまたは複数の核酸分子でトランスフェクトされる。一実施形態では、ｉＰＳＣは、再構成されたＴＣＲ、好ましくは再構成されたαβＴＣＲを発現する細胞に由来する。別の実施形態では、前記細胞は、再構成されたγδＴＣＲを発現する。本発明のｉＰＳＣの生成における使用に適した細胞の例としては、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、胸腺細胞または他の形態の前駆体Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
成熟または分化した細胞（Ｔ細胞または前駆Ｔ細胞など）からｉＰＳＣを生成するための方法は、当業者に公知である。例えば、ｉＰＳＣは、多能性関連遺伝子または「リプログラミング因子」の特定のセットを体細胞型に導入することによって誘導することができる。一般的に使用されるリプログラミング因子のセット（Ｙａｍａｎａｋａ因子としても知られる）は、遺伝子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４である。この組合せは、ｉＰＳＣを産生するために使用される最も従来的な組合せであり得るが、因子の各々は、関連転写因子、ｍｉＲＮＡ、小分子、またはさらに系統指定因子などの非関連遺伝子によって機能的に置き換えることができる。例えば、レトロウイルス系を使用したＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃのトランスフェクション後のｉＰＳＣの誘導は、レンチウイルス系を使用したＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のトランスフェクションによっても達成されている。転写因子の前者のセットはＹａｍａｎａｋａ因子として知られており、後者は一般にＴｈｏｍｓｏｎ因子として知られている。当業者によって理解されるように、基本的なリプログラミング因子発現ベクターに対する広範囲の改変が行われており、効率を増加させ、さもなければリプログラミングされたｉＰＳＣゲノムに組み込まれ得るベクター配列を最小化または除去するために、新たな送達様式が設計されている。これらの方法は当業者に周知であり、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ媒介導入遺伝子切除を伴う単一カセットリプログラミングベクター、およびアデノウイルスまたはセンダイウイルスなどの非組込みウイルスによるリプログラミングが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、タンパク質としてのリプログラミング因子の発現は、導入されたベクターＤＮＡの生殖系列への組込みを受けていないｉＰＳＣを生成する手段を提供する。非ウイルス性のリプログラミング方法も開発されている。これらには、ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ （Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ （２０１０））， ｍｉＲＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ （２０１１）； ＰｉｇｇｙＢａｃ （Ｋａｊｉ ｅｔ ａｌ （２００９）； Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ （２００９））； Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｎａｒｓｉｎｈ ｅｔ ａｌ （２０１１））およびＥｐｉｓｏｍａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ （Ｃｈｕｏ ｅｔ ａｌ （２０１１））が含まれるが、これらに限定されない。様々な小分子が、リプログラミング効率を増強するための当該技術分野において示されている；例えば、以下の表に列挙されるものを参照されたい。
ｉＰＳＣ リプログラミング効率を増加させる化合物
いくつかの実施形態では、供給源細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、エピソームまたはセンダイウイルス形質転換によって誘導される。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０に対して９８％を超える陽性率を有する。
いくつかの態様において、主題の供給源細胞は、多能性幹細胞と比較して免疫細胞に向かってより分化している細胞である。
一部の実施形態では、幹細胞は、非ウイルス法を使用して遺伝子改変することができる。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、非ウイルス法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集システムを用いて改変することができる。
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、非ウイルス編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてｉＰＳＣに導入することができる。
いくつかの実施形態において、遺伝物質のノックアウト（ＫＯ）は、非ウイルス編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてｉＰＳＣにおいて操作することができる。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣにおけるＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζ遺伝子のいずれかのＫＯは、非ウイルス編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いて達成される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＤＧＫαζ遺伝子の二重ＫＯを含み、その遺伝子操作は、非ウイルス編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ供給源細胞は、ＤＧＫαζ遺伝子の発現を阻害するように遺伝子改変される（ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ）。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ供給源細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され、この際、前記受容体は、抗原決定基に対する抗原認識部分を含み、前記抗原決定基は、腫瘍関連抗原ＴＡＧ－７２（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ）の抗原決定基である。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ供給源細胞は、ＤＧＫαζ遺伝子の発現を阻害し、さらにＴＡＧ－７２ ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ）。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子改変されたｉＰＳＣは、多能性および培養で増殖する能力を維持する。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ供給源細胞は、ＣＤ３４＋細胞に分化することができる。いくつかの態様において、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣの両方は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ供給源細胞は、ＣＤ４５＋ ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞に分化することができる。一部の実施形態では、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣは、正常なＮＫ刺激性受容体を発現する成熟ＮＫ細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ供給源細胞は、前駆Ｔ細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣの両方が、主にＣＤ８＋表現型を有する成熟ＣＤ３＋ Ｔ細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣは両方とも、ＴＣＲαβまたはＴＣＲγδのいずれかを発現する成熟ＣＤ３＋ Ｔ細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、非ウイルス編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてｉＰＳＣに導入される。いくつかの実施形態では、得られた遺伝子編集されたｉＰＳＣは、ＣＤ３４＋細胞および／またはＴ前駆細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞は、ＮＫ細胞（ｉＮＫ細胞）に分化することができる。いくつかの実施形態において、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞および／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞はいずれも、分化過程の効率に有意な影響を及ぼすことなく、ＮＫ細胞に分化することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣにおける単一ＤＧＫα／ＤＧＫζまたは二重ＤＧＫαζ ＫＯのいずれも、分化後の前記ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞および／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の正常な表現型に影響を及ぼさない。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣにおける単一ＤＧＫα／ＤＧＫζまたは二重ＤＧＫαζ ＫＯのいずれも、分化後の前記ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞および／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞の正常表現型に影響を及ぼさない。
中胚葉細胞
３種類の主要な細胞集団（一次胚葉）が胚発生中に出現する：中胚葉、外胚葉および内胚葉。これらの細胞集団は、原腸形成として知られるプロセスを介して形成され、このプロセスに続いて、各一次胚細胞層は、細胞集団および組織の特定のセットを生成する。例えば、中内胚葉または中胚葉集団は、心臓、血管および血液細胞（例えば、免疫細胞）を生じる。
免疫細胞を形成するために、中胚葉細胞は複数の分化段階に誘導され、各々が、造血内皮（ＨＥ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞および免疫細胞に大きく分類することができる異なる潜在能力／表現型を有する細胞の亜集団によって表される。各分化段階は、例えば、異なる細胞型になるその潜在能力を制限するその遺伝子発現を変化させることによって、細胞をその最終細胞型に近づける。
いくつかの実施形態において、主題の供給源細胞は、免疫細胞に分化することができる中胚葉細胞である。
造血系細胞
「造血系細胞」という用語は、中胚葉細胞（多能性細胞から得ることができる）から分化した任意の細胞として理解されるべきであり、例えば、ＨＥ、プレＨＳＣおよびＨＳＣならびに前駆細胞（例えば、多能性前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞などのリンパ系前駆細胞、初期胸腺前駆細胞、プレＴ細胞前駆細胞、プレＮＫ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、および骨髄系共通前駆細胞などの骨髄系前駆細胞）を含む。用語「ＨＥ／ＨＳＣ」は、本明細書において、造血系細胞のサブクラスを指すために使用される。ＨＥ／ＨＳＣは、骨髄性（例えば、マクロファージおよび単球）およびリンパ系細胞型（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋幹細胞であり、ＨＥ、プレＨＳＣおよびＨＳＣを含む。ｉＣＤ３４＋細胞は、ｉＰＳＣから分化したＣＤ３４＋発現細胞を表す。
胚形成時に、多能性中胚葉細胞は内皮細胞系に分化する。ＨＥは、造血能を獲得し、内皮から造血への移行と呼ばれるプロセスにおいて多系列の造血幹細胞および前駆細胞を生じる、この系列のサブセットである。内皮細胞の造血性の特定化および造血性内皮からのＨＳＣの生成を導くプロセスは、依然として議論中である。
ＨＳＣは、理論的には造血プロセスを介してリンパ系および骨髄系の任意の血液細胞になる能力を有する血液幹細胞である。ＨＳＣは、成人骨髄、末梢血、および臍帯血中に見出すことができる。ＨＳＣは、確立された技術によって骨髄、末梢血、および臍帯血から収集することができ、一般にＣＤ３４＋発現に関連する。
いくつかの実施形態において、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋ ＣＤ３８－ ＣＤ９０＋ ＣＤ４５ＲＡ－であると定義することができる。いくつかの態様において、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋ ＣＤ４３＋ ＣＤ４５＋として定義することができる。いくつかの実施形態において、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋ ＣＤ１３３＋として定義することができる。
ＨＳＣが多能性幹細胞に由来する場合、それはしばしばｉＨＳＣ（誘導造血幹細胞）と呼ばれる。
「プレＨＳＣ」は、ＨＥ細胞から分化したが、典型的なＨＳＣマーカーを発現しない細胞として理解されるべきであり、例えば、ＣＤ３４を発現するＣＤ４５－細胞である。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（ｉＰＳＣなど）から培養された細胞であって、培養物中で免疫細胞へといくらか分化しているが、免疫細胞へと完全に分化していない細胞が、供給源細胞として使用される。
一部の実施形態では、免疫細胞に分化することができる造血系細胞が、供給源細胞として使用される。一部の実施形態では、造血系細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）にまだ分化しておらず、例えば、造血性内皮（ＨＥ）またはプレＨＳＣである。一部の実施形態では、この造血系細胞はＨＳＣである。
いくつかの実施形態において、主題の供給源細胞は、骨髄系前駆細胞、例えば、骨髄系共通前駆細胞である。
いくつかの実施形態において、主題の供給源細胞は、リンパ球前駆体細胞であり、例えば、多能性前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、初期胸腺前駆細胞、プレＴ細胞前駆細胞、プレＮＫ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ前駆細胞である（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｏｖｅｒｎｓ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１４， Ｖｏｌ．５１０（７５０４）， ｐ．２６８）。いくつかの実施形態において、主題の供給源細胞は、胸腺細胞などの未成熟Ｔ細胞、または未成熟ＮＫ細胞である。
派生細胞
本明細書に開示される方法によって生成される幹細胞由来免疫細胞は、免疫細胞に分化することができる造血系細胞、および免疫細胞を含む。幹細胞由来免疫細胞の例は、ＨＥ、プレＨＳＣ、ＨＳＣ、多能性前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞などのリンパ系前駆細胞、初期胸腺前駆細胞、プレＴ細胞前駆細胞、プレＮＫ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞などの骨髄系前駆細胞、および免疫細胞である。
「免疫細胞」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物免疫系の細胞、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）、好中球、および単球（マクロファージおよび樹状細胞を含む）、ならびに哺乳動物免疫系の細胞に由来する細胞株を含むと理解されるべきである。
本開示は、分化して生産された幹細胞由来の免疫細胞であって、機能が向上した免疫細胞を提供する。「増強された機能」とは、本明細書に開示される改変または操作の結果として提供される免疫細胞が、対照免疫細胞（すなわち、改変または操作を伴わない免疫細胞）と比較して、増強された活性（例えば、細胞傷害性）、増殖、生存、持続、免疫抑制効果（例えば、ＴＧＦβ阻害）に対する耐性および／または浸潤を示すことを意味する。免疫細胞の細胞傷害性とは、一般的に受容体に基づく機構を介して標的細胞を死滅させる免疫細胞の能力を指す。
一部の実施形態では、本方法による幹細胞由来免疫細胞は、幹細胞または他のより分化した細胞（幹細胞から培養および分化した細胞など）から分化させることができる。
一部の実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。一部の実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、マクロファージまたはマクロファージ系統細胞（例えば、単球、樹状細胞）である。
Ｔ細胞
「Ｔ細胞」への言及は、Ｔ細胞受容体を含む任意の細胞への言及として理解されるべきである。これに関して、Ｔ細胞受容体は、α、β、γまたはδ鎖のいずれか１つまたは複数種を含んでもよい。当業者によって理解されるように、ＮＫＴ細胞はまた、Ｔ細胞受容体を発現し、したがって、標的抗原特異的ＮＫＴ細胞もまた、本発明に従って生成することができる（Ｔ細胞の定義に含まれると理解される）。本発明は、Ｔ細胞の任意の特定のサブクラスに限定されることを意図しないが、一実施形態では、主題のＴ細胞はα／βＴＣＲ二量体を発現する。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋ キラーＴ細胞、またはＮＫＴ細胞である。本発明をいずれか１つの理論または作用機序に限定するものではないが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、細胞傷害性細胞としても知られている。適応免疫系の主要部分として、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、主に感染細胞を標的とし、破壊するために細胞内環境を走査する。細胞内内容物に由来する小さなペプチド断片は、プロセシングされ、細胞表面に輸送され、そこでＭＨＣクラスＩ分子との関連で提示される。しかし、ウイルス感染に応答するだけでなく、ＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、癌を含む損傷細胞または異常細胞をモニタリングおよび除去することによって、さらなるレベルの免疫監視を提供する。ＭＨＣ Ｉ提示ペプチドのＣＤ８＋ Ｔ細胞認識は、通常、細胞傷害性顆粒もしくはリンホカインの放出、または対象細胞を破壊するためのＦＡＳ／ＦＡＳＬ相互作用を介したアポトーシス経路の活性化のいずれかをもたらす。一方、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、一般に、ＭＨＣクラスＩＩとの関連で抗原提示細胞によって提示されるペプチドを認識し、Ｂ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を調節するように設計されたサイトカインの放出をもたらす。細胞傷害活性を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞もまた、種々の免疫応答において観察されている。さらに、ＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビトロでＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の細胞傷害性を示し、より長い抗腫瘍活性についてインビボでＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも性能が優れている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＤ４＋ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ２０１８， ３（１０）：ｅ９９０４８； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＴＣＲ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ＣＤ８ ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１７ Ｎｏｖ， ２２； ９（４１７）， ｅａａｇ１２０９を参照）。
一部の実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、細胞傷害性免疫細胞、例えば、細胞傷害性リンパ球である。
一部の実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、リンパ系細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ系細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋ キラーＴ細胞、またはＮＫＴ細胞である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される幹細胞由来Ｔ細胞は、インビトロで抗腫瘍活性を示す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来のＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ Ｔ細胞は、インビトロで卵巣がん細胞株に対するオンターゲット活性を示す。一部の実施形態では、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ Ｔ細胞は、非トランスフェクトｉＰＳＣ由来Ｔ細胞およびＰＢＭＣから単離された非トランスフェクトＴ細胞と比較して、ヒト卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ－３）の増強された死滅を示す。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞は、腫瘍の免疫抑制性微小環境において機能を保持する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来ＤＧＫαζ ＫＯ Ｔ細胞は、例えば、ＴＧＦβの存在下でＯＶＣＡＲ－３細胞に対するインビトロ細胞傷害機能を保持するそのような細胞によって実証されるように、腫瘍の抑制効果に対する感受性が低下している。すなわち、腫瘍微小環境における免疫抑制の重要なメディエーターの１つである。
ＮＫ細胞 ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴまたはＴ／ＮＫ細胞とも呼ばれる）は、セミインバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲαβ）および典型的にはナチュラルキラー細胞に関連する表面抗原を発現するＴ細胞の特殊化された集団である。ＮＫＴ細胞上のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を一般に認識するという点で独特である。ほとんどのＮＫＴ細胞は、インバリアントＴＣＲα鎖と、少数のＴＣＲβ鎖のうちの１つを発現する。Ｉ型ＮＫＴ細胞上に存在するＴＣＲは、一般に、抗原α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）を認識する。この群内で、ＣＤ４＋ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４－ＣＤ８－細胞を含む識別可能な亜集団が同定されている。ＩＩ型ＮＫＴ細胞（または非インバリアントＮＫＴ細胞）は、より広い範囲のＴＣＲα鎖を発現し、α－ＧａｌＣｅｒ抗原を認識しない。ＮＫＴ細胞は、複数の、しばしば反対の効果を有するサイトカインを産生し、例えば、炎症を促進するか、または寛容を含む免疫抑制を誘導する。結果として、それらは、抗菌および抗ウイルス免疫応答に寄与し、腫瘍関連免疫監視を促進し、自己免疫疾患の発症を阻害または促進することができる。ナチュラルキラー細胞と同様に、ＮＫＴ細胞もまた、パーフォリン－、Ｆａｓ－、およびＴＮＦ－関連細胞傷害性を誘導することができる。したがって、Ｔ細胞への言及は、ＮＫＴ細胞への言及を含むと理解されるべきである。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の一部を形成する細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に対して迅速な応答を提供し、感染後約３日で作用し、腫瘍形成にも応答する。典型的には、Ｔ細胞などの免疫細胞は、感染または形質転換細胞表面上に提示された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を検出し、サイトカイン放出を誘発し、標的細胞の溶解またはアポトーシスをもたらす。しかしながら、ＮＫ細胞は、抗体またはＭＨＣの非存在下でストレスを受けた細胞を認識する能力を有し、はるかに速い免疫反応を可能にする。ＭＨＣ Ｉマーカーが欠損しているか、または正常レベルよりも低い有害細胞は、Ｔ細胞などの他の免疫細胞によって検出および破壊され得ないので、この役割は特に重要である。ＮＫＴ細胞とは対照的に、ＮＫ細胞は、ＴＣＲまたはＣＤ３を発現しないが、通常、表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＣＤ５６を発現する。一部の実施形態では、幹細胞由来免疫細胞は、ＮＫ細胞である。
いくつかの実施態様において、増強された機能を有する幹細胞由来ＮＫ細胞が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞は、それらのそれぞれの非トランスフェクトｉＰＳＣ由来ＮＫ対照細胞と比較して、インビトロでの標的がん細胞との長期共培養において、増強された機能性および生存期間を示す。ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の生存および細胞傷害性抗腫瘍機能の増強に対するＤＧＫαζ ＫＯの重要性は、本明細書において確立されている。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞は、（未編集ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞および健常成人ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分から単離されたＮＫ細胞と比較して）インビトロで腫瘍細胞の増強された死滅を示す。
いくつかの実施態様において、改善された増殖能を有する幹細胞由来ＮＫ細胞が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、非トランスフェクトｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞と比較して改善された増殖能力を示すｉＰＳＣ由来ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、腫瘍の免疫抑制性微小環境において機能を保持する。いくつかの実施形態では、腫瘍の抑制効果に対する感受性が低下したｉＰＳＣ由来ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞が本明細書に開示され、これは、例えば、腫瘍微小環境における免疫抑制の重要なメディエーターの１つであるＴＧＦβの存在下でインビトロ細胞傷害機能を保持するそのような細胞によって実証されるＤＧＫαζ ＫＯとおりである。
いくつかの追加の実施形態では、腫瘍の免疫抑制性微小環境において機能を保持するｉＰＳＣ由来ＴＡＧ－７２／ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来ＴＡＧ－７２／ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞は、免疫抑制微小環境を表す条件下で、腫瘍細胞、例えばＯＶＣＡＲ－３細胞株の死滅を誘導することができる。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳＣ由来ＴＡＧ－７２／ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞は、ＴＧＦβの存在下でインビトロ細胞傷害機能を保持する。
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される幹細胞由来ＮＫ細胞は、インビボで抗腫瘍活性を示す。本明細書では、ｉＰＳＣ由来ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞による担癌マウスの処置が、未編集（非トランスフェクト）ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞による処置と比較して、サイトカイン同時投与ありまたはなしで、腫瘍サイズの低減および生存の改善をもたらしたことが開示される。
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される幹細胞由来ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞は、インビボで長期抗腫瘍活性を示す。本明細書において、ｉＰＳＣ由来ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ＮＫ細胞による担癌マウスの処置は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞、未編集（非トランスフェクト）ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のいずれかと比較して、より低い平均腫瘍負荷および優れた長期有効性をもたらすことが示される。
阻害される遺伝子
本開示によれば、増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞は、本明細書において同定される１つまたは複数の遺伝子の機能を阻害するように供給源細胞を改変し、前記改変された供給源細胞を幹細胞由来免疫細胞に分化させることによって生成することができる。
本明細書で使用される「遺伝子の機能の阻害」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または活性が最終的に低減または排除されることを意味する。したがって、遺伝子の機能が、遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に対する操作もしくは修飾（例えば、遺伝子の破壊をもたらす）の結果として、ｍＲＮＡを阻害する（例えば、転写または翻訳を阻害することによって、ｍＲＮＡのレベルまたは機能を低下させる）結果として、またはタンパク質を阻害する（例えば、タンパク質のレベルまたは活性を低下させることによって）結果として、阻害され得る。いくつかの実施形態において、その阻害の程度は、改変細胞における遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または活性が、未改変細胞におけるタンパク質のレベルおよび／または活性と比較される場合、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上である。
本開示によれば、その機能が阻害される遺伝子は、ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群から選択される。
ＤＧＫαおよびＤＧＫζ
ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をホスファチジン酸（ＰＡ）にリン酸化する酵素である。複数のアイソフォームが存在し、そのうちの２つ、ＤＧＫαおよびＤＧＫζは、免疫細胞への強力な機能的リンクを有する。Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方において、ＤＡＧは、活性化および機能の主要なメッセンジャーの１つであり、ＤＧＫαおよびＤＧＫζは、ＤＡＧ依存性活性化を低減することができる免疫「チェックポイント」の新規クラスとして作用する（Ｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ Ｋｉｎａｓｅｓ （ＤＧＫｓ）： Ｎｏｖｅｌ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１６， Ｖｏｌ．４， ｐｐ．１０８； Ｎｏｅｓｓｎｅｒ， ＤＧＫ－ａｌｐｈａ： Ａ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１７， Ｖｏｌ．５， ｐｐ．１６）。ＤＡＧは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびＲａｓ活性化タンパク質（ＲａｓＧＲＰ１）などのＣＤ３シグナル伝達に関与する必須タンパク質と相互作用する。したがって、ＤＧＫの活性化は、細胞外シグナル関連キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）を含むＴＣＲ遠位分子の下方制御をもたらすと考えられている。ＤＧＫαおよびＤＧＫζは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞において優勢に発現され、それらの機能は、それらの発現および活性化が異なる様式で調節されるので、完全に重複しているようには見えない。
本開示によれば、ＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子のうちの少なくとも１つの機能が阻害されている幹細胞は、依然として分化することができ、改変幹細胞から分化した幹細胞由来免疫細胞は、増強された機能を含む。
遺伝子機能の阻害
遺伝子の機能の阻害は、種々のアプローチによって、例えば、遺伝子編集、例えば、ＲＮＡ干渉もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを介した翻訳の阻害を通じて、またはタンパク質産物に直接拮抗する小分子もしくは抗体などの化合物の使用を通じて達成することができる。
遺伝子編集による阻害
いくつかの実施形態において、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子のゲノム配列を改変する遺伝子編集システムの使用によって達成される。
遺伝子編集システムは、典型的には、ヌクレアーゼとカップリングされたＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸を含む。ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸は、遺伝子の標的領域に特異的に結合またはハイブリダイズし、そのヌクレアーゼは、遺伝子の標的化領域において１つまたは複数の二本鎖切断および／または１つまたは複数の一本鎖切断を行う。標的化領域は、遺伝子のコード領域であってもよく、例えば、エクソン、コード領域のＮ末端部分付近（例えば、第１または第２のエクソン内）であってもよい。二本鎖または一本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などによる細胞修復プロセスを介して修復を受け得る。いくつかの例では、修復プロセスは、挿入、欠失、ミスセンス変異、またはフレームシフト変異（例えば、二対立遺伝子フレームシフト変異を含む）を導入し、遺伝子の破壊および遺伝子の機能の阻害を導く。
遺伝子編集系の例としては、ＤＮＡ結合タンパク質と、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのヌクレアーゼ、またはクラスター化して規則的に散在した短いパリンドローム核酸（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとを含む融合体が挙げられる。しかしながら、本発明は、これらのタイプの遺伝子編集システムに限定されるべきではない。むしろ、当該分野で公知であるかまたは同定される任意の型のインヒビターが、遺伝子の機能を阻害するために使用され得る。
ＺＦＰおよびＴＡＬＥＮ
いくつかの態様において、遺伝子の機能の阻害は、エンドヌクレアーゼに融合された１つまたは複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質を含む遺伝子編集システムを利用することによって達成される。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。
ＺＦＰおよびＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインは、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するように「遺伝子操作」され得る。例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の１つまたは複数のアミノ酸は、所定のＤＮＡ配列への結合を指向するように改変され得る。合理的設計の基準は、例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、米国特許第６，４５３，２４２号、米国特許第６，５３４，２６１号、ＷＯ９８／５３０５８号、ＷＯ９８／５３０５９号、ＷＯ９８／５３０６０号、ＷＯ０２／０１６５３６号、ＷＯ０３／０１６４９６号、および米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３ Ａ１号に記載されている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＺＦＰの１つもしくは複数のジンクフィンガードメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、１つまたは複数の「ジンクフィンガー」（その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸の領域）を介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。天然に存在するＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の特定の位置でアミノ酸置換することによって変更され得る。加えて、多くの操作された遺伝子特異的ジンクフィンガーが市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と提携したＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって開発された、ジンクフィンガー構築のためのＣｏｍｐｏＺｒプラットフォームを参照されたい）。したがって、いくつかの態様において、ＺＦＰは、本明細書において阻害されると同定された遺伝子内の標的配列に結合するように操作される。典型的な標的配列としては、エクソン、コード配列のＮ末端領域付近の領域（例えば、第１エクソン、第２エクソン）、および５’調節領域（プロモーターまたはエンハンサー領域）が挙げられる。ＺＦＰは、エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡ切断ドメインに融合されて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成する。ＤＮＡ切断ドメインの例としては、ＩＩＳ型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＺＦＮは、ＺＦＮをコードする核酸配列を含む核酸構築物（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡまたはウイルスベクター）のトランスフェクションを介して細胞（例えば、幹細胞）に導入される。次いで、ＺＦＮは、構築物から細胞において発現され、標的遺伝子の編集および破壊をもたらす。いくつかの実施形態において、ＺＦＮは、そのタンパク質形態で細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などにおいて、天然に存在するかまたは遺伝子操作された転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ ２０１１０３０１０７３Ａ１号を参照されたい。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復を含むポリペプチドであり、各反復は、３３～３５アミノ酸長であり、１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。ＴＡＬ反復の１２位および１３位のＨＤ配列はシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧはＴに結合し、ＮＩはＡに結合し、ＮＮはＧまたはＡに結合することが決定されている。ＵＳ ２０１１０３０１０７３ Ａ１号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥは、本明細書において阻害されると同定された遺伝子内の目的の標的ＤＮＡ配列に対する特異性を有するＴＡＬ反復のアレイを有するように設計することができる。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイはまた、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を通じて市販されている。いくつかの態様において、ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインをエンドヌクレアーゼに融合させてＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を形成し、これが、阻害されるべき本明細書において同定された遺伝子内の核酸標的配列を切断する。
いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮをコードする核酸配列を含む核酸構築物（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡまたはウイルスベクター）のトランスフェクションを介して細胞（例えば、幹細胞）に導入される。次いで、ＴＡＬＥＮは、構築物から細胞内で発現され、標的遺伝子の編集および破壊をもたらす。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、そのタンパク質形態で細胞に導入される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
いくつかの実施形態において、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲ（「Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ」の略）／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ」の略）系を利用することによって達成される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは当技術分野で周知であり、試薬およびプロトコルは容易に利用可能である（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｆｅｂ １５， ２０１３， Ｖｏｌ．３３９（６１２１）， ｐ．８２３（４）； Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｅｌｌ， ０５ Ｊｕｎｅ ２０１４， Ｖｏｌ．１５７（６）， ｐｐ．１２６２－１２７８； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１３， Ｖｏｌ．３１（３）， ｐ．２３３； Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９， Ｖｏｌ．５７６（７７８５）， ｐｐ．１４９－１５７； Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ， ２０１６， Ｎａｔｕｒｅ ５３３： ４２０－４２４； Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１７， Ｖｏｌ．５５１（７６８１）， ｐ．４６４）。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集プロトコルは、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｄｏｕｄｎａ， ａｎｄ Ｐｒａｓｈａｎｔ Ｍａｌｉ， ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２０１６ （ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ： ９７８－１－６２１８２１－３０－４）およびＲａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２０１３， Ｖｏｌ．８（１１）， ｐ．２２８１に記載されている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、一般に、２つの成分を含む：（１）本明細書においてＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼまたはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９、Ｃａｓ１２または他の代替ヌクレアーゼとも呼ばれるＲＮＡ依存性ＤＮＡヌクレアーゼ；ならびに（２）ｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」）を含む二重ＲＮＡまたは一本鎖全長ガイドＲＮＡのいずれかを含み、ヌクレアーゼをゲノム中の標的部位に指向させる標的化配列を含む、非コード短「ガイドＲＮＡ」。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ヌクレアーゼを標的部位に向け、ここで、ヌクレアーゼは、標的部位でＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。次いで、得られたＤＳＢは、２つの一般的な修復経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路および相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のうちの１つによって修復される。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢを迅速に修復することができる最も活性な修復機構であるが、ＤＳＢ部位における小さなヌクレオチド挿入または欠失（インデル）を頻繁にもたらし、非機能的遺伝子産物の産生をもたらすフレームシフト突然変異をもたらす。ＨＤＲ経路は効率が低いが、忠実度が高い。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに切断領域に相同なＤＮＡ鋳型が提供される場合、二本鎖切断は、ＨＤＲを介して相同なＤＮＡ鋳型を使用して修復される。ＨＤＲ経路は、ＲＮＰと共に細胞への大きな遺伝子挿入物の挿入を可能にする。
目的の遺伝子中の標的部位を標的化する配列を含むｇＲＮＡ配列の設計または選択は、当技術分野において記載されている。標的部位は、調節領域（プロモーターおよびエンハンサーなど）の配列、およびコード領域内の配列（エクソン、例えば、５’末端付近のエクソン、またはタンパク質の特定のドメインもしくは領域をコードするエクソンなど）を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的部位は、典型的にはＮＧＧまたはＮＡＧなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’側のその位置に基づいて選択される。
ガイド配列は、標的配列（標的部位の塩基配列）と相補性を有する標的化配列を含むように設計される。ガイド配列と標的配列との間のハイブリダイゼーションを引き起こし、標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの標的化配列と標的配列との間の相補性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上（例えば、１００％または完全に相補的）である。
いくつかの実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、または２０ヌクレオチド長以下である。いくつかの実施形態において、ガイド配列の標的化配列部分は、約２０ヌクレオチド長である。標的相補性のより短い領域（２０ヌクレオチド未満）を有する切断型ｇＲＮＡは、改善された標的特異性で有効であると記載されている（例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１４， Ｖｏｌ．３２（３）， ｐ．２７９を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの標的化配列は、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの標的化配列は、標的部位におけるヌクレオチド配列に完全に相補的である。ガイドＲＮＡの標的化配列が標的部位のヌクレオチド配列に完全に相補的でない一部の実施形態では、ゲノム中のＰＡＭ配列に近い標的化配列の部分（シード領域とも呼ばれる）は、標的部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である。言い換えれば、ガイド配列の５’側のヌクレオチド（すなわち、非シード領域）におけるいくらかの変動が許容される。例えば、ガイド配列は、少なくとも１７ヌクレオチド長（例えば、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長）の標的化部分を含むように設計することができる。
特定の遺伝子における標的配列の例を表１に提供する。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、１７～２０ヌクレオチドの標的化配列を含み、シード領域（標的化配列の３’部分）中の少なくとも１７ヌクレオチドは、標的配列中の少なくとも１７ヌクレオチド、例えば、標的配列の３’末端からの１７ヌクレオチドに完全に相補的である。
ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のためのｇＲＮＡデータベースは、公的に利用可能であり、これは、ヒトゲノムまたはマウスゲノムにおける遺伝子の構成的エクソンにおける例示的なｓｇＲＮＡ標的配列を提供する（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔおよびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるｇＲＮＡデータベースを参照されたい；Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，Ｖｏｌ．１１（８），ｐ．７８３も参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子への最小限のオフターゲット結合を有する配列であるか、またはそれを含む。
本明細書での使用に好適なＣａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの例としては、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｃｅｌｌ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）， ２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５， Ｖｏｌ．１６３（３）， ｐｐ．７５９－７７１）、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、もしくはＣｓｆ４、またはその機能的誘導体（すなわち、天然に存在する形態のＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ活性を実質的に保持する、天然に存在するＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの変異体形態又は誘導体、例えばその断片）が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１８０２４５０９１ Ａ１号およびＵＳ２０１９０２４７５１７ Ａ１号を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｑ９９ＺＷ２で提供されるアミノ酸配列を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９後に同定された多くのＣａｓタンパク質は、望ましい特徴を提供する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２は互い違いの切断を行い、エピゲノム（遺伝子をオンまたはオフにすることができる化学化合物）を編集することができる。Ｃａｓ１３は、ＤＮＡの代わりにＲＮＡを標的とすることによって遺伝子発現に影響を及ぼす。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸはＣａｓ９よりも小さく、遺伝子を編集するだけでなく、遺伝子発現を制御するために使用することができる。ＣａｓＹは、Ｃａｓ９のように作用するが、完全に異なるタンパク質構造からなり、異なる条件で機能することを可能にする。
いくつかの実施形態では、遺伝子の機能の阻害は、ＣＲＩＳＰＲ－媒介遺伝子編集によって達成され、ＣＲＩＳＰＲ－媒介遺伝子編集は、細胞（例えば、多能性幹細胞、またはｉＰＳＣ、またはＨＥ、またはＨＳＣ、または前駆細胞）に、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第１の核酸と、本明細書で阻害されると同定された遺伝子中の標的配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第２の核酸とを導入することを含む。２つの核酸は、細胞におけるＣａｓタンパク質およびｇＲＮＡの発現を達成するために、１つの核酸構築物（またはベクター）中に含まれ得るか、または異なる構築物（またはベクター）上に提供され得る。細胞におけるＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの発現は、標的配列でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導き、これがＤＮＡ切断をもたらす。
いくつかの実施形態において、遺伝子の機能の阻害は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとの組み合わせまたは複合体を細胞に導入することを含む、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集によって達成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡの組み合わせまたは複合体は、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または圧搾、リポソーム、ナノ粒子、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡプラスミド移入、タンパク質形質導入ドメイン媒介形質導入またはウイルス媒介（レトロウイルスおよびレンチウイルスなどの組込み型ウイルスベクター、ならびにアデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、ワクシニアなどの非組込み型ウイルスベクターを含む）を介して細胞に送達され得る。
使用される特定の遺伝子編集方法にかかわらず、遺伝子配列が改変されており、遺伝子機能が阻害されていることを確認するために、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲを含むＰＣＲ、もしくは核酸配列決定を介してＤＮＡもしくはｍＲＮＡを調べることによるか、または例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）を介して特定のタンパク質もしくはペプチドの存在もしくは活性を検出することによることを含む、種々のアッセイが実施され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子の少なくとも１つの機能は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を介してこれらの遺伝子の少なくとも１つの初期エクソンにインデル（複数可）を導入することによって阻害され、これは、編集された遺伝子から機能タンパク質が翻訳されないように、これらの遺伝子の少なくとも１つにおいてフレームシフト変異（複数可）をもたらす。いくつかの実施形態では、２つの遺伝子の機能は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して２つの遺伝子の初期エクソンにインデルを導入することによって阻害され、編集された遺伝子から機能タンパク質が翻訳されないように、２つの遺伝子においてフレームシフト突然変異をもたらす。いくつかの実施形態では、２つの遺伝子のうちの１つの阻害は、別の遺伝子の阻害と組み合わせて行われる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ニッカーゼ（すなわち、ＣＡＳ９ニッカーゼ）およびハイフィデリティー（Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）酵素を使用することによって、二本鎖切断またはドナーＤＮＡなしで使用することもできる。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ， Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９， Ｖｏｌ．５７６（７７８５）， ｐｐ．１４９－１５７； Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１６， ５３３： ４２０-４２４； Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１７， Ｖｏｌ．５５１（７６８１）， ｐ．４６４を参照のこと。
ｍＲＮＡのレベルまたは機能の低減または排除による阻害
いくつかの実施形態において、遺伝子の機能の阻害は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルまたは機能を低減または排除すること、すなわち、ｍＲＮＡの阻害によって達成される。遺伝子編集システムによる阻害とは異なり、ｍＲＮＡの阻害は一過性である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの阻害は、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）もしくはその前駆体、または細胞内で転写されてアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはその前駆体を産生することができる核酸構築物の使用によって達成することができる。
アンチセンス－ アンチセンス技術は周知の方法である。アンチセンスＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡの全長または一部に相補的であり、内因性ｍＲＮＡと二本鎖を形成することによって内因性ｍＲＮＡからの翻訳を遮断するＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡは、合成的に作製され得、目的の細胞（例えば、幹細胞）に導入され得るか、または目的の遺伝子の発現の阻害を達成するために、外因的に導入された核酸構築物からの転写を介して目的の細胞において作製され得る。アンチセンスＲＮＡは、目的の遺伝子由来の全長ｍＲＮＡに相補的である必要はない。しかしながら、アンチセンスＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと二本鎖を形成し、標的ｍＲＮＡに基づく翻訳を遮断するのに十分な長さであるべきである。典型的には、アンチセンスＲＮＡは、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。いくつかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡは、５００、４００、３００、２００、１００、７５または５０ヌクレオチド長以下である。
リボザイム－ リボザイム（すなわち、触媒性ＲＮＡ）は、標的ＲＮＡと特異的に対合し、特定の位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活性化するように設計することができる。例えば、米国特許第６，４２３，８８５号、米国特許第５，２５４，６７８号、およびＰｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｊｕｎｅ ２０， １９９５， Ｖｏｌ．９２（１３）， ｐｐ．６１７５－６１７９を参照されたい。リボザイムは、合成的に作製され得、そして目的の細胞（例えば、幹細胞）に導入され得るか、または外因的に導入された核酸構築物からの転写を介して目的の細胞において作製され得る。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）－ ＲＮＡｉによる遺伝子発現または翻訳の阻害は、当技術分野において公知であり、ｓｉＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ」）、ｓｈＲＮＡ（「短ヘアピンＲＮＡ」）、およびｍｉＲＮＡ（「マイクロＲＮＡ」）などのＲＮＡ分子を利用して達成することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路に関与し、特定の遺伝子の発現に干渉することが知られている。ｓｉＲＮＡは、小型（典型的には２０～２５ヌクレオチド長）の二本鎖ＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡ（すなわち、目的の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）または標的ｍＲＮＡの一部と相同または相補的な配列を含むように設計することができる。ｓｈＲＮＡはリボヌクレアーゼであるＤＩＣＥＲによって切断されてｓｉＲＮＡを産生する。標的遺伝子の配列を考慮して、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、合成的に設計および作製され、目的の細胞（例えば、幹細胞）に導入され得るか、またはそのようなＲＮＡをコードする外因的に導入された核酸構築物から目的の細胞（例えば、幹細胞）において作製され得る。ｍｉＲＮＡはまた、非タンパク質コード遺伝子から転写された長い前駆体からプロセシングされ、標的ｍＲＮＡとの不正確な塩基対合を介して翻訳を妨害する小ＲＮＡ分子（一般に約２１～２２ヌクレオチド）である。ｍｉＲＮＡまたはその前駆体（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）は、合成的に作製され、目的の細胞（例えば、幹細胞）に導入され得るか、またはｍｉＲＮＡもしくはその前駆体のいずれかをコードする外因的に導入された核酸構築物から目的の細胞（例えば、幹細胞）において作製され得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの阻害は、酵素的に不活性なヌクレアーゼであるＣａｓ分子が目的の遺伝子を標的とするｇＲＮＡと組み合わせて使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの改変バージョンを使用して達成することができる。標的部位は、遺伝子の５’調節領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー領域）中にあり得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ分子は、ＤＮＡ切断活性を排除または実質的に低下させる変異、例えば点変異を含む酵素的に不活性なＣａｓ９分子である（例えば、ＷＯ２０１５／１６１２７６号を参照されたい）。いくつかの態様において、酵素的に不活性なＣａｓ９分子は、転写リプレッサータンパク質に直接的または間接的に融合される。
他の手段による阻害
本発明は、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を直接阻害する化合物（例えば、とりわけ小分子、抗体）を細胞（例えば、幹細胞）に導入することによって、遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルまたは活性を低下させることを含む、遺伝子の機能を阻害するための当技術分野で公知の他の方法を含む。
ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の選択された遺伝子の阻害を有するように改変されている細胞（例えば、幹細胞）はまた、キメラ抗原受容体（または「ＣＡＲ」）をコードする核酸を含有するように改変されている。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞が選択された遺伝子の機能を阻害するように改変される前に、それと同時に、またはその後に、細胞に導入され得る。阻害が一過性である（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉを介して）実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸は、好ましくは、阻害を達成するために細胞が改変される前に細胞に導入される。阻害が（例えば、遺伝子編集を通じて）永続的である実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞が阻害を達成するように改変される前に、それと同時に、またはその後に、細胞に導入され得る。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、ＤＳＢの導入後に遺伝子編集の標的部位でのＨＤＲによる挿入を可能にするように設計され、すなわち、遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸のノックインまたは挿入によって破壊される。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の選択された遺伝子の阻害を有するように改変されている細胞（例えば、幹細胞）に由来する細胞（例えば、造血系細胞または免疫細胞）は、キメラ抗原受容体（または「ＣＡＲ」）をコードする核酸を含有するようにも改変されている。
「キメラ抗原受容体」（「ＣＡＲ」、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」および「キメラ免疫受容体」としても知られる）という用語は、抗原認識部分を免疫細胞上に移植する操作された受容体への言及として理解されるべきである。一般的に言えば、ＣＡＲは、互いに作動可能に連結された、標的抗原に特異的な抗原認識部分、膜貫通ドメイン、および免疫細胞上で天然に発現される受容体の細胞内／細胞質シグナル伝達ドメインから構成される。「作動可能に連結された」とは、抗原認識部分が標的抗原に結合すると、シグナルが細胞内シグナル伝達ドメインを介して誘導されて、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を活性化し、そのエフェクター機能を活性化することができるように、個々のドメインが互いに連結されていることを意味する。
ＣＡＲの抗原認識部分は、標的抗原のエピトープを認識して結合する受容体の細胞外部分である。抗原認識部分は、通常、ｓｃＦｖであるが、これに限定されない。
ＣＡＲの細胞内ドメインは、免疫細胞の天然に存在する受容体の一次細胞質シグナル伝達配列、および／または免疫細胞の天然に存在する受容体の二次配列もしくは共刺激配列を含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ由来の細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の共刺激シグナル伝達配列と組み合わせて、ＣＤ３ゼータ由来の細胞質シグナル伝達配列を含むことができる。適切な共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３などが挙げられる。いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、一般に、膜にまたがる典型的な疎水性αヘリックスであり、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、それは主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。
「標的抗原」という用語は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの受容体発現免疫細胞によって標的化されることが求められる細胞によって発現される任意のタンパク質性または非タンパク質性分子に対する言及として理解されるべきである。標的抗原は、「自己」分子（患者の体内で発現される分子）または非自己分子（例えば、感染性微生物由来）であり得る。本明細書で言及される標的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞の免疫応答を自然に誘発することができる分子に限定されない；むしろ、「標的抗原」は、標的化されることが求められる任意のタンパク質性または非タンパク質性分子に対する言及である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞表面上に発現される。標的抗原は、標的細胞によって排他的に発現され得るか、または非標的細胞によっても発現され得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、非自己分子、または標的化されることが求められる細胞によって排他的に発現されるか、もしくは正常細胞と比較して有意に高いレベルで標的化されることが求められる細胞によって発現される、分子である。標的抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐｌＯＯ（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原、およびＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５などの腫瘍特異的多系統抗原；ＭＵＣ１およびＭＵＣ１６などの過剰発現糖タンパク質；ＣＥＡなどの過剰発現胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなどの過剰発現癌遺伝子および突然変異腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなどの染色体転座から生じるユニーク腫瘍抗原；ならびにエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス抗原。他の腫瘍関連抗原としては、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＥＧＦＲ、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ １８０ｅｒｂＢ－３、ｃＭｅｔ、ｎｍ－２３ Ｈｌ、ＰＳＡ、ＣＡ１９－９、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭＡ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ ２７、２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ－７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＰＳＭＡ、メソテリン、またはＢＣＭＡが挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原、特にタンパク質、糖タンパク質または非タンパク質腫瘍関連抗原である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）およびＢＣＭＡからなる群から選択される。
一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原ＴＡＧ－７２である。
他の実施形態では、標的抗原は、表面タンパク質、例えばＣＤ２４であり、別の実施形態では、腫瘍標的化に使用することができる表面タンパク質、例えばＣＤ１９またはＣＤ２０である。
いくつかの態様において、供給源細胞は、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含み、前記受容体は、抗原決定基に向けられた抗原認識部分を含む。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを発現する。
他の実施形態では、派生細胞は、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含み、前記受容体は、抗原決定基に対する抗原認識部分を含む。一部の実施形態では、派生細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを発現する。
遺伝子改変（例えば、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）をコードする核酸分子の導入）が細胞に導入される機構は、当業者に周知であり理解されている任意の適切な形態をとり得ることが、当業者に理解されるであろう。例えば、遺伝物質は、一般に、発現構築物の使用を介して細胞に都合よく導入される。
ＣＡＲは、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡのトランスフェクション；γ－レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むウイルスベクターの形質導入；ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ媒介遺伝子編集によって導入することができる。
分化方法
本発明は、概して、幹細胞、特にｉＰＳＣを改変し、さらに、それらを増強された活性を含む幹細胞由来免疫細胞にさらに分化させるための方法および組成物に関する。
供給源細胞（例えば、多能性幹細胞）を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に分化させるための方法は、当技術分野において公知である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２０１８， ２３（２）： １８１－１９２ ｅ５； Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１３， ３１（１０）： ９２８－３３； Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ａｌｐｈａｂｅｔａ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｔ ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣ Ｉｍｐａｒｔｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０１６， ７６（２３）： ６８３９－６８５０）。
それらは、典型的には、３つの主要な段階に従う：１）ＰＳＣからのＣＤ３４＋細胞の生成および増殖、２）ＣＤ３４＋細胞からの前駆細胞／免疫細胞の分化、ならびに３）前駆細胞／免疫細胞の増殖。
多能性細胞の調製
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、中胚葉細胞への分化の前に調製および／または選別され得る。選択プロセスは、１つまたは複数の遺伝子または１つまたは複数のマーカーに基づいてもよい。
ｉＰＳＣを生成するためにリプログラミングした後、胚様形態、リプログラミング後の導入遺伝子サイレンシング、アルカリホスファターゼアッセイによる多能性評価、またはＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、およびＯｃｔ４などの多能性および再生マーカーの検出に基づいて、細胞を特徴付けることができる。分化能は、胚様体形成および／または奇形腫形成によってモニターされる。核型分析、同一性マッチングおよび無菌性も通常評価される（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ ｂａｎｋｉｎｇ： ｂａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｏｃｔ ２８， ２０１９， Ｖｏｌ．２６（１））。
様々な方法が、ヒトｉＰＳＣの維持および調製のために使用され、これらには、不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞を使用するフィーダー細胞依存性培養、ＭＥＦ馴化培地を使用するｉＰＳＣの培養、ｉＰＳＣからの胚様体の作製、ならびに無血清およびフィーダーフリー増殖培地またはＭＥＦ馴化培地を使用するマトリックス依存性増殖が含まれる。ｉＰＳＣは、酵素的または機械的継代方法を使用して継代され、一般に、これは、コロニーが大きく／密になりすぎたとき、または分化の増加が生じたときに行われる。最適なｉＰＳＣコロニーは、コロニーにわたって明確なエッジおよび均一な形態を有することが観察されたものである。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＰＳＣのゲノム編集のために最も一般的である。一般に、ＴＡＬＥアレイまたはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、クローニングベクターを使用して設計およびクローニングされる。単一細胞ヒトＰＳＣは、ベクターでトランスフェクトまたは形質導入され、標的細胞は、蛍光レポーターを介してＦＡＣＳで、または選択マーカーを介して抗生物質切片によって選択することができる。濃縮後１～２週間後、ＰＳＣを採取し、ゲノムＤＮＡ分析ならびに標的化クローン回収および増殖のために拡大増殖させる。両方の遺伝子編集アプローチが、ノックインおよび／またはノックアウトｉＰＳＣ株を生成するために使用されてきた（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｐｉｔｆａｌｌｓ， ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ， ０７ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６， Ｖｏｌ．１８（１）， ｐｐ．５３－６５）。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、Ａｃｃｕｔａｓｅなどを使用して、溶液中の単一細胞として接着状態から持ち上げられ、次いで、特定の遺伝子ＫＯに対するガイドＲＮＡを含有するＲＮＰ複合体、および／または目的の遺伝子の部位で細胞にノックインすることが所望され得る配列を含有するプラスミドの存在下でエレクトロポレーションされる。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集後、ＮＫ細胞への分化などの機能研究における任意のさらなる操作または試験の前に、ｉＰＳＣを放置して安定化させ、正常培養に戻す。
多能性幹細胞からのＣＤ３４＋細胞の生成および増殖
当該技術分野におけるほとんどの方法は、ＰＳＣを中胚葉細胞に分化させることから始まる。これに続いて、中胚葉細胞をＨＥ／ＨＳＣに分化させ、これも同時に増殖させることができる。
ＰＳＣ分化方法は、胚様体（ＥＢ）形成、フィーダー細胞共培養、二次元細胞外マトリックス被覆培養、および転写因子形質導入を用いたプログラミングまたは再プログラミングを含む様々なアプローチに従うことができる（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ， １８ Ｊｕｎｅ ２０１３， Ｖｏｌ．４（３）， ｐｐ．７１； Ｔａｊｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ： Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｉｃｈｅ， Ｃｅｌｌｓ， １８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１９， Ｖｏｌ．８（２））。これらの方法は、造血前駆細胞を産生し得る。造血内皮（ＨＥ）細胞が、多能性ＨＳＣのデノボ産生に寄与する一過性中間体であることを示唆する証拠が増えている。
ＰＳＣ分化の三次元ＥＢは、インビボ胚発生を模倣し、したがって、ＥＢ形成を使用するいくつかの方法が、ＰＳＣの造血分化のために開発されている。これらには、自発的ＥＢ形成、懸滴ＥＢ形成およびスピンＥＢ形成が含まれる。造血系を特異的に誘導するために、ＥＢの単一細胞懸濁物を、造血サイトカインおよび増殖因子の存在下で造血発生を支持するように機能するメチルセルロース培養培地に向ける。スピンＥＢ法に基づくＨＳＣへの分化は、４～１１日間の培養を要し得る。
フィーダー共培養は、フィーダー細胞の層をＰＳＣと一緒に培養して、それらを適切な培養培地中で造血系統の発生に向けて支持する方法である。間質細胞共培養を用いて、ＨＥ／ＨＳＣを得る。ＯＰ９間質細胞、大動脈生殖腺中腎領域に由来する間質細胞、Ｓ１７およびＭ２１０などの胎児肝臓由来間質細胞および骨髄由来間質細胞、ならびにＡＦＴ０４間質細胞は、共培養に使用される例示的な株である。間質細胞共培養法は、通常、動物由来であり、血清依存性または非依存性のいずれかであり得る。
コラーゲンおよびフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスでコーティングされた培養皿における二次元培養は、ＰＳＣを分化させるための単層培養として使用される。ヒトフィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶを使用するマトリックスは、造血前駆細胞を生成するために主に利用される。ＰＳＣはまた、ラミニン、コラーゲンＩ、エンタクチンおよびヘパリン－硫酸プロテオグリカンならびに増殖因子およびいくつかの他の未定義の化合物などのマトリックス成分の存在下で中胚葉細胞に分化する。これらの中胚葉細胞は、造血カクテル培養培地で置換した後に造血細胞を誘導することができる。
いくつかの細胞外因性因子が、ＨＥ／ＨＳＣへのＰＳＣ分化のための造血カクテル培養培地において必要とされる。化学物質、サイトカインおよび増殖因子の組み合わせとしては、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＳＢ４３１５４２、ＤＫＫ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦＬＴ３－Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。
内皮細胞のＨＥ／ＨＳＣへの直接プログラミングまたは再プログラミングを介した転写因子形質導入は、ＰＳＣからＨＳＣへの分化のために使用されている。転写因子としては、ＥＲＧ、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＬＣＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＰＩ１、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＥＴＶ２およびＧＡＴＡ２が挙げられるが、これらに限定されない。
造血カクテルを使用して、ＣＤ３４＋細胞／ＨＳＣを拡大培養（ｅｘｐａｎｄ）させる。これらには、上記のものが含まれるが、これらに限定されない。造血カクテルの市販キットもまた、ＣＤ３４＋細胞の拡大培養のために利用可能である。
他の小分子、タンパク質および化学物質もまた、ＨＳＣ／ＣＤ３４＋細胞の拡大培養のために、上記のサイトカイン／増殖因子と組み合わせて使用され得る。これらには、テトラエチレンペンタミン、ＨＯＸＢ４、プロスタグランジンＥ２、Ｓｔｅｍｒｅｇｉｎｉｎ １、ＵＭ７２９、ＵＭ１７１、Ｎｏｔｃｈリガンド、アンジオポエチン様５、ＩＧＦＢＰ２、プレイオトロフィン、バルプロ酸、ならびにヒストンデアセチラーゼおよびＤＮＡメチルトランスフェラーゼの低分子阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。三次元ナノファイバー足場もまた、ＨＳＣ増殖に使用されている。
リンパ系／骨髄系細胞へのＨＥ／ＨＳＣの分化
骨髄に加えて、ＨＳＣ／ＣＤ３４＋造血細胞前駆体（ＨＳＣ）の主な供給源は血液である。具体的には、これらは末梢血または臍帯血から単離され得る。ｉＰＳＣ細胞株もまた、これらの細胞の供給源である。ＨＳＣ／ＣＤ３４＋造血前駆細胞の濃縮は、抗ＣＤ３４免疫磁性粒子／ビーズを使用して行うことができる。
ＣＤ３４＋前駆細胞を分化させ、様々なサイトカイン、成長因子および／または小分子を含む増殖カクテルを用いて拡大培養させることができる。抗体染色およびマーカー発現のフローサイトメトリー分析を使用して、分化の成功をモニターする。造血能を、クローン原性コロニー形成単位アッセイによってモニターする。関連する造血遺伝子発現は、ＰＣＲ、トランスクリプトーム分析または他の分子生物学に基づく方法を介してモニターされる。生着は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスなどの動物において試験することができる。
サイトカインおよび増殖因子の組み合わせは、ＨＳＣの免疫細胞への分化を促すために使用される。例えば、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－１５およびＦＬＴ３－Ｌは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７と組み合わせて、ＥＬ０８１Ｄ２などのフィーダー細胞の存在下または非存在下でのＥＢによるＮＫ細胞の生成のために使用される。
リンパ系のコミットメントを誘導するために、Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様－１（ＯＰ９－ＤＬＬ１）またはＯＰ９－ＤＬＬ４を発現するＯＰ９細胞株を、ＳＣＦ、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ－７またはＩＬ－１５の存在下で利用して、ＣＤ３４濃縮またはスピンＥＢ形成なしにＮＫ細胞を生成した。
ＰＳＣ／ＨＳＣ由来のＮＫ細胞の拡大培養は、膜結合ＩＬ－５および４－１ＢＢリガンドを有するＫ５６２などのフィーダー細胞を使用して行うことができる。ＮＫ細胞増殖に使用される他の細胞株としては、膜結合ＩＬ－２１人工抗原提示細胞が挙げられる。ＨＳＣをＮＫ細胞に分化させるための市販のキット、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ細胞生成キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が利用可能である。
ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－７およびＩＬ－２の存在下でＯＰ９およびＯＰ９－ＤＬＬ１を培養し、続いて抗ＣＤ３ 抗ＣＤ２８で刺激することによっても、Ｔ細胞を誘導することができる。ＨＳＣをＴ細胞に分化させるための市販のキット、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｔ細胞世代キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も利用可能である。
単球およびマクロファージは、例えば、ＳＣ１７細胞株またはスピンＥＢ方法論を使用する間質細胞ベースの方法、ならびにＩＬ－３、ＣＳＦ－１およびＭ－ＣＳＦの存在下でのその後の培養を使用して生成され得る。
改変細胞の医薬組成物および治療的使用
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって産生される細胞、すなわち、選択された遺伝子のうちの１つまたは複数の機能が阻害されている改変細胞、およびそれらに由来する細胞を含有する組成物が本明細書で提供される。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書で産生される細胞、及び薬学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物である。薬学的に許容され得る担体としては、溶媒、分散媒、等張剤などが挙げられる。担体の例としては、油、水、生理食塩水、ゲル、脂質、リポソーム、レジン、多孔性マトリックス、保存剤など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、患者への投与のために、例えば養子細胞療法のために、典型的には単位用量注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で調製および製剤化される。いくつかの実施形態は、医薬組成物は、時間放出、遅延放出、および持続放出送達系を使用することができる。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば治療的有効量または予防的有効量の細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される改変細胞を、約１００万～約１０００億個の細胞、例えば、少なくとも１００万、５００万、１０００万、２５００万、５０００万、１億、２億、３億、４億または５億個の細胞から約１０億、５０億、１００億、２００億、３００億、４００億、５００億、６００億、７００億、８００億、９００億または１０００億個の細胞までの量で含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、さらに、化学療法剤などの別の活性薬剤または薬物を含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、養子細胞療法における治療方法および使用などの、本明細書に開示される改変細胞の方法および使用である。
いくつかの実施形態において、方法は、疾患もしくは状態を有するか、または疾患もしくは状態を発症するリスクがある対象への、本明細書において開示される改変細胞または本明細書において開示される改変細胞を含む組成物の投与を含む。
いくつかの態様において、病気または状態は、新生物状態（すなわち、がん）、または微生物もしくは寄生虫感染（例えば、ＨＩＶ、ＳＴＤ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、または抗生物質耐性細菌）、または自己免疫性疾患（例えば、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、炎症性大腸炎、乾せん、硬皮症、自己免疫甲状腺疾患、バセドウ病、クローン病、多発性硬化、ぜんそく）である。
いくつかの実施形態において、新生物状態は、中枢神経系腫瘍、網膜芽腫、神経芽細胞種、小児腫瘍、頭頸部がん（例えば、扁平上皮がん）、乳がんおよび前立腺がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんの両方）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、食道胃がん、肝細胞癌、膵胆管新生物（例えば、腺癌および島細胞腫）、結腸直腸がん、子宮頸がんおよび肛門がん、子宮がんおよび他の生殖管がん、尿路がん（例えば、尿管がんおよび膀胱がん）、胚細胞腫瘍（例えば、精巣胚細胞腫瘍または卵巣胚細胞腫瘍）、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がん）、未知の原発癌、ヒト免疫不全症関連悪性腫瘍（例えば、カポシ肉腫）、リンパ腫、白血病、悪性黒色腫、肉腫、内分泌腫瘍（例えば、甲状腺腫瘍）、中皮腫および他の胸膜腫瘍または腹膜腫瘍、神経内分泌腫瘍およびカルチノイド腫瘍を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、例えば、がんを処置する状況において腫瘍増殖および／もしくは転移を阻害することによって、またはウイルス感染を処置する状況においてウイルス負荷および／もしくは拡散を減少させることによって、状態の処置、すなわち、状態または状態の任意の１つまたは複数の症状の減少または改善をもたらす。「治療」という用語は、必ずしも完全な回復を意味しない。一部の実施形態では、本方法は、状態の予防、すなわち、状態を予防すること、状態を発症するリスクを低減すること、または状態の発症を遅延させることをもたらす。同様に、「予防」は、対象が最終的にその状態に罹患しないことを必ずしも意味しない。
いくつかの実施形態において、細胞または組成物が投与される対象、例えば患者は、哺乳動物、典型的にはヒトなどの霊長類である。
いくつかの実施形態では、細胞または細胞を含む組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与を含む。
派生細胞または派生細胞を含む組成物の所望の投与量は、組成物の単回投与によって、複数回投与によって、または連続注入投与によって送達することができる。治療効果または予防効果は、処置された対象の定期的な評価によってモニターされ得る。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、対象から単離された細胞から生成され、次いで、本明細書に開示される方法に従って改変され（１つまたは複数の遺伝子の機能を阻害する）、さらに分化され、次いで、同じ対象に投与される。
いくつかの態様において、養子細胞療法は、供給源細胞が細胞療法を受ける対象（レシピエント対象）とは異なるドナー対象由来の細胞から生成される同種異系移入によって行われる。一部の実施形態では、ドナー対象およびレシピエント対象は、同じＨＬＡクラスまたはスーパータイプを発現する。
以下の実施例では、限定されないが、腫瘍治療のための増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して２つのＤＧＫ遺伝子を排除したことが例示されている。遺伝子編集効率を、ゲノムＤＮＡ配列決定に基づく定量化によって調べた。ｉＰＳＣを、ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用して単一細胞として持ち上げ、次いで、特異的に設計されたガイドＲＮＡとのＣａｓ９ヌクレアーゼ複合体をこれらのｉＰＳＣにトランスフェクトして、免疫調節因子遺伝子を除去した。次いで、ｉＰＳＣをＣＤ３４＋細胞に分化させた。ＣＤ３４＋細胞をさらにｉＮＫ細胞に分化させた。細胞毒性をインビトロでモニターした。
実施例１ － ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンの生成
ｉＰＳＣのような幹細胞は、無制限に自己再生し、造血幹細胞（ＨＳＣ）および免疫細胞を含む様々な細胞型に分化することができる。Ｔ細胞およびＮＫ細胞のような免疫細胞は、がん治療のためにｉＰＳＣから既に生成されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８，２３（２）：１８１－１９２ ｅ５； Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，３１（１０）：９２８－３３；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ａｌｐｈａｂｅｔａ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｔ ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣ Ｇｒａｎｔｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６，７６（２３）：６８３９－６８５０）。ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、同様の方法に従ってレンチウイルスＣＡＲ形質導入ｉＰＳＣから誘導することができる。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣを生成するために、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１７／０８８０１２およびＰＣＴ／ＡＵ２０２０／０５０８００に記載の非ウイルスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックイン法を介して、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ発現カセットをＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に導入した。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ陽性ｉＰＳＣを選別して、精製ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを生成した（図１）。ｉＰＳＣの表面上でのＣＡＲ発現を、フローサイトメトリーによって特徴付けた。
単一細胞クローニング
単細胞クローニングのために、最初に９６ウェルプレートをＰＢＳ中のＣｅｌｌＡｄｈｅｒｅ（商標）ラミニン－５２１で３７℃で２時間コーティングした。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣを選別し、１細胞／ウェルの平均密度で９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクトされたｉＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して単一細胞として取り出し（ｌｉｆｔ）、続いて計数し、洗浄し、必要に応じて関連する抗体カクテルで染色するために再懸濁した。細胞を４℃で１５分間染色した後、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎで選別した。死細胞排除のためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用した。細胞をゲートしてデブリ、ダブレットおよび死細胞を除去し、続いて９６ウェルプレートに選別した。プレートを直ちに３７℃の細胞インキュベーターに４８時間入れ、細胞が継代に適している場合には毎日培地交換を行った。
実施例２ － ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ（事前選別された単一細胞クローン）の生成
ＤＧＫαおよびＤＧＫζは両方とも複数の転写物を有する。ＤＧＫαおよびＤＧＫζの主要アイソフォームの全てを除去するために、ＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子を標的化するようにガイドＲＮＡのリストを設計した（表１）。したがって、アウトオブフレームのインデルをそれらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の初期エクソンに導入して、ＤＧＫαおよびＤＧＫζの翻訳を破壊することができた。
ＣＲＩＳＰＲ ＤＧＫαおよび／またはＤＧＫζ遺伝子の二重ノックアウトｉＰＳＣを生成するために、代表的なｇＲＮＡ（配列番号３；配列番号１１）によって形成されたＲＮＰ複合体を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システムを用いてｉＰＳＣにトランスフェクトした。最初に、１２ウェルプレートを、ＰＢＳ中のＣｅｌｌＡｄｈｅｒｅ（商標）ラミニン－５２１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングし、３７℃で２時間インキュベートした。トランスフェクションの前に、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にｉＰＳＣを２時間プレインキュベートした。全長ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をＬｏｎｚａ Ｐ３緩衝液およびＣａｓ９と組み合わせることによって、ＲＮＰを調製した。次いで、ＲＮＰ混合物を室温で１０～２０分間インキュベートした。プレインキュベーション後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｉＰＳＣを単一細胞として取り出し、エレクトロポレーションのために反応当たり１×１０６個の細胞を得た。遺伝子ノックアウトｉＰＳＣを生成するために、Ｌｏｎｚａ Ｐ３緩衝液中の細胞およびＲＮＰ混合物をＰＣＲチューブ中に合わせ；遺伝子ノックインｉＰＳＣを生成するために、Ｌｏｎｚａ Ｐ３緩衝液中の細胞をＲＮＰ混合物およびドナーＤＮＡと合わせた。ＲＮＰ混合物を有する細胞を、エレクトロポレーションのためにＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）にロードした。この後、ＣｌｏｎｅＲ（商標）培地を含むｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）を反応物に添加し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｌｏｎｅＲ（商標）培地を含むｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）中のラミニン－５２１プレコートプレートに細胞を添加した。ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）による毎日の培地交換を７２時間実施し、細胞を約８０％の集密度に達したら継代した（エレクトロポレーション後６～７日）。この段階の終わりでの細胞をＤＧＫ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣと呼ぶ。
ＲＮＰトランスフェクションおよび拡大培養後、遺伝子編集の定量分析のために、ゲノムＤＮＡをｉＰＳＣから抽出した。遺伝子編集効率は、ＩＣＥ（Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ）アッセイを用いて解析した（Ｈｓｉａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ． ｂｉｏＲｘｉｖ，２０１８，１０．１１０１／２５１０８２（２５１０８２）。ＤＧＫαのｇＲＮＡ（配列番号３）ｉＰＳＣトランスフェクト試料からのＤＧＫα遺伝子編集効率分析をＩＣＥ分析の代表的な結果としてここに示した（図２Ａ～２Ｃ）。加えて、ＤＧＫαのｇＲＮＡ（配列番号３）およびＤＧＫζのｇＲＮＡ（配列番号１１）が複数のｉＰＳＣ株にインデルを導入することができることも示されている（図３Ａ～３Ｂ）。
ＣＲＩＳＰＲ ＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子の単一／二重ノックアウトｉＰＳＣおよび単一細胞クローニングを生成するため、２つの段階が必要である（図１）。第１に、ｉＰＳＣのエレクトロポレーションおよびそれらの回復を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集と、それに続くトランスジェニックｉＰＳＣのその後の拡大培養で構成される第Ｉ相。第ＩＩ相は、トランスフェクトされたｉＰＳＣの単一細胞クローニングで構成され、これは、単一細胞選別およびその後のクローンｉＰＳＣの拡大培養を含む。
単一細胞クローニング
単細胞クローニングのために、最初に９６ウェルプレートをＰＢＳ中のＣｅｌｌＡｄｈｅｒｅ（商標）ラミニン－５２１で、３７℃で２時間コーティングした。ＤＧＫα（配列番号３）および／またはＤＧＫζ（配列番号１１）のＲＮＰトランスフェクトｉＰＳＣを選別し、９６ウェルプレートに１細胞／ウェルの密度で播種し、コロニーが形成されるまで（例えば、５～９日間）培養した。トランスフェクトされたｉＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して単一細胞として取り出し、続いて計数し、洗浄し、必要であれば、関連する抗体カクテルで染色するために再懸濁した。細胞を４℃で１５分間染色した後、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎで選別した。死細胞排除のためにＰＩ染色を使用した。細胞をゲートしてデブリ、ダブレットおよび死細胞を除去し、続いて９６ウェルプレートに選別した。プレートを直ちに３７℃の細胞インキュベーター中に４８時間置き、細胞が継代に適するまで毎日培地交換を行った。単一細胞クローニング後、単一細胞クローンの遺伝子型を、サンガー配列決定およびＩＣＥアッセイを用いて分析した。９９％～１００％のアウトオブフレーム頻度を有する単一細胞クローンを、ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンとして選択した（図４Ａ～４Ｄ）。これらの選択されたクローンの遺伝子型を、野生型サンガー配列決定トレースとさらに比較した。ＤＧＫαおよびＤＧＫζのＲＮＰ共トランスフェクトｉＰＳＣからのＤＧＫ二重遺伝子ＫＯクローン（ＤＧＫαζのＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローン０１）の代表的な遺伝子型決定結果を示す。予備選別されたＤＧＫαおよびＤＧＫζのＲＮＰ共トランスフェクトｉＰＳＣを、単一細胞クローニング後に精製し、これは、切断部位の下流の塩基の異種混合物の除去、および非トランスフェクト（野生型）細胞と比較した単一クローンにおけるチミン（Ｔ）挿入（＋１）の同定によって証明された（図５Ａ～５Ｂ）。要約すると、これらの結果は、ＤＧＫαのｇＲＮＡおよびＤＧＫζのｇＲＮＡが、インデルをＤＧＫ遺伝子に導入することができ、結果として、ｉＰＳＣに効率的なフレームシフト突然変異をもたらし、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣを生成することを実証した。
ＴＧＦβは、全身性免疫抑制を発揮し、宿主免疫監視を阻害し、腫瘍における免疫抑制性微小環境の主要な因子の１つであると考えられている。胚性幹細胞におけるＴＧＦβ受容体のノックアウトおよびＴＧＦβシグナル伝達の直接阻害は、多分化能の喪失をもたらす（Ｗａｔａｂｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｚｏｎｏ， Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊａｎ ２００９， Ｖｏｌ．１９（１）， ｐｐ．１０３－１５）。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術（参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２０２０／０５１２４３に記載）を使用して、ドミナントネガティブＴＧＦβ１およびＴＧＦβＲ２のｉＰＳＣを生成した。しかしながら、ｉＰＳＣにおけるＴＧＦβＲ１およびＴＧＦβＲ２ドミナントネガティブ突然変異は、それらの多能性を喪失し、遺伝子編集後に自発的に分化し始めた（図１９）。この結果は、ｉＰＳＣにおける遺伝子ノックアウトまたはＴＧＦβ受容体の直接阻害が、免疫細胞療法のための供給源細胞を生成することができないことを示す。
実施例３ － ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫ ＫＯの予備選別ｉＰＳＣおよびＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンの生成
予備選別されたＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣを生成するために、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ単一細胞クローンを、実施例１に記載されるように最初に作製した。次いで、代表的なｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰ複合体を、実施例２に記載のＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システムを使用して、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣにトランスフェクトした。ＩＣＥ分析結果は、ＤＧＫαのｇＲＮＡおよびＤＧＫζのｇＲＮＡが、インデルをＤＧＫ遺伝子に導入することができ、高頻度でＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣにおいてフレームシフト変異をもたらすことを示す（図６）。さらに、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンはまた、実施例２に記載される方法を使用して誘導され得る（図７）。
実施例４ － ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンおよびＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣのＣＤ３４＋細胞への分化
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞は、無限に自己再生し、造血幹細胞（ＨＳＣ）および免疫細胞を含む様々な細胞型に分化することができる。
ＣＤ３４＋細胞は、米国特許第９，２６０，６９６ Ｂ２号（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｋｎｏｒｒ）に、またＬｉら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２０１８）１８１－１９７）により記載されているものなどの一連の公開された方法を使用して、またはＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）造血キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販の培養システムを使用して作製することができる。これらの方法の１つの形態では、ｉＰＳＣのＣＤ３４＋造血前駆細胞へと分化の誘導がＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００の６ウェルプレートを使用した胚様体（ＥＢ）形成によって促進される。ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレートをＡｎｔｉ－ａｄｈｅｒｅｎｃｅ Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で前処理し、使用前に温かいｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）で１回洗浄することができる。次いで、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメントを含むｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）をウェル当たり２．５ｍＬで添加する。ｉＰＳＣ培養物を７０％の集密度に達するまで増殖させ、その時点で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用してｉＰＳＣを単一細胞に解離させ、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレートに再播種し、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメントを含むｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（商標）を培地に加えてウェル当たり合計５ｍＬとする。次いで、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレートを１００×ｇで３分間遠心分離して、細胞を各マイクロウェルに引き込み、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。インキュベーション期間後、培地を血清学的ピペットで除去し、ウェル当たり５ｍＬのＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加する。これは、造血仕様の０日目を示す。２日目に、２．５ｍＬの培地Ａを除去し、２．５ｍＬの新鮮な培地Ａと交換する、半培地交換を行う。３日目に、培地Ａを除去し、５ｍＬのＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換する、完全培地交換を行う。５日目に、各ウェルの表面に対して培養培地をしっかりとピペッティングしてＥＢを除去することによって、ＥＢを収集する。懸濁液を４０μｍフィルターに通す。次いで、フィルターを反転させ、フィルターの表面上に収集されたＥＢを２．５ｍＬの培地Ｂで洗浄して新しい５０ｍＬプラスチックチューブに入れる。次いで、ＥＢを、２．５ｍＬのＭｅｄｉｕｍ Ｂ中の非組織培養処理６ウェルプレートのウェルに播種する。７日目に、ウェル当たり２．５ｍＬのＭｅｄｉｕｍ Ｂを添加する。９日目および１１日目に、上記で概説したように、Ｍｅｄｉｕｍ Ｂを用いて半分の培地交換を行う。１２日目に、接着細胞画分および非接着細胞画分の両方を収集し、ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の指示に従って使用してＣＤ３４＋細胞を選別する。
ＴＡＧ－７２ ＫＩ、ＤＧＫ ＫＯおよびクローニングを上記実施例に記載したように行った。次いで、ｉＰＳＣ単一細胞クローンにおけるおよびＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫ ＫＯ予備選別ｉＰＳＣにおけるＤＧＫ ＫＯを、ＣＤ３４＋細胞に分化させた。作製されたＣＤ３４＋細胞のソート純度および造血前駆細胞プロファイルを、ＣＤ３４発現についてフローサイトメトリーによって決定した。ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣまたはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣから特定された造血前駆細胞のフローサイトメトリー分析は、非トランスフェクト対照に匹敵するＣＤ３４の発現を示し、ＤＧＫ ＫＯ単独またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩおよびＤＧＫ ＫＯの組み合わせのいずれも、ＣＤ３４＋造血前駆細胞へのｉＰＳＣの分化に影響を及ぼさないことを示している（図１１Ａ～１１Ｃ）。
実施例５ － ＤＧＫ ＫＯ ＣＤ３４＋（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲを有する、または有さない）のｉＮＫ細胞への分化
ｉＮＫ細胞は、米国特許第９，２６０，６９６ Ｂ２号（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｋｎｏｒｒ）で、またＬｉら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２０１８）１８１－１９７）によって記載されているものなどの一連の公開された方法を使用して、または市販の培養系ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ細胞生成キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成することができる。これらの方法の１つの形態において、ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ単一細胞クローンまたは予備選別ＴＡＧ－７２ ＣＡＲクローン／ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣのいずれかに由来する、選別された（例えば実施例４に記載されるような）ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）リンパ系分化コーティング材料（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングされたプレート上のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）リンパ系前駆細胞増殖培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再播種される。これは、ＮＫ細胞特定化の０日目をマークする。３日目に、１容量の増殖培地を培養容器に添加する。７日目および１０日目に、新鮮な増殖培地を用いて半分の培地交換を行う。１４日目に、非接着性リンパ系前駆細胞を収集し、３００×ｇで５分間遠心分離する。次いで、細胞を、１μＭのＵＭ７２９を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＮＫ細胞分化培地に再懸濁する。１７日目に、１容量のＮＫ分化培地を培養容器に添加する。２１日目および２４日目に新鮮なＮＫ分化培地を用いて半分の培地交換を行う。ＮＫ細胞への分化は２８日目までに完了する。ＮＫ細胞分化の効率は、ＩＬ－１５、ＦＬＴ３およびＩＬ－７を含む、サイトカインの組み合わせで培地を補充することによって増強され得る。
ＤＧＫ ＫＯ ＣＤ３４＋（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ有するまたは有さない）をｉＮＫ細胞に分化させ、ＤＧＫ ＫＯ、ＮＫ細胞表現型、およびＮＫ細胞機能について分析した。ＩＣＥ分析により、ｉＮＫ±ＴＡＧ－７２ ＣＡＲが、それらの親ＤＧＫ ＫＯ ｉＰＳＣ±ＴＡＧ－７２ ＣＡＲに匹敵するパーセンテージでαおよびζ遺伝子座の両方にインデルを有することが確認された（図１２Ａ～１２Ｂ）。さらに、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩを伴うまたは伴わないｉＰＳＣにおける単一または二重遺伝子ＤＧＫ ＫＯは、分化プロセスから得られるＮＫ細胞の収率に影響を及ぼさないことが示された（図１３）。ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６、ＣＤ４５、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、および２Ｂ４についてのフローサイトメトリー分析は、トランスフェクトされていないｉＮＫとトランスジェニックｉＮＫとの間で同等の発現レベルを示し、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＩの存在下または非存在下で、単一または二重ＤＧＫ ＫＯがｉＮＫ細胞の表現型に影響を及ぼさないことを示した（図１４Ａ～１４Ｂ）。
実施例６ － ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＫＯ ｉＮＫ細胞およびＫＯ ｉＮＫ細胞のインビトロ機能
リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を使用して、インビトロでのｉＮＫ細胞の死滅効率を決定した。１０，０００個／１００μＬの標的細胞（例えば、卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ－３）を、２０％ウシ胎仔血清およびウシインスリンを補充した培養培地（例えば、ＲＰＭＩ－１６４０基本培地）に再懸濁し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムに適合するＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ ＡｎａｌｙｓｉｓマイクロタイターｅＰｌａｔｅに入れた。標的細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３～２０時間維持して、細胞付着を可能にした。標的細胞の付着後、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲまたはＤＧＫαζ ＫＯを伴うまたは伴わないｉＮＫエフェクター細胞を、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。全ての共培養物を最適な増殖条件で少なくとも２０時間維持した。全体を通して、細胞インピーダンスをモニターした；インピーダンスの減少は、標的細胞の脱離および最終的には細胞死を示す。実施例１、２および３に記載されるように、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ挿入有りまたは無しのいずれかのｉＰＳＣクローンに対して、ＤＧＫαζ ＫＯを行った。次いで、これらの細胞を配列決定し、ｉＮＫ細胞に分化させた。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲおよびＤＧＫαζ ＫＯを伴うｉＮＫ細胞および伴わないｉＮＫ細胞を、１：１のエフェクター対標的比でＯＶＣＡＲ－３細胞を標的とするｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）アッセイ（上記の通り）に入れて、ＯＶＣＡＲ－３細胞への長期曝露の前にベースラインｉＮＫ機能を評価した。抗原曝露アッセイのために、ＯＶＣＡＲ－３細胞（ＡＴＣＣ推奨に従って日常的に培養された）を、１２ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルで播種し、６時間放置してプレートに付着させた。次いで、８×１０５個のｉＮＫ細胞を、ＯＶＣＡＲ－３含有ウェルに入れ、合計７２時間インキュベートした。２４時間毎（すなわち、共培養の２４時間、４８時間および７２時間）に、ｉＮＫ細胞および任意の死滅ＯＶＣＡＲ－３細胞を含有する培養物の非接着性画分を収集し、３００×ｇで１０分間遠心分離し、新鮮なｉＮＫ培養培地に再懸濁し、未接触ＯＶＣＡＲ－３細胞を含有するウェルに入れた。ｉＮＫによって死滅しなかった残りのＯＶＣＡＲ－３細胞（すなわち、残りの接着画分）を、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を使用して酵素的に分離し、ＭＵＳＥ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して計数した。これらの細胞数を利用して、図１５Ａに示すように、ｉＮＫ死滅効率を計算した。抗原曝露アッセイの終了時のｉＮＫ細胞も、以前に記載されたようにｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）を使用して細胞傷害機能について評価した。
ＣＡＲ ＫＩおよびＤＧＫαζ ＫＯを有するｉＮＫ細胞は、インビトロでＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞に対して増強された長期細胞毒性機能を示した（図１５Ａ）。ＣＡＲと共にＤＧＫαζ ＫＯを含むことの効果は、がん細胞株への７２時間の反復曝露後に明らかになった。これらのデータにより、ｉＮＫ細胞において機能的利益をもたらすｉＰＳＣにおけるＤＧＫαζ ＫＯに新規機能を含むことが実証された（図１５Ａ）。ＯＶＣＡＲ－３への７２時間の反復曝露後、標的細胞を排除するのにかかる時間は、ベースライン（約５時間）と比較して増加した（１５～２０時間）（図１５Ｂ）。しかしながら、殺傷能力を評価する前にＯＶＣＡＲ－３細胞に７２時間曝露したｉＮＫ細胞の機能を比較すると、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫは機能の改善を示した（図１５Ｂ）。さらに、長期の抗原曝露アッセイを生き延びたｉＮＫ細胞の総数は、それらのそれぞれの非トランスフェクトｉＮＫ対照と比較して、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫクローンにおいて改善された（図１５Ｃ）。まとめると、これは、ＤＧＫαζ ＫＯが、ｉＮＫ生存および腫瘍細胞に対する細胞傷害性機能の増強に重要であることを示す。
実施例７ － ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞のインビトロ機能
上記実施例６において先に記載したように、リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を用いて、インビトロでのｉＮＫ細胞の死滅効率を決定した。長期抗原曝露アッセイのために、ＯＶＣＡＲ－３細胞（ＡＴＣＣ推奨に従って日常的に培養された）を、４８ウェルプレートにウェル当たり２．５×１０４細胞で播種し、４～５時間放置してプレートに付着させた。次いで、５×１０５個のｉＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ ２０：１）をＯＶＣＡＲ－３ウェル上に置き、２４時間インキュベートした。２４時間後、唯一の生存細胞としてｉＮＫ細胞を含有する培養物の非接着性画分を収集し、３００ｇで１０分間遠心分離し、新鮮なｉＮＫ培養培地に再懸濁し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ＭＵＳＥ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して計数した。次いで、これらの残りのｉＮＫを、４時間前に新たに播種したＯＶＣＡＲ－３細胞を含有する新しいウェルに入れた。ｉＮＫによって死滅しなかった残りのＯＶＣＡＲ－３細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡを介して取り上げ、Ｇｕａｖａ（登録商標）ＭＵＳＥ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して計数した。このプロセスを各２４時間間隔で合計５日間繰り返した。抗原曝露アッセイの終了時のｉＮＫ細胞もｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）アッセイに入れて、ＯＶＣＡＲ－３細胞への１２０時間の曝露後のｉＮＫ細胞傷害機能の効果を実証した。実験の終点で、ｉＮＫ細胞の試料もフローサイトメトリー分析に供して、増殖性核マーカーＫｉ６７の発現を評価した。
ＤＧＫαζ ＫＯを有するｉＮＫ細胞は、インビトロでＯＶＣＡＲ－３腫瘍細胞に対して増強された長期細胞毒性機能を示した（図１６Ａ）。１２０時間の反復抗原曝露後、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）アッセイによって測定されるように、非トランスフェクトｉＮＫ細胞と比較して増強された殺傷能力を実証した（図１６Ａ）。これらのデータは、ｉＮＫ細胞において機能的利益をもたらすｉＰＳＣにＤＧＫαζ ＫＯを含むことの新規な機能を実証している（図１６Ａ）。さらに、反復抗原曝露後のフローサイトメトリー分析は、非トランスフェクトｉＮＫと比較して、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫにおいて増殖マーカーＫｉ６７を発現する細胞の割合の増加を示唆した（図１６Ｂ）。増加したＫｉ６７発現へのこの傾向は、ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫにおける改善された増殖能力へのヒントである。
腫瘍微小環境におけるｉＮＫ細胞でのＤＧＫ ＫＯの機能的利点を、ＴＧＦβの存在下で、実施例６に記載されるインビトロ細胞傷害性機能アッセイによりモデル化した。一般的な現象として、固形腫瘍微小環境は、ＴＧＦβなどの様々な免疫チェックポイント阻害剤および可溶性因子で集中的に浸潤され、これが腫瘍エスケープおよび免疫細胞に対する耐性を引き起こす（Ａｌｓｉｎａ－Ｓａｎｃｈｉｓ，Ｅｌｉｓｅｎｄａ ｅｔ ａｌ．，ＴＧＦβ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０１７－０７－３０， Ｖｏｌ．１８ （８）， ｐ．１６５８）。例えば、以前の研究は、ＴＧＦβが複数のシグナル伝達経路を介してナチュラルキラー細胞機能を抑制することができ、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）などのＮＫ活性化受容体の下方制御をもたらし（Ｙａｎｇ， Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＴＧＦ－β ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ： ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｘｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ， ２０１０， Ｖｏｌ．３１ （６）， ｐ．２２０－２２７によって概説されている）、本明細書では殺傷能力を損なうことを示している。標準的なＮＫ培養培地または１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの補充のいずれかにおいて、２：１のエフェクター対標的比で非トランスフェクトｉＮＫ細胞およびＯＶＣＡＲ－３に対し標的化されたＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞の応答を、図１８Ａ～１８Ｂにおいて調査した。ＯＶＣＡＲ－３細胞増殖を、アッセイ内の内部対照として、ＴＧＦβを含むまたは含まない（ｉＮＫ細胞を含まない）培養培地単独でモニターした。この研究において、ｉＮＫ細胞におけるＤＧＫαζ ＫＯの包含が、ＴＧＦβ補充培地内で殺傷応答が低減した非トランスフェクトｉＮＫ細胞と比較して、ＴＧＦβがもつＯＶＣＡＲ－３細胞に対する細胞傷害性機能の抑制効果に抵抗するかまたはそれを回避することを可能にした。自発的分化を引き起こすことなくｉＰＳＣに対して直接ＴＧＦβのＫＯを行うことができないので（図１９に示す）、ＴＧＦβ関連経路内の抑制効果を最小限にすることによってｉＮＫ細胞の下流利点を可能にするＤＧＫαζ ＫＯの能力は、ｉＰＳＣおよびｉＮＫ細胞におけるＤＧＫαζ ＫＯの新規な利点を実証している。
ＤＧＫαζ ＫＯの機能的利点を、さらに、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲと組み合わせてインビトロで評価した。このアッセイでは、ＤＧＫαζ ＫＯを含むまたは含まないＴＡＧ－７２ ＣＡＲ（クローンＤ７）ｉＮＫ細胞を、より厳しい条件下でＯＶＣＡＲ－３細胞に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）アッセイにおいてエフェクター細胞として使用し、この際、エフェクター対標的比を１：５に低下させ、ＮＫ培地中のＴＧＦβの補充を１００ｎｇ／ｍＬに増加させた。図１８Ｃにおいて、エフェクター細胞に対するＴＧＦβの免疫抑制性の影響は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞よりもＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫ細胞において大きかった。１００ｎｇ／ｍＬでのＴＧＦβの添加は、ＯＶＣＡＲ－３細胞に対するＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫ細胞の細胞毒性機能を無効にした。同じ条件下で、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫの細胞傷害性は、ＴＧＦβの添加によってわずかに減少しただけであった。これらのデータは、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫ細胞が、内因性腫瘍微小環境の態様を模倣する、ＴＧＦβを含む免疫抑制因子に感受性であることを支持する。ｉＰＳＣ細胞へのＤＧＫαζ ＫＯの包含および分化後のｉＮＫ細胞への下流での保持は、ＯＶＣＡＲ－３細胞に対するｉＮＫの細胞傷害機能に対するＴＧＦβの影響を低減する。
実施例８ － ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞のインビボ機能
このモデルでは、約１×１０７個のヒト由来ＴＡＧ－７２陽性ＯＶＣＡＲ－３がん細胞を６～１０週齢のマウスの側腹部に皮下注射することによって、ヒト腫瘍細胞株をＮＳＧマウスの側腹部で増殖させた。６～７週間以内に、完全に形成された約１００ｍｍ３の腫瘍が注射部位に発生した。腫瘍がこの体積に達したら、この群を処置のために無作為化した。未編集（すなわち、トランスフェクトされていない）ｉＰＳＣ供給源またはＤＧＫαζ ＫＯ ｉＰＳＣ細胞のいずれかに由来するｉＮＫ細胞を、注射当たり１×１０６個のＮＫ細胞でマウスに静脈内投与した。注射の前に、ｉＮＫ細胞をインビトロで通常のＮＫ増殖条件下で７日間培養した。外因性サイトカインをｉＮＫ細胞と共にマウスに同時投与しなかった。腫瘍体積、体重および臨床スコアを、ｉＮＫ細胞注入後にモニターした。８００ｍｍ３から１０００ｍｍ３超の腫瘍サイズ、有意な体重減少または不良な臨床スコアを有するマウスを、動物倫理承認に従って選別した。
ヒトサイトカインの投与は、ＮＳＧマウスにおけるヒトＮＫ細胞の生存および機能を支持することが実証されている。しかしながら、この研究では、ヒトサイトカインはｉＮＫ細胞と同時投与されず、ｉＮＫ細胞は依然として抗腫瘍活性を示した。ＤＧＫαζ ＫＯを有するｉＮＫ細胞で処置されたマウスは、アッセイを通した複数の時点で腫瘍サイズの減少を実証し、生存性の改善を示した（図１７）。
実施例９ － ＴＡＧ－７２ ＣＡＲおよびＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞のインビトロおよびインビボでの特徴付け
インビボ投与の前に、エフェクター細胞調製物を、最適化されたインビトロアッセイのセットによって事前評価した。これには、ＮＫ細胞純度のフローサイトメトリー分析、関連するＮＫ刺激性受容体の表現型特徴付け、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ発現、ＤＧＫαζ ＫＯ状態、ならびにインビトロＯＶＣＡＲ－３殺傷活性が含まれた。
ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞のフローサイトメトリー分析は、二重陽性のＣＤ４５＋ ＣＤ５６＋ 細胞の高い割合を実証し、ＮＫ細胞の比較的純粋な集団を示唆した（図２０Ａ）。これらの二重陽性ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ細胞のうち、６０％超がＴＡＧ－７２ ＣＡＲを発現し、これは、ＣＡＲ保持が製造および編集プロセスによって影響されなかったことを示唆した（許容可能な範囲内）。ＮＫ刺激性受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、および２Ｂ４、ならびに初期活性化マーカーＣＤ６９もまた、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ細胞上で有意なレベルで発現され、発現は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫにおいて観察されたものに匹敵した（図２０Ａ）。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）インピーダンスベースの技術を使用する機能評価は、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞が、１：２および１：１の両方のエフェクター：標的比で、健常成人ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された未編集ｉＮＫおよびＮＫ細胞と比較して、ＯＶＣＡＲ－３細胞殺傷を増強することを実証した（図２０Ｃは１：２比を示し、１：１比についてのデータは提示されていない）。さらに、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫは、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ単独ｉＮＫに対し同様の殺傷能力を示した。Ｓｙｎｔｈｅｇｏによって開発されたＩＣＥツールを使用して、ＤＧＫαおよびＤＧＫζインデル有効性を分析した（図２０Ｂ）。これは、ＤＧＫαおよびＤＧＫζ遺伝子座についてそれぞれ約６０％および７５％のインデル効率を実証し、インビトロ（図２０Ａ～２０Ｃ）およびインビボ（図２１Ａ～２１Ｅ）の両方で観察された細胞毒性効果が、ＤＧＫαζ遺伝子ＫＯを含有する細胞によって主に媒介されたことを示唆した。
ルシフェラーゼベースの生物発光イメージング（ＢＬＩ）異種移植モデルを使用して、上記の実施例４および５に記載されるように生成したＴＡＧ－７２ ＣＡＲおよびＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞のインビボ有効性を決定した。ＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣がん細胞株を、その標的抗原ＴＡＧ－７２の既知の発現、ＮＳＧマウスへのＯＶＣＡＲ－３細胞の効率的な生着、ならびにインビトロでのＴＡＧ－７２ ＣＡＲおよび／またはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞に対するＯＶＣＡＲ－３細胞の感受性に基づいて異種移植片として選択した（実施例６を参照されたい）。実験の詳細は以下の通りである。エフェクター細胞投与の４日前（－４日目）に、８週齢の雌免疫不全ＮＳＧマウスに、２×１０５個のルシフェラーゼ標識ＯＶＣＡＲ－３細胞を腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。ＮＫ細胞投与の１日前（－１日目）に、マウスを、ＡＭＩ－ＨＴＸ動物撮像装置（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用してベースライン腫瘍量について測定し、比較可能なルシフェラーゼ発現群に配置した。０日目に、１×１０７個の凍結保存ｉＮＫ細胞を解凍し、マウスにｉ．ｐ．注射した。ヒトｉＮＫエフェクター細胞の生存および増殖を支持するために、全ての群は、実験の最初の３週間において、２～３日毎に投与される１×１０４Ｕのインターロイキン（ＩＬ）－２（２１日間）および／または毎日投与される１０ｎｇのＩＬ－１５（７日間）を受けた。腫瘍量をモニタリングし、研究の最後（８４日）までＢＬＩによって毎週定量化した。
このモデルにおいて、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫまたはＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ細胞で処置したマウスは、８４日間の観察期間にわたって、ＰＢＳ、ＰＢＭＣ－ＮＫ対照および未編集ｉＮＫ処置マウスと比較して、測定可能な程度に低い腫瘍負荷を示した（図２１Ａ～Ｃ）。７０日目から、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＮＫで処置したマウスでは、腫瘍細胞の増殖を反映する生物発光シグナルの漸進的増加が観察されたが、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＮＫ処置マウスでは観察されなかった（図２１Ｃ）。個々の時点の分析は、ｉＮＫにおけるＤＧＫαζ ＫＯの包含が、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ単独ｉＮＫと比較して一貫してより低い平均腫瘍負荷によって反映されるように、優れた長期インビボ有効性をもたらしたことを示唆する強い傾向を明らかにした（図２１Ｄ、Ｅ）。
実施例１０ － ＤＧＫ ＫＯ ＣＤ３４＋（ＴＡＧ－７２ ＣＡＲありまたはなし）のｉＴ細胞への分化
ｉＴ細胞は、様々な公開された方法を用いて生成することができ、そのような公知物には、例えば、デルタ様リガンド１（ＤＬＬ１）（Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｏｃｔ ２０１３， Ｖｏｌ ３１（１０）， ｐｐ． ９２８－９３３）またはデルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）（Ｆｌｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ Ｆｒｏｍ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｆｒｏｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ２０ Ｏｃｔ ２０２０， Ｖｏｌ ８， Ａｒｔｉｃｌｅ ５７７４６４）、または懸濁液中の支持構造に結合したノッチリガンドシグナル伝達を介して（ＵＳ２０２００３９９５９９Ａ１号、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ）、ＩＬ－７、ＦＬＴ３、ＳＣＦなどのサイトカインの存在下で、発現する編集マウス間質支持細胞（ｓｔｒｏｍａ ｓｕｐｐｏｒｔ ｃｅｌｌ）（ＯＰ９）を一般に利用することが、または市販の培養系ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することが記載されている。
ｉＰＳＣ供給源は、編集されていないか、またはＤＧＫα ＫＯ、ＤＧＫζ ＫＯ、ＤＧＫαζ ＫＯもしくはＣＡＲノックインの任意の組合せのうちの少なくとも１つを含有するかのいずれかであり得、クローン由来、濃縮集団、または未精製バルク遺伝子編集集団由来のいずれかであり得る。これらのｉＰＳＣ供給源は、ＣＤ３４＋細胞へ分化される。予備選別されたＣＤ３４＋細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）リンパ系前駆細胞増殖培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）リンパ系分化コーティング材料（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングされたプレート上に、再播種される。これを、Ｔ細胞分化の０日目と記す。１４日後、週に２回培地交換を行い、前駆Ｔ細胞を収集し、推奨される期間、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入れる。Ｔ細胞を収集し、次いで、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標） Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＨｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のいずれかを用いて、ＣＤ８ ＳＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で活性化して、主にＣＤ８＋表現型を有する成熟ＣＤ３＋ Ｔ細胞を作製する。
ＴＡＧ－７２を標的とするＣＡＲ構築物を、最初に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用してｉＰＳＣのセーフハーバー遺伝子座にノックインし、次いで、ＤＧＫαおよびＤＧＫζの両方を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してノックアウトした（実施例１～２に記載のとおり）。細胞を遺伝子編集後にクローニングし、ＤＧＫαζ ＫＯおよびＣＡＲのホモ接合体ＫＩを分化のために選択した（実施例３を参照のこと）。ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ ｉＰＳＣ濃縮株のインデル効率は、ＤＧＫαについては９０％、ＤＧＫζについては９９％であった（図２２Ａ）。これらのｉＰＳＣ株は、ｉＴ細胞への分化に成功し、この際、真正Ｔ細胞のホールマークマーカーをフローサイトメトリーによって特徴付けた（図２２Ｂ）。重要なことに、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδと共発現する細胞集団が、ＣＡＲおよびＤＧＫαζ ＫＯのありまたはなしで同等のレベルで得られた。これは、ｉＰＳＣへのＤＧＫαζ ＫＯの包含がｉＰＳＣのｉＴ細胞への発達を遮断しないという知見を支持する。ＣＤ３とのＣＡＲの共発現は、ｉＴ細胞がＣＡＲを明示的に保持することをさらに確認する。
図２２Ｃに示すように、ｉＰＳＣ由来ＴＡＧ－７２ ＣＡＲ＋ＤＧＫαζ ＫＯ ｉＴ細胞は、インビトロでｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）によって示されるように、ＴＡＧ－７２発現卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ－３に対するオンターゲットＣＡＲ媒介性活性を示す。逆に、ＯＶＣＡＲ－３対照と比較して、非トランスフェクトｉＴ細胞およびＣＡＲ構築物を含まないＰＢＭＣから単離されたＴ細胞は、同等の機能を示さない。重要なことに、強力な細胞毒性機能は、ＤＧＫαζ ＫＯおよびＣＡＲ ＫＩ遺伝子編集を有するｉＰＳＣクローンに由来するｉＴ細胞において保持されており、したがって、ＤＧＫαζ ＫＯを有する機能的ＣＡＲ ｉＴ細胞が実証されている。
実施例１１ － ＴＧＦβの存在におけるＴＡＧ－７２ ＣＡＲ／ＤＧＫ ＫＯ ｉＴ細胞のインビトロ機能
ｉＴ細胞は、実施例１０に記載されるように生成され得る。
腫瘍微小環境におけるｉＴ細胞におけるＤＧＫ ＫＯの機能的利点を、図２３Ａに示すように、ＴＧＦβの存在下でのインビトロ細胞傷害性機能アッセイ（実施例７において先に概説した）を使用してモデル化した。簡単に説明すると、ＣＡＲおよびＤＧＫαζ ＫＯを含むまたは含まないｉＴ細胞を、最適増殖培地中の０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬのいずれかのＴＧＦβで少なくとも８時間プレコンディショニングした後、リアルタイムセルモニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標））を用いてインビトロでのｉＴ細胞の殺傷効果を決定した。１０，０００個／１００μＬの標的細胞（例えば、卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ－３）を、２０％ウシ胎仔血清およびウシインスリンを補充した培養培地（例えば、ＲＰＭＩ－１６４０基本培地）に再懸濁し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムに適合するＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ ＡｎａｌｙｓｉｓマイクロタイターｅＰｌａｔｅに入れた。標的細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３～１０時間維持して、細胞付着を可能にした。標的細胞の付着後、ＴＡＧ－７２ ＣＡＲおよびＤＧＫαζ ＫＯを含むまたは含まない、ならびにＴＧＦβへの曝露を伴うまたは伴わないｉＴエフェクター細胞を、１：１のＥ：Ｔで添加した。全ての共培養物を最適増殖条件±ＴＧＦβ中で少なくとも４０時間維持した。さらに、標的細胞単独±ＴＧＦβを並行して維持した。全体を通して、細胞インピーダンスを１５分間隔でモニターした。インピーダンスの減少は、標的細胞の脱離および最終的には細胞死を示す。
ＴＧＦβプレコンディショニングの非存在下では、細胞毒性機能がｉＴ（非トランスフェクト）細胞において観察され（図２３Ｂおよび図２３Ｃ、黒塗り記号）、この際、０のＮｏｒｍａｌｉｓｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘによって示されるように、ほぼ完全な標的細胞死が４０時間のモニタリング期間内に観察される。対照的に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ（図２３Ｂ）または１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ（図２３Ｃ）のいずれかにおけるｉＴ（非トランスフェクト）細胞のプレコンディショニングおよび維持は、インビトロ細胞傷害性機能の低下をもたらした。インビトロでの細胞傷害性に関するＴＧＦβのそのような阻害効果は、ＤＧＫαζ ＫＯを有するＴＡＧ－７２ ＣＡＲ－ｉＴ細胞では観察されず、このことは、ＤＧＫαζの欠失（ノックアウト）が、これらの細胞を、ｉＴ細胞の細胞傷害性機能に対するＴＧＦβの抑制効果に対してより低感受性にしたことを示す。

Claims (39)

  1. 増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成する方法であり、前記方法が、
    （Ｉ）ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群より選択される少なくとも１つの標的遺伝子の機能を阻害するように幹細胞を改変する工程を含み、
    前記改変幹細胞は、前記改変幹細胞の前記標的遺伝子阻害を保持しかつ増強された活性を有する幹細胞由来免疫細胞に分化することができる、方法。
  2. 前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記幹細胞が、プレＨＳＣ、造血内皮（ＨＥ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記幹細胞が、三重ホモ接合性ＨＬＡハプロタイプドナーに由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 工程（Ｉ）で得られた前記改変幹細胞を選択する工程をさらに含み、
    前記標的遺伝子の両方の対立遺伝子が阻害される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ｉ）工程（Ｉ）で得られた前記改変幹細胞または前記改変幹細胞から生成されたクローン細胞を、組成物と接触させて中胚葉細胞を得る工程；
    （ｉｉ）前記中胚葉細胞を組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ 細胞を得る工程；および
    （ｉｉｉ）前記ＣＤ３４＋細胞を組成物と接触させて、幹細胞由来免疫細胞を得る工程をさらに含む、請求項１または５に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの標的遺伝子がＤＧＫαである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの標的遺伝子がＤＧＫζである、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. ＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子の両方が阻害される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記幹細胞由来免疫細胞が、多能性前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、初期胸腺前駆細胞、プレＴ細胞前駆細胞、プレＮＫ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、ＮＫ前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、骨髄系共通前駆細胞、マクロファージおよび単球から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記免疫細胞が、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ３、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδから選択されるマーカーの少なくとも１つを発現するＴ細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記免疫細胞が、ＣＤ５６＋およびＣＤ４５＋を発現するＮＫ細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記標的遺伝子の機能の阻害が、遺伝子編集システムによって達成される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記遺伝子編集システムが、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択されるガイドＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを利用する、請求項１５～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記改変幹細胞がさらに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むように改変されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記改変幹細胞が、前記ＣＡＲを発現する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記方法によって産生された前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むように改変されている、請求項１～１７に記載の方法。
  21. 前記方法によって産生された前記免疫細胞が、前記ＣＡＲを発現する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記方法によって産生された前記免疫細胞が、１つまたは複数の標的抗原を認識する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記方法によって産生された前記免疫細胞が、腫瘍標的または感染性因子標的を認識する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記標的抗原が、ＴＡＧ－７２、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ４７、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＢＣＭＡ、メソテリン、Ｍｕｃ１からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって産生される免疫細胞。
  26. ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群より選択される少なくとも１つの標的遺伝子の機能が阻害されている改変細胞であり、前記改変細胞の前記遺伝子阻害を保持しかつ増強された活性を有する免疫細胞に分化することができる、改変細胞。
  27. 胚性幹細胞、臍帯幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞である、請求項２６に記載の改変細胞。
  28. 造血性内皮細胞、造血前駆細胞、造血始原細胞、造血幹細胞または造血様幹細胞からなる群より選択される、請求項２６に記載の改変細胞。
  29. 三重ホモ接合性ＨＬＡハプロタイプドナーに由来する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の改変細胞。
  30. 前記標的遺伝子の両方の対立遺伝子が阻害されている、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の改変細胞。
  31. 前記少なくとも１つの標的遺伝子がＤＧＫαである、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の改変細胞。
  32. 前記少なくとも１つの標的遺伝子がＤＧＫζである、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の改変細胞。
  33. ＤＧＫα遺伝子およびＤＧＫζ遺伝子の両方が阻害されている、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の改変細胞。
  34. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の改変細胞。
  35. 前記ＣＡＲを発現する、請求項３４に記載の改変された細胞。
  36. ＤＧＫαおよびＤＧＫζからなる群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の機能を阻害するように細胞を改変するための組成物であり、前記組成物が標的遺伝子の配列を編集することができるガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体を含み、
    前記ガイドＲＮＡが、配列番号１～配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、組成物。
  37. 前記ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項３６に記載の組成物。
  38. 請求項２５に記載の免疫細胞を対象に投与する工程を含む、対象における状態を処置する方法。
  39. 前記状態が、がん、感染症、自己免疫障害、器官の線維症、または子宮内膜症である、請求項３８に記載の方法。
JP2023548215A 2021-02-10 2022-02-09 増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法および組成物 Pending JP2024506067A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163147933P 2021-02-10 2021-02-10
US63/147,933 2021-02-10
US202163236828P 2021-08-25 2021-08-25
US63/236,828 2021-08-25
PCT/AU2022/050075 WO2022170384A1 (en) 2021-02-10 2022-02-09 Methods and compositions for generating stem cell-derived immune cells with enhanced function

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024506067A true JP2024506067A (ja) 2024-02-08

Family

ID=82838866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023548215A Pending JP2024506067A (ja) 2021-02-10 2022-02-09 増強された機能を有する幹細胞由来免疫細胞を生成するための方法および組成物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240117311A1 (ja)
EP (1) EP4291660A1 (ja)
JP (1) JP2024506067A (ja)
KR (1) KR20240004245A (ja)
AU (1) AU2022220754A1 (ja)
CA (1) CA3211013A1 (ja)
WO (1) WO2022170384A1 (ja)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2918501T3 (es) * 2013-12-19 2022-07-18 Novartis Ag Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos
JP7215808B2 (ja) * 2016-08-12 2023-01-31 ツールゲン インコーポレイテッド 操作された免疫調節エレメントおよび変更された免疫

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240004245A (ko) 2024-01-11
EP4291660A1 (en) 2023-12-20
WO2022170384A1 (en) 2022-08-18
US20240117311A1 (en) 2024-04-11
CA3211013A1 (en) 2022-08-18
AU2022220754A1 (en) 2023-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3612557B1 (en) Antigen-specific immune effector cells
CN108368520B (zh) 多能细胞的基因组工程改造
CN107075484B (zh) 从多能性干细胞诱导细胞免疫治疗用t细胞的方法
JP6933898B2 (ja) 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用
KR101772860B1 (ko) Ｔ 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍
US20230009232A1 (en) Method for providing immune cells with enhanced function
JP2023507118A (ja) 治療のための操作された細胞
JP2023548467A (ja) 操作されたｉＰＳＣ及び持続性免疫エフェクター細胞
US20240117311A1 (en) Methods and compositions for generating stem cell-derived immune cells with enhanced function
CN117480249A (zh) 包含未重排的t细胞受体(tcr)基因座的干细胞及其使用方法
JP2023548829A (ja) 異種腫瘍制御のための操作されたｉＰＳＣ及び免疫エフェクター細胞
CN117015608A (zh) 用于生成具有增强功能的干细胞衍生的免疫细胞的方法和组合物
CN117858942A (zh) 受保护的效应细胞及其用于同种异体过继性细胞疗法的用途
CA3223323A1 (en) Protected effector cells and use thereof for allogeneic adoptive cell therapies
WO2024077159A1 (en) B cell lineages derived from pluripotent cells
CN116615531A (zh) 用于异质肿瘤控制的工程改造的iPSC和免疫效应细胞
Du Co-Expansion of Gamma Delta T Cells and Cytokine Induced Killer Cells for Adoptive Immune Cell Therapy
EA046022B1 (ru) Антигенспецифические иммунные эффекторные клетки