KR20230165263A - 작용성 항-il-2r 항체 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
항-IL2R(예를 들어, 항-IL2RB, 항-IL2RG, 항-IL2RB/G) 항체가 이러한 항체를 제조하는 방법, 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물을 비롯한 조성물, 및 IL2/IL2R 신호전달 경로에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료에서의 이러한 항체 및 조성물의 용도와 함께 개시된다.
Description
본 출원은 2021년 4월 2일자로 출원된 미국 가출원 제63/170,383호, 및 2021년 9월 1일자로 출원된 미국 가출원 제63/239,883호의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2022년 3월 28일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 60792_00054WO01_(TNO-0038-WO)_SL.txt이고, 크기가 90,527 바이트이다.
본 발명은 인터루킨-2(IL-2) 수용체(IL2R)에 결합하고 작용 활성을 나타내는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 이러한 항체를 제조하는 방법, 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물을 비롯한 조성물, 및 IL2/IL2R 신호전달 경로에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료에서의 이러한 항체 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
강력한 면역 활성화 활성과 암 환자의 지속적인 종양 퇴행을 유도할 가능성을 가짐에도 불구하고 IL-2의 면역치료제로서의 성공은 심각한 용량 제한 독성으로 인해 제한되었다. 이러한 이상 반응은 주로 고친화성 삼량체 수용체인 IL-2Rαβγ를 발현하는 세포, 예컨대 T-조절(Treg) 세포 및 내피 세포에 의한 IL-2의 우선적 흡수로 인한 것이다. 본 발명은 휴면 T-세포 및 NK-세포 상에서 발현되는 이량체 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 결합하고 이를 통해 신호전달을 활성화하는 항체(예를 들어, 다중특이성 항체, 다중특이성 중쇄-단독 항체, 이중특이성 항체, 이중특이성 중쇄-단독 항체)에 관한 것이다. IL-2Rα에 대한 결합을 피함으로써, 본원에 기재된 항체는 천연 IL-2의 우선적인 Treg 활성화를 제거하는 한편 NK-세포와 함께 다른 T-세포 하위세트에 대한 강력한 자극 효과를 유지한다. 추가로, 본원에 기재된 예시적 항체 상의 Fc 영역의 존재는 생체 내 반감기를 재조합 IL-2의 상기 반감기에 비해 유의하게 연장시켜, 치료적 맥락에서 보다 편리한 투약 일정을 허용한다. 마우스 및 시노몰구스 원숭이 둘 모두에서의 생체 내 연구에서는 본원에 기재된 예시적 항체의 생체 내 생물학적 활성, 연장된 약동학적 특성, 및 향상된 안전성 프로파일이 확인되었다. 종합적으로, 이러한 결과는 안전하고 효과적인 IL-2R 작용제로서의 이러한 항체의 용도와, 다수의 유형의 암에 대한 치료적 치료 접근법으로서의 IL-2 신호전달 경로의 용도를 뒷받침한다.
종양에 대항하여 면역계를 활용하는 능력은 확고히 확립되었으며, 인터루킨-2(IL-2)는 거의 40년 전에 암 치료제로 성공적으로 사용된 최초의 재조합 단백질 중 하나이다. 문헌[Lotze et al., Journal of Immunology 135(4), 2865-75 (1985)]; 문헌[Rosenberg, S. A. J Immunol 192, 5451-58 (2014)]. IL-2는 T-세포 및 자연 살해(NK)-세포 둘 모두의 증식을 유도하는 면역 세포의 핵심 조절자이다. 그러나 IL-2는 면역억제 조절 T(Treg)-세포의 증식도 유도하는 다면발현성 사이토카인이다. 문헌[Fontenot et al., Nat Immunol 6, 1142-51 (2005)]. IL-2의 상이한 기능들은 상이한 표적 세포들 상에서 발현되는 IL-2 수용체 복합체 서브유닛의 조성에 의해 결정된다. 문헌[Boyman et al., Nat Rev Immunol 12, 180-90 (2012)]. 고친화성 IL-2 수용체 복합체는 IL-2RA(CD25), IL-2RB(CD122) 및 공통 감마 사슬 수용체 IL-2RG(CD132)로 구성되며, CD4+FoxP3+ Treg 세포 상에서 구성적으로 발현되고 활성화 T-세포 상에서 일시적으로 발현된다. 문헌[Waldmann, T. A., Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2006)]. 중간 친화성 수용체는 단지 IL-2RB 및 IL-2RG로 구성되며, 휴면 T-세포, CD8+ 기억 이펙터 T-세포 및 NK-세포 상에서 발현된다. 문헌[Choudhry, H. et al, Biomed Res Int 2018, 1-7 (2018)]. IL-2RA 서브유닛은 하류 JAK-STAT 신호전달에 필요하지 않지만, IL-2RB 및 IL-2RG와의 그의 회합은 IL-2RB 및 IL-2RG만으로 구성된 이종이량체 수용체와 비교하여 IL-2에 대해 100배 더 높은 친화성을 제공한다. 이러한 수용체 결합 차이 및 세포-특이적 발현을 기반으로 하여, 면역억제 Treg가 완충 역할을 하여 낮은 수준의 IL-2를 소비하고 이펙터 림프구의 IL-2 매개 확장에 대한 역치 효과를 생성한다는 것이 제안되었다. 문헌[Feinerman, O. et al., Mol Syst Biol 6, 437 (2010)].
IL-2의 고유한 신호전달 특성으로 인해, 저용량 IL-2는 임상적으로 Treg를 자극하여 자가면역을 치료하는 데 사용된 반면, 고용량 IL-2는 전이성 흑색종 및 전이성 신장 세포 암종 치료용으로 개발 및 승인되었으며(Proleukin®), 이때 장기 지속 효과(durable response)가 환자의 7~12%에서 관찰되었다. 문헌[McDermott, D. F. et al., J Clin Oncol 23, 133-141 (2004)]; 문헌[Payne, R. et al., J Immunother Cancer 2, 13 (2014)]; 문헌[Atkins, M. B. et al., J Clin Oncol 17, 2105-2105 (1999)]; 문헌[Rosenberg, S. A. et al., Ann Surg 228, 307-319 (1998)]. 그러나 그의 짧은 반감기 및 좁은 치료 범위로 인해 환자에 있어서 IL-2를 안전하고 효과적으로 사용하는 데 상당한 어려움이 있었다. 구체적으로, Proleukin®은 혈관 누출 증후군, 저혈압, 및 간 독성을 비롯한 심각한 부작용을 갖는데, 이는 암 면역요법에서의 그의 사용을 제한하였다. 혈관 누출 독성은 혈관 내피 세포 및 폐 내피 세포 상에서의 고친화성 IL-2R의 발현과 관련되어 폐부종을 초래하는 것으로 나타났다. 문헌[Krieg, C., et al., Proc National Acad Sci 107, 11906-11 (2010)]. Proleukin®의 항종양 효과는 Treg 세포 상의 고친화성 수용체에 이것이 우선적으로 결합함으로써 더욱 손상되어 항암 요법으로서의 그의 효능이 둔화된다. 문헌[Schwartzentruber, D. J. et al., New Engl J Medicine 364, 2119-2127 (2011)]; 문헌[Rezvani, K. et al., Blood 108, 1291-1297 (2006)]. 예로서, 고용량 IL-2 치료를 받은 흑색종 환자에서 공동자극자-양성(ICOS+) Treg 세포가 IL-2를 이용한 치료 후 혈액에서 증식성이 가장 큰 림프구 집단인 것으로 밝혀졌으며, 많은 수의 ICOS+ Treg는 최악의 환자 결과와 일치하였다. 문헌[Sim, G. C. et al., J Clin Invest 124, 99-110 (2014)].
천연 IL-2의 다면발현성 성질과 치료적 분자로서의 그의 관련된 제한으로 인해, 용량 제한 독성을 감소시켜 치료 범위를 넓히는 IL-2 변이체를 조작하려는 상당한 노력이 있어 왔다. 문헌[Murer, P. et al., New Biotechnol 52, 42-53 (2019)]; 문헌[Arenas-Ramirez, N. et al., Trends Immunol 36, 763-77 (2015)]. Treg 및 혈관 내피 세포와 같은 고친화성 IL-2R 발현 세포의 우선적 활성화를 피하는 변이 단백질이 이러한 목표를 달성하기 위한 1가지 접근법이다. 이러한 분자를 생성하기 위한 노력의 일환으로, 다른 접근법은 IL-2 상의 IL-2RA 결합 인터페이스를 돌연변이시키는 것, 폴리에틸렌 글리콜을 IL-2 단백질에 부착시키는 것, 합성 IL-2 단백질을 생성하는 것, 및 IL-2RA 결합 도메인을 차단하는 항체를 생성하는 것을 수반하였다. 문헌[Silva, D.-A. et al., Nature 565, 186-191 (2019)]; 문헌[Charych, D. H. et al., Clin Cancer Res 22, 680-690 (2016)]; 문헌[Arenas-Ramirez, N. et al., Sci Transl Med 8, 367ra166-367ra166 (2016)]; 문헌[Levin, A. M. et al., Nature 484, 529-533 (2012)]; 문헌[Lopes, J. E. et al., J Immunother Cancer 8, e000673 (2020)]. IL-2의 대안으로서, 다른 사람들은 IL-2RB/IL-2RG 서브유닛에 결합하는 IL-15 변이체를 조작하였다. IL-15 특이적 수용체 서브유닛은 자연적으로 항원 제시 세포로부터 트랜스로(in trans) IL-15에 결합하며; 따라서 활성 IL-15 재조합 단백질은 IL-15와 수용체 서브유닛 둘 모두를 발현하는 단일 사슬 구축물을 필요로 한다. 문헌[Bernett, M. J. et al. Abstract 5565: Potency-reduced IL15/IL15Rα heterodimeric Fc-fusions display enhanced in vivo activity through increased exposure. 5565-5565 (2018) doi:10.1158/1538-7445.am2018-5565]. 또한 돌연변이된 사이토카인을 항체 또는 Fc 도메인에 융합시켜 이 분자의 생체 내 반감기를 증가시키고 사이토카인을 종양 부위에 위치화하였다. 문헌[Murer, P. et al., New Biotechnol 52, 42-53 (2019)]; 문헌[Klein, C. et al., Oncoimmunology 6:3 e1277306 (2017)]; 문헌[Schliemann, C. et al., Blood 120, 3716-3716 (2012)]. 이러한 조작된 단백질 중 일부는 원하는 기능적 활성을 갖지만, 다수는 생체 내에서 높은 수준의 면역원성으로 고통받고 있으며 생체 내 안정성 및 제조에 어려움을 겪고 있다. 문헌[Brummelen, E. M. J. van et al., Oncotarget 9, 24737-49 (2018)]; 문헌[Groot, A. S. D. et al., Trends Immunol 28, 482-90 (2007)]; 문헌[Schellekens, H., Nephrol Dial Transpl 18, 1257-59 (2003)]; 문헌[Verhoef, J. J. F., et al., Drug Discov Today 19, 1945-52 (2014)]. 따라서, 원하는 생물학적 활성, 안전성 프로파일, 및 이상적인 약물 유사 특성을 갖는 IL-2 경로의 항종양 작용제를 생성하는 것은 이 분야에서 여전히 상당한 난제로 남아 있다.
본 발명의 분자에서는 항체의 유리한 약물 유사 특성과 IL-2RB 및 IL-2RG 회합 및 하류 신호전달을 촉진하는 분자의 기능적 거동이 조합된다. 본 발명의 양태는 IL-2RB 및 IL-2RG 서브유닛에 동시에 결합하고 따라서 IL-2RA에 대한 결합을 피하면서 IL-2의 활성을 모방하는 완전 인간 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체와 같은 완전 인간 항체 서열과 같은 항체 서열을 포함한다. 면역 이펙터 세포의 원하는 활성화 및 확장을 나타내는 것에 더하여, 본원에 기재된 이중특이성 IL-2RB/G 작용제 항체는 또한 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 억제 Treg의 우선적인 확장을 피한다.
비제한적인 예시적 실시 형태(세트 1)
제한 없이, 본 발명의 일부 예시적인 실시 형태/특징은 다음을 포함한다:
1.
IL2RB에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a)
서열 번호 1~3 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환(예를 들어, 0, 1 또는 2개)을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 4~6 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환(예를 들어, 0, 1 또는 2개)을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 7~10 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환(예를 들어, 0, 1 또는 2개)을 갖는 CDR3 서열.
2.
특징 1에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a)
서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
3.
특징 1 또는 2에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a)
서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및
(b)
서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및
(c)
서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
4.
특징 1~3 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 7의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열.
5.
특징 1~4 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 11~14 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상인 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
6.
특징 1~5 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 11~14로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체.
7.
IL2RB에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a)
하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
(b)
하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
(c)
하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서, X3은 G 또는 A이고;
X4는 S 또는 Q이고;
X5는 S 또는 T임).
8.
IL2RB에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a)
하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
(b)
하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
(c)
하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임).
9.
IL2RG에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a)
서열 번호 15~16 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환(예를 들어, 0, 1 또는 2개)을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 17~19 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환(예를 들어, 0, 1 또는 2개)을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 20~21 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환(예를 들어, 0, 1 또는 2개)을 갖는 CDR3 서열.
10.
특징 9에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a)
서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
11.
특징 9 또는 10에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a)
서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및
(b)
서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및
(c)
서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
12.
특징 9~11 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열.
13.
특징 9~12 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 22~25 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상인 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
14.
특징 9~13 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 22~25로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체.
15.
IL2RG에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a)
하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서, X1은 T 또는 I이고;
X2는 F 또는 V이고;
X3은 S, N, 또는 G이고;
X4는 D 또는 N임);
(b)
하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서, X5는 S 또는 N이고;
X6은 D, S, G, 또는 N이고;
X7은 T 또는 I임); 및
(c)
서열 ARGDAVSITGDY (서열 번호 20)를 포함하는 CDR3 서열.
16.
특징 1~15 중 어느 하나에 있어서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 인간 VH 프레임워크에 존재하는, 항체.
17.
특징 1~16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 다중특이성인, 항체.
18.
특징 1~17 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 이중특이성인, 항체.
19.
특징 1~18 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합하는, 항체.
20.
다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 7의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 17의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
21.
특징 20에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
22.
특징 20 또는 21에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함하는, 항체.
23.
특징 20~22 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 53을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 61을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
24.
다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
25.
특징 24에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
26.
특징 24 또는 25에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하는, 항체.
27.
특징 24~26 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 62를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 63을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
28.
다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 2의 CDR1 서열;
서열 번호 5의 CDR2 서열; 및
서열 번호 9의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
29.
특징 28에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
30.
특징 28 또는 29에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하는, 항체.
31.
특징 28~30 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 64를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 65를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
32.
다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 3의 CDR1 서열;
서열 번호 6의 CDR2 서열; 및
서열 번호 10의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 17의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
33.
특징 32에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
34.
특징 32 또는 33에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함하는, 항체.
35.
특징 32~34 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 66을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
36.
다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 16의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
37.
특징 36에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
38.
특징 36 또는 37에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24를 포함하는, 항체.
39.
특징 36~38 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 34를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
40.
다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 19의 CDR2 서열; 및
서열 번호 21의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
41.
특징 40에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
42.
특징 40 또는 41에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25를 포함하는, 항체.
43.
특징 40~42 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 36을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 37을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
44.
특징 20, 24, 28, 32, 36 또는 40 중 어느 하나에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재하는, 항체.
45.
특징 20, 24, 28, 32, 36, 40 또는 44 중 어느 하나에 있어서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재하는, 항체.
46.
특징 1~22, 24~26, 28~30, 32~34, 36~38, 40~42, 44 또는 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역을 포함하는, 항체.
47.
특징 46에 있어서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역인, 항체.
48.
특징 47에 있어서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는, 항체.
49.
특징 47 또는 48에 있어서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함하는, 항체.
50.
특징 49에 있어서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함하는, 항체.
51.
특징 49 또는 50에 있어서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함하는, 항체.
52.
특징 49~51 중 어느 하나에 있어서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함하는, 항체.
53.
특징 47~52 중 어느 하나에 있어서, 변이체 Fc 영역은 침묵된 Fc 영역인, 항체.
54.
특징 53에 있어서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함하는, 항체.
55.
특징 53 또는 54에 있어서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함하는, 항체.
56.
특징 53~55 중 어느 하나에 있어서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스(effector-less) 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서)) 및/또는 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함하는, 항체.
57.
특징 1~22, 24~26, 28~30, 32~34, 36~38, 40~42, 또는 44~56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 항체.
58.
특징 1~22, 24~26, 28~30, 32~34, 36~38, 40~42, 또는 44~57 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
59.
특징 58에 있어서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함하는, 항체.
60.
특징 58에 있어서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함하는, 항체.
61.
특징 58~60 중 어느 하나에 있어서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함하는, 항체.
62.
특징 58~61 중 어느 하나에 있어서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함하는, 항체.
63.
특징 58~62 중 어느 하나에 있어서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함하는, 항체.
64.
특징 58~62 중 어느 하나에 있어서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하는, 항체.
65.
특징 58~62 중 어느 하나에 있어서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하는, 항체.
66.
특징 1~65 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인, 항체.
67.
특징 1~66 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단리된 항체인, 항체.
68.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG 분자인, 항체.
69.
특징 1~68 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG1 분자인, 항체.
70.
특징 1~68 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG2 분자인, 항체.
71.
특징 1~68 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG4 분자인, 항체.
72.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분인, 항체.
73.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분인, 항체.
74.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분인, 항체.
75.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분인, 항체.
76.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 3쇄 항체-유사 분자인, 항체.
77.
특징 1~67 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 중쇄-단독 항체인, 항체.
78.
특징 1~77 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는, 항체.
79.
특징 1~78 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는, 항체.
80.
특징 1~79 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는, 항체.
81.
특징 1~80 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는, 항체.
82.
특징 1~81 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는, 항체.
83.
특징 80~82 중 어느 하나에 있어서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정되는, 항체.
84.
특징 80~83 중 어느 하나에 있어서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정되는, 항체.
85.
특징 80~82 중 어느 하나에 있어서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정되는, 항체.
86.
특징 1~85 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 하는, 항체.
87.
다음을 포함하는 제약 조성물:
특징 1~86 중 어느 하나의 항체; 및
제약상 허용가능한 부형제.
88.
특징 87에 있어서, 상기 제약 조성물은 정맥내 전달에 적합하게 된, 제약 조성물.
89.
특징 87에 있어서, 상기 제약 조성물은 피하 전달에 적합하게 된, 제약 조성물.
90.
특징 1~86 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
91.
특징 90의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
92.
특징 91의 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, CHO 세포).
93.
특징 1~86 중 어느 하나의 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는, 방법:
항체의 발현을 허용하는 조건 하에 특징 92에 따른 세포(예를 들어, CHO 세포)를 성장시키는 단계; 및
세포 및/또는 세포를 성장시킨 세포 배양 배지로부터 항체를 단리하는 단계
94.
특징 1~86 중 어느 하나의 항체의 제조 방법으로서, 트랜스제닉 동물(예를 들어, 트랜스제닉 래트, UniRatTM 동물)을 IL2R로 면역화하는 단계 및 IL2R-결합 중쇄 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
95.
질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트로서, 다음을 포함하는, 키트:
특징 1~86 중 어느 하나의 항체, 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물; 및
사용 설명서.
96.
특징 95에 있어서, 하나 이상의 추가 시약을 더 포함하는, 키트.
97.
특징 96에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 시약은 화학요법 약물을 포함하는, 키트.
98.
질환 또는 장애의 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 유효 용량의 특징 1~86 중 어느 하나의 항체, 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
99.
특징 98에 있어서, 항체 또는 제약 조성물을 다른 치료 과정과 함께 투여하는, 방법.
100.
특징 98 또는 99에 있어서, 항체 또는 제약 조성물을 화학요법 섭생법과 함께 투여하는, 방법.
101.
질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 특징 1~86 중 어느 하나의 항체의 용도.
102.
특징 101에 있어서, 의약은 다른 치료 과정과 함께 투여하고자 하는 것인, 용도.
103.
특징 101 또는 102에 있어서, 의약은 화학요법 섭생법과 함께 투여하고자 하는 것인, 용도.
104.
질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 특징 1~86 중 어느 하나의 항체, 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물.
105.
특징 104에 있어서, 상기 항체 또는 제약 조성물은 다른 치료 과정과 함께 사용하고자 하는 것인, 항체 또는 제약 조성물.
106.
특징 104에 있어서, 상기 항체 또는 제약 조성물은 화학요법 섭생법과 함께 사용하고자 하는 것인, 항체 또는 제약 조성물.
107.
특징 95~106 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 장애는 암인, 키트, 방법, 용도, 항체, 또는 제약 조성물.
108.
특징 107에 있어서, 암은 진행성 또는 전이성 암인, 키트, 방법, 용도, 항체, 또는 제약 조성물.
109.
특징 107 또는 108에 있어서, 암은 고형 종양 암인, 키트, 방법, 용도, 항체, 또는 제약 조성물.
110.
특징 109에 있어서, 고형 종양 암은 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암으로부터 선택되는, 키트, 방법, 용도, 항체, 또는 제약 조성물.
111.
특징 107 또는 108에 있어서, 암은 액상 암인, 키트, 방법, 용도, 항체, 또는 제약 조성물.
112.
특징 111에 있어서, 액성 암은 다발성 골수종 또는 급성 골수성 백혈병인, 키트, 방법, 용도, 항체, 또는 제약 조성물.
113.
면역 세포에서의 IL2R 신호전달의 자극 방법으로서, 면역 세포를 특징 1~86 중 어느 하나의 항체, 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
114.
면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체성 수용체 복합체의 자극 방법으로서, 면역 세포를 특징 1~86 중 어느 하나의 항체, 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
115.
특징 113 또는 114에 있어서, 면역 세포는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포로부터 선택되는, 방법.
116.
면역 세포에서의 IL2R 신호전달의 자극을 필요로 하는 개체에서 면역 세포에서의 IL2R 신호전달의 자극을 의약의 제조에 있어서의 특징 1~86 중 어느 하나의 항체의 용도.
117.
면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체성 수용체 복합체의 자극을 필요로 하는 개체에서 면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체성 수용체 복합체의 자극을 위한 의약의 제조에 있어서의 특징 1~86 중 어느 하나의 항체의 용도.
118.
특징 116 또는 117에 있어서, 면역 세포는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포로부터 선택되는, 용도.
119.
면역 세포에서의 IL2R 신호전달의 자극 방법에 사용하기 위한 특징 1~86 중 어느 하나의 항체 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물.
120.
면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체성 수용체 복합체의 자극 방법에 사용하기 위한 특징 1~86 중 어느 하나의 항체 또는 특징 87~89 중 어느 하나의 제약 조성물.
121.
특징 119 또는 120에 있어서, 면역 세포는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포로부터 선택되는, 항체 또는 제약 조성물.
비제한적인 예시적 실시 형태(세트 2)
제한 없이, 본 발명의 일부 예시적인 실시 형태/조항은 다음을 포함한다:
1.
IL2RB에 결합하는 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
서열 번호 1~3 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 4~6 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 7~10 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR3 서열.
2.
조항 1에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 인간 프레임워크에 존재하는, 중쇄-단독 항체.
3.
조항 1 또는 2에 있어서, CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 더 포함하는, 중쇄-단독 항체.
4.
조항 1~3 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
5.
조항 4에 있어서, 다음을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및
(b)
서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및
(c)
서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
6.
조항 5에 있어서, 다음을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 7의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열.
7.
조항 1~5 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 11~14 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상인 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
8.
조항 7에 있어서, 서열 번호 11~14로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
9.
IL2RB에 결합하는 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
(b)
하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
(c)
하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서, X3은 G 또는 A이고;
X4는 S 또는 Q이고;
X5는 S 또는 T임).
10.
IL2RB에 결합하는 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
(b)
하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
(c)
하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임).
11.
조항 9~10 중 어느 하나에 있어서, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재하는, 중쇄-단독 항체.
12.
IL2RG에 결합하는 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
서열 번호 15~16 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 17~19 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 20~21 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR3 서열.
13.
조항 12에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 인간 프레임워크에 존재하는, 중쇄-단독 항체.
14.
조항 12 또는 13에 있어서, CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 더 포함하는, 중쇄-단독 항체.
15.
조항 12~14 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b)
서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c)
서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
16.
조항 15에 있어서, 다음을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및
(b)
서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및
(c)
서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
17.
조항 16에 있어서, 다음을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열.
18.
조항 12~16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 22~25 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상인 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
19.
조항 18에 있어서, 서열 번호 22~25로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
20.
IL2RG에 결합하는 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 중쇄-단독 항체:
(a)
하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서, X1은 T 또는 I이고;
X2는 F 또는 V이고;
X3은 S, N, 또는 G이고;
X4는 D 또는 N임);
(b)
하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서, X5는 S 또는 N이고;
X6은 D, S, G, 또는 N이고;
X7은 T 또는 I임); 및
(c)
서열 ARGDAVSITGDY (서열 번호 20)를 포함하는 CDR3 서열.
21.
조항 20에 있어서, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재하는, 중쇄-단독 항체.
22.
조항 1~21 중 어느 하나에 있어서, 다중특이성인, 중쇄-단독 항체.
23.
조항 22에 있어서, 이중특이성인, 중쇄-단독 항체.
24.
조항 22 또는 23에 있어서, IL2RB 및 IL2RG에 결합하는, 중쇄-단독 항체.
25.
조항 1~24 중 어느 하나에 있어서, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 중쇄-단독 항체.
26.
조항 25에 있어서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
27.
조항 25에 있어서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
28.
조항 25~27 중 어느 하나에 있어서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
29.
조항 25~27 중 어느 하나에 있어서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
30.
조항 25~29 중 어느 하나에 있어서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
31.
조항 25~29 중 어느 하나에 있어서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
32.
조항 25~29 중 어느 하나에 있어서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하는, 중쇄-단독 항체.
33.
조항 22~32 중 어느 하나에 있어서, IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 하는, 중쇄-단독 항체.
34.
이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는, 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 7의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 17의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
35.
조항 34에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
36.
조항 35에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함하는, 항체.
37.
조항 36에 있어서, 서열 번호 53을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 61을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
38.
이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는, 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
39.
조항 38에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
40.
조항 39에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하는, 항체.
41.
조항 40에 있어서, 서열 번호 62를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 63을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
42.
이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는, 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 2의 CDR1 서열;
서열 번호 5의 CDR2 서열; 및
서열 번호 9의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
43.
조항 42에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
44.
조항 43에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하는, 항체.
45.
조항 44에 있어서, 서열 번호 64를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 65를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
46.
이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는, 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 3의 CDR1 서열;
서열 번호 6의 CDR2 서열; 및
서열 번호 10의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 17의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
47.
조항 46에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
48.
조항 47에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함하는, 항체.
49.
조항 48에 있어서, 서열 번호 66을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
50.
이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는, 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 16의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
51.
조항 50에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
52.
조항 51에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24를 포함하는, 항체.
53.
조항 52에 있어서, 서열 번호 34를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
54.
이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체로서, 다음을 포함하는, 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 19의 CDR2 서열; 및
서열 번호 21의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
55.
조항 54에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
56.
조항 55에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25를 포함하는, 항체.
57.
조항 56에 있어서, 서열 번호 36을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 37을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
58.
조항 1~57 중 어느 하나의 항체를 포함하는 제약 조성물.
59.
조항 1~57 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
60.
조항 59의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
61.
조항 60의 벡터를 포함하는 세포.
62.
조항 1~57 중 어느 하나의 항체의 제조 방법으로서, 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 조항 61에 따른 세포를 성장시키는 단계, 및 세포 및/또는 세포를 성장시킨 세포 배양 배지로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
63.
조항 1~57 중 어느 하나의 항체의 제조 방법으로서, UniRat 동물을 IL2R로 면역화하는 단계, 및 IL2R 결합 중쇄 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
64.
질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트로서, 조항 1~57 중 어느 하나의 항체 또는 조항 58의 제약 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는, 키트.
65.
조항 64에 있어서, 하나 이상의 추가 시약을 더 포함하는, 키트.
66.
조항 65에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 시약은 화학요법 약물을 포함하는, 키트.
67.
치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 유효 용량의 조항 1~57 중 어느 하나의 항체, 또는 조항 58의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
68.
질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 조항 1~57 중 어느 하나의 항체의 용도.
69.
필요로 하는 개체에서 요법에서 사용하기 위한, 조항 1~57 중 어느 하나의 항체, 또는 조항 58의 제약 조성물.
70.
암의 치료 방법으로서, 상기 암을 앓고 있는 대상체에게 조항 1~57 중 어느 하나의 항체, 또는 조항 58의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
71.
조항 67~70 중 어느 하나에 있어서, 암은 진행성 또는 전이성 암인, 방법 또는 용도.
72.
조항 67~71 중 어느 하나에 있어서, 암은 고형 종양 암인, 방법 또는 용도.
73.
조항 72에 있어서, 고형 종양 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 용도: 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암.
74.
면역 세포에서의 IL2R 신호전달의 자극 방법으로서, 면역 세포를 조항 1~57 중 어느 하나의 항체, 또는 조항 58의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
75.
면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체성 수용체 복합체의 자극 방법으로서, 면역 세포를 조항 1~57 중 어느 하나의 항체, 또는 조항 58의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
76.
조항 74 또는 75에 있어서, 면역 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포.
인터루킨-2 수용체로도 알려진 IL-2R은 다양한 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 이종이량체 단백질이며, 이는 인터루킨 2(IL-2)에 대한 동족 리간드로서의 역할을 한다. IL-2R 복합체는 IL-2Rα(ILR2A), IL-2Rβ(IL2RB) 및 IL-2Rγ(IL2RG) 단백질 사슬의 다양한 조합으로 구성된다. IL-2RA는 CD25로도 지칭되며, 인간 IL2RA 서열(UniProtKB 번호 P01589)은 본원에서 서열 번호 38로 제공된다. IL-2RB는 CD122로도 지칭되며, 인간 IL2RB 서열(UniProtKB 번호 P14784)은 본원에서 서열 번호 39로 제공된다. IL-2RG는 CD132로도 지칭되며, 인간 IL2RG 서열(UniProtKB 번호 P31785)은 본원에서 서열 번호 40으로 제공된다. 인간 IL-2 서열(UniProtKB 번호 P60568)은 본원에서 서열 번호 41로 제공된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RB에 결합하는 항체에 관한 것이다: (a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및 (b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 7의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 인간 VH 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 11~14 중 어느 하나에서 6개 이하(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하; 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개, 0개)의 치환을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 11~14 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)인 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 11~14로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RB에 결합하는 항체를 포함한다:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
(c) 하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서, X3은 G 또는 A이고; X4는 S 또는 Q이고; X5는 S 또는 T임).
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RB에 결합하는 항체를 포함한다:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
(c) 하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임).
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RG에 결합하는 항체를 포함한다: (a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및 (b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 22~25 중 어느 하나에서 6개 이하(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하; 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개, 0개)의 치환을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 22~25 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)인 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 22~24로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RG에 결합하는 항체를 포함한다:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서, X1은 T 또는 I이고; X2는 F 또는 V이고; X3은 S, N, 또는 G이고; X4는 D 또는 N임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서, X5는 S 또는 N이고; X6은 D, S, G, 또는 N이고; X7은 T 또는 I임); 및
(c) 서열 ARGDAVSITGDY (서열 번호 20)를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역 함유 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 불변 영역은 CH1 서열을 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 7의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 17의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 53을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 61을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 18의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 62를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 63을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 2의 CDR1 서열; 서열 번호 5의 CDR2 서열; 및 서열 번호 9의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 18의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 64를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 65를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 3의 CDR1 서열; 서열 번호 6의 CDR2 서열; 및 서열 번호 10의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 17의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 66을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 16의 CDR1 서열; 서열 번호 18의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 34를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 19의 CDR2 서열; 및 서열 번호 21의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 단리된 인간 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG1 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG2 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 온전한 IgG4 분자의 면역학적 활성 부분이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 3쇄 항체-유사 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 중쇄-단독 항체이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 36을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 37을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
통상적인 IgG 항체에서, 중쇄와 경쇄의 회합은 부분적으로 경쇄 불변 영역과 중쇄의 CH1 불변 도메인 사이의 소수성 상호작용에 기인한다. 중쇄 프레임워크 2(FR2) 및 프레임워크 4(FR4) 영역에는 중쇄와 경쇄 사이의 이러한 소수성 상호작용에 또한 기여하는 추가 잔기가 있다.
그러나, 낙타과(낙타, 단봉 낙타, 및 라마를 포함하는 틸로포다(Tylopoda) 아목)의 혈청에는 쌍을 이룬 H-사슬만으로 구성된 주요 유형의 항체(중쇄-단독 항체 또는 HCAb)가 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 낙타과(Camelidae)(카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius), 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus), 라마 글라마(Lama glama), 라마 구아나코(Lama guanaco), 라마 알파카(Lama alpaca), 및 라마 비쿠냐(Lama vicugna))의 중쇄-단독 항체는 단일 가변 도메인(VHH), 힌지 영역, 및 고전적 항체의 CH2 및 CH3 도메인과 매우 상동성인 2개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)으로 이루어진 고유의 구조를 가지고 있다. 이러한 중쇄-단독 항체에는 제1 불변 영역 도메인(CH1)이 없으며, 이는 게놈에 존재하지만 mRNA 프로세싱 중에 스플라이싱되어 제거된다. CH1 도메인은 경쇄의 불변 도메인에 대한 고정 위치이므로, 이 도메인의 부재는 중쇄-단독 항체에서의 경쇄의 부재를 설명한다. 이러한 중쇄-단독 항체는 통상적인 항체 또는 이의 단편으로부터의 3개의 CDR에 의해 항원 결합 특이성과 높은 친화성을 부여하도록 자연적으로 진화되었다. 문헌[Muyldermans, 2001]; 문헌[J Biotechnol 74:277-302]; 문헌[Revets et al., 2005]; 문헌[Expert Opin Biol Ther 5:111-124]. 상어와 같은 연골 어류는 또한, 폴리펩티드 경쇄가 없고 전부 중쇄로 구성된, IgNAR로 명명된 독특한 유형의 면역글로불린을 진화시켰다. IgNAR 분자는 분자 공학에 의해 조작되어 단일 중쇄 폴리펩티드의 가변 도메인(vNAR)을 생성할 수 있다. 문헌[Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003)]; 문헌[Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004)]; 문헌[Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)].
경쇄가 없는 중쇄-단독 항체가 항원에 결합하는 능력은 1960년대에 확립되었다(문헌[Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195]). 경쇄로부터 물리적으로 분리된 중쇄 면역글로불린은 사량체 항체에 비해 항원 결합 활성의 80%를 유지하였다. 문헌[Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790]에서는 재배열된 마우스 μ 유전자로부터의 CH1 도메인의 제거가 포유류 세포 배양에서 경쇄가 없는 중쇄-단독 항체의 생성을 초래함이 입증되었다. 생성된 항체는 VH 결합 특이성과 이펙터 기능을 유지하였다.
높은 특이성 및 친화성을 갖는 중쇄 항체가 면역화를 통해 다양한 항원에 대해 생성될 수 있고(문헌[van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)]), VHH 부분이 효모에서 쉽게 클로닝되고 발현될 수 있다(문헌[Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)]). 이들의 발현, 용해도, 및 안정성 수준은 고전적인 F(ab) 또는 Fv 단편보다 유의하게 더 높다. 문헌[Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)].
λ(람다) 경(L)쇄 유전자좌 및/또는 λ 및 κ(카파) L쇄 유전자좌가 기능적으로 침묵된 마우스 및 이러한 마우스에 의해 생성된 항체는 미국 특허 7,541,513호 및 8,367,888호에 기재되어 있다. 마우스 및 래트에서의 중쇄-단독 항체의 재조합적 생성은 예를 들어 WO 2006008548; 미국 특허 출원 공개 제20100122358호; 문헌[Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101]; 문헌[ et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90]; 및 문헌[Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271-3283]에 보고된 바 있다. 징크 핑거 뉴클레아제의 배아 미세주입을 통한 녹아웃 래트의 생성은 문헌[Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433]에 기재되어 있다. 가용성 중쇄-단독 항체 및 이러한 항체를 생성하는 이종성 중쇄 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 설치류가 미국 특허 제8,883,150호 및 제9,365,655호에 기재되어 있다. 결합(표적화) 도메인으로서 단일-도메인 항체를 포함하는 CAR-T 구조는 예를 들어 문헌[Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641] 및 문헌[Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386]에 기재되어 있다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RB에 결합하는 중쇄 단독 항체를 포함한다: (a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및 (b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 7의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 인간 VH 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 서열 번호 11~14 중 어느 하나에서 6개 이하(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하; 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개, 0개)의 치환을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 서열 번호 11~14 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)인 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 서열 번호 11~14로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RB에 결합하는 중쇄 단독 항체를 포함한다:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
(c) 하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서, X3은 G 또는 A이고; X4는 S 또는 Q이고; X5는 S 또는 T임).
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RB에 결합하는 중쇄 단독 항체를 포함한다:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
(c) 하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임).
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RG에 결합하는 중쇄 단독 항체를 포함한다: (a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나에서 2개 이하(예를 들어, 0, 1, 또는 2개)의 치환을 갖는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및 (b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 서열 번호 22~25 중 어느 하나에서 6개 이하(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하; 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개, 0개)의 치환을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 서열 번호 22~25 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)인 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 서열 번호 22~25로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, IL2RG에 결합하는 중쇄 단독 항체를 포함한다:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서, X1은 T 또는 I이고; X2는 F 또는 V이고; X3은 S, N, 또는 G이고; X4는 D 또는 N임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서, X5는 S 또는 N이고; X6은 D, S, G, 또는 N이고; X7은 T 또는 I임); 및
(c) 서열 ARGDAVSITGDY (서열 번호 20)를 포함하는 CDR3 서열.
일부 실시 형태에서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 불변 영역은 CH1 서열을 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 한다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 7의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 17의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 서열 번호 53을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 61을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 18의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 서열 번호 62를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 63을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 2의 CDR1 서열; 서열 번호 5의 CDR2 서열; 및 서열 번호 9의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 18의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 서열 번호 64를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 65를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 3의 CDR1 서열; 서열 번호 6의 CDR2 서열; 및 서열 번호 10의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 17의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 서열 번호 66을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 16의 CDR1 서열; 서열 번호 18의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 서열 번호 34를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 다음을 포함하는 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체를 포함한다:
IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 19의 CDR2 서열; 및 서열 번호 21의 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재한다.
일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25에 대한 서열 동일성이 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 약 80% 이상(예를 들어, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상)의 상동성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 이종이량체화 변경을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 놉 및 홀 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 또는 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환(예를 들어, 변이체 IgG1 Fc 영역에서, 1) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 2) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 3) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 4) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 5) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 6) 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 전하쌍 치환(예를 들어, 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 또는 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 침묵된 Fc 영역이다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 글리코실화를 변경하는 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 이펙터리스 돌연변이(예를 들어, N297A, N297G, DANA 돌연변이(D265A+N297A), 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)(CH2 영역에서))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 침묵된 Fc 영역은 K322A 및 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인은 F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 T366S, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 서열 번호 36을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 37을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tm 및 약 55℃ 내지 약 65℃의 Tagg를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M(예를 들어, 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 10-6 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 10-8 M; 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-9 M; 약 10-10 M 내지 대략적으로 약 10-9 M)의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고, 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 동역학 모드에서 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 포함하는 ForteBio Octet Qk384 기기를 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, Kd는 본원 실시예에 기재된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체)를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체)를 생성하는 방법을 포함하며, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포를 항체의 발현이 허용되는 조건 하에 성장시키는 단계, 및 세포 및/또는 세포를 성장시킨 세포 배양 배지로부터 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 제조하는 방법을 포함하며, 본 방법은 IL2R로 UniRatTM 동물을 면역화하는 단계, 및 IL2R 결합 중쇄 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태는 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 키트를 포함하며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물, 및 사용 설명서를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 추가 시약은 화학요법 약물을 포함한다.
본 발명의 양태는 치료 방법을 포함하며, 이는 필요로 하는 개체에게 유효 용량의 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태는 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체)의 용도를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 진행성 또는 전이성 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은 액상 암, 예를 들어 다발성 골수종 또는 급성 골수성 백혈병이다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시 형태에서, 고형 종양 암은 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태는 필요로 하는 개체에서 요법에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 포함한다.
본 발명의 양태는 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 진행성 또는 전이성 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은 액상 암, 예를 들어 다발성 골수종 또는 급성 골수성 백혈병이다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시 형태에서, 고형 종양 암은 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태는 암의 치료 방법을 포함하며, 이는 상기 암을 앓고 있는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 진행성 또는 전이성 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은 액상 암, 예를 들어 다발성 골수종 또는 급성 골수성 백혈병이다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시 형태에서, 고형 종양 암은 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태는 면역 세포에서 IL2R 신호전달을 자극하는 방법을 포함하며, 본 방법은 면역 세포를 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태는 면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체 수용체 복합체의 자극 방법을 포함하며, 본 방법은 면역 세포를 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 중쇄-단독 항체; 이중특이성 작용성 항-IL2R 중쇄-단독 항체), 또는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 면역 세포는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 양태 및 추가 양태는 실시예를 포함하여 본 명세서의 나머지 부분에서 추가로 설명될 것이다.
도 1은 인간 및 시노몰구스 IL2RB 및 IL2RG에 대한 열거된 이중특이성 항체 구축물의 결합 동역학을 요약한 표이다.
도 2a~도 2c는 50 nM에서 1시간 동안 다음으로 처리된 인간 PBMC로부터의 CD8+ T-세포에서의 인산화된 STAT5(pSTAT5)의 유도 배수를 도시하는 일련의 히트맵 표이다: 항-IL2Rβ/γ 이중특이성 UniAbsTM(도 2a); 1:1 혼합물 형태의 또는 단일 제제로서의 항-IL2Rβ 및 항-IL2Rγ 단일특이성 UniAbsTM(도 2b); 또는 대조군으로서 Il-2(도 2c). pSTAT5 수준을 유세포 분석법으로 측정하고, 비자극 세포의 gMFI에 대한 기하 평균 형광 강도(gMFI)로 보고하였다.
도 3a~도 3c는 도시된 이중특이성 항체 구축물에 대한 농도의 함수로서의 표시된 세포 유형의 세포 결합을 보여주는 일련의 그래프이다. 세포 결합을 유세포 분석법으로 측정하고, 2차 검출 항체만으로 염색된 세포의 gMFI에 대한 기하 평균 형광 강도(gMFI)로 보고하였다.
도 4a~도 4e는 도시된 이중특이성 항체 구축물 및 대조 분자(IL-2 및 IL-2 변이체)에 대한 농도의 함수로서의 인간 및 시노 PBMC에서의 STAT5 인산화 용량 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. pSTAT5 수준을 유세포 분석법으로 측정하고, 표시된 세포 유형의 백분율로 보고하였다.
도 5a~도 5d는 도시된 이중특이성 항체 구축물 및 대조 분자(IL-2 및 IL-2 변이체)에 대한 농도의 함수로서의 표시된 인간 세포에서의 증식(Ki67 용량 곡선)을 보여주는 일련의 그래프이다. Ki67 수준을 유세포 분석법으로 측정하고, 표시된 세포 유형의 백분율로 보고하였다.
도 6a~도 6d는 도시된 이중특이성 항체 구축물 및 대조 분자(IL-2)에 대한 농도의 함수로서의 인간 전혈에서의 사이토카인 분비를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 7a~도 7b는 표시된 이중특이성 항체 구축물에 대한 세포 내재화 데이터를 제공한다. 도 7a에는 인간 PBMC로부터의 CD8+ T-세포에 의한 표시된 항-IL2Rβ/γ UniAbs의 내재화가 시간의 함수로서 도시되어 있다. 도 7b에는 이 데이터가 표 형식으로 도시되어 있다. UniAb의 표면 수준을 유세포 분석법으로 탐지하고, 내재화되지 않은 세포와 비교하여 보고하였다. 관찰된 반감기는 0.27시간 내지 0.81시간의 범위였다. 여기서 관찰된 바와 같이, 내재화는 잠재적으로 이중특이성 항체의 특정 항-IL2RG 아암에 부분적으로 의존하였으며, 그 이유는 IL2RG_F16B 결합 서열을 포함하는 분자가 다른 항-IL2RG 결합 서열을 함유하는 분자보다 더 빠르고 더 큰 정도로 내재화되었기 때문이다.
도 8a~도 8b는 마우스 모델 PK 데이터를 그래픽(도 8a) 및 표(도 8b) 형식으로 제공한다. BALB/c 마우스(시점당 군당 n=3)에게 표시된 항-IL2Rβ/γ UniAbs 1mg/kg을 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 혈청을 2주에 걸쳐 6개 시점에서 수집하고, 인간 IgG4에 대해 ELISA로 함께 테스트하였다. 결과를 시간의 함수(도 8a) 또는 표 형식(도 8b)으로 나타낸다.
도 9는 표시된 이중특이성 항체 구축물의 여러 특성을 요약한 표이다. 모든 구축물은 ExpiCHO 발현 시스템에서 발현되었으며, 2단계 정제되었다. 열 스트레스 후 SE-HPLC에 의한 응집 퍼센트를 기반으로 하여 안정성을 결정하였다. UNcle 플랫폼을 사용하여 Tm 및 Tagg를 측정하였다. SE-HPLC 실험의 경우, 20 μg의 단백질이 TSK 겔 G3000 5 μm 컬럼에서 러닝되었다(run).
도 10a~도 10c는 GVHD의 마우스 모델로부터의 요약 데이터를 제공한다. 방사선 조사된 NSG 마우스(치료군당 5마리)에게 각각 2천만 개의 인간 PBMC를 생착시켰다. 그 후, 동물을 희생시킬 때까지(체중 20% 감소) 비히클 단독(100 μL)으로 처리하거나, 22 μg의 rhIL-2로 매일 처리하거나, 또는 상기 두 가지 표시된 이중특이성 항체 구축물(1 mg/kg)(100 μL) 중 하나로 일주일에 2회 처리하였다. 도 10a는 GVHD의 마우스 모델 및 후속 투약 스킴에 대한 개요를 제공한다. 도 10b는 표시된 실험군에 대한 시간의 함수로서의 동물 체중을 보여준다. 도 10c는 5일차의 치료 후에 수확된 연구에서의 마우스의 비장으로부터의 세포의 분석을 도시한다. CD8+ T-세포 및 CD4+ T-세포의 증식을 상이한 림프구 집단들에서의 CSFE 염색의 측정에 의해 상기 4개 치료군 간에 비교하였다. 상기 2가지의 테스트된 이중특이성 항체 구축물(IL2RB_F09C**IL2RG_F16A (BsAb-1) 및 IL2RB_F09G**IL2RG_F16B (BsAb-2)) 둘 모두는 rhIL-2 및 비히클 대조군과 비교하여 유의하게 더 많은 증식 CD8+ T-세포를 보여주었다. CD4+ T-세포는 더 적은 정도로 확장되었지만; IL2RB_F09G**IL2RG_F16B (BsAb-2) 처리 마우스에서 증식 CD4+ T-세포의 유의한 증가가 관찰되었다(비히클 대조군과 비교하여)(도 10c). 데이터는 사이토카인 수용체 작용제가 생체 내에서 면역 이펙터의 활성화 및 증식을 촉진하고 huPBMC 생착 NSG 마우스에서 GVHD를 가속화함(사이토카인 대조군과 유사한 속도로)을 입증한다.
도 11a~도 11j는 비-GLP 시노몰구스 원숭이 연구로부터의 생체 내 약력학(PD) 데이터를 요약한 일련의 그래프이다. 도 11a~도 11e는 표시된 세포 유형의 백분율을 투여 후 시간의 함수로 도시한다. 도 11f~도 11j는 혈액의 1 μL당 표시된 세포 유형의 농도(x105)를 투여 후 시간의 함수로서 도시한다. 도 11k는 CD8+ T-세포 대 CD4+ T-세포의 비를 투여 후 시간의 함수로서 보여준다.
도 12a는 표시된 이중특이성 항체에 대한 시간(일)의 함수로서의 혈청 농도를 보여주는 그래프이다. 도 12b는 분자, 용량 및 반감기(t1/2) 정보를 보여주는 표이다.
도 13은 가속화 GVHD 모델에서 동물에 대한 시간(연구일)의 함수로서의 체중(%)을 보여주는 그래프이다.
도 14는 가속화 GVHD 모델에서 동물에 대한 시간(연구일)의 함수로서의 생존 확률을 보여주는 그래프이다.
도 15a~도 15c는 치료 후 5일에 측정되고 치료군으로 분리된 표시된 세포 유형의 세포 증식을 보여주는 그래프의 컬렉션이다. 도 15a는 CD8+ T-세포에 대한 결과를 보여주고, 도 15b는 CD4+ T-세포에 대한 결과를 보여주며, 도 15c는 NK-세포에 대한 결과를 보여준다.
도 16a~도 16l은 표시된 투여 조건 하에서 표시된 세포 유형에 대한 세포 증식 및 절대 세포 농도를 시간의 함수로 보여주는 그래프의 컬렉션이다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; 문헌["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; 문헌["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; 문헌["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; 문헌["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; 문헌["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]; 문헌[Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)]; 및 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988)]에 충분히 설명되어 있다.
달리 표시되지 않는 한, 본원의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
하기 설명에서, 본 발명의 보다 철저한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 이러한 특정 세부사항 중 하나 이상 없이 본 발명이 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 당업자에게 잘 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 인용된 참고 문헌과 본원에 제공된 정의 사이에 정의의 임의의 불일치가 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 우선시된다.
정의:
일부 실시 형태에서, "약"은 측정가능한 수치 변수와 관련하여 사용될 때 표시된 변수 값과 표시된 값의 실험 오차 이내(예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 구간 이내) 또는 표시된 값의 ±10% 이내(둘 중 더 큰 값)에 있는 모든 변수 값을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 수치 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 10분의 1 단위까지의 각 중간 값 및 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 중간 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한도 명시된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계의 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
"포함하는"은 언급된 요소가 조성물/방법/키트에 필요하지만 청구범위 또는 실시 형태의 범위 내에서 조성물/방법/키트 등을 형성하기 위해 다른 요소가 포함될 수 있음을 의미한다.
"~로 본질적으로 이루어진"은 대상 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 명시된 재료 또는 단계로 기재된 조성물 또는 방법의 범위를 제한하는 것을 의미한다.
"~로 이루어진"은 청구범위 또는 실시 형태에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 조성물, 방법, 또는 키트에서 제외함을 의미한다.
본원의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템 및 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 가변 도메인의 잔기(대략적으로 중쇄의 잔기 1~113)를 언급하는 경우 Kabat 넘버링 시스템이 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급하는 경우 "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"가 일반적으로 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌에 보고된 EU 인덱스). "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
면역글로불린이라고도 하는 항체는 통상적으로 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하며, 중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 도메인은 서열이 가변적이므로, 일반적으로 가변 영역 도메인, 또는 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL) 도메인이라고 한다. 상기 두 도메인은 통상적으로 회합하여 특이적 결합 영역을 형성하고, 본원에서 논의하겠지만, 특이적 결합은 중쇄 단독 가변 서열로도 얻을 수 있으며, 다양한 비천연 배열의 항체가 당업계에 알려져 있고 사용된다.
"기능성" 또는 "생물학적 활성" 항체 또는 항원 결합 분자(예를 들어, 중쇄 단독 항체 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체, 및 3쇄 항체-유사 분자(TCA)(본원에 기재됨) 포함)는 구조적, 조절적, 생화학적, 또는 생물물리학적 이벤트에서 천연 활성 중 하나 이상을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들어, 기능성 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있으며, 결합은 결과적으로 신호 전달 또는 효소 활성과 같은 세포 또는 분자 이벤트를 유도하거나 변경할 수 있다. 기능성 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA는 또한 수용체의 리간드 활성화를 차단하거나 작용제 또는 길항제로 작용할 수 있다. 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA가 천연 활성 중 하나 이상을 발휘하는 능력은 폴리펩티드 사슬의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 비롯한 여러 요인에 따라 달라진다.
본원에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 단량체, 이량체, 다량체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 중쇄 단독 항체, 3쇄 항체, TCA, 단쇄 Fc(single chain Fv, scFv), 나노바디 등을 포함하며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편도 포함한다. 문헌[Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861]. 항체는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 다른 종에서 유래된 항체일 수 있다.
예를 들어, "항체"라는 용어는 전장 중쇄, 전장 경쇄, 온전한 면역글로불린 분자, 또는 이러한 폴리펩티드 중 임의의 것의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적의 항원 또는 이의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이러한 표적은 암세포, 또는 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 개시된 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스(감소 또는 강화된 이펙터 세포 활성을 제공하는 변경된 Fc 부분을 갖는 조작된 서브클래스 포함)일 수 있다. 대상 항체의 경쇄는 카파 경쇄(V카파) 또는 람다 경쇄(V람다)일 수 있다. 면역글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 면역글로불린은 주로 인간에서 유래된 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단(즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는, 상기 집단에 포함되는 개별 항체가 동일함)으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 본 발명에 따른 단클론 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 재조합 단백질 생산 방법(예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 통해 또한 제조될 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 바와 같이, "가변"이라는 용어는 항체 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간에 서열에 있어 광범위하게 다르고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합성 및 특이성에 사용된다는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되어 있지는 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역이라고 하는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 β-시트 구조를 연결(일부 경우에는 그 일부를 형성)하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 배열을 채택하는, 4개의 FR을 포함한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 아주 근접하게 함께 결합되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)에 대한 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 경우 "초가변 영역"이라는 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 잔기 31~35(H1), 50~65(H2) 및 95~102(H3))(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 중쇄 가변 도메인의 "초가변 루프" 잔기 26~32(H1), 53~55(H2) 및 96~101(H3)로부터의 아미노산 잔기(문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. 일부 실시 형태에서, "CDR"은 문헌[Lefranc, MP et al., IMGT, the International ImMunoGeneTics database, Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)]에 정의된 바와 같은 항체의 상보성 결정 영역을 의미한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역/CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
예시적인 CDR 표시가 본원에 예시되어 있지만; 당업자는 서열 가변성을 기반으로 하고 가장 일반적으로 사용되는 Kabat 정의를 비롯한 CDR의 다수의 정의가 일반적으로 사용된다는 것을 이해할 것이다(문헌[Zhao et al. "A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol Immunol. 2010;47:694-700] 참조). Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한다(문헌[Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989; 342:877-883]). 관심 있는 대안적 CDR 정의는 제한 없이, 각각이 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된 다음의 문헌에 개시된 것을 포함한다: 문헌[Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool." J Mol Biol. 2001;309:657-670]; 문헌[Ofran et al. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes." J Immunol. 2008;181:6230-6235]; 문헌[Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132-143]; 및 문헌[Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995;9:133-139.].
용어 "중쇄-단독 항체" 및 "중쇄 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 가장 광범위한 의미에서, 통상적인 항체의 경쇄가 결여된, 항체, 또는 항체의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 아암(arm)을 지칭한다(즉, "중쇄 항체"는 경쇄가 결여된 통상적인 항체 이외의 항체 형식 또는 항체의 단리된 부분으로 이루어질 수 있다). 이 용어는 구체적으로, CH1 도메인의 부재하에 VH 항원 결합 도메인 및 CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함하는 동종이량체 항체; 이러한 항체의 기능성 (항원 결합) 변이체, 가용성 VH 변이체, 1개의 가변 도메인(V-NAR) 및 5개의 C-유사 불변 도메인(C-NAR)의 동종이량체를 포함하는 Ig-NAR 및 이의 기능성 단편; 및 가용성 단일 도메인 항체(예를 들어, UniDabsTM)를 제한 없이 포함한다. 일 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 프레임워크 1, CDR1, 프레임워크 2, CDR2, 프레임워크 3, CDR3 및 프레임워크 4로 구성된 가변 영역 항원 결합 도메인으로 구성된다. 또 다른 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 또 다른 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄 단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절단된 중쇄-단독 항체가 또한 본원에 포함된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 및 적어도 하나의 CH(CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 중쇄-단독 항체는 2개의 중쇄가 디술피드 결합되거나 달리 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 부착된 이량체 형태일 수 있다. 중쇄-단독 항체는 IgG 서브클래스에 속할 수 있지만, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 서브클래스와 같은 다른 서브클래스에 속하는 항체도 본원에 포함된다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 서브타입에 속할 수 있다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG1 또는 IgG4 서브타입의 것이다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG4 서브타입의 것이다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG1 서브타입의 것이다. 이펙터 기능을 변경하는 CH 도메인의 변형은 본원에 추가로 설명된다. 중쇄 항체의 비제한적인 예는 예를 들어 WO2018/039180에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 중쇄-단독 항체는 키메라 항원 수용체(CAR)의 결합 (표적화) 도메인으로서 사용된다. 이 정의는 구체적으로 인간 면역글로불린 트랜스제닉 래트(예를 들어, UniRatTM)에 의해 생성되는 인간 중쇄-단독 항체, 예를 들어, UniAbsTM를 포함한다. UniAbsTM의 가변 영역(VH)은 UniDabsTM라고 하며, 다중특이성, 증가된 효력 및 연장된 반감기를 갖는 신규 치료제의 개발을 위해 Fc 영역 또는 혈청 알부민에 연결될 수 있는 다용도의 빌딩 블록이다. 동종이량체 UniAbsTM는 경쇄가 없고 따라서 VL 도메인이 없기 때문에, 항원은 하나의 단일 도메인, 즉 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인(VH 또는 VHH)에 의해 인식된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "온전한 항체 사슬"은 전장 가변 영역 및 전장 불변 영역(Fc)을 포함하는 것이다. 온전한 "통상적인" 항체는 온전한 경쇄 및 온전한 중쇄를 포함할 뿐만 아니라, 분비형 IgG의 경우 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, 힌지, CH2 및 CH3을 포함한다. IgM 또는 IgA와 같은 다른 이소형은 다른 CH 도메인을 가질 수 있다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 온전한 항체는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있는데, 상기 이펙터 기능은 항체의 Fc 불변 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 및 세포 표면 수용체의 하향 조절을 포함한다. 불변 영역 변이체는 이펙터 프로파일, Fc 수용체에 대한 결합 등을 변경하는 것들을 포함한다.
중쇄의 Fc(불변 도메인)의 아미노산 서열에 따라, 항체 및 다양한 항원 결합 단백질은 상이한 클래스로서 제공될 수 있다. 중쇄 Fc 영역의 5가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 "서브클래스"(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 Fc 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다. Ig 형태는 힌지 변형 또는 힌지 무함유 형태를 포함한다. 문헌[Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090]; 문헌[Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256]; US 2005/0048572; US 2004/0229310. 모든 척추동물 종 유래의 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 κ(카파) 및 λ(람다)라는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 카파 경쇄 서열 또는 람다 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 이펙터 기능의 비제한적인 예는 C1q 결합; CDC; Fc-수용체 결합; ADCC; ADCP; 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 수용체, 예를 들어 FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB 수용체, 및 저친화성 FcRn 수용체와 상호작용하기 위해 Fc 영역을 필요로 하며; 당업계에 알려진 다양한 분석법을 사용하여 평가될 수 있다. "죽은" 또는 "침묵된" Fc는 예를 들어 혈청 반감기 연장과 관련하여 활성을 유지하도록 돌연변이되었지만, 고친화성 Fc 수용체를 활성화하지 않거나 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는 것이다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 예를 들어 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 알로타입); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역과, 이의 자연발생적 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상)의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열을 포함한다. 예시적으로, 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본원의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성, 예를 들어 약 85% 이상의 상동성, 예를 들어 약 90% 이상의 상동성, 예를 들어 약 95% 이상의 상동성, 예를 들어 약 99% 이상의 상동성을 가질 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이종이량체화 변경"은 이종이량체 Fc 영역, 즉 Fc 영역의 A 사슬과 B 사슬이 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 Fc 영역의 형성을 촉진하는 Fc 영역의 A 및 B 사슬(즉, Fc 영역에 포함되는 두 사슬(여기서, 하나의 사슬은 본원에서 "A" 사슬로 지칭되고 다른 하나의 사슬은 본원에서 "B" 사슬로 지칭됨)에서의 변경을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 비대칭적일 수 있으며, 즉 특정 변경을 갖는 A 사슬이 상이한 변경을 갖는 B 사슬과 쌍을 형성할 수 있다. 이러한 변경은 이종이량체화를 촉진하고 동종이량체화를 선호하지 않는다. 이종이량체 또는 동종이량체가 형성되었는지 여부는 예를 들어 하나의 폴리펩티드 사슬이 더미(dummy) Fc이고 다른 하나가 scFv-Fc인 상황에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정되는 바와 같은 크기 차이에 의해 평가될 수 있다. 이러한 쌍 형성 이종이량체화 변경의 한 가지 비제한적 예로는 소위 "놉 및 홀" 치환이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허 출원 공개 공보 제2003/0078385호를 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 한 쌍의 놉 및 홀 치환을 포함하는 Fc 영역은 A 사슬에 하나의 치환 및 B 사슬에 다른 치환을 포함한다. 예를 들어, IgG1 Fc 영역의 A 및 B 사슬에서의 다음의 놉 및 홀 치환은 비변형 A 및 B 사슬에서 발견된 것과 비교하여 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 본 발명의 비제한적 실시 형태에서 사용될 수 있다: 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 및 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V. 대안적으로 또는 이러한 변경에 더하여, 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환이 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 공보 제2003/0078385호를 참조한다. IgG1 Fc 영역에서의 이러한 변경은 다음의 치환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C. 추가로 또는 대안적으로, 예를 들어 CH3-CH3 인터페이스에서의 하나 이상의 잔기(들)의 전하를 변화시키는 치환은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 이종이량체 형성을 향상시킬 수 있다. 이러한 치환은 본원에서 "전하쌍 치환"으로 지칭되며, 한 쌍의 전하쌍 치환을 포함하는 Fc 영역은 A 사슬에서 하나의 치환 및 B 사슬에서 상이한 치환을 포함한다. 전하쌍 치환의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 사슬에 K409D 또는 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K 또는 D399R; 2) 하나의 사슬에 K392D 또는 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K 또는 D399R; 3) 하나의 사슬에 K439D 또는 K439E + 다른 하나의 사슬에 E356K 또는 E356R; 및 4) 하나의 사슬에 K370D 또는 K370E + 다른 하나의 사슬에 E357K 또는 E357R. 또한 두 사슬 모두에서의 치환 R355D, R355E, K360D 또는 K360R은 다른 이종이량체화 변경과 함께 사용될 때 이종이량체를 안정화시킬 수 있다. 특정 전하쌍 치환이 단독으로 또는 다른 전하쌍 치환과 함께 사용될 수 있다. 전하쌍 치환들의 단일 쌍 및 이들의 조합의 구체적인 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 및 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K. 이들 이종이량체화 변경 중 임의의 것이 본원에 기재된 바와 같은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 사용될 수 있다.
일부 비제한적 실시 형태에서, 변이체 Fc 서열은 EU 인덱스 위치 234, 235, 및 237에서 FcγRI 결합을 감소시키기 위해 CH2 영역에 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다(문헌[Duncan et al., (1988) Nature 332:563] 참조). EU 인덱스 위치 330 및 331에서의 보체 C1q 결합 부위에서의 2개의 아미노산 치환은 보체 고정을 감소시킨다(문헌[Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993)] 및 문헌[Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)] 참조). 위치 233~236에서의 인간 IgG1 또는 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331에서의 IgG4 잔기로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시킨다(예를 들어 문헌[Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24]; 및 문헌[Shields R.L. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604] 참조). 인간 IgG4 Fc 아미노산 서열(UniProtKB 번호 P01861)은 본원에서 서열 번호 76로 제공된다. 침묵된 IgG1은 예를 들어 문헌[Boesch, A.W., et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions." MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
제한 없이, 디술피드 결합을 형성할 수 있는 영역이 결실된 것, 또는 천연 Fc의 N-말단에서 특정 아미노산 잔기가 제거된 것, 또는 천연 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것을 포함하여, 다른 Fc 변이체가 가능하다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 항체의 하나 이상의 Fc 부분은 디술피드 결합을 제거하기 위해 힌지 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, Fc의 힌지 영역은 완전히 제거될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 항체는 Fc 변이체를 포함할 수 있다.
또한, Fc 변이체는 보체 결합 또는 Fc 수용체 결합을 일으키기 위해 아미노산 잔기를 치환(돌연변이)시키거나 결실시키거나 부가함으로써 이펙터 기능을 제거하거나 실질적으로 감소시키도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한 없이, 결실은 C1q-결합 부위와 같은 보체-결합 부위에서 발생할 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편의 이러한 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제 특허 공보 WO 97/34631호 및 WO 96/32478호에 개시되어 있다. 또한, Fc 도메인은 인산화, 황산화, 아실화, 글리코실화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화, 아미드화 등에 의해 변형될 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체는 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호 참조). 일부 실시 형태에서, 이펙터 기능이 감소된 변이체 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 포함하며, 이는 EU 넘버링에 따른 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환(즉, EU 넘버링에 따른 D265A 및 N297A)을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다(예를 들어 미국 특허 제7,332,581호 참조). 일부 실시 형태에서, 이펙터 기능이 감소된 변이체 Fc 영역은 다음의 2개의 아미노산 치환을 포함한다: D265A 및 N297A.
일부 실시 형태에서, 이펙터 기능은 글리코실화를 제거하는 불변 영역에서의 돌연변이, 예를 들어 "이펙터리스 돌연변이"를 통해 감소된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터리스 돌연변이는 CH2 영역에서의 N297A 또는 DANA 돌연변이(D265A+N297A)이다. 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001)]. 일부 실시 형태에서, 이펙터리스 돌연변이는 CH2 영역에서의 N297G 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)이다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 N297에서 글리코실화가 결여되어 있으며, 예를 들어 변이체 Fc 영역은 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 공보 WO 2014/153063에 기재된 바와 같이 N297에서 글리코실화가 결여된 변이체 Fc 영역이다. 대안적으로, 이펙터 기능이 감소되거나 제거되는 추가 돌연변이는 다음을 포함한다: K322A 및 L234A/L235A(LALA). 대안적으로, 이펙터 기능은 글리코실화되지 않는 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 이펙터 기능 촉진에 효과가 없거나 덜 효과적인 변경된 글리코실화 패턴을 초래하는 숙주 세포에서의 발현과 같은 생산 기술을 통해 감소되거나 제거될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003)]).
일부 실시 형태에서, 야생형 인간 Fc 영역의 위치 329(EU 넘버링)(P329)의 프롤린은 글리신 또는 아르기닌 또는 Fc/Fcγ 수용체 인터페이스 내의 프롤린 샌드위치를 파괴하기에 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환되는데, 상기 인터페이스는 Fc의 P329와 FcgRIII의 트립토판 잔기 W87 및 W110 사이에 형성된다(문헌[Sondermann et al., Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)]). 일부 추가 실시 형태에서, Fc 변이체 영역에서의 적어도 하나의 추가 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S이다. 일부 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 추가 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E(모두 EU 넘버링에 따름)이다(예를 들어, 미국 특허 제8,969,526호를 참조하며, 이는 그 전체가 참고로 포함됨).
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 인간 IgG Fc 영역의 P329가 글리신으로 치환된 것을 가지며, 여기서, 변이체 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E에서 적어도 2개의 추가 아미노산 치환을 포함하고, 상기 잔기들은 EU 넘버링에 따라 넘버링된다(예를 들어, 미국 특허 제8,969,526호 참조). 일부 실시 형태에서, P329G, L234A 및 L235A(EU 넘버링) 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역은 인간 FcγRIIIA 및 FcγRIIA에 대해 감소된 친화도를 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 다음의 삼중 돌연변이를 포함한다: 위치 P329에서의 아미노산 치환, L234A, 및 L235A 돌연변이(EU 넘버링에 따름)(P329/LALA)(예를 들어, 미국 특허 제8,969,526호 참조). 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 다음의 아미노산 치환을 포함한다: P329G, L234A, 및 L235A(EU 넘버링에 따름).
일부 실시 형태에서, 항체는 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하며, 이는 본원에서 선택적으로 IgG4 CH3 놉 서열로 지칭될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 T366S 돌연변이, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하며, 이는 본원에서 선택적으로 IgG4 CH3 홀 서열로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 IgG4 CH3 돌연변이를 임의의 적합한 방식으로 이용하여 항체 이량체에서 제1 단량체의 제1 중쇄 불변 영역 상에 "놉"을 배치하고 항체 이량체에서 제2 단량체의 제2 중쇄 불변 영역 상에 "홀"을 배치함으로써 항체에서 중쇄 폴리펩티드 서브유닛의 원하는 쌍의 적절한 쌍 형성(이종이량체화)을 촉진할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 및 T366W 돌연변이(놉)를 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 서브유닛을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, T366S 돌연변이, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이(홀)를 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 서브유닛을 포함한다.
"Fc 영역 포함 항체"라는 용어는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 중에 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합적 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체는 K447이 있거나 없는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 양태는 1가 또는 2가 배열의 중쇄-단독 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 중쇄-단독 가변 영역 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 "1가 배열"이라는 용어는 단지 하나의 중쇄-단독 가변 영역 도메인이 존재하여 단일 결합 부위를 갖게 됨을 의미한다. 이와는 대조적으로, 중쇄-단독 가변 영역 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 "2가 배열"이라는 용어는 2개의 중쇄-단독 가변 영역 도메인이 존재하고(각각 단일 결합 부위를 가짐), 링커 서열에 의해 연결되어 있음을 의미한다. 링커 서열의 비제한적인 예는 본원에서 추가로 논의되며, 다양한 길이의 GS 링커 서열을 제한 없이 포함한다. 중쇄-단독 가변 영역이 2가 배열인 경우, 2개의 중쇄-단독 가변 영역 도메인 각각은 동일한 항원에, 또는 상이한 항원들에(예를 들어, 동일한 단백질 상의 상이한 에피토프; 2가지의 상이한 단백질 등에) 결합할 수 있다. 그러나, 구체적으로 달리 언급하지 않는 한, "2가 배열"인 것으로 표시되는 중쇄-단독 가변 영역은 링커 서열에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄-단독 가변 영역 도메인을 포함하는 것으로 이해되며, 여기서, 상기 2개의 동일한 중쇄-단독 가변 영역 도메인 각각은 동일한 표적 항원에 결합한다.
본 발명의 양태는, 제한 없이 이중특이성, 삼중특이성 등의 배열을 포함하는, 다중특이성 배열을 갖는 항체를 포함한다. 매우 다양한 방법 및 단백질 배열이 공지되어 있으며, 이중특이성 단클론 항체(BsMAB), 삼중특이성 항체 등에서 사용된다.
2가지 이상의 항체의 가변 도메인들을 재조합적으로 융합함으로써 다가의 인공 항체를 생성하는 다양한 방법이 개발되었다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드 상의 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다. 이러한 폴리펩티드 링커의 하나의 비제한적인 예로는 4개의 글리신 잔기에 이어 1개의 세린 잔기의 아미노산 서열을 갖는 GS 링커가 있으며, 여기서, 상기 서열은 n회 반복되고, n은 1 내지 약 10(서열 번호 68)의 범위의 정수, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이다. 이러한 링커의 비제한적인 예는 GGGGS(서열 번호 49)(n=1) 및 GGGGSGGGGS(서열 번호 50)(n=2)를 포함한다. 다른 적합한 링커가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357-69]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
"3쇄 항체-유사 분자" 또는 "TCA"라는 용어는 3개의 폴리펩티드 서브유닛(이들 중 2개는 단클론 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄, 또는 항원 결합 영역 및 적어도 하나의 CH 도메인을 포함하는, 이러한 항체 사슬의 기능성 항원 결합 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어짐)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 항체-유사 분자를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 이 중쇄/경쇄 쌍은 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 제3 폴리펩티드 서브유닛은 CH1 도메인의 부재 하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분, 및 제2 항원의 에피토프 또는 제1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인)을 포함하는 중쇄-단독 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 이러한 결합 도메인은 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 동일성을 갖는다. 이러한 가변 영역의 부분은 VH 및/또는 VL 유전자 절편, D 및 JH 유전자 절편, 또는 JL 유전자 절편에 의해 코딩될 수 있다. 가변 영역은 재배열된 VHDJH, VLDJH, VHJL, 또는 VLJL 유전자 절편에 의해 코딩될 수 있다.
TCA 결합 화합물은, 본원에서 사용되는 바와 같이 중쇄 불변 영역 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4를 포함하지만 CH1 도메인을 포함하지 않는 단쇄 항체를 의미하는 "중쇄 단독 항체" 또는 "중쇄 항체" 또는 "중쇄 폴리펩티드"를 사용한다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 또 다른 실시 형태에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절단된 중쇄 항체가 또한 본원에 포함된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 및 적어도 하나의 CH(CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 중쇄-단독 항체는 2개의 중쇄가 디술피드 결합되거나 달리 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 부착된 이량체 형태일 수 있으며, 폴리펩티드 사슬 사이의 적절한 쌍 형성을 용이하게 하기 위해 CH 도메인 중 1개 이상 사이에 비대칭 인터페이스(예를 들어, 놉-인-홀(KiH) 인터페이스)를 선택적으로 포함할 수 있다. 중쇄 항체는 IgG 서브클래스에 속할 수 있지만, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 서브클래스와 같은 다른 서브클래스에 속하는 항체도 본원에 포함된다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 특히 IgG1 서브타입 또는 IgG4 서브타입이다. TCA 결합 화합물의 비제한적인 예는 예를 들어 WO2017/223111 및 WO2018/052503에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 양태는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 형성하는 중쇄-단독 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 가변 영역과 쌍을 형성하는 경쇄 가변 영역은 "고정 경쇄" 가변 영역으로 지칭된다. 특정 실시 형태에서, 항체는 2개의 중쇄-단독 가변 영역을 포함하며, 이들 각각은 고정 경쇄 가변 영역과 쌍을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 고정 경쇄 가변 영역 서열은 경쇄 불변 영역 서열에 연결되어 전장 항체 경쇄 폴리펩티드를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 2개의 전장 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 전장 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 전장 중쇄 폴리펩티드들은 상이한 서열들을 포함하는 반면, 전장 경쇄 폴리펩티드들은 동일한 서열을 포함한다(예를 들어, 상기 2개의 전장 경쇄 폴리펩티드들은 동일하다).
중쇄 항체는 낙타과, 예를 들어 낙타 및 라마에 의해 생성된 IgG 항체의 약 1/4를 구성한다(문헌[Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)]). 이러한 항체는 2개의 중쇄에 의해 형성되지만 경쇄는 없다. 결과적으로, 가변 항원 결합 부분은 VHH 도메인으로 지칭되며, 길이가 약 120개 아미노산에 불과한 가장 작은 자연발생적인, 온전한 항원 결합 부위를 나타낸다(문헌[Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)]). 높은 특이성 및 친화성을 갖는 중쇄 항체가 면역화를 통해 다양한 항원에 대해 생성될 수 있고(문헌[van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)]), VHH 부분이 효모에서 쉽게 클로닝되고 발현될 수 있다(문헌[Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)]). 이들의 발현, 용해도, 및 안정성 수준은 고전적인 F(ab) 또는 Fv 단편보다 유의하게 더 높다(문헌[Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)]). 또한 상어는 항체에 VNAR이라고 칭해지는 단일 VH-유사 도메인을 갖는 것으로 밝혀졌다. (문헌[Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003)]; 문헌[Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004)]; 문헌[Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)]).
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같은 용어 "IL2" 및 "IL-2"는 림프구에 의해 발현되는 IL2 수용체 복합체에 결합함으로써 특정 면역 세포의 활성을 조절하는 15.5 내지 16 kDa의 사이토카인 신호전달 단백질 분자인 인터루킨-2를 지칭한다. 용어 "IL2"는 임의의 인간 및 비인간 동물 종의 IL2 단백질을 포함하고, 구체적으로는 인간 IL2뿐만 아니라 비인간 포유류의 IL2를 포함한다. 인간 IL-2 서열(UniProtKB 번호 P60568)은 본원에서 서열 번호 41로 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 IL2"이라는 용어는 공급원 또는 제조 방식에 관계없이, 인간 IL2의 임의의 변이체, 이소형, 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, "인간 IL2"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 인간 IL2 및 인간 IL2 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 IL2를 포함한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같은 용어 "IL2R", "IL-2R", "IL2 수용체" 및 "IL-2 수용체"는 일반적으로 IL2 수용체 복합체를 지칭하며, 이는 알파, A 또는 α 사슬, 베타, B 또는 β 사슬 및 감마, G 또는 γ 사슬로 지칭되는 3개의 폴리펩티드 서브유닛 또는 사슬로 구성된다. 용어 "IL2R"은 임의의 인간 및 비인간 동물 종의 IL2 수용체 복합체의 임의의 서브유닛 또는 임의의 IL2R 단백질을 포함하며, 구체적으로는 인간 IL2R뿐만 아니라 비인간 포유류의 IL2R도 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 IL2R"이라는 용어는 공급원 또는 제조 방식에 관계없이, 인간 IL2R의 임의의 변이체, 이소형, 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, "인간 IL2R"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 인간 IL2R 및 인간 IL2R 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 IL2R을 포함한다.
용어 "IL2RA"는 CD25로도 지칭되며, 인간 IL2RA 서열(UniProtKB 번호 P01589)은 본원에서 서열 번호 38로 제공된다.
용어 "IL-2RB"는 CD122로도 지칭되며, 인간 IL2RB 서열(UniProtKB 번호 P14784)은 본원에서 서열 번호 39로 제공된다.
용어 "IL2RG" IL2RG는 CD132로도 지칭되며, 인간 IL2RG 서열(UniProtKB 번호 P31785)은 본원에서 서열 번호 40으로 제공된다.
용어 "항-IL2R 중쇄-단독 항체", "IL2R 중쇄-단독 항체", "항-IL2R 중쇄 항체" 및 "IL2R 중쇄 항체"는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 인간 IL2R을 포함하는 IL2R에 면역특이적으로 결합하는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 중쇄-단독 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 정의는 상기 정의된 바와 같은 인간 항-IL2R UniAbTM 항체를 생성하는 UniRatsTM를 포함하여, 인간 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 래트 또는 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 인간 중쇄 항체를 제한 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는 분자의 부재 하에서의 기능 또는 활성과 비교하여 상기 기능 또는 활성의 증가를 야기하는 분자를 지칭한다. 따라서 신호전달 경로의 "작용제"는 그 존재가 신호전달 경로의 기능 또는 활성의 증가를 야기하는 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용화하다"는 기능 또는 활성의 증가의 야기를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 항체의 작용제 기능은 본원에 기재된 분석법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 분자의 부재 하에서의 기능 또는 활성과 비교하여 상기 기능 또는 활성의 감소를 야기하는 분자를 지칭한다. 따라서 신호전달 경로의 "길항제"는 그 존재가 신호전달 경로의 기능 또는 활성의 감소를 야기하는 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항시키다"는 기능 또는 활성의 감소의 야기를 지칭한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되어 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 예를 들어 99 중량% 초과의 항체까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 예를 들어, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 원위치(in situ) 항체를 포함한다. 그러나 보통, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
본 발명의 항체는 다중특이성 항체를 포함한다. 다중특이성 항체는 하나 초과의 결합 특이성을 갖는다. "다중특이성"이라는 용어는 구체적으로 "이중특이성" 및 "삼중특이성", 및 고차 독립성 특이적 결합 친화성, 예컨대 고차 폴리에피토프 특이성, 및 4가 항체 및 항체 단편을 포함한다. 용어 "다중특이성 항체", "다중특이성 중쇄-단독 항체", "다중특이성 중쇄 항체" 및 "다중특이성 UniAbTM"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 하나 초과의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 구체적으로, 인간 IL2RA, IL2RB 및/또는 IL2RG 단백질과 같은 IL2R 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 또한 구체적으로, 인간 IL2RB와 같은 IL2R 단백질 상의 에피토프에 그리고, 예를 들어, IL2RG 단백질, 예컨대, 인간 IL2RG와 같은 상이한 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 하나의 결합 특이성을 갖는 단일특이성 항체를 포함한다. 단일특이성 항체는 구체적으로 단일 결합 특이성을 포함하는 항체, 및 동일한 결합 특이성을 갖는 하나 초과의 결합 유닛을 포함하는 항체를 포함한다. "단일특이성 항체", "단일특이성 중쇄-단독 항체", "단일특이성 중쇄 항체", 및 "단일특이성 UniAbTM"라는 용어는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 하나의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다. 본 발명의 단일특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 구체적으로, IL2R 단백질, 예컨대 인간 IL2R 단백질, 또는 이의 서브유닛(예를 들어, 인간 IL2RA, IL2RB, 또는 IL2RG 단백질) 상의 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 단일특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 또한 구체적으로, 인간 IL2R과 같은 IL2R 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 하나 초과의 결합 유닛을 갖는 항체(예를 들어, 다가 항체)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 실시 형태에 따른 단일특이성 항체는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서, 각각의 항원 결합 도메인은 IL2R 단백질(즉, IL2RA, IL2RB, 또는 IL2RG 단백질) 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
"에피토프"는 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위이다. 일반적으로, 항원은 몇몇 또는 많은 상이한 에피토프를 가지고 있으며, 많은 상이한 항체와 반응한다. 이 용어는 구체적으로 선형 에피토프 및 입체형태 에피토프를 포함한다.
"에피토프 매핑"은 표적 항원 상의 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하는 프로세스이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다. 입체형태 에피토프는 단백질 서열 내 불연속적인, 그러나 단백질 폴딩시 3차원 구조로 합쳐지는 아미노산으로 형성된다.
"폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 구체적으로, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-IL2R 중쇄 항체, 즉 인간 IL2RB와 같은 제1 IL2R 단백질 상의 하나 이상의 비중첩 에피토프에 결합하는 항-IL2R 중쇄 항체; 및 제1 IL2R 단백질(예를 들어, IL2RB 단백질) 상의 하나 이상의 에피토프 및 예를 들어 IL2RG 단백질과 같은 상이한 IL2R 단백질 상의 에피토프에 결합하는 항-IL2R 중쇄 항체를 포함한다. 항원의 "비중첩 에피토프(들)" 또는 "비경쟁적 에피토프(들)"이라는 용어는 한 쌍의 항원 특이적 항체 중 하나의 구성원에 의해서는 인식되지만 다른 구성원에 의해서는 인식되지 못하는 에피토프(들)를 의미하는 것으로 본원에서 정의된다. 비중첩 에피토프를 인식하는, 다중특이성 항체 상의 동일한 항원을 표적화하는 항원 결합 영역들, 또는 항체의 쌍들은 그 항원에의 결합에 대해 경쟁하지 않으며 그 항원에 동시에 결합할 수 있다.
항체가 기준 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합하는 것은 두 항체가 동일 에피토프 또는 입체적 중첩 에피토프를 인식하는 경우이다. 2개의 에피토프가 동일 에피토프 또는 입체적 중첩 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 신속한 방법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다양한 형식으로 구성될 수 있는 경쟁 분석이다. 일반적으로, 항원을 96웰 플레이트에 고정시키고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력을 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가(valent)"는 항체 분자에서의 명시된 결합 부위 수를 지칭한다.
"1가" 항체는 하나의 결합 부위를 갖는다. 따라서 1가 항체는 또한 단일특이성이다.
"다가" 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 용어 "2가", "3가", 및 "4가"는 각각 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 및 4개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 적어도 2가이며, 3가, 4가, 또는 다가일 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 2가 항체는 동일한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위(즉, 2가, 단일파라토프), 또는 2개의 상이한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위(즉, 2가, 이중파라토프)를 가질 수 있다.
매우 다양한 방법 및 단백질 배열이 이중특이성 단클론 항체(BsMAB), 삼중특이성 항체 등의 제조에 대해 알려져 있고 사용된다.
"인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 본원의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기, 예를 들어 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 도입되거나 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. "인간 항체"라는 용어는 구체적으로, 트랜스제닉 래트 또는 마우스와 같은 트랜스제닉 동물에 의해 생성된, 인간 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 중쇄-단독 항체, 특히 상기 정의된 바와 같은 UniRatsTM에 의해 생성된 UniAbsTM를 포함한다.
"키메라 항체" 또는 "키메라 면역글로불린"은 적어도 2개의 상이한 Ig 유전자좌로부터의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 분자, 예를 들어 인간 Ig 유전자좌에 의해 코딩된 부분 및 래트 Ig 유전자좌에 의해 코딩된 부분을 포함하는 트랜스제닉 항체를 의미한다. 키메라 항체는 비인간 Fc 영역 또는 인공 Fc 영역, 및 인간 이디오타입을 갖는 트랜스제닉 항체를 포함한다. 이러한 면역글로불린은 이러한 키메라 항체를 생성하도록 조작된 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이펙터 세포"라는 용어는 면역 반응의 인지 및 활성화 단계가 아닌 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 이러한 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며 특정 면역 기능을 수행한다. 일부 실시 형태에서, 자연 살해 세포와 같은 이펙터 세포는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구 및 대식세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 구성요소에 항원을 제시하는 것, 또는 항원을 제시하는 세포에 대한 결합에 관여한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포에 식균작용을 할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 T-세포 수용체 또는 FcR과 같은 수용체를 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T-세포, 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 이의 천연 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 바와 같다.
"면역 세포"라는 용어는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 이는 골수성 또는 림프성 기원의 세포, 예를 들어 림프구(예컨대, B-세포 및 세포용해 T-세포(CTL)를 포함하는 T-세포), 살해 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예컨대 호중구, 과립구, 비만세포, 및 호염기구를 제한 없이 포함한다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다.
"항체 의존성 세포매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관 내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템의 첫 번째 구성요소(C1q)의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석이 수행될 수 있다.
"결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용 총계의 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 측정될 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 결합 상태를 유지하는 경향이 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Kd" 또는 "Kd 값"은 동역학 모드로 Octet QK384 기기(Fortebio Inc., 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)를 사용하여 생물층 간섭계로 측정된 해리 상수를 의미한다. 예를 들어, 항마우스 Fc 센서에 마우스-Fc 융합 항원을 로드한 다음, 이를 항체가 포함된 웰에 침지시켜 농도 의존적 결합률(kon)을 측정한다. 항체 해리율(koff)은 최종 단계에서 측정되며, 여기서, 센서는 완충액만을 포함하는 웰에 침지된다. Kd는 koff/kon의 비이다. (더욱 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009]을 참조한다).
"치료", "치료하는" 등의 용어는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 일반적으로 의미하도록 본원에서 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 포유류에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 질환에 취약할 수 있지만 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 유발하는 것. 치료제는 질환 또는 손상의 발병 전에, 발병 중에, 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 진행 중인 질환의 치료(여기서, 상기 치료는 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시킴)가 특히 관심 대상이다. 이러한 치료는 영향을 받은 조직의 기능이 완전히 상실되기 전에 수행하는 것이 바람직하다. 대상 요법은 질환의 증상기 동안 투여될 수 있고, 일부 경우 질환의 증상기 후에 투여될 수 있다.
"치료적 유효량"은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는 데 필요한 활성제의 양을 의미한다. 예를 들어, "치료적 유효량"은 질환과 관련된 병리학적 증상, 질환 진행, 또는 생리학적 상태의 호전을 유도, 개선, 또는 달리 유발하거나, 장애에 대한 내성을 향상시키는 양이다.
"면역 세포에서 IL2R 신호전달의 활성화에 의해 매개되는"이라는 용어는 IL2/IL2R 신호전달 경로가 질환 또는 장애의 특징인 하나 이상의 병리학적 과정과 연관되거나 관련된 임의의 질환 또는 장애를 광범위하게 지칭한다. 이러한 장애는 감염성 질환, 자가면역 장애(예를 들어, 크론병, 다발성 경화증), 암, 염증성 질환(예를 들어, 관절염), 또는 IL-2 매개 신호전달 결함, T-세포 증식 결함 또는 T-세포 기능장애와 관련된 질환 또는 장애를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"대상체", "개체", 및 "환자"라는 용어는 치료에 대해 평가되고/되거나 치료받는 포유류를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일 실시 형태에서, 포유류는 인간이다. "대상체", "개체", 및 "환자"라는 용어는 암이 있는 개체, 자가면역 질환이 있는 개체, 병원체 감염이 있는 개체 등을 제한 없이 포함한다. 대상체는 인간일 수 있지만, 다른 포유류, 특히 인간 질환에 대한 실험실 모델로 유용한 포유류, 예를 들어 마우스, 래트 등을 또한 포함할 수 있다.
"제약 조성물"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태의 제제로, 제형이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 멸균 제형이다. "제약상 허용가능한" 부형제(예를 들어, 비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상 포유류에게 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
"멸균" 제형은 무균이거나 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없거나 본질적으로 없다. "동결" 제형은 0℃미만의 온도의 것이다.
"안정한" 제형은 제형 내의 단백질이 보관시 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다. 일부 실시 형태에서, 제형은 보관시 물리적 및 화학적 안정성, 및 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제형의 의도된 유효 기간에 따라 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당업계에서 이용가능하며, 예를 들어 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 문헌[Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993)]에서 검토되고 있다. 안정성은 선택 온도에서 선택 기간 동안 측정될 수 있다. 안정성은 응집체 형성 평가(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 사용, 혼탁도 측정, 및/또는 육안 검사); 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전 포커싱(icIEF), 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이질성 평가; 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열 분석; 질량 분광 분석; 환원된 항체와 온전한 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵(예를 들어, 트립신 처리 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능 평가 등을 비롯한, 다양한 상이한 방법으로 정성적 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 다음 중 하나 이상을 수반할 수 있다: 응집, 탈아미드화(예를 들어, Asn 탈아미드화), 산화(예를 들어, Met 산화), 이성질화(예를 들어, Asp 이성질화), 클리핑/가수분해/단편화(예를 들어, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 쌍을 이루지 않은 시스테인(들), N-말단 확장, C-말단 프로세싱, 글리코실화 차이 등.
항-IL2R 항체
본 발명은 인간 IL2R에 결합하는 다양한 패밀리의 항체를 제공한다. 본 발명의 양태는 그 구성원이 특정 IL2R 서브유닛 또는 사슬에 결합하는, 예를 들어 IL2RB 또는 IL2RG, 또는 이들의 조합에 결합하는 밀접하게 관련된 항체 패밀리를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 다음의 서열 식을 갖는 CDR 서열을 포함한다. X는 가변 아미노산을 나타내며, 이는 일부 실시 형태에서 아래 열거된 특정 아미노산일 수 있다:
CDR1 (IL2RB_F09)
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
CDR2 (IL2RB_F09)
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
CDR3 (IL2RB_F09)
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서,
X3은 G 또는 A이고;
X4는 S 또는 Q이고;
X5는 S 또는 T임).
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 각각 서열 번호 26, 27 및 28의 서열 식을 포함하는 CDR1, 및 CDR2 및 CDR3 서열의 임의의 조합을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RB_F09 항체로 지칭될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 다음의 서열 식을 갖는 CDR 서열을 포함한다. X는 가변 아미노산을 나타내며, 이는 일부 실시 형태에서 아래 열거된 특정 아미노산일 수 있다:
CDR1 (IL2RB_F18)
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
CDR2 (IL2RB_F18)
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
CDR3 (IL2RB_F18)
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임).
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 각각 서열 번호 29, 30 및 31의 서열 식을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 임의의 조합을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RB_F18 항체로 지칭될 수 있다.
IL2RB에 결합하는 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 표 2에 제시된 중쇄 가변 영역(VH) 서열, 및 표 1에 제시된 제공된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 예시되고 본원에 정의된 CDR 서열의 세트를 포함할 수 있다. 이들 항체는 임상 치료제(들)로서의 유용성에 기여하는 다수의 이점을 제공한다. 이러한 항체는 다양한 결합 친화도를 갖는 구성원을 포함하여, 원하는 결합 친화도를 갖는 특정 서열의 선택을 가능하게 한다.
[표 1]
[표 2]
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 다음의 서열 식을 갖는 CDR 서열을 포함한다. X는 가변 아미노산을 나타내며, 이는 일부 실시 형태에서 아래 열거된 특정 아미노산일 수 있다:
CDR1 (IL2RG_F16)
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서,
X1은 T 또는 I이고;
X2는 F 또는 V이고;
X3은 S, N, 또는 G이고;
X4는 D 또는 N임);
CDR2 (IL2RG_F16)
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서,
X5는 S 또는 N이고;
X6은 D, S, G, 또는 N이고;
X7은 T 또는 I임); 및
CDR3 (IL2RG_F16)
ARGDAVSITGDY (서열 번호 20).
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 서열 식을 포함하는 CDR1, 및 CDR2 및 CDR3 서열의 임의의 조합을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RG_F16 항체로 지칭될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 GFTFSDYY(서열 번호 15)를 포함하는 CDR1 서열, ISSSGTTT(서열 번호 19)를 포함하는 CDR2(IL2RG_F18) 서열, 및 ARGAAVAPGFDS(서열 번호 21)를 포함하는 CDR3(IL2RG_F18) 서열을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RG_F18 항체로 지칭될 수 있다.
IL2RG에 결합하는 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 표 4에 제시된 중쇄 가변 영역(VH) 서열, 및 표 3에 제시된 제공된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 예시되고 본원에 정의된 CDR 서열의 세트를 포함한다. 이 항체 패밀리는 임상 치료제(들)로서의 유용성에 기여하는 다수의 이점을 제공한다. 이러한 항체는 다양한 결합 친화도를 갖는 구성원을 포함하여, 원하는 결합 친화도를 갖는 특정 서열의 선택을 가능하게 한다.
[표 3]
[표 4]
적합한 항체는 개발 및 치료적 용도 또는 기타 용도(다중특이성 항체, 예컨대 이중특이성 항체로서의 용도를 제한 없이 포함함)를 위해 본원에 제공된 항체로부터 선택될 수 있다.
후보 단백질에 대한 친화도의 결정은 Biacore 측정과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 항체 패밀리의 구성원은 IL2R에 대한 친화성을 가질 수 있으며, 이때 Kd는 다음을 제한 없이 포함한, 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-11이다: 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-10; 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-9; 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-8; 약 10-8 내지 대략적으로 약 10-11; 약 10-8 내지 대략적으로 약 10-10; 약 10-8 내지 대략적으로 약 10-9; 약 10-9 내지 대략적으로 약 10-11; 약 10-9 내지 대략적으로 약 10-10; 또는 이들 범위 내의 임의의 값. 친화도 선택은 시험관 내 분석, 전임상 모델, 및 임상 시험을 포함하는 IL2R 생물학적 활성의 조절, 예를 들어, 작용화에 대한 생물학적 평가뿐만 아니라 잠재적 독성의 평가로 확인될 수 있다.
본원에 기재된 항체 패밀리의 구성원은 시노몰구스 마카크의 IL2R 단백질과의 교차 반응성을 가지며, 이는, 예를 들어 본원에 기재된 항체의 작용 메커니즘, 약동학, 독성학 및 기타 속성을 검증하기 위한 동물 모델로서의 시노몰구스 마카크의 사용을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, 본원의 IL2R-특이적 항체는 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 상기 CDR 서열들은 예를 들어 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 대해 각각, 서열 번호 11~14 및 22~25에 나타낸 제공된 예시적인 가변 영역 서열의 대략 아미노산 잔기 26~33; 51~58; 및 97~116의 영역에 위치할 수 있다. 상이한 프레임워크 서열이 선택되는 경우 상기 CDR 서열들이 상이한 위치에 있을 수 있지만, 일반적으로 상기 서열들의 순서는 동일하게 유지됨을 당업자는 이해할 것이다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 1~3 중 어느 하나의 CDR1 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 1을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 2를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 3을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 4~6 중 어느 하나의 CDR2 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 4를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 5를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 6을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 7~10 중 어느 하나의 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR3 서열은 서열 번호 7을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 8을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 9를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 10을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 중쇄-단독 항체는 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 7의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 11~14의 임의의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다(표 2).
또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 11의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 13의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 14의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IL2RB 항체에서 CDR 서열은 서열 번호 1~10(표 1) 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 세트 또는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열에 관한 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, CDR3 서열은, 표 1에 CDR3 서열이 제공된 항체 중 어느 하나의 CDR3 서열에 대해 아미노산 수준에서 80% 이상, 예컨대, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RB에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, 전체 세트의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)은 표 1에 CDR 서열이 제공된 항체의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)에 대해 아미노산 수준에서 팔십오 퍼센트(85%) 이상(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RB에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 11~14(표 2에 나타냄)의 임의의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 98%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, IL2RB에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 고정된 경쇄 서열과 쌍을 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 인간 VL 프레임워크에 서열 번호 44의 CDR1 서열, 서열 번호 45의 CDR2 서열 및 서열 번호 46의 CDR3 서열을 포함한다. 종합하면, 항-IL2RB VH 영역 및 고정된 경쇄 가변 영역은 IL2RB에 대해 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄 도메인은 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 경쇄 불변 영역 서열(CL)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 48의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 경쇄 서열과 쌍을 형성하지 않은 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄-단독 항체이다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 15~16 중 어느 하나의 CDR1 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 15를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 16을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 17~19 중 어느 하나의 CDR2 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 17을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 18을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 19를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 20~21 중 어느 하나의 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR3 서열은 서열 번호 20을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 21을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 중쇄-단독 항체는 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 17의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 22~25의 임의의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다(표 4).
또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 22의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IL2RG 항체에서 CDR 서열은 서열 번호 15~21(표 3) 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 세트 또는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열에 관한 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, CDR3 서열은, 표 3에 CDR3 서열이 제공된 항체 중 어느 하나의 CDR3 서열에 대해 아미노산 수준에서 80% 이상, 예컨대, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, 전체 세트의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)은 표 3에 CDR 서열이 제공된 항체의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)에 대해 아미노산 수준에서 팔십오 퍼센트(85%) 이상(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 22~25(표 4에 나타냄)의 임의의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 98%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 고정된 경쇄 서열과 쌍을 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 인간 VL 프레임워크에 서열 번호 44의 CDR1 서열, 서열 번호 45의 CDR2 서열 및 서열 번호 46의 CDR3 서열을 포함한다. 종합하면, 항-IL2RG VH 영역 및 고정된 경쇄 가변 영역은 IL2RG에 대해 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄 도메인은 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 경쇄 불변 영역 서열(CL)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 48의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 경쇄 서열과 쌍을 형성하지 않은 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄-단독 항체이다.
다중특이성 항체
본 발명의 양태는 다중특이성, 예를 들어 이중특이성 항체를 포함하며, 이는 본원에 논의된 임의의 배열을 가질 수 있고, 이는 제한 없이, 비대칭(예를 들어, 놉-인-홀(KiH)) 인터페이스를 통해 서로 결부된 2개의 동일하지 않은 중쇄 폴리펩티드 서브유닛들을 포함하는 이중특이성, 2가 중쇄 항체를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 이중특이성, 2가 중쇄 항체는 비대칭 인터페이스를 통해 서로 결부된 2개의 동일하지 않은 중쇄 폴리펩티드 서브유닛들을 포함할 수 있고, 2개의 동일한 고정된 경쇄 폴리펩티드 서브유닛들(이들 각각은 상기 2개의 중쇄 폴리펩티드 서브유닛 중 하나와 결부됨)을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 제1 IL2R 서브유닛에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 제2 IL2R 서브유닛에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 CH1 도메인의 부재 하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분을 추가로 포함한다.
다양한 형식의 다중특이성 항체가 본 발명의 범위 내에 있으며, 이는 제한 없이, 단쇄 폴리펩티드, 2쇄 폴리펩티드, 3쇄 폴리펩티드, 4쇄 폴리펩티드, 및 이들의 다중체를 포함한다. 본원의 다중특이성 항체는 구체적으로, IL2RB 및 IL2RG에 결합하는 항체를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 26을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 27을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 28을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F09 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 32를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 33을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 20을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F16 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 26을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 27을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 28을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F09 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 15를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 19를 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 21을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 29를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 30을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 31을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 32를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 33을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 20을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F16 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 29를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 30을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 31을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 15를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 19를 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 21을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 7의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열, 및 서열 번호 9의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열, 및 서열 번호 10의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열, 및 서열 번호 21의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
표 5는 본 발명의 실시 형태에 따른 이중특이성 IL2RB x IL2RG 항체의 다양한 CDR 조합의 요약을 제공한다.
[표 5]
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 11의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 22의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 13의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 14의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 22의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
표 6은 본 발명의 실시 형태에 따른 이중특이성 IL2RB x IL2RG 항체의 다양한 중쇄 가변 영역 조합의 요약을 제공한다.
[표 6]
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 제1 및 제2 폴리펩티드, 즉 제1 및 제2 폴리펩티드 서브유닛을 포함하며, 여기서, 각각의 폴리펩티드는 중쇄 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 힌지 영역, 또는 힌지 영역의 적어도 일부를 추가로 포함하며, 이는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이에 적어도 하나의 디술피드 결합을 형성하는 것을 촉진할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 적어도 하나의 중쇄 불변 영역(CH) 도메인, 예컨대 CH2 도메인, 및/또는 CH3 도메인, 및/또는 CH4 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, CH 도메인에는 CH1 도메인이 결여되어 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 각각의 항원 결합 도메인은 다중특이성 항체에 항원 결합 능력을 부여하기 위해 본원에 기재된 임의의 CDR 서열 및/또는 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 각각의 폴리펩티드 서브유닛은 상이한 IL2R 서브유닛 또는 사슬(예를 들어, IL2RB 및 IL2RG)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이 및 T366W 돌연변이(놉)를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 서열, 및 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, T366S 돌연변이, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이(홀)를 포함하는 제2 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 이 변이체 또는 변형 IgG4 Fc 도메인은 원치 않는 Fab 교환을 방지하고, 항체의 이펙터 기능을 감소시키며, 또한 중쇄 폴리펩티드 서브유닛들의 이종이량체화를 촉진하여 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체를 형성한다.
본원에 기재된 다중특이성 항체의 구성요소(즉, CDR 서열, 가변 영역 서열 및 Fc 도메인 서열(예를 들어, 힌지, CH2 및 CH3 도메인 서열))는 IL2R, 예를 들어 IL2RB 및 IL2RG에 결합하고 유익한 특성, 예를 들어 감소된 이펙터 기능 활성, 증가된 IL2R 작용 활성 등을 갖는 다중특이성 항체를 생성하기 위해 다양한 방식으로 조합될 수 있다.
표 7은 인간 IgG1 및 IgG4 Fc 영역 서열의 서열뿐만 아니라 추가적인 원하는 특성을 부여하는 추가적인 돌연변이(변이체)를 포함하는 버전의 이들 서열도 제공한다.
[표 7]
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 53의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 61의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 62의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 63의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 64의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 65의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 66의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 67의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 34의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 35의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 36의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 37의 서열을 포함함)을 포함한다.
표 8은 본 발명의 실시 형태에 따른 이중특이성 IL2RB x IL2RG 항체의 다양한 중쇄 폴리펩티드 서브유닛 서열 조합의 요약을 제공한다.
[표 8]
본원에 언급된 추가 서열은 참고를 위해 표 9 및 표 10에 제공된다.
[표 9]
[표 10]
세포 내재화
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 일단 결합 표적(예를 들어, IL2R)에 결합되면 세포 내로 내재화되며, 여기서, 내재화는 내재화되지 않는 하나 이상의 대조 항체와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, or 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 또는 적어도 약 200% 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법의 양태는 원하는 효과를 달성하기 위해, 예를 들어 IL2R 작용제로서 작용하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체를 세포 내에 내재화하는 것을 포함한다.
세포 내재화 결과는 도 7a~도 7b에 제공된다. 도 7a에는 인간 PBMC로부터의 CD8+ T-세포에 의한 표시된 항-IL2Rβ/γ UniAbsTM의 내재화가 시간의 함수로서 도시되어 있다. 도 7b에는 이 데이터가 표 형식으로 도시되어 있다. UniAbTM의 표면 수준을 유세포 분석법으로 탐지하고, 내재화되지 않은 세포와 비교하여 보고하였다. 관찰된 반감기는 0.27시간 내지 0.81시간의 범위였다. 여기서 관찰된 바와 같이, 내재화는 잠재적으로 이중특이성 항체의 특정 항-IL2RG 아암에 부분적으로 의존하였으며, 그 이유는 IL2RG_F16B 결합 서열을 포함하는 분자가 다른 항-IL2RG 결합 서열을 함유하는 분자보다 더 빠르고 더 큰 정도로 내재화되었기 때문이다.
항-IL2R 항체의 제조
본 발명의 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원의 항체는 트랜스제닉 마우스 및 래트를 포함한 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 래트(여기서, 내인성 면역글로불린 유전자는 녹아웃되거나 무력화됨)에 의해 생성된다. 일부 실시 형태에서, 본원의 중쇄 항체는 UniRatTM에서 생성된다. UniRatTM는 침묵된 내인성 면역글로불린 유전자를 갖고 있으며, 완전 인간 HCAb의 다양한, 자연적으로 최적화된 레퍼토리를 발현하기 위해 인간 면역글로불린 중쇄 전좌(translocus)를 사용한다. 래트의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 다양한 기술을 사용하여 녹아웃 또는 침묵될 수 있지만, UniRatTM에서는 징크 핑거 (엔도)뉴클레아제(ZNF) 기술을 사용하여 내인성 래트 중쇄 J-유전자좌, 경쇄 Cκ 유전자좌, 및 경쇄 Cλ 유전자좌를 불활성화시켰다. 난모세포에 미세주입하기 위한 ZNF 구축물은 IgH 및 IgL 녹아웃(KO) 주(line)을 생성할 수 있다. 자세한 내용은 예를 들어 문헌[Geurts et al., 2009, Science 325:433]을 참조한다. Ig 중쇄 녹아웃 래트의 특성화는 문헌[Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941]에 보고된 바 있다.. ZNF 기술의 장점은 최대 수 kb의 결실을 통해 유전자 또는 유전자좌를 침묵시키기 위한 비상동 말단 연결도 상동성 통합을 위한 표적 부위를 제공할 수 있다는 것이다(문헌[Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67]). UniRatTM에서 생성된 인간 중쇄 항체는 UniAbsTM라고 하며, 종래의 항체로는 공격할 수 없는 에피토프에 결합할 수 있다. 이들은 높은 특이성, 친화성, 및 작은 크기로 인해 단일 및 다중 특이적 용도에 이상적이다.
UniAbsTM 외에도, 낙타과 VHH 프레임워크 및 돌연변이, 및 이들의 기능성 VH 영역이 결여된 중쇄-단독 항체가 본원에 구체적으로 포함된다. 이러한 중쇄-단독 항체는 예를 들어 WO2006/008548에 기재된 바와 같이, 예를 들어 완전 인간 중쇄-단독 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 래트 또는 마우스에서 생성될 수 있지만, 다른 트랜스제닉 포유류, 예컨대 토끼, 기니피그 및 래트도 사용될 수 있다. 중쇄-단독 항체(이들의 VHH 또는 VH 기능성 단편 포함)는 또한, 예를 들어 포유류 세포(예를 들어 CHO 세포), 이. 콜라이, 또는 효모를 비롯한 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에서 코딩 핵산을 발현시킴으로써, 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.
중쇄-단독 항체의 도메인들은 항체와 소분자 약물의 장점을 합한 것으로서, 1가 또는 다가일 수 있으며; 독성이 낮으며; 제조 비용이 효율적이다. 작은 크기로 인해, 이러한 도메인은 경구 또는 국소 투여를 포함하여 투여하기 쉽고, 위장 안정성을 포함하여 높은 안정성을 특징으로 하며; 이들의 반감기는 원하는 용도 또는 적응증에 맞춰질 수 있다. 또한, HCAb의 VH 및 VHH 도메인은 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있다.
특정 실시 형태에서, UniAbsTM를 포함하는 본 발명의 중쇄 항체는, FR4 영역의 첫 번째 위치(Kabat 넘버링 시스템에 따르면 아미노산 위치 101)의 천연 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 갖는데, 이는 해당 위치에서 천연 아미노산 잔기를 포함하거나 이와 회합된 표면 노출된 소수성 패치를 파괴할 수 있다. 이러한 소수성 패치는 일반적으로 항체 경쇄 불변 영역과의 인터페이스에 묻혀 있지만, HCAb에서 표면 노출되며, 적어도 부분적으로는 HCAb의 원치 않는 응집 및 경쇄 회합을 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 치환 아미노산 잔기는 하전된 것이다. 일부 실시 형태에서, 치환 아미노산 잔기는 양으로 하전된 것, 예컨대 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 또는 히스티딘(His, H), 예를 들어, 아르기닌(R)이다. 일부 실시 형태에서, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 중쇄-단독 항체는 위치 101에서 Trp에서 Arg로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생성된 HCAb는 응집의 부재 하에 생리학적 조건 하에 높은 항원 결합 친화도 및 용해도를 갖는다.
본 발명의 일부로서, ELISA 단백질 및 세포-결합 분석에서 인간 IL2R에 결합하는, UniRatTM 동물로부터의 특유 서열을 갖는 인간 IgG 항-IL2R 중쇄 항체(UniAbTM)가 확인되었다. 확인된 중쇄 가변 영역(VH) 서열은 인간 IL2R 단백질 결합 및/또는 IL2R+ 세포에 대한 결합에 대해 양성이고, IL2R을 발현하지 않는 세포에 대한 결합에 대해서는 모두 음성이다.
IL2R 단백질 상의 비중첩 에피토프에 결합하는 중쇄 항체, 예를 들어 UniAbsTM는 효소-결합 면역분석(ELISA 분석) 또는 유세포 경쟁 결합 분석과 같은 경쟁 결합 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원에 결합하는 알려진 항체와 관심 항체 사이의 경쟁을 사용할 수 있다. 이 접근법을 사용하면, 일련의 항체를 기준 항체와 경쟁하는 것과 그렇지 않은 것으로 나눌 수 있다. 비경쟁 항체는 기준 항체가 결합하는 에피토프와 중첩되지 않는 별개의 에피토프에 결합하는 것으로 확인된다. 대개, 하나의 항체가 고정되고, 항원이 결합되고, 제2의 표지된(예를 들어, 비오티닐화) 항체가 포획 항원에 결합하는 능력에 대해 ELISA 분석에서 테스트된다. 이는 또한, Octet Red384 및 Octet HTX(ForteBio, Pall Inc)와 같은 생물층 간섭계 플랫폼에서뿐만 아니라, ProteOn XPR36(BioRad, Inc), Biacore 2000 및 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences), 및 MX96 SPR 이미저(Ibis technologies B.V.)를 비롯한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 더 자세한 내용은 본원의 실시예를 참조한다.
전형적으로, 항체는 표준 기술, 예컨대 상기 기재된 경쟁 결합 분석으로 측정시 표적 항원에 대한 기준 항체의 결합을 약 15~100% 감소시키는 경우 기준 항체와 "경쟁"한다. 일부 실시 형태에서, 경쟁적 결합은 효소 결합 면역분석(ELISA 분석)을 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, 하나의 항체가 고정되고, 항원이 결합되고, 제2의 표지된(예를 들어, 비오티닐화) 항체가 포획 항원에 결합하는 능력에 대해 ELISA 분석에서 테스트된다. 이는 예를 들어, Octet Red384 및 Octet HTX(ForteBio, Pall Inc)와 같은 생물층 간섭계 플랫폼에서뿐만 아니라, 예를 들어 ProteOn XPR36(BioRad, Inc), Biacore 2000 및 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences), 및 MX96 SPR 이미저(Ibis technologies B.V.)와 같은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 경쟁적 결합은 유세포 분석 경쟁적 결합 분석을 사용하여 측정된다.
다양한 실시 형태에서, 상대적 억제는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50% 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상이다.
제약 조성물
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 하나 이상의 항체를 적합한 제약상 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 제약상 허용가능한 담체는 보조제, 고체 담체, 물, 완충제, 또는 치료 성분을 보유하기 위해 당업계에서 사용되는 다른 담체, 또는 이들의 조합으로 예시되지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시 형태에서, 제약 조성물은 IL2R에 결합하는 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 제약 조성물은 IL2R 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 에피토프(예를 들어, 제1 IL2R 폴리펩티드 사슬(예를 들어, IL2RB) 상의 제1 에피토프 및 제2 IL2R 폴리펩티드 사슬(예를 들어, IL2RG) 상의 제2 에피토프)에 결합하는 다중특이성(이중특이성 포함) 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제약 조성물은 IL2RB 및 IL2RG에 결합하는 다중특이성(이중특이성 포함) 중쇄 항체(예를 들어 UniAbTM)를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 항체의 제약 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 단백질을 선택적인 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 참조)와 혼합하여 보관을 위해, 예컨대 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸, 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물(글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함); EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비경구 투여용 제약 조성물은 멸균이고 실질적으로 등장성이며, GMP(Good Manufacturing Practice) 조건 하에 제조된다. 제약 조성물은 단위 투여 형태(즉, 단일 투여에 대한 투여량)로 제공될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 따라 다르다. 본원의 항체는 정맥 주사 또는 주입 또는 피하로 투여될 수 있다. 주사 투여의 경우, 본원의 항체는 수성 용액, 예를 들어 주사 부위의 불편함을 감소시키기 위해 생리학적으로 양립가능한 완충액 중에 제형화될 수 있다. 용액은 상기 논의된 바와 같은 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 무발열원 멸균수와 함께 구성하기 위한 동결건조 형태일 수 있다.
항체 제형은 예를 들어 미국 특허 제9,034,324호에 개시되어 있다. 유사한 제형이 본 발명의, UniAbsTM를 포함하는 중쇄 항체에 대해 사용될 수 있다. 피하 항체 제형은, 예를 들어, US20160355591 및 US20160166689에 기재되어 있다.
사용 방법
본원에 기재된 항-IL2R 항체 및 제약 조성물은 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포, 예컨대 이펙터 T-세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 IL2R 신호전달을 활성화함으로써 매개되는 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 질환 또는 병태는 감염성 질환, 자가면역 장애(예를 들어, 크론병, 다발성 경화증), 암, 염증성 질환(예를 들어, 관절염), IL-2 매개 신호 전달 결함, T-세포 증식 결함, 또는 T-세포 기능장애와 관련된 질환 또는 장애일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 증가된 IL-2 매개 신호전달이 환자에게 치료적인 것이다. 일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 T-세포 반응 결함, 예를 들어 CD8+ T-세포 반응 결함과 관련된다.
일부 실시 형태에서, 치료는 다음에 의해 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 것을 목표로 한다: CD3+ T-세포 수 증가, CD4+ T-세포 수 증가, CD8+ T-세포 수 증가, CD8+ 이펙터 T-세포(예를 들어, CTL) 수 증가, NK 세포 수 증가, CD8+ T-세포 대 CD4+ T-세포의 비의 증가, Treg의 비율의 감소, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 감염으로 나타날 수 있거나, 감염에 대해 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 없는 상태로 나타날 수 있다. 감염은 만성적이거나 지속적이거나 잠복적이거나 느릴 수 있으며 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염의 결과일 수 있다. 따라서 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염이 있는 환자에게 치료가 제공될 수 있다. 박테리아 감염의 비제한적인 예는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염을 포함한다. 바이러스 감염의 비제한적인 예는 EBV, HIV, B형 간염 또는 C형 간염 감염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 예를 들어 종양 면역 탈출과 같이 암과 관련될 수 있다. 많은 인간 종양은 T-세포에 의해 인식되고 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 관련 항원을 발현한다. 암은 또한 T-세포 기능장애 장애의 징후가 없는 경우에도 치료될 수 있지만, 본원에 기재된 항체의 사용은 효과적인 면역 반응을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, 치료는 IL-2 매개 신호전달의 결함 및/또는 감소와 관련된 질환 또는 장애의 예방을 목표로 한다. 따라서, 본원에 기재된 항체는 제약 조성물 또는 의약을 제형화하는 데 사용될 수 있으며, 대상체는 질환 상태의 발병에 대해 예방적으로 치료받을 수 있다. 이는 질환 상태의 증상이 시작되기 전에 일어날 수 있고/있거나, 이러한 치료는 질환 또는 장애의 위험이 더 큰 것으로 간주되는 대상체에게 제공될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본원의 방법은 조절 T 세포(Treg)를 우선적으로 활성화시키지 않고서 면역 이펙터 세포의 활성화를 유도하는 것을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 Treg의 우선적 활성화 없이 인간 면역 이펙터 세포에서 IL2R 신호전달의 활성화를 유도하도록(즉, 작용제로서 작용하도록) IL2 수용체의 베타 및 감마 서브유닛 둘 모두를 동시에 표적화하여, T-이펙터 및 NK-세포의 활성화 쪽으로 균형을 이동시키는 다중특이성 항체가 IL2R 신호전달 활성화에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료 결과를 개선시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 양태는 치료적 유효량의 본원에 기재된 상기 하나 이상의 항체를 투여함으로써 대상체의 면역 반응을 강화하거나 보조하는 치료 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 암성 세포를 파괴하는 면역 반응을 달성하기 위해 본원에 기재된 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기재된 항체는 IL2R 신호전달 경로의 작용제로서 작용하여 이러한 결과를 달성한다. 본 발명의 실시 형태에 따른 방법은 또한 병용 요법을 포함하며, 여기서, 대상체에게 또 다른 요법 과정, 예를 들어 화학요법 섭생법과 함께 본원에 기재된 바와 같은 항체가 투여된다.
일 양태에서, IL2R 신호전달 경로에 대한 작용제 활성을 갖는 본원에 기재된 바와 같은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체가 암 치료에 사용된다. 이러한 치료가 가능한 암은 진행성 또는 전이성 암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양 암이다. 본 발명의 실시 형태에 따른 고형 종양 암은 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 양태는 또한, 면역 세포에서 IL2R 신호전달을 자극하는 방법을 포함하며, 여기서, 본 방법은 면역 세포를 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 작용성 이중특이성 항체)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 방법은 IL2RB 및 IL2RG 둘 모두에 결합하고 IL2R 복합체의 작용제로서 작용하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체와 면역 세포를 접촉시킴으로써 면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체 수용체 복합체를 자극하는 것을 포함한다. 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는, IL2R을 발현하는 임의의 다양한 면역 세포가 대상 방법에 포함될 수 있다: CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포.
질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 기타 투여 약물, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 포함한 다양한 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 비인간 포유류, 예를 들어 개, 고양이, 말 등과 같은 반려동물, 토끼, 마우스, 래트 등과 같은 실험실용 포유류 등도 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하도록 적정될 수 있다.
투여량 수준은 통상의 숙련된 임상의에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 필요에 따라, 예를 들어 요법에 대한 대상체의 반응을 변경하기 위해 필요에 따라 변경될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다르다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다.
일부 실시 형태에서, 제제의 치료적 투여량은 숙주 체중 1 kg당 약 0.0001 내지 100 mg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 체중 1 kg당 1 mg 또는 체중 1 kg당 10 mg, 또는 1~10 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주에 1회, 또는 1개월에 1회, 또는 3 내지 6개월에 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 치료적 엔티티(entity)는 일반적으로 여러 차례 투여된다. 단회 투여량 사이의 간격은 매주, 매월, 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 치료적 엔티티의 혈중 농도를 측정하여 나타나는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 치료적 엔티티는 서방형 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량과 빈도는 환자에서의 폴리펩티드 반감기에 따라 다르다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조되며; 주사 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 본원의 제약 조성물은 직접 또는 고체(예를 들어, 동결건조된) 조성물의 재구성 후, 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합하다. 또한 본 제제는 상기 논의된 바와 같이 강화된 보조 효과를 위해 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 공중합체와 같은 마이크로 입자 또는 리포솜에 캡슐화되거나 유화될 수 있다. 문헌[Langer, Science 249: 1527, 1990] 및 문헌[Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997]. 본 발명의 제제는 활성 성분의 지속적 또는 주기적 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사제 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 멸균, 실질적 등장성 상태로 제형화되며, 미국 식품의약국의 모든 GMP(Good Manufacturing Practice) 규정을 완전히 따른다.
본원에 기재된 항체 및 항체 구조의 독성은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약학 절차에 의해, 예를 들어 LD50(집단의 50%를 치사에 이르게 하는 용량) 또는 LD100(집단의 100%를 치사에 이르게 하는 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인체에 사용하기에 독성이 없는 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 항체의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 용량을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투약 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 의사 각자가 선택할 수 있다.
투여용 조성물은 일반적으로, 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 수성 담체에 용해된 항체 또는 기타 제거제(ablative agent)를 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균이며 일반적으로는 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 통상적인 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하는 데 필요한 제약상 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이러한 제형에서의 활성제의 농도는 크게 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 주로 체액 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980)] 및 문헌[Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)]).
본 발명의 활성제, 이의 제형, 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범주 내에 있다. 키트는 적어도 하나의 추가 시약, 예를 들어 화학요법 약물 등을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "라벨"이라는 용어는 키트에 또는 키트와 함께 제공되거나, 달리 키트에 부속되는 임의의 글 또는 기록 자료를 포함한다.
이제 예시적 실시 형태를 충분히 설명하였지만, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 다양한 변화 및 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
재료 및 방법:
항체 구축물 명칭
하기 표(표 11)는 본원에서 평가된 6가지의 이중특이성 항체 구축물에 대한 약칭 명명을 제공한다:
[표 11]
면역화, 차세대 서열결정, 클론형 분석 및 클로닝
방법은 본질적으로 문헌[Harris et al. Front Immunol. 2018 Apr 24; 9:889(60)]에 기재된 바와 같다. 간단히 말하면, UniRat 동물을 48일 프로토콜 또는 DNA 면역화에서 재조합 단백질 항원과 함께 표준 보조제(Complete Freunds 또는 Titermax/Ribi)를 사용하여 면역화하였다. 단백질 면역화를 위해, 부스트는 적절한 보조제와 함께 각 동물의 각 다리에 주사되는 10 μg의 재조합 단백질로 이루어졌다. DNA 면역화의 경우, 금 입자를 표적 항원의 cDNA를 포함하는 벡터로 코팅하고, 그 후 이를 유전자 총을 사용하여 7일마다 피하 투여하였다. ELISA에 의해 항원에 대한 혈청 역가를 평가하기 위해 면역화 후 혈장 샘플을 수집하였다.
대략 7주(단백질 항원) 또는 10주(DNA 항원)의 면역화 후, 배수 림프절을 수확하고 전체 RNA를 단리하였다. Ig 중쇄 서열을 문헌[Harris et al. Front Immunol. 2018 Apr 24; 9:889]에 이전에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제1 가닥 cDNA 합성 및 5' RACE(PCR에 의해)를 사용하여 증폭시키고, 그 후 겔 추출에 의해 정제하였다.
2 x 300 쌍 형성 말단 판독을 이용하여 MiSeq 플랫폼(Illumina)을 사용하여 차세대 서열결정을 완료하였다. 샘플의 다중화를 가능하게 하기 위해 프라이머 확장에 의해 인덱싱 표지체를 부가하였다. 각 샘플에는 대략 100,000개의 쌍 형성 판독이 포함되었으며, 인간 Ig 유전자좌에 대한 20개 미만의 뉴클레오티드의 정렬을 나타낸 판독을 폐기하였다. VH 영역의 병합된 정방향 및 역방향 판독을 오픈 리딩 프레임으로 번역하고, 프레임워크 및 CDR 영역을 IGBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)에 의해 확인하였다. 병합 클러스터링을 사용하여 샘플에 대해 클론형(80% 이상의 서열 유사성을 갖는 CDR3 단백질 서열에 의해 정의됨)을 결정하였다. CDR3 클론형은 해당 클론형에 의해 정의된 샘플 중 총 판독의 퍼센트에 의해 순위를 매겼다. 가장 큰 풍부도를 갖는 것들이 CH1-결실 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 발현 벡터로의 고처리량 클로닝을 위해 우선시되었고 Sanger 서열결정에 의해 검증되었다. LB 배양 배지에서 성장시킨 이. 콜라이를 플라스미드로 형질전환시키고, 그 후 이를 정제하여 96웰 형식으로 HEK 293 세포를 일시적으로 형질감염시키는 것을 가능하게 하였다. 수 일의 발현 후, 항체를 함유하는 상청액을 수확하고 청징화하였다(원심분리에 의해).
고처리량 ELISA
방법은 본질적으로 문헌[Harris et al. Front Immunol. 2018 Apr 24; 9:889]에 기재된 바와 같다. 간단히 말하면, BupH 카르보네이트-바이카르보네이트 완충액을 사용하여 재조합 단백질을 96웰 플레이트에서 4℃에서 하룻밤 코팅하였다(인간 IL-2Rβ, Acrobiosystems; 시노몰구스 IL-2Rβ, Sino Biological). 그 후 플레이트를 TBST(20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.6)로 세척하고, 차단 완충액(1% 분유 함유 TBST)으로 차단하였다. 항체를 함유하는 HEK 293 상청액을 차단 완충액에 1:100으로 희석하고, 항원 코팅 플레이트에 첨가하였다. HRP-표지 항-인간 Ig 이차 항체를 화학발광 기질과 함께 사용하여 결합 항체의 검출을 수행하였다.
발광을 정량화하고(SpectraMax i3X, Molecular devices), 각 웰에 대한 신호를 비형질감염 HEK 293 세포로부터의 상청액과 함께 인큐베이션한 항원 코팅 웰의 평균 배경 발광으로 나누어 정규화하였다.
세포주 및 PBMC
M07e 세포를 DSMZ로부터 획득하고, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10 ng/mL rhGM-CSF를 함유하는 RPMI 배지에서 성장시켰다. HSC-F 세포를 The Nonhuman Primate Reagent Resource로부터 획득하고, 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 55 μM β-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 293-F를 Gibco로부터 획득하고, 이의 권장 사항에 따라 성장시켰다.
인간 IL-2Rβ 또는 시노몰구스 IL-2Rβ를 발현하는 안정한 세포주를 생성하기 위해 발현 구축물은 항원에 대한 전장 cDNA 및 NeoR 선발 카세트를 지니고 있었다. 그 후 각 발현 구축물을 선형화하고, 이를 사용하여 CHO 세포를 전기천공하였다. 형질감염 3일 후, 제네티신 처리를 사용하여 세포를 3~6주 동안 선발하였다. 선발 기간이 끝나면, 모든 비형질감염 세포주 및 음성 대조 세포주는 사멸된 반면, 모든 형질감염된 풀은 성공적으로 형질감염된 풀에 대해 예상되는 바와 같이 재성장을 나타냈다. 그 후 각 표적의 4개 풀을 유세포 분석법에 의해 양성 대조 항체에 대한 결합에 대해 분석하였다. CHO 세포를 위한 배양 배지는 8 mM L-글루타민, 0.1 μg/L IGF-1, 5% 투석 FBS, 0.45 mg/mL 제네티신 및 0.45 mg/mL 하이그로마이신을 함유하는 EX-CELL® 325 PF CHO 배지였다. 세포를 현탁 상태에서 성장시키고 0.5x106/mL 내지 2x106/mL의 농도에서 유지하였다.
Ficoll® Paque Premium(GE Healthcare Life Sciences) 밀도 구배 원심분리에 의해 신선한 백혈구 성분채집 팩(StemCell)으로부터 사내에서 인간 PBMC를 단리하였다.
유세포 분석에 의한 세포 결합
세포, 항체 및 시약의 모든 세척 및 희석은 유동 완충액(1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3, pH 7.4)을 사용하여 수행하였다. 염색을 100,000개의 세포/웰로 시딩된 둥근 바닥 96웰 플레이트(Corning)에서 수행하고, 모든 인큐베이션을 4℃에서 또는 얼음 위에서 수행하였다. 일차 및 이차 스크린의 경우, 세포를 50 μL의 총 부피로 사전 희석 테스트 항체(이차 스크린 및 용량 곡선) 또는 항체를 함유하는 1:5 희석 HEK 293 상청액(일차 스크린 및 다양성 스크린의 경우)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 μL 유동 완충액으로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 유동 완충액 중 0.625 μg/mL의 검출 항체(Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-PE, Southern Biotech)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 2회 더 세척한 후, 세포를 최종 부피 150 μL의 유동 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 BD FACSCelesta 또는 Guava easyCyte 8-HT 유세포 분석기에서 분석하였다. 적어도 3000개의 이벤트를 수집하고, PE 기하 평균 형광 강도를 배경에 대한 배수로서 플로팅하였다(세포를 단지 이차 검출 항체와 함께 인큐베이션함). 인간 또는 시노몰구스 PBMC를 수반하는 일부 이차 스크린에서, 추가 CD4 항체(BioLegend) 및/또는 CD8 항체(BioLegend)를 포함시켜 세포 결합을 추가로 특성화하였다.
유세포 분석에 의한 pSTAT5 검출
유세포 분석에 의한 pSTAT5의 검출을 위해, 냉동 전혈(시노몰구스) 또는 냉동 LeukoPak(인간)으로부터 PBMC를 준비하였다. 세포를 해동하고, 완전 RPMI 배지로 2회 세척하고, 5x106개의 세포/mL로 재현탁하였다. 그 후 100 μL/웰의 이들 세포를 멸균, 둥근 바닥 96웰 플레이트(Corning)로 옮기고 AeraSealTM(Excel Scientific)로 밀봉하였다. 그 후 플레이트를 37℃및 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 사전 희석 항체(또는 IL-2/IL-2 변이체)를 적절한 웰에 첨가하였다. 최종 농도 10 nM의 IL-2(R&D Systems)를 대조 웰에 사용하여 검출가능 pSTAT5를 보장하였다. 그 후 플레이트를 재밀봉하고, 추가 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣어 두었다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 4℃까지 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 Human TruStain FcX(BioLegend)로 차단하고, 그 후 후속적으로 Fixable Viability Dye(Invitrogen) 및 CD3, CD4, CD8, CD25 및/또는 CD56에 대한 항체로 30분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 다시 원심분리하고, 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 200 μL/웰의 Fixation Buffer(BioLegend)의 첨가에 의해 고정하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 고정 후, 세포를 원심분리하고, Flow Buffer(1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 다음으로, 세포를 -20℃까지 사전 냉각시킨 200 μL/웰의 True-Phos 완충액(BioLegend)에 재현탁하여 투과화시키고, -20℃냉동고로 옮겼다(하룻밤). 다음날 아침, 세포를 원심분리하고, 유동 완충액으로 2회 세척한 후, 항-pSTAT5(BD Biosciences)로 30분 동안 염색하였다. 2회 추가 세척 후, 세포를 125 μL/웰의 유동 완충액에 재현탁하고, BD FACSCelesta에서 획득하였다.
유세포 분석에 의한 Ki67 검출
유세포 분석에 의한 Ki67의 검출을 위해, 냉동 인간 PBMC(이전에 LeukoPak으로부터 사내 단리됨)를 해동하고, 1x106개의 세포/mL로 완전 RPMI 배지에서 하룻밤 방치하였다. 분석 당일 아침에 PBMC를 완전 RPMI로 세척하고, 1e6개의 세포/mL로 재현탁하였다. 그 후, 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 PBMC 100 μL, 0.16X ImmunoCult(StemCellTech) 50 μL 및 희석 항체 또는 rhIL-2(R&D Systems) 50 μL를 첨가하였다. 0.5X ImmunoCult를 염색 대조군에 사용하여 보상을 위한 검출가능 Ki67 및 CD25 신호를 보장하였다. 그 후 플레이트를 덮고, 37℃및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 3일 후, 배지를 100 μL/웰의 상응하는 농도의 항체 및 ImmunoCult로 리프레쉬하고, 그 후 인큐베이터에 다시 넣었다. 추가 3일(총 6일) 후, 세포를 원심분리하고 4℃까지 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 Human TruStain FcX(BioLegend)로 차단하고, 그 후 후속적으로 Fixable Viability Dye(Invitrogen) 및 CD3, CD4, CD8, CD25 및/또는 CD56에 대한 항체로 30분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 다시 원심분리하고, 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 고정하고, 200 μL/웰의 FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer 작업 용액(Invitrogen)을 사용하여 1시간 동안 투과화시켰다. 투과화 후, 세포를 원심분리하고, 투과화 완충액으로 2회 세척한 후, 항-FoxP3(BioLegend) 및 항-Ki67(BioLegend)로 30분 동안 염색하였다. 2회 추가 세척 후, 세포를 125 μL/웰의 유동 완충액에 재현탁하고, BD FACSCelesta에서 획득하였다.
전혈 사이토카인 방출 분석
AllCells로부터 획득한 신선한 인간 전혈(헤파린 처리)을 사용하여 사이토카인 분비를 검출하였다. 하기 방법은 문헌[B. Wolf et al. Cytokine 60 (2012) 828-837(61)]으로부터 수정하였다. 20X 농축(1X PBS에 희석) 테스트 물품 12.5 μL를 멸균 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 여기에 비특이적 활성화를 감소시키기 위해 최소한의 피펫팅으로 237.5 μL의 신선한 인간 전혈을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 37℃및 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 플레이트를 1800 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 그 후 50 μL의 혈청을 96웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 그 후 혈청을 즉시 MSD(#K15010K-1 또는 맞춤형 U-Plex 플레이트)로 테스트하거나 나중에 테스트하기 위해 -80℃에서 냉동시켰다.
마우스 약동학(PK) 평가
BsAb-1 및 BsAb-2의 PK를 1 mg/kg의 단회 꼬리 정맥 주사 후 6마리의 수컷 BALB/c 마우스에서 각각 평가하였다(n=3 * 6개의 군, Aragen Biosciences, 미국 캘리포니아주 모건 힐 소재). 혈청 샘플을 투여 후 14일의 과정에 걸쳐 선택된 시점에서 수집하였다.
BsAb-5의 PK를 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 단회 꼬리 정맥 주사 후 9마리의 암컷 BALB/c 마우스의 두 군에서 평가하였다(투여군당 9마리의 마우스, CrownBio, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재). 혈청 샘플을 투여 후 14일의 과정에 걸쳐 선택된 시점에서 수집하였다.
마우스 가속 GVHD 연구
각각의 면역 손상 NSG 마우스(프랑스 소재 Charles River로부터의 8~9주령)에 연구 -1일차에 1.5 Gy를 조사하였다. 마우스를 4개 군(n=5)으로 나누고, 2명의 상이한 PBMC 기증자를 사용하여 2회의 독립적인 실험을 수행하였다. 연구 0일차에 각 마우스에게 2명의 기증자 중 한 명으로부터의 2천만 개의 인간 PBMC를 IV로 입양 전달하였으며, 각 마우스를 비히클 대조군(100 μL), 22 μg rhIL-2(350,000 UI/마우스, Proleukin, Novartis)(매일), 1 mg/kg BsAb-1(주 2회) 또는 1 mg/kg BsAb-2(주 2회)로 처리하였다. GVHD를 모든 동물에서 시간 경과에 따른 체중 감소의 측정에 의해 평가하였다. 20%의 체중 감소가 관찰되었을 때 동물을 안락사시켰다.
두 번째 실험에서, NSG 마우스(프랑스 소재 Charles River로부터의 8~9주령)에 연구 -1일차에 1.5 Gy를 조사하였다. 마우스를 4개 군으로 나누고, 2명의 상이한 PBMC 기증자를 사용하여 2회의 독립적인 실험을 수행하였다. 연구 0일차에 각 마우스에게 2명의 기증자 중 한 명으로부터의 2천만 개의 CSFE-표지 인간 PBMC를 IV로 입양 전달하였으며, 각 마우스를 비히클 대조군(100 μL)(n=7), 22 μg rhIL-2(350,000 UI/마우스)(매일)(n=6), 1 mg/kg BsAb-1(주 2회)(n=6) 또는 1 mg/kg BsAb-2(주 2회)(n=6)로 처리하였다. 모든 동물을 연구 5일차에 희생시켰다.
유세포 분석에 의한 생착된 PBMC의 면역표현형 결정을 희생 당일 마우스 비장으로부터 제조된 단일 세포 현탁액에서 수행하였다. 검출 방법은 인간 PBMC를 숙주 세포와 더 잘 구별하기 위해 상이한 항체 패널들을 사용한 것을 제외하고는 유세포 분석에 의한 Ki67 검출을 위한 상기 방법과 대체로 동일하였다. 세포를 항-인간 CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD16, CD19 및/또는 CD69로 표면 염색하였다. 고정 및 투과화 후, 세포 중 일부를 항-인간 FoxP3으로 염색하였다. 그 후 샘플을 유세포 분석기에서 수집하고 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
BsAb-5의 경우, 2천만 개가 아닌 1천만 개의 PBMC를 전달하였고, 마우스를 3개 군으로 나누었다.
시노몰구스 약력학(PD) 연구
BsAb-1 및 BsAb-2의 PD 프로파일을 0.03, 0.1 또는 0.3 mg/kg의 단회 IV(느린 볼루스) 용량 후 2~4세의 나이브 시노몰구스 원숭이 12마리에서 평가하였다. 각 처리군은 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷 시노몰구스 원숭이(Charles River Lab, 미국 네바다주 리노 소재)를 포함하였다. 혈액학, 혈청 화학, 사이토카인 및 PD 종점의 분석을 위해 투여 후 21일 동안 선택된 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다. 연구 종료 후, 연구로부터의 동물을 일반 서식지로 돌려보냈다. 모든 절차는 CRL IACUC의 승인을 받았으며, 동물 복지법, 실험실 동물의 관리 및 사용 지침 및 실험실 동물 복지국 지침에 따라 수행하였다.
시노몰구스 혈액 면역표현형 결정
수집된 각 시점의 혈액의 일부를 유세포 분석에 의한 정량화 및 면역표현형 결정에 사용하였다. 유세포 분석에 의한 Ki67 검출 방법은 시노 반응성 항체의 상이한 패널을 사용한 것을 제외하고는 위에서 설명한 것과 대체로 동일하였다. 세포를 CD3, CD4, CD8, CD20, CD25 및 CD159a에 대한 항체로 표면 염색하였다. 고정 및 투과화 후 세포를 FoxP3 및 Ki67에 대한 항체로 염색하였다. 그 후 샘플을 유세포 분석기에서 수집하고 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
이와 동시에, 각 혈액 샘플의 일부를 BD TruCount 튜브로 옮기고, 말초 혈액 세포 절대 카운트의 실시간 정량화를 위해 CD45로 염색하였다. 상기 혈액 분석으로부터의 세포 하위세트 백분율을 상응하는 TruCount 튜브로부터의 전체 세포 수에 적용하였다.
αIgG4 ELISA
마우스 혈청 중 BsAb-1 및 BsAb-2의 혈청 농도를 항원 포획 ELISA를 사용하여 결정하였다. 모든 세척 및 희석을 신선 제조 TBS-T(Accuris)를 사용하여 수행하였다. 200 μL/웰인 코팅, 차단 및 세척을 제외하고는 모든 부피는 100 μL/웰인 것으로 가정해야 한다. 분석 전날 밤, Nunc MaxiSorpTM 편평 바닥 플레이트(Invitrogen)를 카르보네이트-바이카르보네이트 완충액(Thermo Scientific)에서 1 μg/mL까지 희석한 재조합 인간 IL2Rγ 단백질로 코팅하고 4℃에서 방치하였다. 다음날 플레이트를 5회 세척하고 그 후 1% BSA로 30분 동안 차단하였다. 플레이트를 1회 세척하고, 그 후 혈청 샘플의 다수의 희석물들을 기준 표준물과 함께 첨가하였다. BsAb-1 및 BsAb-2에 대한 공지된 농도의 스톡을 사용하여 표준 곡선을 만들었다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 8회 세척하고, 그 후 3 μg/mL까지 희석한 비오티닐화 항-인간 IgG4-Fc(MABTECH)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하고, 그 후 다시 8회 세척하였다. 다음으로, 플레이트를 1:4000으로 희석한 HRP-Streptavidin(Thermo Scientific)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 추가로 8회 세척한 후, 플레이트를 실온 1-Step Ultra TMB(Thermo Scientific)와 함께 암소에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 2 N 황산을 사용하여 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450 nm 및 570 nm에서 평가하였다.
단백질 발현 및 정제
단일특이성 UniAbs를 제조업체의 설명서(ThermoFisher A29133, 표준 프로토콜)에 따라 ExpiCHO 세포에서 발현시켰다. 청징 상청액을 7일차에 수확하고, KingFisher Flex Platform(ThermoFisher)을 사용하여 단백질 A 자기 비드를 사용하여 정제하였다. 항체를 0.1 M 시트레이트, 0.1 M NaCl, 10% 글리세롤, 10% 수크로스, pH 3.5에서 용출시켰다.
이중특이성 UniAbs를 발현시키기 위해, ExpiCHO 세포를 2개의 발현 벡터(놉 및 홀 벡터, 놉 벡터는 C-말단 His-태그를 포함함)로 형질감염시키고, 고역가 프로토콜을 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 ExpiCHO 세포에서 발현시켰다. 청징 상청액을 수확하고, 용출을 위해 이미다졸 구배를 사용하여 IMAC(Ni Sepharose® Excel, Cytive Life Sciences)로 항체를 정제하였다. IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs 함유 분획을 풀링하고, 농축시키고, 양이온 교환으로 추가 정제하여 임의의 제품 관련 불순물을 제거하였다(Mono S® 10/100 GL 컬럼(Cytiva Life Sciences)). 모든 항체를 SEC-UPLC 및 SDS-PAGE로 분석하여 이의 크기 및 순도를 확인하였다.
시노몰구스 IL-2Rγ 서열을 Uniprot.org(UniProt 등록 ID: G7Q2Z6)로부터 얻었고, 세포외 도메인(aa Met1~Asn254)을 내인성 리더 서열 및 C-말단 His-태그를 포함하는 독점 벡터에 클로닝하였다. IL-2Rγ 시약을 공급업체 설명서(고역가 프로토콜, ThermoFisher)에 따라 ExpiCHO 세포에서 발현시켰다. 세포를 8일차에 수확하고, 상청액을 SDS-PAGE(NuPAGE 4~12% Bis Tris Gel)에서 러닝시켜 표적 단백질 발현을 확인하였다. 용출을 위해 이미다졸 구배를 사용하여 Ni-Sepharose Excel 수지(Cytiva Life Sciences)를 사용하여 IMAC에 의해 청징 수확물을 정제하였다. 피크를 풀링하고, QiaXpert(Qiagen)를 사용하여 정량화하였다.
돌연변이 IL-2 단백질(T3A, F42A, Y45A, L72G, C125A)의 클로닝, 발현 및 정제를 Lake Pharma에서 완료하였다. C-말단 His-태그를 부가하여, 표준 절차를 사용하고 이미다졸 구배를 사용한 용출을 사용하여 IMAC에 의해 정제할 수 있었다.
Octet-기반 오프-레이트(Off-Rate) 측정
모든 오프-레이트 측정은 진탕 속도를 1000 rpm으로 하여 항-인간 IgG Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 사용하여 25℃에서 96웰 마이크로플레이트에서 Octet Qk384 기기(ForteBio)에서 수행하였다. 오프-레이트 결정을 위해, 항체를 5 μg/mL로 AHC 센서에 로딩하였다. 동역학 완충액(0.02% Tween20, 0.1% BSA, 0.05% 소듐 아지드, 1X PBS)의 짧은 기준선을 따른다. 오프레이트 측정을 다음에 대해 수행하였다: 인간 IL-2Rβ(AcroBiosystems), 인간 IL-2Rγ(Sino Biological), 시노몰구스 IL-2Rβ(Sino Biological), 시노몰구스 IL-2Rγ(ExpiCHO 발현 시스템, 이어서 Ni-NTA His-태그 정제를 사용하여 사내에서 발현 및 정제), 마우스 IL-2Rγ(Sino Biological), 마우스 IL-2Rβ(Sino Biological), 인간 IL-2Rα(Sino Biological), IL-4R(Sino Biological), IL-7R(Sino Biological), IL-9R(R&D Systems ) 및 IL-21R(Sino Biological). 하기 항체를 양성 대조군으로 사용하여 표적 결합 및 시약 품질을 확인하였다: 항-인간 IL-9R(R&D Systems), 항-인간 IL-21R(R&D Systems), 항-인간 IL-7R(R&D Systems) 및 항-인간 IL-4Ra(R&D Systems). 그 후, 로딩된 센서를 결합 단계에 대해 100 nM 농도의 항원을 포함하는 웰에 담갔다. 해리를 동역학 완충액에서 모니터링하였다. 캡처 표면을 60초 동안 재생하였다. ForteBio 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅하여 결합율 및 해리율을 추출하였다.
Octet-기반 동역학 측정
모든 동역학 측정 실험을 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 사용하여 ForteBio Octet Qk384 기기에서 수행하였다. 이중특이성 UniAbs 및 항원을 동역학 완충액(0.02% Tween20, 0.1% BSA, 0.05% 소듐 아지드, 1X PBS)에서 최종 농도까지 희석시켰다. 동역학 측정을 하기 항원에 대해 수행하였다: 인간 IL-2RB(AcroBiosystems), 인간 IL-2RG(AcroBiosystems), 시노몰구스 IL-2RB(Sino Biological), 시노몰구스 IL-2RG(ExpiCHO 발현 시스템, 이어서 Ni-NTA his-태그 정제를 사용하여 사내에서 발현 및 정제). 최대 로딩을 위해 항체를 5 μg/mL로 AHC 센서에 로딩하였다. 동역학 완충액의 짧은 기준선 이후, 결합 단계를 위해 일련의 피분석물 농도(7.8 nM~500 nM)에 센서를 노출시켰으며 배경 차감을 사용하여 센서 표류를 보정하였다. 해리를 동역학 완충액에서 모니터링하였다. 캡처 표면을 60초 동안 재생하였다. 모든 실험을 1000 rpm에서 진탕하면서 수행하였다. ForteBio 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅하여 결합율 및 해리율을 추출하였다. KD를 kd/ka 비를 사용하여 계산하였다. 6가지의 이중특이성 항체 구축물에 대한 동역학 데이터가 도 1에 제공되어 있다.
생물물리학적 특성 분석(Tm, Tagg)
UNcle 플랫폼에서 Tm 및 Tagg를 측정하였다. 간단히 말하면, 각 샘플 9 μL를 Uni(UNcle 카세트)에 이중으로 로딩하고, 1℃/분의 일정한 속도로 20℃로부터 70℃까지의 열적 램프(ramp)를 사용하여 러닝시켰다. UNcle Analysis 3.1 소프트웨어를 사용하여, 형광 강도의 무게 중심 평균(BCM)의 일차 도함수를 사용하여 각 샘플의 Tm을 계산하였다. 266 nm에서 산란광의 강도를 사용하여 각 샘플의 Tagg를 계산하였다.
열 스트레스 및 안정성 특성화
이중특이성 UniAb 분자를 20 mM 시트레이트 및 0.1 M NaCl(pH 6.2)에서 10 mg/mL까지 농축시켰다. 고분자량 및 저분자량 종(%HMW 및 %LMW)의 존재를 분석용 ThermoFisher UltiMateTM 3000 UPLC에서 SEC에 의해 2~8℃및 37℃에서 1개월 동안 온도 스트레스 전후에 결정하였다.
실시예 1: 작용제 활성을 갖는 IL-2Rβγ 이중특이성 항체 조합의 확인
IL-2 수용체 복합체의 활성화는 STAT5의 인산화(pSTAT5), pSTAT5 이량체의 핵으로의 전위, 및 STAT5 조절 유전자의 전사를 초래하는 신호전달 캐스케이드를 촉발한다(문헌[M. Rickert, et al., Science 308, 1477-1480 (2005)]; 문헌[G. C. Sim, et al., Cytokine Growth F R 25, 377-390 (2014)]). IL-2R의 베타 및 감마 서브유닛을 표적화하는 이중특이성 항체가 IL-2R 신호전달의 활성화를 유도할 수 있는지를 결정하기 위한 일차 분석으로서, 독특한 CDR3 패밀리로부터의 5개의 항-IL-2Rβ 결합 아암 및 독특한 CDR3 패밀리로부터의 5개의 항-IL-2Rγ 결합 아암을 조합하여 작용제 활성에 대한 전체적인 스크리닝을 수행하기 위한 25가지의 이중특이성 UniAbs를 제조하였다. 이중특이성 UniAbs는 중쇄 이종이량체 형성을 촉진하기 위해 놉-인투-홀 기술을 사용하여 침묵되고 안정화된 인간 IgG4 Fc(CH1 도메인 결실)에서 발현시켰으며, 이때 단일 항-IL- 2Rγ VH가 놉 아암에 있고 단일 항-IL-2Rβ VH가 홀 아암에 있다(문헌[J. B. B. Ridgway et al., Protein Eng Des Sel 9, 617-621 (1996)]; 문헌[S. M. Canfield, et al., J Exp Medicine 173, 1483-1491 (1991)]; 문헌[D. Xu et al., Cell Immunol 200, 16-26 (2000)]; 문헌[J. W. Bloom et al., Protein Sci 6, 407-415 (1997)]; 문헌[M. P. Reddy et al., J Immunol 164, 1925-1933 (2000)]; 문헌[A. M. Merchant et al., Nat Biotechnol 16, 677-681 (1998)]).
인간 CD8+ T-세포 상의 rhIL-2와 비교하여 25가지의 IL-2Rβγ UniAb 조합에 의한 STAT5의 인산화를 측정하고 비교하기 위해 포스포-유세포 분석을 사용하였다. STAT5 인산화는 임의의 항-IL-2Rβ 또는 항-IL-2Rγ 단일특이성 UniAbs에서 관찰되지 않았다. 이와 유사하게, STAT5 인산화는 또한, 항-IL-2Rβ 및 항-IL-2Rγ 단일특이성 UniAbs를 pSTAT5 분석에서 혼합물로서 테스트한 경우 관찰되지 않았다(도 2b). 이와는 대조적으로, 하나의 항-IL-2Rβ 아암 및 하나의 항-IL-2Rγ 아암을 갖는 이중특이성 UniAbs는 도 2a에 요약된 바와 같이 다양한 수준의 작용제 활성을 나타냈다. 흥미롭게도, STAT5 작용제 활성의 인산화를 유도하는 능력은 이중특이성 조합에 존재하는 항-IL-2Rβ 아암에 크게 의존하는 것으로 보이는 반면, 아고니즘의 정도는 항-IL-2Rγ 아암에 의존하는 것으로 나타났다. 대조군 데이터를 도 2c에 나타낸다.
더 넓은 범위의 작용제 활성을 갖는 항체를 확인하기 위해, STAT5 활성에 대한 이중특이성 스크리닝에서 확인된 4개의 리드 CDR3 클론형 패밀리 중 3개에서 다른 독특한 VH 서열을 조사하기 위해 이차 다양성 스크리닝을 시작하였다. 이러한 추가 VH 서열은 리드 CDR3 클론형 패밀리로부터 선택되었으며, CDR1, CDR2 및 프레임워크 영역에서의 서열 변이를 포함한다. 전체적으로, 추가의 157개의 독특한 패밀리 구성원은 두 번째 라운드의 고처리량 유전자 조립, 발현을 겪었고, IL-2R 발현 세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. IL-2Rβ의 경우, 인간 및 시노몰구스 IL-2Rβ 세포에 결합된 추가의 33개의 IL-2Rβ 패밀리 F09 구성원 및 추가의 22개의 IL-2Rβ 패밀리 F18 구성원을 다양성 스크린에서 확인하였다. 다양성 스크린에서 인간 및 시노몰구스 IL-2Rγ 재조합 단백질에 결합되는 그리고 세포 상의 추가 29개의 IL-2Rγ 패밀리 F16 구성원이 확인되었다. 신규 IL-2R 결합 UniAbs의 이러한 크고 다양한 세트는 다양한 기능적 활성을 갖는 리드 IL-2Rβγ 이중특이성 조합의 세트를 확인하려는 후속 노력을 가능하게 하였다.
실시예 2: IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs의 시험관 내 특성화
일차 및 이차 결합 스크리닝 결과와, 전체적인 이중특이성 UniAb 스크린에서 관찰되는 STAT5 인산화를 기반으로, 추가적인 시험관 내 특성화를 위해 6가지의 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAb 분자를 선발하였다. 상기 6가지의 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs는 다양한 EC50 값으로 인간 및 시노몰구스 T-세포 둘 모두에 효율적으로 결합하였다(도 3). Octet 오프-레이트 분석에 의하면 상기 6가지의 이중특이성 UniAbs 중 어느 것도 다른 일반적인 감마 사슬 파트너(IL-4R, IL-7R, IL-9R 또는 IL-21R) 또는 IL-2Rα에 결합하지 않았다.
인간 CD4+ T, CD8+ T 및 NK-세포에서 IL-2R 신호전달을 자극하는 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs의 능력은, 중간 친화성 IL-2Rβγ 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 능력을 유지하면서 IL-2Rα에 대한 결합을 방해하는 것으로 나타난 돌연변이(F42A, Y45A, L72G)를 포함하는 rhIL-2 변이체 및 rhIL-2와 비교하여 STAT5 인산화가 용량 의존적으로 증가하는 것에 의해 확인되었다(도 4a~도 4c)(문헌[C. Klein et al., Oncoimmunology 6:3 e1277306 (2017)]). CD8+ T-세포 상에서, 이중특이성 UniAbs는 pSTAT5 분석에서 다양한 EC50 값을 나타내며, 이때 다수의 구축물(BsAb-1, BsAb-3, BsAb-4)은 rhIL-2 및 rhIL-2 변이체와 거의 동등한 활성을 나타낸다(도 4a). 그러나 이는 이중특이성 UniAbs가 높은 수준의 IL-2Rα를 발현하는 세포 상의 rhIL-2와 비교하여 유의하게 더 낮은 효력을 나타내는 CD4+CD25+FoxP3+ T-조절 세포에서의 pSTAT5 수준과 극명한 대조를 이룬다(도 4c~도 4d). 따라서 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs는 이들 분자의 주요 기능적 기준인 T-reg의 우선적인 활성화를 피한다. 모든 6가지의 이중특이성 UniAbs는 또한, 시노몰구스 T-세포 상에서 IL-2R 신호전달을 활성화하는 것으로 확인되었으며, 이는 후속 연구에서 시노몰구스 원숭이가 적합한 비인간 영장류 모델로서 확립되게 하였다(도 4e).
상기 6가지의 이중특이성 UniAbs와 rhIL-2 간의 기능적 활성을 추가로 비교하기 위해 세포 증식 분석을 수행하였다. 이중특이성 IL-2R 작용제 UniAbs 또는 IL-2 사이토카인 대조군을 사용한 처리에 반응하여, 면역 이펙터 세포(건강한 기증자 PBMC로부터 유래된 T 및 NK- 세포)는 용량 의존적 증식을 나타냈다(도 5a~도 5d). IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs로 처리된 PBMC에서 CD8+ T-세포 및 NK-세포의 증식에서 다양한 효력이 관찰된 반면, 몇몇(BsAb-1, BsAb-3, BsAb-4)은 rhIL-2 및 rhIL-2 변이체 대조군과 유사한 수준의 증식의 유도를 나타낸 반면, 모든 분자는 유사한 수준의 최대 증식을 달성하였다(도 5a~도 5b). 이와는 대조적으로, rhIL-2는 CD4+ 세포(T-reg 포함) 상에서 이중특이성 작용제 UniAbs 및 rhIL-2 변이체 대조군보다 더 큰 활성을 가졌다(도 5c~도 5d).
이중특이성 IL-2R 작용제 UniAbs의 사이토카인 방출 프로파일을 rhIL-2와 비교한 것을 생체 외 인간 전혈 분석에서 평가하였다. IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs 또는 rhIL-2의 존재 하에서 24시간 인큐베이션한 후, 모든 테스트 물품에 대해 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-8의 용량 의존적 증가가 관찰되었다(도 6a~도 6d). 이중특이성 UniAbs 중 2가지(BsAb-3 및 BsAb-4)는 모든 테스트된 사이토카인에 있어서 사이토카인 수준(최대 농도 또는 EC50)을 rhIL-2의 것 이상으로 유도했지만, 나머지 4가지는 사이토카인 대조군보다 더 낮은 수준을 유도하였다.
요약하면, 6가지의 이중특이성 IL-2Rβγ 항체가 다양한 작용제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. BsAb-1은 STAT5의 인산화에 의해 그리고 증식 분석에서 측정된 면역 이펙터 세포에서 rhIL-2에서 관찰된 것과 유사한 수준의 작용제 활성을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 상기 시험관 내 분석에서 BsAb-2는 rhIL-2 및 BsAb-1과 비교하여 감소된 효력을 나타낸다. 두 항체 모두 SEC에 의해 측정할 경우 낮은 응집을 나타냈고, 유리한 용융 온도를 가졌으며, 37℃에서 1개월 동안 안정하였다(도 9). BsAb-1 및 BsAb-2의 유리한 사이토카인 방출 프로파일과 조합된 이러한 결과는 추가의 생체 내 특성화를 위해 이들 2가지의 이중특이성 항체를 선택하게 하였다.
실시예 3: IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs BsAb-1 및 BsAb-2의 생체 내 특성화
생체 내 기능 연구를 수행하기 전에, 이중특이성 항체의 생체 내 안정성 및 약동학을 마우스에서 측정하였다. 각각의 이중특이성 항체의 관찰된 5~7일 반감기는 마우스에서 인간 IgG4 항체의 반감기와 일치한다(도 8a)(문헌[R. Deng et al., Mabs 3, 61-66 (2011)]). 이중특이성 항체의 생체 내 기능적 활성을 평가하기 위해, 가속화된 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 사용하여 BsAb-1, BsAb-2 및 rhIL-2의 기능적 활성을 비교하였다(도 10a~도 10c). 첫 번째 실험에서, 방사선 조사된 NSG 마우스에 인간 PBMC를 생착시키고, 후속적으로 마우스를 비히클, rhIL-2(매일), 또는 상기 2가지 이중특이성 작용제 항체 중 하나(주 2회)로 처리하였다(희생시킬 때까지). 예상되는 바와 같이, 비히클 대조군으로 처리된 동물은 체중 감소로 측정할 경우 약 20일차에 GVHD의 발병을 나타냈고, 대략 35일차에 20% 체중 감소로 희생되었다. 이와는 대조적으로, 이중특이성 IL-2Rβγ 작용제 항체(BsAb-1, BsAb-2), 및 rhIL-2 처리 동물은 대략 8일차에 GVHD의 발병을 나타냈고 9일차와 13일차 사이에 20% 체중 감소로 희생되었으며, 이는 비히클 대조군과 비교하여 GVHD의 가속화를 나타내는 것으로서, 이는 처리된 마우스에서 면역 이펙터 세포의 강화된 활성화와 일치한다(도 10b).
생체 내에서 면역 이펙터 세포의 증식을 자극하는 BsAb-1 및 BsAb-2의 능력을 직접 측정하기 위해 두 번째 연구를 수행하였다. 첫 번째 실험과 유사하게, 방사선 조사된 NSG 마우스에 CSFE로 표지된 인간 PBMC를 생착시키고, 상기 마우스를 비히클, rhIL-2, BsAb-1 또는 BsAb-2로 처리하였다. 5일차의 처리 후, 비장을 수확하고 CD8+ T 및 CD4+ T-세포의 증식을 상이한 림프구 집단들에서의 CSFE 염색의 측정에 의해 상기 4개 처리군 간에 비교하였다. BsAb-1 및 BsAb-2 둘 모두 rhIL-2 및 비히클 대조군과 비교하여 유의하게 더 많은 증식 CD8+ T-세포를 나타냈다(도 10c). CD4+ T-세포는 더 적은 정도로 확장되었지만; BsAb-2 처리 마우스에서 증식 CD4+ T-세포의 유의한 증가가 관찰되었다(비히클 대조군과 비교하여).
이중특이성 항체 작용제의 전임상 평가의 중요한 측면은 시노몰구스 원숭이를 분자의 약력학을 측정하기 위한 적절한 생체 내 모델로 확립하는 것이었다. 인간 및 시노몰구스의 기능적 동등성을 결정하기 위해, 이중특이성 항체는 일차 인간 T-세포에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로 시노몰구스 일차 T-세포에서 생체 외에서 pSTAT5 신호전달을 활성화시키는 것으로 확인되었다(도 4c 및 도 4e). 인간과 시노몰구스 사이의 기능적 동등성을 확립한 후, 비인간 영장류 모델에서 생체 내에서 BsAb-1 및 BsAb-2의 활성을 추가로 조사하기 위해 비-GLP 시노몰구스 연구를 수행하였다. 상기 2가지의 이중특이성 작용제 항체를 0.03, 0.1 또는 0.3 mg/kg의 BsAb-1 또는 BsAb-2의 단회 정맥내(느린 볼루스) 용량을 받은 2의 군의 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 두 분자 모두의 모든 용량에서 말초 CD8+ T 및 NK-세포의 현저한 확장이 관찰되었다(도 11). 림프구 수의 처음의 일시적인 감소 후, CD8+ T, NK-세포 및 덜한 정도의 CD4+ T-세포는 혈액에 있어서의 용량 의존적 증식 및 확장을 보여주었으며, 이는 대략 4~7일차에 최고조에 달한 후 약 14일차에 기준선 수준으로 돌아갔다(도 11a~도 11c, 도 11f~도 11h). 중요하게도, CD4+CD25+FoxP3+ T-조절 세포의 뚜렷한 확장은 관찰되지 않았으며, 이는 삼량체 IL-2 수용체의 우선적 활성화를 피하는 이중특이성 작용제 항체와 일치한다(도 11d, 도 11i). 이 효과는 CD8+:CD4+ T-세포의 비(이는 CD8+ T-세포 하위세트에 유리하게 치우쳐짐)에 의해 추가로 확인되었다(도 11k). 더욱이, IL-2Rβγ 작용제 항체는 테스트된 모든 용량 수준에서 원숭이에서 내용성이 우수하였으며, 이때 혈관 누출 증후군 또는 기타 명백한 독성의 징후는 없었다.
실시예 4: IL-2Rβγ 이중특이성 UniAb BsAb-5의 생체 내 특성화
생체 내 기능 연구를 수행하기 전에, 이중특이성 항체의 생체 내 안정성 및 약동학을 다음의 두 용량 수준에서 마우스에서 측정하였다. 1 mg/kg 및 10 mg/kg. BsAb-5(IL2RB_F09K**IL2RG_F16B)의 관찰된 5일 반감기는 마우스에서 인간 IgG4 항체의 반감기와 일치한다(도 12a 및 도 12b)(문헌[R. Deng et al., Mabs 3, 61-66 (2011)]). 이중특이성 항체의 생체 내 기능적 활성을 평가하기 위해, 가속화된 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 사용하여 BsAb-5 및 rhIL-2의 기능적 활성을 비교하였다(도 13~도 14). 첫 번째 실험에서, 방사선 조사된 NSG 마우스에 인간 PBMC를 생착시키고, 후속적으로 마우스를 비히클, rhIL-2(매일), 또는 BsAb-5(주 2회)로 처리하였다(희생시킬 때까지). 예상되는 바와 같이, 비히클 대조군으로 처리된 동물은 체중 감소로 측정할 경우 약 20일차에 GVHD의 발병을 나타냈고, 대략 35일차에 20% 체중 감소로 희생되었다. 이와는 대조적으로, BsAb-5 처리 동물, 및 rhIL-2 처리 동물은 대략 8일차에 GVHD의 발병을 나타냈고 9일차와 13일차 사이에 20% 체중 감소로 희생되었으며, 이는 비히클 대조군과 비교하여 GVHD의 가속화를 나타내는 것으로서, 이는 처리된 마우스에서 면역 이펙터 세포의 강화된 활성화와 일치한(도 14).
생체 내에서 면역 이펙터 세포의 증식을 자극하는 BsAb-5의 능력을 직접 측정하기 위해 두 번째 연구를 수행하였다. 첫 번째 실험과 유사하게, 방사선 조사된 NSG 마우스에 CPD450으로 표지된 인간 PBMC를 생착시키고, 상기 마우스를 비히클, rhIL-2, 또는 BsAb-5로 처리하였다. 5일차의 처리 후, 비장을 수확하고 CD8+ T-세포, CD4+ T-세포, 및 NK-세포의 증식을 상이한 집단들에서의 CPD450 희석의 측정에 의해 상기 3개 처리군 간에 비교하였다. 3가지 측정된 세포 유형 모두에서 BsAb-5는 rhIL-2 또는 비히클 대조군보다 유의하게 더 많은 증식을 유도하였다(도 15a~도 15c).
이중특이성 항체 작용제의 전임상 평가의 중요한 측면은 시노몰구스 원숭이를 분자의 약력학을 측정하기 위한 적절한 생체 내 모델로 확립하는 것이었다. 인간 및 시노몰구스의 기능적 동등성을 결정하기 위해, 이중특이성 항체는 일차 인간 T-세포에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로 시노몰구스 일차 T-세포에서 생체 외에서 pSTAT5 신호전달을 활성화시키는 것으로 확인되었다(도 4c 및 도 4e). 인간과 시노몰구스 사이의 기능적 동등성을 확립한 후, 비인간 영장류 모델에서 생체 내에서 BsAb-5의 활성을 추가로 조사하기 위해 비-GLP 시노몰구스 연구를 수행하였다. BsAb-5를 0.1, 0.3 또는 0.5 mg/kg의 단회 정맥내(느린 볼루스) 용량으로 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 처음 2개의 용량 수준에 대해서는 2의 군, 및 0.5 mg/kg 용량 수준에 대해서는 4의 군의 원숭이에게 투여하였다. 모든 용량 수준에서, 말초 CD8+ T-, NK-, 및 NKT-세포의 현저한 확장이 관찰되었다(도 16a~도 16f). 림프구 수의 처음의 일시적인 감소 후, CD8+ T-, NK-, NKT-세포 및 덜한 정도의 CD4+ T-세포는 혈액에 있어서의 용량 의존적 증식 및 확장을 보여주었으며, 이는 대략 4~7일차에 최고조에 달한 후 약 14일차에 기준선 수준으로 돌아갔다(도 16a~도 16h). 중요하게도, CD4+CD25+Foxp3+ T-조절 세포의 우선적인 확장은 관찰되지 않았으며, 이는 삼량체 IL-2 수용체의 우선적 활성화를 피하는 이중특이성 작용제 항체와 일치한다(도 16a~도 16j). 추가로, IL-2 수용체 발현의 결여로 인해 유용한 음성 대조군 역할을 하는 B-세포는 BsAb-5에 반응하여 증식하는 것이 없었다(도 16k~도 16l). 더욱이, IL-2Rβγ 작용제 항체는 0.5 mg/kg까지는 원숭이에서 내용성이 우수하였으며, 이때 혈관 누출 증후군 또는 기타 명백한 독성의 징후는 없었다.
본 발명의 비제한적인 예시적 실시 형태를 본원에 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시 형태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게는, 이제 본 발명을 벗어나는 일 없이, 수많은 변형, 변경 및 치환이 떠오를 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시 형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위가 본 발명의 범주를 정한다는 것과, 이에 의해 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 이들의 균등물을 아우르는 것으로 의도된다.
도 2a~도 2c는 50 nM에서 1시간 동안 다음으로 처리된 인간 PBMC로부터의 CD8+ T-세포에서의 인산화된 STAT5(pSTAT5)의 유도 배수를 도시하는 일련의 히트맵 표이다: 항-IL2Rβ/γ 이중특이성 UniAbsTM(도 2a); 1:1 혼합물 형태의 또는 단일 제제로서의 항-IL2Rβ 및 항-IL2Rγ 단일특이성 UniAbsTM(도 2b); 또는 대조군으로서 Il-2(도 2c). pSTAT5 수준을 유세포 분석법으로 측정하고, 비자극 세포의 gMFI에 대한 기하 평균 형광 강도(gMFI)로 보고하였다.
도 3a~도 3c는 도시된 이중특이성 항체 구축물에 대한 농도의 함수로서의 표시된 세포 유형의 세포 결합을 보여주는 일련의 그래프이다. 세포 결합을 유세포 분석법으로 측정하고, 2차 검출 항체만으로 염색된 세포의 gMFI에 대한 기하 평균 형광 강도(gMFI)로 보고하였다.
도 4a~도 4e는 도시된 이중특이성 항체 구축물 및 대조 분자(IL-2 및 IL-2 변이체)에 대한 농도의 함수로서의 인간 및 시노 PBMC에서의 STAT5 인산화 용량 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. pSTAT5 수준을 유세포 분석법으로 측정하고, 표시된 세포 유형의 백분율로 보고하였다.
도 5a~도 5d는 도시된 이중특이성 항체 구축물 및 대조 분자(IL-2 및 IL-2 변이체)에 대한 농도의 함수로서의 표시된 인간 세포에서의 증식(Ki67 용량 곡선)을 보여주는 일련의 그래프이다. Ki67 수준을 유세포 분석법으로 측정하고, 표시된 세포 유형의 백분율로 보고하였다.
도 6a~도 6d는 도시된 이중특이성 항체 구축물 및 대조 분자(IL-2)에 대한 농도의 함수로서의 인간 전혈에서의 사이토카인 분비를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 7a~도 7b는 표시된 이중특이성 항체 구축물에 대한 세포 내재화 데이터를 제공한다. 도 7a에는 인간 PBMC로부터의 CD8+ T-세포에 의한 표시된 항-IL2Rβ/γ UniAbs의 내재화가 시간의 함수로서 도시되어 있다. 도 7b에는 이 데이터가 표 형식으로 도시되어 있다. UniAb의 표면 수준을 유세포 분석법으로 탐지하고, 내재화되지 않은 세포와 비교하여 보고하였다. 관찰된 반감기는 0.27시간 내지 0.81시간의 범위였다. 여기서 관찰된 바와 같이, 내재화는 잠재적으로 이중특이성 항체의 특정 항-IL2RG 아암에 부분적으로 의존하였으며, 그 이유는 IL2RG_F16B 결합 서열을 포함하는 분자가 다른 항-IL2RG 결합 서열을 함유하는 분자보다 더 빠르고 더 큰 정도로 내재화되었기 때문이다.
도 8a~도 8b는 마우스 모델 PK 데이터를 그래픽(도 8a) 및 표(도 8b) 형식으로 제공한다. BALB/c 마우스(시점당 군당 n=3)에게 표시된 항-IL2Rβ/γ UniAbs 1mg/kg을 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 혈청을 2주에 걸쳐 6개 시점에서 수집하고, 인간 IgG4에 대해 ELISA로 함께 테스트하였다. 결과를 시간의 함수(도 8a) 또는 표 형식(도 8b)으로 나타낸다.
도 9는 표시된 이중특이성 항체 구축물의 여러 특성을 요약한 표이다. 모든 구축물은 ExpiCHO 발현 시스템에서 발현되었으며, 2단계 정제되었다. 열 스트레스 후 SE-HPLC에 의한 응집 퍼센트를 기반으로 하여 안정성을 결정하였다. UNcle 플랫폼을 사용하여 Tm 및 Tagg를 측정하였다. SE-HPLC 실험의 경우, 20 μg의 단백질이 TSK 겔 G3000 5 μm 컬럼에서 러닝되었다(run).
도 10a~도 10c는 GVHD의 마우스 모델로부터의 요약 데이터를 제공한다. 방사선 조사된 NSG 마우스(치료군당 5마리)에게 각각 2천만 개의 인간 PBMC를 생착시켰다. 그 후, 동물을 희생시킬 때까지(체중 20% 감소) 비히클 단독(100 μL)으로 처리하거나, 22 μg의 rhIL-2로 매일 처리하거나, 또는 상기 두 가지 표시된 이중특이성 항체 구축물(1 mg/kg)(100 μL) 중 하나로 일주일에 2회 처리하였다. 도 10a는 GVHD의 마우스 모델 및 후속 투약 스킴에 대한 개요를 제공한다. 도 10b는 표시된 실험군에 대한 시간의 함수로서의 동물 체중을 보여준다. 도 10c는 5일차의 치료 후에 수확된 연구에서의 마우스의 비장으로부터의 세포의 분석을 도시한다. CD8+ T-세포 및 CD4+ T-세포의 증식을 상이한 림프구 집단들에서의 CSFE 염색의 측정에 의해 상기 4개 치료군 간에 비교하였다. 상기 2가지의 테스트된 이중특이성 항체 구축물(IL2RB_F09C**IL2RG_F16A (BsAb-1) 및 IL2RB_F09G**IL2RG_F16B (BsAb-2)) 둘 모두는 rhIL-2 및 비히클 대조군과 비교하여 유의하게 더 많은 증식 CD8+ T-세포를 보여주었다. CD4+ T-세포는 더 적은 정도로 확장되었지만; IL2RB_F09G**IL2RG_F16B (BsAb-2) 처리 마우스에서 증식 CD4+ T-세포의 유의한 증가가 관찰되었다(비히클 대조군과 비교하여)(도 10c). 데이터는 사이토카인 수용체 작용제가 생체 내에서 면역 이펙터의 활성화 및 증식을 촉진하고 huPBMC 생착 NSG 마우스에서 GVHD를 가속화함(사이토카인 대조군과 유사한 속도로)을 입증한다.
도 11a~도 11j는 비-GLP 시노몰구스 원숭이 연구로부터의 생체 내 약력학(PD) 데이터를 요약한 일련의 그래프이다. 도 11a~도 11e는 표시된 세포 유형의 백분율을 투여 후 시간의 함수로 도시한다. 도 11f~도 11j는 혈액의 1 μL당 표시된 세포 유형의 농도(x105)를 투여 후 시간의 함수로서 도시한다. 도 11k는 CD8+ T-세포 대 CD4+ T-세포의 비를 투여 후 시간의 함수로서 보여준다.
도 12a는 표시된 이중특이성 항체에 대한 시간(일)의 함수로서의 혈청 농도를 보여주는 그래프이다. 도 12b는 분자, 용량 및 반감기(t1/2) 정보를 보여주는 표이다.
도 13은 가속화 GVHD 모델에서 동물에 대한 시간(연구일)의 함수로서의 체중(%)을 보여주는 그래프이다.
도 14는 가속화 GVHD 모델에서 동물에 대한 시간(연구일)의 함수로서의 생존 확률을 보여주는 그래프이다.
도 15a~도 15c는 치료 후 5일에 측정되고 치료군으로 분리된 표시된 세포 유형의 세포 증식을 보여주는 그래프의 컬렉션이다. 도 15a는 CD8+ T-세포에 대한 결과를 보여주고, 도 15b는 CD4+ T-세포에 대한 결과를 보여주며, 도 15c는 NK-세포에 대한 결과를 보여준다.
도 16a~도 16l은 표시된 투여 조건 하에서 표시된 세포 유형에 대한 세포 증식 및 절대 세포 농도를 시간의 함수로 보여주는 그래프의 컬렉션이다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; 문헌["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; 문헌["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; 문헌["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; 문헌["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; 문헌["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]; 문헌[Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)]; 및 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988)]에 충분히 설명되어 있다.
달리 표시되지 않는 한, 본원의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
하기 설명에서, 본 발명의 보다 철저한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 이러한 특정 세부사항 중 하나 이상 없이 본 발명이 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 당업자에게 잘 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 인용된 참고 문헌과 본원에 제공된 정의 사이에 정의의 임의의 불일치가 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 우선시된다.
정의:
일부 실시 형태에서, "약"은 측정가능한 수치 변수와 관련하여 사용될 때 표시된 변수 값과 표시된 값의 실험 오차 이내(예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 구간 이내) 또는 표시된 값의 ±10% 이내(둘 중 더 큰 값)에 있는 모든 변수 값을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 수치 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 10분의 1 단위까지의 각 중간 값 및 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 중간 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한도 명시된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계의 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
"포함하는"은 언급된 요소가 조성물/방법/키트에 필요하지만 청구범위 또는 실시 형태의 범위 내에서 조성물/방법/키트 등을 형성하기 위해 다른 요소가 포함될 수 있음을 의미한다.
"~로 본질적으로 이루어진"은 대상 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 명시된 재료 또는 단계로 기재된 조성물 또는 방법의 범위를 제한하는 것을 의미한다.
"~로 이루어진"은 청구범위 또는 실시 형태에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 조성물, 방법, 또는 키트에서 제외함을 의미한다.
본원의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템 및 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 가변 도메인의 잔기(대략적으로 중쇄의 잔기 1~113)를 언급하는 경우 Kabat 넘버링 시스템이 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급하는 경우 "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"가 일반적으로 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌에 보고된 EU 인덱스). "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
면역글로불린이라고도 하는 항체는 통상적으로 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하며, 중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 도메인은 서열이 가변적이므로, 일반적으로 가변 영역 도메인, 또는 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL) 도메인이라고 한다. 상기 두 도메인은 통상적으로 회합하여 특이적 결합 영역을 형성하고, 본원에서 논의하겠지만, 특이적 결합은 중쇄 단독 가변 서열로도 얻을 수 있으며, 다양한 비천연 배열의 항체가 당업계에 알려져 있고 사용된다.
"기능성" 또는 "생물학적 활성" 항체 또는 항원 결합 분자(예를 들어, 중쇄 단독 항체 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체, 및 3쇄 항체-유사 분자(TCA)(본원에 기재됨) 포함)는 구조적, 조절적, 생화학적, 또는 생물물리학적 이벤트에서 천연 활성 중 하나 이상을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들어, 기능성 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있으며, 결합은 결과적으로 신호 전달 또는 효소 활성과 같은 세포 또는 분자 이벤트를 유도하거나 변경할 수 있다. 기능성 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA는 또한 수용체의 리간드 활성화를 차단하거나 작용제 또는 길항제로 작용할 수 있다. 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA가 천연 활성 중 하나 이상을 발휘하는 능력은 폴리펩티드 사슬의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 비롯한 여러 요인에 따라 달라진다.
본원에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 단량체, 이량체, 다량체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 중쇄 단독 항체, 3쇄 항체, TCA, 단쇄 Fc(single chain Fv, scFv), 나노바디 등을 포함하며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편도 포함한다. 문헌[Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861]. 항체는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 다른 종에서 유래된 항체일 수 있다.
예를 들어, "항체"라는 용어는 전장 중쇄, 전장 경쇄, 온전한 면역글로불린 분자, 또는 이러한 폴리펩티드 중 임의의 것의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적의 항원 또는 이의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이러한 표적은 암세포, 또는 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 개시된 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스(감소 또는 강화된 이펙터 세포 활성을 제공하는 변경된 Fc 부분을 갖는 조작된 서브클래스 포함)일 수 있다. 대상 항체의 경쇄는 카파 경쇄(V카파) 또는 람다 경쇄(V람다)일 수 있다. 면역글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 면역글로불린은 주로 인간에서 유래된 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단(즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는, 상기 집단에 포함되는 개별 항체가 동일함)으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 본 발명에 따른 단클론 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 재조합 단백질 생산 방법(예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 통해 또한 제조될 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 바와 같이, "가변"이라는 용어는 항체 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간에 서열에 있어 광범위하게 다르고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합성 및 특이성에 사용된다는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되어 있지는 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역이라고 하는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 β-시트 구조를 연결(일부 경우에는 그 일부를 형성)하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 배열을 채택하는, 4개의 FR을 포함한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 아주 근접하게 함께 결합되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)에 대한 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 경우 "초가변 영역"이라는 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 잔기 31~35(H1), 50~65(H2) 및 95~102(H3))(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 중쇄 가변 도메인의 "초가변 루프" 잔기 26~32(H1), 53~55(H2) 및 96~101(H3)로부터의 아미노산 잔기(문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. 일부 실시 형태에서, "CDR"은 문헌[Lefranc, MP et al., IMGT, the International ImMunoGeneTics database, Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)]에 정의된 바와 같은 항체의 상보성 결정 영역을 의미한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역/CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
예시적인 CDR 표시가 본원에 예시되어 있지만; 당업자는 서열 가변성을 기반으로 하고 가장 일반적으로 사용되는 Kabat 정의를 비롯한 CDR의 다수의 정의가 일반적으로 사용된다는 것을 이해할 것이다(문헌[Zhao et al. "A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol Immunol. 2010;47:694-700] 참조). Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한다(문헌[Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989; 342:877-883]). 관심 있는 대안적 CDR 정의는 제한 없이, 각각이 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된 다음의 문헌에 개시된 것을 포함한다: 문헌[Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool." J Mol Biol. 2001;309:657-670]; 문헌[Ofran et al. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes." J Immunol. 2008;181:6230-6235]; 문헌[Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132-143]; 및 문헌[Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995;9:133-139.].
용어 "중쇄-단독 항체" 및 "중쇄 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 가장 광범위한 의미에서, 통상적인 항체의 경쇄가 결여된, 항체, 또는 항체의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 아암(arm)을 지칭한다(즉, "중쇄 항체"는 경쇄가 결여된 통상적인 항체 이외의 항체 형식 또는 항체의 단리된 부분으로 이루어질 수 있다). 이 용어는 구체적으로, CH1 도메인의 부재하에 VH 항원 결합 도메인 및 CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함하는 동종이량체 항체; 이러한 항체의 기능성 (항원 결합) 변이체, 가용성 VH 변이체, 1개의 가변 도메인(V-NAR) 및 5개의 C-유사 불변 도메인(C-NAR)의 동종이량체를 포함하는 Ig-NAR 및 이의 기능성 단편; 및 가용성 단일 도메인 항체(예를 들어, UniDabsTM)를 제한 없이 포함한다. 일 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 프레임워크 1, CDR1, 프레임워크 2, CDR2, 프레임워크 3, CDR3 및 프레임워크 4로 구성된 가변 영역 항원 결합 도메인으로 구성된다. 또 다른 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 또 다른 실시 형태에서, 중쇄-단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄 단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절단된 중쇄-단독 항체가 또한 본원에 포함된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 및 적어도 하나의 CH(CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 중쇄-단독 항체는 2개의 중쇄가 디술피드 결합되거나 달리 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 부착된 이량체 형태일 수 있다. 중쇄-단독 항체는 IgG 서브클래스에 속할 수 있지만, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 서브클래스와 같은 다른 서브클래스에 속하는 항체도 본원에 포함된다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 서브타입에 속할 수 있다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG1 또는 IgG4 서브타입의 것이다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG4 서브타입의 것이다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG1 서브타입의 것이다. 이펙터 기능을 변경하는 CH 도메인의 변형은 본원에 추가로 설명된다. 중쇄 항체의 비제한적인 예는 예를 들어 WO2018/039180에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 중쇄-단독 항체는 키메라 항원 수용체(CAR)의 결합 (표적화) 도메인으로서 사용된다. 이 정의는 구체적으로 인간 면역글로불린 트랜스제닉 래트(예를 들어, UniRatTM)에 의해 생성되는 인간 중쇄-단독 항체, 예를 들어, UniAbsTM를 포함한다. UniAbsTM의 가변 영역(VH)은 UniDabsTM라고 하며, 다중특이성, 증가된 효력 및 연장된 반감기를 갖는 신규 치료제의 개발을 위해 Fc 영역 또는 혈청 알부민에 연결될 수 있는 다용도의 빌딩 블록이다. 동종이량체 UniAbsTM는 경쇄가 없고 따라서 VL 도메인이 없기 때문에, 항원은 하나의 단일 도메인, 즉 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인(VH 또는 VHH)에 의해 인식된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "온전한 항체 사슬"은 전장 가변 영역 및 전장 불변 영역(Fc)을 포함하는 것이다. 온전한 "통상적인" 항체는 온전한 경쇄 및 온전한 중쇄를 포함할 뿐만 아니라, 분비형 IgG의 경우 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, 힌지, CH2 및 CH3을 포함한다. IgM 또는 IgA와 같은 다른 이소형은 다른 CH 도메인을 가질 수 있다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 온전한 항체는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있는데, 상기 이펙터 기능은 항체의 Fc 불변 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 및 세포 표면 수용체의 하향 조절을 포함한다. 불변 영역 변이체는 이펙터 프로파일, Fc 수용체에 대한 결합 등을 변경하는 것들을 포함한다.
중쇄의 Fc(불변 도메인)의 아미노산 서열에 따라, 항체 및 다양한 항원 결합 단백질은 상이한 클래스로서 제공될 수 있다. 중쇄 Fc 영역의 5가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 "서브클래스"(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 Fc 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다. Ig 형태는 힌지 변형 또는 힌지 무함유 형태를 포함한다. 문헌[Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090]; 문헌[Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256]; US 2005/0048572; US 2004/0229310. 모든 척추동물 종 유래의 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 κ(카파) 및 λ(람다)라는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 카파 경쇄 서열 또는 람다 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 이펙터 기능의 비제한적인 예는 C1q 결합; CDC; Fc-수용체 결합; ADCC; ADCP; 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 수용체, 예를 들어 FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB 수용체, 및 저친화성 FcRn 수용체와 상호작용하기 위해 Fc 영역을 필요로 하며; 당업계에 알려진 다양한 분석법을 사용하여 평가될 수 있다. "죽은" 또는 "침묵된" Fc는 예를 들어 혈청 반감기 연장과 관련하여 활성을 유지하도록 돌연변이되었지만, 고친화성 Fc 수용체를 활성화하지 않거나 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는 것이다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 예를 들어 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 알로타입); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역과, 이의 자연발생적 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상)의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열을 포함한다. 예시적으로, 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본원의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성, 예를 들어 약 85% 이상의 상동성, 예를 들어 약 90% 이상의 상동성, 예를 들어 약 95% 이상의 상동성, 예를 들어 약 99% 이상의 상동성을 가질 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이종이량체화 변경"은 이종이량체 Fc 영역, 즉 Fc 영역의 A 사슬과 B 사슬이 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 Fc 영역의 형성을 촉진하는 Fc 영역의 A 및 B 사슬(즉, Fc 영역에 포함되는 두 사슬(여기서, 하나의 사슬은 본원에서 "A" 사슬로 지칭되고 다른 하나의 사슬은 본원에서 "B" 사슬로 지칭됨)에서의 변경을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변경은 비대칭적일 수 있으며, 즉 특정 변경을 갖는 A 사슬이 상이한 변경을 갖는 B 사슬과 쌍을 형성할 수 있다. 이러한 변경은 이종이량체화를 촉진하고 동종이량체화를 선호하지 않는다. 이종이량체 또는 동종이량체가 형성되었는지 여부는 예를 들어 하나의 폴리펩티드 사슬이 더미(dummy) Fc이고 다른 하나가 scFv-Fc인 상황에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정되는 바와 같은 크기 차이에 의해 평가될 수 있다. 이러한 쌍 형성 이종이량체화 변경의 한 가지 비제한적 예로는 소위 "놉 및 홀" 치환이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허 출원 공개 공보 제2003/0078385호를 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 한 쌍의 놉 및 홀 치환을 포함하는 Fc 영역은 A 사슬에 하나의 치환 및 B 사슬에 다른 치환을 포함한다. 예를 들어, IgG1 Fc 영역의 A 및 B 사슬에서의 다음의 놉 및 홀 치환은 비변형 A 및 B 사슬에서 발견된 것과 비교하여 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 본 발명의 비제한적 실시 형태에서 사용될 수 있다: 1) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 2) 하나의 사슬에 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W; 3) 하나의 사슬에 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W; 4) 하나의 사슬에 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S; 5) 하나의 사슬에 Y407T 및 다른 하나의 사슬에 T366Y; 6) 하나의 사슬에 T366Y 및 F405A 및 다른 하나의 사슬에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬에 T366W 및 F405W 및 다른 하나의 사슬에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬에 F405W 및 Y407A 및 다른 하나의 사슬에 T366W 및 T394S; 및 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에 T366W 및 다른 하나의 폴리펩티드에 T366S, L368A 및 Y407V. 대안적으로 또는 이러한 변경에 더하여, 새로운 디술피드 가교체를 생성하는 치환이 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 공보 제2003/0078385호를 참조한다. IgG1 Fc 영역에서의 이러한 변경은 다음의 치환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E356C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 Y349C 및 다른 하나의 사슬에 E357C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 L351C 및 다른 하나의 사슬에 S354C; 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 T394C 및 다른 하나의 사슬에 E397C; 또는 하나의 Fc 폴리펩티드 사슬에 D399C 및 다른 하나의 사슬에 K392C. 추가로 또는 대안적으로, 예를 들어 CH3-CH3 인터페이스에서의 하나 이상의 잔기(들)의 전하를 변화시키는 치환은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 이종이량체 형성을 향상시킬 수 있다. 이러한 치환은 본원에서 "전하쌍 치환"으로 지칭되며, 한 쌍의 전하쌍 치환을 포함하는 Fc 영역은 A 사슬에서 하나의 치환 및 B 사슬에서 상이한 치환을 포함한다. 전하쌍 치환의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 사슬에 K409D 또는 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K 또는 D399R; 2) 하나의 사슬에 K392D 또는 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K 또는 D399R; 3) 하나의 사슬에 K439D 또는 K439E + 다른 하나의 사슬에 E356K 또는 E356R; 및 4) 하나의 사슬에 K370D 또는 K370E + 다른 하나의 사슬에 E357K 또는 E357R. 또한 두 사슬 모두에서의 치환 R355D, R355E, K360D 또는 K360R은 다른 이종이량체화 변경과 함께 사용될 때 이종이량체를 안정화시킬 수 있다. 특정 전하쌍 치환이 단독으로 또는 다른 전하쌍 치환과 함께 사용될 수 있다. 전하쌍 치환들의 단일 쌍 및 이들의 조합의 구체적인 예는 다음을 포함한다: 1) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 2) 하나의 사슬에 K409E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 3) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 4) 하나의 사슬에 K409D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 5) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399R; 6) 하나의 사슬에 K392E + 다른 하나의 사슬에 D399K; 7) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399R; 8) 하나의 사슬에 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K; 9) 하나의 사슬에 K409D 및 K360D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬에 D399K 및 E357K; 11) 하나의 사슬에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬에 D399K, E356K, 및 E357K; 12) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D 및 다른 하나의 사슬 상에 D399K; 13) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K; 14) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K392D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 15) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K370D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 D357K; 16) 하나의 사슬 상에 D399K + 다른 하나의 사슬 상에 K409D 및 K360D; 및 17) 하나의 사슬 상에 K409D 및 K439D + 다른 하나의 사슬 상에 D399K 및 E356K. 이들 이종이량체화 변경 중 임의의 것이 본원에 기재된 바와 같은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 사용될 수 있다.
일부 비제한적 실시 형태에서, 변이체 Fc 서열은 EU 인덱스 위치 234, 235, 및 237에서 FcγRI 결합을 감소시키기 위해 CH2 영역에 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다(문헌[Duncan et al., (1988) Nature 332:563] 참조). EU 인덱스 위치 330 및 331에서의 보체 C1q 결합 부위에서의 2개의 아미노산 치환은 보체 고정을 감소시킨다(문헌[Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993)] 및 문헌[Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)] 참조). 위치 233~236에서의 인간 IgG1 또는 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331에서의 IgG4 잔기로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시킨다(예를 들어 문헌[Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24]; 및 문헌[Shields R.L. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604] 참조). 인간 IgG4 Fc 아미노산 서열(UniProtKB 번호 P01861)은 본원에서 서열 번호 76로 제공된다. 침묵된 IgG1은 예를 들어 문헌[Boesch, A.W., et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions." MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
제한 없이, 디술피드 결합을 형성할 수 있는 영역이 결실된 것, 또는 천연 Fc의 N-말단에서 특정 아미노산 잔기가 제거된 것, 또는 천연 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것을 포함하여, 다른 Fc 변이체가 가능하다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 항체의 하나 이상의 Fc 부분은 디술피드 결합을 제거하기 위해 힌지 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, Fc의 힌지 영역은 완전히 제거될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 항체는 Fc 변이체를 포함할 수 있다.
또한, Fc 변이체는 보체 결합 또는 Fc 수용체 결합을 일으키기 위해 아미노산 잔기를 치환(돌연변이)시키거나 결실시키거나 부가함으로써 이펙터 기능을 제거하거나 실질적으로 감소시키도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한 없이, 결실은 C1q-결합 부위와 같은 보체-결합 부위에서 발생할 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편의 이러한 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제 특허 공보 WO 97/34631호 및 WO 96/32478호에 개시되어 있다. 또한, Fc 도메인은 인산화, 황산화, 아실화, 글리코실화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화, 아미드화 등에 의해 변형될 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체는 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호 참조). 일부 실시 형태에서, 이펙터 기능이 감소된 변이체 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 포함하며, 이는 EU 넘버링에 따른 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환(즉, EU 넘버링에 따른 D265A 및 N297A)을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다(예를 들어 미국 특허 제7,332,581호 참조). 일부 실시 형태에서, 이펙터 기능이 감소된 변이체 Fc 영역은 다음의 2개의 아미노산 치환을 포함한다: D265A 및 N297A.
일부 실시 형태에서, 이펙터 기능은 글리코실화를 제거하는 불변 영역에서의 돌연변이, 예를 들어 "이펙터리스 돌연변이"를 통해 감소된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터리스 돌연변이는 CH2 영역에서의 N297A 또는 DANA 돌연변이(D265A+N297A)이다. 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001)]. 일부 실시 형태에서, 이펙터리스 돌연변이는 CH2 영역에서의 N297G 또는 DANG 돌연변이(D265A+N297G)이다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 N297에서 글리코실화가 결여되어 있으며, 예를 들어 변이체 Fc 영역은 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 공보 WO 2014/153063에 기재된 바와 같이 N297에서 글리코실화가 결여된 변이체 Fc 영역이다. 대안적으로, 이펙터 기능이 감소되거나 제거되는 추가 돌연변이는 다음을 포함한다: K322A 및 L234A/L235A(LALA). 대안적으로, 이펙터 기능은 글리코실화되지 않는 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 이펙터 기능 촉진에 효과가 없거나 덜 효과적인 변경된 글리코실화 패턴을 초래하는 숙주 세포에서의 발현과 같은 생산 기술을 통해 감소되거나 제거될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003)]).
일부 실시 형태에서, 야생형 인간 Fc 영역의 위치 329(EU 넘버링)(P329)의 프롤린은 글리신 또는 아르기닌 또는 Fc/Fcγ 수용체 인터페이스 내의 프롤린 샌드위치를 파괴하기에 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환되는데, 상기 인터페이스는 Fc의 P329와 FcgRIII의 트립토판 잔기 W87 및 W110 사이에 형성된다(문헌[Sondermann et al., Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)]). 일부 추가 실시 형태에서, Fc 변이체 영역에서의 적어도 하나의 추가 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S이다. 일부 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 추가 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E(모두 EU 넘버링에 따름)이다(예를 들어, 미국 특허 제8,969,526호를 참조하며, 이는 그 전체가 참고로 포함됨).
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 인간 IgG Fc 영역의 P329가 글리신으로 치환된 것을 가지며, 여기서, 변이체 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E에서 적어도 2개의 추가 아미노산 치환을 포함하고, 상기 잔기들은 EU 넘버링에 따라 넘버링된다(예를 들어, 미국 특허 제8,969,526호 참조). 일부 실시 형태에서, P329G, L234A 및 L235A(EU 넘버링) 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역은 인간 FcγRIIIA 및 FcγRIIA에 대해 감소된 친화도를 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 다음의 삼중 돌연변이를 포함한다: 위치 P329에서의 아미노산 치환, L234A, 및 L235A 돌연변이(EU 넘버링에 따름)(P329/LALA)(예를 들어, 미국 특허 제8,969,526호 참조). 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 다음의 아미노산 치환을 포함한다: P329G, L234A, 및 L235A(EU 넘버링에 따름).
일부 실시 형태에서, 항체는 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하며, 이는 본원에서 선택적으로 IgG4 CH3 놉 서열로 지칭될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 T366S 돌연변이, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하며, 이는 본원에서 선택적으로 IgG4 CH3 홀 서열로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 IgG4 CH3 돌연변이를 임의의 적합한 방식으로 이용하여 항체 이량체에서 제1 단량체의 제1 중쇄 불변 영역 상에 "놉"을 배치하고 항체 이량체에서 제2 단량체의 제2 중쇄 불변 영역 상에 "홀"을 배치함으로써 항체에서 중쇄 폴리펩티드 서브유닛의 원하는 쌍의 적절한 쌍 형성(이종이량체화)을 촉진할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 및 T366W 돌연변이(놉)를 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 서브유닛을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, T366S 돌연변이, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이(홀)를 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 서브유닛을 포함한다.
"Fc 영역 포함 항체"라는 용어는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 중에 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합적 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체는 K447이 있거나 없는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 양태는 1가 또는 2가 배열의 중쇄-단독 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 중쇄-단독 가변 영역 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 "1가 배열"이라는 용어는 단지 하나의 중쇄-단독 가변 영역 도메인이 존재하여 단일 결합 부위를 갖게 됨을 의미한다. 이와는 대조적으로, 중쇄-단독 가변 영역 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 "2가 배열"이라는 용어는 2개의 중쇄-단독 가변 영역 도메인이 존재하고(각각 단일 결합 부위를 가짐), 링커 서열에 의해 연결되어 있음을 의미한다. 링커 서열의 비제한적인 예는 본원에서 추가로 논의되며, 다양한 길이의 GS 링커 서열을 제한 없이 포함한다. 중쇄-단독 가변 영역이 2가 배열인 경우, 2개의 중쇄-단독 가변 영역 도메인 각각은 동일한 항원에, 또는 상이한 항원들에(예를 들어, 동일한 단백질 상의 상이한 에피토프; 2가지의 상이한 단백질 등에) 결합할 수 있다. 그러나, 구체적으로 달리 언급하지 않는 한, "2가 배열"인 것으로 표시되는 중쇄-단독 가변 영역은 링커 서열에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄-단독 가변 영역 도메인을 포함하는 것으로 이해되며, 여기서, 상기 2개의 동일한 중쇄-단독 가변 영역 도메인 각각은 동일한 표적 항원에 결합한다.
본 발명의 양태는, 제한 없이 이중특이성, 삼중특이성 등의 배열을 포함하는, 다중특이성 배열을 갖는 항체를 포함한다. 매우 다양한 방법 및 단백질 배열이 공지되어 있으며, 이중특이성 단클론 항체(BsMAB), 삼중특이성 항체 등에서 사용된다.
2가지 이상의 항체의 가변 도메인들을 재조합적으로 융합함으로써 다가의 인공 항체를 생성하는 다양한 방법이 개발되었다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드 상의 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다. 이러한 폴리펩티드 링커의 하나의 비제한적인 예로는 4개의 글리신 잔기에 이어 1개의 세린 잔기의 아미노산 서열을 갖는 GS 링커가 있으며, 여기서, 상기 서열은 n회 반복되고, n은 1 내지 약 10(서열 번호 68)의 범위의 정수, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이다. 이러한 링커의 비제한적인 예는 GGGGS(서열 번호 49)(n=1) 및 GGGGSGGGGS(서열 번호 50)(n=2)를 포함한다. 다른 적합한 링커가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357-69]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
"3쇄 항체-유사 분자" 또는 "TCA"라는 용어는 3개의 폴리펩티드 서브유닛(이들 중 2개는 단클론 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄, 또는 항원 결합 영역 및 적어도 하나의 CH 도메인을 포함하는, 이러한 항체 사슬의 기능성 항원 결합 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어짐)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 항체-유사 분자를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 이 중쇄/경쇄 쌍은 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 제3 폴리펩티드 서브유닛은 CH1 도메인의 부재 하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분, 및 제2 항원의 에피토프 또는 제1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인)을 포함하는 중쇄-단독 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 이러한 결합 도메인은 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 동일성을 갖는다. 이러한 가변 영역의 부분은 VH 및/또는 VL 유전자 절편, D 및 JH 유전자 절편, 또는 JL 유전자 절편에 의해 코딩될 수 있다. 가변 영역은 재배열된 VHDJH, VLDJH, VHJL, 또는 VLJL 유전자 절편에 의해 코딩될 수 있다.
TCA 결합 화합물은, 본원에서 사용되는 바와 같이 중쇄 불변 영역 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4를 포함하지만 CH1 도메인을 포함하지 않는 단쇄 항체를 의미하는 "중쇄 단독 항체" 또는 "중쇄 항체" 또는 "중쇄 폴리펩티드"를 사용한다. 일 실시 형태에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 또 다른 실시 형태에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절단된 중쇄 항체가 또한 본원에 포함된다. 추가 실시 형태에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 및 적어도 하나의 CH(CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 중쇄-단독 항체는 2개의 중쇄가 디술피드 결합되거나 달리 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 부착된 이량체 형태일 수 있으며, 폴리펩티드 사슬 사이의 적절한 쌍 형성을 용이하게 하기 위해 CH 도메인 중 1개 이상 사이에 비대칭 인터페이스(예를 들어, 놉-인-홀(KiH) 인터페이스)를 선택적으로 포함할 수 있다. 중쇄 항체는 IgG 서브클래스에 속할 수 있지만, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 서브클래스와 같은 다른 서브클래스에 속하는 항체도 본원에 포함된다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 특히 IgG1 서브타입 또는 IgG4 서브타입이다. TCA 결합 화합물의 비제한적인 예는 예를 들어 WO2017/223111 및 WO2018/052503에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 양태는 경쇄 가변 영역(VL)과 쌍을 형성하는 중쇄-단독 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄-단독 가변 영역과 쌍을 형성하는 경쇄 가변 영역은 "고정 경쇄" 가변 영역으로 지칭된다. 특정 실시 형태에서, 항체는 2개의 중쇄-단독 가변 영역을 포함하며, 이들 각각은 고정 경쇄 가변 영역과 쌍을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 고정 경쇄 가변 영역 서열은 경쇄 불변 영역 서열에 연결되어 전장 항체 경쇄 폴리펩티드를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 2개의 전장 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 전장 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 전장 중쇄 폴리펩티드들은 상이한 서열들을 포함하는 반면, 전장 경쇄 폴리펩티드들은 동일한 서열을 포함한다(예를 들어, 상기 2개의 전장 경쇄 폴리펩티드들은 동일하다).
중쇄 항체는 낙타과, 예를 들어 낙타 및 라마에 의해 생성된 IgG 항체의 약 1/4를 구성한다(문헌[Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)]). 이러한 항체는 2개의 중쇄에 의해 형성되지만 경쇄는 없다. 결과적으로, 가변 항원 결합 부분은 VHH 도메인으로 지칭되며, 길이가 약 120개 아미노산에 불과한 가장 작은 자연발생적인, 온전한 항원 결합 부위를 나타낸다(문헌[Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)]). 높은 특이성 및 친화성을 갖는 중쇄 항체가 면역화를 통해 다양한 항원에 대해 생성될 수 있고(문헌[van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)]), VHH 부분이 효모에서 쉽게 클로닝되고 발현될 수 있다(문헌[Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)]). 이들의 발현, 용해도, 및 안정성 수준은 고전적인 F(ab) 또는 Fv 단편보다 유의하게 더 높다(문헌[Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)]). 또한 상어는 항체에 VNAR이라고 칭해지는 단일 VH-유사 도메인을 갖는 것으로 밝혀졌다. (문헌[Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003)]; 문헌[Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004)]; 문헌[Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)]).
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같은 용어 "IL2" 및 "IL-2"는 림프구에 의해 발현되는 IL2 수용체 복합체에 결합함으로써 특정 면역 세포의 활성을 조절하는 15.5 내지 16 kDa의 사이토카인 신호전달 단백질 분자인 인터루킨-2를 지칭한다. 용어 "IL2"는 임의의 인간 및 비인간 동물 종의 IL2 단백질을 포함하고, 구체적으로는 인간 IL2뿐만 아니라 비인간 포유류의 IL2를 포함한다. 인간 IL-2 서열(UniProtKB 번호 P60568)은 본원에서 서열 번호 41로 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 IL2"이라는 용어는 공급원 또는 제조 방식에 관계없이, 인간 IL2의 임의의 변이체, 이소형, 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, "인간 IL2"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 인간 IL2 및 인간 IL2 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 IL2를 포함한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같은 용어 "IL2R", "IL-2R", "IL2 수용체" 및 "IL-2 수용체"는 일반적으로 IL2 수용체 복합체를 지칭하며, 이는 알파, A 또는 α 사슬, 베타, B 또는 β 사슬 및 감마, G 또는 γ 사슬로 지칭되는 3개의 폴리펩티드 서브유닛 또는 사슬로 구성된다. 용어 "IL2R"은 임의의 인간 및 비인간 동물 종의 IL2 수용체 복합체의 임의의 서브유닛 또는 임의의 IL2R 단백질을 포함하며, 구체적으로는 인간 IL2R뿐만 아니라 비인간 포유류의 IL2R도 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 IL2R"이라는 용어는 공급원 또는 제조 방식에 관계없이, 인간 IL2R의 임의의 변이체, 이소형, 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, "인간 IL2R"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 인간 IL2R 및 인간 IL2R 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 IL2R을 포함한다.
용어 "IL2RA"는 CD25로도 지칭되며, 인간 IL2RA 서열(UniProtKB 번호 P01589)은 본원에서 서열 번호 38로 제공된다.
용어 "IL-2RB"는 CD122로도 지칭되며, 인간 IL2RB 서열(UniProtKB 번호 P14784)은 본원에서 서열 번호 39로 제공된다.
용어 "IL2RG" IL2RG는 CD132로도 지칭되며, 인간 IL2RG 서열(UniProtKB 번호 P31785)은 본원에서 서열 번호 40으로 제공된다.
용어 "항-IL2R 중쇄-단독 항체", "IL2R 중쇄-단독 항체", "항-IL2R 중쇄 항체" 및 "IL2R 중쇄 항체"는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 인간 IL2R을 포함하는 IL2R에 면역특이적으로 결합하는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 중쇄-단독 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 정의는 상기 정의된 바와 같은 인간 항-IL2R UniAbTM 항체를 생성하는 UniRatsTM를 포함하여, 인간 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 래트 또는 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 인간 중쇄 항체를 제한 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는 분자의 부재 하에서의 기능 또는 활성과 비교하여 상기 기능 또는 활성의 증가를 야기하는 분자를 지칭한다. 따라서 신호전달 경로의 "작용제"는 그 존재가 신호전달 경로의 기능 또는 활성의 증가를 야기하는 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용화하다"는 기능 또는 활성의 증가의 야기를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 항체의 작용제 기능은 본원에 기재된 분석법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 분자의 부재 하에서의 기능 또는 활성과 비교하여 상기 기능 또는 활성의 감소를 야기하는 분자를 지칭한다. 따라서 신호전달 경로의 "길항제"는 그 존재가 신호전달 경로의 기능 또는 활성의 감소를 야기하는 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항시키다"는 기능 또는 활성의 감소의 야기를 지칭한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되어 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 예를 들어 99 중량% 초과의 항체까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 예를 들어, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 원위치(in situ) 항체를 포함한다. 그러나 보통, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
본 발명의 항체는 다중특이성 항체를 포함한다. 다중특이성 항체는 하나 초과의 결합 특이성을 갖는다. "다중특이성"이라는 용어는 구체적으로 "이중특이성" 및 "삼중특이성", 및 고차 독립성 특이적 결합 친화성, 예컨대 고차 폴리에피토프 특이성, 및 4가 항체 및 항체 단편을 포함한다. 용어 "다중특이성 항체", "다중특이성 중쇄-단독 항체", "다중특이성 중쇄 항체" 및 "다중특이성 UniAbTM"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 하나 초과의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 구체적으로, 인간 IL2RA, IL2RB 및/또는 IL2RG 단백질과 같은 IL2R 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 또한 구체적으로, 인간 IL2RB와 같은 IL2R 단백질 상의 에피토프에 그리고, 예를 들어, IL2RG 단백질, 예컨대, 인간 IL2RG와 같은 상이한 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 하나의 결합 특이성을 갖는 단일특이성 항체를 포함한다. 단일특이성 항체는 구체적으로 단일 결합 특이성을 포함하는 항체, 및 동일한 결합 특이성을 갖는 하나 초과의 결합 유닛을 포함하는 항체를 포함한다. "단일특이성 항체", "단일특이성 중쇄-단독 항체", "단일특이성 중쇄 항체", 및 "단일특이성 UniAbTM"라는 용어는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 하나의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다. 본 발명의 단일특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 구체적으로, IL2R 단백질, 예컨대 인간 IL2R 단백질, 또는 이의 서브유닛(예를 들어, 인간 IL2RA, IL2RB, 또는 IL2RG 단백질) 상의 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 단일특이성 중쇄 항-IL2R 항체는 또한 구체적으로, 인간 IL2R과 같은 IL2R 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 하나 초과의 결합 유닛을 갖는 항체(예를 들어, 다가 항체)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 실시 형태에 따른 단일특이성 항체는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서, 각각의 항원 결합 도메인은 IL2R 단백질(즉, IL2RA, IL2RB, 또는 IL2RG 단백질) 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
"에피토프"는 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위이다. 일반적으로, 항원은 몇몇 또는 많은 상이한 에피토프를 가지고 있으며, 많은 상이한 항체와 반응한다. 이 용어는 구체적으로 선형 에피토프 및 입체형태 에피토프를 포함한다.
"에피토프 매핑"은 표적 항원 상의 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하는 프로세스이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다. 입체형태 에피토프는 단백질 서열 내 불연속적인, 그러나 단백질 폴딩시 3차원 구조로 합쳐지는 아미노산으로 형성된다.
"폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 구체적으로, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-IL2R 중쇄 항체, 즉 인간 IL2RB와 같은 제1 IL2R 단백질 상의 하나 이상의 비중첩 에피토프에 결합하는 항-IL2R 중쇄 항체; 및 제1 IL2R 단백질(예를 들어, IL2RB 단백질) 상의 하나 이상의 에피토프 및 예를 들어 IL2RG 단백질과 같은 상이한 IL2R 단백질 상의 에피토프에 결합하는 항-IL2R 중쇄 항체를 포함한다. 항원의 "비중첩 에피토프(들)" 또는 "비경쟁적 에피토프(들)"이라는 용어는 한 쌍의 항원 특이적 항체 중 하나의 구성원에 의해서는 인식되지만 다른 구성원에 의해서는 인식되지 못하는 에피토프(들)를 의미하는 것으로 본원에서 정의된다. 비중첩 에피토프를 인식하는, 다중특이성 항체 상의 동일한 항원을 표적화하는 항원 결합 영역들, 또는 항체의 쌍들은 그 항원에의 결합에 대해 경쟁하지 않으며 그 항원에 동시에 결합할 수 있다.
항체가 기준 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합하는 것은 두 항체가 동일 에피토프 또는 입체적 중첩 에피토프를 인식하는 경우이다. 2개의 에피토프가 동일 에피토프 또는 입체적 중첩 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 신속한 방법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다양한 형식으로 구성될 수 있는 경쟁 분석이다. 일반적으로, 항원을 96웰 플레이트에 고정시키고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력을 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가(valent)"는 항체 분자에서의 명시된 결합 부위 수를 지칭한다.
"1가" 항체는 하나의 결합 부위를 갖는다. 따라서 1가 항체는 또한 단일특이성이다.
"다가" 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 용어 "2가", "3가", 및 "4가"는 각각 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 및 4개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 적어도 2가이며, 3가, 4가, 또는 다가일 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 2가 항체는 동일한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위(즉, 2가, 단일파라토프), 또는 2개의 상이한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위(즉, 2가, 이중파라토프)를 가질 수 있다.
매우 다양한 방법 및 단백질 배열이 이중특이성 단클론 항체(BsMAB), 삼중특이성 항체 등의 제조에 대해 알려져 있고 사용된다.
"인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 본원의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기, 예를 들어 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 도입되거나 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. "인간 항체"라는 용어는 구체적으로, 트랜스제닉 래트 또는 마우스와 같은 트랜스제닉 동물에 의해 생성된, 인간 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 중쇄-단독 항체, 특히 상기 정의된 바와 같은 UniRatsTM에 의해 생성된 UniAbsTM를 포함한다.
"키메라 항체" 또는 "키메라 면역글로불린"은 적어도 2개의 상이한 Ig 유전자좌로부터의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 분자, 예를 들어 인간 Ig 유전자좌에 의해 코딩된 부분 및 래트 Ig 유전자좌에 의해 코딩된 부분을 포함하는 트랜스제닉 항체를 의미한다. 키메라 항체는 비인간 Fc 영역 또는 인공 Fc 영역, 및 인간 이디오타입을 갖는 트랜스제닉 항체를 포함한다. 이러한 면역글로불린은 이러한 키메라 항체를 생성하도록 조작된 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이펙터 세포"라는 용어는 면역 반응의 인지 및 활성화 단계가 아닌 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 이러한 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며 특정 면역 기능을 수행한다. 일부 실시 형태에서, 자연 살해 세포와 같은 이펙터 세포는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구 및 대식세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 구성요소에 항원을 제시하는 것, 또는 항원을 제시하는 세포에 대한 결합에 관여한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포에 식균작용을 할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 T-세포 수용체 또는 FcR과 같은 수용체를 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T-세포, 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 이의 천연 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 바와 같다.
"면역 세포"라는 용어는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 이는 골수성 또는 림프성 기원의 세포, 예를 들어 림프구(예컨대, B-세포 및 세포용해 T-세포(CTL)를 포함하는 T-세포), 살해 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예컨대 호중구, 과립구, 비만세포, 및 호염기구를 제한 없이 포함한다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다.
"항체 의존성 세포매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관 내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템의 첫 번째 구성요소(C1q)의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석이 수행될 수 있다.
"결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용 총계의 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 측정될 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 결합 상태를 유지하는 경향이 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Kd" 또는 "Kd 값"은 동역학 모드로 Octet QK384 기기(Fortebio Inc., 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)를 사용하여 생물층 간섭계로 측정된 해리 상수를 의미한다. 예를 들어, 항마우스 Fc 센서에 마우스-Fc 융합 항원을 로드한 다음, 이를 항체가 포함된 웰에 침지시켜 농도 의존적 결합률(kon)을 측정한다. 항체 해리율(koff)은 최종 단계에서 측정되며, 여기서, 센서는 완충액만을 포함하는 웰에 침지된다. Kd는 koff/kon의 비이다. (더욱 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009]을 참조한다).
"치료", "치료하는" 등의 용어는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 일반적으로 의미하도록 본원에서 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 포유류에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 질환에 취약할 수 있지만 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 유발하는 것. 치료제는 질환 또는 손상의 발병 전에, 발병 중에, 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 진행 중인 질환의 치료(여기서, 상기 치료는 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시킴)가 특히 관심 대상이다. 이러한 치료는 영향을 받은 조직의 기능이 완전히 상실되기 전에 수행하는 것이 바람직하다. 대상 요법은 질환의 증상기 동안 투여될 수 있고, 일부 경우 질환의 증상기 후에 투여될 수 있다.
"치료적 유효량"은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는 데 필요한 활성제의 양을 의미한다. 예를 들어, "치료적 유효량"은 질환과 관련된 병리학적 증상, 질환 진행, 또는 생리학적 상태의 호전을 유도, 개선, 또는 달리 유발하거나, 장애에 대한 내성을 향상시키는 양이다.
"면역 세포에서 IL2R 신호전달의 활성화에 의해 매개되는"이라는 용어는 IL2/IL2R 신호전달 경로가 질환 또는 장애의 특징인 하나 이상의 병리학적 과정과 연관되거나 관련된 임의의 질환 또는 장애를 광범위하게 지칭한다. 이러한 장애는 감염성 질환, 자가면역 장애(예를 들어, 크론병, 다발성 경화증), 암, 염증성 질환(예를 들어, 관절염), 또는 IL-2 매개 신호전달 결함, T-세포 증식 결함 또는 T-세포 기능장애와 관련된 질환 또는 장애를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"대상체", "개체", 및 "환자"라는 용어는 치료에 대해 평가되고/되거나 치료받는 포유류를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일 실시 형태에서, 포유류는 인간이다. "대상체", "개체", 및 "환자"라는 용어는 암이 있는 개체, 자가면역 질환이 있는 개체, 병원체 감염이 있는 개체 등을 제한 없이 포함한다. 대상체는 인간일 수 있지만, 다른 포유류, 특히 인간 질환에 대한 실험실 모델로 유용한 포유류, 예를 들어 마우스, 래트 등을 또한 포함할 수 있다.
"제약 조성물"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태의 제제로, 제형이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 멸균 제형이다. "제약상 허용가능한" 부형제(예를 들어, 비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상 포유류에게 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
"멸균" 제형은 무균이거나 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없거나 본질적으로 없다. "동결" 제형은 0℃미만의 온도의 것이다.
"안정한" 제형은 제형 내의 단백질이 보관시 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다. 일부 실시 형태에서, 제형은 보관시 물리적 및 화학적 안정성, 및 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제형의 의도된 유효 기간에 따라 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당업계에서 이용가능하며, 예를 들어 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 문헌[Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993)]에서 검토되고 있다. 안정성은 선택 온도에서 선택 기간 동안 측정될 수 있다. 안정성은 응집체 형성 평가(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 사용, 혼탁도 측정, 및/또는 육안 검사); 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전 포커싱(icIEF), 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이질성 평가; 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열 분석; 질량 분광 분석; 환원된 항체와 온전한 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵(예를 들어, 트립신 처리 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능 평가 등을 비롯한, 다양한 상이한 방법으로 정성적 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 다음 중 하나 이상을 수반할 수 있다: 응집, 탈아미드화(예를 들어, Asn 탈아미드화), 산화(예를 들어, Met 산화), 이성질화(예를 들어, Asp 이성질화), 클리핑/가수분해/단편화(예를 들어, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 쌍을 이루지 않은 시스테인(들), N-말단 확장, C-말단 프로세싱, 글리코실화 차이 등.
항-IL2R 항체
본 발명은 인간 IL2R에 결합하는 다양한 패밀리의 항체를 제공한다. 본 발명의 양태는 그 구성원이 특정 IL2R 서브유닛 또는 사슬에 결합하는, 예를 들어 IL2RB 또는 IL2RG, 또는 이들의 조합에 결합하는 밀접하게 관련된 항체 패밀리를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 다음의 서열 식을 갖는 CDR 서열을 포함한다. X는 가변 아미노산을 나타내며, 이는 일부 실시 형태에서 아래 열거된 특정 아미노산일 수 있다:
CDR1 (IL2RB_F09)
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
CDR2 (IL2RB_F09)
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
CDR3 (IL2RB_F09)
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서,
X3은 G 또는 A이고;
X4는 S 또는 Q이고;
X5는 S 또는 T임).
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 각각 서열 번호 26, 27 및 28의 서열 식을 포함하는 CDR1, 및 CDR2 및 CDR3 서열의 임의의 조합을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RB_F09 항체로 지칭될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 다음의 서열 식을 갖는 CDR 서열을 포함한다. X는 가변 아미노산을 나타내며, 이는 일부 실시 형태에서 아래 열거된 특정 아미노산일 수 있다:
CDR1 (IL2RB_F18)
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
CDR2 (IL2RB_F18)
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
CDR3 (IL2RB_F18)
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임).
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 각각 서열 번호 29, 30 및 31의 서열 식을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 임의의 조합을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RB_F18 항체로 지칭될 수 있다.
IL2RB에 결합하는 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 표 2에 제시된 중쇄 가변 영역(VH) 서열, 및 표 1에 제시된 제공된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 예시되고 본원에 정의된 CDR 서열의 세트를 포함할 수 있다. 이들 항체는 임상 치료제(들)로서의 유용성에 기여하는 다수의 이점을 제공한다. 이러한 항체는 다양한 결합 친화도를 갖는 구성원을 포함하여, 원하는 결합 친화도를 갖는 특정 서열의 선택을 가능하게 한다.
[표 1]
[표 2]
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 다음의 서열 식을 갖는 CDR 서열을 포함한다. X는 가변 아미노산을 나타내며, 이는 일부 실시 형태에서 아래 열거된 특정 아미노산일 수 있다:
CDR1 (IL2RG_F16)
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서,
X1은 T 또는 I이고;
X2는 F 또는 V이고;
X3은 S, N, 또는 G이고;
X4는 D 또는 N임);
CDR2 (IL2RG_F16)
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서,
X5는 S 또는 N이고;
X6은 D, S, G, 또는 N이고;
X7은 T 또는 I임); 및
CDR3 (IL2RG_F16)
ARGDAVSITGDY (서열 번호 20).
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 서열 식을 포함하는 CDR1, 및 CDR2 및 CDR3 서열의 임의의 조합을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RG_F16 항체로 지칭될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 GFTFSDYY(서열 번호 15)를 포함하는 CDR1 서열, ISSSGTTT(서열 번호 19)를 포함하는 CDR2(IL2RG_F18) 서열, 및 ARGAAVAPGFDS(서열 번호 21)를 포함하는 CDR3(IL2RG_F18) 서열을 포함한다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 IL2RG_F18 항체로 지칭될 수 있다.
IL2RG에 결합하는 본 발명의 실시 형태에 따른 항체는 표 4에 제시된 중쇄 가변 영역(VH) 서열, 및 표 3에 제시된 제공된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 예시되고 본원에 정의된 CDR 서열의 세트를 포함한다. 이 항체 패밀리는 임상 치료제(들)로서의 유용성에 기여하는 다수의 이점을 제공한다. 이러한 항체는 다양한 결합 친화도를 갖는 구성원을 포함하여, 원하는 결합 친화도를 갖는 특정 서열의 선택을 가능하게 한다.
[표 3]
[표 4]
적합한 항체는 개발 및 치료적 용도 또는 기타 용도(다중특이성 항체, 예컨대 이중특이성 항체로서의 용도를 제한 없이 포함함)를 위해 본원에 제공된 항체로부터 선택될 수 있다.
후보 단백질에 대한 친화도의 결정은 Biacore 측정과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 항체 패밀리의 구성원은 IL2R에 대한 친화성을 가질 수 있으며, 이때 Kd는 다음을 제한 없이 포함한, 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-11이다: 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-10; 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-9; 약 10-6 내지 대략적으로 약 10-8; 약 10-8 내지 대략적으로 약 10-11; 약 10-8 내지 대략적으로 약 10-10; 약 10-8 내지 대략적으로 약 10-9; 약 10-9 내지 대략적으로 약 10-11; 약 10-9 내지 대략적으로 약 10-10; 또는 이들 범위 내의 임의의 값. 친화도 선택은 시험관 내 분석, 전임상 모델, 및 임상 시험을 포함하는 IL2R 생물학적 활성의 조절, 예를 들어, 작용화에 대한 생물학적 평가뿐만 아니라 잠재적 독성의 평가로 확인될 수 있다.
본원에 기재된 항체 패밀리의 구성원은 시노몰구스 마카크의 IL2R 단백질과의 교차 반응성을 가지며, 이는, 예를 들어 본원에 기재된 항체의 작용 메커니즘, 약동학, 독성학 및 기타 속성을 검증하기 위한 동물 모델로서의 시노몰구스 마카크의 사용을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, 본원의 IL2R-특이적 항체는 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 상기 CDR 서열들은 예를 들어 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 대해 각각, 서열 번호 11~14 및 22~25에 나타낸 제공된 예시적인 가변 영역 서열의 대략 아미노산 잔기 26~33; 51~58; 및 97~116의 영역에 위치할 수 있다. 상이한 프레임워크 서열이 선택되는 경우 상기 CDR 서열들이 상이한 위치에 있을 수 있지만, 일반적으로 상기 서열들의 순서는 동일하게 유지됨을 당업자는 이해할 것이다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 1~3 중 어느 하나의 CDR1 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 1을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 2를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 3을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 4~6 중 어느 하나의 CDR2 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 4를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 5를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 6을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 7~10 중 어느 하나의 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR3 서열은 서열 번호 7을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 8을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 9를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 10을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 중쇄-단독 항체는 서열 번호 1의 CDR1 서열; 서열 번호 4의 CDR2 서열; 및 서열 번호 7의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 11~14의 임의의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다(표 2).
또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 11의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 13의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 14의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IL2RB 항체에서 CDR 서열은 서열 번호 1~10(표 1) 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 세트 또는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열에 관한 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, CDR3 서열은, 표 1에 CDR3 서열이 제공된 항체 중 어느 하나의 CDR3 서열에 대해 아미노산 수준에서 80% 이상, 예컨대, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RB에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, 전체 세트의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)은 표 1에 CDR 서열이 제공된 항체의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)에 대해 아미노산 수준에서 팔십오 퍼센트(85%) 이상(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RB에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 11~14(표 2에 나타냄)의 임의의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 98%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, IL2RB에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 고정된 경쇄 서열과 쌍을 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 인간 VL 프레임워크에 서열 번호 44의 CDR1 서열, 서열 번호 45의 CDR2 서열 및 서열 번호 46의 CDR3 서열을 포함한다. 종합하면, 항-IL2RB VH 영역 및 고정된 경쇄 가변 영역은 IL2RB에 대해 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄 도메인은 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 경쇄 불변 영역 서열(CL)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 48의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 경쇄 서열과 쌍을 형성하지 않은 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄-단독 항체이다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 15~16 중 어느 하나의 CDR1 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 15를 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR1 서열은 서열 번호 16을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 17~19 중 어느 하나의 CDR2 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 17을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 18을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 19를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 20~21 중 어느 하나의 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR3 서열은 서열 번호 20을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CDR2 서열은 서열 번호 21을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 중쇄-단독 항체는 서열 번호 15의 CDR1 서열; 서열 번호 17의 CDR2 서열; 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 22~25의 임의의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다(표 4).
또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 22의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또한 추가 실시 형태에서, 항-IL2RB 항체는 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IL2RG 항체에서 CDR 서열은 서열 번호 15~21(표 3) 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 세트 또는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열에 관한 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, CDR3 서열은, 표 3에 CDR3 서열이 제공된 항체 중 어느 하나의 CDR3 서열에 대해 아미노산 수준에서 80% 이상, 예컨대, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)(여기서, 전체 세트의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)은 표 3에 CDR 서열이 제공된 항체의 CDR 1, 2 및 3(조합됨)에 대해 아미노산 수준에서 팔십오 퍼센트(85%) 이상(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 가짐)을 포함하고, IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 서열 번호 22~25(표 4에 나타냄)의 임의의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 98%의 동일성 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, IL2RG에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 고정된 경쇄 서열과 쌍을 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 인간 VL 프레임워크에 서열 번호 44의 CDR1 서열, 서열 번호 45의 CDR2 서열 및 서열 번호 46의 CDR3 서열을 포함한다. 종합하면, 항-IL2RG VH 영역 및 고정된 경쇄 가변 영역은 IL2RG에 대해 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄 도메인은 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 경쇄 불변 영역 서열(CL)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 고정된 경쇄는 서열 번호 48의 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-IL2RG 항체는 경쇄 서열과 쌍을 형성하지 않은 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄-단독 항체이다.
다중특이성 항체
본 발명의 양태는 다중특이성, 예를 들어 이중특이성 항체를 포함하며, 이는 본원에 논의된 임의의 배열을 가질 수 있고, 이는 제한 없이, 비대칭(예를 들어, 놉-인-홀(KiH)) 인터페이스를 통해 서로 결부된 2개의 동일하지 않은 중쇄 폴리펩티드 서브유닛들을 포함하는 이중특이성, 2가 중쇄 항체를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 이중특이성, 2가 중쇄 항체는 비대칭 인터페이스를 통해 서로 결부된 2개의 동일하지 않은 중쇄 폴리펩티드 서브유닛들을 포함할 수 있고, 2개의 동일한 고정된 경쇄 폴리펩티드 서브유닛들(이들 각각은 상기 2개의 중쇄 폴리펩티드 서브유닛 중 하나와 결부됨)을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 제1 IL2R 서브유닛에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 제2 IL2R 서브유닛에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 CH1 도메인의 부재 하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분을 추가로 포함한다.
다양한 형식의 다중특이성 항체가 본 발명의 범위 내에 있으며, 이는 제한 없이, 단쇄 폴리펩티드, 2쇄 폴리펩티드, 3쇄 폴리펩티드, 4쇄 폴리펩티드, 및 이들의 다중체를 포함한다. 본원의 다중특이성 항체는 구체적으로, IL2RB 및 IL2RG에 결합하는 항체를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 26을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 27을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 28을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F09 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 32를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 33을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 20을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F16 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 26을 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 27을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 28을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F09 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 15를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 19를 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 21을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 29를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 30을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 31을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 32를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 33을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 20을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F16 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 서열 번호 29를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 30을 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 31을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RB_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제1 가변 영역, 및 서열 번호 15를 포함하는 CDR1 서열, 서열 번호 19를 포함하는 CDR2 서열, 및 서열 번호 21을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 IL2RG_F18 패밀리의 구성원을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 7의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열, 및 서열 번호 9의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열, 및 서열 번호 10의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열, 및 서열 번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열, 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열, 및 서열 번호 21의 CDR3 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
표 5는 본 발명의 실시 형태에 따른 이중특이성 IL2RB x IL2RG 항체의 다양한 CDR 조합의 요약을 제공한다.
[표 5]
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 11의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 22의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 13의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 14의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 22의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하고 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 및 IL2RG에 결합하고 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.
표 6은 본 발명의 실시 형태에 따른 이중특이성 IL2RB x IL2RG 항체의 다양한 중쇄 가변 영역 조합의 요약을 제공한다.
[표 6]
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 제1 및 제2 폴리펩티드, 즉 제1 및 제2 폴리펩티드 서브유닛을 포함하며, 여기서, 각각의 폴리펩티드는 중쇄 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 힌지 영역, 또는 힌지 영역의 적어도 일부를 추가로 포함하며, 이는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이에 적어도 하나의 디술피드 결합을 형성하는 것을 촉진할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 적어도 하나의 중쇄 불변 영역(CH) 도메인, 예컨대 CH2 도메인, 및/또는 CH3 도메인, 및/또는 CH4 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, CH 도메인에는 CH1 도메인이 결여되어 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 각각의 항원 결합 도메인은 다중특이성 항체에 항원 결합 능력을 부여하기 위해 본원에 기재된 임의의 CDR 서열 및/또는 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 각각의 폴리펩티드 서브유닛은 상이한 IL2R 서브유닛 또는 사슬(예를 들어, IL2RB 및 IL2RG)에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이 및 T366W 돌연변이(놉)를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 서열, 및 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, T366S 돌연변이, L368A 돌연변이 및 Y407V 돌연변이(홀)를 포함하는 제2 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 이 변이체 또는 변형 IgG4 Fc 도메인은 원치 않는 Fab 교환을 방지하고, 항체의 이펙터 기능을 감소시키며, 또한 중쇄 폴리펩티드 서브유닛들의 이종이량체화를 촉진하여 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체를 형성한다.
본원에 기재된 다중특이성 항체의 구성요소(즉, CDR 서열, 가변 영역 서열 및 Fc 도메인 서열(예를 들어, 힌지, CH2 및 CH3 도메인 서열))는 IL2R, 예를 들어 IL2RB 및 IL2RG에 결합하고 유익한 특성, 예를 들어 감소된 이펙터 기능 활성, 증가된 IL2R 작용 활성 등을 갖는 다중특이성 항체를 생성하기 위해 다양한 방식으로 조합될 수 있다.
표 7은 인간 IgG1 및 IgG4 Fc 영역 서열의 서열뿐만 아니라 추가적인 원하는 특성을 부여하는 추가적인 돌연변이(변이체)를 포함하는 버전의 이들 서열도 제공한다.
[표 7]
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 53의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 61의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 62의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 63의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 64의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 65의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 66의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 67의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 34의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 35의 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 IL2RB에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제1 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 36의 서열을 포함함), 및 IL2RG에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(여기서, 제2 중쇄 폴리펩티드 서브유닛은 서열 번호 37의 서열을 포함함)을 포함한다.
표 8은 본 발명의 실시 형태에 따른 이중특이성 IL2RB x IL2RG 항체의 다양한 중쇄 폴리펩티드 서브유닛 서열 조합의 요약을 제공한다.
[표 8]
본원에 언급된 추가 서열은 참고를 위해 표 9 및 표 10에 제공된다.
[표 9]
[표 10]
세포 내재화
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 일단 결합 표적(예를 들어, IL2R)에 결합되면 세포 내로 내재화되며, 여기서, 내재화는 내재화되지 않는 하나 이상의 대조 항체와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, or 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 또는 적어도 약 200% 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법의 양태는 원하는 효과를 달성하기 위해, 예를 들어 IL2R 작용제로서 작용하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체를 세포 내에 내재화하는 것을 포함한다.
세포 내재화 결과는 도 7a~도 7b에 제공된다. 도 7a에는 인간 PBMC로부터의 CD8+ T-세포에 의한 표시된 항-IL2Rβ/γ UniAbsTM의 내재화가 시간의 함수로서 도시되어 있다. 도 7b에는 이 데이터가 표 형식으로 도시되어 있다. UniAbTM의 표면 수준을 유세포 분석법으로 탐지하고, 내재화되지 않은 세포와 비교하여 보고하였다. 관찰된 반감기는 0.27시간 내지 0.81시간의 범위였다. 여기서 관찰된 바와 같이, 내재화는 잠재적으로 이중특이성 항체의 특정 항-IL2RG 아암에 부분적으로 의존하였으며, 그 이유는 IL2RG_F16B 결합 서열을 포함하는 분자가 다른 항-IL2RG 결합 서열을 함유하는 분자보다 더 빠르고 더 큰 정도로 내재화되었기 때문이다.
항-IL2R 항체의 제조
본 발명의 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원의 항체는 트랜스제닉 마우스 및 래트를 포함한 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 래트(여기서, 내인성 면역글로불린 유전자는 녹아웃되거나 무력화됨)에 의해 생성된다. 일부 실시 형태에서, 본원의 중쇄 항체는 UniRatTM에서 생성된다. UniRatTM는 침묵된 내인성 면역글로불린 유전자를 갖고 있으며, 완전 인간 HCAb의 다양한, 자연적으로 최적화된 레퍼토리를 발현하기 위해 인간 면역글로불린 중쇄 전좌(translocus)를 사용한다. 래트의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 다양한 기술을 사용하여 녹아웃 또는 침묵될 수 있지만, UniRatTM에서는 징크 핑거 (엔도)뉴클레아제(ZNF) 기술을 사용하여 내인성 래트 중쇄 J-유전자좌, 경쇄 Cκ 유전자좌, 및 경쇄 Cλ 유전자좌를 불활성화시켰다. 난모세포에 미세주입하기 위한 ZNF 구축물은 IgH 및 IgL 녹아웃(KO) 주(line)을 생성할 수 있다. 자세한 내용은 예를 들어 문헌[Geurts et al., 2009, Science 325:433]을 참조한다. Ig 중쇄 녹아웃 래트의 특성화는 문헌[Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941]에 보고된 바 있다.. ZNF 기술의 장점은 최대 수 kb의 결실을 통해 유전자 또는 유전자좌를 침묵시키기 위한 비상동 말단 연결도 상동성 통합을 위한 표적 부위를 제공할 수 있다는 것이다(문헌[Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67]). UniRatTM에서 생성된 인간 중쇄 항체는 UniAbsTM라고 하며, 종래의 항체로는 공격할 수 없는 에피토프에 결합할 수 있다. 이들은 높은 특이성, 친화성, 및 작은 크기로 인해 단일 및 다중 특이적 용도에 이상적이다.
UniAbsTM 외에도, 낙타과 VHH 프레임워크 및 돌연변이, 및 이들의 기능성 VH 영역이 결여된 중쇄-단독 항체가 본원에 구체적으로 포함된다. 이러한 중쇄-단독 항체는 예를 들어 WO2006/008548에 기재된 바와 같이, 예를 들어 완전 인간 중쇄-단독 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 래트 또는 마우스에서 생성될 수 있지만, 다른 트랜스제닉 포유류, 예컨대 토끼, 기니피그 및 래트도 사용될 수 있다. 중쇄-단독 항체(이들의 VHH 또는 VH 기능성 단편 포함)는 또한, 예를 들어 포유류 세포(예를 들어 CHO 세포), 이. 콜라이, 또는 효모를 비롯한 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에서 코딩 핵산을 발현시킴으로써, 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.
중쇄-단독 항체의 도메인들은 항체와 소분자 약물의 장점을 합한 것으로서, 1가 또는 다가일 수 있으며; 독성이 낮으며; 제조 비용이 효율적이다. 작은 크기로 인해, 이러한 도메인은 경구 또는 국소 투여를 포함하여 투여하기 쉽고, 위장 안정성을 포함하여 높은 안정성을 특징으로 하며; 이들의 반감기는 원하는 용도 또는 적응증에 맞춰질 수 있다. 또한, HCAb의 VH 및 VHH 도메인은 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있다.
특정 실시 형태에서, UniAbsTM를 포함하는 본 발명의 중쇄 항체는, FR4 영역의 첫 번째 위치(Kabat 넘버링 시스템에 따르면 아미노산 위치 101)의 천연 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 갖는데, 이는 해당 위치에서 천연 아미노산 잔기를 포함하거나 이와 회합된 표면 노출된 소수성 패치를 파괴할 수 있다. 이러한 소수성 패치는 일반적으로 항체 경쇄 불변 영역과의 인터페이스에 묻혀 있지만, HCAb에서 표면 노출되며, 적어도 부분적으로는 HCAb의 원치 않는 응집 및 경쇄 회합을 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 치환 아미노산 잔기는 하전된 것이다. 일부 실시 형태에서, 치환 아미노산 잔기는 양으로 하전된 것, 예컨대 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 또는 히스티딘(His, H), 예를 들어, 아르기닌(R)이다. 일부 실시 형태에서, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 중쇄-단독 항체는 위치 101에서 Trp에서 Arg로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생성된 HCAb는 응집의 부재 하에 생리학적 조건 하에 높은 항원 결합 친화도 및 용해도를 갖는다.
본 발명의 일부로서, ELISA 단백질 및 세포-결합 분석에서 인간 IL2R에 결합하는, UniRatTM 동물로부터의 특유 서열을 갖는 인간 IgG 항-IL2R 중쇄 항체(UniAbTM)가 확인되었다. 확인된 중쇄 가변 영역(VH) 서열은 인간 IL2R 단백질 결합 및/또는 IL2R+ 세포에 대한 결합에 대해 양성이고, IL2R을 발현하지 않는 세포에 대한 결합에 대해서는 모두 음성이다.
IL2R 단백질 상의 비중첩 에피토프에 결합하는 중쇄 항체, 예를 들어 UniAbsTM는 효소-결합 면역분석(ELISA 분석) 또는 유세포 경쟁 결합 분석과 같은 경쟁 결합 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원에 결합하는 알려진 항체와 관심 항체 사이의 경쟁을 사용할 수 있다. 이 접근법을 사용하면, 일련의 항체를 기준 항체와 경쟁하는 것과 그렇지 않은 것으로 나눌 수 있다. 비경쟁 항체는 기준 항체가 결합하는 에피토프와 중첩되지 않는 별개의 에피토프에 결합하는 것으로 확인된다. 대개, 하나의 항체가 고정되고, 항원이 결합되고, 제2의 표지된(예를 들어, 비오티닐화) 항체가 포획 항원에 결합하는 능력에 대해 ELISA 분석에서 테스트된다. 이는 또한, Octet Red384 및 Octet HTX(ForteBio, Pall Inc)와 같은 생물층 간섭계 플랫폼에서뿐만 아니라, ProteOn XPR36(BioRad, Inc), Biacore 2000 및 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences), 및 MX96 SPR 이미저(Ibis technologies B.V.)를 비롯한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 더 자세한 내용은 본원의 실시예를 참조한다.
전형적으로, 항체는 표준 기술, 예컨대 상기 기재된 경쟁 결합 분석으로 측정시 표적 항원에 대한 기준 항체의 결합을 약 15~100% 감소시키는 경우 기준 항체와 "경쟁"한다. 일부 실시 형태에서, 경쟁적 결합은 효소 결합 면역분석(ELISA 분석)을 사용하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, 하나의 항체가 고정되고, 항원이 결합되고, 제2의 표지된(예를 들어, 비오티닐화) 항체가 포획 항원에 결합하는 능력에 대해 ELISA 분석에서 테스트된다. 이는 예를 들어, Octet Red384 및 Octet HTX(ForteBio, Pall Inc)와 같은 생물층 간섭계 플랫폼에서뿐만 아니라, 예를 들어 ProteOn XPR36(BioRad, Inc), Biacore 2000 및 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences), 및 MX96 SPR 이미저(Ibis technologies B.V.)와 같은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 경쟁적 결합은 유세포 분석 경쟁적 결합 분석을 사용하여 측정된다.
다양한 실시 형태에서, 상대적 억제는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50% 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상이다.
제약 조성물
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 하나 이상의 항체를 적합한 제약상 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 제약상 허용가능한 담체는 보조제, 고체 담체, 물, 완충제, 또는 치료 성분을 보유하기 위해 당업계에서 사용되는 다른 담체, 또는 이들의 조합으로 예시되지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시 형태에서, 제약 조성물은 IL2R에 결합하는 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 제약 조성물은 IL2R 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 에피토프(예를 들어, 제1 IL2R 폴리펩티드 사슬(예를 들어, IL2RB) 상의 제1 에피토프 및 제2 IL2R 폴리펩티드 사슬(예를 들어, IL2RG) 상의 제2 에피토프)에 결합하는 다중특이성(이중특이성 포함) 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제약 조성물은 IL2RB 및 IL2RG에 결합하는 다중특이성(이중특이성 포함) 중쇄 항체(예를 들어 UniAbTM)를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 항체의 제약 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 단백질을 선택적인 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 참조)와 혼합하여 보관을 위해, 예컨대 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸, 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물(글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함); EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비경구 투여용 제약 조성물은 멸균이고 실질적으로 등장성이며, GMP(Good Manufacturing Practice) 조건 하에 제조된다. 제약 조성물은 단위 투여 형태(즉, 단일 투여에 대한 투여량)로 제공될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 따라 다르다. 본원의 항체는 정맥 주사 또는 주입 또는 피하로 투여될 수 있다. 주사 투여의 경우, 본원의 항체는 수성 용액, 예를 들어 주사 부위의 불편함을 감소시키기 위해 생리학적으로 양립가능한 완충액 중에 제형화될 수 있다. 용액은 상기 논의된 바와 같은 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 무발열원 멸균수와 함께 구성하기 위한 동결건조 형태일 수 있다.
항체 제형은 예를 들어 미국 특허 제9,034,324호에 개시되어 있다. 유사한 제형이 본 발명의, UniAbsTM를 포함하는 중쇄 항체에 대해 사용될 수 있다. 피하 항체 제형은, 예를 들어, US20160355591 및 US20160166689에 기재되어 있다.
사용 방법
본원에 기재된 항-IL2R 항체 및 제약 조성물은 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포, 예컨대 이펙터 T-세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 IL2R 신호전달을 활성화함으로써 매개되는 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 질환 또는 병태는 감염성 질환, 자가면역 장애(예를 들어, 크론병, 다발성 경화증), 암, 염증성 질환(예를 들어, 관절염), IL-2 매개 신호 전달 결함, T-세포 증식 결함, 또는 T-세포 기능장애와 관련된 질환 또는 장애일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 증가된 IL-2 매개 신호전달이 환자에게 치료적인 것이다. 일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 T-세포 반응 결함, 예를 들어 CD8+ T-세포 반응 결함과 관련된다.
일부 실시 형태에서, 치료는 다음에 의해 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 것을 목표로 한다: CD3+ T-세포 수 증가, CD4+ T-세포 수 증가, CD8+ T-세포 수 증가, CD8+ 이펙터 T-세포(예를 들어, CTL) 수 증가, NK 세포 수 증가, CD8+ T-세포 대 CD4+ T-세포의 비의 증가, Treg의 비율의 감소, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 감염으로 나타날 수 있거나, 감염에 대해 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 없는 상태로 나타날 수 있다. 감염은 만성적이거나 지속적이거나 잠복적이거나 느릴 수 있으며 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염의 결과일 수 있다. 따라서 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염이 있는 환자에게 치료가 제공될 수 있다. 박테리아 감염의 비제한적인 예는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염을 포함한다. 바이러스 감염의 비제한적인 예는 EBV, HIV, B형 간염 또는 C형 간염 감염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 질환 또는 장애는 예를 들어 종양 면역 탈출과 같이 암과 관련될 수 있다. 많은 인간 종양은 T-세포에 의해 인식되고 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 관련 항원을 발현한다. 암은 또한 T-세포 기능장애 장애의 징후가 없는 경우에도 치료될 수 있지만, 본원에 기재된 항체의 사용은 효과적인 면역 반응을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, 치료는 IL-2 매개 신호전달의 결함 및/또는 감소와 관련된 질환 또는 장애의 예방을 목표로 한다. 따라서, 본원에 기재된 항체는 제약 조성물 또는 의약을 제형화하는 데 사용될 수 있으며, 대상체는 질환 상태의 발병에 대해 예방적으로 치료받을 수 있다. 이는 질환 상태의 증상이 시작되기 전에 일어날 수 있고/있거나, 이러한 치료는 질환 또는 장애의 위험이 더 큰 것으로 간주되는 대상체에게 제공될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본원의 방법은 조절 T 세포(Treg)를 우선적으로 활성화시키지 않고서 면역 이펙터 세포의 활성화를 유도하는 것을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 Treg의 우선적 활성화 없이 인간 면역 이펙터 세포에서 IL2R 신호전달의 활성화를 유도하도록(즉, 작용제로서 작용하도록) IL2 수용체의 베타 및 감마 서브유닛 둘 모두를 동시에 표적화하여, T-이펙터 및 NK-세포의 활성화 쪽으로 균형을 이동시키는 다중특이성 항체가 IL2R 신호전달 활성화에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료 결과를 개선시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 양태는 치료적 유효량의 본원에 기재된 상기 하나 이상의 항체를 투여함으로써 대상체의 면역 반응을 강화하거나 보조하는 치료 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 암성 세포를 파괴하는 면역 반응을 달성하기 위해 본원에 기재된 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기재된 항체는 IL2R 신호전달 경로의 작용제로서 작용하여 이러한 결과를 달성한다. 본 발명의 실시 형태에 따른 방법은 또한 병용 요법을 포함하며, 여기서, 대상체에게 또 다른 요법 과정, 예를 들어 화학요법 섭생법과 함께 본원에 기재된 바와 같은 항체가 투여된다.
일 양태에서, IL2R 신호전달 경로에 대한 작용제 활성을 갖는 본원에 기재된 바와 같은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체가 암 치료에 사용된다. 이러한 치료가 가능한 암은 진행성 또는 전이성 암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양 암이다. 본 발명의 실시 형태에 따른 고형 종양 암은 신세포 암종, 흑색종, 요로상피암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 육종, 두경부 편평 세포 암종, 및 전이성 거세 저항성 전립선암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 양태는 또한, 면역 세포에서 IL2R 신호전달을 자극하는 방법을 포함하며, 여기서, 본 방법은 면역 세포를 본원에 기재된 바와 같은 항체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 작용성 이중특이성 항체)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 방법은 IL2RB 및 IL2RG 둘 모두에 결합하고 IL2R 복합체의 작용제로서 작용하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체와 면역 세포를 접촉시킴으로써 면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체 수용체 복합체를 자극하는 것을 포함한다. 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는, IL2R을 발현하는 임의의 다양한 면역 세포가 대상 방법에 포함될 수 있다: CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 자연 살해(NK) 세포.
질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 기타 투여 약물, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 포함한 다양한 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 비인간 포유류, 예를 들어 개, 고양이, 말 등과 같은 반려동물, 토끼, 마우스, 래트 등과 같은 실험실용 포유류 등도 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하도록 적정될 수 있다.
투여량 수준은 통상의 숙련된 임상의에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 필요에 따라, 예를 들어 요법에 대한 대상체의 반응을 변경하기 위해 필요에 따라 변경될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다르다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다.
일부 실시 형태에서, 제제의 치료적 투여량은 숙주 체중 1 kg당 약 0.0001 내지 100 mg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 체중 1 kg당 1 mg 또는 체중 1 kg당 10 mg, 또는 1~10 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주에 1회, 또는 1개월에 1회, 또는 3 내지 6개월에 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 치료적 엔티티(entity)는 일반적으로 여러 차례 투여된다. 단회 투여량 사이의 간격은 매주, 매월, 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 치료적 엔티티의 혈중 농도를 측정하여 나타나는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 치료적 엔티티는 서방형 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량과 빈도는 환자에서의 폴리펩티드 반감기에 따라 다르다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조되며; 주사 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 본원의 제약 조성물은 직접 또는 고체(예를 들어, 동결건조된) 조성물의 재구성 후, 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합하다. 또한 본 제제는 상기 논의된 바와 같이 강화된 보조 효과를 위해 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 공중합체와 같은 마이크로 입자 또는 리포솜에 캡슐화되거나 유화될 수 있다. 문헌[Langer, Science 249: 1527, 1990] 및 문헌[Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997]. 본 발명의 제제는 활성 성분의 지속적 또는 주기적 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사제 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 멸균, 실질적 등장성 상태로 제형화되며, 미국 식품의약국의 모든 GMP(Good Manufacturing Practice) 규정을 완전히 따른다.
본원에 기재된 항체 및 항체 구조의 독성은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약학 절차에 의해, 예를 들어 LD50(집단의 50%를 치사에 이르게 하는 용량) 또는 LD100(집단의 100%를 치사에 이르게 하는 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인체에 사용하기에 독성이 없는 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 항체의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 용량을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투약 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 의사 각자가 선택할 수 있다.
투여용 조성물은 일반적으로, 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 수성 담체에 용해된 항체 또는 기타 제거제(ablative agent)를 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균이며 일반적으로는 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 통상적인 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하는 데 필요한 제약상 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이러한 제형에서의 활성제의 농도는 크게 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 주로 체액 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980)] 및 문헌[Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)]).
본 발명의 활성제, 이의 제형, 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범주 내에 있다. 키트는 적어도 하나의 추가 시약, 예를 들어 화학요법 약물 등을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "라벨"이라는 용어는 키트에 또는 키트와 함께 제공되거나, 달리 키트에 부속되는 임의의 글 또는 기록 자료를 포함한다.
이제 예시적 실시 형태를 충분히 설명하였지만, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 다양한 변화 및 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
재료 및 방법:
항체 구축물 명칭
하기 표(표 11)는 본원에서 평가된 6가지의 이중특이성 항체 구축물에 대한 약칭 명명을 제공한다:
[표 11]
면역화, 차세대 서열결정, 클론형 분석 및 클로닝
방법은 본질적으로 문헌[Harris et al. Front Immunol. 2018 Apr 24; 9:889(60)]에 기재된 바와 같다. 간단히 말하면, UniRat 동물을 48일 프로토콜 또는 DNA 면역화에서 재조합 단백질 항원과 함께 표준 보조제(Complete Freunds 또는 Titermax/Ribi)를 사용하여 면역화하였다. 단백질 면역화를 위해, 부스트는 적절한 보조제와 함께 각 동물의 각 다리에 주사되는 10 μg의 재조합 단백질로 이루어졌다. DNA 면역화의 경우, 금 입자를 표적 항원의 cDNA를 포함하는 벡터로 코팅하고, 그 후 이를 유전자 총을 사용하여 7일마다 피하 투여하였다. ELISA에 의해 항원에 대한 혈청 역가를 평가하기 위해 면역화 후 혈장 샘플을 수집하였다.
대략 7주(단백질 항원) 또는 10주(DNA 항원)의 면역화 후, 배수 림프절을 수확하고 전체 RNA를 단리하였다. Ig 중쇄 서열을 문헌[Harris et al. Front Immunol. 2018 Apr 24; 9:889]에 이전에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제1 가닥 cDNA 합성 및 5' RACE(PCR에 의해)를 사용하여 증폭시키고, 그 후 겔 추출에 의해 정제하였다.
2 x 300 쌍 형성 말단 판독을 이용하여 MiSeq 플랫폼(Illumina)을 사용하여 차세대 서열결정을 완료하였다. 샘플의 다중화를 가능하게 하기 위해 프라이머 확장에 의해 인덱싱 표지체를 부가하였다. 각 샘플에는 대략 100,000개의 쌍 형성 판독이 포함되었으며, 인간 Ig 유전자좌에 대한 20개 미만의 뉴클레오티드의 정렬을 나타낸 판독을 폐기하였다. VH 영역의 병합된 정방향 및 역방향 판독을 오픈 리딩 프레임으로 번역하고, 프레임워크 및 CDR 영역을 IGBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)에 의해 확인하였다. 병합 클러스터링을 사용하여 샘플에 대해 클론형(80% 이상의 서열 유사성을 갖는 CDR3 단백질 서열에 의해 정의됨)을 결정하였다. CDR3 클론형은 해당 클론형에 의해 정의된 샘플 중 총 판독의 퍼센트에 의해 순위를 매겼다. 가장 큰 풍부도를 갖는 것들이 CH1-결실 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 발현 벡터로의 고처리량 클로닝을 위해 우선시되었고 Sanger 서열결정에 의해 검증되었다. LB 배양 배지에서 성장시킨 이. 콜라이를 플라스미드로 형질전환시키고, 그 후 이를 정제하여 96웰 형식으로 HEK 293 세포를 일시적으로 형질감염시키는 것을 가능하게 하였다. 수 일의 발현 후, 항체를 함유하는 상청액을 수확하고 청징화하였다(원심분리에 의해).
고처리량 ELISA
방법은 본질적으로 문헌[Harris et al. Front Immunol. 2018 Apr 24; 9:889]에 기재된 바와 같다. 간단히 말하면, BupH 카르보네이트-바이카르보네이트 완충액을 사용하여 재조합 단백질을 96웰 플레이트에서 4℃에서 하룻밤 코팅하였다(인간 IL-2Rβ, Acrobiosystems; 시노몰구스 IL-2Rβ, Sino Biological). 그 후 플레이트를 TBST(20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.6)로 세척하고, 차단 완충액(1% 분유 함유 TBST)으로 차단하였다. 항체를 함유하는 HEK 293 상청액을 차단 완충액에 1:100으로 희석하고, 항원 코팅 플레이트에 첨가하였다. HRP-표지 항-인간 Ig 이차 항체를 화학발광 기질과 함께 사용하여 결합 항체의 검출을 수행하였다.
발광을 정량화하고(SpectraMax i3X, Molecular devices), 각 웰에 대한 신호를 비형질감염 HEK 293 세포로부터의 상청액과 함께 인큐베이션한 항원 코팅 웰의 평균 배경 발광으로 나누어 정규화하였다.
세포주 및 PBMC
M07e 세포를 DSMZ로부터 획득하고, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10 ng/mL rhGM-CSF를 함유하는 RPMI 배지에서 성장시켰다. HSC-F 세포를 The Nonhuman Primate Reagent Resource로부터 획득하고, 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 55 μM β-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 293-F를 Gibco로부터 획득하고, 이의 권장 사항에 따라 성장시켰다.
인간 IL-2Rβ 또는 시노몰구스 IL-2Rβ를 발현하는 안정한 세포주를 생성하기 위해 발현 구축물은 항원에 대한 전장 cDNA 및 NeoR 선발 카세트를 지니고 있었다. 그 후 각 발현 구축물을 선형화하고, 이를 사용하여 CHO 세포를 전기천공하였다. 형질감염 3일 후, 제네티신 처리를 사용하여 세포를 3~6주 동안 선발하였다. 선발 기간이 끝나면, 모든 비형질감염 세포주 및 음성 대조 세포주는 사멸된 반면, 모든 형질감염된 풀은 성공적으로 형질감염된 풀에 대해 예상되는 바와 같이 재성장을 나타냈다. 그 후 각 표적의 4개 풀을 유세포 분석법에 의해 양성 대조 항체에 대한 결합에 대해 분석하였다. CHO 세포를 위한 배양 배지는 8 mM L-글루타민, 0.1 μg/L IGF-1, 5% 투석 FBS, 0.45 mg/mL 제네티신 및 0.45 mg/mL 하이그로마이신을 함유하는 EX-CELL® 325 PF CHO 배지였다. 세포를 현탁 상태에서 성장시키고 0.5x106/mL 내지 2x106/mL의 농도에서 유지하였다.
Ficoll® Paque Premium(GE Healthcare Life Sciences) 밀도 구배 원심분리에 의해 신선한 백혈구 성분채집 팩(StemCell)으로부터 사내에서 인간 PBMC를 단리하였다.
유세포 분석에 의한 세포 결합
세포, 항체 및 시약의 모든 세척 및 희석은 유동 완충액(1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3, pH 7.4)을 사용하여 수행하였다. 염색을 100,000개의 세포/웰로 시딩된 둥근 바닥 96웰 플레이트(Corning)에서 수행하고, 모든 인큐베이션을 4℃에서 또는 얼음 위에서 수행하였다. 일차 및 이차 스크린의 경우, 세포를 50 μL의 총 부피로 사전 희석 테스트 항체(이차 스크린 및 용량 곡선) 또는 항체를 함유하는 1:5 희석 HEK 293 상청액(일차 스크린 및 다양성 스크린의 경우)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 μL 유동 완충액으로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 유동 완충액 중 0.625 μg/mL의 검출 항체(Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-PE, Southern Biotech)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 2회 더 세척한 후, 세포를 최종 부피 150 μL의 유동 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 BD FACSCelesta 또는 Guava easyCyte 8-HT 유세포 분석기에서 분석하였다. 적어도 3000개의 이벤트를 수집하고, PE 기하 평균 형광 강도를 배경에 대한 배수로서 플로팅하였다(세포를 단지 이차 검출 항체와 함께 인큐베이션함). 인간 또는 시노몰구스 PBMC를 수반하는 일부 이차 스크린에서, 추가 CD4 항체(BioLegend) 및/또는 CD8 항체(BioLegend)를 포함시켜 세포 결합을 추가로 특성화하였다.
유세포 분석에 의한 pSTAT5 검출
유세포 분석에 의한 pSTAT5의 검출을 위해, 냉동 전혈(시노몰구스) 또는 냉동 LeukoPak(인간)으로부터 PBMC를 준비하였다. 세포를 해동하고, 완전 RPMI 배지로 2회 세척하고, 5x106개의 세포/mL로 재현탁하였다. 그 후 100 μL/웰의 이들 세포를 멸균, 둥근 바닥 96웰 플레이트(Corning)로 옮기고 AeraSealTM(Excel Scientific)로 밀봉하였다. 그 후 플레이트를 37℃및 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 사전 희석 항체(또는 IL-2/IL-2 변이체)를 적절한 웰에 첨가하였다. 최종 농도 10 nM의 IL-2(R&D Systems)를 대조 웰에 사용하여 검출가능 pSTAT5를 보장하였다. 그 후 플레이트를 재밀봉하고, 추가 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣어 두었다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 4℃까지 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 Human TruStain FcX(BioLegend)로 차단하고, 그 후 후속적으로 Fixable Viability Dye(Invitrogen) 및 CD3, CD4, CD8, CD25 및/또는 CD56에 대한 항체로 30분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 다시 원심분리하고, 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 200 μL/웰의 Fixation Buffer(BioLegend)의 첨가에 의해 고정하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 고정 후, 세포를 원심분리하고, Flow Buffer(1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 다음으로, 세포를 -20℃까지 사전 냉각시킨 200 μL/웰의 True-Phos 완충액(BioLegend)에 재현탁하여 투과화시키고, -20℃냉동고로 옮겼다(하룻밤). 다음날 아침, 세포를 원심분리하고, 유동 완충액으로 2회 세척한 후, 항-pSTAT5(BD Biosciences)로 30분 동안 염색하였다. 2회 추가 세척 후, 세포를 125 μL/웰의 유동 완충액에 재현탁하고, BD FACSCelesta에서 획득하였다.
유세포 분석에 의한 Ki67 검출
유세포 분석에 의한 Ki67의 검출을 위해, 냉동 인간 PBMC(이전에 LeukoPak으로부터 사내 단리됨)를 해동하고, 1x106개의 세포/mL로 완전 RPMI 배지에서 하룻밤 방치하였다. 분석 당일 아침에 PBMC를 완전 RPMI로 세척하고, 1e6개의 세포/mL로 재현탁하였다. 그 후, 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 PBMC 100 μL, 0.16X ImmunoCult(StemCellTech) 50 μL 및 희석 항체 또는 rhIL-2(R&D Systems) 50 μL를 첨가하였다. 0.5X ImmunoCult를 염색 대조군에 사용하여 보상을 위한 검출가능 Ki67 및 CD25 신호를 보장하였다. 그 후 플레이트를 덮고, 37℃및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 3일 후, 배지를 100 μL/웰의 상응하는 농도의 항체 및 ImmunoCult로 리프레쉬하고, 그 후 인큐베이터에 다시 넣었다. 추가 3일(총 6일) 후, 세포를 원심분리하고 4℃까지 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 Human TruStain FcX(BioLegend)로 차단하고, 그 후 후속적으로 Fixable Viability Dye(Invitrogen) 및 CD3, CD4, CD8, CD25 및/또는 CD56에 대한 항체로 30분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 다시 원심분리하고, 사전 냉각시킨 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 고정하고, 200 μL/웰의 FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer 작업 용액(Invitrogen)을 사용하여 1시간 동안 투과화시켰다. 투과화 후, 세포를 원심분리하고, 투과화 완충액으로 2회 세척한 후, 항-FoxP3(BioLegend) 및 항-Ki67(BioLegend)로 30분 동안 염색하였다. 2회 추가 세척 후, 세포를 125 μL/웰의 유동 완충액에 재현탁하고, BD FACSCelesta에서 획득하였다.
전혈 사이토카인 방출 분석
AllCells로부터 획득한 신선한 인간 전혈(헤파린 처리)을 사용하여 사이토카인 분비를 검출하였다. 하기 방법은 문헌[B. Wolf et al. Cytokine 60 (2012) 828-837(61)]으로부터 수정하였다. 20X 농축(1X PBS에 희석) 테스트 물품 12.5 μL를 멸균 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 여기에 비특이적 활성화를 감소시키기 위해 최소한의 피펫팅으로 237.5 μL의 신선한 인간 전혈을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 37℃및 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 플레이트를 1800 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 그 후 50 μL의 혈청을 96웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 그 후 혈청을 즉시 MSD(#K15010K-1 또는 맞춤형 U-Plex 플레이트)로 테스트하거나 나중에 테스트하기 위해 -80℃에서 냉동시켰다.
마우스 약동학(PK) 평가
BsAb-1 및 BsAb-2의 PK를 1 mg/kg의 단회 꼬리 정맥 주사 후 6마리의 수컷 BALB/c 마우스에서 각각 평가하였다(n=3 * 6개의 군, Aragen Biosciences, 미국 캘리포니아주 모건 힐 소재). 혈청 샘플을 투여 후 14일의 과정에 걸쳐 선택된 시점에서 수집하였다.
BsAb-5의 PK를 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 단회 꼬리 정맥 주사 후 9마리의 암컷 BALB/c 마우스의 두 군에서 평가하였다(투여군당 9마리의 마우스, CrownBio, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재). 혈청 샘플을 투여 후 14일의 과정에 걸쳐 선택된 시점에서 수집하였다.
마우스 가속 GVHD 연구
각각의 면역 손상 NSG 마우스(프랑스 소재 Charles River로부터의 8~9주령)에 연구 -1일차에 1.5 Gy를 조사하였다. 마우스를 4개 군(n=5)으로 나누고, 2명의 상이한 PBMC 기증자를 사용하여 2회의 독립적인 실험을 수행하였다. 연구 0일차에 각 마우스에게 2명의 기증자 중 한 명으로부터의 2천만 개의 인간 PBMC를 IV로 입양 전달하였으며, 각 마우스를 비히클 대조군(100 μL), 22 μg rhIL-2(350,000 UI/마우스, Proleukin, Novartis)(매일), 1 mg/kg BsAb-1(주 2회) 또는 1 mg/kg BsAb-2(주 2회)로 처리하였다. GVHD를 모든 동물에서 시간 경과에 따른 체중 감소의 측정에 의해 평가하였다. 20%의 체중 감소가 관찰되었을 때 동물을 안락사시켰다.
두 번째 실험에서, NSG 마우스(프랑스 소재 Charles River로부터의 8~9주령)에 연구 -1일차에 1.5 Gy를 조사하였다. 마우스를 4개 군으로 나누고, 2명의 상이한 PBMC 기증자를 사용하여 2회의 독립적인 실험을 수행하였다. 연구 0일차에 각 마우스에게 2명의 기증자 중 한 명으로부터의 2천만 개의 CSFE-표지 인간 PBMC를 IV로 입양 전달하였으며, 각 마우스를 비히클 대조군(100 μL)(n=7), 22 μg rhIL-2(350,000 UI/마우스)(매일)(n=6), 1 mg/kg BsAb-1(주 2회)(n=6) 또는 1 mg/kg BsAb-2(주 2회)(n=6)로 처리하였다. 모든 동물을 연구 5일차에 희생시켰다.
유세포 분석에 의한 생착된 PBMC의 면역표현형 결정을 희생 당일 마우스 비장으로부터 제조된 단일 세포 현탁액에서 수행하였다. 검출 방법은 인간 PBMC를 숙주 세포와 더 잘 구별하기 위해 상이한 항체 패널들을 사용한 것을 제외하고는 유세포 분석에 의한 Ki67 검출을 위한 상기 방법과 대체로 동일하였다. 세포를 항-인간 CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD16, CD19 및/또는 CD69로 표면 염색하였다. 고정 및 투과화 후, 세포 중 일부를 항-인간 FoxP3으로 염색하였다. 그 후 샘플을 유세포 분석기에서 수집하고 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
BsAb-5의 경우, 2천만 개가 아닌 1천만 개의 PBMC를 전달하였고, 마우스를 3개 군으로 나누었다.
시노몰구스 약력학(PD) 연구
BsAb-1 및 BsAb-2의 PD 프로파일을 0.03, 0.1 또는 0.3 mg/kg의 단회 IV(느린 볼루스) 용량 후 2~4세의 나이브 시노몰구스 원숭이 12마리에서 평가하였다. 각 처리군은 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷 시노몰구스 원숭이(Charles River Lab, 미국 네바다주 리노 소재)를 포함하였다. 혈액학, 혈청 화학, 사이토카인 및 PD 종점의 분석을 위해 투여 후 21일 동안 선택된 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다. 연구 종료 후, 연구로부터의 동물을 일반 서식지로 돌려보냈다. 모든 절차는 CRL IACUC의 승인을 받았으며, 동물 복지법, 실험실 동물의 관리 및 사용 지침 및 실험실 동물 복지국 지침에 따라 수행하였다.
시노몰구스 혈액 면역표현형 결정
수집된 각 시점의 혈액의 일부를 유세포 분석에 의한 정량화 및 면역표현형 결정에 사용하였다. 유세포 분석에 의한 Ki67 검출 방법은 시노 반응성 항체의 상이한 패널을 사용한 것을 제외하고는 위에서 설명한 것과 대체로 동일하였다. 세포를 CD3, CD4, CD8, CD20, CD25 및 CD159a에 대한 항체로 표면 염색하였다. 고정 및 투과화 후 세포를 FoxP3 및 Ki67에 대한 항체로 염색하였다. 그 후 샘플을 유세포 분석기에서 수집하고 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
이와 동시에, 각 혈액 샘플의 일부를 BD TruCount 튜브로 옮기고, 말초 혈액 세포 절대 카운트의 실시간 정량화를 위해 CD45로 염색하였다. 상기 혈액 분석으로부터의 세포 하위세트 백분율을 상응하는 TruCount 튜브로부터의 전체 세포 수에 적용하였다.
αIgG4 ELISA
마우스 혈청 중 BsAb-1 및 BsAb-2의 혈청 농도를 항원 포획 ELISA를 사용하여 결정하였다. 모든 세척 및 희석을 신선 제조 TBS-T(Accuris)를 사용하여 수행하였다. 200 μL/웰인 코팅, 차단 및 세척을 제외하고는 모든 부피는 100 μL/웰인 것으로 가정해야 한다. 분석 전날 밤, Nunc MaxiSorpTM 편평 바닥 플레이트(Invitrogen)를 카르보네이트-바이카르보네이트 완충액(Thermo Scientific)에서 1 μg/mL까지 희석한 재조합 인간 IL2Rγ 단백질로 코팅하고 4℃에서 방치하였다. 다음날 플레이트를 5회 세척하고 그 후 1% BSA로 30분 동안 차단하였다. 플레이트를 1회 세척하고, 그 후 혈청 샘플의 다수의 희석물들을 기준 표준물과 함께 첨가하였다. BsAb-1 및 BsAb-2에 대한 공지된 농도의 스톡을 사용하여 표준 곡선을 만들었다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 8회 세척하고, 그 후 3 μg/mL까지 희석한 비오티닐화 항-인간 IgG4-Fc(MABTECH)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하고, 그 후 다시 8회 세척하였다. 다음으로, 플레이트를 1:4000으로 희석한 HRP-Streptavidin(Thermo Scientific)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 추가로 8회 세척한 후, 플레이트를 실온 1-Step Ultra TMB(Thermo Scientific)와 함께 암소에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 2 N 황산을 사용하여 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450 nm 및 570 nm에서 평가하였다.
단백질 발현 및 정제
단일특이성 UniAbs를 제조업체의 설명서(ThermoFisher A29133, 표준 프로토콜)에 따라 ExpiCHO 세포에서 발현시켰다. 청징 상청액을 7일차에 수확하고, KingFisher Flex Platform(ThermoFisher)을 사용하여 단백질 A 자기 비드를 사용하여 정제하였다. 항체를 0.1 M 시트레이트, 0.1 M NaCl, 10% 글리세롤, 10% 수크로스, pH 3.5에서 용출시켰다.
이중특이성 UniAbs를 발현시키기 위해, ExpiCHO 세포를 2개의 발현 벡터(놉 및 홀 벡터, 놉 벡터는 C-말단 His-태그를 포함함)로 형질감염시키고, 고역가 프로토콜을 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 ExpiCHO 세포에서 발현시켰다. 청징 상청액을 수확하고, 용출을 위해 이미다졸 구배를 사용하여 IMAC(Ni Sepharose® Excel, Cytive Life Sciences)로 항체를 정제하였다. IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs 함유 분획을 풀링하고, 농축시키고, 양이온 교환으로 추가 정제하여 임의의 제품 관련 불순물을 제거하였다(Mono S® 10/100 GL 컬럼(Cytiva Life Sciences)). 모든 항체를 SEC-UPLC 및 SDS-PAGE로 분석하여 이의 크기 및 순도를 확인하였다.
시노몰구스 IL-2Rγ 서열을 Uniprot.org(UniProt 등록 ID: G7Q2Z6)로부터 얻었고, 세포외 도메인(aa Met1~Asn254)을 내인성 리더 서열 및 C-말단 His-태그를 포함하는 독점 벡터에 클로닝하였다. IL-2Rγ 시약을 공급업체 설명서(고역가 프로토콜, ThermoFisher)에 따라 ExpiCHO 세포에서 발현시켰다. 세포를 8일차에 수확하고, 상청액을 SDS-PAGE(NuPAGE 4~12% Bis Tris Gel)에서 러닝시켜 표적 단백질 발현을 확인하였다. 용출을 위해 이미다졸 구배를 사용하여 Ni-Sepharose Excel 수지(Cytiva Life Sciences)를 사용하여 IMAC에 의해 청징 수확물을 정제하였다. 피크를 풀링하고, QiaXpert(Qiagen)를 사용하여 정량화하였다.
돌연변이 IL-2 단백질(T3A, F42A, Y45A, L72G, C125A)의 클로닝, 발현 및 정제를 Lake Pharma에서 완료하였다. C-말단 His-태그를 부가하여, 표준 절차를 사용하고 이미다졸 구배를 사용한 용출을 사용하여 IMAC에 의해 정제할 수 있었다.
Octet-기반 오프-레이트(Off-Rate) 측정
모든 오프-레이트 측정은 진탕 속도를 1000 rpm으로 하여 항-인간 IgG Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 사용하여 25℃에서 96웰 마이크로플레이트에서 Octet Qk384 기기(ForteBio)에서 수행하였다. 오프-레이트 결정을 위해, 항체를 5 μg/mL로 AHC 센서에 로딩하였다. 동역학 완충액(0.02% Tween20, 0.1% BSA, 0.05% 소듐 아지드, 1X PBS)의 짧은 기준선을 따른다. 오프레이트 측정을 다음에 대해 수행하였다: 인간 IL-2Rβ(AcroBiosystems), 인간 IL-2Rγ(Sino Biological), 시노몰구스 IL-2Rβ(Sino Biological), 시노몰구스 IL-2Rγ(ExpiCHO 발현 시스템, 이어서 Ni-NTA His-태그 정제를 사용하여 사내에서 발현 및 정제), 마우스 IL-2Rγ(Sino Biological), 마우스 IL-2Rβ(Sino Biological), 인간 IL-2Rα(Sino Biological), IL-4R(Sino Biological), IL-7R(Sino Biological), IL-9R(R&D Systems ) 및 IL-21R(Sino Biological). 하기 항체를 양성 대조군으로 사용하여 표적 결합 및 시약 품질을 확인하였다: 항-인간 IL-9R(R&D Systems), 항-인간 IL-21R(R&D Systems), 항-인간 IL-7R(R&D Systems) 및 항-인간 IL-4Ra(R&D Systems). 그 후, 로딩된 센서를 결합 단계에 대해 100 nM 농도의 항원을 포함하는 웰에 담갔다. 해리를 동역학 완충액에서 모니터링하였다. 캡처 표면을 60초 동안 재생하였다. ForteBio 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅하여 결합율 및 해리율을 추출하였다.
Octet-기반 동역학 측정
모든 동역학 측정 실험을 항-인간 Fc 포획(AHC, 18-5005) 센서를 사용하여 ForteBio Octet Qk384 기기에서 수행하였다. 이중특이성 UniAbs 및 항원을 동역학 완충액(0.02% Tween20, 0.1% BSA, 0.05% 소듐 아지드, 1X PBS)에서 최종 농도까지 희석시켰다. 동역학 측정을 하기 항원에 대해 수행하였다: 인간 IL-2RB(AcroBiosystems), 인간 IL-2RG(AcroBiosystems), 시노몰구스 IL-2RB(Sino Biological), 시노몰구스 IL-2RG(ExpiCHO 발현 시스템, 이어서 Ni-NTA his-태그 정제를 사용하여 사내에서 발현 및 정제). 최대 로딩을 위해 항체를 5 μg/mL로 AHC 센서에 로딩하였다. 동역학 완충액의 짧은 기준선 이후, 결합 단계를 위해 일련의 피분석물 농도(7.8 nM~500 nM)에 센서를 노출시켰으며 배경 차감을 사용하여 센서 표류를 보정하였다. 해리를 동역학 완충액에서 모니터링하였다. 캡처 표면을 60초 동안 재생하였다. 모든 실험을 1000 rpm에서 진탕하면서 수행하였다. ForteBio 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅하여 결합율 및 해리율을 추출하였다. KD를 kd/ka 비를 사용하여 계산하였다. 6가지의 이중특이성 항체 구축물에 대한 동역학 데이터가 도 1에 제공되어 있다.
생물물리학적 특성 분석(Tm, Tagg)
UNcle 플랫폼에서 Tm 및 Tagg를 측정하였다. 간단히 말하면, 각 샘플 9 μL를 Uni(UNcle 카세트)에 이중으로 로딩하고, 1℃/분의 일정한 속도로 20℃로부터 70℃까지의 열적 램프(ramp)를 사용하여 러닝시켰다. UNcle Analysis 3.1 소프트웨어를 사용하여, 형광 강도의 무게 중심 평균(BCM)의 일차 도함수를 사용하여 각 샘플의 Tm을 계산하였다. 266 nm에서 산란광의 강도를 사용하여 각 샘플의 Tagg를 계산하였다.
열 스트레스 및 안정성 특성화
이중특이성 UniAb 분자를 20 mM 시트레이트 및 0.1 M NaCl(pH 6.2)에서 10 mg/mL까지 농축시켰다. 고분자량 및 저분자량 종(%HMW 및 %LMW)의 존재를 분석용 ThermoFisher UltiMateTM 3000 UPLC에서 SEC에 의해 2~8℃및 37℃에서 1개월 동안 온도 스트레스 전후에 결정하였다.
실시예 1: 작용제 활성을 갖는 IL-2Rβγ 이중특이성 항체 조합의 확인
IL-2 수용체 복합체의 활성화는 STAT5의 인산화(pSTAT5), pSTAT5 이량체의 핵으로의 전위, 및 STAT5 조절 유전자의 전사를 초래하는 신호전달 캐스케이드를 촉발한다(문헌[M. Rickert, et al., Science 308, 1477-1480 (2005)]; 문헌[G. C. Sim, et al., Cytokine Growth F R 25, 377-390 (2014)]). IL-2R의 베타 및 감마 서브유닛을 표적화하는 이중특이성 항체가 IL-2R 신호전달의 활성화를 유도할 수 있는지를 결정하기 위한 일차 분석으로서, 독특한 CDR3 패밀리로부터의 5개의 항-IL-2Rβ 결합 아암 및 독특한 CDR3 패밀리로부터의 5개의 항-IL-2Rγ 결합 아암을 조합하여 작용제 활성에 대한 전체적인 스크리닝을 수행하기 위한 25가지의 이중특이성 UniAbs를 제조하였다. 이중특이성 UniAbs는 중쇄 이종이량체 형성을 촉진하기 위해 놉-인투-홀 기술을 사용하여 침묵되고 안정화된 인간 IgG4 Fc(CH1 도메인 결실)에서 발현시켰으며, 이때 단일 항-IL- 2Rγ VH가 놉 아암에 있고 단일 항-IL-2Rβ VH가 홀 아암에 있다(문헌[J. B. B. Ridgway et al., Protein Eng Des Sel 9, 617-621 (1996)]; 문헌[S. M. Canfield, et al., J Exp Medicine 173, 1483-1491 (1991)]; 문헌[D. Xu et al., Cell Immunol 200, 16-26 (2000)]; 문헌[J. W. Bloom et al., Protein Sci 6, 407-415 (1997)]; 문헌[M. P. Reddy et al., J Immunol 164, 1925-1933 (2000)]; 문헌[A. M. Merchant et al., Nat Biotechnol 16, 677-681 (1998)]).
인간 CD8+ T-세포 상의 rhIL-2와 비교하여 25가지의 IL-2Rβγ UniAb 조합에 의한 STAT5의 인산화를 측정하고 비교하기 위해 포스포-유세포 분석을 사용하였다. STAT5 인산화는 임의의 항-IL-2Rβ 또는 항-IL-2Rγ 단일특이성 UniAbs에서 관찰되지 않았다. 이와 유사하게, STAT5 인산화는 또한, 항-IL-2Rβ 및 항-IL-2Rγ 단일특이성 UniAbs를 pSTAT5 분석에서 혼합물로서 테스트한 경우 관찰되지 않았다(도 2b). 이와는 대조적으로, 하나의 항-IL-2Rβ 아암 및 하나의 항-IL-2Rγ 아암을 갖는 이중특이성 UniAbs는 도 2a에 요약된 바와 같이 다양한 수준의 작용제 활성을 나타냈다. 흥미롭게도, STAT5 작용제 활성의 인산화를 유도하는 능력은 이중특이성 조합에 존재하는 항-IL-2Rβ 아암에 크게 의존하는 것으로 보이는 반면, 아고니즘의 정도는 항-IL-2Rγ 아암에 의존하는 것으로 나타났다. 대조군 데이터를 도 2c에 나타낸다.
더 넓은 범위의 작용제 활성을 갖는 항체를 확인하기 위해, STAT5 활성에 대한 이중특이성 스크리닝에서 확인된 4개의 리드 CDR3 클론형 패밀리 중 3개에서 다른 독특한 VH 서열을 조사하기 위해 이차 다양성 스크리닝을 시작하였다. 이러한 추가 VH 서열은 리드 CDR3 클론형 패밀리로부터 선택되었으며, CDR1, CDR2 및 프레임워크 영역에서의 서열 변이를 포함한다. 전체적으로, 추가의 157개의 독특한 패밀리 구성원은 두 번째 라운드의 고처리량 유전자 조립, 발현을 겪었고, IL-2R 발현 세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. IL-2Rβ의 경우, 인간 및 시노몰구스 IL-2Rβ 세포에 결합된 추가의 33개의 IL-2Rβ 패밀리 F09 구성원 및 추가의 22개의 IL-2Rβ 패밀리 F18 구성원을 다양성 스크린에서 확인하였다. 다양성 스크린에서 인간 및 시노몰구스 IL-2Rγ 재조합 단백질에 결합되는 그리고 세포 상의 추가 29개의 IL-2Rγ 패밀리 F16 구성원이 확인되었다. 신규 IL-2R 결합 UniAbs의 이러한 크고 다양한 세트는 다양한 기능적 활성을 갖는 리드 IL-2Rβγ 이중특이성 조합의 세트를 확인하려는 후속 노력을 가능하게 하였다.
실시예 2: IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs의 시험관 내 특성화
일차 및 이차 결합 스크리닝 결과와, 전체적인 이중특이성 UniAb 스크린에서 관찰되는 STAT5 인산화를 기반으로, 추가적인 시험관 내 특성화를 위해 6가지의 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAb 분자를 선발하였다. 상기 6가지의 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs는 다양한 EC50 값으로 인간 및 시노몰구스 T-세포 둘 모두에 효율적으로 결합하였다(도 3). Octet 오프-레이트 분석에 의하면 상기 6가지의 이중특이성 UniAbs 중 어느 것도 다른 일반적인 감마 사슬 파트너(IL-4R, IL-7R, IL-9R 또는 IL-21R) 또는 IL-2Rα에 결합하지 않았다.
인간 CD4+ T, CD8+ T 및 NK-세포에서 IL-2R 신호전달을 자극하는 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs의 능력은, 중간 친화성 IL-2Rβγ 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 능력을 유지하면서 IL-2Rα에 대한 결합을 방해하는 것으로 나타난 돌연변이(F42A, Y45A, L72G)를 포함하는 rhIL-2 변이체 및 rhIL-2와 비교하여 STAT5 인산화가 용량 의존적으로 증가하는 것에 의해 확인되었다(도 4a~도 4c)(문헌[C. Klein et al., Oncoimmunology 6:3 e1277306 (2017)]). CD8+ T-세포 상에서, 이중특이성 UniAbs는 pSTAT5 분석에서 다양한 EC50 값을 나타내며, 이때 다수의 구축물(BsAb-1, BsAb-3, BsAb-4)은 rhIL-2 및 rhIL-2 변이체와 거의 동등한 활성을 나타낸다(도 4a). 그러나 이는 이중특이성 UniAbs가 높은 수준의 IL-2Rα를 발현하는 세포 상의 rhIL-2와 비교하여 유의하게 더 낮은 효력을 나타내는 CD4+CD25+FoxP3+ T-조절 세포에서의 pSTAT5 수준과 극명한 대조를 이룬다(도 4c~도 4d). 따라서 IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs는 이들 분자의 주요 기능적 기준인 T-reg의 우선적인 활성화를 피한다. 모든 6가지의 이중특이성 UniAbs는 또한, 시노몰구스 T-세포 상에서 IL-2R 신호전달을 활성화하는 것으로 확인되었으며, 이는 후속 연구에서 시노몰구스 원숭이가 적합한 비인간 영장류 모델로서 확립되게 하였다(도 4e).
상기 6가지의 이중특이성 UniAbs와 rhIL-2 간의 기능적 활성을 추가로 비교하기 위해 세포 증식 분석을 수행하였다. 이중특이성 IL-2R 작용제 UniAbs 또는 IL-2 사이토카인 대조군을 사용한 처리에 반응하여, 면역 이펙터 세포(건강한 기증자 PBMC로부터 유래된 T 및 NK- 세포)는 용량 의존적 증식을 나타냈다(도 5a~도 5d). IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs로 처리된 PBMC에서 CD8+ T-세포 및 NK-세포의 증식에서 다양한 효력이 관찰된 반면, 몇몇(BsAb-1, BsAb-3, BsAb-4)은 rhIL-2 및 rhIL-2 변이체 대조군과 유사한 수준의 증식의 유도를 나타낸 반면, 모든 분자는 유사한 수준의 최대 증식을 달성하였다(도 5a~도 5b). 이와는 대조적으로, rhIL-2는 CD4+ 세포(T-reg 포함) 상에서 이중특이성 작용제 UniAbs 및 rhIL-2 변이체 대조군보다 더 큰 활성을 가졌다(도 5c~도 5d).
이중특이성 IL-2R 작용제 UniAbs의 사이토카인 방출 프로파일을 rhIL-2와 비교한 것을 생체 외 인간 전혈 분석에서 평가하였다. IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs 또는 rhIL-2의 존재 하에서 24시간 인큐베이션한 후, 모든 테스트 물품에 대해 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-8의 용량 의존적 증가가 관찰되었다(도 6a~도 6d). 이중특이성 UniAbs 중 2가지(BsAb-3 및 BsAb-4)는 모든 테스트된 사이토카인에 있어서 사이토카인 수준(최대 농도 또는 EC50)을 rhIL-2의 것 이상으로 유도했지만, 나머지 4가지는 사이토카인 대조군보다 더 낮은 수준을 유도하였다.
요약하면, 6가지의 이중특이성 IL-2Rβγ 항체가 다양한 작용제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. BsAb-1은 STAT5의 인산화에 의해 그리고 증식 분석에서 측정된 면역 이펙터 세포에서 rhIL-2에서 관찰된 것과 유사한 수준의 작용제 활성을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 상기 시험관 내 분석에서 BsAb-2는 rhIL-2 및 BsAb-1과 비교하여 감소된 효력을 나타낸다. 두 항체 모두 SEC에 의해 측정할 경우 낮은 응집을 나타냈고, 유리한 용융 온도를 가졌으며, 37℃에서 1개월 동안 안정하였다(도 9). BsAb-1 및 BsAb-2의 유리한 사이토카인 방출 프로파일과 조합된 이러한 결과는 추가의 생체 내 특성화를 위해 이들 2가지의 이중특이성 항체를 선택하게 하였다.
실시예 3: IL-2Rβγ 이중특이성 UniAbs BsAb-1 및 BsAb-2의 생체 내 특성화
생체 내 기능 연구를 수행하기 전에, 이중특이성 항체의 생체 내 안정성 및 약동학을 마우스에서 측정하였다. 각각의 이중특이성 항체의 관찰된 5~7일 반감기는 마우스에서 인간 IgG4 항체의 반감기와 일치한다(도 8a)(문헌[R. Deng et al., Mabs 3, 61-66 (2011)]). 이중특이성 항체의 생체 내 기능적 활성을 평가하기 위해, 가속화된 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 사용하여 BsAb-1, BsAb-2 및 rhIL-2의 기능적 활성을 비교하였다(도 10a~도 10c). 첫 번째 실험에서, 방사선 조사된 NSG 마우스에 인간 PBMC를 생착시키고, 후속적으로 마우스를 비히클, rhIL-2(매일), 또는 상기 2가지 이중특이성 작용제 항체 중 하나(주 2회)로 처리하였다(희생시킬 때까지). 예상되는 바와 같이, 비히클 대조군으로 처리된 동물은 체중 감소로 측정할 경우 약 20일차에 GVHD의 발병을 나타냈고, 대략 35일차에 20% 체중 감소로 희생되었다. 이와는 대조적으로, 이중특이성 IL-2Rβγ 작용제 항체(BsAb-1, BsAb-2), 및 rhIL-2 처리 동물은 대략 8일차에 GVHD의 발병을 나타냈고 9일차와 13일차 사이에 20% 체중 감소로 희생되었으며, 이는 비히클 대조군과 비교하여 GVHD의 가속화를 나타내는 것으로서, 이는 처리된 마우스에서 면역 이펙터 세포의 강화된 활성화와 일치한다(도 10b).
생체 내에서 면역 이펙터 세포의 증식을 자극하는 BsAb-1 및 BsAb-2의 능력을 직접 측정하기 위해 두 번째 연구를 수행하였다. 첫 번째 실험과 유사하게, 방사선 조사된 NSG 마우스에 CSFE로 표지된 인간 PBMC를 생착시키고, 상기 마우스를 비히클, rhIL-2, BsAb-1 또는 BsAb-2로 처리하였다. 5일차의 처리 후, 비장을 수확하고 CD8+ T 및 CD4+ T-세포의 증식을 상이한 림프구 집단들에서의 CSFE 염색의 측정에 의해 상기 4개 처리군 간에 비교하였다. BsAb-1 및 BsAb-2 둘 모두 rhIL-2 및 비히클 대조군과 비교하여 유의하게 더 많은 증식 CD8+ T-세포를 나타냈다(도 10c). CD4+ T-세포는 더 적은 정도로 확장되었지만; BsAb-2 처리 마우스에서 증식 CD4+ T-세포의 유의한 증가가 관찰되었다(비히클 대조군과 비교하여).
이중특이성 항체 작용제의 전임상 평가의 중요한 측면은 시노몰구스 원숭이를 분자의 약력학을 측정하기 위한 적절한 생체 내 모델로 확립하는 것이었다. 인간 및 시노몰구스의 기능적 동등성을 결정하기 위해, 이중특이성 항체는 일차 인간 T-세포에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로 시노몰구스 일차 T-세포에서 생체 외에서 pSTAT5 신호전달을 활성화시키는 것으로 확인되었다(도 4c 및 도 4e). 인간과 시노몰구스 사이의 기능적 동등성을 확립한 후, 비인간 영장류 모델에서 생체 내에서 BsAb-1 및 BsAb-2의 활성을 추가로 조사하기 위해 비-GLP 시노몰구스 연구를 수행하였다. 상기 2가지의 이중특이성 작용제 항체를 0.03, 0.1 또는 0.3 mg/kg의 BsAb-1 또는 BsAb-2의 단회 정맥내(느린 볼루스) 용량을 받은 2의 군의 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 두 분자 모두의 모든 용량에서 말초 CD8+ T 및 NK-세포의 현저한 확장이 관찰되었다(도 11). 림프구 수의 처음의 일시적인 감소 후, CD8+ T, NK-세포 및 덜한 정도의 CD4+ T-세포는 혈액에 있어서의 용량 의존적 증식 및 확장을 보여주었으며, 이는 대략 4~7일차에 최고조에 달한 후 약 14일차에 기준선 수준으로 돌아갔다(도 11a~도 11c, 도 11f~도 11h). 중요하게도, CD4+CD25+FoxP3+ T-조절 세포의 뚜렷한 확장은 관찰되지 않았으며, 이는 삼량체 IL-2 수용체의 우선적 활성화를 피하는 이중특이성 작용제 항체와 일치한다(도 11d, 도 11i). 이 효과는 CD8+:CD4+ T-세포의 비(이는 CD8+ T-세포 하위세트에 유리하게 치우쳐짐)에 의해 추가로 확인되었다(도 11k). 더욱이, IL-2Rβγ 작용제 항체는 테스트된 모든 용량 수준에서 원숭이에서 내용성이 우수하였으며, 이때 혈관 누출 증후군 또는 기타 명백한 독성의 징후는 없었다.
실시예 4: IL-2Rβγ 이중특이성 UniAb BsAb-5의 생체 내 특성화
생체 내 기능 연구를 수행하기 전에, 이중특이성 항체의 생체 내 안정성 및 약동학을 다음의 두 용량 수준에서 마우스에서 측정하였다. 1 mg/kg 및 10 mg/kg. BsAb-5(IL2RB_F09K**IL2RG_F16B)의 관찰된 5일 반감기는 마우스에서 인간 IgG4 항체의 반감기와 일치한다(도 12a 및 도 12b)(문헌[R. Deng et al., Mabs 3, 61-66 (2011)]). 이중특이성 항체의 생체 내 기능적 활성을 평가하기 위해, 가속화된 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 사용하여 BsAb-5 및 rhIL-2의 기능적 활성을 비교하였다(도 13~도 14). 첫 번째 실험에서, 방사선 조사된 NSG 마우스에 인간 PBMC를 생착시키고, 후속적으로 마우스를 비히클, rhIL-2(매일), 또는 BsAb-5(주 2회)로 처리하였다(희생시킬 때까지). 예상되는 바와 같이, 비히클 대조군으로 처리된 동물은 체중 감소로 측정할 경우 약 20일차에 GVHD의 발병을 나타냈고, 대략 35일차에 20% 체중 감소로 희생되었다. 이와는 대조적으로, BsAb-5 처리 동물, 및 rhIL-2 처리 동물은 대략 8일차에 GVHD의 발병을 나타냈고 9일차와 13일차 사이에 20% 체중 감소로 희생되었으며, 이는 비히클 대조군과 비교하여 GVHD의 가속화를 나타내는 것으로서, 이는 처리된 마우스에서 면역 이펙터 세포의 강화된 활성화와 일치한(도 14).
생체 내에서 면역 이펙터 세포의 증식을 자극하는 BsAb-5의 능력을 직접 측정하기 위해 두 번째 연구를 수행하였다. 첫 번째 실험과 유사하게, 방사선 조사된 NSG 마우스에 CPD450으로 표지된 인간 PBMC를 생착시키고, 상기 마우스를 비히클, rhIL-2, 또는 BsAb-5로 처리하였다. 5일차의 처리 후, 비장을 수확하고 CD8+ T-세포, CD4+ T-세포, 및 NK-세포의 증식을 상이한 집단들에서의 CPD450 희석의 측정에 의해 상기 3개 처리군 간에 비교하였다. 3가지 측정된 세포 유형 모두에서 BsAb-5는 rhIL-2 또는 비히클 대조군보다 유의하게 더 많은 증식을 유도하였다(도 15a~도 15c).
이중특이성 항체 작용제의 전임상 평가의 중요한 측면은 시노몰구스 원숭이를 분자의 약력학을 측정하기 위한 적절한 생체 내 모델로 확립하는 것이었다. 인간 및 시노몰구스의 기능적 동등성을 결정하기 위해, 이중특이성 항체는 일차 인간 T-세포에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로 시노몰구스 일차 T-세포에서 생체 외에서 pSTAT5 신호전달을 활성화시키는 것으로 확인되었다(도 4c 및 도 4e). 인간과 시노몰구스 사이의 기능적 동등성을 확립한 후, 비인간 영장류 모델에서 생체 내에서 BsAb-5의 활성을 추가로 조사하기 위해 비-GLP 시노몰구스 연구를 수행하였다. BsAb-5를 0.1, 0.3 또는 0.5 mg/kg의 단회 정맥내(느린 볼루스) 용량으로 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 처음 2개의 용량 수준에 대해서는 2의 군, 및 0.5 mg/kg 용량 수준에 대해서는 4의 군의 원숭이에게 투여하였다. 모든 용량 수준에서, 말초 CD8+ T-, NK-, 및 NKT-세포의 현저한 확장이 관찰되었다(도 16a~도 16f). 림프구 수의 처음의 일시적인 감소 후, CD8+ T-, NK-, NKT-세포 및 덜한 정도의 CD4+ T-세포는 혈액에 있어서의 용량 의존적 증식 및 확장을 보여주었으며, 이는 대략 4~7일차에 최고조에 달한 후 약 14일차에 기준선 수준으로 돌아갔다(도 16a~도 16h). 중요하게도, CD4+CD25+Foxp3+ T-조절 세포의 우선적인 확장은 관찰되지 않았으며, 이는 삼량체 IL-2 수용체의 우선적 활성화를 피하는 이중특이성 작용제 항체와 일치한다(도 16a~도 16j). 추가로, IL-2 수용체 발현의 결여로 인해 유용한 음성 대조군 역할을 하는 B-세포는 BsAb-5에 반응하여 증식하는 것이 없었다(도 16k~도 16l). 더욱이, IL-2Rβγ 작용제 항체는 0.5 mg/kg까지는 원숭이에서 내용성이 우수하였으며, 이때 혈관 누출 증후군 또는 기타 명백한 독성의 징후는 없었다.
본 발명의 비제한적인 예시적 실시 형태를 본원에 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시 형태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게는, 이제 본 발명을 벗어나는 일 없이, 수많은 변형, 변경 및 치환이 떠오를 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시 형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위가 본 발명의 범주를 정한다는 것과, 이에 의해 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 이들의 균등물을 아우르는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> TENEOBIO, INC.
<120> AGONISTIC ANTI-IL-2R ANTIBODIES AND METHODS OF USE
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Phe Asp Ile
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asp Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Trp Glu Leu Thr Asp Ala Phe Asp Ile Arg Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ala Val Ser Ile Thr Gly Asp Tyr Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
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Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asp Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Trp Glu Leu Thr Asp Ala Phe Asp Ile Arg Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
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<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ser Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ala Val Ala Pro Gly Phe Asp Ser Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
<210> 38
<211> 272
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 39
<211> 551
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp
180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser
210 215 220
Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr
225 230 235 240
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
245 250 255
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro
260 265 270
Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe
275 280 285
Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu
290 295 300
Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro
305 310 315 320
Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu
325 330 335
Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn
340 345 350
His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His
355 360 365
Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr
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Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro
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Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp
405 410 415
Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro
420 425 430
Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro
450 455 460
Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro
465 470 475 480
Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala
485 490 495
Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
500 505 510
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg
515 520 525
Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly
530 535 540
Gln Asp Pro Thr His Leu Val
545 550
<210> 40
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu
260 265 270
Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro
275 280 285
Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His
290 295 300
Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro
325 330 335
Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn
340 345 350
Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu
355 360 365
Thr
<210> 41
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 42
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 43
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ala Val Ser Ile Thr Gly Asp Tyr Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
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<213> Artificial Sequence
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polypeptide"
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Val Leu Thr Gly Asp Pro Val Gly Gly
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser
115 120 125
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Gly Lys
355
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<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ala Val Ser Ile Thr Gly Asp Tyr Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
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<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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polypeptide"
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<221> SITE
<222> (1)..(50)
<223> /note="This sequence may encompass 1-10 'Gly Gly Gly Gly Ser'
repeating units"
<400> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
Claims (60)
- IL2RB에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
(b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
(c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR3 서열. - 제1항에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 1~3 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및
(b) 서열 번호 4~6 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및
(c) 서열 번호 7~10 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 7의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 1의 CDR1 서열, 서열 번호 4의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 2의 CDR1 서열, 서열 번호 5의 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 3의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 10의 CDR3 서열. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 11~14 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상인 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 11~14로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체.
- IL2RB에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G G S I S S S X1 W (서열 번호 26)
(여기서, X1은 D 또는 N임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I X2 H S G S T (서열 번호 27)
(여기서, X2는 D 또는 S임); 및
(c) 하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
X3 R G X4 W E L X5 D A F D I (서열 번호 28)
(여기서, X3은 G 또는 A이고;
X4는 S 또는 Q이고;
X5는 S 또는 T임). - IL2RB에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F T F S X1 Y G (서열 번호 29)
(여기서, X1은 S 또는 T임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S Y D G S N X2 (서열 번호 30)
(여기서, X2는 K 또는 R임); 및
(c) 하기 식을 포함하는 CDR3 서열:
A R D L D Y D X3 L T G D P V G G F D I (서열 번호 31)
(여기서, X3은 V 또는 I임). - IL2RG에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
(b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
(c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 갖는 CDR3 서열. - 제9항에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열. - 제9항 또는 제10항에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 15~16 중 어느 하나를 포함하는 CDR1 서열; 및
(b) 서열 번호 17~19 중 어느 하나를 포함하는 CDR2 서열; 및
(c) 서열 번호 20~21 중 어느 하나를 포함하는 CDR3 서열. - 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, 항체:
(a) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 17의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(c) 서열 번호 16의 CDR1 서열, 서열 번호 18의 CDR2 서열 및 서열 번호 20의 CDR3 서열; 또는
(d) 서열 번호 15의 CDR1 서열, 서열 번호 19의 CDR2 서열 및 서열 번호 21의 CDR3 서열. - 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 22~25 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 95% 이상인 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 22~25로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체.
- IL2RG에 결합하는 항체로서, 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체:
(a) 하기 식을 포함하는 CDR1 서열:
G F X1 X2 X3 X4 Y Y (서열 번호 32)
(여기서, X1은 T 또는 I이고;
X2는 F 또는 V이고;
X3은 S, N, 또는 G이고;
X4는 D 또는 N임);
(b) 하기 식을 포함하는 CDR2 서열:
I S X5 S G X6 X7 I (서열 번호 33)
(여기서, X5는 S 또는 N이고;
X6은 D, S, G, 또는 N이고;
X7은 T 또는 I임); 및
(c) 서열 ARGDAVSITGDY (서열 번호 20)를 포함하는 CDR3 서열. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 인간 VH 프레임워크에 존재하는, 항체.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다중특이성인, 항체.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이성인, 항체.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IL2RB 및 IL2RG에 결합하는, 항체.
- 다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 7의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 17의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역. - 제20항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함하는, 항체.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 53을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 61을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
- 다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역. - 제24항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하는, 항체.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 62를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 63을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
- 다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 2의 CDR1 서열;
서열 번호 5의 CDR2 서열; 및
서열 번호 9의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역. - 제28항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13을 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23을 포함하는, 항체.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 64를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 65를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
- 다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 3의 CDR1 서열;
서열 번호 6의 CDR2 서열; 및
서열 번호 10의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 17의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역. - 제32항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 22를 포함하는, 항체.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 66을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
- 다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 16의 CDR1 서열;
서열 번호 18의 CDR2 서열; 및
서열 번호 20의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역. - 제36항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 24를 포함하는, 항체.
- 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 34를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
- 다음을 포함하는 항체:
IL2RB에 결합하고
서열 번호 1의 CDR1 서열;
서열 번호 4의 CDR2 서열; 및
서열 번호 8의 CDR3 서열
을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역; 및
IL2RG에 결합하고
서열 번호 15의 CDR1 서열;
서열 번호 19의 CDR2 서열; 및
서열 번호 21의 CDR3 서열
을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역. - 제40항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25에 대한 서열 동일성이 95% 이상인, 항체.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 제1 중쇄 가변 영역은 서열 번호 12를 포함하고, 제2 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25를 포함하는, 항체.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 36을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호 37을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 항체.
- 제20항, 제24항, 제28항, 제32항, 제36항 또는 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재하고/하거나;
제2 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 VH 인간 프레임워크에 존재하는, 항체. - 제1항 내지 제22항, 제24항 내지 제26항, 제28항 내지 제30항, 제32항 내지 제34항, 제36항 내지 제38항, 제40항 내지 제42항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 변이체 Fc 영역을 포함하는, 항체.
- 제45항에 있어서, 변이체 Fc 영역은 침묵된 Fc 영역인, 항체.
- 제1항 내지 제22항, 제24항 내지 제26항, 제28항 내지 제30항, 제32항 내지 제34항, 제36항 내지 제38항, 제40항 내지 제42항 또는 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CH1 서열의 부재 하에 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 항체.
- 제1항 내지 제22항, 제24항 내지 제26항, 제28항 내지 제30항, 제32항 내지 제34항, 제36항 내지 제38항, 제40항 내지 제42항 또는 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
- 제48항에 있어서, 힌지 영역은 다음을 포함하는, 항체:
야생형 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 54); 또는
S228P 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 힌지 영역 서열(서열 번호 55). - 제48항 또는 제49항에 있어서, CH2 도메인은 다음을 포함하는, 항체:
야생형 인간 IgG4 CH2 도메인 서열(서열 번호 56); 또는
F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 또는 F234A 돌연변이와 L235A 돌연변이 둘 모두를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH2 도메인. - 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CH3 도메인은 다음을 포함하는, 항체:
야생형 인간 IgG4 CH3 도메인 서열(서열 번호 58);
T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열; 또는
T366S, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체 및/또는 단리된 항체인, 항체.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄-단독 항체인, 항체.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 약 10-11 M 내지 대략적으로 약 10-6 M의 Kd로 IL2R에 대한 친화도를 갖고/갖거나;
상기 항체는 약 10-8 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-7 M의 Kd로 IL2RB에 대한 친화도를 갖고/갖거나;
상기 항체는 약 10-9 M 내지 대략적으로 약 2.5 x 10-8 M의 Kd로 IL2RG에 대한 친화도를 갖는, 항체. - 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IL2 수용체 베타/감마 작용제로서의 기능을 하는, 항체.
- 다음을 포함하는 제약 조성물:
제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체; 및
제약상 허용가능한 부형제. - 제56항에 있어서, 상기 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 전달에 적합하게 된, 제약 조성물.
- 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 유효 용량의 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제56항 또는 제67항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제58항에 있어서, 항체 또는 제약 조성물을 화학요법 섭생법과 함께 투여하는, 방법.
- 면역 세포 상의 IL2RB/IL2RG 이량체성 수용체 복합체를 자극하고/하거나 면역 세포에서 IL2R 신호전달을 자극하는 방법으로서, 면역 세포를 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제56항 또는 제57항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
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