KR20230140885A - 어류 연쇄구균 감염증 예방을 위한 어류 경구백신용 리포좀 및 이의 제조방법 - Google Patents

어류 연쇄구균 감염증 예방을 위한 어류 경구백신용 리포좀 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 어류 연쇄구균 감염증 예방을 위한 어류 경구 백신용 리포좀 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 레시틴 (lecithin)으로 구성되어 있는 리포좀 및 어류 연쇄구균 균체를 함유하는 어류의 경구투여용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리포좀의 제조방법은 기존의 방법에 비하여 제조 방법이 간단하고, 제조 속도가 빠를 뿐만 아니라, 포집율이 높아 생산성이 뛰어난 장점이 있으며, 상기 방법으로 제조된 레시틴 (lecithin)으로 구성되어 있는 리포좀 및 어류 연쇄구균 균체를 포함하는 어류의 경구 투여용 백신 조성물은 접종이 수월하며, 경구투여 시 안정성이 우수하여, 효율적으로 양식어류의 연쇄구균 감염증을 예방할 수 있다.

Description

어류 연쇄구균 감염증 예방을 위한 어류 경구백신용 리포좀 및 이의 제조방법 {Fish Oral Vaccine Liposomes for preventing streptococcal infection and Preparation Method Thereof}
본 발명은 어류 연쇄구균 감염증 예방을 위한 어류 경구 백신용 리포좀 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 레시틴 (lecithin)으로 구성되어 있는 리포좀 및 어류 연쇄구균 균체를 함유하는 어류의 경구투여용 백신 조성물에 관한 것이다.
양식기술의 발달과 생산량의 증가로 인해 필연적으로 수반되는 질병 피해규모가 크게 증가하여 국내 양식 산업은 심각한 장애를 겪고 있다 (Cho et al., Fish Pathol. 20: 61-70, 2007). 이러한 질병의 치료를 위해 무분별하게 사용되는 항생제는 다제내성균을 유발하는 등 오남용으로 인한 부작용이 증가하고 있으며 치료 효과 또한 현저히 낮다. 따라서, 유용한 백신의 개발은 항생제 사용량을 줄이고 생산량을 증가시키기 위한 가장 올바른 방향일 것이다. 그러나 현재 개발되어있는 수산용 백신은 주사백신으로 백신 처리 과정에서 스트레스를 유발하는 등 현장에서 대량의 어류에 효과적으로 백신을 처리를 한다는 것에 현실적으로 매우 어려움이 있다. 또한, 경구백신의 개발을 위해 사료에 백신을 섞어 급여한 사례가 있으나 효과가 미비하였다. 이에, 접종의 수월성을 높일 수 있는 효과적인 백신의 개발이 필요하다.
대부분의 어류에서 호흡기(아가미), 소화기(위, 장), 체표 상처 부위(피부)등 감염이 일어나는 곳은 주로 점막 조직이며, 점막 면역 반응을 유도하는 것이 가장 효과적인 방어의 전략일 것이다. 수생 환경의 특성상 어류의 점막은 병원체가 포함된 다양한 환경에 항상 노출되어있기 때문에 경구백신을 이용한 점막면역 반응의 활성을 통해 병원체에 대한 보다 효율적인 예방 시스템을 도모할 수 있게 된다. 뿐만 아니라 접종비용이 산업의 경제성과 밀접하게 연관 되어있는 수산양식산업의 특성상 현장에서 매우 유용하게 이용될 수 있다. 점막백신은 또한 주사바늘을 사용하지 않기 때문에, 통증이나 거부감이 없고, 안전하고, 쉽게 투여할 수 있는 이점들을 가지고 있다. 실제로 이전 연구결과들에서 점막투여(mucosal immunization)시 주사투여(parenteral immunization)보다 점막경로를 통해 감염되는 병원성 미생물들에 대해 더 효율적으로 방어한다는 것이 보고되었다 (Shim, B.-S., et al., PloS one, 6(11):e27953, 2011; Neirynck, S., et al., Nature medicine, 5(10):1157-1163, 1999; Rao, S.S., et al., PloS one, 5(3):e9812, 2010).
결론적으로 점막면역체계(mucosal immune system)를 이용한 점막면역(mucosal immunization)의 가장 큰 장점은, 지금까지 일반적으로 사용되고 있는 주사형 백신(injection vaccine)의 경우 전신면역반응(systemic immune response)만 유발할 수 있는데 반해, 점막(비강 또는 구강) 백신(mucosal vaccine)은 점막표면(mucosal surface)에서 항원 특이적 secretory IgA를 생산하는 점막면역반응(mucosal immune response)뿐만 아니라 항원 특이적 serum IgG를 생산하는 전신면역반응까지 동시에 유발할 수 있다는 점이다 (Neutra, M et al., Nature Reviews Immunology, 6(2): 148-158, 2006; Holmgren, J et al., Nature medicine, 11: S45-S53, 2005).
그러나, 점막백신은 최근 많은 연구진들에 의해 개발 및 연구되고 있음에도 불구하고, 효율성, 안전성 및 점막면역증강제의 부재 등으로 상용화에 어려움을 겪고 있는 상황이다. 항원의 경구투여의 경우 소화 효소에 의한 항원의 파괴가 불가피하고, 효과적인 면역반응을 유도하기 위해 항원을 장까지 안전하게 전달할 수 있는 방법을 확립하는 것이 필요하다. 즉, 점막면역을 유도하기 위한 면역원을 위에서 분해, 변성되지 않고 장 점막까지 전달하기 위한 기술의 개발이 시급하다.
본 발명자들은 상기 문제점을 극복할 수 있는 어류 경구 백신용 리포좀을 개발한 바 있다(대한민국 특허 제10-2047910호). 하지만 상기 어류 경구 백신용 리포좀은 합성 물질의 종류가 많고, 제작 단계가 복잡하며, 포집율이 낮아 생산성이 떨어질 뿐만 아니라, 제작 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복할 수 있는 새로운 어류 경구 백신용 최적의 항원 전달 시스템(antigen-delivery system)을 개발하고자 예의 노력한 결과, 면역원을 미세입자로 캡슐화하는 리포좀(liposome)이 어류 경구 백신의 약물 운반체로 우수한 효능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 어류 연쇄구균 감염증 예방을 위한 리포좀 백신의 경구투여에 의한 점막면역 유도를 통해 효율적으로 예방하기 위하여, 레시틴 (lecithin)으로 구성되어 있는 리포좀 및 어류 연쇄구균 균체를 포함하는 어류의 경구 투여용 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 어류의 경구 투여용 백신 조성물을 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증의 예방 또는 치료용 사료 조성물 및 상기 경구 투여용 백신 조성물을 어류에 경구투여하는 단계를 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 레시틴 (lecithin)과 수용액을 교반시켜 리포좀을 제조하는 단계; (b) 상기 형성된 리포좀에 불활성화된 어류 연쇄구균 균체와 계면활성제를 첨가하고 교반하여 리포좀에 어류 연쇄구균 균체를 포집하는 단계; 및 (c) 상기 리포좀을 세척하여 어류 경구백신용 리포좀을 수득하는 단계를 포함하는 어류 연쇄구균 균체가 포집된 어류 경구백신용 리포좀 (liposome)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 불활성화된 어류 연쇄구균 균체가 포집되어 있는 리포좀을 포함하는 어류용 경구백신 조성물, 상기 리포좀은 레시틴(lecithin)에 의해 형성되고, 300 내지 8000nm 크기인 것을 특징으로 하는 어류의 경구백신투여용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 경구 투여용 백신 조성물을 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증의 예방 또는 치료용 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 경구 투여용 백신 조성물을 어류에 경구투여하는 단계를 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리포좀의 제조방법은 기존의 방법에 비하여 제조 방법이 간단하고, 제조 속도가 빠를 뿐만 아니라, 포집율이 높아 생산성이 뛰어난 장점이 있으며, 상기 방법으로 제조된 레시틴 (lecithin)으로 구성되어 있는 리포좀 및 어류 연쇄구균 균체를 포함하는 어류의 경구 투여용 백신 조성물은 접종이 수월하며, 경구투여 시 안정성이 우수하여, 효율적으로 양식어류의 연쇄구균 감염증을 예방할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 리포좀의 현미경 사진(a:40배, b:100배, c:200배, d:400배) 이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 리포좀을 countess Ⅱ를 이용하여 확인한 결과로서, (A)는 FKC, (B)는 FKC 포집 리포좀, (C)는 키토산 코팅 FCK 포집 리포좀이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 리포좀의 안정성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 리포좀의 포집율을 측정한 결과로서, a는 ibuprofen의 HPLC 결과, b는 gallic acid의 HPLC 결과, c는 리포좀에 포집되지 않은 지표물질들의 HPLC 결과, d는 리포좀에 포집된 지표물질들의 HPLC 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 다당류 코팅 리포좀을 현미경으로 확인한 사진(A)이고, (B)는 이를 1/10로 희석하여 확인한 사진이다.
도 6의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 다당류 코팅 리포좀의 냉장(위 패널) 및 상온(아래 패널)에서 20일간 안정성을 확인한 결과이며, (B)는 다당류 비코팅 리포좀의 안정성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 리포좀의 시간에 따른 항원 용출을 확인한 것이다.
도 8은 비코팅(A), 코팅(B) 리포좀의 제타전위를 측정한 결과이다.
도 9는 비코팅(A), 코팅(B) 리포좀의 크기를 측정한 결과이다.
도 10은 리포좀 경구백신 투여 후, 각 실험군별 2주 후, 혈청(A) 및 장(B)에서의 항원 특이 항체가를 분석한 것이다.
도 11은 리포좀 경구백신 투여 후, 각 실험군별 3주 후, 혈청(A) 및 장(B)에서의 항원 특이 항체가를 분석한 것이다.
도 12는 리포좀 경구백신 투여 후, 각 실험군별 기간에 따른 폐사율을 분석한 것이다.
도 13은 리포좀 경구백신 투여 후, 각 실험군별 상대 생존율을 분석한 것이다.
도 14는 리포좀 경구백신 제형을 나타낸 것으로 스프레이형(A), 제환형(B, C)의 개념도이다.
도 15는 본 발명의 방법(peristatic pump method)과 기존의 방법(basic method)을 이용하여 생산한 리포좀을 비교한 것으로 (A)는 각 방법의 생산량, (B) 및 (C)는 생산된 리포좀의 현미경 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
주사 백신은 근육이나 복강으로 백신을 투여하여 면역화시키는 방법으로, 보조제와 함께 사용할 수 있어 면역반응이 강하게 나타나고 효과적이나 백신 처리 과정에서 스트레스를 유발하는 등 현장에서 대량의 어류에 처리하기가 매우 어려우며, 침지백신은 고농도의 백신액에 어류를 침지하여 체표나 아가미 등의 점막으로 면역화시키는 방법으로, 핸들링에 의한 스트레스가 적은 반면 백신이 대량으로 필요하고 효능이나 지속기간이 매우 낮다는 단점이 있다.
현재 사용되고 있는 백신 대부분은 주사용 백신으로 전신 면역기구를 활성화시켜 백신의 효능을 유도하는 메커니즘이나, 주사 백신이 경골어류의 점막 면역을 효과적으로 유도할 수 있는지에 대해서는 의문이 있다. 경구백신과 비교하여 비경구 백신의 경우 일반적으로 더 높은 방어면역을 일으킴에도 불구하고 얻어진 면역능은 기대보다 낮은 것으로 알려져 있다.
점막 면역 반응을 유도하는 경구백신은 감염 부위의 점막에서 직접적으로 면역 반응을 유도할 수 있으나, 위장관내에서 강한 접착성이 있고 강산과 분해 효소에 의해 항원이 파괴되어 항체생성을 방해받는 단점이 있어 이를 극복하기 위한 연구가 필요하다.
수생 환경의 특성상 어류의 점막은 병원체가 포함된 다양한 환경에 항상 노출되어있기 때문에 경구백신을 이용한 점막면역 반응의 활성을 통해 병원체에 대한 보다 효율적인 예방 시스템을 도모할 수 있게 된다. 뿐만 아니라 접종비용이 산업의 경제성과 밀접하게 연관 되어있는 수산양식산업의 특성상 현장에서 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 이러한 장점에 의하여 현재 백신 개발의 최종적인 추구 방향으로 설정되어있는 유용한 백신 접종 형태라고 할 수 있다.
이에, 본 발명에서는 어류의 연쇄구균 감염증을 점막면역을 통해 우수한 효율로 예방할 수 있는 백신을 개발하고자, 레시틴 (lecithin)으로 형성된 리포좀에 어류 연쇄구균 균체를 포집 시킨 어류의 경구투여용 백신 조성물을 제조하여 어류 연쇄구균 감염증 예방 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 (a) 레시틴 (lecithin)과 수용액을 교반시켜 리포좀을 제조하는 단계;
(b) 상기 형성된 리포좀에 불활성화된 어류 연쇄구균 균체와 계면활성제를 첨가하고 교반하여 리포좀에 어류 연쇄구균 균체를 포집하는 단계; 및
(c) 상기 리포좀을 세척하여 어류 경구백신용 리포좀을 수득하는 단계를 포함하는 어류 연쇄구균 균체가 포집된 어류 경구백신용 리포좀 (liposome)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 어류는 해산어류 또는 담수어류인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 감성돔, 참돔, 돌돔, 기타돔류, 민어, 방어, 복어류, 조피볼락, 기타볼락류, 고등어류, 노래미류, 송어류, 숭어류, 연어, 붕장어, 전갱이류, 전어, 참조기, 쥐치류, 철갑상어, 잉어류, 뱀장어류, 메기류, 쏘가리 및 열대어로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 어류 연쇄구균 균체는 어류 병원성의 Gram positive cocci인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), S difficile (스트렙토코커스 디피실), L piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae(=Enterococcus seriolicida) (락토코커스 가르비에=엔테로코커스 세리올리사이다), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae(=Streptococcus difficilis) (스트렙토코커스 디스갈락티애=스트렙토코커스 디피칠리스), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는Streptococcus parauberis 19FBSPa0001 (KCTC 13795BP)인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 Streptococcus parauberis 19FBSPa0001 (KCTC 13795BP)는 2019년 1월 22일자로 한국생물자원센터에 기탁되었다.
본 발명에 있어서, 상기 교반은 2000 내지 8000rpm으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 교반 rpm이 2000rpm 보다 낮을 경우에는 리포좀이 충분한 양이 생성되지 않으며, 8000rpm 보다 높을 경우에는 리포좀이 파괴되어 충분한 양의 리포좀을 확보할 수 없게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제 또는 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제는 트윈 20인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 스판 85인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀을 세척하기 전에 키토산으로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키토산 농도는 0.5~2 wt %인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 코팅 시간이 길수록, 그리고 키토산 용액의 농도가 높을수록 생성되는 코팅의 두께가 두꺼워질 수 있으며, 따라서 면역원성의 방출이 느려질 수 있다. 따라서, 목적하는 약물의 방출속도 등을 고려해서 통상의 기술자가 키토산 용액의 농도 및 코팅 시간을 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키토산 농도가 2 wt% 이상일 경우 리포좀 간의 엉겨 붙는 경향성이 증가하며 생산성이 떨어지게 되고, 0.5 wt% 이하인 경우 안정성이 낮아지게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 키토산 용액은 0.5 wt% 젖산 (lactic acid)이 포함된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코팅된 리포좀은 PBS로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 어류 연쇄구균 균체를 리포좀으로 포집할 경우, 일정한 속도로 동일한 양을 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 튜브 연동식 펌프(peristatic pump)를 이용하여 어류 연쇄구균 균체가 리포좀 제조시 리포좀 내부로 포집될 수 있도록 일정한 속도로 공급하는 것이다.
본 발명에서, 상기 일정한 속도는 리포좀에 어류 연쇄구균 균체가 포집될 수 있는 속도이면 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 0.5ml ~ 5ml/min의 속도일 수 있다. 5ml/min 보다 속도가 빠를 경우, 어류 연쇄구균 균체가 포집된 리포좀의 형성이 저해된다.
본 발명에서 용어 "리포좀"은 인지질 이중층의 matrix 형태를 갖추고 있는 세포막과 가장 유사한 형태의 단층 혹은 다층의 지질-이중막 구조를 가진다. Phosphatidylcholine(PC), ethanolamine (PE), serine, sphingomyelins, cardiolipins, plasmalogens, phosphatidic acid, cerebroside 같은 인지질로 구성되어 있는 이중층 폐쇠막을 형성하여 물과 평형상태에 있는 분자단을 말한다. 리포좀을 구성하는 기본 단위인 인지질은 음이온성, 또는 극성머리부분과 비극성인 2개의 탄화수소 사슬로 되어있다. 탄화수소 사슬은 길이가 다양한데, 천연 인지질의 경우 탄화수소의 길이는 16개 이상이며, 1쌍 정도의 불포화도를 가진다.
직경이 200-1000nm 정도의 넓은 범위에 걸쳐 있고 보통 5개 이상의 동심원으로 구성되어 있는 리포좀은 multilammellar vesicle (MLV)이고, 인지질의 머리부가 곡률을 극복하면서 배열할 수 있는 가장 작은 크기의 리포좀은 small unilamellar vesicle (SUV) 이며 일반적으로 SUV의 직경은 20-50nm 이다. 직경이 100-1000nm이고 단층으로 된 리포좀을 large unilamellar vesicle (LUV)이라 하고, 직경이 약 100nm이고 단층으로 구성된 리포좀은 intermediate-sized unilamellar vesicle (IUV)이며, 천연 또는 합성 인지질로서 신진대사에 참여하여 생체막 분자와 상호 교환이 가능하고, 생분해성이고, 신체에 대한 독성이 거의 없으며, 화학적 결합 없이 활성물질을 포집할 수 있다.
또한, 화학적으로 민감한 분자를 보호할 수 있고, 선택적 투과성과 지연성이 우수하여 방출속도 조절 시스템의 제조에 적당하며, 리포좀을 구성하고 있는 지질의 성분, 크기, 전하 투과성, 표면 리간드 등의 변화시킴으로써 유기체 내에서의 리포좀의 분포와 특성을 상황에 따라 조절할 수 있다. 친수성이나 친유성 약 모두를 전달하는데 선택적으로 사용이 가능하다는 장점이 있고 천천히 분해되는 동안 서서히 약물이 방출되므로 약믈 전달체로서 응용될 수 있는 잠재성이 매우 높다. 또한, 리포좀은 약물 전달체로써 많은 장점을 가지고 있다. 하지만, 경구로 투여할 경우 낮은 위의 pH와 소화효소에 의해 쉽게 분해되거나 용해될 수 있다. 따라서, 리포좀의 membrane을 보호할 수 있는 방법으로 다당의 고분자를 이용하여 표면을 코팅함으로써 그 안정성을 높이고 효과적으로 약물을 목적하는 부위로 전달하고자 한다.
특히, 리포좀의 크기는 체내 흡수율과 관련이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀은 300 내지 8000nm 크기인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 340 내지 7400nm인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
리포좀의 크기가 300nm 이하일 경우에는 충분한 양의 연쇄구균 균체를 포집하기 어렵고, 8000nm 이상일 경우에는 체내 흡수율이 감소한다.
본 발명의 리포좀은 343nm 정도의 크기가 되므로 항원이 충분히 포집될 수 있다. 또한, 키토산 코팅에 의해 리포좀의 크기가 더 커지고, 7354nm에 집중되어 있어 포집율이 더 우수하다. 리포좀의 특정 크기 범위는 특히 체내 흡수율과 관련이 깊다. 리포좀 제조에서 흡수율과 함께 포집율이 가장 중요하다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 리포좀은 항원을 포집하기 가장 적합한 크기로 생산되어 그 포집율을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀의 포집율은 40 내지 80%인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조되고, 불활성화된 어류 연쇄구균 균체가 포집되어 있는 리포좀을 포함하는 어류용 경구백신 조성물로, 상기 리포좀은 레시틴(lecithin)에 의해 형성되고, 300 내지 8000nm 크기인 것을 특징으로 하는 어류의 경구백신투여용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제(製劑)로서, 감염증의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원(免疫原)을 말한다. 생체내 면역은 병원균의 감염 후에 생체내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 상기 항원성 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원성 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), S difficile (스트렙토코커스 디피실), L piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae(=Enterococcus seriolicida) (락토코커스 가르비에=엔테로코커스 세리올리사이다), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae(=Streptococcus difficilis) (스트렙토코커스 디스갈락티애=스트렙토코커스 디피칠리스), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적인 항원에는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 병원성 바이러스가 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항원성 물질은 포르말린 불활성화 사균 (FKC, formalin killed cell)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신용 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N--디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들수 있다.
또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
분산제제는 조입자 분산으로 분류되는 제제군이며 분산제제의 분산상의 입자는 대략 0.1 ㎛보다 크고 이것이 분산매 중에 산재되어 불균일한 계를 형성한다. 분산제제에 속하는 주된 제형으로 유제, 현탁제, 리니멘트제, 에어로솔제, 스프레이제, 흡입제 등이 있으며 에어로솔제와 스프레이제는 특수한 용기(장치)를 이용하여 약물을 함유한 미립자를 공기 중에 분산시키는 제제이다. 분산제제는 용액제제에 비해서 약물의 산화, 분해가 잘 일어나지 않으며, 내복용 분산제제에서는 약물의 나쁜 냄새나 맛을 방지할 수 있다. 한편 물리적으로 안정한 것을 얻기 어렵고 고형제제(정제, 캡슐제 등)에 비해서 용량이 부정확한 것이 분산제제가 가지는 단점이다. 스프레이제는 약액을 분무기에 넣어 사용할 때 안개상으로 분산시키는 제제로 피부와 국소 점막에 적용한다.
성형제제는 의약품을 일정한 형상으로 성형 또는 피포하여 만든 제제이다. 성형제제에 속하는 주된 제제에는 정제, 트로키제, 캡슐제, 환제, 자제 등이 있다. 이 제제는 각 1개가 약 용량에 대응하는 일정량의 유효성분(주약)을 함유하고 있는 이른바 단위제제 (unit preparation, dosed preparation)이며 따라서 필요한 약 용량을 제제의 개수로 취급하는 것이 가능하여 사용하기가 매우 편리하다. 또 분립체에 비해 비표면적이 아주 작기 때문에 제제가 자동산화 등의 변화를 받을 기회가 적고 장기간 품질을 유지하기 쉽다.
정제는 의약품을 일정한 형상(렌즈형, 원판상 등)으로 압축하여 만든 제제이다. 캡슐제와 함께 가장 많이 사용되는 제형으로 전신작용 또는 국소(구강 내, 위, 장 등)작용을 기대한다. 정제의 특징은 복용이 쉬우며 투여량이 정확하고 기술적으로 작용 양상을 조절하는 것이 가능하다. 하지만 제제설계의 미묘한 차가 붕해나 용출에 영향을 미쳐 약효에도 큰 변화를 가져오므로 제조 시 세심한 주의가 필요하다.
환제는 의약품을 구상으로 만든 것이며 매우 작은 환제를 parvules 또는 입환(granules)이라고 부르고 매우 큰 것(0.5 g 이상)을 거환(boluses)이라고 하여 보통 크기의 환제와 구별하고 있다. 필요에 따라서 제피나 환(전분, 탈크 등으로)을 입힌다. 환제에는 콜로이드성 점장액(아라비아고무 용액 등의 보형제)과 약물을 연합한 것이 많고 정제나 캡슐제에 비해서 붕해가 완만하여 약물을 서서히 흡수시키므로 작용이 완화한 것이 장점이다. 그러나 성분으로서 생약의 엑스나 효모를 함유한 것은 보존 중에 곰팡이가 발생한다던지, 수분의 방출에 의해 붕해성이 나빠지는 일이 있다. 환제는 구형이며 부피가 작아 취급이나 휴대가 편리하다. 일반적으로 서서히 붕해하므로 지속작용을 바랄 때 유효하며 표면이 치밀하고 표면적이 작아 외적 요인(광, 공기, 습기)에 대해 화학적으로 안정하다. 하지만 환이 소화관을 통과하는 사이에 서서히 붕해하므로 속효를 기대하는 경우 부적당하다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 어류 병원체의 불활성화 균체를 포함하거나, 완충액을 추가로 포함할 수 있으며, 불활성화 균체는 포르말린 처리 방법, 열처리 방법 또는 동결처리 방법 등으로 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제 또는 면역 증강제를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 면역 증강제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 스쿠알렌 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제의 예는 트윈 80, 트윈60 또는 트윈 20일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트윈 20일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 어류 병원체를 완충액에 현탁하여 현탁액으로 사용하거나, 어류 연쇄구균 균체가 포함된 완충액 현탁액과 면역 보조제를 혼합하여 제조할 수 있다. 또는, 면역 보조제와 완충액의 혼합 용액에 어류 연쇄구균 균체를 완충액에 현탁하여 현탁액를 첨가하여 제조할 수도 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 경구 투여용 백신 조성물을 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증의 예방 또는 치료용 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 “사료”란 동물이 먹고 섭취하고 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 또는 한끼식의 성분을 의미한다.
사료 조성물은 통상의 어류 양식에 사용되는 배지에, 본 발명에 따른 백신 조성물을 일정량 첨가하여 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 경구 투여용 백신 조성물을 어류에 경구투여하는 단계를 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 불활성화 균체의 함량은 적용 대상 어류 또는 병원체 등에 따라 적절히 조절하여 설정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 어류 1 마리당 주입되는 불활성화 균체의 함량을 고려하여 제조될 수 있으며, 상기 균체의 함량은 일괄 또는 수회 나누어 투여될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 항원 준비
Streptococcus parauberis (19FBSPa0001) 균주는 2005년 완도지역의 병든 양식 넙치에서 분리하였으며, 2019년 1월 22일에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC13795BP).
S. parauberis 19FBSPa0001균은 Gram positive cocci로 직경은 0.5~2㎛이다. S. parauberis 균은 1.5%(v/v) NaCl이 첨가된 BHIB (Brain heart infusion agar) 배지에 접종한 후, 27℃에서 24시간 배양하였다. 그 다음, 배양된 평판배지의 집락을 무균적으로 1.5% NaCl이 첨가된 BHIB에 접종 후 교반 배양기(JS Research Inc.)에서 150rpm, 27℃로 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균액에 37%(v/v) 포르말린(Merck, Germany)을 각 배양액의 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하여 교반 배양기에서 150 rpm, 20℃로 24 시간 동안 불활화하였다.
불활화가 확인된 균액(formalin killed cell, FKC)을 12,000 RCF로 원심분리한 다음, PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척한 후 균체를 수거하고 최종적으로 습균체 무게를 측정하여 실험구에 따라 농도에 맞게 현탁하였다. 백신액을 멸균된 유리병에 분주하여 4℃에 보관 후 실험에 사용하였다.
실시예 2: FKC 함유 어류 경구 백신용 다당류 코팅/비코팅 리포좀의 제조
2-1. 비코팅 리포좀의 제조
7.5g lecithin (P3556, sigma)과 PBS 300 ml를 비커에 넣고 homogenizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 분산시키면서 peristaltic pump(튜브 연동식 펌프)를 이용하여 포집할 물질인 FKC를 유속 3 ml/min으로 설정 후 2 channel로 5분간 dropwise한 다음, homogenizing mixer 2,000rpm에서 1시간 추가로 분산하여 FKC가 포함된 리포좀을 형성시킨 후, 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하여 리포좀을 분리하였다.
2-2. 코팅 리포좀의 제조
먼저, 키토산 용액은 1.0 wt%의 농도로 제조하였는데, PBS 버퍼 용액을 용매로 사용하였다. 키토산은 수용성 고분자이지만 상온에서 잘 녹지 않을 뿐만 아니라 PBS 버퍼의 pH 7.4에서는 녹지 않고 산성인 조건에서만 녹기 때문에 젖산 (lactic acid)를 0.5wt% 첨가하여 산성 조건으로 만들고 온도를 높여서 키토산을 용해시켜 제조하였다.
7.5g lecithin과 PBS 300 ml를 비커에 넣고 homogenizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 분산시키면서 peristaltic pump를 이용하여 포집할 물질인 FKC를 유속 3 ml/min으로 설정 후, 2 channel로 5분간 dropwise한 다음, homogenizing mixer 2,000rpm에서 1시간 추가로 분산하여 FKC가 포함된 리포좀을 형성시켰다.
이후 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하여 리포좀이 형성되지 않은 lecithin을 제거하고, 원심분리가 끝난 후 고분자 키토산 용액을 넣어 스틸러에서 1시간 코팅한 다음, 다시 세척하여 코팅된 리포좀 침전물을 수득하였다(도 1, 도 2, 도 5).
연동식 펌프를 이용하여 0.4mg/ml 농도의 FKC를 3ml/min의 속도로 리포좀 제조 용액에 공급하였으며, 이러한 제조 방법은 항원과 레시틴의 충돌횟수를 높여 리포좀 포집율을 높일 수 있다. 기존 방법(대한민국 특허 제10-2047910호)은 FKC와 리포좀 제조 용액이 처음부터 혼합된 상태이므로 그 농도가 낮아져 FKC와 레시틴의 충돌 횟수가 적은 반면 본 발명의 방법은 레시틴 용액에 FKC용액이 첨가되면서 리포좀이 형성되기 때문에 FKC가 레시틴에 모두 포집되는 방법이다.
실시예 3: FKC 함유 리포좀 백신의 In vitro 효능 검증
3-1: 리포좀의 안정성 조사
7.5g lecithin과 PBS 300 ml를 비커에 넣고 homogenizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 분산시키면서 peristaltic pump를 이용하여 포집할 물질인 FKC와 50 mM calcein을 유속 3 ml/min으로 설정 후 2 channel로 5분간 dropwise한다. 그 후 homogenizing mixer 2,000rpm에서 1시간 추가로 분산하여 FKC와 calcein가 포함된 리포좀을 형성시켰다.
리포좀이 포집되지 않은 형광물질을 씻어내기 위해 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge한 다음, 상층액은 버린 후 침전물을 50배 희석하고 다시 9 ml에 Triton X-100 2 ml(blank; buffer 2 ml)를 각각 시험관에 담아 여러 조건별로 일정시간 보관 후 원심분리하였다. 상층액을 syringe 필터로 여과시킨 후, 여과액의 형광광도의 세기를 에서 측정하였다.
그 결과, 형광물질인 calcein이 470-509 nm에서 용출된 것을 보면 RT에서 리포좀이 안정하며 온도가 높아짐에 따라 리포좀의 안정성이 떨어진다는 것을 알 수 있었다(도 3).
또한 코팅/비코팅 리포좀을 각각 상온 또는 4℃에서 20일간, 보관한 결과 모두 안정한 상태로 유지되는 것을 확인하였다(도 6).
3-2: 리포좀의 크기 측정
나노 수준의 입자가 작은 미립자 형태가 되면 용매의 분자 운동에 영향을 받아 브라운 운동을 하게 된다. 브라운 운동이란 액체나 기체 속에서 미소입자들이 불규칙하게 운동하는 현상이며 운동 속도는 입자의 크기에 영향을 받으며 작은 입자일수록 빨리, 큰 입자일수록 느리게 운동한다. 이 입자에 빛을 쏘아 입자 운동 속도에 따른 위상차 산란 현상을 이용하면 동적광산란법이 일어난다. 동적광산란법의 원리를 이용하여 입자의 크기, 분포를 분석하였다. 리포좀 size 측정은 한국고분자연구소에 의뢰하여 zeta-potential & particle size analyzer ELSZ-2000ZS를 이용하여 측정하였다.
입자 사이에서 반발력이나 인력을 기반으로 하는 양전하 밀도 차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 제타전위라고 하며, 용액 내 입자의 분산 혹은 응집의 정도를 평가할 수 있다. 일반적으로 전위차의 절대값이 클수록 좋은 분산상태라고 평가한다.
지질막 유동성 측정결과, 반도체 파장 664.5nm에서 제타 전위 -200에서 200mV 사이의 제타 전위를 측정하였다. emulsion 리포좀은 제타전위가 평균 -42.01 mV, emulsion coating의 경우 -43.33 mV로 보아 코팅 리포좀의 제타전위 절대값이 크며 분산이 잘 되어있는 것으로 나타났다(도 8).
리포좀의 size 측정결과, emulsion 리포좀은 평균입경이 평균 343.4 nm, emulsion coating 리포좀의 경우, 평균입경이 73.54 ㎛로 측정되어 코팅 리포좀의 평균입경이 더 크다는 것을 확인하였다(도 9).
3-3: 리포좀의 포집율 측정
10% 갈산 (gallic acid; junsei, Japan)를 포함한 리포좀을 제조하고 이부프로펜 (ibuprofen; I4883-1G, sigma, Korea)을 함유한 PBS에 녹여 HPLC실험에 사용하였다. 상층과 Triton X-100으로 리포좀을 터뜨린 하층의 상층액을 증발시키고, 잔류량은 동일한 농도로 하여 필터 후 HPLC로 측정하였다. HPLC는 Waters사(Alliance e2695 Separations Module), UV 검출기(Waters 2489 UV/Vis Detector) 및 Empower3 소프트웨어를 활용하여 정량 분석하였다. 컬럼은 C18 column(SunFireTM, 4.6*300mm, 5μm)을 사용하였다. HPLC 분석조건으로 용매는 Phosphate 버퍼(pH 6.8):Acetonitrile=65:35를 사용하 였으며, 유속은 1 ml/min, 시료 주입량은 10 μl, 파장은 UV 222nm이었다. 시험액 중의 gallic acid을 분석한 결과 gallic acid은 유지시간이 1.98±0.02분으로 나타났으며 이부프로펜의 경우 6.01±0.09분으로 나타났다.
리포좀의 상층과 하층으로 구분하여 표준물질인 이부프로펜에 대한 gallic acid의 함유량으로 포집율을 계산하였다
포집율(%)=
A: 리포좀에 포집되지 않은 ibuprofen에 대한 gallic acid의 면적 비율
B: 리포좀에 포집된 ibuprofen에 대한 gallic acid의 면적 비율
결과, 리포좀에 포집 되지 않은 지표물질 층은 36%, 리포좀에 포집된 지표물질 층은 64%로 리포좀 포집율이 64%인 것을 알 수 있다(도 4a-d).
3-4: 리포좀의 인공위액, pH 변화에 따른 항원 용출 시험
항원 용출시험은 대한약전 일반시험법 제2법(패들법)에 따라 용출시험장치(KDIT-200, Kukje Engineering Co., Korea)를 이용하여 인공위액(simulated gastric fluid TS, pH 1.2)에서 실시하였으며 용출액을 용기에 넣고 패들을 100 rpm의 속도로 회전시킨 다음 리포좀을 넣고 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60분 후 각각 용출액을 취하여 여과하여 HPLC로 분석하였다. 이동상은 아세토니트릴, 메탄올, 0.01M 인산염완충액(pH 7.4)의 혼합액(30;20;50)을 사용하였으며 유속은 1.0 mL/min이었다. 컬럼은 Lichrospher RP-18을 사용하였으며 주입량은 10 μL, 검출파장은 275nm이였다.
HPLC 결과값은 (A-B/A)*100으로 계산하였다 (A: 인공위액에서 용출 전 리포좀, B: 인공위액에서 용출시간별 리포좀). 결과에 의하면 비코팅 리포좀은 10분째 용출되었고, 코팅 리포좀은 15분째 용출되었다. 모든 리포좀에서 25분째부터 각 시간대에서 용출량에 유의성 있는 차이가 없이 동일한 용출 양상을 나타내었다.
따라서, 키토산 코팅한 리포좀이 코팅하지 않은 리포좀보다 인공위액에서 용출률이 낮은 것으로 확인되었다(도 7).
3-5: 기존 리포좀 제작 방법과의 비교
동일한 양의 레시틴과 FKC를 이용하여 대한민국 특허 제10-2047910호의 실시예 5-2에 기재된 방법으로 제조된 리포좀과 본 발명의 방법으로 제조된 리포좀의 양을 비교하였다.
그 결과, 도 15에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법으로 제조한 리포좀의 포집율이 뛰어나 같은 양의 레시틴과 FKC로부터 훨씬 많은 양의 리포좀을 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4: 리포좀 백신의 제형 제조
4-1: 스프레이 형태 제형
공급된 사료(1 kg)에 실시예 2에서 제작한 경구백신용 리포좀 용액(60 mg/ml)을 분무기를 이용하여 50 mL 스프레이하였다. 이 때 스프레이된 리포좀 용액의 양은 사료의 0.5-5%가 되도록 사료에 흡착시켰으며, 사료가 엉겨 붙지 않을 정도의 점성을 유지하도록 하며 서로 달라붙지 않게 하도록 제조하였다(도 14a).
4-2: 환 형태 제형
리포좀 백신의 사료 적용성을 알아보기 위해 일반 어류용 사료를 분쇄하여 분말화된 사료와 리포좀을 제환기에 넣어 환제로 제형화하였다. 설계된 원료들을 분말 형태로 잘 혼합하고, 혼합된 분말 1 kg을 제환기에 넣고 회전을 하면서 증류수를 스프레이 분무하여, 물방울이 분말사료에 엉겨붙어 seed형태가 되고 이 seed들이 뭉쳐져 제환 형태로 제형화 시킨 사료를 제조하였다. 이때 수분의 사용은 사료량의 5-30%로 설정하였다. 제조된 환을 자연 건조하였다(도 14b, c).
4-3: 실험군별 제형 제조
FKC 코팅 사료, 리포좀 코팅 스프레이 사료, 리포좀 코팅 환 사료, 리포좀 chitosan 언코팅 스프레이 사료, 리포좀 chitosan 언코팅 환 사료를 제작하였다.
넙치 한 마리당 3 mg의 FKC가 포집된 리포좀 사료 0.5 g을 급여하며 넙치는 한 군당 30마리씩 총 4회 경구투여가 필요하므로, FKC 3 mg에 해당되는 리포좀의 양은 75 ㎕이며 리포좀의 포집율이 64%이므로 1.6배에 해당하는 120 ㎕의 FKC가 필요하며, 따라서 한 군당 60 g의 넙치 사료에 FKC 14.4 ml가 포집된 리포좀이 필요하다.
실험군별 제형
group ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
sample FKC oral FKC coating oral IP PBS coating Liposome uncoating Liposome
제형 - spay - - spay 환 spay 환
필요량 FKC 14.4 ml FKC 120 ul×30마리×4회 = 약 14.4 ml
사료 0.5 g×30마리×4회 = 60 g
① FKC를 coating한 사료(group 2)
FKC 7.2 ml에 0.5% chitosan coating액 5 ml와 PBS 30 ml를 넣고 stiller에서 1시간 교반하였다. 이 후 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 하층을 PBS에 녹인 후 넙치 사료에 스프레이하였다.
② 리포좀을 coating한 스프레이 사료(group 5)
1.875g lecithin과 PBS 75 ml를 비커에 넣고 homognizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 5분간 분산시켰다. 동시에 peristaltic pump에 포집할 물질인 FKC를 유속 1.5 ml/min으로 설정 후 2 channel로 2분 30초간 dropwise하여 FKC가 포함된 리포좀을 형성시켰다. 이후 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하여 리포좀을 분리하였다. 이 후 0.5% chitosan 코팅액을 5 ml 넣고 stiller에서 1시간 교반하여 코팅 리포좀을 제조하였고 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하였다. 24well에 넙치 사료를 0.25 g씩 넣고 리포좀을 스프레이한 후 다시 0.25 g의 넙치 사료와 혼합하였다.
③ 리포좀을 coating한 환 사료(group 6)
1.875g lecithin과 PBS 75 ml를 비커에 넣고 homogenizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 분산시키는 동시에 peristaltic pump에 포집할 물질인 FKC를 유속 1.5 ml/min으로 설정 후 2 channel로 2분 30초간 dropwise하였다. 그리고 homogenizing mixer 2,000rpm에서 1시간 추가로 분산하여 FKC가 포함된 리포좀을 형성시켰다. 이후 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하여 리포좀을 분리하였다. 그 후 0.5% chitosan 코팅액 5 ml를 넣고 stiller에서 1시간 교반하여 코팅 리포좀을 제조하였고 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하였다. 제환기에 넙치 사료 30 g을 넣고 리포좀을 뿌려주면서 sieve를 사용하여 직경 3~5 mm의 환 형태의 사료를 제조하였다.
④ 리포좀에 chitosan을 coating하지 않은 스프레이 사료(group 7)
1.875g lecithin과 PBS 75 ml를 비커에 넣고 homogenizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 분산시키는 동시에 peristaltic pump에 포집할 물질인 FKC를 유속 1.5 ml/min으로 설정 후 2 channel로 2분 30초간 dropwise하였다. 그리고 homogenizing mixer 2,000rpm에서 1시간 동안 추가로 분산하여 FKC가 포함된 리포좀을 형성시켰다. 이후 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하여 리포좀을 분리하였다. 24 well에 넙치 사료를 0.25 g씩 넣고 리포좀을 스프레이한 후 다시 0.25 g의 넙치 사료와 혼합하였다.
⑤ 리포좀에 chitosan을 coating하지 않은 환 사료(group 8)
1.875g lecithin과 PBS 75 ml를 비커에 넣고 homogenizing mixer를 사용하여 2,000rpm에서 분산시키는 동시에 peristaltic pump에 포집할 물질인 FKC를 유속 1.5 ml/min으로 설정 후 2 channel로 2분 30초간 dropwise하였다. 그리고 homogenizing mixer 2,000rpm에서 1시간 동안 추가로 분산하여 FKC가 포함된 리포좀을 형성시켰다. 이후 3,000rpm으로 10분씩 3번 centrifuge하여 리포좀을 분리하였다. 제환기에 넙치 사료 30 g을 넣고 리포좀을 뿌려주면서 환 형태의 사료를 제조하였다.
실시예 5: 리포좀 백신의 In vivo 효능 검증
넙치 입식 및 순치 시 비특이적 요인 및 환경변화를 최소화하였고, 실험을 수행하기 전 병성검사 지침서에 따른 질병검사를 수행하여 병원체가 검출되지 않은 넙치를 이용해 다당체 코팅/비코팅 리포좀의 경구투여와 특이-항체 형성능 분석을 수행하였다.
실험에 사용된 넙치는 경상남도 거제시 소재의 종묘생산장에서 구입하여 실험군별로 30마리씩 수조에 수용시킨 후 수온 21~22℃ 하에서 1주간 순치시켰다. 실험에 사용하기 전 세계동물 보건기구(OIE)와 국립수산과학원의 병성검사 지침서에 따라 병성검사를 수행하였으며, 모든 검체에서 병원성 세균과 바이러스가 검출되지 않았다. 검증된 넙치는 급이양을 결정하기 위해 평균 체중을 확인한 결과 49±7.2 g으로 확인되었다
5-1: 리포좀 경구백신 투여
실험군과 대조군은 백신과 사료 제작방법을 고려하여 8가지 그룹으로 나누어 투여실험을 수행하였다(표 2). 동일한 양의 경구백신을 안정적으로 투여하기 위하여 이전에 보고된 방법에 따라 benzocaine을 이용한 마취 후 경구투여용 주사기를 이용하여 투여하였으며(M. R. Jo, et al., Fish. Aquat. Sci., 43(6): 623-628, 2010), 투여 후 마취에서 회복하는 과정을 충분히 관찰하며 실험을 진행하였다. 사료의 투여량과 투여 기간은 어체중의 1%인 500 mg을 하루 2회로 나누어 1, 3, 5, 10일마다 각각 투여하였고, 18일차에 부스팅을 위해 1회 더 수행하였다.
또한, 경구백신 투여로 생성된 특이-항체가를 비교하기 위한 대조군에는 제작한 S. parauberis FKC 백신을 어체당 1 mg/fish의 농도로 복강 주사하였으며, 사료급여는 경구백신이 첨가되지 않은 동일한 제품으로 실험군과 같은 시간에 실시하였다.
투여실험 시작 2주와 3주 후 말초혈액과 장 조직을 각각 무균적으로 추출하였다. 추출한 혈액은 4℃에서 1시간 동안 반응 후 4℃에서 6,000rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
장 조직은 적출한 직후 절개하여 PBS로 이물질을 제거한 후 스파츄러(spatula)를 이용하여 장 내부의 점막을 조심스럽게 긁어내어 1.5 mL의 PBS에 현탁해 0.45 ㎛ syringe filter로 정제하였다. 획득한 혈청과 장 점막 샘플은 항체가 측정 전까지 4℃에서 냉장 보관하였다.
5-2: ELISA를 이용한 특이 항체 형성능 분석
특이-항체가의 측정은 효소면역측정법인 ELISA 기법을 이용하여 수행하였다. 먼저 96-well ELISA용 plate에 carbonate bicarbonate buffer에 현탁시킨 S. parauberis를 107 ㎍/well의 농도로 분주하였고, 4℃에서 밤새 배양하여 항원을 부착시켰다. 그 후, 3% skim milk를 이용하여 실온에서 1시간 동안 blocking을 수행하였고, 1차 항체로는 분리한 넙치 혈청과 장 점막 현탁액을 PBS에 1:10으로 각각 희석해 well 당 100 ㎕씩 분주하였다. 1시간 동안 실온에서 배양 후 PBST를 이용하여 3회 세척하였고, 2차 항체는 구입한 anti-Japanese flounder IgM Mab을 사용하여 PBS에 1:1,000으로 희석한 뒤 well 당 100 ㎕씩 분주하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. PBST로 3회 세척 후, 구입한 AP-conjugated anti-mouse IgG (whole molecule)를 1:1,000으로 희석해 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응시켰고, PBST로 세척한 후 기질 (PNPP substrate solution)을 첨가하여 20분간 반응시켰다. 마지막으로 stop solution을 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시킨 후 405 nm하에서 흡광도를 측정하였다.
한편 장 점막 샘플은 세척과 샘플처리 과정 등에서 농도변화가 발생할 수 있으므로 단백질 정량을 실시하여 확인한 항체가를 보정하였다. 단백질 정량은 bradford법 기반의 BIO-RAD사 kit를 사용하였으며(그림 21), 제조사의 매뉴얼에 따라 정량화한 후 항체가에 대입하여 최종 항체가를 산출하였다. 또한 측정된 항체가의 통계 분석은 SPSS 프로그램을 사용하여 tukey 다중검정법에 따라 유의성을 검증하였다.
그 결과, 경구투여 2주 후, ELISA를 이용한 특이-항체 형성능 분석결과 장 점막과 혈청에서 제환형 코팅 리포좀이 가장 높은 항체가를 보인 것을 확인하였고(도 10), 3주 후 혈청 샘플에서는 스프레이형 코팅 리포좀이 1순위, 제환형 코팅 리포좀이 2순위로 높은 항체가를 나타내었으며, 장 점막에서는 제환형 코팅 리포좀이 1순위, 스프레이형 코팅 리포좀이 2순위로 높은 항체가를 나타내는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 6: 백신용 코팅 리포좀 경구투여에 대한 생존율 분석
경구투여 3주 차 샘플링이 끝난 직후 인위감염 적정 수온인 27℃까지 순차적으로 가온하여 수일간 추가적으로 순치시켰다. 그리고 준비된 S. parauberis KCTC13795BP를 PBS에 현탁시켜 그룹당 20마리씩 106 CFU/fish의 농도로 피하 주사한 뒤 15일간 누적 폐사율과 상대 생존율을 분석하였다.
그 결과, 제환형 리포좀 코팅에서 가장 높은 생존율(55%)을 보였으며, 복강(IP) 및 일반 백신 경구투여(FKC)와 리포좀 비코팅보다 높은 생존율이 나타나는 것을 확인하였다(도 12). 제환형 코팅 그룹에서 가장 낮은 폐사율(45%)이 나타났으며, 제환형 비코팅 그룹에서는 70%의 폐사율이 나타났다. 또한, 복강 투여(80%)와 일반 경구투여(85%) 그룹에서 제환형 코팅보다 높은 폐사율을 확인할 수 있었으며, 스프레이형 코팅과 비코팅 그룹에서는 각각 65와 85%의 폐사율을 보였다. 모든 실험군은 13일차부터 폐사가 나타나지 않았으며 control에서 전량폐사가 나타났다.
또한, 상대 생존율 분석결과, 제환형 리포좀 코팅 그룹에서 가장 높은 상대 생존율(55%)을 나타내었으며, 스프레이 코팅(35%), 제환형 비코팅(30%) 그리고 복강투여(20%) 순으로 높은 상대 생존율을 확인할 수 있었다(도 13).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 다음 단계를 포함하는 불활성화된 어류 연쇄구균 균체가 포집된 어류 경구백신용 리포좀 (liposome)의 제조방법:
    (a) 레시틴 (lecithin)과 수용액을 교반시켜 리포좀을 제조하는 단계;
    (b) 상기 형성된 리포좀에 불활성화된 어류 연쇄구균 균체와 계면활성제를 첨가하고 교반하여 리포좀에 어류 연쇄구균 균체를 포집하는 단계; 및
    (c) 상기 리포좀을 세척하여 어류 경구백신용 리포좀을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 어류는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 감성돔, 참돔, 돌돔, 기타돔류, 민어, 방어, 복어류, 조피볼락, 기타볼락류, 고등어류, 노래미류, 송어류, 숭어류, 연어, 붕장어, 전갱이류, 전어, 참조기, 쥐치류, 철갑상어, 잉어류, 뱀장어류, 메기류, 쏘가리 및 열대어로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 리포좀의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 어류 연쇄구균 균체는 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), Streptococcus difficile (스트렙토코커스 디피실), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 리포좀의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 불활성화된 어류 연쇄구균 균체가 포집된 어류 경구백신용 리포좀 (liposome)의 포집율은 40 내지 80%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제 또는 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 리포좀의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 리포좀을 세척하기 전에 키토산으로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 리포좀의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 키토산은 0.5~2wt%인 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 리포좀의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 300 내지 8000nm인 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 리포좀의 제조방법.
  9. 제1항의 방법으로 제조되고, 불활성화된 어류 연쇄구균 균체가 포집되어 있는 리포좀을 포함하는 어류용 경구백신 조성물로, 상기 리포좀은 레시틴(lecithin)에 의해 형성되고, 300 내지 8000nm 크기인 것을 특징으로 하는 어류의 경구백신투여용 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 어류는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 감성돔, 참돔, 돌돔, 기타돔류, 민어, 방어, 복어류, 조피볼락, 기타볼락류, 고등어류, 노래미류, 송어류, 숭어류, 연어, 붕장어, 전갱이류, 전어, 참조기, 쥐치류, 철갑상어, 잉어류, 뱀장어류, 메기류, 쏘가리 및 열대어로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 어류의 경구투여용 백신 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 어류 연쇄구균 균체는 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), Streptococcus difficile (스트렙토코커스 디피실), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 어류 경구백신용 백신 조성물.
  12. 제9항의 경구 투여용 백신 조성물을 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증의 예방 또는 치료용 사료 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 어류는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 감성돔, 참돔, 돌돔, 기타돔류, 민어, 방어, 복어류, 조피볼락, 기타볼락류, 고등어류, 노래미류, 송어류, 숭어류, 연어, 붕장어, 전갱이류, 전어, 참조기, 쥐치류, 철갑상어, 잉어류, 뱀장어류, 메기류, 쏘가리 및 열대어로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사료 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 어류 연쇄구균 감염증은 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), Streptococcus difficile (스트렙토코커스 디피실), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 균체에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 사료 조성물.
  15. 제9항의 경구 투여용 백신 조성물을 어류에 경구투여하는 단계를 포함하는 어류의 연쇄구균 감염증을 예방 또는 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 어류는 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 감성돔, 참돔, 돌돔, 기타돔류, 민어, 방어, 복어류, 조피볼락, 기타볼락류, 고등어류, 노래미류, 송어류, 숭어류, 연어, 붕장어, 전갱이류, 전어, 참조기, 쥐치류, 철갑상어, 잉어류, 뱀장어류, 메기류, 쏘가리 및 열대어로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 어류의 연쇄구균 감염증을 예방 또는 치료하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 어류 연쇄구균 감염증은 Streptococcus parauberis (스트렙토코커스 파라우베러스), Streptococcus iniae (스트렙토코커스 이니아에), Streptococcus difficile (스트렙토코커스 디피실), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움), Vagococcus salmoninarum (바고코커스 살모니나럼), Lactococcus garvieae (락토코커스 가르비에), Streptococcus agalactiae (스트렙토코커스 아갈락티애), Streptococcus dysgalactiae (스트렙토코커스 디스갈락티애), Streptococcus milleri (스트렙토코커스 밀레리), Lactococcus piscium (락토코커스 피시움) 및 Carnobacterium piscicola (카르노박테리움 피시콜라)로 구성된 군에서 선택되는 균체에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 어류의 연쇄구균 감염증을 예방 또는 치료하는 방법.
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