KR20230136989A - SNP markers for predicting the ratio of proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens and their use - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토종닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 토종닭의 맹장에서 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율을 판별할 수 있는 SNP 12개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율을 확인한 것인 바, 이를 이용하여 닭의 장 건강 및 체중을 예측할 수 있는 바, 건강상태가 좋은 개체 또는 고체중 개체를 선발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a SNP marker for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of native chickens and its use, which can determine the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes in the cecum of native chickens. By selecting 12 SNPs, the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes according to the genotype was confirmed, and using this, the intestinal health and body weight of chickens can be predicted. Individuals in good health or high weight. It can be useful in selecting.
Description
본 발명은 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a SNP marker for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens and its use.
동물의 위장관 (gastrointestinal tract)은 영양소 흡수 및 미생물의 증식 기능을 하며, 장내 미생물의 조성은 생산성(사료효율 등) 및 면역력과 직접적 관련 있다. 닭은 성장률과 사료전환율 같은 높은 생산성을 갖도록 개량되어 왔으며, 다른 가축에 비하여 저렴한 단백질원으로 이용되고 있다. 닭에서 장내미생물의 조절은 생산성을 높이기 위한 잠재력을 가지며, 이는 가금산업에서 프로바이오틱스의 사용을 증가를 일으키고 있다 The gastrointestinal tract of animals functions to absorb nutrients and proliferate microorganisms, and the composition of intestinal microorganisms is directly related to productivity (feed efficiency, etc.) and immunity. Chickens have been improved to have high productivity, such as growth rate and feed conversion ratio, and are used as a cheap protein source compared to other livestock. Modulation of the gut microbiota in chickens has the potential to increase productivity, leading to increased use of probiotics in the poultry industry.
장내미생물은 병원균으로 부터의 보호, 면역체계 발달뿐만 아니라 영양학적으로도 중요한 역할을 한다. 소화관에서 맹장은 미생물 세포가 가장 높은 농도를 차지하는 부위로서, 대부분의 미생물 군집연구는 맹장에 집중되어 있다. 맹장내 미생물군은 소장을 통과하는 탄수화물로부터 아세테이트 (acetate), 부티레이트 (butyrate), 락테이트 (lactate) 및 프로피오네이트 (propionate)와 같은 단쇄지방산 (Short Chain Fatty Acids, SCFAs) 생산하고, 이는 체내에 흡수되어 에너지원으로 사용된다. 일부 맹장내 미생물군은 질소 화합물의 분해와 아미노산 합성을 통하여, 체내 질소 재활용 (recycling)에 관여한다. Intestinal microorganisms play an important role not only in protecting against pathogens and developing the immune system, but also nutritionally. In the digestive tract, the cecum is the area with the highest concentration of microbial cells, and most microbial community studies are focused on the cecum. Microorganisms in the cecum produce short chain fatty acids (SCFAs) such as acetate, butyrate, lactate, and propionate from carbohydrates passing through the small intestine, which are stored in the body. It is absorbed and used as an energy source. Some cecal microorganisms are involved in nitrogen recycling in the body through the decomposition of nitrogen compounds and amino acid synthesis.
가축의 경제 형질을 향상시키기 위해 후보 유전자내 유전자 마커의 이용은 여러 연구에서 보고된 바 있다. 현재에는 마커 도움 선발 (marker associated selection, MAS)을 통한 가축의 선발이 가축 육종 프로그램에서 보편화된 방법 중 하나이다. 이는 게놈 정보를 사용하면 개체 선발의 정확성과 속도를 높일 수 있기 때문이다. The use of genetic markers within candidate genes to improve economic traits of livestock has been reported in several studies. Currently, livestock selection through marker associated selection (MAS) is one of the common methods in livestock breeding programs. This is because using genomic information can increase the accuracy and speed of individual selection.
종래의 선행기술로서 대한민국 등록특허 제102235340호에는 TBC1D1 유전자 내 SNP에 기반한 토종닭의 체중, 증체량 및 도체중과 같은 성장 형질을 조기에 예측할 수 있는 SNP 마커가 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2017-0087429호에는 닭의 산란 형질 관련 유전자 마커 및 이를 이용하여 닭의 산란 형질을 분별하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제102141091호에는 토종닭의 유전적 배경 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커가 개시되어 있으나, 닭의 장내미생물 유전체 (metagenome)와 숙주 유전체와의 연관성에 대해서는 기재된 바가 없다.As a conventional prior art, Republic of Korea Patent No. 102235340 discloses a SNP marker that can early predict growth traits such as body weight, weight gain, and carcass weight of native chickens based on SNPs in the TBC1D1 gene, and Republic of Korea Patent Publication No. 2017- No. 0087429 discloses genetic markers related to chicken laying traits and a method for distinguishing chicken laying traits using them, and Republic of Korea Patent No. 102141091 discloses SNP markers for determining the genetic background or breed of native chickens. However, there has been no description of the relationship between the chicken intestinal microbial genome (metagenome) and the host genome.
이에 본 발명자들은 닭 300수에 대해 토종닭 집단의 맹장내 박테로이데테스 (Bacteriodetes)에 대한 프로테오박테리아 (Proteobacteria)의 비율과 숙주의 유전자형간의 전장유전체 연관성분석 (Genome-wide association study, GWAS)을 통하여 닭의 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율을 조기 예측 가능한 SNP 12개를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors conducted a genome-wide association study (GWAS) between the ratio of Proteobacteria to Bacteriodetes in the cecum of a native chicken population and the genotype of the host for 300 chickens. The present invention was completed by selecting 12 SNPs that can early predict the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in chickens.
본 발명의 목적은 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 조성물, 이를 포함하는 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 키트, 또는 이를 이용한 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측 방법을 제공하는 것이다. The object of the present invention is to provide a composition for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chicken, a kit for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes containing the same, or a composition for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes using the same. To provide a method for predicting the proportion of Proteobacteria.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 및 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a single nucleotide polymorphism (SNP) in which the 61st base is A or G in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1; the 61st base in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 is A or G. SNP that is G or A; SNP in which the 51st base is G or A in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 3; SNP in which the 61st base is G or A in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 4; SNP in which the 61st base is G or A in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 5 SNP whose 61st base is G or A in the polynucleotide; SNP whose 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6; SNP whose 61st base is C or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7 ; SNP in which the 61st base is A or G in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 8; SNP in which the 61st base is G or A in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 9; 61st in the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 10 SNP whose base is A or G; SNP whose 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11; and SNP whose 61st base is A or C in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12; Consisting of Provided is a composition for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, which includes an agent capable of detecting or amplifying one or more SNPs selected from the group.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens comprising the composition.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 마이크로어레이를 제공한다.Additionally, the present invention provides a microarray for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens comprising the composition.
또한, 본 발명은 1) 닭으로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계; 를 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of 1) amplifying a region containing a SNP of a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12 or a complementary polynucleotide thereof from DNA of a sample isolated from chicken; and 2) determining the base type of the SNP in the region containing the amplified SNP; Provides a method for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, including.
본 발명은 토종닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 토종닭의 맹장에서 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율을 판별할 수 있는 SNP 12개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율을 확인한 것인 바, 이를 이용하여 닭의 장 건강 및 체중을 예측할 수 있는 바, 건강상태가 좋은 개체 또는 고체중 개체를 선발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a SNP marker for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of native chickens and its use, which can determine the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes in the cecum of native chickens. By selecting 12 SNPs, the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes according to the genotype was confirmed, and using this, the intestinal health and body weight of chickens can be predicted. Individuals in good health or high weight. It can be useful in selecting.
도 1은 6개 계통별 유전자형 기반 주성분 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율 관련 전장유전체연관분석에 대한 Quantile-quantile plot을 나타낸 도이다.
도 3은 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율 관련 전장유전체연관분석에 대한 Manhattan plot을 나타낸 도이다.Figure 1 shows the results of genotype-based principal component analysis for each of the six lineages.
Figure 2 is a diagram showing a quantile-quantile plot for genome-wide association analysis related to the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes.
Figure 3 is a diagram showing a Manhattan plot for genome-wide association analysis related to the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 및 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 조성물을 제공한다.The present invention relates to a SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2; A SNP where the 51st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5; A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6; SNP where the 61st base is C or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7; A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9; A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 10; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11; and a SNP where the 61st base is A or C in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12; Provided is a composition for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, which includes an agent capable of detecting or amplifying any one or more SNPs selected from the group consisting of.
상기 프로테오박테리아는 닭의 맹장에서 발견되는 미생물로써, 대장균, 살모넬라, 비브리오, 헬리코박터 등 다양한 병원균과 질소고정세균을 포함한다. 인간에서는 대사증후군과 염증성 장질환과 관련되어 있으며, 닭에서는 체중과 연관성이 있음이 알려져 있다. 상기 박테로이데테스는 복부의 지방세포에 작용하여 지방분해효소를 활성화하고 체내 지방연소를 돕는다. 따라서 프로테오박테리아/박테로이데테스의 비율은 닭의 장 건강 및 체중 등의 예측을 위한 지표로 활용될 수 있다. 이에 연관된 변이를 통해, 가축의 장 건강상태 및 고체중 개체를 선발하기 위한 숙주의 유전자형 지표로 활용될 수 있다.The proteobacteria are microorganisms found in the cecum of chickens and include various pathogens and nitrogen-fixing bacteria such as E. coli, Salmonella, Vibrio, and Helicobacter. In humans, it is associated with metabolic syndrome and inflammatory bowel disease, and in chickens, it is known to be associated with body weight. The Bacteroidetes act on abdominal fat cells to activate lipolytic enzymes and help burn fat in the body. Therefore, the ratio of Proteobacteria/Bacteroidetes can be used as an indicator for predicting intestinal health and body weight of chickens. Through mutations related to this, it can be used as an indicator of the host's genotype to select intestinal health status of livestock and high-weight individuals.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.An agent capable of detecting or amplifying the SNP may be a primer or probe, and specifically, a probe capable of specifically binding to a region containing the SNP, a polynucleotide containing a region containing the SNP, or a polynucleotide thereof. It may be a primer that can specifically amplify a complementary polynucleotide.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.The primer can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These primers can be modified using many means known in the art as long as they are effective in detecting the region containing the SNP. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoroamidate). , carbamate, etc.) or a charged linker (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). Nucleic acids may contain one or more additional covalently linked residues, such as proteins (e.g., nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), insertions (e.g., acridine, etc.) , propalene, etc.), chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents. Additionally, if necessary, the primer may contain a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules and chemical groups (e.g., biotin), etc. There is.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.The term "probe" used herein refers to a nucleic acid fragment of several to hundreds of bases that can specifically bind to DNA or RNA, including an oligonucleotide probe and a single stranded DNA probe. , can be produced in the form of a double stranded DNA probe or RNA probe.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.The probe can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. These probes can be modified using many means known in the art as long as they are effective in detecting the region containing the SNP. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoroamidate). , carbamate, etc.) or a charged linker (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.). Nucleic acids may contain one or more additional covalently linked residues, such as proteins (e.g., nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), insertions (e.g., acridine, etc.) , propalene, etc.), chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. The probe may additionally have a reporter conjugated to its 5' end. The reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas Red, fluorescein, fluorescein chlorotriazinyl, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro -6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), Oregon green, Alexa Fluor (alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC ( It may be any one or more selected from the group consisting of tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine dyes, and thiadicarbocyanine. However, any substance known in the art that can be used as a reporter can be used.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.The probe may be further conjugated with a quencher at its 3' end. The quencher is TAMRA, BHQ (black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ (nonfluorescent quencher), dabcyl, Eclipse, DDQ (deep dark quencher), Blackberry Quencher, Iowa black ), but any material known in the art that can be used as a photoquencher can be used.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제에는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.Agents capable of detecting or amplifying the SNP may include reverse transcription polymerase, DNA polymerase, cofactors such as Mg 2+ , dATP, dCTP, dGTP, and dTTP. To amplify reverse transcribed cDNA, various DNA polymerases can be used in the amplification step of the present invention. Examples of DNA polymerases include Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase, or bacteriophage T7 DNA polymerase. There are enzymes. The polymerase can be isolated from the bacteria themselves, purchased commercially, or obtained from cells expressing high levels of the cloned gene encoding the polymerase.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens comprising the composition.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 및 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.The composition may have the characteristics described above. For example, the present invention provides a SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2; A SNP where the 51st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5; A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6; SNP where the 61st base is C or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7; A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9; A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 10; A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11; and a SNP where the 61st base is A or C in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12; It may include an agent capable of detecting or amplifying any one or more SNPs selected from the group consisting of.
또한, 상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.In addition, the agent capable of detecting or amplifying the SNP may be a primer or probe, and specifically, a probe capable of specifically binding to the region containing the SNP, and a polynucleotide containing the region containing the SNP. Alternatively, it may be a primer that can specifically amplify its complementary polynucleotide.
상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The kit may be a PCR kit or a DNA analysis kit, but is not limited thereto.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율을 예측할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.The kit of the present invention uses the composition to confirm the genotype of the SNP marker provided in the present invention through amplification, or by checking the expression level of mRNA, to determine the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens. It is predictable. The kit provided by the present invention may be a kit containing the essential elements necessary to perform RT-PCR.
예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.For example, an RT-PCR kit includes a tube or other suitable container, reaction buffer (pH and magnesium concentration may vary), in addition to a pair of primers specific for a polynucleotide containing the region containing the SNP or its complementary polynucleotide. , deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase inhibitors, RNase inhibitors, DEPC-water, sterilized water, etc. Meanwhile, the ingredients included in the kit may be manufactured in liquid form or in dried form to improve the stability of the product by lowering the degree of freedom of the included ingredients. To manufacture this dried form, a drying step is required, and in this case, heated drying, natural drying, reduced pressure drying, freeze-drying, or a combination process thereof may be used.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측용 마이크로어레이를 제공한다.Additionally, the present invention provides a microarray for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens comprising the composition.
본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. In the present invention, a microarray refers to a microarray in which groups of polynucleotides are immobilized at a high density on a substrate, and each polynucleotide group is immobilized in a certain region. Such microarrays are well known in the art.
또한, 본 발명은 1) 닭으로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계; 를 포함하는 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of 1) amplifying a region containing a SNP of a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12 or a complementary polynucleotide thereof from DNA of a sample isolated from chicken; and 2) determining the base type of the SNP in the region containing the amplified SNP; Provides a method for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, including.
상기 단계 1)의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.The step of amplifying the region containing the SNP in step 1) can be performed using any method known to those skilled in the art. For example, target nucleic acid can be amplified through PCR and purified. In addition, ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)), transcription amplification (Kwoh et al., ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173) (1989)), self-sustaining sequence cloning (Guatelli et al., ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874 (1990)) and nucleic acid-based sequence amplification (NASBA) can be used.
상기 단계 2)의 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계는 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. The step of determining the base type of the SNP in the region containing the amplified SNP in step 2) includes sequence analysis, hybridization by microarray, allele specific PCR, and dynamic allele hybridization techniques. (dynamic allelespecific hybridization, DASH), PCR extension assay, PCR-SSCP, PCR-RFLP assay or TaqMan techniques, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (e.g., Sequenom's MassARRAY system), minisequencing methods. , performed using the Bio-Plex system (BioRad), the CEQ and SNPstream system (Beckman), Molecular Inversion Probe array technology (e.g., Affymetrix GeneChip), and BeadArray Technologies (e.g., Illumina GoldenGate and Infinium assays). It may be, but is not limited to this.
상기 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측 방법에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C인 경우; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 및 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율이 높은 것으로 예측할 수 있다.In the method for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, when the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 is A; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2 is G; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3 is G; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4 is G; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5 is G; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6 is A; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7 is C; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8 is A; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9 is G; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 10 is A; When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11 is G; and when the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12 is A; If it corresponds to at least one selected from the group consisting of, it can be predicted that the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes is high.
상기 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율이 높으면 닭의 장 건강이 좋거나 또는 체중이 높을 것이라고 예측할 수 있다.If the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes is high, it can be predicted that the chicken will have good intestinal health or high body weight.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples and experimental examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.However, the following examples and experimental examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples and experimental examples.
<실시예 1> 장내 미생물 군집과 SNP 유전형과의 연관성 분석<Example 1> Association analysis between intestinal microbial community and SNP genotype
<1-1> 실험동물의 준비<1-1> Preparation of experimental animals
국내 환경에 토착화된 6 계통 (재래적갈색, 재래황갈색, 로드아일랜드, 코니쉬흑색, 코니쉬갈색, 백색레그혼)의 닭을 이용하였다. 상기 닭은 농촌진흥청 국립축산과학원 가금연구소에서 혈통 선발 (pedigree selection)에 의해 순계 (pure-line)로 유지되고 있다. 계통별 60수씩 2년간 성장단계별로 5차 (4주령, 14주령, 20주령, 32주령, 44주령)에 걸쳐 총 300수가 샘플링 되었으며, 겸용 3계통 (재래적갈색, 재래황갈색, 로드아일랜드)와 육용 2계통 (코니쉬 흑색, 코니쉬 갈색) 그리고 난용 1계통 (백색 레그혼)으로 구분된다. Chickens of 6 lines (traditional red brown, traditional tan, Rhode Island, Cornish black, Cornish brown, and white leghorn) indigenous to the domestic environment were used. The chickens are maintained as pure-line through pedigree selection at the Poultry Research Institute of the National Institute of Animal Science, Rural Development Administration. A total of 300 animals were sampled 5 times (4 weeks of age, 14 weeks of age, 20 weeks of age, 32 weeks of age, and 44 weeks of age) by growth stage for 2 years, 60 of each lineage, and 3 lines for dual use (traditional reddish brown, traditional tan, Rhode Island) and broilers. It is divided into 2 strains (Cornish black, Cornish brown) and 1 strain (white leghorn).
<1-2> DNA 추출 및 유전자형 분석<1-2> DNA extraction and genotyping
닭 299수의 혈액 샘플로부터 Wizard genome DNA purification kit (Promega, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. NanoDrop 1000 분광광도계 (ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 DNA 농도 및 순도를 측정한 후, 53,314개의 SNP가 포함된 Illumina 60K SNP Chip을 사용하여 전체 DNA 샘플의 유전자형을 생성하였다. 성별에 대한 SNP는 이 분석에서 제외되었다. Genomic DNA was isolated from blood samples of 299 chickens using the Wizard genome DNA purification kit (Promega, USA). After measuring DNA concentration and purity using a NanoDrop 1000 spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, USA), the total DNA sample was genotyped using an Illumina 60K SNP Chip containing 53,314 SNPs. SNPs for gender were excluded from this analysis.
계통별 개체의 장관으로부터 맹장을 분리하여 조직 및 맹장액을 추출하였으며, 장내 미생물 메타게놈 서열정보를 이용한 군집 분석 비율에 대한 연관성을 분석을 위해 닭 맹장 장내미생물 13종에 관한 전장유전체 연관분석 (Genome-Wide Association Study; GWAS)을 수행하였다. 장내 미생물 서열분석 후 얻어진 53,314 SNP Chip 데이터를 PLINK ver.1.9 소프트웨어를 사용하여 다음 조건에 따라 유전자형 데이터에 대한 필터링을 수행하였다. 필터 조건은 소수 대립 유전자 빈도 (Minor Allele Frequency; MAF) <1%, 낮은 유전자형 calling <90%, 누락된 유전자형 calling >10%, Hardy-Weinberg 불균형 <1.0E-6이였으며, 21,115 SNP가 제거되었다. 품질 관리 적용 후 296마리의 닭에 대한 32,199 SNPs가 후속 분석에 적합한 것으로 간주되었다.The cecum was separated from the intestinal tract of individuals of each lineage, tissue and cecal fluid were extracted, and whole-genome association analysis of 13 types of chicken cecal intestinal microorganisms was performed to analyze the relationship between cluster analysis ratios using intestinal microbial metagenome sequence information. -Wide Association Study (GWAS) was conducted. The 53,314 SNP Chip data obtained after analyzing the intestinal microorganism sequence were filtered using PLINK ver.1.9 software according to the following conditions. Filter conditions were Minor Allele Frequency (MAF) <1%, low genotype calling <90%, missing genotype calling >10%, Hardy-Weinberg imbalance <1.0E-6, and 21,115 SNPs were removed. . After applying quality control, 32,199 SNPs from 296 chickens were considered suitable for subsequent analysis.
<1-3> 계통별 유전적 관련성 확인<1-3> Confirmation of genetic relatedness for each lineage
개체간의 유전적 관련성을 추정하기 위해 게놈 전체 복합 특성 분석 (Genome-wide Complex Trait Analysis; GCTA) 소프트웨어를 사용하여 모든 유전자형 데이터에 대한 고유 벡터를 계산하여 게놈 관계 매트릭스 (Genome Relationship Matrix; GRM)에 기초한 주성분분석 (Principle Component Analysis; PCA)을 실시하였다. To estimate genetic relatedness between individuals, eigenvectors for all genotype data were calculated using Genome-wide Complex Trait Analysis (GCTA) software, based on the Genome Relationship Matrix (GRM). Principal component analysis (PCA) was performed.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 레그혼(F)이 제 1 주성분으로 분류되었으며, 제 2 주성분으로 로드아일랜드(C)와 코니쉬 흑색(H)이 분류되었다. 코니쉬 갈색(S)와 재래계통(Y, R) 세 계통이 클러스터 (cluster)를 보이며, 특히 재래계통은 혼재 양상을 나타내었다.As a result, as shown in Figure 1, leghorn (F) was classified as the first main component, and Rhode Island (C) and Cornish black (H) were classified as the second main component. The three lines, Cornish brown (S) and traditional lines (Y, R), showed a cluster, and especially the traditional lines showed a mixed pattern.
상기의 결과는 품종별로 유전적 조성이 구분됨을 시사한다.The above results suggest that genetic composition is differentiated by breed.
<1-4> 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 조기 예측 가능한 10개 SNP의 선별<1-4> Selection of 10 SNPs that can early predict the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens
혼형선형모형 (Mixed Linear Model; MLM) 모형을 이용하여 모든 유전자형 SNP와 장내미생물 13종에 관한 전장유전체 연관분석 (GWAS)을 진행하여 각 형질에 대한 유의성을 확인하였으며, 분석에 사용된 다음 모델은 GCTA의 MLMA 옵션을 사용하여 수행되었다. 성별 (암컷, 수컷)과 성장단계 (4주령, 14주령, 20주령, 32주령, 44주령)를 고정효과로 사용하고 상위 2개의 주성분을 공변량으로 사용하여 수행되었다.Genome-wide association analysis (GWAS) was conducted on all genotype SNPs and 13 types of intestinal microorganisms using the Mixed Linear Model (MLM) model to confirm the significance of each trait, and the following model used in the analysis was This was performed using GCTA's MLMA option. This was performed using gender (female, male) and growth stage (4 weeks, 14 weeks, 20 weeks, 32 weeks, 44 weeks of age) as fixed effects and the top two principal components as covariates.
여기서, y는 미생물체에 대한 표현형 값의 벡터이고, μ는 전체 평균이고, x는 0, 1, 2로 코딩된 SNP 유전자형 지시 변수이며, g는 GRM (유전자 관계 행렬, 모든 SNP를 사용하여 계산)에 의해 캡쳐된 모든 SNP의 누적 효과, e는 잔차효과이다. where y is the vector of phenotypic values for the microbiota, μ is the overall mean, x is the SNP genotype indicator variable coded as 0, 1, 2, and g is the GRM (gene relationship matrix, calculated using all SNPs). The cumulative effect of all SNPs captured by , e is the residual effect.
유전체 전장 연관 분석을 통하여 대조군에 비해 통계적으로 유의한 SNP을 한눈에 알아볼 수 있도록 Quantile-quantile (QQ) plot을 수행하여 추정결과가 과대 또는 과소 추정되었는지를 확인하였으며, Manhattan plot을 수행하여 개별 SNP의 유의성 검정에 대한 p-value를 변이가 위치하는 염색체 및 염색체상의 위치로 도식화하였다. QQ plot 및 manhattan plot은 R 패키지 qqman을 사용하여 생성하였다 (도 2 및 도 3). Quantile-quantile (QQ) plot was performed to identify statistically significant SNPs at a glance compared to the control group through genome-wide association analysis to check whether the estimation results were over- or under-estimated, and Manhattan plot was performed to identify individual SNPs. The p-value for the significance test was plotted by the chromosome where the mutation is located and the location on the chromosome. The QQ plot and manhattan plot were generated using the R package qqman (Figures 2 and 3).
변이 성분의 추정은 GCTA의 REML 옵션을 사용하여 수행되었으며, 게놈 유전율 (h2)은 표현형 변이 (V(G)+V(E))에 대한 부가적 유전변이 (V(G))의 비율로 계산되었다.Estimation of the variation component was performed using the REML option in GCTA, where the genomic heritability ( h2 ) was calculated as the ratio of additive genetic variation (V(G)) to phenotypic variation (V(G)+V(E)). It was calculated.
유의적인 SNP를 보유하는 관련 유전자를 추출하기 위해, GWAS 결과를 기반으로 FDR (False Discovery Rate) <0.05를 필터링하여 SNP를 검출하였다. SnpEff ver.4.3 소프트웨어를 사용하여 필터링된 SNP 영역의 유전자를 추출하였으며, 해당 변이별 미생물 비율에 대한 통계치와 boxplot을 작성하였다.To extract related genes with significant SNPs, SNPs were detected by filtering FDR (False Discovery Rate) <0.05 based on GWAS results. Genes in the filtered SNP region were extracted using SnpEff ver.4.3 software, and statistics and boxplots for the microbial ratio for each variant were created.
속 (phylum) 수준의 미생물 13종에 대해 피르미쿠테스 (Fimicutes) (57%), 박테로이데테스 (20%), 프로테오박테리아 (5%)가 맹장내 미생물의 상위 주요 군에 해당됨을 확인하였으며, 최종적으로 군집 비율 (프로테오박테리아/박테로이데테스)에 대한 분석을 진행하였다. 유의 SNP 관련 유전자는 암시적 유의수준 (FDR < 0.05)으로 필터링하였다. For 13 types of microorganisms at the phylum level, it was confirmed that Firmicutes (57%), Bacteroidetes (20%), and Proteobacteria (5%) were the top major groups of microorganisms in the cecum. And finally, analysis of the population ratio (Proteobacteria/Bacteroidetes) was performed. Significant SNP-related genes were filtered at the implicit significance level (FDR < 0.05).
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 유의 SNP 관련 유전자는 각각 염색체 11, 21, 3, 12, 2, 6, 19에 위치하였다. 검출된 상위 SNP 중 11번 염색체에 위치한 상위 유전자들은 CNOT1, RIPOR1, ENSGALG00000050464이고, 21번 염색체에 위치한 유전자는 MTOR이다. 12번 염색체에 위치한 유전자는 PTPRG, 3번 염색체에 위치한 유전자는 KIF26B, 2번 염색체에 위치한 유전자는 LDLRAD4, 6번 염색체에 위치한 유전자는 GRID1, 19번 염색체에 위치한 유전자는 AUTS2과 UBE2G1이다. As a result, as shown in Table 2, significant SNP-related genes were located on chromosomes 11, 21, 3, 12, 2, 6, and 19, respectively. Among the top SNPs detected, the top genes located on chromosome 11 are CNOT1, RIPOR1, and ENSGALG00000050464, and the gene located on chromosome 21 is MTOR. The gene located on chromosome 12 is PTPRG, the gene located on chromosome 3 is KIF26B, the gene located on chromosome 2 is LDLRAD4, the gene located on chromosome 6 is GRID1, and the genes located on chromosome 19 are AUTS2 and UBE2G1.
국내 토종닭 6계통 미생물체의 연관 SNP 마커에 대한 분산성분과 유전력을 GCTA 소프트웨어를 사용하여 추정하였다. 유의한 SNP 마커 12개만을 사용하였다.The variance component and heritability of the associated SNP markers of the 6 lineages of domestic domestic chicken microorganisms were estimated using GCTA software. Only 12 significant SNP markers were used.
국내 토종닭 맹장내 장내미생물 연관 유전자별 평균치와 표준오차값의 하기 표 4에 나타내었다. The average and standard error values for each gene associated with intestinal microorganisms in the cecum of domestic chickens are shown in Table 4 below.
본 발명에서는 토종닭의 맹장내 미생물군의 속 (phylum) 수준에서, 상위를 차지하는 박테로이데테스, 프로테오박테리아 간의 비율과 숙주 혈액내 유전자형간의 전장유전체연관성 분석을 통한 미생물 군집 연관 숙주내 변이를 발굴하였다. 박테로이데테스는 닭의 맹장에서 세 번째로 많은 미생물로써, 대장균, 살모넬라, 비브리오, 헬리코박터 등 다양한 병원균과 질소고정세균을 포함한다. 인간에서는 대사증후군과 염증성 장질환과 관련되어 있으며, 닭에서는 체중과 연관성이 있음이 알려져 있다. 이에 반하여, 맹장내 두 번째로 많은 프로테오박테리아는 복부의 지방세포에 작용하여 지방분해효소를 활성화하고 체내 지방연소를 돕는다. 따라서 프로테오박테리아/박테로이데테스 비율은 닭의 장 건강 및 체중 등의 예측을 위한 지표로 활용될 수 있다. 이에 연관된 변이를 통해, 가축의 장 건강상태 및 고체중 개체를 선발하기 위한 숙주의 유전자형 지표로 활용될 수 있다.In the present invention, at the phylum level of the cecal microbial community of native chickens, the ratio between the top Bacteroidetes and Proteobacteria and the genome-wide correlation analysis between genotypes in the host blood are used to identify microbial community-related intra-host mutations. It was excavated. Bacteroidetes is the third most abundant microorganism in the chicken caecum and includes various pathogens and nitrogen-fixing bacteria such as E. coli, Salmonella, Vibrio, and Helicobacter. In humans, it is associated with metabolic syndrome and inflammatory bowel disease, and in chickens, it is known to be associated with body weight. In contrast, Proteobacteria, the second most abundant in the cecum, act on the fat cells in the abdomen, activating lipolytic enzymes and helping the body burn fat. Therefore, the Proteobacteria/Bacteroidetes ratio can be used as an indicator for predicting intestinal health and body weight of chickens. Through mutations related to this, it can be used as an indicator of the host's genotype to select intestinal health status of livestock and high-weight individuals.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP markers for predicting the ratio of proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens and their use <130> 2021p-06-014 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGaluGA035131 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or G <400> 1 gcagctctct ccctgatatg ggctgtgtat gacgagctca atgggagagg atacagcrtc 60 ncttcccaag ggggaacaag gaagatggct tcagatctgg caaaccactg cctttctgcc 120 c 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gga_rs15130789 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is a or g <400> 2 accactgcaa aactctgtac cactgtaatt atactgattt agactgtggt tacataaacc 60 ntatatgtat caacatatac tatctttgct accaacagaa ggagaaacaa ttgcaaaata 120 t 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gga_rs16250652 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is a or g <400> 3 atttcaggaa gcctatgtgt gaatatttca ttgattggca atcagggaca 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Claims (7)
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 51번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP;
서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; 및
서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 닭의 맹장내 박테로이데테스 (Bacteriodetes)에 대한 프로테오박테리아 (Proteobacteria)의 비율 예측용 조성물.
A single nucleotide polymorphism (SNP) in which the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1;
A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2;
A SNP where the 51st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3;
A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4;
A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5;
A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6;
SNP where the 61st base is C or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7;
A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8;
A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9;
A SNP where the 61st base is A or G in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 10;
A SNP where the 61st base is G or A in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11; and
A SNP where the 61st base is A or C in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12;
For predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteriodetes in the cecum of chicken, comprising an agent capable of detecting or amplifying any one or more SNPs selected from the group consisting of Composition.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 1,
A composition, characterized in that the agent capable of detecting or amplifying the SNP is a primer or probe.
A kit for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, comprising the composition of claim 1.
A microarray for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chickens, comprising the composition of claim 1.
2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 닭의 맹장내 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율 예측 방법.
1) Amplifying a region containing the SNP of a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12 or a complementary polynucleotide thereof from DNA of a sample isolated from chicken; and
2) determining the base type of the SNP in the region containing the amplified SNP;
A method for predicting the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes in the cecum of chicken, comprising:
서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C인 경우;
서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 및
서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 박테로이데테스에 대한 프로테오박테리아의 비율이 높은 것으로 예측하는 방법.
According to clause 5,
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 is A;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2 is G;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3 is G;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4 is G;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5 is G;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6 is A;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7 is C;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8 is A;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9 is G;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 10 is A;
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11 is G; and
When the 61st base in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12 is A;
A method of predicting that the ratio of Proteobacteria to Bacteroidetes is high if it corresponds to at least one selected from the group consisting of.
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