KR20230135630A - 유전자 전사 프레임워크, 벡터 시스템, 게놈 서열 편집 방법 및 응용 - Google Patents
유전자 전사 프레임워크, 벡터 시스템, 게놈 서열 편집 방법 및 응용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유전자 전사 프레임워크, 벡터 시스템, 게놈 시퀀스 편집 방법 및 응용을 제공한다. 유전자 전사 프레임워크는 진핵생물 역전사 메커니즘에 기초하고, DNA, RNA 또는 RNP 경로에 의해 매개될 수 있고, 및 하나 이상의 표적 사이트 상류 서열, 삽입하고자 하는 서열 및 표적 사이트 하류 서열을 포함하는 전사 생산 서열, 하나 이상의 SINE(원소), 하나 이상의 LINE(원소), 하나 이상의 ORF1p 코딩 서열 및/또는 하나 이상의 ORF2p 코딩 서열을 포함한다. 유전자 편집 방법에 따르면, 가능한 한 이물질이나 물질이 유입되지 않고, DNA 이중 가닥 절단이 발생하지 않는다는 전제하에, 유전자 편집 시스템을 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 핵 또는 세포질로 전달함으로써(RNA 또는 RNP는 ORF1p 및/또는 ORF2p 매개체를 통해 세포질에서 핵으로 전달됨), 표적 단편을 게놈의 지정된 부위에 삽입하거나 게놈의 지정된 단편을 삭제 또는 교체하여 높은 표적화 정확도를 달성한다.
Description
본 발명은 생물 기술분야에 속하는 것으로서, 유전자 편집 기술에 관한 것이다. 특히, 그것은 DNA, RNA 또는 RNP 경로(방법)에 의해 매개되는 유전자 편집 기술과 그 응용을 포함한다.
현재 생물 기술분야에서 유전자 편집 기술은 주요하게 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 및 Targetron 기술이 있다. 그 중 ZFN 기술은 역사상 처음 개발되었다. 그러나 DNA 결합 도메인은 길이가 9bp인 서열만 인식할 수 있기 때문에 실제 적용에서 표적화 정확도가 크게 제한된다. 또한이 기술의 실제 설계는 복잡하다. 알 수 없는 업스트림 및 다운스트림 시퀀스가 있는 시퀀스를 편집할 수 없다. 또한 세포 독성과 표적 이탈률이 높다. ZFN에 비해 TALEN 기법은 설계가 더 간단하고 특이도가 더 높은 17-18bp 염기서열을 인식할 수 있다. 그러나 핵심 기술은 개별 상업 회사에 의해 통제되기 때문에 대부분의 실험실에서 자체적으로 완료 할 수 없기 때문에 보급 및 적용이 어느 정도 제한된다. 동시에 건설 과정은 여전히 비교적 복잡하다. CRISPR/Cas9 기술은 세 가지 기술 중 가장 간단하고 가장 잘 작동한다. 고세균과 세균에서 처음 발견되었으며, 약 20bp의 염기서열을 특이적으로 인식할 수 있어 Cas9 엔도뉴클레아제의 작용으로 특정 부위에 이중 가닥 절단을 일으키고 시스템 자체의 DNA 복구 기능을 통해 복구하여 유전자 편집 작업을 수행할 수 있다.
그러나 세 가지 기술 모두 이른바 off-target 문제를 가지고 있으며, 인식 길이가 가장 긴 CRISPR/Cas9 기술도 예외는 아니다. 연구에 따르면 표적 부위에 대한 CRISPR/Cas9 인식의 특이성은 주로 gRNA PAM 부위 근처의 10-12개 염기 쌍에 따라 달라지며, 이로 인해 비특이적 절단이 생성되는 경향이 있다. 또한, 이 세 가지 기술에 의해 DNA 이중 가닥 절단이 생성된 후, DNA 이중 가닥 절단은 상동 재조합 대신 비상동 말단 결합에 의해 복구될 가능성이 높으며, 무작위 서열이 생성되어 불확실성이 특히 인체 및 임상 적용에서 실제 적용을 크게 손상시킨다. 동시에 이 세 가지 기술은 수용 시스템(예: 인체)의 일부가 아닌 유전 물질과 단백질을 가져오며, 이는 의도하지 않은 영향을 미칠 수도 있다.
한편, 업데이트된 Targetron 기술은 그룹 II 인트론을 사용하여 게놈의 특정 부위에 서열을 삽입하여 해당 유전자를 돌연변이시킨다. 그러나 이 기술은 필연적으로 게놈 이중 가닥 절단을 유발하고 외인성 그룹 II 인트론을 게놈에 도입하여 "흉터"를 생성한다. 더욱이, 이 기술은 원핵생물에서 유래하기 때문에 역전사를 위해 자체적으로 생성된 RNA는 막횡단 수송 기능이 없어 기능 수행을 위한 RNA의 적용을 제한한다. 또한 가장 중요한 것은 이 기술이 박테리아 유전자 편집 분야에서는 잘 수행되었지만 고등 유기체에서는 제대로 수행되지 않았다는 것이다. 네 가지 유전자 편집 기술 모두 수용 시스템에 속하지 않는 단백질과 핵산을 도입해야 하며, 이는 효과의 불확실성을 증가시키고 임상 적용을 크게 방해한다.
상기 문제를 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 유전자 전사 프레임워크를 제공하는 것으로서, 해당 유전자 전사 프레임워크는 전사 후 DNA, RNA 및/또는 RNP 경로(방법)을 거쳐 매개되어 세포핵 또는 세포질에 전달되어, 표적 토막을 게놈 중의 특정 사이트로 삽입하거나 또는 게놈 중의 특정 토막을 삭제 또는 교체하며, 아울러 비교적 높은 표적 정확성을 갖는다.
본 발명의 다른 목적은 DNA, RNA 및/또는 RNP 경로(방법)을 통하여 매개되는 벡터 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 유전자 편집 방법을 제공하는 것으로서, 해당 유전자 편집 방법은 최대한 외부 시스템 및 물질을 도입하지 않고 DNA 이중 가닥 파손을 발생시키지 않는 전제 하에서, DNA, RNP 또는 RNA(체외에서 제조하여 생성할 수 있음) 및 관련 단백질을 매개로 하여, DNA, RNA 또는 RNP 경로(방법)을 거쳐 세포핵 또는 세포질로 전달되어, 표적 토막을 게놈 중의 지정된 사이트로 삽입하거나 또는 게놈 중의 지정된 토막을 삭제 또는 교체하며, 아울러 비교적 높은 표적 정확성을 갖는다.
상기 목적을 구현하기 위하여, 본 발명은 유전자 전사 프레임워크를 제공하는 바, 해당 유전자 전사 프레임워크는 5'→3' 방향에 따라 표적 사이트 상류 서열, 삽입하고자 하는 서열, 표적 사이트 하류 서열을 포함하며;
해당 유전자 전사 프레임워크는 RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III를 통하여 전사할 수 있는 한 토막의 DNA 서열이며, 해당 유전자 전사 프레임워크의 전사 생성물 또는 그 전사 생성물의 전환 생성물 중의 표적 사이트 상류 서열 또는 그 상보 서열은 세포 게놈 중 표적 사이트의 상류 서열 또는 그 상보 서열과 교잡할 수 있고, 표적 사이트 하류 서열 또는 그 상보 서열은 세포 게놈 중 상응한 표적 사이트의 하류 서열 또는 그 상보 서열과 교잡할 수 있으며, 해당 표적 사이트 상류 서열과 표적 사이트 하류 서열은 게놈 중 상응한 표적 유전자 서열 중에서 직접적으로 연결되고, 게놈 상의 표적 유전자 서열 중의 표적 사이트 상류 서열과 표적 사이트 하류 서열 사이의 사이트는 바로 삽입하고자 하는 서열의 표적 사이트인 것을 특징으로 하는 유전자 전사 프레임워크.
상기 유전자 전사 프레임워크는 삽입하고자 하는 서열을 게놈 표적 사이트로 삽입하기 위한 것이다.
바람직하게는, 상기 세포는 진핵 세포이다.
본 발명은 또한 벡터 시스템을 제공하는 바, 해당 벡터 시스템은 한 가지 또는 여러 가지 벡터를 포함하고, 해당 한 가지 또는 여러 가지 벡터는,
하나 또는 복수의 1) 제1항의 상기 유전자 전사 프레임워크; 및/또는
하나 또는 복수의 2) 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 및/또는
하나 또는 복수의 3) 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열을 포함하며;
해당 구성 요소 1), 2) 및/또는 3)은 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며;
해당 구성 요소 1)이 복수일 때, 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며;
해당 구성 요소 2)가 복수일 때, 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며;
해당 구성 요소 3)가 복수일 때, 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며;
해당 벡터 상에는 하나 또는 복수의 프로모터를 구비하며, 해당 프로모터는 해당 RNA 중합효소 I 프로모터, RNA 중합효소 II 프로모터 또는 RNA 중합효소 III 프로모터이고, 해당 구성 요소 1), 2) 및/또는 3)의 상류에 위치하며;
해당 벡터 시스템은 DNA, RNA 및/또는 RNP 방법 통하여 매개된다.
더욱 나아가, 상기 벡터는 진핵 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 인공 염색체, 파지 벡터, 코스미드 벡터이다.
더욱 나아가, 상기 벡터는 발현 벡터, 클론 벡터, 시퀀싱 벡터, 전환 벡터, 셔틀 벡터 또는 다기능 벡터이다.
더욱 나아가, 1)과 2)가 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류에 위치하고, 해당 유전자 전사 프레임워크는 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 하나의 프로모터를 공용하며; 간접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
더욱 나아가, 1)과 3)이 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 해당 유전자 전사 프레임워크의 상류 및/또는 하류에 위치하고, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하며; 간접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
더욱 나아가, 1), 2)와 3)이 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류 및/또는 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 하류에 위치하며; 해당 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소가 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류에 위치할 때, 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 유전자 전사 프레임워크의 상류에 위치하며, 및/또는 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소의 하류에 위치하며; 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소가 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 하류에 위치할 때, 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류에 위치하며; 그리고 해당 유전자 전사 프레임워크, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열 사이는 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하며; 간접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
더욱 나아가, 2)와 3)이 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소의 상류 및/또는 하류에 위치하고, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하고, 간접적으로 연결될 때, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
전사 효율을 향상시키기 위하여, 벡터 시스템 중의 유전자 전사 프레임워크, 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 수량을 증가한다. 상이한 종에도 천연적으로 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소가 존재하지만, 천연적인 자체 구비하는 프로모터의 활성이 약하기 때문에, 추가 프로모터를 사용한 전사 및/또는 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 추가 전사를 적용하여 발현 및 유전자 편집 효율을 증가시킨다.
본 발명은 또한 게놈 서열 편집 방법을 제공하는 바,
1) 게놈 중에서 편집하고자 하는 표적 유전자의 삽입하고자 하는 사이트(표적 사이트)를 선택하고, 삽입하고자 하는 사이트 양쪽의 표적 유전자의 삽입하고자 하는 사이트의 상류 서열(표적 사이트 상류 서열)과 하류 서열(표적 사이트 하류 서열)을 결정하는 단계;
2) 상기 벡터 시스템을 제조하는 단계;
3) 벡터 시스템을 세포, 조직, 장기, 배아 또는 생물체에 전환 또는 전달 감염진행하여 유전자 편집을 구현하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 벡터, 시스템의 게놈 임의 영역에서 DNA 서열의 삽입, 삭제, 교체를 진행하는 과정에서의 응용을 제공한다.
바람직하게는, 상기 DNA 서열은 하나 또는 복수의 CNV 서열, CNV 말단 서열, 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소, 부분적 긴 산재 요소, ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열인 것을이다.
DNA 서열이 CNV 서열, CNV 말단 서열일 때, CNV 말단(즉 CNV 말단 중의 유전자 부분과 부분적 SINE 사이)에 대하여 편집을 진행하여, 게놈 또는 국소 게놈과 상동성이 아닌 염기서열을 삽입하여 CNV 변경 및 발현 변경을 차단한다; 또는 CNV 말단의 유전자 부분 서열에 대하여 삭제를 진행하여 상응한 세포 발현을 개변시킨다.
본 발명은 또한 상기 벡터 시스템의 예방 및/또는 치료암, 유전자 관련 유전병, 신경퇴행성 질환의 약물에서의 응용을 제공한다.
바람직하게는, 상기 암은 신경교종, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 위암, 대장암, 십이지장암, 백혈병, 전립선암, 자궁내막암, 갑상선암, 림프종, 췌장암, 간암, 흑색종, 피부암, 뇌하수체 종양, 생식세포종양, 수막종, 수막암, 교모세포종, 모든 종류의 성상세포종, 모든 희소돌기아교세포종, 성상세포종, 모든 종류의 뇌실막종, 맥락막 신경총 유두종, 맥락막 신경총암, 척색종, 맥락막 세포 종양, 모든 종류의 신경절 세포 종양, 후각 신경모세포종, 교감신경계 신경모세포종, 송과체 세포 종양, 송과체 모세포종, 수모세포종, 삼차 신경초종, 안면 청신경종, 경정맥 사구종, 혈관종, 혈관 망상술종, 두개인두종 및/또는 과립층 세포 종양.
바람직하게는, 상기 유전자 관련 유전병은 헌팅턴병, 취약 X 증후군, 페닐케톤뇨증, 근육의 가성비대, 미토콘드리아 뇌근병증, 척수성 근위축증, 파킨슨병 중첩 증후군, 백색증, 적록 색맹, 연골 무형성증, 알캅톤뇨증, 선천성 난청, 지중해빈혈, 겸상 적혈구 빈혈, 혈우병, 유전적 변화와 관련된 간질, 근간대증, 근위축증, 근간대성발작, 근긴장이상, 뇌졸중 및 정신분열증, 비타민 D 저항성 구루병, 가족성 선종성 용종증 및/또는 유전성 신염.
바람직하게는, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 척수소뇌성 운동실조증, 다계통 위축, 원발성 측삭 경화증, 픽병, 전두측두엽 치매, 루이소체 치매 및/또는 진행 핵상 마비.
본 발명은 상기 암 및 이의 전이성 암의 발생을 예방하고, 이들의 증식을 억제하고, 상승 및 진행을 방지하거나, 그 성질을 역전시켜 치료할 수 있고; 인슐린, 레보도파, 다양한 종양 화학 요법 약물 및 표적 약물에 대한 약물 내성을 예방, 지연 또는 개선하고 세포, 조직, 기관, 배아 또는 유기체의 유전자 변경 및 상태 변화, 조직 및 장기 재생 및 생물학적 재생을 지연 또는 중지한다.
본 발명의 관련 기술을 적용함으로써, 각 유전자의 유전자 복제수 변이(CNV) 및 이의 말단 부분(CNV 말단)을 편집하여 말단 위치를 변경하거나 말단을 안정화시킬 수 있다. 각 유전자 및 그 말단 부분(CNV 말단)의 카피수 변이가 유전자 발현을 결정하므로, 말단 위치의 변화 또는 말단의 안정화는 세포, 조직, 배아, 기관 및 유기체"의 각 상태를 안정화 또는 변화시킬 수 있고, 그것은 "세포, 조직, 기관, 배아 및 유기체"의 유전자와 상태를 수정하고 변경하기 위해 기술 분야에서 사용될 수 있다. 기능을 향상시키기 위해 인간과 같은 유기체의 게놈을 변형하고, 헌팅턴병 및 취약 X 증후군과 같은 "유전자와 관련된 다양한 유전 질환"을 치료하기 위해 인간과 같은 유기체의 게놈을 수정하고, 세포, 조직, 기관, 배아 및 유기체의 유전자 및 상태 변화를 지연 또는 중지한다(예: 노화), 그것은 세포, 조직, 기관, 배아 또는 유기체의 유전자와 상태를 변화시킬 수 있다. 배아, 조직 또는 장기 재건및 생물학적 재생, 체세포를 생식 세포로 전환시키는 전사 인자를 도입하여 번식을 돕고, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 다계통 위축, 원발성 측삭 경화증, 척수소뇌 운동실조증, 픽병, 전두측두엽 치매, 루이스 소체 치매 및 진행성 핵상 마비와 같은 신경퇴행성 질환을 예방하거나 지연시켜 종양 세포의 대사 활성 및 증식 속도 및 생산을 억제하고 진행을 지연시키고 악성 정도를 개선할 수 있다. 뿐만 아니라 당뇨병과 같은 유전 및 CNV 변화와 관련된 다른 모든 질병의 연구 및 치료 및 기타 생리학적, 병리학적 및 병태생리학적 연구.
본 발명에서 유전자 전사 프레임워크에 서열을 삽입하는 것은 외원 서열이거나 내원 서열일 수 있으며, 일회용 삽입 서열의 길이는 1bp-2000bp이다. 여러 번 삽입할 때 임의의 길이의 DNA 시퀀스를 삽입할 수 있다. 표적 사이트 상류 서열 길이는 10bp-2000bp, 표적 사이트 하류 서열 길이는 10bp-2000bp이다.
본 발명의 특징으로는, 게놈의 선택된 사이트에 삽입하여야 하는 삽입하고자 하는 서열을 벡터 상에서 서열 양측에 삽입된 표적 사이트의 상하류 서열에 의하여 게놈 상의 삽입하고자 하는 사이트에 포지셔닝한다, 또한 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및 표현된 단백질의 도움말으로삽입하고자 하는 서열를 게놈의 선택한 위치 점에 삽입한다. 또한 세포에 있거나 운반체를 통해 표현되는 ORF2p는 핵산 운반체의 3'에서 게놈에서 단일 체인 절단에 사용되는 절단 위치로 부드럽게 미끄러질 수 있다. 담체상의 표적 사이트 상류 서열이나 그 상호보완서열이 세포게놈중의 상응한 표적위치의 표적 사이트 상류 서열이나 그 상호보완서열과 완전히 일치한다는 조건하에서만, 따라서 표적 정확성을 크게 향상시키고 예기치 않은 절단의 발생을 피할 수 있으며 표적 정확성은 이론적으로 기존의 유전자 편집 기술보다 높다.
또한, 필요한 RNA와 ORF1p 및 ORF2p와 같은 해당 내인성 단백질을 시험관 내에서 생산할 수 있으며, 게놈의 표적 서열 및 유전자는 RNA 또는 RNP 경로에 의해 편집될 수 있으며, 불필요하게 핵으로 직접 형질주입되고 DNA 단편을 도입하지 않는다. RNA 또는 RNP 매개 경로는 수용 시스템에 미치는 영향을 최소화하고 표적화 정확도를 향상시키면서 비특이적 효과를 감소시킬 수 있다. ORF1p 및 ORF2p의 핵 국소화 기능과 핵산에 대한 ORF1p의 보호 효과 덕분에 세포로 형질주입된 RNA 및 단백질을 핵으로 유도할 수 있으며, 이는 벡터가 핵으로 운반되는 어려움으로 인해 작동하기 어려운 세포의 유전자 편집에 도움이 된다.
본 발명은 더 나은 표적화를 가지며, 이중 가닥 절단을 생성하지 않는다는 전제 하에 보다 정확한 표적 서열 식별 및 절단을 수행할 수 있고, 상동 재조합을 통해 원하는 서열을 방향성으로 삽입할 수 있으며, 상응하는 단편을 삭제 및 대체할 수 있다. 그러나 CRISPR과 같은 기존 유전자 편집 기술은 이중 가닥 절단과 예측할 수 없는 무작위 돌연변이를 생성하며, 이러한 기술은 매우 비효율적인 상동 재조합을 통해 표적 서열 도입 가능성이 낮다. 본 발명은 DNA 이중 가닥 단절의 위험 및 예상치 못한 무작위 서열의 도입에 대한 두려움 없이 이중 가닥 단절을 생성하지 않는다.
본 발명은 이전 삽입 후 생성된 새로운 부위에 따라 추가 삽입을 위한 벡터를 지속적으로 설계함으로써 점진적인 방식으로 긴 염기서열을 게놈 내로 도입할 수 있으며, 이 역시 현재 알려진 유전자 편집 기술로는 달성하기 어렵다. 유사하게, 게놈 상의 표적화되고 정확한 서열 삭제 및 서열 치환은 종래 기술에 의해 달성되기 어렵지만, 또한 본 발명에 의해 달성될 수 있다. 더욱이, 세포 또는 유기체의 유전자 발현 및/또는 상태를 변경 또는 안정화하기 위한 CNV 또는 그 말단을 편집 또는 안정화하는 것과 같은 작업은 기존의 유전자 편집 기술로는 실현할 수 없으나, 본 발명에 의해 실현될 수 있다.
본 발명의 유익한 효과로는, 본 발명은 진핵 생물 레트로트랜스포존 매커니즘에 기반하는 DNA, RNA 또는 RNP 경로(방법)을 거쳐 매개되는 유전자 편집 방법을 제공한다. 이 방법에 따르면 진핵생물의 내적메커니즘을 통해 될수록 외원시스템이나 물질을 도입하지 않고 이중사슬이 끊어지지 않는 전제하에, DNA, RNP 또는 RNA (체외에서 제조 및 생성 가능) 및 관련 단백질을 사용하여, 또한 표적 조각 (삽입하고자 하는 서열) 은 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 세포 핵 또는 세포 질로 이동한다. 또한 표적 조각 (삽입하고자 하는 서열) 를 게놈의 선택한 위치 점에 삽입하거나 게놈에서 선택한 시퀀스를 삭제하거나 대체하며 높은 표적 정확성을 실현한다. 기존 유전자 편집 기술에 비해 원핵생물에서 유래한 단백질과 같은 외부 시스템이 도입되지 않고 이중 사슬이 끊어지지 않았기 때문에 본 발명은 임상실험에 더욱 쉽게 응용될 수 있다.
도 1은 진핵 생물 자체의 모든 레트로트랜스포존 매커니즘에 기반하여 유전자 편집을 진행하는 기본 원리도이다.
도 2은 DNA가 매개하는 게놈 삽입 또는 누락에 대한 도식이다.
도 3은 RNA와 RNP가 매개하는 게놈 삽입과 결핍의 도표이다.
도 4은 CNV 끝에 비동원 시퀀스를 삽입하여 CNV 끝의 변화를 차단하는 도식이다.
도 5은 본 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다.
도 6은 본 발명에 제공된 프로모터 연결하는 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다.
도 7은 본 발명에 제공된 프로모터 연결하는 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소를 연결하는 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다.
도 8은 본 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크 업스트림 연결 부팅 서브와 다운스트림 연결 본 발명을 위 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 구조 설명도를 제공한다.
도 9은 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 여기서 상술한 유전자 전사 프레임워크는 상류에서 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열과 연결되고, 부팅 서브는 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 상류에 연결된다.
도 10은 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 그 중 프로모터 연결은 유전자 전사 프레임워크 상류, 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 유전자 역전 프레임 하류에 연결된다. 그런 다음 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 유사한 다운스트림에 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열을 연결한다.
도 11은 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 그 중에서 상술한 유전자 전사 프레임워크 하류의 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 연결된다. 상기 유전자 전사 프레임워크는 업스트림의 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 연결되며, 상기 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 업스트림은 프로모터와 연결된다.
도 12은 본 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이며, 이 유전자 전사 프레임워크은 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 프로모터 공유하지 않는다.
도 13은 이 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이며, 이 유전자 전사 프레임워크는 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 프로모터를 공유하지 않는다.
도 14는 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 이 유전자 전사 프레임워크는 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 프로모터를 공유하지 않는다. 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열가 프로모터를 공유한다.
도 15는 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 이 유전자 전사 프레임워크는 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 프로모터를 공유하지 않는다. 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열가 프로모터를 공유한다.
도 16은 실시 사례 1에 구축된 플라스 미드 pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1의플라스 미드도표로, 유전자 전사 프레임워크인 VEGFA1을 실시 사례 1의 캐리어에 삽입한다.
도 17은 실시 사례 6에 구축된 플라스 미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1의플라스 미드도표로, 유전자 전사 프레임워크인 IT15-1을 실시 사례 6의 담체에 삽입한다.
도 2은 DNA가 매개하는 게놈 삽입 또는 누락에 대한 도식이다.
도 3은 RNA와 RNP가 매개하는 게놈 삽입과 결핍의 도표이다.
도 4은 CNV 끝에 비동원 시퀀스를 삽입하여 CNV 끝의 변화를 차단하는 도식이다.
도 5은 본 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다.
도 6은 본 발명에 제공된 프로모터 연결하는 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다.
도 7은 본 발명에 제공된 프로모터 연결하는 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소를 연결하는 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다.
도 8은 본 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크 업스트림 연결 부팅 서브와 다운스트림 연결 본 발명을 위 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 구조 설명도를 제공한다.
도 9은 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 여기서 상술한 유전자 전사 프레임워크는 상류에서 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열과 연결되고, 부팅 서브는 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 상류에 연결된다.
도 10은 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 그 중 프로모터 연결은 유전자 전사 프레임워크 상류, 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 유전자 역전 프레임 하류에 연결된다. 그런 다음 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 유사한 다운스트림에 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열을 연결한다.
도 11은 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 그 중에서 상술한 유전자 전사 프레임워크 하류의 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 연결된다. 상기 유전자 전사 프레임워크는 업스트림의 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 연결되며, 상기 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 업스트림은 프로모터와 연결된다.
도 12은 본 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이며, 이 유전자 전사 프레임워크은 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 프로모터 공유하지 않는다.
도 13은 이 발명이 제공한 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이며, 이 유전자 전사 프레임워크는 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 프로모터를 공유하지 않는다.
도 14는 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 이 유전자 전사 프레임워크는 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 프로모터를 공유하지 않는다. 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열가 프로모터를 공유한다.
도 15는 본 발명에 제공된 유전자 전사 프레임워크의 구조 설명도이다. 이 유전자 전사 프레임워크는 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열와 프로모터를 공유하지 않는다. 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열가 프로모터를 공유한다.
도 16은 실시 사례 1에 구축된 플라스 미드 pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1의플라스 미드도표로, 유전자 전사 프레임워크인 VEGFA1을 실시 사례 1의 캐리어에 삽입한다.
도 17은 실시 사례 6에 구축된 플라스 미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1의플라스 미드도표로, 유전자 전사 프레임워크인 IT15-1을 실시 사례 6의 담체에 삽입한다.
본 발명은 트랜스포존을 통하여 게놈 상의 유전자 복사 수 및 중복 서열 등에 대하여 수정을 진행하는 진핵 생물에 보편적으로 존재하는 게놈 재구성 매커니즘에 기반한다. 이러한 메카니즘은 헌팅턴병 및 취약 X 증후군과 같은 일부 중추신경계 퇴행성 질환에서 병원성 삼중뉴클레오티드 반복의 삭제 또는 추가를 초래할 수 있고, 서열의 높은 상동성과 같은 상동성 재조합과 일치하고, 메틸화에 의해 억제될 수 있고, 발현 수준과 관련된다. 도 1에 도시된 바와 같이. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명은 개방 판독 프레임 1 단백질（open reading frame 1 protein，ORF1p）, 개방 판독 프레임 2 단백질（open reading frame 2 protein，ORF2p） 및 다른 종류의 개방 판독 프레임 단백질（open reading frame protein，ORFp）과 짧은 산재 핵 요소（짧은 산재 요소, short interspersed element，short interspersed nuclear element, SINE）, 긴 산재 핵 요소（긴 산재 요소, long interspersed element, long interspersed nuclear element, LINE） 및 이들의 관련 단백질에 관한 것이다. 짧은 산재 원소 (SINE)는 주로 영장류의 Alu 원소 및 SVA 원소, MIR 및 MIR3와 같은 포유류 전체 산재 반복 원소 (mammalian-wide interspersed repeat elements, MIRs), 모노 트레노의 Mon-1, 설치류의 B1 및 B2 원소, 제브라 피쉬의 HE1 가족, 파충류의 Anolis SINE2 및 Sauria SINE, 오징어와 같은 무척추 동물의 IdioSINE1, IdioSINE2 등을 포함한다. 쌀과 같은 식물의 세피아사인, 세피오스-사인1, 세피오스-사인2A, 세피오스-사인2B 및 외고프사인, p-SINE1. 긴 산재 원소는 주로 다양한 LINE-1 (L1), 다양한 LINE-2 (L2) 및 다양한 LINE-3 (L3), Ta 원소 및 R2, RandI, L1, RTE, I 및 다양한 생물 종의 다른 LINE 종을 포함한다. 이러한 구조는 다양한 식물과 동물에서 널리 발견되며 게놈 전체에 흩어져 있으며 각각 보완 기능에 해당하는 고유한 SINE 및 LINE이 있다. SINE의 주요 특징은 내부 RNA 중합 효소 III 프로모터를 포함하고 A- 또는 T- 풍부한 꼬리 또는 짧은 단순 반복으로 끝나는 게놈에 분포 된 비교적 짧은 트랜스포존이며, LINE의 도움으로 역전사되며, 전사체의 오른쪽 절반은 역전 될 수있는 기능적 구조를 포함한다. 한편, LINE은 역전사효소 코딩 서열을 포함하는 게놈에 널리 분포된 트랜스포존이 특징이다. SINE과 각각의 종에서 해당 LINE은 모두 유사한 메커니즘을 통해 게놈을 지속적으로 재구성한다. 이 메커니즘의 기본 원리는 pre-mRNA 처리를 통해 신체에서 생성된 올가미 구조를 전단에 의한 SINE의 잔류 역전사 구조의 오른쪽 절반과 연결하는 것이다(중간 부위에서 완전한 SINE 전사체 절단에 의해 생성 된 역전사 구조를 갖는 SINE의 오른쪽 절반을 부분 SINE 서열이라고 하며, 전단 부위는 SINE 종에 따라 다르다. SINE의 자연 전단 부위는 일반적으로 전장의 중간에 위치하고, 일반적인 총 길이가 약 100-400 nt인 SINE의 경우, 자연 전단 부위는 일반적으로 100-250 nt에 위치하며, 예를 들어 총 길이가 약 300 bp인 Alu 요소의 경우, 전단 부위는 118 번째 nt에 위치하고; 총 길이가 약 260 nt인 다양한 유형의 MIR의 경우, 전단 부위는 100-150 nt 범위에서 관찰될 수 있다. 사실, 사이트의 위치에 관계없이 전단되는 한 나머지 오른쪽 부분에는 완전한 역전사 기능 구조가 포함된다(2 차 구조는 일반적으로 Ω 모양의 특수 구조를 형성한다. 그것의 1 차 구조는 중간 스페이서 서열을 포함하지 않는 게놈상의 상보적인 서열을 결합하고 두 서열을 직접 연결할 수있는 두 세그먼트 사이의 중간 스페이서 서열에 의해 분리 된 두 세그먼트를 포함하는 서열을 특징으로한다. LINE에 의해 암호화된 ORF2p는 전사체의 두 서열 중 3'에 있는 서열에 결합하고 역전사를 시작하여 두 서열 사이의 해당 게놈 유전자좌에서 게놈 단일 가닥), 즉 부분 SINE 서열을 절단할 수 있다. Alu 원소에 의해 생성 된 부분 SINE과 같은 특정 사인의 경우, 부분 Alu, 특히 중간 아데 닐 레이트 반복 또는 2-3 염기 상류와 함께 Alu 오른쪽 단량체 및 오른쪽 단량체 뒤에 3 '폴리 A 반복으로 기록된다. 또한, 역전사 기능적 구조를 포함하고 역전사를 개시할 수 있지만 종래의 SINE과 서열적으로 상이한 서열을 유사한 짧은 산란 요소(SINE-유사한, SINE-like, 클래스SINE)라고 한다), 해당 유형의 LINE(예 : Alu 요소의 기능에 해당하는 LINE-1 및 다양한 MIR 요소에 해당하는 LINE-2 등)에 의해 발현되는 단백질 (즉, ORF1p 및 ORF2p)을 통해 RNA는 이중 가닥 DNA로 변환되고 게놈에서 상보적인 서열에 결합된다(여기서 전사 형성 RNA는 역전사되어 단일 가닥 DNA를 생성하고, 게놈 서열을 프라이머로 한 단일 가닥 DNA에 의해 생성 된 이중 가닥 DNA는 전사체의 형질 산물이다). 특정 Ω 구조를 형성함으로써, 외인성 서열은 상동 재조합 메커니즘에 의해 게놈에 삽입된다. 또한, LINE은 다운스트림 서열(즉, 3' transduction)을 전사하고 게놈의 상보적 서열과 결합하여 Ω 구조를 형성함으로써 RNA를 이중 가닥 DNA 및 게놈 삽입으로 유사하게 형질전환할 수 있다. Alu 요소와 그 기능을 보조하는 해당 LINE-1을 예로 들면, 유전자 발현 후 생성된 pre-mRNA를 절단하여 pre-mRNA의 모든 영역에서 발생할 수 있는 서열적으로 겹치는 올가미를 생성할 수 있다. 차이점은 이러한 올가미를 생성하는 절단의 강도에 있다. 엑손의 상류 및 하류 올가미의 절단 강도(서열 차이에 기초)가 주변의 다른 올가미의 절단 강도보다 높기 때문에, 엑손은 pre-mRNA 과정에서 쉽고 완전하게 차단될 수 있고, 다른 올가미의 생성이 억제된다. 동시에 LINE-1에 의해 생성된 ORF1p는 이에 결합된 핵산을 보호할 수 있으며, 이는 LINE(LINE-1)에 의해 생성된 ORF2p와 함께 핵산을 핵에 위치시켜 핵으로 운반할 수 있다. 또한, ORF2p는 Alu 요소 전사체의 특수 Ω 2차 구조에 결합하고 후속 게놈 단일 가닥 절단, 역전사 및 게놈으로의 통합을 매개할 수 있다. Alu 요소의 전사체는 특정 부위 (Multiple dispersed loci produce small cytoplasmic element RNA, 즉, 일반적으로 Alu 전사체의 중간 polyA 서열의 앞에 위치하는 scAlu 절단 부위 또는 아래의 천연 절단 부위, 및 실제 조건에 따라 달라질 수 있음)에서 절단될 수 있고, 작은 세포질 Alu (scAlu, small cytoplasmic element) RNA 및 우측 단량체를 함유하는 나머지 부분(ORF2p에 결합할 수 있는 역전사 기능적 구조체 포함)이 생성된다. 우측 단량체를 포함하는 나머지 부분은 부분 Alu RNA로 지칭되고, 이로부터 부분 Alu RNA가 전사되는 DNA 서열은 부분 Alu 서열(partial Alu)로 지칭된다. 그 후, 생성된 올가미 구조는 그의 3' 말단으로부터 "역전사 작용 구조를 함유하는 절단된 Alu 서열 전사체의 나머지"로 연결될 수 있고, 및 ORF2p는 A(아데닐레이트)가 풍부한 서열을 통해 모집될 수 있고 부분 Alu RNA 2차 구조에 의해 형성된 Ω 구조의 3' 다리와 결합될 수 있으며, Ω의 서열과 일치하는 게놈의 서열을 식별할 수 있다(주로 부분 Alu RNA의 UU/AAAA, U와 A 사이의 불연속성, 즉, 갭이 있는 위치). Ω 갭에 반대되는 게놈 부위의 단일 가닥 DNA가 절단되고 Ω에 상보적인 게놈 서열이 역전사를 위한 프라이머로 용융된다. 이러한 과정을 표적 프라이밍 역전사(TPRT, target-primed reverse transcription)라고 한다. 그런 다음 ORF2p는 역전사를 통해 생성된 단일 가닥 DNA의 3' 말단으로 이동하고, 생성된 단일 가닥 DNA 서열은 게놈의 상보적 서열과 결합하여 게놈의 해당 삽입할 부위(표적 부위)에서 Ω 2차 구조를 형성할 수 있다(삽입될 서열은 게놈 상의 대응하는 표적 사이트(표적 부위)에 존재하지 않는 반면, 단일가닥 DNA상의 삽입될 염기서열의 양면에 서열은 게놈 상의 표적 사이트(표적 부위)의 양면에 존재하기 때문에). ORF2p는 상보적인 서열을 따라 3' 내지 5' 방향으로 Ω 구조로 미끄러질 수 있고, Ω 구조의 아래쪽 2개 다리에 상보적인 6개의 뉴클레오티드(주로 3'의 4개의 뉴클레오티드와 5'의 2개의 뉴클레오티드)로 게놈 서열을 확인하고 위에서 언급한 유사한 과정을 통해 이중 가닥 DNA를 생성한다. 완벽하게 일치하는 서열만이 ORF2p를 절단 부위(즉, 생성된 DNA 상의 Ω 구조의 갭에 해당하는 게놈 부위)로 슬라이드할 수 있으며, 이는 표적화 정확도를 보장한다. 최종적으로 제조된 이중가닥 DNA는 해당 표적 사이트(표적 부위)의 양면과 다시 Ω 형태(Ω 구조)로 결합된다. 6개의 뉴클레오티드(주로 ORF2p에 의해 인식되는 3'의 4개 뉴클레오티드와 5'의 2개 뉴클레오티드 사이)가 갭에서 불연속적일 때(이중 가닥 DNA의 Ω 구조의 갭에서), ORF2p의 엔도뉴클레아제 작용을 통해 갭에 해당하는 유전자(게놈)와 생성된 이중 가닥 DNA의 다른 가닥에 두 개의 단일 가닥 DNA 절개를 생성할 수 있다. 그리고 Ω 구조의 중간 원형 부분은 상동 재조합 메커니즘에 의해 게놈에 삽입된다. 삽입된 서열(삽입될 서열)을 변경함으로써, 상동성 재조합을 통해 게놈에 대한 삭제 또는 치환과 같은 다른 효과를 얻을 수 있다. 상기 과정에서 LINE에 의해 인코딩된 ORF1p의 어닐링 및 해체 기능은 기술된 게놈 재구성 과정에서 핵산에 의해 생성된 2차 구조와 게놈에 대한 결합을 안정화하고, 결합 및 작용 후 게놈에서 핵산의 분리를 촉진하는 보조 역할을 할 수 있다. 또한, ORF1p는 높은 RNA 친화력과 핵 국소화 기능을 가지고 있다. ORF2p는 게놈 이중 가닥의 한 가닥만 절단할 수 있고 이중 가닥 절단을 생성할 수 없기 때문에 안전성이 높다. 다른 SINE 및 LINE 조합에도 유사한 메커니즘이 적용된다. 배아 발달 및 종양 형성과 같은 생리학적 및 병리학적 과정 동안 국소 유전자 복제수 변이의 변화 및 인간 게놈에 삭제된 HIV-1 게놈의 삽입은 SINE 서열에 대한 선호도를 갖는다는 것은 본질적으로 이러한 메커니즘의 징후이다. 전사된 mRNA 서열은 ORF1p 및 ORF2p의 도움으로 게놈에 통합될 수 있다고 보고되었다. 그러나 전사 주형은 순전히 외인성 비상동 서열이었기 때문에 게놈의 특정 부위를 표적화할 수 없었고 역전사 기능 구조를 가진 단편이 부착되지 않아 비효율적이고 제어하기 어려운 무작위 과정이 발생했다. 본 발명에 따르면, 전사 서열을 재설계하고, 다양한 능동적 또는 수동적 수단에 의해 다양한 유형의 SINE 또는 부분 SINE과 같은 역전사 기능 구조를 포함하는 서열과 연결됨으로써, 보다 정확하고 효율적인 유전자 편집 효과가 달성된다.
생리학적 조건 하에서, 유전자 복제수 변이 (CNV)는 온전한 유전자 원본의 사본과 유사하다. 상술한 기작을 통해, 본래의 온전한 유전자에 따라 카피로서 연속적으로 확장될 수 있는 CNV는 세포, 조직 및 유기체의 단백질 발현 및 다양한 상태를 끊임없이 변화시킬 수 있다. CNV 말단은 상류의 유전(유전자) 부분과 하류의 부분 SINE 서열(시퀀스) 부분으로 구성되며, 올가미(lariat)에 포함된 짧은 서열 단편은 CNV를 확장하기 위해 부분 SINE 서열(일부SINE서열사)과 연결되는 올가미(lariat) 의 서열을 통해 CNV 말단의 두 부분 사이에 연속적으로 삽입된다. 초기 배아 발달에서 LINE의 전사는 유의하게 증가하는 반면, 게놈 SINE(예: Alu 원소 서열)은 상당한 탈메틸화를 보여준다. LINE-매개된 3' 형질도입(대응(연관된) 유전자 프로모터의 상류에 있는 SINE의 오른쪽 단량체 삭제 및 대응하는(연관된) 유전자의 프로모터의 하류에 있는 완전한 SINE 구조에 기초하여)이 관련 유전자 유전자 복제수 변이(CNV)의 확장을 개시하는 동안, 서로 탈메틸화된 SINE 서열의 상동성 재조합은 이전에 확장된 CNV의 대부분을 삭제한다(초기화).
그 후, 완전히 초기화된 배아 세포는 과메틸화 상태를 회복하고, CNV 말단의 부분 SINE 서열은 CNV 말단의 점진적인 확장을 매개하여 각 세포의 발현 상태 및 상태를 변화시킨다. 차례로, 각 세포의 유전자 발현 상태는 올가미(lariat)를 통한 CNV의 변화에 영향을 미치므로 게놈의 변화와 점진적인 분화 유도로 이어진다. 이것은 배아에서 CNV의 일반적인 변화와 다양한 조직에서 CNV의 차이와 일치한다.
다른 유전자의 CNV(예: 종양유전자의 CNV)의 연장은 일반적으로 모든 종류의 종양 세포에 존재하며 임상 등급과 양의 상관관계가 있다. 동시에, 원발암유전자 및 종양 억제 유전자의 발현 수준도 CNV의 길이에 정비례하므로 종양의 형성 및 진행은 원발암유전자 또는 종양 억제 유전자에서 CNV의 장애와 관련되어야 한다. 또한 당뇨병과 같은 외부 자극과 관련된 일부 돌이킬 수 없는 질병도 CNV의 이상과 관련이 있다. 대부분의 약물 내성은 장기간의 외부 자극에 의한 상응하는 단백질의 발현의 변화와 관련되기 때문에, 그의 상응하는 유전자의 CNV 변화가 관여할 수 있고, 약물 내성은 이 기술에 의해 개선되거나 방해될 수 있다.
I. DNA가 매개하는 서열을 게놈에 삽입하는 기술(유전자 편집이 DNA에 의해 매개될 때 1-40개의 TTAAAA 또는 TTTTAA 서열을 운반체에 추가하여 RNA가 DNA로 전환되도록 도울 수 있음)(도 2 참조)
1. 후두구조가 매개하는 방법: 삽입할 위치점(즉 표적 위치)의 상류와 하류 서열(2000 bp 이내)을 선택하고 또한 업스트림 및 다운스트림 시퀀스의 중간 삽입 위치에 삽입하고자 하는 서열(2000 bp 이내)를 추가한다. 설계된 시퀀스는 합성되어 운반체에 통합되어 RNA 중합효소 II에 의해 전사되기 시작했다. 캐리어의 다른 영역에 SINE 시퀀스(0-20, 수신 시스템의 종에 따라 해당 종의 SINE이 될 수 있으므로 수신 시스템에 미치는 영향을 줄인다. SINE 시퀀스는 영장류에서 Alu 시퀀스일 수 있고 단일 구멍에서 Mon-1 시퀀스일 수 있으며 수량은 일정한 범위내에서 효율에 비례한다. 또한 비 천연 SINE을 사용할 수 있으며, 그후에는 사용중인 SINE의 기능에 해당하는 LINE 또는 그 단백질인 코딩 시퀀스를 도입해야 한다. 아래 참조) RNA 중합효소 II 또는 III에 의해 개별적으로 작동한다. SINE 시퀀스 다음에 해당 RNA 중합효소 의 종료 신호를 선택적으로 연결한다(해당 LINE 시퀀스 또는 LINE 시퀀스로 인코딩된 단백질 시퀀스를 SINE 시퀀스 이후의 종료 신호에 선택적으로 추가할 수 있기 전에, SINE의 Alu 컴포넌트에 대응하는 LINE-1 시퀀스, LINE-1로 인코딩된 ORF1p 및 ORF2p 시퀀스, MIR 컴포넌트에 대응하는 LINE-2 시퀀스, LINE-2로 인코딩된 ORF1p 및 ORF2p 시퀀스 등 유전자 편집에 필요한 단백질을 표현하여 유전자 편집 또는 편집 효율을 높임)(RNA 중합효소 II에 의해 전사될 때, 해당 종료 신호는 ORF2p의 모집을 증가시키기 위해 길이를 적절히 연장(200bp 이내)할 수 있는 polyA 서열이다. 그렇지 않으면 신호를 종료하 기전의 ORF1p 및 ORF2p 시퀀스 뒤에 적절한 길이의 polyA 시퀀스(200 bp 이내)를 추가하고 SINE 시퀀스 끝의 polyA 시퀀스(200 bp 이내)를 적절히 확장할 수 있다). 이후, 벡터(Alu시퀀스에 해당하는 LINE-1 또는 ORF2p 및/또는 ORF1p 시퀀스와 같은 캐리어에 포함된 SINE 시퀀스에 해당하는LINE 시퀀스 또는 LINE 시퀀스로 인코딩된 단백질 시퀀스를 표현하는 다른 캐리어는 동시에 수신 시스템에 전염되어 유전자 편집 효과를 높일 수 있다. 수신 시스템이 해당 LINE의 ORF1P 및 ORF2p와 같은 위의 단백질을 발현하지 않을 경우 추가로 발현해야 한다. 또한 SINE을 표현하는 운반체도 동시에 수신 시스템에 전염되어 유전자 편집 효율을 높일 수 있다). 지질체나 바이러스 전염 등 일반적인 수단을 통해 체외에서 배양된 세포와 조직으로 전이되거나 혈액, 림프, 뇌척수액 등 또는 국부 조직 등 경로를 통해 생물체에 주어 구축된 담체가 세포핵 표현에 들어가게 하고 그리고 삽입하고자 하는 서열를 게놈의 표적 사이트(삽입할 위치, 표적 사이트, target site)에 삽입하는 목적을 달성한다. (기대 효율이 달성되지 않으면, 표적 사이트의 상류 및 하류 서열과 삽입될 중간 서열을 포함하는 올가미의 형성 효율이 높지 않기 때문일 수 있으며, 상류 및 하류 서열 또는 삽입되는 서열의 길이는 올가미구조의 형성을 촉진하기 위해 증가 또는 감소될 수 있다. 또는 삽입할 비트(표적 위치)를 포함하는 올가미 구조를 감지하고 올가미 구조의 시퀀스 또는 부분 시퀀스를 표적 위치의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스로 사용할 수 있다. 게놈 시퀀스에 따라 표적 위치의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스를 적절히 연장하고, 삽입하고자 하는 서열를 표적 위치의 다운스트림 시퀀스와 업스트림 시퀀스 사이의 중간 삽입 비트(표적 위치)에 배치하여 캐리어로 구축할 수 있는 유전자 전사 프레임 워크를 형성한다. 이 캐리어의 전염도 유전자 편집 효율을 높일 수 있다.)(구축된 담체는 선택적으로 ORF1p 및/또는 ORF2p가 함유된 생리액에서 짧은 시간 동안 부화할 수 있다(적당한 온도에서 상온 또는 37 ℃에서 48 시간 이내)). 위의 방법에 따라 이전 삽입 후 생성된 새비트에서 삽입을 계속하면 시퀀스 삽입이 연속적 일 수 있으며 큰 길이 제한이 없는 긴 세그먼트를 게놈에 삽입할 수 있다.
2. SINE직접 연결 방식:
이 접근 방식은 생성된 올가미를 절단된 SINE 전사체와 연결할 필요가 없다. 그러나 삽입할 부위의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스와 삽입하고자 하는 서열를 벡터 구성 중에 SINE 관련 시퀀스와 직접 연결한다. 방법은 박테리아 등과 같은 원핵생물에 적합하며, 진핵생물 pre-mRNA 스플라이싱 메커니즘 없이 올가미 구조를 생성할 수 없으며, 또한 pre-mRNA 스플라이싱 메커니즘을 가진 진핵생물에도 적합하다. 이는 다음과 같은 LINE 방식에도 적용된다. 구체적인 단계는 다음과 같다. 삽입 대기 비트(표적 비트)의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스(2000bp 이내) 및 업스트림 및 다운스트림 시퀀스 사이의 삽입 대기 시퀀스(2000bp 이내)는 "유전자 전사 프레임 워크"를 형성한다. RNA 중합효소 II 또는 III의 부팅 서브에 의해 시작되며 다운스트림의 "SINE 시퀀스, 부분 SINE 시퀀스 또는 SINE-유사한 시퀀스"에 의해 연결된다. 상술한 핵산 서열을 합성한다. (선택적으로 SINE 시퀀스, 일부 SINE 시퀀스 또는 SINE-유사한 시퀀스 뒤에 해당 SINE 기능을 보조할 수 있는 LINE 시퀀스 또는 그 단백질 코딩 시퀀스를 추가하여 유전자 편집 효율을 높인다; 또한 수신 시스템이 LINE 또는 그 인코딩 단백질 자체를 표현하지 않을 경우 인코딩 단백질을 수신 시스템에 추가하거나 수신 시스템에서 추가로 표현해야 한다). 그 후, 상응하는 종류의 RNA 중합효소 의 종결 신호가 SINE 서열, 부분 SINE 서열 또는 SINE-유사한 서열 뒤에 선택적으로 첨가(종결 신호가 polyA 시퀀스인 경우, 종결 신호는 ORF2p 모집을 증가시키기 위해 적절하게 확장(200bp 이내)될 수 있고, 또는 그렇지 않은 경우, 적절한 길이(200bp 이내)를 갖는 polyA 서열은 SINE 서열, 부분 SINE 서열, SINE-유사한 서열, LINE서열, ORF1p서열 및/또는 ORF2p 서열 뒤에 첨가될 수 있으며, ORF2p 모집을 증가시키기 위해 종결 신호 전에), 시퀀스가 벡터에 추가된다. 지질체나 바이러스 전염 등 일반적인 수단을 통해 체외에서 배양된 세포와 조직으로 전이되거나 혈액, 림프, 뇌척수액 등 또는 국부 조직 등 경로를 통해 생물체에 주어 구축된 담체가 세포핵 표현에 들어가게 하고 그리고 삽입하고자 하는 서열를 게놈의 삽입할 위치 (표적 사이트)에 삽입하는 목적을 달성한다(구축된 담체는 선택적으로 ORF1p 및/또는 ORF2p가 함유된 생리액에서 짧은 시간 동안 부화할 수 있다(적당한 온도에서 상온 또는 37 ℃에서 48시간 이내)). 위의 방법에 따라 이전 삽입 후 생성된 새비트에서 삽입을 계속하면 시퀀스 삽입이 연속적일 수 있으며 큰 길이 제한이 없는 긴 세그먼트를 게놈에 삽입할 수 있다.
3. LINE-매개 접근법: RNA 중합효소 II는 LINE 또는 그 안에 있는 ORF2p 및/또는 ORF1p 코딩 서열의 발현을 시작하고, 이어서 SINE직접 연결 방식의 동일한 방법으로 설계된 서열이 뒤따른다(수신 시스템에 미치는 영향을 최소화하기 위해 수신 시스템의 SINE 및 LINE 유형을 선택할 수 있다. 효율성을 높이기 위해 해당 SINE 시퀀스를 이전 LINE에 기능적으로 대응하도록 선택할 수 있다). 그런 다음 끝에서 사용되는 RNA 중합효소 II의 종료 신호를 선택적으로 연결할 수 있다. 이후 지질체나 바이러스 전염 등 일반적인 전염 수단을 통해 체외에서 배양된 세포나 조직으로 운반체를 옮기거나 혈액, 림프, 뇌척수액 또는 국부 조직 등의 경로를 통해 생물체에 주고 구축된 운반체를 세포핵으로 옮겨 발현한다(구축된 담체는 선택적으로 ORF1p 및/또는 ORF2p(적절한 온도에서 상온 또는 37 ℃에서 48시간 이내)가 함유된 생리 액체에서 잠시 부화하여 담체의 세포핵으로 이동 및 포지셔닝하는 효율과 도입 효률을 높일 수 있다). 그런 다음 삽입하고자 하는 서열를 게놈에서 삽입할 해당 비트 포인트에 삽입한다. 삽입 후 생성된 새비트포인트에 따라 위의 방법으로 계속 삽입하면 지속 가능한 삽입이 가능하고 뚜렷한 길이 제한이 없는 긴 세그먼트 삽입이 완료된다.
4. 다운스트림 연결 ORF2p와 결합 가능한 시퀀스법: 캐리어에 있는 유전자 전사 프레임의 표적점 업스트림 시퀀스, 표적점 다운스트림 시퀀스 및 중간의 삽입 대기 시퀀스가 게놈과 결합하여 형성된 Ω 구조는 이 Ω 구조로 SINE의 역전 기능 구조를 대체하여 역전을 시작하고, 따라서 유전자 전사 프레임에서 표적 위치의 다운스트림은 ORF2p와 결합할 수 있는 ORF2p 시퀀스(예: 다중폴리 A 시퀀스)를 연결할 수 있다. 또한 선택적으로 LINE 시퀀스, ORF1p 및/또는 ORF2p 인코딩 시퀀스를 유전자 전사 프레임 워크 와 동일한 캐리어 또는 다른 캐리어에 추가하여 효율성을 높일 수 있다. 이후 지질체나 바이러스 전염 등 일반적인 전염 수단을 통해 체외에서 배양된 세포나 조직으로 운반체를 옮기거나 혈액, 림프, 뇌척수액 또는 국부 조직 등의 경로를 통해 생물체에 주고 구축된 운반체를 세포핵으로 옮겨 발현한다(구축된 담체는 선택적으로 ORF1p 및/또는 ORF2p(적절한 온도에서 상온 또는 37 ℃에서 48시간 이내)가 함유된 생리 액체에서 잠시 부화하여 담체의 세포핵으로 이동 및 포지셔닝하는 효율과 도입 효률을 높일 수 있다), 그런 다음 삽입하고자 하는 서열를 게놈에서 삽입할 해당 비트포인트에 삽입한다. 삽입 후 생성된 새 비트포인트에 따라 위의 방법으로 계속 삽입하면 지속 가능한 삽입이 가능하고 뚜렷한 길이 제한이 없는 긴 세그먼트 삽입이 완료된다.
II.DNA가 매개하는 게놈 서열 삭제 기술, 도 2와 같이
1. 게놈에서 임의의 영역 삭제: 위 삽입 기술에서 설계한 벡터의 삽입하고자 하는 서열을 삽입 포인터 업스트림 또는 다운스트림(10000 bp 이내)의 시퀀스(2000 bp 이내)로 변경한다. 이 발명에서 설명한 DNA, RNP 또는 RNA 매개의 삽입 경로를 통해 이 세그먼트 서열을 삽입한 후 동원 재조합을 통해 일정한 효율로 두 세그먼트의 동일한 서열 사이의 서열을 제거할 수 있다. 재조합 비트(GCAGA[A/T]C, CCCA[C/G]GAC/ 또는 CCAGC)가 포함된 시퀀스를 선택하여 삽입할 수 있으므로 삽입 후 상동 재조합 효율성이 향상된다.
2. CNV 끝에서 삭제: 시퀀싱 및 비교(유전자 서열과 일부 SINE 서열의 연결부에 비교)를 통해 세포 또는 조직의 CNV 끝을 검사한다. 또한 처리하고 자하는 CNV 말단 중 유전자 부분(2000 bp 이내) 및 그 말단이 '완전한 유전자' 중 하류 구간 범위(20000 bp 이내)에서 형성할 수 있는 올가미의 3'부분 서열(하류에서 형성할 수 있는 올가미는 아래 서술한 방법으로 예측하거나 측정할 수 있다)(또한 이 끝이 "완전한 유전자" 중 하류의 한 구간 범위 내(20000 bp 이내)에 있는 시퀀스를 직접 선택하여 절단한 후 상술한 3'부분 시퀀스를 대체할 수도 있다)을 선택한다. CNV 끝의 삽입하고자 하는 서열 업스트림(10000 bp 이내)에 인접한 시퀀스와 각각 연결한다. 그런 다음 전체 SINE 서열, 부분 SINE 서열 또는 클래스 SINE 서열에 연결한다(위의 다른 삽입 방법에 따라)(위의 설명에 따르면 ORF1p 인코딩 시퀀스와ORF2p 인코딩 시퀀스를 뒤에 연결할 수 있음). 서열합성을 하고 위에서 설명한 유전자 삽입 방식 중 하나 를 통해 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 실제 CNV 말단의 유전자 부분과 부분 SINE 서열(벡터에 사용된 SINE 시퀀스가 삽입점 주위의 SINE 시퀀스와 같거나 더 가까운 경우 효율성 향상) 사이에 말단의 삭제 대기 서열 상류 인접 서열을 삽입한다. 이후 상동 서열(homologous sequence) 사이에서 발생하는 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 삭제하고자 하는 서열(sequence to be deleted)를 삭제한다. 재조합 비트(GCAGA[A/T]C, CCCA[C/G]GAC/또는 CCAGC)가 포함된 시퀀스를 선택하여 삽입할 수 있으므로 삽입 후 상동 재조합 효율성이 향상된다.
III. DNA가 매개하는 게놈 시퀀스 교체 기술
위의 삽입 기술에서 설계된 벡터의 삽입하고자 하는 서열을 대체 서열 및 게놈의 대체할 서열 주변 시퀀스로 변경(즉, 삽입할 대체 서열과 게놈의 시퀀스 사이에 상동 재조합이 발생하면 삭제되는 시퀀스이다. 이 시퀀스는 벡터를 구축할 때 대체 서열의 3'또는 5'에 위치하며, 삽입 포인터가 게놈에서 대체할 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 따라 달라진다)(대체 서열과 게놈의 대체할 서열 사이는 상동 서열여야 함). 위의 유전자 편집 삽입 방식을 통해 대체 서열 및 게놈의 대체할 서열의 주변 시퀀스를 게놈의 대체할 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 삽입한다. 삽입된 대체 서열과 게놈의 대체할 서열 사이에 상동 서열이 발생하면, 게놈의 대체할 서열는 같은 대체 서열(삽입됨) 또는 비슷한 대체 서열(삽입됨)로 대체된다. 동시에 상동 서열으로 인해 삭제된 대체할 서열의 주변 시퀀스 부분은 삽입 시 대체 서열과 함께 다시 삽입된다.
IV. RNA가 매개하는 게놈 시퀀스 편집 기술(RNA에서 DNA로의 전환이 필요하지 않으므로 TTAAAA 비트 또는 TTTTAA 비트를 추가로 추가할 필요가 없다), 도 3과 같이.
1. 리보 핵단백질(RNP) 경로: 앞에서 설명한 합성된 벡터를 증폭하여 증폭된 벡터를 LINE(작성된 vector에 포함된 SINE 시퀀스 기능에 해당하는 LINE을 선택하여 효율성을 높일 수 있다. 예를 들어 작성된 벡터에 Alu 시퀀스 또는 일부 Alu 시퀀스가 포함되어 있으면 LINE-1 및 코딩 단백질 ORF1p 및 ORF2p에 해당한다)(관련 단백질을 전염시켜 표현하는 벡터, 또는 전염 후 선별하여 영구적으로 관련 단백질을 과잉 표현하는 공정 세포를 얻는다. 만약 그후 관련 단백질인 ORF1p와 ORF2p의 부화를 거친다면, 벡터가 전염된 공정 세포는 반드시 관련 단백질을 표현할 필요가 없다). 이 코딩한 단백질을 고 발현하는 공정용 세포계로 전염시키고, 일정 시간 후 세포핵 및 세포질을 추출하고, 서열·특이성 등 원리 및 상응하는 일반적인 방법을 응용하여 단일체인 플라스미드산물(단일체인 RNA) 또는 단일체인 플라스미드산물(단일체인 RNA)을 함유한 생물 활성 핵당핵단백질(RNP) 복합체를 추출한다(ORF1p 및/또는 ORF2p를 함유한 세포질 중 또는 ORF1p 및/또는 ORF2p를 함유한 생리 액체에서 부화한 후 다시 추출하여 순화시키는 것을 선택할 수 있다(적당한 온도, 상온 또는 37 ℃ 모두 가능, 부화 48h 이내), 체외 생리액체나 세포질에는 RNA 효소 억제제를 첨가해야 하며, 이전에 전입한 세포가 관련 단백질을 표현하지 않으면 ORF1p 및/또는 ORF2p와 부화해야 한다）.그후 일반적인 전염 수단을 통해 례를 들면 지용성 물질 례하면 지질체나 바이러스 등을 사용하여 핵당핵단백질 복합체를 소포한 후 이를 체외에서 배양한 세포, 조직으로 전입하거나 혈액, 림프액과 뇌척수액 등 통로를 거치거나 직접 국부 조직을 주는 등 방식으로 생물체로 전입하여 상응한 유전자 편집 역할을 완성하였다(세포질로 들어가면 되고 핵에 들어갈 필요가 없다). 방향성 전입이 필요하면 벡터 밖의 소포에 수식을 할 수 있다. RNA가 분해되지 않도록 전체 과정을 주의하십시오.
또한, LINE-매개 접근법으로 합성된 벡터가 RNP 형태로 적용될 경우, 추출한 단일체인 플라스미드산물(단일체인 RNA)이 포함된 생체활성을 가진 리보 핵단백질(RNP) 복합체에서 앞 부분 LINE-1 시퀀스 또는 ORF1p 및 ORF2p 코딩시퀀스가 없는 산물을 선별해 야 한다(시퀀스 특이성 사용 가능)(절단을 촉진하기 위해 체외핵산내접효소 등의 처리를 추가로 추가할 수 있다). 프런트 엔드 시퀀스가 유전자 편집을 방해하는 표적 정확성을 방지한다.
2. RNA 매개 접근법:
앞서 언급했듯이, 삽입점(즉, 표적점, 표적 사이트, 표적 부위) 상하류 서열(각각 2000 bp 이내)과 그 중간, 삽입점 위치에 대응하는 삽입하고자 하는 서열(2000bp 이내), 그 다음에 SINE 서열, 부분 SINE 서열 또는 클래스 SINE 서열을 연결하고 그 다음에 선택한 SINE 기능에 해당하는 LINE 시퀀스 또는 그 안에 포함된 단백질 인코딩 시퀀스를 연결하는 서열을 합성하여(예를 들어 부분 Alu 시퀀스를 사용하는 경우 LINE-1 및 해당 ORF1p 및 ORF2p 인코딩 시퀀스에 해당한다. 부분 MIR 시퀀스를 사용하는 경우 LINE-2 및 해당 단백질 코딩 시퀀스에 해당한다.). 이 시퀀스를 캐리어에 구축하고 RNA 중합효소 II/III 플라스미드를 통해 전사한다(또는 상술한 각종 DNA 매개 방법에서 얻은 벡터를 직접 채용하여 공정 세포에 전입할 수 있으며 그 후 일반적인 수단인 서렬 특이성 등에 따라 유전자 편집에 사용할 수 있는 RNA 산물을 추출할 수 있다). 그 표현의 RNA를 분리하여 순화시킨 후, 그 후 일반적인 전염 수단을 통해 례를 들면 지용성 물질 례하면 지질체나 바이러스 등을 사용하여 핵당핵단백질 복합체를 소포한 후 이를 체외에서 배양한 세포, 조직으로 전입하거나 혈액, 림프액과 뇌척수액 등 통로를 거치거나 직접 국부 조직을 주는 등 방식으로 생물체로 전입하여 상응한 유전자 편집 역할을 완성하였다(세포질로 들어가면 되고 핵에 들어갈 필요가 없다.). 삽입 후 생성된 새 비트포인트에 따라 위의 방법으로 계속 삽입하면 지속 가능한 삽입이 가능하고 뚜렷한 길이 제한이 없는 긴 세그먼트 삽입이 완료된다(RNA를 지속적으로 세포로 옮겨야 할 수도 있다).
V. 트랜스포 존으로 인한 게놈 변화를 저해하고 게놈 및 그 위의 CNVs를 안정시킨다(즉 이 유전자 편집 기술을 통해 CNV 말단의 유전자 부분과 부분 SINE서열 사이 또는 기타 영역에 게놈 또는 이 CNV 말단의 유전자 부분 및 이 유전자 부분이 완전한 유전자 중의 상류 하류 계열과 비동원적인 서열을 삽입하여 CNV의 추가 확장을 방해한다; CNV 말단은 유전자 서열이 부분적 SINE 서열을 직접 연결하는 곳으로 정의되는 데, 이곳에서 유전자가 확장될 수 있으며, 각 특정 CNV 말단의 유전자 부분 서열과 부분적 SINE 서열의 구체적인 서열은 유전자 서열 분석이나 유전자 칩 등 분자생물학적 수단을 통해 얻을 수 있다)(그 후 일반적인 전염 수단을 통해 례를 들면 지용성물질 례하면 지질체나 바이러스 등을 사용하여 핵당핵단백질 복합체를 소포한 후 이를 체외에서 배양한 세포, 조직으로 전입하거나 혈액, 림프액과 뇌척수액 등 통로를 거치거나 직접 국부 조직을 주는 등방식으로 생물체로 전입하여 상응한 유전자 편집 역할을 완성하였다)(도 4와 같이)
1. 특정 CNV를 편집한다(그중 삽입할 때 사용한 상류 서열은 특정 유전자의 CNV 말단 유전자 부분이다):
조작이 필요한 CNV의 유전자부분의 3'끝과 일부 SINE 서렬의 교차점을 삽입점 (표적점)으로 설정한다, 상술한 삽입 방법에서 표적 사이트 상류 서열 을 CNV 끝 유전자 부분의 3'끝 (2000bp 이내)으로 설정하고, 표적 사이트 하류 서열 을 부분 SINE 서열로 설정하였다(따라서, 위에서 언급한표적 사이트 하류 서열뒤에 연결된SINE서열, 부분 SINE 서열또는클래스SINE서열은 생략할 수 있다), 삽입하고자 하는 서열 은 게놈과 상동성이 아닌 임의의 서열이고, 또는 CNV 말단의 유전자 부분과 온전한 유전자의 상류 및 하류 서열과 상동성이 아닌 임의의 서열(2000bp 이내). 운반체가 만들어지면, 운반체는 상술한 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 해당 세포, 생체 조직 또는 생물체로 이동하며, CNV 말단에비상동 서열이 삽입된다. 비상동 서열이 전체 유전자에서 상응하는 CNV 말단(끝의) 유전자 서열의 하류에 존재하지 않기 때문에, 완전한 유전자 서열에 따라 CNV 말단 더 이상 확장할 수 없고, 따라서 CNV 말단 더 이상의 변화를 방해한다.
2. 게놈의 CNV에 대한 광범위한 간섭(삽입에 사용되는표적 사이트 상류 서열은 CNV 끝부분의 유전자 부분이 모두 들어 있어야 하는 경우이다):
(1) 게놈파괴서렬법:
조작이 필요한 생물체나 조직, 세포계에서 세포를 채취하여 체외에서 배양한다, 혹은 직접 게놈을 추출하여 초음파파쇄후 랜덤프라이머와 PCR을 통해 그 함량을 증가시킨다. 짧은 무작위 서열 (20bp 이내)을 설계 합성하고, 그 아래쪽에부분 SINE 서열을 연결한다. 이후 게놈 조각을짧은 무작위 서열 + 부분 SINE 서열과 PCR 기법을 통해 연결했다, 서로 다른 게놈 조각 + 짧은 무작위 서열 + 부분 SINE 서열의 DNA 서열을 얻는 것이다. 그 DNA 조각을 벡터에 삽입해서, 벡터는 상술한 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 세포나 조직, 유기체로 이동한다. 게놈 조각을 이용하여 게놈의 모든 CNV 말단 표적으로 하여 CNV 말단유전자 부분과부분 SINE사이에비상동 서열을 삽입한다(즉, 짧은 무작위 서열 (short random sequence) 또는 부분적인 짧은 무작위 서열 (partial short random sequence)이다, 그것은 유전자 단편의 비상동성 부분이며, 또한 상응하는 유전자 단편의 국소 유전자 서열에 대해 비상동성이다), 비상동 서열은 온전한 유전자에서 상응하는 CNV 말단 유전자 부분 서열의 하류에 존재하지 않기 때문에, CNV 말단에서의 추가의 변화가 방해된다.
(2) 랜덤 서열 방법: 적당한 길이의 무작위 서열(100bp 이내)(모든 순열이 포함되며, SINE 시퀀스와 유사한 조합은 제외 가능) + 임의의 게놈의 비상동 서열(2000bp 이내) + 부분 SINE을 전사하는 플라스미드를 만든다, 또는 무작위 서열 (100bp 이내) + SINE의 자연 전단 부위(예를 들어, Alu의 RNA의 경우 전단 부위는 scAlu 및 부분 Alu를 생성하기 위해 절단될 수 있는 중간 부분이다) 뒤에 게놈과 상동성이 아닌 서열의 부분 SINE 서열을 추가한다(2000bp 이내)을 전사하는 플라스미드를 만든다. 또한, RNA 중합효소 II에 의해 발현되는 랜덤 서열 + 게놈에 대한 임의의 비상동 서열(이하, 올가미로 표시됨)의 벡터를 합성하는 것도 가능하다(벡터는 SINE 시퀀스를 포함하거나 SINE 시퀀스를 포함하는 다른 벡터를 추가로 사용해야 한다. SINE 서열의 하류는 SINE 기능에 대응하는 "LINE 서열 또는 그 단백질 코딩 서열"에 연결되거나, SINE 기능에 대응하는 "LINE 서열 또는 그 단백질 코딩 서열"을 추가적으로 발현할 수 있다). 벡터는 상술한 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 세포나 조직, 유기체로 이동한다. 무작위 서열 이용하여 게놈의 모든 CNV 말단 표적으로 하여 CNV 말단유전자 부분과부분 SINE사이에비상동 서열을 삽입한다, 비상동 서열은 온전한 유전자에서 상응하는 CNV 말단 유전자 부분 서열의 하류에 존재하지 않기 때문에, CNV 말단에서의 추가의 변화가 방해된다.
(3) 올가미 말단 서열 방법에 따라: 테스트는 모든 유형의 올가미를 얻는다(게놈과 상동성이 아닌 작은 무작위 서열(100bp 이내)이 SINE 서열에 삽입되는 반면, SINE 서열은 여전히 정상적으로 절단되어 부분적인 SINE 서열을 생성할 수 있다(즉, 비상동 서열의 삽입 위치는 전단 부위가 아닌 SINE의 자연 전단 부위의 하류이다), 이 조작된 SINE 서열을 발현하는 플라스미드를 구성하여 조작할 유기체에서 채취한 세포 또는 해당 종의 세포주로 전달했다(검출하고자 하는 상응하는 종의 게놈도 채취될 수 있고, 전체 게놈은 긴 길이(200 bp 이상)를 갖는 단편으로 절단될 수 있고, 어느 정도 서로 겹치고(10 bp 이상 겹침), 벡터로 구성될 수 있으며, 이는 RNA 중합효소 II에 의해 해당 종의 시험관 내 세포에서 과발현된다), 일정 시간이 지나면 SINE 서열에 삽입된 비상동 서열의 서열에 따라 해당 핵산을 추출하고, 그리고 그것을 시퀀싱한다. 비상동 서열을 연결하는 부분 SINE 서열에 연결된 다양한 올가미의 서열 정보를 얻는다). 또는/동시에 pre-mRNA의 올가미 형성 서열 법칙(예: 대부분 AG로 끝남)에 따라 올가미 서열을 예측하고 종 또는 살아있는 개체의 모든 올가미 서열 정보를 얻는다. 모든 올가미의 3'서열(2000bp 이내)을 취하여 게놈의 임의의 비상동 서열(2000bp 이내)을 연결하고 SINE 서열(상기에 따르면, 이 시퀀스 뒤에 SINE 기능에 해당하는 LINE 서열 또는 그 단백질 코딩 서열을 연결하여 효율을 높일 수 있다)을 발현하는 위의 벡터를 삽입(SINE은 다른 벡터에서도 발현될 수 있음) 전사하고 올가미를 생성한다. 그런 다음 올가미는 SINE RNA의 세포 전단에 의해 생성된 부분 SINE 서열에 연결된다. 또는 얻은 모든 올가미의 3' 서열을 게놈의 임의의 비상동 서열(2000bp 이내)에 연결한 다음 부분 SINE 서열(상기에 따르면, 이 시퀀스 뒤에 SINE 기능에 해당하는 LINE 서열 또는 그 단백질 코딩 서열을 연결하여 효율을 높일 수 있다)(사용되는 SINE 서열은 바람직하게는 이 SINE 서열의 전면에 부착된 올가미의 3'서열이 위치한 유전자의 SINE 서열과 동일하거나 유사해야 한다)을 연결하고 발현을 위해 벡터에 삽입한다. 벡터는 위에서 설명한 DNA, RNP 또는 RNA 경로를 통해 적절한 세포, 조직 또는 유기체로 전달되어 광범위한 CNV 말단의 게놈 전체 편집이 가능하다.
(4) SINE 서열를 수정하여 메서드:상기 변형된 SINE 시퀀스를 추가적으로 발현시킴으로써, 삽입하고자 하는 서열 은 게놈과 상동성이 아닌 임의의 서열이고, 또는 CNV 말단의 유전자 부분과 온전한 유전자의 상류 및 하류 서열과 상동성이 아닌 임의의 서열, 삽입하고자 하는 서열는 각 CNV 말단에 삽입되어 CNV 말단의 확장을 방지한다. SINE의 자연 전단 부위 앞에 추가적인 짧은 서열(통상적으로 생성된 올가미의 3'시퀀스와의 불일치; 이 시퀀스는 SINE의 자연 전단 부위에 걸쳐 있는 짧은 시퀀스(100bp 이내)일 수 있다)을 포함하는 완전한 SINE 서열의 합성은 SINE의 RNA가 이 추가 영역에서 자연적으로 절단될 수 있도록 한다. 이 SINE 서열(상기에 따르면, 이 시퀀스 뒤에 SINE 기능에 해당하는 LINE 서열 또는 그 단백질 코딩 서열을 연결하여 효율을 높일 수 있다)를 벡터에 삽입한다. 또는 RNA의 자연 절단 부위 뒤에 게놈의 임의의 비상동 서열(200bp 이내)을 추가하여 완전한 SINE 서열(상기에 따르면, 이 시퀀스 뒤에 SINE 기능에 해당하는 LINE 서열 또는 그 단백질 코딩 서열을 연결하여 효율을 높일 수 있다)을 합성한다. 이 SINE 서열은 벡터에 삽입되어 해당 세포, 생체 조직 또는 유기체로 전달된다. 사용된 SINE 서열은 전체 게놈의 모든 CNV 말단을 정밀하게 편집하기 위해 해당 종 또는 살아있는 개체의 모든 SINE 서열(예: 시퀀싱 또는 어레이 칩에 의해)을 포괄하려고 한다.
전체 게놈은 또한 서로 겹치는 긴 세그먼트로 절단 될 수 있다(올가미 구조의 길이를 넘어 겹침). 벡터를 삽입하고, 해당 종의 시험관 내 세포주에서 과발현하고 올가미 구조를 생성하고, 그 후, 수정된 SINE 서열(상응하는 SINE 기능에 상응하는 LINE 서열 또는 이의 단백질-코딩 서열의 다운스트림 첨가 후, 이는 RNA 경로에 의해 매개될 수 있다)을 발현하는 벡터가 세포로 전달되고, 생물학적 활성을 갖는 단일가닥 RNA(올가미를 연결하는 부분 SINE 서열(수정된SINE에서 생성됨))의 리보핵단백질 복합체 (RNP) 또는 RNA는 서열 특이성 및 다른 특성 및 통상적인 수단에 의해 단리 및 정제된다, 그런 다음 해당 RNA 또는 RNP 경로를 통해 작동한다.
3. 게놈에서 SINE 및 LINE의 수정:
본 발명을 통해 임의의 서열(500bp 이내)을 게놈 상의 SINE의 프로모터, RNA의 자연 전단 부위 또는 SINE 상의 다른 서열 및/또는 LINE의 프로모터, 단백질 코딩 서열 또는 기타 서열에 삽입하고, 게놈의 SINE 서열이 전사되는 것을 방지하거나, 전사 후 절단할 수 없음 및/또는 LINE을 전사할 수 없거나 정상적인 기능을 가진 단백질을 생성한다. 편집되는 개인의 전체 게놈의 SINE 또는 LINE 서열이 먼저 시퀀싱된다, 해당 서열를 가져온다. 표적 사이트로 프로모터, RNA의 자연 전단 부위, 단백질 코딩 서열 또는 기타 서열을 선택하고, 표적 사이트 상류 서열 및 표적 사이트 하류 서열은 표적 사이트에 대한 SINE 또는 LINE 시퀀스 상의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스이고, 삽입하고자 하는 서열는 임의의 서열일 수 있다. 위의 삽입 방법에 의해 임의의 서열이 게놈 상의 SINE 또는 LINE의 해당 부위에 삽입된다. 또한, 상기 유전자 편집 방법에 의해 유전체 상의 SINE 또는 LINE을 대체하거나 삭제하여 비활성화시킬 수도 있다.
4. CNV 말단 삭제하다 고정한다:
조작할 CNV 말단을 선택하고, 유전자 부분의 3' 말단과 부분 SINE 서열의 접합부를 표적 사이트로 설정하고, 표적 사이트 상류 서열은 CNV 끝에 있는 유전자 부분의 3' 말단(2000bp 이내)으로 설정된다. 표적 사이트 하류 서열는 부분 SINE 서열이고(따라서, 상기 유전자 편집 방법에서 표적 사이트 하류 서열 뒤에 연결된 부분 SINE 서열은 생략할 수 있다), 삽입하고자 하는 서열는 게놈에서 삭제하려면 하는 서열(100000bp 이내)에 인접한 상류 서열(2000bp 이내) 다음에 게놈의 임의의 비상동 서열(2000bp 이내)이 온다. 벡터가 구축된 후, 상술한 DNA, RNA 또는 RNP 경로를 통해 상응하는 세포, 생체 조직 또는 유기체로 전달된다. 게놈에서 삭제하려면 하는 서열에 인접한 상류 서열 다음에 게놈의 임의의 비상동 서열를 해당 CNV 말단 삽입하고, 두 개의 동일한 서열이 상동 재조합을 겪어 중간 서열이 삭제될 때, 비상동 서열은 CNV의 추가 확장을 방해할 것이다.
5. 고유 메커니즘 방법의 억제:
또한 세포 또는 유기체의 고유한 CNV 확장 메커니즘을 직접 억제하여 기능을 방해할 수 있다. 예를 들어, RNA 간섭 및 SINE 및 LINE의 전사를 억제하거나 ORF1p 및 ORF2p와 같은 RNA 및 단백질의 생성을 억제하는 다른 방법에 의해, 특정 단백질에 의해 이러한 CNV 확장 메카니즘과 관련된 단백질의, 예컨대 ORF1p, ORF2p 또는 스플라이소좀(spliceosome), 또는 복합체의 기능적 구조에 결합. 상술한 유전자 편집 기술 등에 의해 Alu 및 다양한 MIR등과 같은 게놈 SINE, 및 다양한 유형의 LINE 및 단백질 코딩 서열 등를 변형시키고, 그 활성을 불활성화 또는 감소시키는 단계와, 억제 상동 재조합 또는 불일치 복구 메커니즘에 대한 관련 단백질, 또는 변형된 뉴클레오시드 관련 물질를 통해 역전사를 방해하고, 따라서, 본질적인 CNV 확장 메커니즘을 억제함으로써, 게놈 변화를 방해하고 CNVs를 안정화시키는 효과를 얻을 수 있다.
SINE, LINE 및 이들이 발현하는 단백질은 진핵생물에 널리 존재하기 때문에 이 기술을 통해 광범위한 진핵생물에서 유전자 편집 작업을 수행할 수 있다. 또한 유전자 변형 질환의 치료에도 적용될 수 있다, 유전적 변화 등과 관련된 세포 또는 유기체의 상태를 변경하거나 안정화한다 등등.
본 발명에서는 어떤 확정된 서렬(예: 삽입하고자 하는 서열)이 5헐′' 방향을 따른다고 정의하였다. 업스트림은 확정된 서열의 5' 말단 앞이고, 다운스트림은 확정된 서열의 3' 말단 이후이다. 상류 서열는 확정된 서열의 5' 말단 앞에 오는 서열이고, 하류 서열는 확정된 서열의 3' 말단 이후의 서열이다.
본 발명에서 제공하는 유전자 전사 프레임워크는, 도 5에 도시된 바와 같이, 5'→3' 방향을 따라 표적 사이트 상류 서열, 삽입하고자 하는 서열, 표적 사이트 하류 서열을 포함한다. 유전자 전사 프레임워크와 짧은 산재 핵 요소, 긴 산재 핵 요소, 프로모터 사이의 위치 관계를 더 잘 이해하기 위해 이해를 위해 몇 가지 다른 연결 형태가 나열된다.
도 6에 표시된 구조의 개략도: 유전자 전사 프레임워크 앞에 프로모터 연결, 프로모터는 RNA 중합효소 I 프로모터, RNA 중합효소 II 프로모터, 및 RNA 중합효소 III 프로모터일 수 있다. 프로모터는 벡터 상에 위치할 수 있고, 유전자 전사 프레임워크, 짧은 산재 핵 요소, 긴 산재 핵 요소 등은 벡터의 제한 자리를 통해 프로모터의 하류에 삽입되고, 세포 내로 형질주입되어 발현된다. 또한, 프로모터와 유전자 전사 프레임워크, 짧은 산재 핵 요소, 긴 산재 핵 요소 등를 직접 합성하여 벡터에 삽입하는 것도 가능하다. 도 7은 유전자 전사 프레임워크의 업스트림에서 프로모터를 연결하고, 다운스트림에서 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소를 연결하는 구조이다. 도 8은 유전자 전사 프레임워크의 업스트림 연결 프로모터, 다운스트림 연결 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열 구조 다이어그램이다. 도 9은 유전자 전사 프레임워크의 업스트림 연결인 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열이다. 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열의 업스트림에서 프로모터의 구조 다이어그램을 연결한다. 도 10은 유전자 전사 프레임워크의 업스트림에서 프로모터를 연결하고, 다운스트림에서 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소를 연결한 후, 다운스트림에서 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열의 구조 설명도를 연결한다. 도 11은 유전자 전사 프레임워크의 다운스트림에서 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소를 연결하고 유전자 전사 프레임워크의 업스트림에서 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열를 연결하며 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열의 업스트림에서 프로모터를 연결하는 구조 다이어그램이다. 도 12는 유전자 전사 프레임워크와 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소가 하나의 프로모터를 공유하지 않는 구조 설명도이다. 도 13은 유전자 전사 프레임워크와 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열가 프로모터를 공유하지 않는 구조 다이어그램이다. 도 14는 유전자 전사 프레임워크와 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소 및 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열가 하나의 프로모터를 공유하지 않는 구조이고 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소는 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열의 하류에 위치하며 양자는 하나의 프로모터를 공유한다. 도 15는 유전자 전사 프레임워크와 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소 및 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열가 하나의 프로모터를 공유하지 않는 구조이고 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소는 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열의 상류에 위치하며 양자는 하나의 프로모터를 공유한다. 위의 경우는 모두 유전자 전사 프레임워크, 짧은 산재 요소, 부분적 짧은 산재 요소, 또는 유사 짧은 산재 요소, 긴 산재 요소 또는 ORF1p 코딩 서열 또는 ORF2p 코딩 서열 가 동일한 벡터에 있는 경우이며, 동일한 벡터에 있지 않을 수도 있다, 세포에 형질주입 하여 부동한 프로모터를 통해 전사한다.
다음 실시예에서 사용된 재료는 인간 소스 세포이기 때문에 사용되는 SINE은 영장류 특유의 짧은 산재 요소 Alu 요소이다. Alu 요소의 전체 서열는 Seq ID No. 1을 참조하십시오. 부분적 Alu 서열는 Seq ID No. 2 를 참조한다. 사용된 재료가 다른 종일 때 짧은 산재 요소을 해당 종의 짧은 산재 요소으로 교체하여 표현에 유리하게 할 수 있다.
재료
1. pSIL-eGFP 플라스미드 벡터는 Addgene, Plasmid 52675로부터 구매하였고, pBS-L1PA1-CH-mneo 플라스미드 벡터는 Addgene, Plasmid 51288로부터 구매한 것이다.
2. 10Х 소화 완충액(NheI 소화에 필요): 330mM Tris-아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 660mM 아세트산칼륨, 1mg/mL BSA; 10Х 소화 완충액(SalI 소화에 필요): 500mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 1000mM NaCl, 1mg/mL BSA.
3. 제한효소 NheI, SalI는 ThermoFisher에서 구입하였다.
4. T4 DNA 리가아제 및 그의 적용에 필요한 10 Х 완충액은 Promega로부터 구입하였다.
5. Entranster-H4000 형질주입 시약은 베이징Engreen생물과학기술유한공사로부터 구입하였다.
6. 베이징 TIANGEN 생화학 과학 기술 유한 회사에서 구입한 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 키트, 카탈로그 번호: DP304.
7. 베이징 TIANGEN 생화학 과학 기술 유한 회사에서 구입한 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）, 카탈로그 번호: FP205.
8. 베이징 TIANGEN 생화학 과학 기술 유한 회사에서 구입한 마그네틱 비드 방식 조직/세포/혈액 총 RNA 추출 키트, 카탈로그 번호: DP761.
9. 베이징 TIANGEN 생화학 과학 기술 유한 회사에서 구입한 FastKing cDNA 첫 번째 가닥 합성 키트, 카탈로그 번호: KR116.
10. 베이징 TIANGEN 생화학 과학 기술 유한 회사에서 구입한 TIANSeq mRNA 캡처 키트, 카탈로그 번호: NR105.
11. LipofectamineTM MessengerMAXTM mRNA 형질주입 시약은 ThermoFisher로부터 구입하였다.
12. 트립신은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다, 카탈로그 번호: T1426.
13. 베이징 TIANGEN 생화학 과학 기술 유한 회사에서 구입한 Dnase I, 카탈로그 번호: RT411.
14. 프라이머 및 서열의 화학적 합성은 상해백금상생물기술유한공사에 의해 수행된다.
실시예 1 DNA 매개 외인성 삽입하고자 하는 서열은 게놈 지정 부위에 삽입된다
혈관 내피 성장 인자 (VEGFA)는 PDGF / VEGF 성장 인자 패밀리의 구성원이다. 그것은 이황화 결합 동종이량체로 존재하는 헤파린 결합 단백질을 암호화한다. 이 성장 인자는 혈관 신생, 내피 세포 성장, 내피 세포 증식 유도, 세포 이동 촉진, 세포 사멸 억제 및 혈관 투과성 유도에 역할을 하며, 이는 생리적 및 병리학 적 혈관 신생 모두에 필요하다.
본 실시예에서는 본 발명의 DNA 매개 게놈 서열 삽입 기술을 확인하기 위해 VEGFA 유전자에 외인성 서열을 삽입한다.
인간 게놈에서 VEGFA 유전자의 459-bp 서열을 선별하고, Seq ID No.3에 나타내었다:
ATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGGTGAGGATGTAGTCACGGATTCATTATCAGCAAGTGGCTGCAGGGTGCCTGATCTGTGCCAGGGTTAAGCATGCTGTACTTTTTGGCCCCCGTCCAGCTTCCCGCTATGTGACCTTTGGCATTTTACTTCAATGTGCCTCAGTTTCTACATCTGTAAAATGGGCAC * AATAGTAGTATACTTCATAGCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAA，이고, 상기 *는 선택된 표적 사이트(표적 사이트, target site)였다. VEGFA 유전자 내의 표적 사이트 상류 서열(표적 부위의 상류 서열)은 표적 사이트 전이었고, VEGFA 유전자 내의 표적 사이트 하류 서열(표적 부위의 하류 서열)는 표적 사이트 후였다. 무작위로 설계된 비-상동 서열을 표적 사이트에 삽입하여 유전자 전사 프레임워크를 형성하는 서열로 추가하고, 유전자 전사 프레임워크가 발현 벡터에 삽입될 수 있도록 유전자 전사 프레임워크의 양쪽 말단에 제한 엔도뉴클레아제 NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기(overhangs)를 추가하였다. 전체 시퀀스는 Seq ID No.4에 나와 있다:
CTAGCTAGCTAG ATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGGTGAGGATGTAGTCACGGATTCATTATCAGCAAGTGGCTGCAGGGTGCCTGATCTGTGCCAGGGTTAAGCATGCTGTACTTTTTGGCCCCCGTCCAGCTTCCCGCTATGTGACCTTTGGCATTTTACTTCAATGTGCCTCAGTTTCTACATCTGTAAAATGGGCACGCTACGGAATAAGAGGAGGCCACAACAGTCGTGGGTCGAATAGTAGTATACTTCATAGCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAA CTAGCTAGCTAG ，여기서, 밑줄이 그어진 부분은 무작위로 설계된 외인성 비상동 서열(즉, 삽입될 서열, 삽입하고자 하는 서열)이고, 길이는 38bp이고, 서열의 2개의 말단은 NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기 (굵은 기울임꼴)였다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, VEGFA1로서 명명하였다. 삽입될 외인성 서열은 VEGFA 유전자의 그 서열과 비상동성인 서열로서 설계되어, 그 게놈의 표적 부위에서의 삽입이 이후 실험에서 특이적으로 검출될 수 있었다.
동시에, VEGFA 유전자에서 표적 사이트 상류 서열 및 하류 서열의 짧은 서열을 벡터에 표적 사이트 전후에 첨가하여 삽입 효과에 대한 길이가 다른 표적 사이트 상류 서열과 표적 사이트 하류 서열의 효과를 확인하였다.
VEGFA 서열의 표적 사이트 전 10bp 및 후 10bp를 선택하여 Seq ID No.5에 나타낸 바와 같이 비상동 서열, NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기를 갖는 서열을 짧은 서열로 설계하였다:
CTAGCTAGCTAG AAATGGGCACGCTACGGAATAAGAGGAGGCCACAACAGTCGTGGGTCGAATAGTAGTA CTAGCTAGCTAG ，그 중에서, 밑줄이 그어진 부분은 38bp 길이의 무작위로 설계된 외인성 비상동 서열(즉, 삽입될 서열), 서열의 양단에서 NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기(굵은 기울임꼴)를 나타내고, 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고 VEGFA2로 명명하였다.
제한 효소 절단 부위의 선택은 플라스미드 구성의 편의를 위한 것일 뿐이며 다른 벡터에 따라 변경될 수 있다.
VEGFA1 및 VEGFA2를 각각 플라스미드 벡터 pSIL-eGFP에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pSIL-eGFP-VEGFA1및pSIL-eGFP-VEGFA2를 구축하였다.
VEGFA1, VEGFA2 및 플라스미드 pSIL-eGFP를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 1에 나타내었다:
[표 1] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 VEGFA1 또는 VEGFA2을 플라스미드 벡터 pSIL-eGFP 로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 2에 나타내었다:
[표 2] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pSIL-eGFP-VEGFA1 및 pSIL-eGFP-VEGFA2을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
pSIL-eGFP플라스미드는 그 자신의 CMV 프로모터를 운반하기 때문에, 발현 프레임워크가 CMV 프로모터 내로 삽입되는 한 RNA 중합효소 II에 의해 전사가 개시될 수 있다.
Alu 발현 서열은 Alu 서열, 비상동 서열 (18bp), TTTTT 및 TTTTAA*n을 함께 연결하여 설계되었으며, 여기서 n은 6이고, 그 서열의 두 말단에 SalI 효소 절단 부위 및 상응하는 보호 염기를 추가하여 Seq ID No.6에 나타낸 서열을 수득하였다：
여기서 양단의 이탤릭체는 굵게 표시된 SalI 소화 부위 및 해당 보호 염기이고, 상류 SalI 소화 부위와 해당 보호 염기 뒤에는 Alu 서열이 따르고, 밑줄은 Alu에 첨가 한 후 비 상동 서열 (18bp)이며, 이는 Alu를 표지하는 데 사용되며, 이는 유전자 전사 프레임 워크 (삽입할 서열 포함)의 전사에 의해 생성 된 올가미와 전사 산물의 연결을 쉽게 검출하는 데 사용된다. 실험의 작용 메커니즘을 확인하기 위해 물결 선은 전사의 종결자이며 이중 밑줄은 RNA를 DNA로 변환하는 데 사용되는 6 TTTTAA의 반복이며, 이는 게놈의 일반적인 반복 서열이다. 여러 항목을 추가하거나 추가하지 않도록 선택할 수 있지만 이 예제에서는 6을 추가한다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고 Alu1로 명명하였다.
Alu1, 플라스미드 pSIL-eGFP-VEGFA1 및 플라스미드 pSIL-eGFP-VEGFA2를 각각 SalI에 의해 분해시켰다. 소화 반응 시스템을 표 3에 나타내었다:
[표 3] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서3시간 동안 인큐베이션하고, 80 ℃로 가열하고, 10분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된Alu1을 플라스미드 벡터pSIL-eGFP-VEGFA1및pSIL-eGFP-VEGFA2로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 4에 나타내었다:
[표 4] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1 (도 16과 같이)및pSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
pSIL-eGFP 플라스미드 자체는 RNA 중합효소 III에 의존하는 프로모터인 U6 프로모터를 운반하기 때문에 Alu 서열이 U6 프로모터 뒤에 삽입되면 Alu 서열(Alu 요소)의 전사가 RNA 중합효소 III에 의해 개시될 수 있다.
pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1 또는 pSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1을 Hela 세포에 형질주입시켜 무작위로 설계된 서열의 삽입 효율을 시험하였다. 삽입 효율을 향상시키기 위해 ORF1p와 ORF2p(LINE)를 발현하는 플라스미드인 pBS-L1PA1-CH-mneo를 Hela 세포에 동시 형질주입시키고 해당 대조군을 설계하였다. 그 실험군과 대조군에서 공동형질주입된 플라스미드를 표 5에 나타내었다.
그룹화
| 그룹 | 공동 형질주입된 플라스미드 |
| 대조군 1 | pSIL-eGFP+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 1 | pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 2 | pSIL-eGFP-VEGFA1+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 3 | pSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 4 | pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1 |
그룹화에서 나타낸 바와 같이, 대조군 1에서, 본래의 pSIL-eGFP 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동-형질주입시켰으며, 이는 유전자 전사 프레임워크 서열 및 Alu1 서열을 포함하지 않았다. 실험군 1에서, pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동-형질주입시켰으며, 이는 VEGFA 유전자의 표적 부위의 상류 및 하류의 긴 서열을 함유하는 유전자 전사 프레임워크, Alu1 서열 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 함유하였다. 실험군 2에서, pSIL-eGFP-VEGFA1 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동-형질주입시켰으며, 이는 VEGFA 유전자 상의 표적 부위의 긴 서열 상류 및 하류를 포함하는 유전자 전사 프레임워크 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 포함하지만, Alu1 서열은 포함하지 않았다. 실험군3에서는 pSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1과 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동 형질주입시키고, VEGFA 유전자의 표적 부위의 상류 및 하류 짧은 서열을 포함하는 유전자 전사 프레임워크, Alu1 서열 및 pBS-L1PA1-CH-mneo; 실험군 4에서 pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1은 형질주입되었으나 pBS-L1PA1-CH-mneo는 형질주입되지 않았으며, 이는 VEGFA 유전자 상의 표적 부위의 상류 및 하류의 긴 서열을 포함하는 유전자 전사 프레임워크 및 Alu1 서열을 포함했지만 pBS-L1PA1-CH-mneo는 포함하지 않았다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
전염 단계는 Hela 세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염한다. 세포의 각 판을 형질주입시키기 위해, 48μg 또는 96μg의 구축된 플라스미드 (실험 그룹에 따라, 단 하나의 플라스미드가 형질주입된 경우 48μg; 2개의 플라스미드를 공동형질주입시킨 경우, 각 플라스미드 48μg, 2개의 플라스미드 총 96μg을 사용함) 300μL 무혈청 DMEM으로 희석하고 완전히 혼합하였다; 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0.25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검출하기 위한 상류 프라이머 서열은 다음과 같이 Seq ID No.7에 제시되어 있다: 5'-CACTGCCACCCAGAAGACTG-3'. 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.8: 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'에 제시되어 있다.
프라이머 쌍 1 및 프라이머 쌍 2를 설계하였고, 여기서 프라이머 쌍 1의 상류 프라이머 서열은 Seq ID No.9: 5'-CCCAGGGTTGTCCCATCT-3'; 및 하류 프라이머 서열은 Seq ID No.10: 5'-CCTCCTCTTATTCCGTAGC-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 1의 상류 프라이머 서열은 완전한 VEGFA 유전자에 위치하고, 표적 사이트(target site)의 상류 서열의 더 상류에 위치하며, 플라스미드가 아니라 게놈에서만 위치하며, 프라이머 쌍 1의 하류 프라이머 서열은 삽입될 무작위로 설계된 비상동 서열의 5' 말단에서 19bp 서열에 위치한다(삽입될 서열). 프라이머 쌍 2의 상류 서열은 Seq ID No.11에 나타내었다: 5'-CACAACAGTCGTGGGTCG-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.12: 5'-GAGGGAGAAGTGCTAAAGTCAG-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 2의 상류 프라이머 서열은 삽입될 랜덤하게 설계된 비-상동 서열(삽입될 서열)의 3' 말단에 있는 18bp 서열에 위치하고, 하류 프라이머 서열은 완전한 VEGFA 유전자, 표적 사이트(target site)의 하류 서열의 하류 서열에 위치하며, 플라스미드가 아니라 게놈에만 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 6에 나타내었다.
[표 6] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 1 및 실험군 1-4으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응사이클:
프라이머 쌍 1: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 50 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
프라이머 쌍 2: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 54 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삽입되는 서열의 삽입의 검출의 증폭곡선에서 지수성장상이 관찰되어 대략 평행한 것으로 확인되었고, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 7및표 8에 나타내었다, 여기서 표 7은 프라이머 쌍 1의 결과이고, 표 8은 프라이머 쌍 2의 결과이다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 1에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열 삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 1 플레이트 1 | 25.63 | N/A | 14.37 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 2 | 25.21 | N/A | 14.79 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 3 | 26.28 | N/A | 13.72 | - | - |
| 대조군1평균 | 14.29±0.44 | 0.00±0.44 | 1.00（0.74-1.36） | ||
| 실험군1플레이트 1 | 26.12 | 25.93 | -0.19 | - | - |
| 실험군1플레이트 2 | 25.54 | 25.42 | -0.12 | - | - |
| 실험군1플레이트 3 | 25.89 | 25.97 | 0.08 | - | - |
| 실험군1평균 | -0.08±0.11 | -14.37±0.11 | 21173.91 (19619.49-22851.48) | ||
| 실험군2플레이트 1 | 25.87 | 38.92 | 13.05 | - | - |
| 실험군2플레이트 2 | 26.33 | 39.16 | 12.83 | - | - |
| 실험군2플레이트 3 | 25.94 | 38.47 | 12.53 | - | - |
| 실험군2평균 | 12.80±0.21 | -1.49±0.21 | 2.81（2.43-3.25） | ||
| 실험군3플레이트 1 | 26.75 | 39.34 | 12.59 | - | - |
| 실험군3플레이트 2 | 25.91 | 38.99 | 13.08 | - | - |
| 실험군3플레이트 3 | 25.68 | 38.94 | 13.26 | - | - |
| 실험군3평균 | 12.98±0.28 | -1.31±0.28 | 2.48（2.04-3.01） | ||
| 실험군4플레이트 1 | 25.92 | 33.21 | 7.29 | - | - |
| 실험군4플레이트 2 | 25.71 | 32.65 | 6.94 | - | - |
| 실험군4플레이트 3 | 26.34 | 33.12 | 6.78 | - | - |
| 실험군4평균 | 7.00±0.21 | -7.29±0.21 | 156.50（135.30-181.02） |
다른 그룹(N/A는 40. 00에 따라 계산)과 비교했을 때, 실험그룹 1의 상대적인 복제 수는 다른 그룹보다 유의하게 높았으며, 통계적 유의성(P < 0.05)이 있어 유전자 전사 프레임워크에서 표적 사이트(표적 부위)의 더 긴 상류 또는 하류 서열과 Alu 요소(SINE) 및/또는 ORF1p 및/또는 ORF2p(LINE)의 적절한 발현으로 유전자 편집이 가장 효율적임을 시사한다.
실험군 2, 3, 4의 상대적 복제수는 대조군 1보다 높았고(N/A는 40.00에 따라 계산) 모든 결과는 통계적 유의성(P < 0.05)을 보였으며, 이는 유전자 편집이 여전히 효과적이지만 덜 효율적임을 시사한다. 유전자 전사 프레임워크에서 표적 사이트(표적 부위)의 더 짧은 상류 또는 하류 서열, 세포 자체의 Alu 요소(SINE)의 낮은 발현 또는 무발현, 또는 ORF1p 및 ORF2p (LINE) 의 발현이 낮거나 없는 조건.
유전자 전사 프레임워크 내의 표적 사이트(표적 사이트, target site)의 양쪽에 충분한 길이의 서열은 효율적인 삽입을 보장하기 위해 올가미의 형성을 용이하게 하는 것이 요구된다.
표적 부위의 더 긴 업스트림 및/또는 다운스트림 서열 또는 ORF1p, ORF2p(LINE) 및/또는 Alu 요소(SINE)의 추가 발현은 편집 효율성을 향상시킬 수 있다.
프라이머 쌍 2에 대한 결과（n=3, `x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열 삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 1 플레이트 1 | 25.43 | N/A | 14.57 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 2 | 25.77 | N/A | 14.23 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 3 | 25.98 | N/A | 14.02 | - | - |
| 대조군1평균 | 14.27±0.23 | 0.00±0.23 | 1.00（0.85-1.17） | ||
| 실험군1플레이트 1 | 25.12 | 25.30 | 0.18 | - | - |
| 실험군1플레이트 2 | 25.84 | 25.61 | -0.23 | - | - |
| 실험군1플레이트 3 | 25.36 | 25.76 | 0.40 | - | - |
| 실험군1평균 | 0.12±0.26 | -14.15±0.26 | 18179.19（15181.22-21769.19） | ||
| 실험군2플레이트 1 | 26.54 | 39.02 | 12.48 | - | - |
| 실험군2플레이트 2 | 25.89 | 38.75 | 12.86 | - | - |
| 실험군2플레이트 3 | 26.30 | 39.43 | 13.13 | - | - |
| 실험군2평균 | 12.82±0.27 | -1.45±0.27 | 2.73（2.27-3.29） | ||
| 실험군3플레이트 1 | 25.35 | 38.19 | 12.84 | - | - |
| 실험군3플레이트 2 | 25.09 | 38.48 | 13.39 | - | - |
| 실험군3플레이트 3 | 25.47 | 38.75 | 13.28 | - | - |
| 실험군3평균 | 13.17±0.24 | -1.10±0.24 | 2.14（1.82-2.53） | ||
| 실험군4플레이트 1 | 25.74 | 33.34 | 7.60 | - | - |
| 실험군4플레이트 2 | 26.03 | 32.82 | 6.79 | - | - |
| 실험군4플레이트 3 | 25.29 | 33.37 | 8.08 | - | - |
| 실험군4평균 | 7.49±0.53 | -6.78±0.53 | 109.90（76.11-158.68） |
다른 그룹(N/A는 40. 00에 따라 계산)과 비교했을 때, 실험그룹 1의 상대적인 복제 수는 다른 그룹보다 유의하게 높았으며, 통계적 유의성(P < 0.05)이 있어 유전자 전사 프레임워크에서 표적 사이트(표적 부위)의 더 긴 상류 또는 하류 서열과 Alu 요소(SINE) 및/또는 ORF1p 및/또는 ORF2p(LINE)의 적절한 발현으로 유전자 편집이 가장 효율적임을 시사한다.
실험군 2, 3, 4의 상대적 복제수는 대조군 1보다 높았고(N/A는 40.00에 따라 계산) 모든 결과는 통계적 유의성(P < 0.05)을 보였으며, 이는 유전자 편집이 여전히 효과적이지만 덜 효율적임을 시사한다. 유전자 전사 프레임워크에서 표적 사이트(표적 사이트, 표적 부위)의 더 짧은 상류 또는 하류 서열, 세포 자체의 Alu 요소(SINE)의 낮은 발현 또는 무발현, 또는 ORF1p 및 ORF2p (LINE) 의 발현이 낮거나 없는 조건.
유전자 전사 프레임워크 내의 표적 사이트(표적 사이트, target site)의 양쪽에 충분한 길이의 서열은 효율적인 삽입을 보장하기 위해 올가미의 형성을 용이하게 하는 것이 요구된다.
표적 부위의 더 긴 업스트림 및/또는 다운스트림 서열 또는 ORF1p, ORF2p(LINE) 및/또는 Alu 요소(SINE)의 추가 발현은 편집 효율성을 향상시킬 수 있다.
표 7 및 표 8의 결과에 따르면, 삽입하고자 하는 서열의 양 말단이 게놈 상에서 표적 사이트에 삽입되었고, 이는 삽입하고자 하는 서열이 표적 사이트(target site)에 완전히 삽입되었음을 의미한다. 실험군 1, 2, 3, 4는 비상동 염기서열을 게놈에 완전히 삽입할 수 있었고, 실험군 1이 가장 높은 효율을 보였다.
실시예 2 유전자 전사 프레임워크(삽입할 서열 함유)에 의해 형성된올가미 구조와 부분 SINE 서열(예를 들어 Alu 요소)을 포함하는 RNA 단편(자연 절단 부위에서 절단된 Alu 요소의 전사체) 사이의 접합부를 검출한다.
실시예 1에서 실험군 1과 대조군 1의 형질주입된 세포 총 RNA의 추출:
세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0.25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 세포를 포함하는 용액을 RNase-Free의 원심분리 튜브로 옮기고 300g에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 수집하고 모든 상청액을 버린다. "마그네틱 비드 방법 조직/세포/혈액 총 RNA 추출 키트"의 지침에 따라 총 RNA 추출을 수행한다.
cDNA의 역전사 합성 :
cDNA는 FastKing cDNA 첫 번째 가닥 합성 키트의 지침에 따라 합성되며, 합성 된 cDNA의 농도는 후속 테스트를 위해 UV 분광 광도계에 의해 결정된다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
프라이머 쌍 3은 삽입될 서열을 함유하는 전사 올가미 구조와 Alu 요소의 전사 산물에 의해 생성된 부분 Alu 서열을 함유하는 RNA 단편 사이의 결합을 검출하도록 설계되었다. 상기 상류 프라이머 서열은 Seq ID No.11:5'-CACAACAGTCGTGGGTCG-3'에 나타나 있으며, 상류 프라이머는 삽입될 서열 상에 위치하고; 하류 프라이머 서열은 Seq ID No.13:5'-TACGGGCTCGCCTGATAG-3'에 제시되어 있다. 하류 프라이머는 플라스미드로 구성된 Alu 서열 뒤의 비상동 서열(18bp)에 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 9에 나타내었다.
[표 9] qPCR 반응 시스템
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 3: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 54 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삽입할 서열을 포함하는 올가미 구조와 부분 Alu를 포함하는 RNA 단편 사이의 연결의 전사의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 10에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 3에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH |
삽입하고자 하는 서열을 포함하는올가미구조체와 부분 Alu 서열을 포함하는 RNA 단편 사이의 연결 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 1 플레이트 1 | 18.74 | N/A | 21.26 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 2 | 19.56 | N/A | 20.44 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 3 | 19.17 | N/A | 20.83 | - | - |
| 대조군 1 평균 | 20.84±0.33 | 0.00±0.33 | 1.00（0.80-1.26） | ||
| 실험군 1 플레이트 1 | 19.53 | 29.49 | 9.96 | - | - |
| 실험군 1 플레이트 2 | 18.82 | 28.21 | 9.39 | - | - |
| 실험군 1 플레이트 3 | 18.67 | 28.58 | 9.91 | - | - |
| 실험군 1평균 | 9.75±0.26 | -11.09±0.26 | 2179.83 (1820.35-2610.30) |
대조군 1(N/A는 40. 00에 따라 계산)과 비교했을 때, 실험군 1의 상대적인 복제 수는 통계적 유의성(P < 0.05)으로 유의하게 높았으며, 이는 삽입할 서열을 포함하는 올가미 구조가 실제로 Alu 서열의 RNA(즉, 부분 Alu를 포함하는 RNA 단편)와 연결되어 있음을 시사한다.
표 10으로부터 Alu 서열의 RNA(즉, 부분 Alu를 함유하는 RNA 단편)가 삽입될 서열을 함유하는 RNA와 실제로 연결되어 있음을 알 수 있다.
실시예 3 DNA 매개 외인성 삽입하고자 하는 서열은 게놈 지정 부위에 삽입된다
MMP(matrix metalloproteinase) 유전자 패밀리의 구성원인 MMP2 유전자는 세포외 기질의 구성 요소와 신호에 관여하는 분자를 절단할 수 있는 아연 의존성 효소이다 변환. 이 유전자에 의해 암호화 된 단백질은 콜라겐 분해 효소 A, IV 형 콜라게나제이며, 촉매 부위에 3 개의 피브로넥틴 유형 II 반복을 포함하여, 변성 된 IV 형 및 V 형 콜라겐 및 엘라스틴을 결합한다. 대부분의 MMP 패밀리 구성원과 달리 이 단백질의 활성화는 세포막에서 발생할 수 있다. 이 효소는 프로토도메인을 제거하기 위해 단백질 가수분해를 할 필요 없이 S-글루타티온을 통해 프로테아제에 의해 세포외에서 활성화될 수 있다. 이 단백질은 신경계의 역할, 자궁내막 월경 파열, 혈관 조절 및 전이를 포함한 다양한 경로에 관여하는 것으로 생각된다. 이 유전자의 돌연변이는 윈체스터 증후군 및 결절성 관절병증 골용해(NAO) 증후군과 관련이 있다. 대체 스플라이싱은 서로 다른 하위 유형의 여러 전사 변이체를 인코딩한다.
본 실시예에서는 본 발명의 DNA 매개 게놈 서열 삽입 기술을 확인하기 위해 MMP2 유전자 내로 외인성 서열을 삽입하였다.
인간 게놈에서 MMP2 유전자의 479-bp 서열을 선별하고, 서열은 Seq ID No.14에 나타내었다:
AGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGGACCAGAGAG * GTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAG，이고, 상기 *는 선택된 표적 사이트(표적 사이트)였다. MMP2유전자 내의 표적 사이트 상류 서열 (표적 사이트 상류 서열)은 표적 사이트 전이었고, MMP2유전자 내의 표적 사이트 하류 서열는 표적 사이트 후였다. 무작위로 설계된 비-상동 서열을 표적 사이트에 삽입하여 유전자 전사 프레임워크를 형성하는 서열로 추가하고, 유전자 전사 프레임워크가 발현 벡터에 삽입될 수 있도록 유전자 전사 프레임워크의 양쪽 말단에 제한 엔도뉴클레아제 NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기(overhangs)를 추가하였다. 전체 시퀀스는 Seq ID No.15에 나와 있다:
CTAGCTAGCTAG AGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGGACCAGAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAG CTAGCTAGCTAG ，여기서, 밑줄이 그어진 부분은 무작위로 설계된 외인성 비상동 서열 (즉, 삽입될 서열, 삽입하고자 하는 서열)이고, 길이는 103bp이고, 서열의 2개의 말단은 NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기 (굵은 기울임꼴)였다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, MMP2-1로서 명명하였다. 삽입될 외인성 서열은 MMP2유전자의 그 서열과 비상동성인 서열로서 설계되어, 그 게놈의 표적 부위에서의 삽입이 이후 실험에서 특이적으로 검출될 수 있었다.
동시에, MMP2유전자에서 표적 사이트 상류 서열 및 하류 서열의 짧은 서열을 벡터에 표적 사이트 전후에 첨가하여 삽입 효과에 대한 길이가 다른 표적 부위의 상류 서열과 표적 부위의 하류 서열의 효과를 확인하였다.
MMP2서열의 표적 사이트 전 10bp 및 후 10bp를 선택하여 Seq ID No.16에 나타낸 바와 같이 비상동 서열, NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기를 갖는 서열을 짧은 서열로 설계하였다:
CTAGCTAGCTAG GACCAGAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGG CTAGCTAGCTAG ，그 중에서, 밑줄이 그어진 부분은 103bp 길이의 무작위로 설계된 외인성 비상동 서열(즉, 삽입될 서열), 서열의 양단에서 NheI 효소 절단 부위 및 보호 염기(굵은 기울임꼴)를 나타내고, 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고 MMP2-2로 명명하였다.
제한 효소 절단 부위의 선택은 플라스미드 구성의 편의를 위한 것일 뿐이며 다른 벡터에 따라 변경될 수 있다.
MMP2-1 및 MMP2-2를 각각 플라스미드 벡터 pSIL-eGFP에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-1 및 pSIL-eGFP-MMP2-2를 구축하였다.
MMP2-1、MMP2-2 및 플라스미드 pSIL-eGFP를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 11에 나타내었다:
[표 11] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 MMP2-1또는MMP2-2을 플라스미드 벡터 pSIL-eGFP 로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 12에 나타내었다:
[표 12] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-1및pSIL-eGFP-MMP2-2을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
pSIL-eGFP플라스미드는 그 자신의 CMV 프로모터를 운반하기 때문에, 발현 프레임워크가 CMV 프로모터 내로 삽입되는 한 RNA 중합효소 II에 의해 전사가 개시될 수 있다.
Alu 발현 서열은 Alu 서열, 비상동 서열 (18bp), TTTTT 및 TTTTAA*n을 함께 연결하여 설계되었으며, 여기서 n은 6이고, 그 서열의 두 말단에 SalI 효소 절단 부위 및 상응하는 보호 염기를 추가하여 Seq ID No.17에 나타낸 서열을 수득하였다：
여기서 양단의 이탤릭체는 굵게 표시된 SalI 소화 부위 및 해당 보호 염기이고, 상류 SalI 소화 부위와 해당 보호 염기 뒤에는 Alu 서열이 따르고, 밑줄은 Alu에 첨가 한 후 비 상동 서열 (18bp)이며, 이는 Alu를 표지하는 데 사용되며, 이는 유전자 전사 프레임 워크 (삽입 할 서열 포함)의 전사에 의해 생성 된 올가미와 전사 산물의 연결을 쉽게 검출하는 데 사용된다. 실험의 작용 메커니즘을 확인하기 위해 물결 선은 전사의 종결자이며 이중 밑줄은 RNA를 DNA로 변환하는 데 사용되는 6 TTTTAA의 반복이며, 이는 게놈의 일반적인 반복 서열이다.여러 항목을 추가하거나 추가하지 않도록 선택할 수 있지만 이 예제에서는 6을 추가한다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고 Alu2로 명명하였다.
Alu2, 플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-1 및 플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-2를 각각 SalI에 의해 분해시켰다. 소화 반응 시스템을 표 13에 나타내었다:
[표 13] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서3시간 동안 인큐베이션하고, 80 ℃로 가열하고, 10분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 Alu2을 플라스미드 벡터pSIL-eGFP-MMP2-1및pSIL-eGFP-MMP2-2로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 14에 나타내었다:
[표 14] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2및pSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
pSIL-eGFP 플라스미드 자체는 RNA 중합효소 III에 의존하는 프로모터인 U6 프로모터를 운반하기 때문에 Alu 서열이 U6 프로모터 뒤에 삽입되면 Alu 서열(Alu 요소)의 전사가 RNA 중합효소 III에 의해 개시될 수 있다.
pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2또는pSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2을 U251 세포에 형질주입시켜 무작위로 설계된 서열의 삽입 효율을 시험하였다. 삽입 효율을 향상시키기 위해 ORF1p와 ORF2p(LINE)를 발현하는 플라스미드인 pBS-L1PA1-CH-mneo를 U251 세포에 동시 형질주입시키고 해당 대조군을 설계하였다. 그 실험군과 대조군에서 공동형질주입된 플라스미드를 표 15에 나타내었다.
그룹화
| 그룹 | 공동 형질주입된 플라스미드 |
| 대조군 1 | pSIL-eGFP+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 5 | pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 6 | pSIL-eGFP-MMP2-1+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 7 | pSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 8 | pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2 |
그룹화에서 나타낸 바와 같이, 대조군 1에서, 본래의 pSIL-eGFP 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동-형질주입시켰으며, 이는 유전자 전사 프레임워크 서열 및 Alu2 서열을 포함하지 않았다. 실험군 5에서, pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동-형질주입시켰으며, 이는 MMP2 유전자의 표적 부위의 상류 및 하류의 긴 서열을 함유하는 유전자 전사 프레임워크, Alu2 서열 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 함유하였다. 실험군6에서, pSIL-eGFP-MMP2-1 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동-형질주입시켰으며, 이는 MMP2유전자 상의 표적 부위의 긴 서열 상류 및 하류를 포함하는 유전자 전사 프레임워크 및 pBS-L1PA1-CH-mneo를 포함하지만, Alu2 서열은 포함하지 않았다. 실험군7에서는 pSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2과 pBS-L1PA1-CH-mneo를 공동 형질주입시키고, MMP2유전자의 표적 부위의 상류 및 하류 짧은 서열을 포함하는 유전자 전사 프레임워크, Alu2 서열 및 pBS-L1PA1-CH-mneo; 실험군 8에서 pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2은 형질주입되었으나 pBS-L1PA1-CH-mneo는 형질주입되지 않았으며, 이는 MMP2 유전자 상의 표적 부위의 상류 및 하류의 긴 서열을 포함하는 유전자 전사 프레임워크 및 Alu2서열을 포함했지만 pBS-L1PA1-CH-mneo는 포함하지 않았다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 U251세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
전염 단계는 U251세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염한다. 세포의 각 판을 형질주입시키기 위해, 48μg 또는 96μg의 구축된 플라스미드 (실험 그룹에 따라, 단 하나의 플라스미드가 형질주입된 경우 48μg; 2개의 플라스미드를 공동형질주입시킨 경우, 각 플라스미드 48μg, 2개의 플라스미드 총 96μg을 사용함) 300μL 무혈청 DMEM으로 희석하고 완전히 혼합하였다; 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0.25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검출하기 위한 상류 프라이머 서열은 다음과 같이 Seq ID No.7에 제시되어 있다: 5'-CACTGCCACCCAGAAGACTG-3'. 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.8: 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'에 제시되어 있다.
프라이머 쌍4를 설계하였고, 여기서 프라이머 쌍 4의 상류 프라이머 서열은 Seq ID No.18: 5'-TTTCAGGGTCTAGGTGGC-3'; 및 하류 프라이머 서열은 Seq ID No.19: 5'-AAATGCTTTCTCCGCTCT-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 4의 상류 프라이머 서열은 완전한 MMP2유전자에 위치하고, 표적 사이트(target site)의 상류 서열의 더 상류에 위치하며, 플라스미드가 아니라 게놈에서만 위치하며, 프라이머 쌍 4의 하류 프라이머 서열은 삽입될 무작위로 설계된 비상동 서열(삽입하고자 하는 서열, 삽입될 서열) 상에 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 16에 나타내었다.
[표 16] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 1 및 실험군 5-8으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 4: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 50 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삽입되는 서열의 삽입의 검출의 증폭곡선에서 지수성장상이 관찰되어 대략 평행한 것으로 확인되었고, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 17에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 4에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열 삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 1 플레이트 1 | 25.14 | N/A | 14.86 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 2 | 25.77 | N/A | 14.23 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 3 | 25.49 | N/A | 14.51 | - | - |
| 대조군1평균 | 14.53±0.26 | 0.00±0.26 | 1.00（0.84-1.20） | ||
| 실험군5플레이트 1 | 25.98 | 25.37 | -0.61 | - | - |
| 실험군5플레이트 2 | 25.35 | 25.19 | -0.16 | - | - |
| 실험군5플레이트 3 | 26.06 | 25.77 | -0.29 | - | - |
| 실험군5평균 | -0.35±0.19 | -14.88±0.19 | 30152.71 (26432.04-34397.12) | ||
| 실험군6플레이트 1 | 25.33 | 39.10 | 13.77 | - | - |
| 실험군6플레이트 2 | 25.84 | 39.25 | 13.41 | - | - |
| 실험군6플레이트 3 | 25.12 | 38.37 | 13.25 | - | - |
| 실험군6평균 | 13.48±0.22 | -1.05±0.22 | 2.07（1.78-2.41） | ||
| 실험군7플레이트 1 | 26.39 | 38.89 | 12.50 | - | - |
| 실험군7플레이트 2 | 26.02 | 38.10 | 12.08 | - | - |
| 실험군7플레이트 3 | 25.75 | 38.04 | 12.29 | - | - |
| 실험군7평균 | 12.29±0.17 | -2.24±0.17 | 4.72（4.20-5.31） | ||
| 실험군8플레이트 1 | 25.30 | 30.51 | 5.21 | - | - |
| 실험군8플레이트 2 | 25.88 | 31.34 | 5.46 | - | - |
| 실험군8플레이트 3 | 25.21 | 31.26 | 6.05 | - | - |
| 실험군8평균 | 5.57±0.35 | -8.96±0.35 | 498.00（390.72-634.73） |
다른 그룹(N/A는 40. 00에 따라 계산)과 비교했을 때, 실험그룹 5의 상대적인 복제 수는 다른 그룹보다 유의하게 높았으며, 통계적 유의성(P < 0.05)이 있어 유전자 전사 프레임워크에서 표적 사이트(표적 부위)의 더 긴 상류 또는 하류 서열과 Alu 요소(SINE) 및/또는 ORF1p 및/또는 ORF2p(LINE)의 적절한 발현으로 유전자 편집이 가장 효율적임을 시사한다. 실험군 6, 7, 8의 상대적 복제수는 대조군 1보다 높았고(N/A는 40. 00에 따라 계산) 모든 결과는 통계적 유의성(P < 0.05)을 보였으며, 이는 유전자 편집이 여전히 효과적이지만 덜 효율적임을 시사한다. 유전자 전사 프레임워크에서 표적 사이트(표적 부위)의 더 짧은 상류 또는 하류 서열, 세포 자체의 Alu 요소(SINE)의 낮은 발현 또는 무발현, 또는 ORF1p 및 ORF2p (LINE) 의 발현이 낮거나 없는 조건. 유전자 전사 프레임워크 내의 표적 사이트의 양쪽에 충분한 길이의 서열은 효율적인 삽입을 보장하기 위해 올가미의 형성을 용이하게 하는 것이 요구된다. 표적 부위의 더 긴 업스트림 및/또는 다운스트림 서열 또는 ORF1p, ORF2p(LINE) 및/또는 Alu 요소(SINE)의 추가 발현은 편집 효율성을 향상시킬 수 있다.
실시예 4 유전자 전사 프레임워크(삽입할 서열 함유)에 의해 형성된올가미 구조와 부분 SINE 서열(예를 들어 Alu 요소)을 포함하는 RNA 단편(자연 절단 부위에서 절단된 Alu 요소의 전사체) 사이의 접합부를 검출한다.
실시예 3에서 실험군5과 대조군 1의 형질주입된 세포 총 RNA의 추출:
세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0.25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 세포를 포함하는 용액을 RNase-Free의 원심분리 튜브로 옮기고 300g에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 수집하고 모든 상청액을 버린다. 마그네틱 비드 방법 조직/세포/혈액 총 RNA 추출 키트의 지침에 따라 총 RNA 추출을 수행한다.
cDNA의 역전사 합성 :
cDNA는 FastKing cDNA 첫 번째 가닥 합성 키트의 지침에 따라 합성되며, 합성 된 cDNA의 농도는 후속 테스트를 위해 UV 분광 광도계에 의해 결정된다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No.7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
프라이머 쌍 5은 삽입될 서열을 함유하는 전사 올가미 구조와 Alu 요소의 전사 산물에 의해 생성된 부분 Alu 서열을 함유하는 RNA 단편 사이의 결합을 검출하도록 설계되었다. 상기 상류 프라이머 서열은 Seq ID No.20:5'-GGCATAATGATGTGGCTGTT-3'에 나타나 있으며, 상류 프라이머는 삽입될 서열 상에 위치하고; 하류 프라이머 서열은 Seq ID No.21:5'-TCTGTTGGCTCGCTCTTG-3'에 제시되어 있다. 하류 프라이머는 플라스미드로 구성된 Alu 서열 뒤의 비상동 서열(18bp)에 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 18에 나타내었다.
[표 18] qPCR 반응 시스템
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 5: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 52 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삽입할 서열을 포함하는 올가미 구조와 부분 Alu를 포함하는 RNA 단편 사이의 연결의 전사의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 19에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 5에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH |
삽입하고자 하는 서열을 포함하는올가미 (lariat)구조체와 부분 Alu 서열을 포함하는 RNA 단편 사이의 연결 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 1 플레이트 1 | 18.53 | N/A | 21.47 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 2 | 19.16 | N/A | 20.84 | - | - |
| 대조군 1 플레이트 3 | 18.92 | N/A | 21.08 | - | - |
| 대조군 1 평균 | 21.13±0.26 | 0.00±0.26 | 1.00（0.84-1.20） | ||
| 실험군 5 플레이트 1 | 19.68 | 28.76 | 9.08 | - | - |
| 실험군 5 플레이트 2 | 18.89 | 27.91 | 9.02 | - | - |
| 실험군 5 플레이트 3 | 19.25 | 27.67 | 8.42 | - | - |
| 실험군 5평균 | 8.84±0.30 | -12.29±0.30 | 5007.93 (4067.71-6165.49) |
대조군 1(N/A는 40. 00에 따라 계산)과 비교했을 때, 실험군 5의 상대적인 복제 수는 통계적 유의성(P < 0.05)으로 유의하게 높았으며, 이는 삽입할 서열을 포함하는 올가미 구조가 실제로 Alu 서열의 RNA(즉, 부분 Alu를 포함하는 RNA 단편)와 연결되어 있음을 시사한다. 표 19으로부터 Alu 서열의 RNA(즉, 부분 Alu를 함유하는 RNA 단편)가 삽입될 서열을 함유하는 RNA와 실제로 연결되어 있음을 알 수 있다.
실시예 5 본 발명에서 유전자 편집 기술의 타겟팅 정확도를 시험하기 위해
Seq ID No.15에 표시된 서열에서 무작위로 설계된 비상동 서열(즉, 삽입할 서열)의 상류 5bp~10bp(총 6bp 서열)를 CGATGA으로 대체하여 Seq ID No.22에 표시된 서열을 얻는다.
이 시퀀스에서 물결 부분은 원래 GACCAG였으며 CGATGA으로 대체되었으며 나머지 시퀀스는 Seq ID No. 15와 동일하다. 서열은 화학적 합성에 의해 얻어졌고, MMP2-3로 명명되었다.
MMP2-3은 플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2를 얻기 위해 실시예 3의 방법을 사용하여 제조하였다.
플라스미드 pSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2를 U251 세포(인간 신경교종)에 형질주입시키고, ORF1p 및 ORF2p(LINE)를 발현하는 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo도 U251 세포에 공동형질주입시켰다를 실험군으로, 및 상기 언급된 세포는 pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2 및 pBS-L1PA1-CH-mneo로 공동형질주입되었다를 대조군으로 하였다. 구체적인 그룹화는 표 20에 나와 있다.
그룹화
| 그룹 | 공동 형질주입된 플라스미드 |
| 대조군 2 | pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2+pBS-L1PA1-CH-mneo |
| 실험군 9 | pSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2+pBS-L1PA1-CH-mneo |
각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 U251 세포로 배양된 6웰 플레이트였다. 형질주입 및 형질주입 후 세포 DNA의 추출의 방법은 실시예 3과 동일하였다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복제 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내부 참조 유전자로 사용한다.
GAPDH 유전자의 상류 프라이머 서열은 Seq ID No.7에 나타내고, 하류 프라이머 서열은 Seq ID No.8에 나타내었다.
프라이머 쌍 4를 이용한 qPCR 검출, qPCR 검출을 위해 실시예 3의 qPCR 반응 시스템 및 반응 사이클을 사용하였다.
GAPDH와 삽입하고자 하는 서열의 삽입의 검출의 증폭곡선에서 지수성장상이 관찰되어 대략 평행한 것으로 확인되었고, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 21에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 4（n=3, x±s）에 대한 결과
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열 삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 2 플레이트 1 | 25.23 | 25.74 | 0.51 | - | - |
| 대조군 2 플레이트 2 | 25.98 | 26.10 | 0.12 | - | - |
| 대조군 2 플레이트 3 | 25.45 | 25.63 | 0.18 | - | - |
| 대조군 2 평균 | 0.27±0.17 | 0.00±0.17 | 1.00（0.89-1.13） | ||
| 실험군 9 플레이트 1 | 26.79 | N/A | 13.21 | - | - |
| 실험군 9 플레이트 2 | 25.97 | N/A | 14.03 | - | - |
| 실험군 9 플레이트 3 | 26.26 | N/A | 13.74 | - | - |
| 실험군 9 평균 | 13.66±0.34 | 13.39±0.34 | 9.32Х10-5 (7.36Х10-5-11.79Х10-5) |
표 21에서 알 수 있는 바와 같이, 실험군의 상대적 복제수는 대조군보다 현저히 낮았으며(N/A는 40.00에 따라 계산됨), 통계적으로 유의하였는데(P<0.05), 이는 벡터의 표적 사이트(표적 부위)의 상류 서열이 게놈 상의 표적 사이트(표적 부위)의 상류 서열과 일치하지 않을 때, 게놈의 표적 부위에 서열을 삽입하는 것은 어려웠다. 따라서, 본 발명에 의해 구현된 유전자 편집은 높은 표적화 정확도를 갖는다.
실시예 6: 삽입하고자 하는 외인성 서열을 삽입하기 위한 SINE 서열(Alu 서열) 직접 연결 방법의 적용
IT15 유전자는 헌팅턴병의 원인 유전자로서, 본 실시예에서는 IT15 유전자에 외인성 서열을 삽입하여 DNA 매개 직접 결찰 방법인 SINE 서열(Alu 서열를 예로 들어 보겠다)을 일례로 취함 유전체 서열 삽입 기술을 확인하였다.
인간 게놈에서 유전자 IT15의 160bp 서열을 Seq ID No.23과 같이 선별하였다:
ATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACATGTGTGCAGTTACAG * AAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCA，여기서 *는 선택된 표적 사이트(target site)이고, 삽입 전 부위는 IT15 유전자의 표적 사이트 상류 서열(표적 사이트 상류 서열)이고, 삽입 후 부위는 IT15 유전자의 표적 사이트의 하류 서열(표적 사이트 하류 서열)이다.
무작위로 설계된 비상동 서열을 삽입할 서열로 표적 사이트에 추가하고, 부분 Alu 서열을 표적 부위의 서열 하류의 하류에 연결하여 유전자 전사 프레임워크가 되도록 하고, 유전자 전사 프레임워크를 발현 벡터에 삽입할 수 있도록 하기 위해, 제한 효소 NheI 소화 부위 및 보호 염기가 양쪽 말단에 추가되고, 완전한 서열은 Seq ID No.24에 나타내었다.
여기서 밑줄은 길이가 60bp인 무작위로 설계된 외인성 비상동 서열(즉, 삽입하고자 하는 서열)을 나타내고, 서열의 양쪽 끝에는 NheI 소화 부위와 보호 염기(이탤릭체 굵은 글씨)가 있다. IT15 유전자의 표적 사이트 하류 서열과 3' 말단의 NheI 소화 부위 및 보호 염기 서열 사이에는 부분 Alu 서열(음영 부분)이 있다. 이 서열은 화학 합성에 의해 얻어졌고 IT15-1로 명명되었다.
부분 Alu 서열을 표적 사이트 하류 서열 하류 위치에 연결하는 선택은 유기체의 특정 구조에 의해 형성된 특정 상태를 모방하기 위해 선택된다. 이 상태는 SINE (Alu 요소)의 세포 내 작용 (SINE 전사체의 자연 전단 부위에서 절단)에 의해 생성 된 역전사 기능을 보존하는 구조이며, pre-mRNA의 전단에 의해 생성 된 올가미 구조와 연결된다.
플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo에 IT15-1을 삽입하고 도 17과 같이 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1을 구성하며, 구체적인 과정은 다음과 같다.
IT15-1 및 pBS-L1PA1-CH-mneo는 별도로 소화되었고, 반응 시스템은 표 22에 나타내었다 :
[표 22] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 IT15-1을 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 23에 나타내었다:
[표 23] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
pBS-L1PA1-CH-mneo 플라스미드는 그 자신의 CMV 프로모터를 운반하기 때문에, 발현 프레임워크가 CMV 프로모터 내로 삽입되는 한 RNA 중합효소 II에 의해 전사가 개시될 수 있다.
실험군: 형질주입된 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1 플라스미드를 실험군 10으로 설정하였다; 조작되지 않은 pBS-L1PA1-CH-mneo 플라스미드로 형질주입된 군을 대조군 3으로 설정하였다. 각 그룹에는 3개의 평행선이 설정되었고, 각 평행선은 Hela 세포가 배양된 6-웰 플레이트였다.
전염 단계는 Hela 세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염한다. 플레이트당 세포의 형질주입을 위해 300μL의 무혈청 DMEM으로 희석한 48μg의 구성된 플라스미드를 취하고 잘 혼합한다; 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0.25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 6: Seq ID No.25에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-GAAATTGGTTTGAGCAGGAG-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.26: 5'-CGATTGGATGGCAGTAGC-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 6의 상류 프라이머 서열은 무손상 IT15 유전자에 위치하고, 플라스미드가 아닌 게놈에서만 사용되는 표적 사이트(표적 부위)의 서열 상류에 위치하고, 프라이머 쌍 6의 하류 프라이머 서열은 무작위로 설계된 비상동 서열 (삽입될 서열) 상에 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 24에 나타내었다.
[표 24] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 3 및 실험군 10으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 6: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 50 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삽입하고자 하는 서열의 삽입의 검출의 증폭곡선에서 지수성장상이 관찰되어 대략 평행한 것으로 확인되었고, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 25에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 6에 대한 결과（n=3, `x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 3 플레이트 1 | 26.72 | N/A | 13.28 | - | - |
| 대조군 3 플레이트 2 | 27.49 | N/A | 12.51 | - | - |
| 대조군 3 플레이트 3 | 27.65 | N/A | 12.35 | - | - |
| 대조군 3 평균 | 12.71±0.41 | 0.00±0.41 | 1.00（0.75-1.33） | ||
| 실험군 10 플레이트 1 | 25.94 | 25.31 | -0.63 | - | - |
| 실험군 10 플레이트 2 | 26.67 | 25.59 | -1.08 | - | - |
| 실험군 10 플레이트 3 | 25.85 | 25.10 | -0.75 | - | - |
| 실험군 10 평균 | -0.82±0.19 | -13.53±0.19 | 11828.67 (10369.08-13493.72) |
표 25에서 알 수 있듯이 실험군 10의 상대적 복제수는 대조군 3의 상대적인 복제수(N/A는 40.00에 따라 계산됨)보다 유의하게 높았으며, 이는 통계적으로 유의하며(P<0.05), 이는 삽입하고자 하는 서열이 게놈의 표적 사이트에 효율적으로 삽입됨을 나타낸다.
실시예 7 본 발명에서 유전자 편집 기술의 타겟팅 정확도를 시험하기 위해
Seq ID No.24에 표시된 서열에서 무작위로 설계된 비상동 서열(즉, 삽입하고자 하는 서열)의 상류 10bp~15bp(총 6bp 서열)를 GGACAT으로 대체하여 Seq ID No.27에 표시된 서열을 얻는다.
이 시퀀스에서 물결 부분은 원래 TGTGTG였으며 GGACAT으로 대체되었으며 나머지 시퀀스는 Seq ID No.24와 동일하다. 서열은 화학적 합성에 의해 얻어졌고, IT15-2로 명명되었다.
IT15-2를 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo에 삽입하고, 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-2를 구축하고, 방법은 실시예 6을 참조한다.
Hela 세포를 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-2 플라스미드로 형질주입시킨 실험군 11; Hela 세포군을 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1 플라스미드로 형질주입시킨 군은 대조군 4였다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
실시예 6의 방법은 qPCR 검출을 위해 형질주입된 세포 DNA의 형질주입 및 추출을 위해 사용되었다.
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복제 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내부 참조 유전자로 사용한다.
GAPDH 유전자의 상류 프라이머 서열은 Seq ID No.7에 나타내고, 하류 프라이머 서열은 Seq ID No.8에 나타내었다.
실시예 6과 같이 qPCR, 반응 시스템 및 반응 사이클에 프라이머 쌍 6을 사용한다.
GAPDH와 삽입하고자 하는 서열의 삽입의 검출의 증폭곡선에서 지수성장상이 관찰되어 대략 평행한 것으로 확인되었고, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 26에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 6（n=3, x±s）에 대한 결과
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 4 플레이트 1 | 25.49 | 24.73 | -0.76 | - | - |
| 대조군 4 플레이트 2 | 25.66 | 25.04 | -0.62 | - | - |
| 대조군 4 플레이트 3 | 25.89 | 25.67 | -0.22 | - | - |
| 대조군 4 평균 | -0.53±0.23 | 0.00±0.23 | 1.00（0.85-1.17） | ||
| 실험군 11 플레이트 1 | 25.52 | N/A | 14.48 | - | - |
| 실험군 11 플레이트 2 | 25.14 | N/A | 14.86 | - | - |
| 실험군 11 플레이트 3 | 24.78 | N/A | 15.22 | - | - |
| 실험군 11 평균 | 14.85±0.30 | 15.38±0.30 | 2.35Х10-5 (1.90Х10-5-2.89Х10-5） |
실험군의 상대적 복제수는 대조군보다 현저히 낮았으며(N/A는 40.00에 따라 계산됨), 통계적으로 유의하였는데(P<0.05), 이는 벡터의 표적 사이트(표적 부위)의 상류 서열이 게놈 상의 표적 사이트(표적 부위)의 상류 서열과 일치하지 않을 때, 게놈의 표적 부위에 서열을 삽입하는 것은 어려웠다.
결론: 본 발명에 의해 구현된 게놈 서열 삽입은 높은 표적화 정확도를 갖는다.
상기 실시예 1 내지 실시예 6으로부터, 게놈 지정 부위에 DNA 매개 외인성 서열을 삽입하는 방법은 진핵세포(예: 세포주 또는 일차세포)의 유전자 편집이 효과적일 수 있으며, 삽입하고자 하는 서열이 높은 효율과 정확도로 표적 사이트를 표적화하는 방법임을 알 수 있다. 서로 다른 조직 세포를 편집하는 타당성으로부터, 이 방법은 다양한 세포, 조직 및 유기체 (살아있는 유기체)에 적용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: DNA 매개 게놈에서 지정 영역 서열 (삭제하고자 하는 서열) 삭제
인간 게놈에서 유전자 MINK1의 서열은 Seq ID No.28에 나타낸 바와 같이 무작위로 선택된다:
여기서 밑줄이 그어진 부분은 삭제하고자 하는 서열이다. 삭제하고자 하는 서열 앞에는 삭제하고자 하는 서열의 5' 끝에 바로 인접한 업스트림 서열이다. 삭제하고자 하는 서열 뒤에는 삭제하고자 하는 서열의 3' 끝에 바로 인접한 다운스트림 서열이 온다. 그림자 부분은 삭제하고자 하는 서열의 3' 서열이다.
서열은 다음의 순서로 구성된다: 삭제하고자 하는 서열의 3' 서열 + 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열 + 삭제하고자 하는 서열의 3' 말단에 바로 인접한 하류 서열, NheI 소화 부위 및 상응하는 보호 염기가 양쪽 말단에 추가되고, 서열은 Seq ID No. 29에 나타내었다:
CTAGCTAGCTAG AGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCAGAGAATGAGGGGCCCCTTTTTCTCTCTGGTGGCTCAGGCCCAACTCCCTTCCTACTGGGGAGGCTCACTCCCTCCCCTTTCCCCTCTCCCCCTGGAATGCCCTGCCTCCTGCTGAAAATCCCTCAGGAAGCTCTTCACCTGTCACCTGTTACGGGCCAGGTGCTCTGCAGGTTGCTCTGGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTG CTAGCTAGCTAG , 양쪽 끝의 기울임 꼴과 굵은 부분은 NheI 소화 부위와 해당 보호 기지이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고 MINK1-1로 명명하였다.
동시에, MINK1 유전자와 상동성이 없는 서열을 사용하여 Seq ID No.29에서 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열을 대체하고, 서열은 Seq ID No.30과 같이 얻어진다:
CTAGCTAGCTAG AGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTG CTAGCTAGCTAG ，여기서 밑줄은 MINK1 유전자와 상동성이 아닌 치환된 서열이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, MINK1-2로 명명하였다.
MINK1-1 및 MINK1-2를 각각 플라스미드 벡터 pSIL-eGFP에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pSIL-eGFP-MINK1-1 및 pSIL-eGFP-MINK1-2를 구축하였다.
MINK1-1, MINK1-2 및 플라스미드 pSIL-eGFP를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 27에 나타내었다:
[표 27] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 MINK1-1또는MINK1-2을 플라스미드 벡터 pSIL-eGFP 로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 28에 나타내었다:
[표 28] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pSIL-eGFP-MINK1-1 및 pSIL-eGFP-MINK1-2 을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 Alu1, 플라스미드 pSIL-eGFP-MINK1-1 및 플라스미드 pSIL-eGFP-MINK1-2를 각각 SalI를 이용하여 분해한 후 연결시키고, 반응 시스템 및 조건은 실시예 1과 동일하게 하여 pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1 및 pSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1을 얻었다.
pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1 또는 pSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1을 Hela 세포에 형질주입시켜 삭제하고자 하는 서열의 삭제 효과를 시험하고, 삭제 효율을 향상시키기 위해 ORF1p 및 ORF2p(LINE)를 발현하는 "플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo"를 Hela 세포에 동시 형질주입시키고 해당 대조군을 설계하였다. 그 중, pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneo를 형질주입된 군은 실험군 12로 설정하였고, pSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneo로 형질주입된 군은 대조군 5로 설정하였다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
실시예 1의 방법에 따라, 플라스미드 형질주입이 수행되고, 형질주입된 세포 DNA가 추출된다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 서열; 다운스트림의 지시자 서열는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 7: Seq ID No.31에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-ACAGGGTATGGAGTGGAAAG-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.32: 5'-ATAGACGGGAAAGAAGGAAC-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 7의 상류 프라이머는 삭제가 필요한 게놈의 MINK1 유전자의 서열에 위치하며, 플라스미드에는 존재하지 않는다. 하류 프라이머는 삭제해야하는 게놈의 MINK1 유전자 서열에 위치하며, 플라스미드에는 존재하지 않는다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 29에 나타내었다.
[표 29] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 5 및 실험군 12으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 7: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 50 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삭제하고자 하는 서열의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 30에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 7에 대한 결과（n=3, x±s)
| Ct 값 | GAPDH | 삭제하고자 하는 서열 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 5 플레이트 1 | 24.13 | 23.74 | -0.39 | - | - |
| 대조군 5 플레이트 2 | 24.90 | 24.22 | -0.68 | - | - |
| 대조군 5 플레이트 3 | 24.67 | 23.91 | -0.76 | - | - |
| 대조군 5 평균 | -0.61±0.16 | 0.00±0.16 | 1.00（0.90-1.12） | ||
| 실험군 12 플레이트 1 | 25.26 | 39.13 | 13.87 | - | - |
| 실험군 12 플레이트 2 | 25.44 | 39.06 | 13.62 | - | - |
| 실험군 12 플레이트 3 | 25.85 | N/A | 14.15 | - | - |
| 실험군 12평균 | 13.88±0.22 | 14.49±0.22 | 4.35Х10-5 (3.73Х10-5-5.06Х10-5) |
실험 12 그룹 (40. 00에 따라 계산 된 N / A)의 상대적 사본 수는 대조군 5 그룹보다 현저히 낮았으며, 이는 통계적으로 유의했으며 (P<0.05), 게놈에서 삭제하고자 하는 서열이 삭제되었음을 나타낸다.
실시예 9 SINE 서열 (Alu 서열를 예로 사용) 직접 연결 방법으로 서열 삭제
FMR1 유전자는 유전성 정신 지체 - 취약 X 증후군과 관련이 있으며, Seq ID No. 33과 같이 서열 중 하나가 선택되었다:
여기서 밑줄이 그어진 부분은 삭제하고자 하는 서열이다. 삭제하고자 하는 서열 앞에는 삭제하고자 하는 서열의 5' 끝에 바로 인접한 업스트림 서열이다. 삭제하고자 하는 서열 뒤에는 삭제하고자 하는 서열의 3' 끝에 바로 인접한 다운스트림 서열이 온다. 음영 부분은 삭제하고자 하는 서열의 3' 시퀀스이다.
서열은 다음의 순서로 구성된다: 삭제하고자 하는 서열의 3' 서열 + 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열 + 삭제하고자 하는 서열의 3' 말단에 바로 인접한 하류 서열 + 부분 Alu 서열, NheI 소화 부위 및 상응하는 보호 염기가 양쪽 말단에 추가되고, 서열은 Seq ID No. 34에 나타내었다:
양쪽 끝의 기울임 꼴과 굵은 부분은 NheI 소화 부위와 해당 보호 기지이다. 음영 부분은 부분 Alu 서열이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, FMR1-1로 명명하였다.
동시에, FMR1 유전자와 상동성이 없는 서열을 사용하여 Seq ID No.34에서 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열을 대체하고, 서열은 Seq ID No.35과 같이 얻어진다:
여기서 밑줄은 FMR1 유전자와 상동성이 아닌 치환된 서열이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, FMR1-2로 명명하였다.
FMR1-1 및 FMR1-2를 각각 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2를 구축하였다.
FMR1-1, FMR1-2 및 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 31에 나타내었다:
[표 31] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된FMR1-1또는FMR1-2을 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo 로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 32에 나타내었다:
[표 32] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1및 pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
그 중, pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1를 형질주입된 군은 실험군 13로 설정하였고, pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2로 형질주입된 군은 대조군 6로 설정하였다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
전염 단계는 Hela 세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염된다. 플레이트당 세포의 형질주입을 위해 300μL의 무혈청 DMEM으로 희석한 48μg의 구성된 플라스미드를 취하고 잘 혼합한다; 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0. 25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 8: Seq ID No.36에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-ACAGGGTTACAATTTGGT-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.37: 5'-CATTTGCTCTGGAATACAC-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 8의 상류 프라이머는 삭제가 필요한 게놈의 FMR1 유전자의 서열에 위치하며, 플라스미드에는 존재하지 않는다. 하류 프라이머는 삭제해야하는 게놈의 FMR1 유전자 서열에 위치하며, 플라스미드에는 존재하지 않는다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 33에 나타내었다.
[표 33] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 6 및 실험군 13으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 8: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 45 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삭제하고자 하는 서열의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 34에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 8에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삭제하고자 하는 서열 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 6 플레이트 1 | 25.07 | 25.44 | 0.37 | - | - |
| 대조군 6 플레이트 2 | 25.69 | 26.10 | 0.41 | - | - |
| 대조군 6 플레이트 3 | 25.49 | 25.44 | -0.05 | - | - |
| 대조군 6 평균 | 0.24±0.21 | 0.00±0.21 | 1.00（0.86-1.16） | ||
| 실험군 13 플레이트 1 | 26.40 | N/A | 13.60 | - | - |
| 실험군 13 플레이트 2 | 25.26 | 39.48 | 14.22 | - | - |
| 실험군 13 플레이트 3 | 26.51 | N/A | 13.49 | - | - |
| 실험군 13평균 | 13.77±0.32 | 13.53±0.32 | 8.45Х10-5 (6.77Х10-5-10.55Х10-5） |
실험 13 그룹 (40.00에 따라 계산된 N/A)의 상대적 사본 수는 대조군 6 그룹보다 현저히 낮았으며, 이는 통계적으로 유의했으며 (P<0.05), 게놈에서 삭제하고자 하는 서열이 삭제되었음을 나타낸다.
상기 실시예들로부터 본 발명은 게놈의 임의의 영역에서 임의의 서열을 삭제시키는데 사용된다는 것을 알 수 있다. 동시에, 시퀀싱이 각 유전자의 CNVs 말단을 얻을 때 (즉, 상응하는 유전자 서열이 SINE 서열의 일부를 연결함), CNVs 말단도 편집할 수 있다 : CNV를 편집하기 위해 삽입 또는 삭제 (CNVs 말단) 그들에 의해 가져온 발현 변화에 의해 세포, 조직 또는 살아있는 유기체의 상태를 수정한다.
실시예 10: RNA 매개 게놈에 외인성 삽입하고자 하는 서열의 삽입
인간 게놈에서 유전자 IT15의 서열을 선택하고 해당 서열을 다음 순서로 설계하였다: NheI 소화 인식 부위 및 보호 염기 + 표적 사이트(표적 부위) 상류 서열 + 삽입하고자 하는 서열 + 표적 사이트(표적 부위) 하류 서열 + 부분 Alu 서열 + NheI 소화 인식 부위 및 보호 염기, Seq ID No.38에 나타내어:
상기 밑줄은 삽입될 랜덤하게 설계된 60bp 길이 서열을 나타내고, 이는 IT15 유전자와 상동성이 아니며, 서열의 양쪽 끝에는 NheI 소화 부위와 보호 염기 (기울임 꼴 굵게)가 있다. IT15 유전자 표적 사이트(표적 부위)의 하류 서열과 3'-말단 NheI 소화 부위 및 보호 염기 서열 사이에는 부분 Alu 서열(그림자 부분)이 있다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고 IT15-3으로 명명하였다.
IT15-3를 각각 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3를 구축하였다.
IT15-3 및 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 35에 나타내었다:
[표 35] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 IT15-3을 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo 로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 36에 나타내었다:
[표 36] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
이어서, pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3 및 pBS-L1PA1-CH-mneo 플라스미드를 각각 헬라 세포 내로 형질주입시켰다.
전염 단계는 Hela 세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염한다. 플레이트당 세포의 형질주입을 위해 300μL의 무혈청 DMEM으로 희석한 48μg의 구성된 플라스미드를 취하고 잘 혼합한다; 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 RNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0. 25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 세포를 포함하는 용액을 RNase-Free의 원심분리 튜브로 옮기고 300g에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 수집하고 모든 상청액을 버린다. "마그네틱 비드 방법 조직/세포/혈액 총 RNA 추출 키트"의 지침에 따라 총 RNA 추출을 수행한다.
총 RNA에서 mRNA 추출 :
이전에 추출한 총 RNA 농도를 UV 분광 광도계로 검출하고, 총 RNA 1000ng를 뉴클레아제가 없는 ddH2O로 50μL로 희석하고, TIANSeq mRNA 포획 키트의 지침에 따라 mRNA를 추출하고, 샘플의 일부를 취하여 mRNA 함량을 검출하였다(형질주입을 위한 충분한 mRNA를 얻기 위해 상기 실험 단계를 여러 번 반복함).
실험군: pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3 플라스미드로 형질주입된 헬라 세포로부터 추출한 mRNA를 주어진 군을 실험군 14로 설정하였다; pBS-L1PA1-CH-mneo 플라스미드로 형질주입된 Hela 세포로부터 추출한 mRNA를 부여군은 대조군 7로 설정하였다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
얻어진 mRNA를 Lipofectamine MessengerMAX 형질주입 시약을 이용하여 세포 내로 형질주입시키고, 실험군 14 및 대조군 7에서 6-웰 플레이트에서 배양한 Hela 세포를 형질주입시켰다. 첫 번째 형질 감염은 세포가 40 % 컨플루언시로 성장할 때 수행된다. 형질주입된 세포의 각 웰에 대해 7.5μL의 "Lipofectamine MessengerMAX 형질주입 시약"을 125μL의 무혈청 DMEM 용액으로 희석하고 실온에서 10분 동안 배양한다. 제조된 mRNA 5μg과 무혈청 DMEM 용액 125μL를 혼합한 후, 미리 희석한 125μL의 Lipofectamine MessengerMAX 형질주입 시약과 혼합하여 실온에서 5분간 배양하였다. 생성 된 혼합 용액을 배양 된 세포의 각 웰의 배양 배지에 첨가하고 부드럽게 혼합한다. 셀이 70 % 합류하면 위의 작업을 반복한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0. 25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 6: Seq ID No.25에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-GAAATTGGTTTGAGCAGGAG-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.26: 5'-CGATTGGATGGCAGTAGC-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 6의 상류 프라이머 서열은 무손상 IT15 유전자에 위치하고, 플라스미드가 아닌 게놈에서만 사용되는 표적 사이트(표적 부위)의 서열 상류에 위치하고, 프라이머 쌍 6의 하류 프라이머 서열은 무작위로 설계된 비상동 서열 (삽입될 서열) 상에 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 37에 나타내었다.
[표 37] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 7 및 실험군 14으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 6: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 50 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삽입하고자 하는 서열의 삽입의 검출의 증폭곡선에서 지수성장상이 관찰되어 대략 평행한 것으로 확인되었고, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 38에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 6에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삽입하고자 하는 서열 삽입 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 7 플레이트 1 | 26.05 | N/A | 13.95 | - | - |
| 대조군 7 플레이트 2 | 26.41 | N/A | 13.59 | - | - |
| 대조군 7 플레이트 3 | 26.49 | N/A | 13.51 | - | - |
| 대조군 7 평균 | 13.68±0.19 | 0.00±0.19 | 1.00（0.88-1.14） | ||
| 실험군 14 플레이트 1 | 25.55 | 25.03 | -0.52 | - | - |
| 실험군 14 플레이트 2 | 24.90 | 24.67 | -0.23 | - | - |
| 실험군 14 플레이트 3 | 25.12 | 24.99 | -0.13 | - | - |
| 실험군 14 평균 | -0.29±0.17 | -13.97±0.17 | 16046.82 (14263.10-18053.61） |
표 38에서 알 수 있듯이 실험군 14의 상대적 복제수는 대조군 7의 상대적인 복제수(N/A는 40.00에 따라 계산됨)보다 유의하게 높았으며, 이는 통계적으로 유의하며(P<0.05), 이는 삽입할 서열이 게놈의 표적 부위에 효율적으로 삽입됨을 나타낸다. 는 본 발명의 RNA 경로에 의한 유전자 편집이 효과적임을 나타낸다.
완전한 RNA 매개의 타당성으로 인해, ORF2p 및/또는 ORF1p의 코딩 서열이 편집될 시스템으로 임포트될 서열에 추가되지 않으면, 표적 사이트(target site) 상류 서열 + 삽입하고자 하는 서열 + 표적 사이트(target site) 하류 서열 + SINE 서열(예: Alu 서열), 부분 SINE 서열 또는 SINE 유사 서열의 RNA 생성물은 시험관내에서 ORF2p에 결합하거나 ORF1p 및 ORF2p를 조합함으로써 시험관내에서 RNP-매개 경로를 통해 세포(세포질)로 전달될 수 있다.
실시예 11 CNV말단 는 본 발명에 의해 고정되고 편집된다
유기체에 널리 존재하는 CNV 확장 현상을 바탕으로 각 유전자의 CNV가 말단을 가져야 한다고 추론할 수 있다. 구체적으로, 대응하는 유전자 내의 서열의 세그먼트는 부분 SINE(Alu) 서열에 하류로 연결되고, 유전자 서열은 CNV의 말단에서 부분적 SINE 서열 앞에 상이한 올가미 연결부분 SINE(Alu) 서열(이중-가닥 DNA)에 의해 연속적으로 삽입되고, CNV를 점진적으로 확장시킨다. 엑손은 pre-mRNA에서 절단되어야하기 때문에 인트론의 끝은 올가미를 형성해야하며 겹치는 엑손을 포함하는 올가미는 생성 확률이 낮기 때문에 상대적으로 낮은 발현을 갖는 유전자의 경우 상대적으로 긴 기간이 있어야하며 CNV 말단은 유전자의 인트론 끝에 위치하며 부분SINE(Alu) 서열에 연결된다.
이 예에서는 BRCA1 유전자에서 인트론의 3' 서열을 무작위로 선택하여 다음 예에서 삭제하고자 하는 서열로 선택하였다. BRCA1 유전자의 인트론의 3' 서열은 Seq ID No.39에 나타내었다:
여기서 밑줄 부분은 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 업스트림 서열이고, 밑줄 뒤의 서열은 삭제하고자 하는 서열(특히 BRCA1 유전자에서 인트론의 3' 서열)이고, 물결선은 삭제하고자 하는 서열의 3' 말단 서열이다(다음 예에서 삭제됨, 따라서 이름).
서열은 다음의 순서로 구성된다: 삭제하고자 하는 서열의 3'-말단 서열 + BRCA1 유전자와 상동하지 않는 무작위로 설계된 서열 + 부분 Alu 서열, 및 NheI 소화 부위 및 보호 염기가 서열의 양쪽 말단에 추가되어 서열을 구성한다.
Alu 요소 전사체가 부분적인 Alu 서열만을 포함하는 RNA를 생성하도록 하는 자연 전단 부위가 다른 문헌에서 일관되게 보고되지 않았기 때문에, CNV의 끝에서 부분적인 Alu 서열 불일치로 인한 삽입이 가능하지 않도록 하기 위해, 3개의 가능한 부분 Alu 서열이 합성되고 수입되며(차이점은 5'-말단 서열이 다르다는 점), 관련 서열은 Seq ID No.40, Seq ID No.41, Seq ID No.42와 같이 구성된다.
Seq ID No.40 서열는 다음과 같다:
여기서 밑줄은 랜덤하게 설계된 비상동 서열 (BRCA1 유전자와 상동성이 아닌 서열)을 나타내고, 서열의 양쪽 말단은 NheI 절단 부위 및 보호 염기 (이탤릭체 굵게)이고, 부분 Alu 서열-Alu3 (음영 부분)은 비-상동 서열 및 3' 말단 NheI 절단 부위 및 보호 염기 서열 사이에 위치한다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, BRCA1-1-Alu3로 명명하였다.
Seq ID No.41의 서열는 다음과 같다:
여기서 밑줄은 랜덤하게 설계된 비상동 서열 (BRCA1 유전자와 상동성이 아닌 서열)을 나타내고, 서열의 양쪽 말단은 NheI 절단 부위 및 보호 염기 (이탤릭체 굵게)이고, 부분 Alu 서열-Alu4 (음영 부분)은 비-상동 서열 및 3' 말단 NheI 절단 부위 및 보호 염기 서열 사이에 위치한다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, BRCA1-1-Alu4로 명명하였다.
Seq ID No.42의 서열는 다음과 같다:
여기서 밑줄은 랜덤하게 설계된 비상동 서열 (BRCA1 유전자와 상동성이 아닌 서열)을 나타내고, 서열의 양쪽 말단은 NheI 절단 부위 및 보호 염기 (이탤릭체 굵게)이고, 부분 Alu 서열-Alu5 (음영 부분)은 비-상동 서열 및 3' 말단 NheI 절단 부위 및 보호 염기 서열 사이에 위치한다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, BRCA1-1-Alu5로 명명하였다.
또한, 비상동성 서열(BRCA1 유전자와 상동성이 아닌 서열)을 포함하지 않는 상응하는 서열을 Seq ID No.43, Seq ID No.44 및 Seq ID No.45에 나타낸 바와 같이 설계한다.
Seq ID No.43 서열은:
여기서, Seq ID No.43은 BRCA1-1-Alu3의 비상동 서열을 제거함으로써 수득된다. 서열을 화학 합성에 의해 수득하고 BRCA1-2-Alu3로 명명하였다.
Seq ID No.44 서열는 다음과 같다:
여기서, Seq ID No.44은 BRCA1-1-Alu4의 비상동 서열을 제거함으로써 수득된다. 서열을 화학 합성에 의해 수득하고 BRCA1-2-Alu4로 명명하였다.
Seq ID No.45 서열는 다음과 같다:
여기서, Seq ID No.45은 BRCA1-1-Alu5의 비상동 서열을 제거함으로써 수득된다. 서열을 화학 합성에 의해 수득하고 BRCA1-2-Alu5로 명명하였다.
BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4및BRCA1-2-Alu5를 각각 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5를 구축하였다.
BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5 및 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 39에 나타내었다:
[표 39] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된 BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5을 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 40에 나타내었다:
[표 40] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
그 중, pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5를 형질주입된 군은 실험군 15로 설정하였고, pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5로 형질주입된 군은 대조군 8로 설정하였다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
전염 단계는 Hela 세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염한다. 플레이트당 세포의 형질주입을 위해, 300μL의 무혈청 DMEM으로 희석된 구축된 플라스미드 96μg(각 플라스미드당 32μg)을 취하여 잘 혼합한다. 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0. 25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 9: Seq ID No.46에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-CCCCTTTATCTCCTTCTG-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.47: 5'-ATTTCTCCCATTCCACTT-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 9의 상류 프라이머 서열은 완전한 BRCA1 유전자에서 삭제하고자 하는 서열의 3' 말단 서열의 하류에 위치하고, 플라스미드에 존재하지 않고 게놈에만 존재하며, 프라이머 쌍 9의 하류 프라이머 서열은 완전한 BRCA1 유전자에서 삭제하고자 하는 서열의 3' 말단 서열의 하류, 플라스미드가 아니라 게놈 상에서만에 위치한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 41에 나타내었다.
[표 41] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 8 및 실험군 15으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 9: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 46 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삭제하고자 하는 서열의 3' 서열의 다운스트림 서열 삽입 감지의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 42에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 9에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 다운스트림서열 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 8 플레이트 1 | 24.16 | 23.30 | -0.86 | - | - |
| 대조군 8 플레이트 2 | 23.52 | 22.44 | -1.08 | - | - |
| 대조군 8 플레이트 3 | 24.34 | 23.65 | -0.69 | - | - |
| 대조군 8 평균 | -0.88±0.16 | 0.00±0.16 | 1.00（0.90-1.12） | ||
| 실험군 15 플레이트 1 | 26.07 | 25.69 | -0.38 | - | - |
| 실험군 15 플레이트 2 | 25.47 | 25.18 | -0.29 | - | - |
| 실험군 15 플레이트 3 | 25.83 | 25.43 | -0.40 | - | - |
| 실험군 15평균 | -0.36±0.05 | 0.52±0.05 | 0.70（0.67-0.72） |
실험 15 그룹 (40.00에 따라 계산된 N/A)의 상대적 사본 수는 대조군 8 그룹보다 현저히 낮았으며, 이는 통계적으로 유의했으며 (P<0.05), 이는 실험 그룹 15 내의 CNV 말단의 유전자 부분이 상응하는 완전한 유전자 내의 하류 서열의 더 적은 카피를 갖는다는 것을 의미하며, 이는 CNV 말단으로의 비-상동 서열의 삽입이 CNV 말단의 유전자 부분의 하류 확장을 방해한다는 것을 나타낸다.
결론 : CNV 말단에 비 상동 서열의 삽입이 해당 CNV의 확장을 방해한다는 것을 알 수있다.
실시예 12: CNV 말단의 절단
BRCA1 유전자의 인트론 중 하나의 3' 서열(실시예 11에서 Seq ID No.39에 위치)의 서열을 선택하고, 서열을 삭제하고자 하는 서열의 3' 말단 서열 + 비상동 서열 + 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열 + 부분 Alu 서열의 순서로 합성하고, NheI 소화 부위 및 보호 염기를 양쪽 말단에 첨가하였다. 서열은 Seq ID No.48, Seq ID No.49, 및 Seq ID No.50에 나타내었다.
Seq ID No.48 서열은:
여기서 밑줄은 무작위로 설계된 비상동 서열을 나타내며, 서열의 양쪽 끝에 NheI 소화 부위 및 보호 염기(기울임꼴 굵게)가 있고, 비-상동 서열과 그림자 서열 사이에는 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열이 있고, 그림자 시퀀스는 부분 Alu 서열 - Alu3이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, BRCA1-3-Alu3로 명명하였다.
Seq ID No.49 서열는 다음과 같다:
여기서 밑줄은 무작위로 설계된 비상동 서열을 나타내며, 서열의 양쪽 끝에 NheI 소화 부위 및 보호 염기(기울임꼴 굵게)가 있고, 비-상동 서열과 그림자 서열 사이에는 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열이 있고, 그림자 서열는 부분 Alu 서열 - Alu4이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, BRCA1-3-Alu4로 명명하였다.
Seq ID No.50 서열는 다음과 같다:
여기서 밑줄은 무작위로 설계된 비상동 서열을 나타내며, 서열의 양쪽 끝에 NheI 소화 부위 및 보호 염기(기울임꼴 굵게)가 있고, 비-상동 서열과 그림자 서열 사이에는 삭제하고자 하는 서열의 5' 말단에 바로 인접한 상류 서열이 있고, 그림자 서열는 부분 Alu 서열 - Alu5이다. 서열을 화학적 합성에 의해 수득하고, BRCA1-3-Alu5로 명명하였다.
BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4및BRCA1-3-Alu5를 각각 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo에 삽입하여 다음과 같이 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4및pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5를 구축하였다.
BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4、BRCA1-3-Alu5및 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo를 별도로 분해하고, 반응 시스템을 표 43에 나타내었다:
[표 43] 소화 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 65 ℃로 가열하고, 20분 동안 인큐베이션하여 엔도뉴클레아제 효소를 불활성화시키고, 전기영동하고, 소화된 생성물을 회수하였다.
소화된BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4및BRCA1-3-Alu5을 플라스미드 벡터 pBS-L1PA1-CH-mneo 로 라이게이션하고, 반응 시스템을 표 44에 나타내었다:
[표 44] 연결 반응 시스템
반응 조건은 다음과 같았다: 16 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 리가아제를 불활성화시키기 위해 10분 동안 70 ℃로 인큐베이션하고, 전기영동 및 정제하여 플라스미드 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3, pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5을 수득하였다. 플라스미드가 정확한지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
그 중, pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5를 형질주입된 군은 실험군 16로 설정하였고, pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4 및 pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5로 형질주입된 군은 대조군 9로 설정하였다. 각 그룹에 3개의 평행선을 설정하고, 각 평행선은 Hela 세포로 배양된 6웰 플레이트였다.
전염 단계는 Hela 세포를 6 공판으로 대물림하여 펴는 것이다. 다음 날에는 Entranster-H4000 전염 시약을 적용하여 전염한다. 플레이트당 세포의 형질주입을 위해, 300μL의 무혈청 DMEM으로 희석된 구축된 플라스미드 96μg(각 플라스미드당 32μg)을 취하여 잘 혼합한다; 동시에 120μL의 Entranster-H4000 시약용 300μL의 무혈청 DMEM은 희석하여 충분히 섞은 후 실온은 5min으로 정온한다. 이후 제조된 두 종류의 액체를 혼합하여 충분히 혼합하고 실온을 15min 정치하여 전염 복합물을 만든다. 전염 복합체를 구멍당 2ml의 태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 배양액의 육공판으로 넣어 전염한다. 세포의 길이가 90% 정도까지 융합될 때 대물림되고, 대물림 후 상술한 조작을 반복하며, 세포의 길이가 90% 정도까지 융합된 후 재료를 취하여 후속 조작을 진행한다.
전염 후 세포 DNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0. 25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 이후 혈액/세포/조직 게놈 DNA 추출 시약함의 제품 설명서에 따라 세포 DNA를 추출하고, 자외선 분광 광도계는 DNA 농도를 측정한다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자는 Alu 서열을 포함하지 않고 복사 수가 안정적이기 때문에 GAPDH 유전자를 내삼 유전자로 삼는다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 10: Seq ID No.51에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-GCTTTCTCAGGGCTCTTT-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.52: 5'-GCACCATCTCGGCTCACT-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 10의 상류 프라이머 서열은 삭제하고자 하는 서열에 위치하여 플라스미드에 존재하지 않고 게놈에만 존재하며, 프라이머 쌍 10의 하류 프라이머 서열은 삭제하고자 하는 서열에 위치하여 플라스미드에 존재하지 않고 게놈에만 존재한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 45에 나타내었다.
[표 45] qPCR 반응 시스템
세포 DNA 주형은 형질주입 후 전술한 대조군 9 및 실험군 16으로부터 추출한 DNA였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 10: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 49 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 삭제하고자 하는 서열의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 46에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 10에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH | 삭제하고자 하는 서열 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 9 플레이트 1 | 25.35 | 24.68 | -0.67 | - | - |
| 대조군 9 플레이트 2 | 25.87 | 25.14 | -0.73 | - | - |
| 대조군 9 플레이트 3 | 25.40 | 24.31 | -1.09 | - | - |
| 대조군 9 평균 | -0.83±0.19 | 0.00±0.19 | 1.00（0.88-1.14） | ||
| 실험군 16 플레이트 1 | 26.17 | 25.92 | -0.25 | - | - |
| 실험군 16 플레이트 2 | 26.01 | 25.57 | -0.44 | - | - |
| 실험군 16 플레이트 3 | 25.46 | 25.16 | -0.30 | - | - |
| 실험군 16평균 | -0.33±0.08 | 0.50±0.08 | 0.71（0.67-0.75） |
실험 16 그룹 (40. 00에 따라 계산 된 N / A)의 상대적 사본 수는 대조군 9 그룹보다 현저히 낮았으며, 이는 통계적으로 유의했으며 (P<0. 05), 실험군 16에서 삭제하고자 하는 서열이 삭제되고, CNV 말단의 유전자 부분 서열이 감소된 것으로 나타났다.
실시예 11로부터, 비상동 서열이 그의 추가 확장을 방해하기 위해 CNV 말단에 삽입될 수 있음을 알 수 있고; 실시예 12는 실험군에서 CNV 말단의 유전자 부분의 서열이 대조군의 서열보다 현저히 작다는 것을 보여주며, 이는 CNV가 짧아지는 동안 CNV 말단이 잘리는 것을 나타내며, 본 발명에서 CNV 말단이 관련 방법에 의해 변형될 수 있음을 증명한다. 따라서, 또한, 본 발명의 유전자 편집 방법에서 삽입 지점의 상류의 가이드 서열(즉, 표적 사이트 상류 서열, 표적 부위 상류 서열)을 변경함으로써 게놈 상의 다중 또는 모든 CNV를 변형시킬 수도 있다(CNV 말단을 편집하는 경우, 표적 사이트 상류 서열은 CNV 말단의 유전자 부위 서열일 수 있다).
실시예 13: CNV 말단을 클리핑 후 상응하는 유전자 발현 변화
실시예 12의 실험군 16 및 대조군 9의 세포로부터 총 RNA를 추출한다:
전염 후 세포 RNA 추출: 세포 배양기를 흡입한 후 PBS로 세포를 두 번 씻은 후 적당량의 0. 25% 인슐린을 넣어 소화시키고, 37도에서 총 20min을 소화하며, 5min당 15회 취타(흡화취)를 한다. 세포가 부상하면 혈청을 함유한 완전 배양기 종지 반응을 넣는다. 세포를 포함하는 용액을 RNase-Free의 원심분리 튜브로 옮기고 300g에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 수집하고 모든 상청액을 버린다. 마그네틱 비드 방법 조직/세포/혈액 총 RNA 추출 키트의 지침에 따라 총 RNA 추출을 수행한다.
총 RNA에서 mRNA 추출 :
이전에 추출한 총 RNA 농도를 UV 분광 광도계로 검출하고, 총 RNA 1000ng를 뉴클레아제가 없는 ddH2O로 50μL로 희석하고, TIANSeq mRNA 포획 키트의 지침에 따라 mRNA를 추출하고, 샘플의 일부를 취하여 mRNA 함량을 검출하였다(형질주입을 위한 충분한 mRNA를 얻기 위해 상기 실험 단계를 여러 번 반복함).
cDNA의 역전사 합성 :
cDNA는 FastKing cDNA 첫 번째 가닥 합성 키트의 지침에 따라 합성되며, 합성 된 cDNA의 농도는 후속 테스트를 위해 UV 분광 광도계에 의해 결정된다.
qPCR 검사:
GAPDH 유전자의 발현은 다양한 조직에서 비교적 안정하기 때문에, GAPDH 유전자가 내부 기준 유전자로서 사용된다.
GAPDH 유전자를 검사하는 데 사용: Seq ID No. 7과 같이 업스트림의 유인물의 시퀀스; 다운스트림의 지시자 시퀀스는 Seq ID No. 8과 같다.
디자인 프라이머 쌍 11: Seq ID No.53에 나타낸 바와 같은 이의 상류 프라이머 서열: 5'-CAGAGGACAATGGCTTCCATG-3'; 다운스트림 프라이머 서열은 Seq ID No.54: 5'-CTACACTGTCCAACACCCACTCTC-3'에 제시되어 있다. 프라이머 쌍 11의 상류 프라이머 서열은 BRCA1 유전자에 위치하며 플라스미드에는 존재하지 않고 게놈에만 존재하며, 프라이머 쌍 11의 하류 프라이머 서열은 BRCA1 유전자에 위치하여 플라스미드에는 존재하지 않고 게놈에만 존재한다.
상기 프라이머는 화학적 합성에 의해 얻어진다.
qPCR 반응 시스템을 표 47에 나타내었다.
[표 47] qPCR 반응 시스템
세포 DNA는 각각 전술한 형질주입 후 대조군 9군 및 실험군 16으로부터 추출된 mRNA로부터 합성하였다.
반응 시스템을 얼음 위에 준비하고, 준비 후 반응 튜브의 뚜껑을 덮고, 부드럽게 혼합하고, 모든 성분이 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 짧게 원심분리하였다. 각각의 6-웰 플레이트 세포 샘플을 동시에 3회 반복하였다.
qPCR 반응 사이클:
프라이머 쌍 11: 95 ℃에서 15분 동안 사전 변성; (95 ℃에서 10초 동안 변성, 55 ℃에서 20초 동안 어닐링, 72 ℃에서 20초 동안 연장) 40 사이클. GAPDH 프라이머를 동일한 조건으로 반응시켰다.
GAPDH와 BRCA1의 전사의 증폭 곡선에서 지수 성장 주기를 관찰하고, 그것이 대략 평행임을 확인한 후, 얻어진 데이터는 2-△△Ct법으로 분석하였고, 그 결과를 표 48에 나타내었다. PCR 산물은 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 확인되었다.
프라이머 쌍 11에 대한 결과（n=3, x±s）
| Ct 값 | GAPDH |
BRCA1 | △Ct | △△Ct (실험군의 평균 △Ct - 대조군의 평균 △Ct) | 복사 수의 상대적 양（2-△△Ct） |
| 대조군 9 플레이트 1 | 19.70 | 23.82 | 4.12 | - | - |
| 대조군 9 플레이트 2 | 19.11 | 23.05 | 3.94 | - | - |
| 대조군 9 플레이트 3 | 18.60 | 23.07 | 4.47 | - | - |
| 대조군 9 평균 | 4.18±0.22 | 0.00±0.22 | 1.00（0.86-1.16） | ||
| 실험군 16 플레이트 1 | 20.17 | 24.91 | 4.74 | - | - |
| 실험군 16 플레이트 2 | 19.13 | 24.36 | 5.23 | - | - |
| 실험군 16 플레이트 3 | 20.35 | 25.18 | 4.83 | - | - |
| 실험군 16평균 | 4.93±0.21 | 0.75±0.21 | 0.59（0.51-0.69） |
실험군 16에서의 BRCA1 유전자의 상대적 발현은 대조군 9에서의 BRCA1 유전자의 상대적 발현보다 낮았다. 결과는 통계적으로 유의하였다(P<0.05), 이는 BRCA1 유전자의 CNV 말단 클리핑이 그의 발현의 감소로 이어진다는 것을 시사한다.
결론 : BRCA1 유전자의 발현이 감소하여 CNV의 편집이 해당 유전자의 전사에 영향을 미치고 단백질의 발현과 세포, 조직 또는 유기체의 상태에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
실시예 11 내지 13에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 기초한 CNV 말단을 고정, 연장 및 절단할 수 있으며, 동시에 세포의 유전자 전사 및 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있다. 또한 CNV는 배아 및 개체 발생 발달 및 종양 발생과 같은 생리적 과정에 따라 변하고 세포, 조직 및 개인마다 다르므로 CNV를 편집하면 해당 세포, 조직 및 유기체상태도 변경할 수 있다.
상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 진핵생물에 널리 존재하는 레트로트랜스포존과 이의 역전사 기능을 이용하여 게놈을 편집하며, 이때 관여하는 SINE, LINE 서열 및 관련 단백질은 정상 생물체에 널리 존재하며, 이중 가닥 절단을 생성하지 않고보다 정확한 표적 서열 인식 및 절단, 표적 단편이 게놈에 통합되고 해당 단편을 삭제하고 대체 할 수 있다. 이중 가닥 절단이 없기 때문에 게놈 이중 가닥 DNA 절단의 위험과 예상치 못한 무작위 서열의 도입에 대해 걱정할 필요가 없다. SIN에서의 Alu 요소 서열과 LINE의 LINE-1에 해당하는 기능을 예로 들면, Alu 원소 및 LINE-1은 영장류의 게놈에 널리 분포되어 있으며, 구체적인 실시예에서, 상기 삽입될 서열은 삽입될 서열의 양면(표적 부위의 상류 서열 및 표적 부위의 하류 서열)에 의존하여 게놈 상의 표적 사이트(target site)로 안내되고, 또한, ORF2p는 표적 사이트 상류 서열이 완전히 일치하는 조건에서 게놈의 단일 가닥 DNA 절단을 위해 캐리어 핵산의 3' 말단에서 전단 부위까지만 부드럽게 미끄러질 수 있어 표적 정확도가 크게 향상되고 예상치 못한 절단의 발생을 방지하며 표적화 정확도는 이론적으로 현재 존재하는 다른 유전자 편집 기술보다 높다. 또한, 관심있는 서열, 유전자 및 게놈은 시험관 내에서 필요한 RNA 및 ORF1p 및 ORF2p와 같은 상응하는 단백질을 생성함으로써 형질 감염 중에 DNA 단편을 도입하고 핵에 진입하지 않고 RNA 또는 RNP 경로를 통해 변형 될 수있다. ORF1p (및 ORF2p)의 핵 국소화 기능으로 세포로 형질 감염된 RNA와 단백질을 핵으로 유도 할 수있어 벡터의 핵 진입의 어려움으로 인해 조작하기 어려운 세포를 편집하는 데 유리하다. 동시에, 본 발명은 또한 게놈 상의 CNV를 편집할 수 있어서, CNV가 단백질 발현 등에 직접적으로 영향을 미칠 수 있기 때문에, 본 발명을 통해 CNV가 증가, 감소 또는 안정화(계속 변화할 수 없음)되도록, CNV의 조작은 상응하는 세포의 발현 및 상태를 변화시키거나 안정화시킬 수 있다. 다양한 MIRs 및 LINE-2와 같은 다양한 유형의 SINE 및 LINE이 Alu 원소 및 LINE-1과 상동적이고 기능적으로 유사하기 때문에, 본 발명은 다른 진핵 시스템에도 적용될 수 있다.
다른 유전자 편집 기술과 달리, 본 발명에서 사용되는 관련 메카니즘은 외래 메카니즘 및 시스템의 도입 없이, 유전자 편집을 위한 수용 시스템에 미치는 영향을 감소시키는 정상 유기체에 존재한다. 원핵생물 유래 단백질과 같은 외래계를 도입하지 않고, 이중가닥 절단을 생성하지 않기 때문에, 본 발명은 기존의 다른 유전자 편집 기술보다 임상에 적용하기 용이하다.
Claims (17)
- 유전자 전사 프레임워크에 있어서, 해당 유전자 전사 프레임워크는 5헐′' 방향에 따라 표적 사이트 상류 서열, 삽입하고자 하는 서열, 표적 사이트 하류 서열을 포함하며;
해당 유전자 전사 프레임워크는 RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III를 통하여 전사할 수 있는 한 토막의 DNA 서열이며, 해당 유전자 전사 프레임워크의 전사 생성물 또는 그 전사 생성물의 전환 생성물 중의 표적 사이트 상류 서열 또는 그 상보 서열은 세포 게놈 중 표적 사이트의 상류 서열 또는 그 상보 서열과 교잡할 수 있고, 표적 사이트 하류 서열 또는 그 상보 서열은 세포 게놈 중 상응한 표적 사이트의 하류 서열 또는 그 상보 서열과 교잡할 수 있으며, 해당 표적 사이트 상류 서열과 표적 사이트 하류 서열은 게놈 중 상응한 표적 유전자 서열 중에서 직접적으로 연결되고, 게놈 상의 표적 유전자 서열 중의 표적 사이트 상류 서열과 표적 사이트 하류 서열 사이의 사이트는 바로 삽입하고자 하는 서열의 표적 사이트인 것을 특징으로 하는 유전자 전사 프레임워크. - 제1항에 있어서,
상기 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 유전자 전사 프레임워크. - 벡터 시스템에 있어서, 해당 벡터 시스템은 한 가지 또는 여러 가지 벡터를 포함하고, 해당 한 가지 또는 여러 가지 벡터는,
하나 또는 복수의 1) 제1항의 상기 유전자 전사 프레임워크;
하나 또는 복수의 2) 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소, 및/또는
하나 또는 복수의 3) 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열을 포함하며;
해당 구성 요소 1), 2) 및/또는 3)은 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며;
해당 벡터 상에는 하나 또는 복수의 프로모터를 구비하며, 해당 프로모터는 해당 RNA 중합효소 I 프로모터, RNA 중합효소 II 프로모터 또는 RNA 중합효소 III 프로모터이고, 해당 구성 요소 1), 2) 및/또는 3)의 상류에 위치하며;
해당 벡터 시스템은 DNA, RNA 및/또는 RNP 방법 통하여 매개되는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
구성 요소 1)이 복수일 때, 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며; 구성 요소 2)가 복수일 때, 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며; 구성 요소 3)이 복수일 때, 해당 벡터 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
상기 벡터는 진핵 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 인공 염색체, 파지 벡터, 코스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
상기 벡터는 발현 벡터, 클론 벡터, 시퀀싱 벡터, 전환 벡터, 셔틀 벡터 또는 다기능 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
1)과 2)가 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류에 위치하고, 해당 유전자 전사 프레임워크는 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 하나의 프로모터를 공용하며; 간접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
1)과 3)이 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 해당 유전자 전사 프레임워크의 상류 및/또는 하류에 위치하고, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하며; 간접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크와 해당 하나 또는 복수의 긴 산재 요소, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF1p 코딩 서열, 및/또는 하나 또는 복수의 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
1), 2)와 3)이 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소는 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류 및/또는 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 하류에 위치하며; 해당 짧은 산재 요소 및/또는 부분적 짧은 산재 요소 및/또는 유사 짧은 산재 요소가 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류에 위치할 때, 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 유전자 전사 프레임워크의 상류에 위치하며, 및/또는 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소의 하류에 위치하며; 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소가 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열의 하류에 위치할 때, 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 유전자 전사 프레임워크의 하류에 위치하며; 그리고 해당 유전자 전사 프레임워크, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열 사이는 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하며; 간접적으로 연결될 때, 해당 유전자 전사 프레임워크, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 제3항에 있어서,
2)와 3)이 동일한 벡터 상에 위치할 때, 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소의 상류 및/또는 하류에 위치하고, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로 연결되며; 직접적으로 연결될 때, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하고, 간접적으로 연결될 때, 해당 짧은 산재 요소, 및/또는 부분적 짧은 산재 요소, 및/또는 유사 짧은 산재 요소와 해당 긴 산재 요소 및/또는 ORF1p 코딩 서열 및/또는 ORF2p 코딩 서열은 하나의 프로모터를 공용하거나 또는 하나의 프로모터를 공용하지 않는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템. - 게놈 서열 편집 방법에 있어서,
1) 게놈 중에서 편집하고자 하는 표적 유전자의 삽입하고자 하는 사이트를 선택하고, 삽입하고자 하는 사이트 양쪽의 표적 유전자의 삽입하고자 하는 사이트의 상류 서열과 하류 서열을 결정하는 단계;
2) 제3항 내지 제10항의 어느 한 항의 상기 벡터 시스템을 제조하는 단계;
3) 벡터 시스템을 세포, 조직 또는 생물체에 전환 또는 전달 감염진행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 게놈 서열 편집 방법. - 제3항 내지 제10항의 어느 한 항의 상기 DNA, RNA 및/또는 RNP 방법을 통하여 매개될 수 있는 벡터 시스템의 게놈 임의 영역에서 DNA 서열의 삽입, 삭제, 교체를 진행하는 과정에서의 응용.
- 제12항에 있어서,
상기 DNA 서열은 하나 또는 복수의 CNV 서열, CNV 말단 서열, 짧은 산재 요소 또는 긴 산재 요소 서열인 것을 특징으로 하는 응용. - 제3항 내지 제10항의 어느 한 항의 상기 벡터 시스템의 예방 및/또는 치료암, 유전자 관련 유전병, 신경퇴행성 질환의 약물에서의 응용.
- 제14항에 있어서,
상기 암은 신경교종, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 위암, 대장암, 십이지장암, 백혈병, 전립선암, 자궁내막암, 갑상선암, 림프종, 췌장암, 간암, 흑색종, 피부암, 뇌하수체 종양, 생식세포종양, 수막종, 수막암, 교모세포종, 모든 종류의 성상세포종, 모든 희소돌기아교세포종, 성상세포종, 모든 종류의 뇌실막종, 맥락막 신경총 유두종, 맥락막 신경총암, 척색종, 맥락막 세포 종양, 모든 종류의 신경절 세포 종양, 후각 신경모세포종, 교감신경계 신경모세포종, 송과체 세포 종양, 송과체 모세포종, 수모세포종, 삼차 신경초종, 안면 청신경종, 경정맥 사구종, 혈관종, 혈관 망상술종, 두개인두종 및/또는 과립층 세포 종양인 것을 특징으로 하는 응용. - 제14항에 있어서,
상기 유전자 관련 유전병은 헌팅턴병, 취약 X 증후군, 페닐케톤뇨증, 근육의 가성비대, 미토콘드리아 뇌근병증, 척수성 근위축증, 파킨슨병 중첩 증후군, 백색증, 적록 색맹, 연골 무형성증, 알캅톤뇨증, 선천성 난청, 지중해빈혈, 겸상 적혈구 빈혈, 혈우병, 유전적 변화와 관련된 간질, 근간대증, 근위축증, 근간대성발작, 근긴장이상, 뇌졸중 및 정신분열증, 비타민 D 저항성 구루병, 가족성 선종성 용종증 및/또는 유전성 신염인 것을 특징으로 하는 응용. - 제14항에 있어서,
상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 척수소뇌성 운동실조증, 다계통 위축, 원발성 측삭 경화증, 픽병, 전두측두엽 치매, 루이소체 치매 및/또는 진행 핵상 마비인 것을 특징으로 하는 응용.
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