KR20230126214A - 고분산성 hek293t 세포주 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

고분산성 hek293t 세포주 및 이의 스크리닝 방법 Download PDF

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KR20230126214A
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Abstract

고분산성 HEK293T 세포주 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다. 구체적으로, 무혈청 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주의 스크리닝 방법, 상기 방법으로 스크리닝된 세포주, 및 상기 세포주를 사용하여 바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

고분산성 HEK293T 세포주 및 이의 스크리닝 방법
관련 출원 및 참조 인용
본 출원에서 인용되거나 언급된 모든 문서(본 명세서에 인용된 모든 문헌, 특허, 개시된 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않음)(“본 출원에 인용된 문서”), 본 출원에 인용된 문서에서 인용되거나 언급된 모든 문서, 및 본 출원 또는 임의의 본 출원에 인용된 문서에서 언급된 임의의 제품의 제조업체의 매뉴얼, 설명서, 제품 규격 및 제품 페이지는 모두 참조로서 본 출원에 인용되고, 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 참고문서는 모두 각 문서가 참조로서 인용되는 것처럼 참조로서 본 출원에 인용된다. 본 명세서에서 언급된 임의의 Genbank 서열은 참조로서 본 출원에 인용된다.
본 출원에서 임의의 문서의 인용은 이러한 문서가 본 발명의 선행기술인 것으로 인정하는 것과 다르다.
기술분야
본 출원은 무혈청 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주, 특히 무혈청 현탁 배양에 적응되고 분산성이 우수한 HEK293T 세포주의 스크리닝 방법, 및 상기 방법으로 스크리닝된 HEK293T 세포주, 특히 수탁번호가 CGMCC No.: 21100인 PowerSTM-293T에 관한 것이다. 본 출원은 또한 스크리닝된 세포주, 특히 PowerSTM-293T를 사용하여 바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
유전자 치료와 세포 치료는 비약적인 발전 단계에 접어들었고 생명의학의 가장 유망한 발전 방향이 되었다. 유전자 치료의 주요 목표는 외인성 유전자를 표적 세포 또는 조직에 도입하고 특정 유전자를 대체, 보상, 차단 및 변형하여 질환 치료의 목적을 달성하는 것이다. 유전자 치료에서, 치료 요법의 70%~80%는 바이러스 벡터에 의해 완성된다. 바이러스 벡터는 치료용 외인성 유전자를 표적 부위에 전달하는 핵심 벡터이며, 약물로서 직접 주사되거나 약물 생산을 위한 중요한 원료로 사용될 수 있다. 현재 표적 세포로의 외인성 유전자 도입에 사용되는 바이러스 벡터는 주로 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등 바이러스 벡터로부터 유래된다. 렌티바이러스는 레트로바이러스 벡터의 일종으로 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)을 기반으로 발전된 고효율 벡터이다. 일반적으로 렌티바이러스 벡터의 생산에는 두 가지 방법이 있는데, 하나는 렌티바이러스 패키징 시스템 요소를 안정적으로 발현하는 세포계를 사용하는 것이고; 다른 하나는 일시적 형질감염 방법을 사용하는 것이다. 일시적 형질감염의 패키징 방법은 조작이 간편하고 시간을 절약할 수 있으며, 일시적 형질감염 벡터 시스템에서 많은 전이유전자와 전령 당단백질이 매우 쉽게 교체될 수 있으므로, 일시적 형질감염을 통해 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법이 여전히 가장 일반적으로 사용되고 있다.
인간 배아 신장 세포 293으로도 알려진 HEK293 세포는 레트로바이러스 및 다른 바이러스 벡터 생산에 가장 일반적으로 사용되는 세포이다. 이러한 세포는 인간 배아 신장 세포의 세포계로부터 유래되는 것으로, 형질감염 효율이 높고 배양이 쉬운 특징이 있다. SV40 대형 T 항원 유전자를 HEK293 세포에 형질감염시켜 HEK293T 세포계를 형성한다. HEK293T 세포는 SV40 복제개시점이 포함된 플라스미드를 크게 증폭시키고 단백질 발현을 촉진할 수 있으므로 다양한 유전자의 발현 및 단백질의 생산에 사용된다.
현재 대부분의 렌티바이러스의 생산은 T형 배양병, 플레이트 등 시스템에 소태아혈청을 넣어 HEK293 유래 세포계(예를 들어, 293T 및 293E)를 부착 배양하고 다중 플라스미드의 일시적 형질감염을 통해 패키징하여 바이러스를 얻는다. 세포 및 유전자 치료 연구 개발 회사의 경우, 임상 전 연구, IND 신고 및 임상 시험 기간 동안 바이러스 벡터에 대한 수요량이 제한적이므로, 거의 모든 회사가 부착 세포 HEK293T의 일시적 형질감염을 사용하여 렌티바이러스 벡터를 생산한다. HEK293T 세포의 부착 배양은 일반적으로 세포 공장의 형태이며, 이러한 생산 방식은 주로 배양 단위의 수를 증가시켜 세포의 양을 증가시키는 것에 의존한다. 따라서, 더 많은 수의 바이러스 벡터가 필요한 경우, 종종 많은 공간을 차지하고 많은 노동력이 필요하다.
큰 성장 영역을 얻는 동시에 노동력을 줄이기 위한 한 가지 방법은 렌티바이러스 생산용 세포주를 현탁 배양에 적응시키는 것이다. 현탁 배양은 부착 배양에 비해 세포 밀도를 크게 향상시킬 수 있다. 이 밖에, 무혈청 배지를 사용하여 세포를 배양할 수 있어 최종 제품에 잠재적인 면역원성 물질 오염 및 동물성 성분을 감소시키고, 다운스트림 정제 공정을 단순화하여 제품의 임상 등급으로의 변환을 크게 촉진한다. 현탁 배양의 확장은 배양 단위의 증가에 의한 원래 부착 배양에 비해 배치(batch) 간 차이를 감소시킬 수도 있다. 그러나, HEK293T 세포의 무혈청 현탁 순화 과정에서는 세포가 쉽게 응집되는 문제가 존재한다. 세포의 응집은 많은 벡터 생산용 플라스미드가 세포를 형질감염시킬 수 없고 큰 응집체 중간에 있는 세포는 영양분 부족으로 인해 죽게 될 수 있다. 현재, 세포의 응집을 개선하는 방법은 주로 항응집제를 첨가하는 것이다. 그러나 항응집제를 첨가하면 형질감염 효율이 현저히 감소되어 세포가 렌티바이러스를 형질감염시키지 못하고 패키징할 수 없게 된다.
본 출원의 발명자는 많은 실험을 통해 무혈청 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주의 스크리닝 방법을 찾아냈다. 상기 방법을 통해 분산성이 높고 증식 밀도가 높은 세포주를 스크리닝할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 출원은 무혈청 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은,
i) 혈청 함유 배지에서 부착 배양된 HEK293T 세포를 취하여 무혈청 배지에 넣어 현탁 배양하는 단계, 및
ii) 무혈청 현탁 배양에 적응된 단클론 세포주를 선택하는 단계를 포함한다.
단계 i)의 혈청 함유 배지는 10% 혈청, 예를 들어 10% 소태아혈청을 함유할 수 있다.
단계 i)의 현탁 배양은 37℃ 및 8% CO2 조건에서의 진탕 배양을 포함할 수 있다.
단계 i)의 현탁 배양은 세포 계대배양을 포함할 수 있다.
무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지(Gibco, A35834-01), Expi293 발현 배지(Gibco, A14351-01), FreeStyle™293 발현 배지(Gibco, 12338-018), CD293 AGT 배지(Gibco, 11913-019), EX-CELL®293 무혈청 배지(Sigma, 14571C-1000mL), BanlanCD HEK293 배지(Irvine, 91165), Pro293s-CDM 무혈청 배지(Lonza, 12-765Q), OPM-293 CD03 배지(OPM, 81070-001) 및 Celkey CD HEK293 배지(Jianshun, 10804-19008)로부터 선택될 수 있다. 무혈청 배지는 바람직하게는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지이다.
단계 ii)는 무혈청 현탁 배양에 적응되고 응집되지 않는 단클론 세포주를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 ii)는 반고체 배지에서 세포를 배양하고, 반고체 배지에서 단일 세포를 선택하며, 선택된 세포를 현탁 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 ii)의 선택된 세포의 현탁 배양은 37℃ 및 8% CO2 조건에서의 진탕 배양을 포함할 수 있다. 단계 ii)의 선택된 세포의 현탁 배양은 세포 계대배양, 예를 들어 3세대 이상의 계대배양을 포함할 수 있다.
반고체 배지는 스크리닝 배지가 첨가된 메틸셀룰로오스계 배지일 수 있다.
상기 방법의 실시 과정에서, 항응집제를 첨가할 필요가 없다.
본 출원의 방법에서, 1) 혈청 함유 배지에서 부착 배양된 세포를 혈청 점진적 감소 단계 없이 직접 무혈청 배양하므로 스크리닝 과정을 단축할 수 있고; 2) 무혈청 배지로 세포를 배양하므로, 잠재적인 면역원성 물질 오염 및 동물성 성분을 방지하고, 다운스트림 정제 공정을 단순화하며; 3) LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택된 무혈청 배지를 사용하므로, 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주, 즉 증식 밀도가 높고 분산성이 우수한 HEK293T 세포주를 스크리닝하는데 더욱 유리하고; 4) 항응집제의 사용을 피하므로 세포의 형질감염 효율에 영향을 미치지 않으며; 및 5) 반고체 배지를 사용하므로, 조건에 부합되는 단클론의 스크리닝에 편리하다.
본 출원은 또한 분산성이 높고 증식 밀도가 높은 HEK293T 세포주의 스크리닝에서 LV-MAX 생산 배지(Gibco, A35834-01), Expi293 발현 배지(Gibco, A14351-01) 및 OPM-293 CD03 배지(OPM, 81070-001)로부터 선택된 배지의 용도를 포함한다.
다른 양태에서, 본 출원은 상기 방법으로 스크리닝된 HEK293T 세포주에 관한 것이다.
특히, 본 출원은 2020년 12월 7일에 부다페스트 조약에 따라 중국 일반 미생물 균종 보존 관리 센터(CGMCC)에 보존되며 기탁번호가 CGMCC No.: 21100인 신규 인간 배아 신장 HEK293T 세포주 PowerSTM-293T를 제공한다.
상기 세포주는 무혈청 배지에서 현탁 배양에 의해 성장될 수 있다. 상기 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택될 수 있다.
상기 세포주는 현탁 배양 과정에서 세포 응집이 발생하지 않을 수 있다.
상기 세포주는 바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다.
PowerSTM-293T 세포주는 무혈청 배지에서 현탁 배양에 의해 성장될 수 있고, 증식 밀도가 높으며, 활성이 우수하고, 세포 응집이 발생하지 않으며, 즉 분산성이 높다. 따라서, 현탁 배양 과정에서 항응집제를 별도로 첨가할 필요가 없다. Gibco의 CTS™ 바이러스 생산용 세포(공개 번호: MAN0018590)와 비교하여, PowerSTM-293T의 세포는 배가 시간이 짧고, 바이러스 플라스미드의 형질감염 후 더 많은 바이러스 벡터를 생산한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 바이러스 벡터의 제조에서 스크리닝된 HEK293T 세포주의 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 출원은 PowerSTM-293T를 포함한 본 출원에서 스크리닝된 세포주를 사용하여 바이러스 벡터를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
i) 세포주를 배양하는 단계;
ii) 바이러스 벡터 발현 시스템을 세포주에 도입하는 단계;
iii) 바이러스 벡터의 생산 조건에서 세포주를 배양하는 단계; 및
vi) 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 포함한다.
단계 vi) 이후에, 상기 방법은 바이러스 벡터의 역가를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
단계 i)은 세포주의 현탁 배양을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포주는 37℃ 및 8% ℃ 조건 하에 무혈청 배지에서 진탕 배양된다. 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택될 수 있다.
단계 i)은 세포주의 계대배양을 더 포함할 수 있다.
단계 ii)는 물리적 또는 화학적 형질감염 방법으로 바이러스 발현 시스템을 세포주에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 물리적 형질감염 방법은 전기천공법, 미세주입법 및 유전자총법 등을 포함할 수 있다. 화학적 형질감염 방법은 인산칼슘 공침전, 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 매개되는 형질감염, 및 Lipofectamine(Invitrogen)에 의해 매개되는 형질감염 등을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터 발현 시스템은 패키징 핵산 벡터 및 외피 핵산 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 발현 시스템은 보조 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 발현 시스템은 이종 핵산 함유 전이 핵산 벡터와 같은 이종 핵산 함유 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다. 이러한 핵산 벡터는 플라스미드일 수 있다.
이종 핵산의 길이는 4 kb 이하이다. 이종 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 siRNA와 같은 핵산을 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, 또는 CD269(BCMA)를 표적으로 하는 CAR과 같은 CAR을 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 암배아 항원(CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR, HER2), 티로신 키나아제 수용체(EPHA2) 등을 포함한 성장 및 분화 신호에 관여하는 항원을 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(VEGFR) 등을 포함한 종양 혈관 신생에 관여하는 항원을 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신(tenascin) 단백질 등을 포함한 종양 지지 구조의 종양 스트로마 및 세포외 기질 항원을 표적으로 할 수 있다. 이종 핵산 함유 플라스미드는 pCDH 및 pCMV 등을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, α-레트로바이러스 벡터, γ-레트로바이러스 벡터, 또는 포미 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIN, EIAV 및 VISNA로부터 선택된 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 벡터일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 아데노 관련 바이러스 벡터는 AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 및 AAV10으로부터 선택된다.
레트로바이러스 벡터 발현 시스템은 레트로바이러스 구조 단백질 gag-pol 유전자를 함유하는 벡터, 및 env 유전자 또는 이의 기능적 대체물을 함유하는 핵산 벡터를 포함할 수 있다. env 유전자 또는 이의 기능적 대체물은 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩할 수 있다. 레트로바이러스 벡터 발현 시스템은 보조 유전자 rev 또는 이의 유사 유전자를 함유하는 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터 발현 시스템은 이종 핵산 함유 전이 핵산 벡터와 같은 이종 핵산 함유 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 HIV-1 gag-pol-rev 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩하는 핵산, 및 이종 핵산을 각각 포함하는 3개의 핵산 벡터를 세포주에 도입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조에 사용된다.
일 실시형태에서, 방법은 HIV-1 gag-pol 유전자, HIV-1 rev 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩하는 핵산, 및 이종 핵산을 각각 포함하는 4개의 핵산 벡터를 세포주에 도입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조에 사용된다. 이종 핵산 함유 핵산 벡터는 자가 불활성화 렌티바이러스 긴 말단 반복 서열을 포함할 수 있다.
단계 iii)은 세포주의 현탁 배양을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포주는 37℃ 및 8% ℃ 조건 하에 무혈청 배지에서 진탕 배양된다. 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택될 수 있다.
단계 iii)은 세포 계대배양을 포함할 수 있다.
여기서 개시된 다른 특징 및 이점은 아래의 구체적인 설명 및 실시예에 기초하여 명백해질 것이며, 이러한 구체적인 설명 및 실시예는 제한되는 것으로 간주되어서는 아니된다. 본 출원에서 인용된 모든 인용 문헌, GenBank 등록 번호, 특허 및 개시된 특허 출원은 모두 참조로서 본 명세서에 명확하게 인용된다.
본 출원에서, 특히 특허청구범위에서, 예를 들어 “포함”, “포괄” 등 용어, 예를 들어 “기본적으로 ...로 구성”이라는 용어는 명확하게 서술되지 않은 요소의 존재를 허용함을 유의해야 한다. 본 명세서에서 설명된 본 발명의 양태 및 실시형태는 “포함”, “...로 구성”, 및 “기본적으로 ...로 구성”의 양태 및 실시형태를 포함한다.
본 출원의 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 “하나”, “한 가지” 및 “해당/상기”는 문맥상 명확하게 달리 규정되지 않은 한 복수의 언급된 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “하나/한 가지 분자”에 대한 언급은 2개/2가지 또는 그 이상의 이러한 분자의 조합, 예를 들어 이러한 것들을 선택적으로 포함한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 “약”은 당업자에게 쉽게 알려진 상응한 값에 대한 통상적인 오차 범위를 의미한다. 본 명세서에서 “약” 어느 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 실시형태를 포함(설명)한다.
다음은 예시로서 주어지지만 본 발명이 상기 구체적인 실시형태의 구체적인 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않으며 도면과 결부하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 상이한 배지에서 순화된 세포의 형태를 나타낸다.
도 2는 3가지 무혈청 배지에서 순화된 세포의 성장 곡선을 나타낸다.
도 3은 3가지 무혈청 배지에서 순화된 단클론 세포의 형태를 나타낸다.
도 4는 세포주 PowerSTM-293T의 세포 형태(A) 및 성장 곡선(B)을 나타낸다.
보존 설명: 본 출원에서 언급된 신규 인간 배아 신장 HEK293T 세포주 PowerSTM-293T는 2020년 12월 7일에 부다페스트 조약에 따라 중국 일반 미생물 균종 보존 관리 센터(CGMCC)에 보존되었으며, 기탁번호는 CGMCC No.: 21100이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 출원은 무혈청 현탁 배양에 적응된 세포주의 스크리닝 방법, 및 상기 방법으로 스크리닝된 세포주를 제공한다. 상기 세포주는 분산성이 우수하고 증식 밀도가 높아 고역가의 바이러스 입자 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 사용될 수 있다.
바이러스 벡터
바이러스 벡터는 외인성 유전자를 포함하고 바이러스 입자로 패키징될 수 있으며 외인성 유전자의 전이 및 발현을 매개하고 유기체에 병을 일으키지 않는, 세포에 유전 물질을 전달하기 위해 분자 생물학자가 사용하는 도구이다. 본 발명에서 “이종 핵산”, “이종 유전자”, “외인성 핵산” 또는 “외인성 유전자”는 바이러스에서 자연적으로 존재하지 않는 핵산 또는 유전자를 의미한다. 일반적으로, 이종 핵산 또는 외인성 유전자는 표적 단백질 또는 비번역 RNA를 코딩하는 열린 해독틀을 포함한다.
용어 “바이러스 벡터”, “바이러스 입자” 또는 “바이러스 벡터 입자”는 본 명세서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
공지된 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 등을 포함한다.
레트로바이러스
레트로바이러스 벡터는 인간 유전자 치료 연구에서 가장 많이 사용되는 바이러스 벡터이다. 레트로바이러스는 역전사 효소를 코딩하고 RNA 게놈으로부터 DNA를 생산한 다음 상기 DNA를 숙주 세포 DNA에 삽입할 수 있는, 슈도디플로이드 단일 가닥 RNA 게놈을 포함하는 바이러스 패밀리이다. 모든 레트로바이러스는 gag, pol 및 env의 적어도 3가지 유전자를 포함하고, 이들은 구조 단백질 및 효소(역전사 효소, RNase H, 인테그레이즈, 및 프로테아제)를 코딩하며 바이러스 복제에 필수적이다.
레트로바이러스를 더 잘 이해하기 위해, 먼저 모든 레트로바이러스가 공유하는 핵산 서열을 다음과 같이 해석한다.
긴 말단 반복 서열(LTR): 레트로바이러스 게놈의 기본 구조는 5'-LTR 및 3'-LTR을 포함하고, 레트로바이러스의 생성에 필요한 유전자는 그 사이 또는 그 중간에 위치한다. LTR은 레트로바이러스 통합 및 전사에 필수적이다. 이들은 레트로바이러스 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 서열로 작용할 수 있다(즉, 이들은 시스 작용 유전자임). LTR은 U3, R, U5로 구분되는 3개의 하위 영역으로 구성되는데, U3는 RNA 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래되고; R은 RNA의 양 말단에서 반복되는 서열로부터 유래되며; U5는 RNA 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. 복제 능력을 갖는 바이러스의 생성과 관련된 안전 문제를 해결하기 위해, 3'LTR의 U3 영역에서 하나의 세그먼트를 삭제하여 자가 불활성화(SIN) 벡터를 개발하였으며, 상기 U3 영역은 TATA 박스와 전사 인자 Sp1 및 NF-κB의 결합 부위를 포함한다(Miyoshi H et al., (1998) Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol. 72(10):8150-8157). 역전사 및 감염된 세포로의 통합 후, 해당 결실은 5'LTR로 옮겨져 LTR의 전사 불활성화를 초래한다.
ψ: 레트로바이러스 게놈 5' 말단에 위치한 ψ(psi) 서열을 통해 레트로바이러스 RNA의 캡슐화를 일으킨다. psi 서열의 다운스트림 및 gag 코딩 영역으로 확장되는 서열이 효율적인 레트로바이러스 벡터의 생성에 관여한다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다(Yan Cui et al., (1999) Contribution of viral splice sites and cis-regulatory elements to lentivirus vector function. J. Virol. 73(7):6171-6176).
프라이머 결합 부위(PBS): 레트로바이러스 게놈은 5'-LTR의 U5 영역 뒤에 존재하는 PBS를 포함한다. 상기 부위는 역전사를 시작하는데 필요한 tRNA프라이머에 결합한다.
PPT: 레트로바이러스 게놈은 레트로바이러스 게놈의 3' 말단 근처에 폴리퓨린 단편(PPT)이라고 불리우는 짧은 확장 퓨린을 포함한다. 이러한 PPT는 역전사 과정에서 양성 가닥 DNA 합성을 위한 RNA 프라이머로 작용한다. 복잡한 레트로바이러스(예를 들어, HIV-1)는 DNA 합성의 시작을 위한 두 번째 부위를 제공하는 더 중앙에 위치한 두 번째 PPT(즉, 중앙 폴리퓨린 도메인(cPPT))를 포함한다. cPPT를 코딩하는 레트로바이러스 벡터가 강화된 형질도입 및 전이 유전자 발현을 갖는 것으로 나타났다(Barry SC et al., (2001) Lentivirus vectors encoding both central polypurine tract and posttranscriptional regulatory element provide enhanced transduction and transgene expression. Hum Gene Ther. 12(9):1103-1108).
상기 비코딩 영역의 게놈 구조는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, HIV-1의 비코딩 영역의 게놈 구조에 대한 자세한 내용은 NCBI Genbank의 Genome 등록 번호 AF033819에서 찾을 수 있거나, 또는 HIV-1HXB2(일반적으로 사용되는 HIV-1 참조 균주)의 경우 Genome 등록 번호 K03455에서 찾을 수 있다.
Gag/pol: gag 및 pol 유전자의 발현은 gag와 pol 사이의 번역 프레임시프트에 의존한다. 둘 모두 성숙 과정에서 절단되는 다단백질이다. 레트로바이러스 벡터의 주요 구조 기질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질은 gag에 의해 코딩된다. pol 유전자는, i) 레트로바이러스 RNA 게놈을 이중 가닥 DNA로 역전사시키는데 매우 중요한 역전사 효소; ii) 레트로바이러스 DNA 게놈을 숙주 세포 염색체에 통합시키는 인테그레이즈; 및 iii) 합성된 다단백질을 분해하여 레트로바이러스의 성숙하고 기능적인 단백질을 생성하는 프로테아제를 포함한 바이러스 복제 관련 효소를 코딩한다. 일 실시형태에서, gag 및 pol 단백질을 코딩하는 레트로바이러스 핵산 서열은 Genome 등록 번호 K03455, 예를 들어 염기쌍 790-5105로부터 얻을 수 있는 HIV-1HXB2 서열로부터 유래된다.
Env: env(“외피”) 유전자는 레트로바이러스 외피의 표면 및 막관통 성분(예를 들어, HIV-1의 당단백질 gp120 및 gp41)을 코딩하고 레트로바이러스-세포막 융합에 관여한다. 레트로바이러스 벡터의 조직 형질감염성을 넓히기 위해, 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스로부터 유래된 외피 단백질로 슈도타이핑될 수 있다. 슈도타이핑은 레트로바이러스 벡터 입자의 당단백질(GP)을 변경함으로써 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터를 포함)의 숙주 세포 범위를 확장 또는 변경하는 것을 의미하며, 예를 들어, 다른 외피 바이러스로부터 얻거나 다른 외피 바이러스로부터 유래된 GP 또는 합성/인공 GP를 사용한다. 이의 광범위한 형질감염성 및 높은 벡터 입자 안정성으로 인해, 레트로바이러스 벡터를 슈도타이핑하기 위한 가장 일반적으로 사용되는 당단백질 수포성 구내염 바이러스 GP(VSVg)이다. 그러나, 당업자는 다른 당단백질이 슈도타이핑에 사용될 수 있음을 이해해야 한다(Cronin J et al., (2005) Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5(4):387-398). 슈도타이핑을 위한 바이러스의 선택은 표적으로 할 세포 및/또는 기관의 유형에 따라 달라질 수 있다. env 단백질 또는 이의 기능적 대체물은 수포성바이러스(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스), 리사바이러스(예를 들어, 광견병 바이러스, 모콜라 바이러스(Mokola virus)), 아레나바이러스(예를 들어, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)), 알파바이러스(예를 들어, 로스리버바이러스(RRV), 신드비스바이러스, 셈리키삼림열바이러스(SFV), 베네수엘라말뇌염 바이러스, 필로바이러스(예를 들어, 에볼라바이러스 레스톤 균주, 에볼라바이러스 자이르 균주, 라사바이러스), 알파레트로바이러스(예를 들어, 조류백혈병 바이러스(ALV)), 베타레트로바이러스(예를 들어, 양 폐선종 레트로바이러스(JSRV)), 감마레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV), 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114)), 델타-레트로바이러스(예를 들어, 인간 T-세포 림프 친화성 바이러스 1형(HTLV-1)), 포미바이러스(예를 들어, 인간 포미바이러스), 렌티바이러스(예를 들어, 메디-비스나 바이러스(MVV)), 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV), 호흡기 바이러스(예를 들어, 센다이바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)), C형 간염 바이러스속(예를 들어, C형 간염 바이러스(HCV)), 인플루엔자바이러스(예를 들어, 인플루엔자바이러스 A형) 및 핵다각체병바이러스(예를 들어, 아우토그라파 칼리포니카 다중 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV))로부터 선택된 바이러스로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, env 단백질 또는 이의 기능적 대체물 수포성 구내염 바이러스로부터 얻어지거나 유래된다. 상기 실시형태에서, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSVg)을 사용할 수 있으며, 이는 레트로바이러스 입자가 더 넓은 범위의 숙주 세포를 형질감염시키도록 하고 야생형 외피 단백질의 재조합 생성 기회를 제거한다. 다른 실시형태에서, env 단백질 또는 이의 기능적 대체물을 코딩하는 레트로바이러스 핵산 서열은 Genome 등록 번호 J02428.1의 서열, 예를 들어 염기쌍 3071 내지 4720으로부터 유래된다.
본 명세서에 따른 구조 유전자는 모든 레트로바이러스에 공통적이다. 다른 보조 유전자는 상이한 유형의 레트로바이러스에 존재할 수 있다. 예를 들어, HIV-1과 같은 렌티바이러스는 또한 rev, vif, vpu, vpr, nef 및 tat로 불리우는 6가지 보조 유전자를 포함한다. 다른 레트로바이러스는 본 명세서에 설명된 유전자와 유사한 보조 유전자를 가질 수 있지만 문헌에서와 같은 명칭이 항상 주어지지는 않을 수 있다. 예를 들어 Tomonaga 및 Mikami는 다양한 레트로바이러스 보조 유전자를 설명하였다(Tomonaga K, Mikami T. (1996) Molecular biology of the feline immunodeficiency virus auxiliary genes. J Gen Virol 77(Pt 8): 1611-1621).
Rev: 보조 유전자 rev(“비리온의 조절자”)는 Rev 반응 요소(RRE)에 결합하고 레트로바이러스 전사체의 방출을 촉진하는 보조 단백질을 코딩한다. 상기 유전자의 단백질 산물은 Rev 반응 요소(RRE)를 포함하는 레트로바이러스 mRNA 단편이 세포핵에서 세포질로 방출되도록 허용한다. 복잡한 접힌 구조를 형성하기 위해 RRE 서열을 예측한다. rev의 이러한 특수한 작용은 스플라이싱 및 핵 방출 단계의 긴밀한 결합을 반영한다. RRE 서열은 Genome 등록 번호 K03455, 예를 들어 염기쌍 7622 내지 8479 또는 7769 내지 8146, 특히 염기쌍 7622 내지 8479로부터 얻을 수 있는 HIV-1HXB2 서열로부터 유래될 수 있다.
Rev는 RRE에 결합하여 단일 접합(env, vif, vpr 및 vpu) 또는 비접합(gag, pol 및 게놈 RNA) 바이러스 전사체의 방출을 촉진함으로써, 유전자 번역 및 패키징과 같은 다운스트림 이벤트를 초래한다(Suhasini M, Reddy TR. (2009) Cellular proteins and HIV-1 Rev function. Curr HIV Res. 7(1):91-100). 일 실시형태에서, 바이러스 발현 시스템은 보조 유전자 rev 또는 이와 유사한 유전자(즉, 다른 레트로바이러스 또는 기능적으로 유사한 시스템으로부터 유래됨)를 포함한다. rev 유전자를 포함하면, 특히 RRE 요소가 수송될 전사체에도 포함되어 있으면 레트로바이러스 벡터 게놈의 RNA 전사체가 세포핵에서 세포질로 효과적으로 방출되도록 확보한다. rev 유전자는 Genome 등록 번호 M11840(즉 HIV-1 클론 12cDNA, HIVPCV12 유전자좌)의 염기쌍 970 내지 1320과 적어도 60%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 70%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 선택적인 실시형태에서, rev 유전자는 Genome 등록 번호 K03455.1(즉 인간 면역결핍 바이러스 1형, HXB2)의 염기쌍 5970 내지 6040 및 8379 내지 8653과 적어도 60%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 70%, 80%, 90% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
보조 유전자는 레트로바이러스 복제 및 발병 기전에 역할을 하는 것으로 생각되므로 현재의 많은 바이러스 벡터 생산 시스템에는 이러한 유전자 중 일부가 포함되어 있지 않는다. 일반적으로 존재하는 rev는 예외이거나 rev/RRE 시스템과 유사한 시스템을 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터에서 하나 이상의 보조 유전자 vpr, vif, vpu, tat 및 nef 또는 유사한 보조 유전자를 코딩하는 핵산 서열은 보조 유전자가 레트로바이러스 벡터 입자의 RNA 게놈으로부터 제거되거나 기능적 보조 단백질을 코딩할 수 없도록 파괴될 수 있다. 다른 실시형태에서, 적어도 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 모든 보조 유전자 vpr, vif, vpu, tat 및 nef 또는 유사한 보조 유전자는 상기 보조 유전자가 레트로바이러스 벡터 입자의 RNA 게놈으로부터 제거되거나 기능적 보조 단백질을 코딩할 수 없도록 파괴될 수 있다. 기능적 보조 유전자를 제거할 때 전체 유전자를 제거할 필요가 없으며; 유전자의 일부를 제거하거나 또는 유전자를 파괴하면 된다.
복제 결함 레트로바이러스 벡터 입자를 코딩하는 핵산 서열은 레트로바이러스 벡터 입자가 기반으로 하는 레트로바이러스의 야생형 유전자와 동일하거나 상기 레트로바이러스의 야생형 유전자로부터 유래될 수 있는데, 즉, 서열은 야생형 바이러스에 포함된 유전적으로 또는 다른 방식으로 버전이 변형된 서열일 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 핵산 벡터 또는 숙주 세포 게놈에 도입된 레트로바이러스 유전자는 야생형 유전자 의 코돈 최적화 버전을 의미할 수도 있다.
렌티바이러스 벡터
레트로바이러스 벡터의 일종인 렌티바이러스 벡터는 HIV-1을 기반으로 발전된 유전자 치료 벡터로, 동물 및 인간의 일차 세포 또는 세포계에 표적 유전자를 도입할 수 있다. 렌티바이러스 게놈은 양성 가닥 RNA로, 게놈이 세포에 들어간 후 세포질에서 자체 역전사 효소에 의해 DNA로 역전되어 DNA 사전 통합 복합체를 형성하고 세포핵에 들어간 후 DNA가 세포 게놈에 통합된다. 통합된 DNA는 mRNA를 전사하고 세포질로 돌아가 표적 단백질을 발현한다. 렌티바이러스에 의해 매개된 유전자 발현은 목적 유전자가 숙주 세포 게놈에 통합되고 세포 게놈이 분열함에 따라 분열하기 때문에 지속적이고 안정적이다. 이 밖에, 렌티바이러스는 비분열 세포에 효율적으로 감염되고 통합될 수 있다. 위의 특성으로 인해 렌티바이러스 벡터는 통합되지 않은 아데노바이러스 벡터, 통합율이 낮은 아데노 관련 바이러스 벡터 및 분열 세포만 통합하는 기존의 레트로바이러스 벡터와 같은 다른 바이러스 벡터와 비교하여 추가적인 이점이 있다.
렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스의 게놈을 기반으로 하며 바이러스 활동과 관련된 많은 서열 구조를 제거하여 생물학적으로 안전하다. 그리고, 이 게놈 백본에 임상 또는 연구에 필요한 목적 유전자 서열 및 발현 구조를 도입하여 벡터로 제조한다. 현재의 렌티바이러스 벡터는 패키징, 형질감염, 안정적인 통합에 필요한 모든 유전 정보를 포함하고 있으며 렌티바이러스 벡터 시스템의 주요 구성 부분이다. 외인성 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 세포계의 도움으로 바이러스 패키징을 거쳐 감염성 바이러스 입자가 되고, 이를 수집 및 농축하여 숙주 세포 또는 동물 모델을 직접 감염시킬 수 있음으로써, 세포 또는 생체 조직에서 외인성 유전자의 발현을 구현한다. 연구에 따르면 렌티바이러스 벡터는 신경 세포, 간 세포, 심근 세포, 종양 세포, 내피 세포, 줄기 세포 등 다양한 유형의 세포를 효과적으로 감염시키고 목적 유전자의 장기 발현을 매개할 수 있다. 현재 렌티바이러스는 RNAi 발현 연구에도 널리 사용되고 있다. 렌티바이러스 벡터는 shRNA를 발현하는 고역가 렌티바이러스를 생산할 수 있으며, 주기적 및 비주기적 세포, 줄기 세포, 수정란 및 분화된 자손 세포에서 shRNA를 발현할 수 있고, 다양한 유형의 세포 및 전이 유전자 마우스에서 유전자 발현의 특이적이고 안정적인 기능적 침묵을 구현하며, 일차 인간 및 동물 세포 조직에서 유전자 기능을 신속하고 효율적으로 연구하고 특정 유전자의 발현이 감소된 동물을 생산할 수 있는 가능성을 제공한다.
초기 렌티바이러스 벡터는 HIV-1형 벡터 시스템 및 HIV-2형 벡터 시스템을 포함한 HIV에서 수정되었다. HIV-1은 게놈 구조가 다른 레트로바이러스와 유사한 이중 가닥 RNA 바이러스이며, 3가지 주요 바이러스 구조 단백질을 코딩할 수 있는 유전자, 즉 gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자는 뉴클레오캡시드 단백질(p7), 내막 단백질(p17) 및 캡시드 단백질(p24)과 같은 바이러스의 핵심 단백질을 코딩하고, pol 유전자는 바이러스 복제 관련 효소를 코딩하며, env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩하고 바이러스가 숙주를 감염시키는 표적성을 결정한다. 이 밖에, 바이러스 게놈에는 tat와 rev 2개의 조절 유전자도 포함되어 있는데, rev는 주로 단백질 조절의 발현 수준에 관여하고, 이에 의해 코딩된 단백질은 gag, pol, env의 발현 수준을 조절할 수 있으며, tat에 의해 코딩된 단백질은 RNA 전사의 제어에 관여하고, 바이러스의 긴 말단 반복 서열(LTR)에 결합한 후 바이러스의 모든 유전자의 전사를 촉진한다. 이 밖에, 게놈은 vif, vpr, vpu, nef 4개의 보조 유전자를 더 포함한다. HIV-1의 게놈 구조에는 또한 바이러스 복제 및 패키징 등에 필요한 신호와 같이 바이러스의 생활사에 필요한 다른 서열 구조도 포함되어 있으며, 예를 들어 게놈의 양 말단은 복제에 필요한 시스 작용 요소(cis-acting element)를 포함하는 긴 말단 반복 서열이다.
HIV-1형 렌티바이러스 벡터 시스템의 구축은 벡터의 생물학적 안전성을 점진적으로 향상시키기 위해 점진적인 개선 과정을 거쳤다.
1세대 HIV-1 렌티바이러스 벡터는 3개의 구조 유전자 env, gag 및 pol, 2개의 조절 유전자 tat, rev 및 4개의 보조 유전자 vpr, vif, vpu 및 nef를 포함하는 이중 플라스미드 시스템이며, 양 말단에는 긴 말단 반복 서열(LTR)이 있고, 5'LTR과 gag 사이에는 또한 바이러스 패키징 신호 서열이 있다. 렌티바이러스 벡터의 초기 패키징은 HIV 게놈에서 트랜스 작용(trans-acting) 단백질 유전자 서열을 제거한 후, 표적 유전자를 포함하는 핵산 벡터, 및 바이러스 입자가 필요로 하는 단백질을 트랜스로 제공할 수 있는 패키징 플라스미드를 패키징하는 동시에 숙주 세포(예를 들어, 293T 세포)를 공동 형질감염시키고 패키징하는 것이다. 이것은 복제 결함 벡터 시스템으로, 생성된 바이러스의 역가가 매우 낮아 CD4+ 세포에만 감염이 가능하며 형질감염 과정에서 패키징된 단백질 DNA와 벡터 DNA가 재결합할 수 있어 복제 능력을 갖는 바이러스 시스템 생성의 안전 위험이 있다.
2세대 벡터는 삼중 플라스미드 발현 시스템으로, 즉 HIV-1 게놈에서 패키징, 역전사 및 통합에 필요한 시스 작용 서열 구조, 및 트랜스 작용 단백질을 코딩하는 서열을 분리한 다음, 3개의 독립적인 플라스미드에 클로닝하되, 그 중 하나는 CMV 프로모터를 포함하는 패키징 플라스미드로, env를 제외한 모든 바이러스 구조 유전자의 발현을 제어하며, 테일링 신호로서 3'LTR을 인간 인슐린 유전자의 polyA로 대체하고, 두 번째는 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 유전자를 발현하는 서열을 포함하는 외피 플라스미드로, 이 유전자는 원래 바이러스의 env 유전자를 대체하고, 이 유전자의 산물은 바이러스의 숙주 범위를 향상시킬 수 있으며, 마지막 하나는 연구자가 관심을 갖는 유전자 서열 구조, 및 관련된 모든 시스 작용 요소를 포함한다. 그러나 이 삼중 플라스미드 시스템은 여전히 HIV-1의 보조 유전자를 보유하고 있으며, 이 플라스미드 시스템은 우발적으로 활성 바이러스를 생성할 가능성이 더 높기 때문에 안전 계수가 더 낮은 것으로 간주된다.
3세대 플라스미드 시스템은 HIV 바이러스의 모든 보조 유전자 서열을 제거하며, 이러한 보조 유전자의 제거는 바이러스의 역가 및 형질감염 능력에 영향을 미치지 않음과 동시에 벡터의 안전성을 증가시킨다.
4세대 벡터는 사중 플라스미드 시스템으로 현재 널리 사용되는 렌티바이러스 벡터 시스템이기도 하다. 3세대를 기반으로 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터를 구축하였는데, 즉 U3 영역의 3' LTR을 삭제하여 벡터가 HIV-1 인핸서 및 프로모터 서열을 잃어 모든 바이러스 단백질이 존재하는 경우에도 RNA를 전사할 수 없도록 하였으며, 또한 env 유전자를 별도의 발현 플라스미드에 놓고 tat 유전자도 제거하여 이종 프로모터 서열로 교체하였다. 이로써, 4개의 플라스미드 시스템, 즉 pGag/Pol, pRev, pVSV-G를 형성하였고, 그 외에 목적 유전자 서열을 배치할 수 있는 핵산 벡터가 하나 더 있다. 이 시스템에서 우발적으로 활성 바이러스가 생성될 가능성이 크게 줄어든다. 이러한 유형의 벡터 시스템은 유도성 유전자를 포함할 수 있는데, 가장 대표적인 것은 시스템과 렌티바이러스 벡터의 결합 산물을 조절하고, 렌티바이러스에 이식된 목적 유전자의 발현을 인위적으로 제어하여 유전자의 조건부 발현 및 유전자 녹아웃이 가능해지도록 하며, 유자가 불활성화의 이점을 계속 유지할 수 있는 테트라사이클린-유도 시스템이다(Meng F et al., (2014) Advances of lentiviral vectors. Zhongguo Fei Ai Za Zhi 17(12):870-6; Mart
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nez-Molina, E. et al., (2020) Large-Scale Production of Lentiviral Vectors: Current Perspectives and Challenges. Pharmaceutics 12:1051).
다른 유형의 렌티바이러스 벡터 시스템은 주로 시미안 면역결핍 바이러스(SIV) 벡터 시스템, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 벡터 시스템, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)벡터시스템, 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV) 벡터 시스템, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 벡터 시스템, 비스나바이러스(VMV) 벡터 시스템 등을 포함한다.
바이러스 벡터의 제조
바이러스 벡터 입자의 제조에는 일반적으로,
1) 숙주 세포를 배양하고 증폭하는 단계; 2) 바이러스 벡터 발현 시스템을 숙주 세포에 도입하는 단계; 3) 바이러스 벡터 발현 시스템이 도입된 숙주 세포를 배양하고 증폭하는 단계; 4) 생성된 바이러스 벡터를 수집하고 정제하는 단계를 필요로 한다.
현재 일부 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 시험관 내(무세포)에서 패키징할 수 있지만, 이러한 패키징 시스템은 여전히 세포 추출물이 필요하고 패키징 효율은 생산 가능한 수준과는 거리가 멀게 상당히 낮다. 지금까지 바이러스 벡터의 패키징은 주로 상기 바이러스에 민감한 숙주 세포에서 이루어졌다. 숙주 세포는 바이러스 복제 및 패키징을 위한 환경 조건을 제공할 뿐만 아니라 많은 세포 성분이 바이러스 복제 및 패키징 과정에 직접 관여한다.
바이러스 벡터의 제조에 필요한 숙주 세포는 생산/패키징 세포계라고도 한다. 렌티바이러스 벡터의 배경 하에, 용어 “패키징세포계”는 gag 및 pol 및 env 유전자가 도입된 세포계를 의미할 수 있고; “생산 세포계”는 gag, pol, env 유전자 및 외인성 유전자가 도입된 세포계를 의미할 수 있다. 일 실시형태에서, “패키징 세포계”는 세포 게놈에 gag 및 pol 및 env 유전자가 삽입된 세포계이고; “생산 세포계”는 세포 게놈에 gag, pol, env 유전자 및 외인성 유전자가 삽입된 세포계이다. 다른 실시형태에서, “패키징 세포계”는 세포 게놈에 gag 및 pol 및 env 유전자가 안정적으로 삽입된 세포계이고; “생산 세포계”는 세포 게놈에 gag, pol, env 유전자 및 외인성 유전자가 안정적으로 삽입된 세포계이다.
숙주 세포의 배양은 부착 배양과 현탁 배양으로 구분된다. 바이러스 벡터의 제조를 향상시키려면 세포 부착에 사용할 수 있는 총 표면적을 늘리거나 세포의 현탁 배양을 수행할 수 있다.
인간 배아 신장 세포 293으로도 알려진 HEK293 세포는 레트로바이러스 및 다른 바이러스 벡터 생산에 가장 일반적으로 사용되는 세포이다. SV40 T 항원이 통합된 HEK293T 세포는 모 세포계 HEK293보다 더 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있다. HEK293T 세포는 일반적으로 10% 소태아혈청 배지를 포함하는 세포 배양 플라스크에서 부착 배양되며, 바이러스 생산량이 적다. 세포가 부착할 수 있는 표면적을 늘리기 위해, HYPERFlaskTM(Corning)와 같은 다층 용기, 및 세포 공장 시스템(Numc, EasyFill, ThermoScientific, Waltham, MA, USA)과 같은 다층 세포 공장을 사용할 수 있다. HYPERFlaskTM(Corning)의 총 성장 면적은 약 1720 cm2이고, 산소와 이산화탄소 교환을 위한 기체 투과성 표면을 가지고 있어 생산량은 대략 T-150 배양 플라스크의 10배가 넘을 수 있다. 세포 공장 시스템(Numc, EasyFill, ThermoScientific, Waltham, MA, USA)은 최대 40개의 층을 가질 수 있어 약 170개의 T-150 배양 플라스크에 해당하는 배양 표면적을 생성할 수 있다. 이 밖에, 시장에서 또한 iCELLis(Pall Life Sciences, Hoegaarden, 벨기에)와 같은 고정층 생물 반응기 및 Scale-XTM 생물 반응기 시스템(Univercells, Gosselies, 벨기에)을 개발하였으며, 고정층은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 섬유 또는 PET 섬유층으로 채워져 세포 부착을 위한 넓은 표면적을 제공한다. iCELLis 500이 제공하는 세포 성장 면적은 약 3000개의 HYPERFlask이다.
혈청 의존성 부착 HEK293T의 배양을 확장할 수 있는 다양한 장비가 업데이트되었지만 여전히 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이다. 따라서 연구자들은 HEK293 세포를 현탁 배양에 적응하도록 순화시키려는 시도를 시작하였다. HEK293E 세포가 가장 먼저 순화되고 무혈청 배지에서 현탁 배양된다. 그 후, HEK293SF-3F6 등과 같은 이러한 유형의 새로운 세포계가 지속적으로 개발되었다(Ansorge, S.et al., (2009) Development of a Scalable Process for High-Yield Lentiviral Vector Production by Transient Transfection of HEK293 Suspension Cultures. J. Gene Med. 11:868-876). 부착 배양에 비해 현탁 배양은 복잡한 배양 기기가 필요 없고, 세포를 분리하기 위해 기계적인 힘이나 효소가 필요하지 않으며, 계대 배양이 더 편리하고, 규모 확장에 편리한 등 많은 장점이 있다.
세포 및 유전자 치료 연구 개발 회사의 경우, 임상 전 연구, IND 신고 및 임상 시험 기간 동안 바이러스 벡터에 대한 수요량이 제한적이므로, 거의 모든 회사가 부착 세포 HEK293T의 일시적 형질감염을 사용하여 렌티바이러스 벡터를 생산한다. HEK293T 세포의 부착 배양은 일반적으로 세포 공장의 형태이며, 이러한 생산 방식은 주로 배양 단위의 수를 증가시켜 세포의 양을 증가시키는 것에 의존한다. 따라서, 더 많은 수의 바이러스 벡터가 필요한 경우, 종종 많은 공간을 차지하고 많은 노동력이 필요하다. 큰 성장 영역을 얻는 동시에 노동력을 줄이기 위한 한 가지 방법은 렌티바이러스 생산용 세포주를 현탁 배양에 적응시키는 것이다. 현탁 배양은 부착 배양에 비해 세포 밀도를 크게 향상시킬 수 있다.
두 번째 단계는 바이러스 벡터 발현 시스템을 숙주 세포에 도입하는 것인데, 즉 패키징 핵산 벡터, 외피 핵산 벡터, 보조 핵산 벡터, 이종 유전자를 운반하는 핵산 벡터 등으로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이다.
본 출원에서 “바이러스 발현 시스템”은 적합한 숙주 세포 내에 도입될 때 바이러스 복제 및 패키징을 지원하기에 충분한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 시스템을 의미한다. 바이러스 발현 벡터는 또한 RNA 또는 폴리펩티드/단백질과 같은 코딩된 핵산이 바이러스 벡터 입자로 함께 패키징될 수 있는 이종 유전자를 운반하는 핵산 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스의 발현 시스템은 일반적으로 gag-pol 유전자, env 유전자, 및 보조 유전자 rev 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 렌티바이러스의 발현 시스템은 HIV-1 gag-pol-rev 유전자, 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유한 핵산 벡터를 포함한다. 다른 실시형태에서, 렌티바이러스의 발현 시스템은 HIV-1 gag-pol 유전자, HIV-1 rev 유전자, 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유한 핵산 벡터를 포함한다. AAV 발현 시스템은 일반적으로 AAV rep 및 cap, 보조 유전자 및 rAAV 게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 “핵산 벡터”는 DNA 또는 RNA의 벡터를 의미하고, 구체적인 실시형태에서 플라스미드, 또는 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), P1 유래 인공 염색체(PAC), 포스미드 또는 코스미드 등일 수 있다. 핵산 벡터는 필요에 따라 복제원점, 프로모터, 전사 조절 요소 등을 포함할 수 있다. 모든 요소는 발현을 제어할 수 있도록 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 언급된 프로모터는 예를 들어 조절 단백질의 존재 하에 지속적으로 활성화되거나 유도될 수 있는 알려진 프로모터(완전 또는 부분)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산 벡터는 CMV 프로모터와 같은 고효율 프로모터를 추가로 포함한다. 상기 프로모터는 비포유 동물 핵산 벡터에 코딩된 요소의 높은 수준의 발현을 촉진하는 이점이 있다. 다른 실시형태에서, CMV 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스 균주 AD169로부터 유래된 서열을 포함한다. 상기 서열은 Genome 등록 번호 X17403, 예를 들어 염기쌍 173731 내지 174404로부터 얻을 수 있다. 본 출원에서, 외인성 유전자가 포함된 핵산 벡터를 전달 벡터라고 할 있으며, 일 실시형태에서 전달 플라스미드일 수 있다. 전달 벡터 플라스미드는 일반적으로 프로모터(예를 들어, CMV), 3'LTR(자가 불활성화(즉 SIN) 3'-LTR일 수도 있고 아닐 수도 있음), 5'LTR(U5 영역을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있음), 캡슐화 서열(ψ), 및 프로모터에 연결된 잠재적인 외인성 유전자를 포함한다.
본 명세서에 따른 “형질감염” 또는 “감염”은 본 명세서에 따른 “바이러스 발현 시스템”과 같은 외인성 유전 물질을 숙주 세포에 도입하는 것을 의미한다. 당업자에게 공지된 일반적으로 사용되는 형질감염 방법은 물리적 방법(예를 들어, 전기천공법, 세포 압출, 소노천공법, 광학 형질감염, 원형질체 융합, 충격 형질감염, 자기 형질감염, 유전자총법 또는 입자 충격), 화학 시약(예를 들어, 인산칼슘, 고도로 분지된 유기 화합물 또는 양이온성 중합체) 또는 양이온성 지질(예를 들어, 리포펙션)의 사용을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 많은 형질감염 방법은 플라스미드 DNA 용액을 세포에 접촉시킨 다음 마커 유전자 발현을 위해 성장 및 선택해야 한다.
외인성 핵산이나 핵산 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것이 쉽지 않고, 세포막의 장벽을 넘어야 하며, 고역가의 바이러스 벡터 입자를 생성하기 위해서는 높은 형질감염 효율이 필요하다. 바이러스 플라스미드 형질감염의 방법은 크게 화학적 및 물리적 2가지로 나눌 수 있다. 일반적으로 사용되는 화학적 방법은 인산칼슘 공침전, 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 매개된 형질감염, 및 Lipofectamine(Invitrogen)에 의해 매개된 형질감염을 포함하고, 물리적 방법은 유동 전기천공법과 같은 전기천공법 , 미세주입법 및 유전자총법 등을 포함한다.
인산칼슘 공침전은 다양한 세포 유형에 적합하며 동시에 많은 수의 세포를 형질감염시킬 수 있어 대규모 바이러스 제조에 사용할 수 있다. 그러나, 인산칼슘은 pH 변화에 매우 민감하며 세포에 상당히 독성이 있다. 독성을 피하기 위해 혈청 또는 알부민이 포함된 배지에서 숙주 세포를 배양해야 하며, 형질감염 후 배지는 제때에 교체해야 한다.
PEI에 의해 매개된 형질감염은 인산칼슘만큼 효율적이다. 상기 방법을 사용할 때 적절한 PEI/DNA 비율을 선택해야 한다. PEI는 또한 세포에 독성이 있지만 형질감염 후 배지를 교체하지 않고 그대로 둘 수도 있다. 이 밖에, PEI 방법은 pH에 민감하지 않다. PEI 방법은 부착 세포와 현탁 배양 세포 모두에 사용할 수 있으며, 배지 내 혈청은 필수적이다(Toledo, J.R. et al., (2009) Polyethylenimine-Based Transfection Method as a Simple and Effective Way to Produce Recombinant Lentiviral Vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157:538-544).
Lipofectamine에 의해 매개된 형질감염은 가장 효율적이고 편리하며 다양한 세포 유형에 적합하고 형질감염률이 매우 높으며, 예를 들어 일부 구현예에서 세포의 100%가 렌티바이러스로 형질감염될 수 있다. 그러나, Lipofectamine의 사용은 대규모 바이러스 벡터 제조에 비용이 많이 든다.
유동 전기천공법은 인산칼슘법만큼 효율적이나 DNA 양의 1/3 이하만 필요하고 세포에 독성이 없으며 현탁 배양 세포에 적합하다.
이 밖에, 형질감염 후 배지에 부티르산 나트륨을 첨가하면 바이러스 역가가 증가하는 것으로 보고되었다.
상기 형질감염 방법에서, PEI는 부착 배양 세포에 더 적합하고 유동 전기천공법은 현탁 배양 세포에 더 적합하며 인산칼슘과 Lipofectamine은 비용상의 이유로 소규모 적용에 더 적합하다.
일단 숙주 세포 내로 들어가면 핵산 벡터는 포유 동물 숙주 세포의 내인성 게놈에 무작위로 통합될 것이다. 따라서, 예를 들어 zeocin 내성 마커 등과 같은 항생제 내성 선택 마커를 사용하여 핵산 벡터에 코딩된 핵산이 통합된 숙주 세포를 선택하는 것도 필요할 수 있다.
당업자는 핵산 벡터의 통합을 촉진하는 방법, 예를 들어 플라스미드와 같은 핵산 벡터가 자연적으로 환형인 경우 상기 핵산 벡터를 선형화하는 방법을 알고 있을 것이다. 핵산 벡터는 내인성 게놈 내의 선택된 부위로 직접 통합하기 위해 숙주 세포의 내인성 염색체와 공유된 상동성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이 밖에, 핵산 벡터에 재조합 부위가 존재한다면 표적 재조합에 사용할 수 있다. 다른 표적 통합 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 게놈 DNA의 표적 절단을 유도하는 방법을 사용하여 선택된 염색체 유전자좌에서 표적 재조합을 촉진할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 조작된 절단 시스템을 사용하여 내인성 게놈에서 이중 가닥 절단(DSB) 또는 닉(nick)을 유도하여 자연적 과정(예를 들어,비상동 말단 연결)에 의해 절단을 복구하거나 복구 템플릿을 사용하여 복구(즉, 상동성 지향 복구 또는 HDR)하는 것이다. 조작된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)와 같은 특정 뉴클레아제, 전사 활성화 인자(예를 들어, 이펙터 뉴클레아제)(TALEN)를 사용하고, CRISPR/Cas9 시스템 및 조작된 crRNA/tracr RNA('단일 가이드 RNA')를 사용하여 특이적 절단을 가이드하거나, 및/또는 Argonaute 시스템을 기반으로 하는 뉴클레아제(예를 들어, 'TtAgo'라는 고온성 세균(T.thermophilus)으로부터 유래됨, Swarts DC et al., (2014) DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature. 507(7491):258-261)를 사용하여 절단할 수 있다. 이러한 뉴클레아제 시스템 중 하나를 사용하는 표적 절단은 HDR 또는 NHEJ에 의해매개된 과정을 활용하여 특정 표적 위치에 핵산을 삽입하할 수 있다. 따라서,일 실시형태에서, 적어도 하나의 뉴클레아제를 사용하여 핵산 벡터에 코딩된 핵산 서열을 숙주 세포의 게놈(즉, 내인성 염색체)에 통합하되, 여기서 상기 적어도 하나의 뉴클레아제는 숙주 세포의 게놈을 절단하여 핵산 서열이 세포의 게놈에 통합되도록 한다. 다른 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALE 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
형질감염은 또한 일시적 형질감염 및 안정적 형질감염으로 구분된다. 일시적 형질감염의 경우, 외인성 유전자가 발현되지만 세포의 게놈에 통합되지 않아 복제되지 않는다. 세포에서 일시적으로 발현되는 외인성 유전자는 세포 분열 중 다양한 요인으로 인해 외인성 유전자가 소실될 때까지 제한된 기간 동안, 보통 며칠 동안만 발현된다. 안정적 형질감염은 일시적 형질감염을 기반으로 하지만 중요한 우발적 과정, 즉 적은 수의 형질감염된 세포에서 외인성 유전자가 세포의 게놈에 통합될 수 있어야 한다. 안정적 형질감염 세포의 특징은 외인성 유전자가 세포 게놈의 일부가 되어 복제된다는 것이다. 안정적 형질감염 세포의 자손 세포도 외인성 유전자를 발현하여 안정한 세포계를 형성한다.
일시적 형질감염은 일반적으로 며칠 동안 지속되고, 일시적 형질감염으로 유전자 발현을 연구하며, 일반적으로 형질감염 후 24시간에서 96시간 이내에 세포를 수확하는데, 구체적인 시간은 세포 유형 및 벡터 구축과 같은 많은 요인에 따라 달라진다. 이 때문에 일시적 형질감염은 일반적으로 유전자 또는 유전자 산물의 단기 발현, 유전자 녹아웃 또는 RNA에 의해 매개된 유전자 침묵, 및 소규모 단백질 합성을 연구하는데 사용된다. mRNA의 일시적 형질감염은 mRNA가 핵 외부에서 직접 발현될 수 있고 일부 시스템에서는 mRNA가 형질감염 후 몇 분 이내에 발현될 수 있기 때문에 기존의 플라스미드 DNA 형질감염보다 결과가 더 빨리 나온다. 이에 따라 장기간의 유전자 발현이 필요한 경우 대규모 단백질 합성, 장기 약리 연구, 유전자 치료 연구, 및 장기 유전 조절 기전 연구 등 안정적 형질감염이 이루어져야 한다. 안정적 형질감염은 일시적 형질감염보다 더 오래 걸리고 더 힘들다.
안정적 형질감염된 세포계는 또한 구성형 안정적 형질감염 세포계 및 유도형 안정적 형질감염 세포계로 구분된다. 구성형 안정적 형질감염 세포계는 일반적으로 렌티바이러스 VSV-G와 같이 세포독성이 더 높은 바이러스 외피를 발현하지 않으며 몇 달 동안 더 높은 역가에서 바이러스 벡터 입자를 생산한다. 이러한 세포계는 극소수이며 렌티바이러스로 안정적으로 형질감염된 것으로 알려진 세포계는 STAR 세포계, WinPac 세포계, RD-MolPack 세포, LentiPro26 세포계 등이 있다. 유도형 안정적 형질감염 세포계는 일반적으로 바이러스 제조가 필요한 경우에만 바이러스 외피 발현을 유도하는데, 예를 들어 성장 배지에 항생제와 같은 유도제를 첨가하는 경우에만 발현이 일어난다. 유도형 안정적 형질감염 세포계는 장기간에 걸쳐 더 높은 역가의 바이러스를 제조할 수도 있다. 예를 들어, ProSavin은 83일 이내에 최대 3×105 TU/ml의 역가를 생성할 수 있고(Broussau, S. et al., (2008) Inducible Packaging Cells for Large-Scale Production of Lentiviral Vectors in Serum-Free Suspension Culture. Mol. Ther. 16:500-507; Stewart, H.J. et al., (2011) A Stable Producer Cell Line for the Manufacture of a Lentiviral Vector for Gene Therapy of Parkinson’s Disease. Hum. Gene Ther. 22:357-369); Milani 등이 개발한 이 유형의 세포계는 4.4×106 TU/ml의 역가를 생성할 수 있다(Milani, M. et al., (2017) Genome Editing for Scalable Production of Alloantigen-free Lentiviral Vectors for in Vivo Gene Therapy. EMBO Mol. Med. 9:1558-1573).
안정적 형질감염 세포계를 얻기 어렵기 때문에 렌티바이러스 벡터 제조와 같은 현재의 주류 바이러스 제조는 여전히 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포계를 사용한다.
바이러스 벡터 제조의 세 번째 단계는 첫 번째 단계와 유사하게 바이러스 벡터 발현 시스템에 도입된 숙주 세포를 배양하고 증폭하는 것이다.
네 번째 단계는 바이러스 벡터의 분리하고 정제하는 것이다. 바이러스 벡터 입자를 포함하는 수집된 세포 배양 상청액은 숙주 세포, 숙주 세포에 의해 생성된 다른 단백질, 플라스미드 DNA, 혈청 등과 같은 다양한 불순물을 포함할 수 있는데, 여기서 혈청의 성분은 복잡하고 내독소와 면역원성 단백질 등을 포함할 수 있다. 이러한 불순물을 제거하고 최종 제품을 농축해야 한다. 이러한 처리에서 가장 큰 문제는 어떻게 바이러스 벡터의 활성/기능성을 유지할 것인가이므로 가능한 한 적은 단계를 사용하여 최단 시간에 처리해야 한다. 소규모 정제에 사용되는 방법은 분명히 대규모 생산에는 적합하지 않다. 또한 원심분리와 같은 일부 정제 단계는 cGMP 규정을 준수하지 않으며 고속 원심분리는 바이러스 외피를 어느 정도 파괴한다.
기존의 대규모 바이러스 벡터 정제 방법에는 정화, 농축 및 정제가 포함된다.
정화는 상청액을 수집한 후 숙주 세포와 숙주 세포 파편을 제거하는 것을 의미한다. 소규모 정화는 원심분리 및 미세 여과 등과 같은 방법으로 수행할 수 있지만 대규모 정화는 바람직하게는 45 μm 다공성 막을 사용한다. 기공 막힘을 방지하기 위해 기공 크기가 점감된 막을 사용하여 여과 효율을 향상시킬 수 있다.
정화된 바이러스 벡터 입자는 기공 크기가 1~100 nm인 막 사용을 포함한 접선 흐름 여과(TFF) 사용에 의해 농축되고 적절한 완충액으로 침투될 수 있다. 이 기술은 바이러스 입자 농축, 혈청 제거, DNA 절편 분해 등을 위해 단시간 내에 부피를 크게 줄일 수 있다. 가장 중요한 것은 TFF로 조작하는 것이 cGMP 규정을 완전히 준수한다는 것이다. TFF 조작에서 액체가 필터와 평행하기 때문에 다른 한외 여과 방법에서 종종 발생하는 막 막힘 문제를 크게 줄일 수 있으며 액체 유속을 높은 수준으로 유지할 수 있다. TFF에 의해 렌티바이러스 입자의 약 90~100%를 회수할 수 있다. 현재 TFF는 약 100 L의 바이러스 제품을 처리할 수 있다(Valkama, A.J. et al., (2020) Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 17:717-730).
인간에 적용되는 의약품의 경우 렌티바이러스 벡터 제품도 크로마토그래피로 정제해야 한다. 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)는 렌티바이러스 벡터가 중성 pH에서 양전하를 띠는 특징을 기반으로 하는 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터의 정제를 위한 효율적인 도구이다. 바이러스 벡터 상청액이 음전하를 띤 기질이 있는 컬럼을 통과하면 양전하를 띤 바이러스 입자가 음전하를 띤 기질에 결합하고 불순물이 컬럼을 통해 직접 흘러나간다. 그 후, 바이러스 벡터는 높은 염도 환경(0.5~1 M NaCl)에 노출되고 결합된 입자는 음이온 교환 컬럼에서 용출된다. 높은 염도는 바이러스 입자를 불활성화할 수 있는데, 이것이 이 기술의 유일한 단점이다. 실온에서 높은 염도의 용리액에 바이러스 입자를 노출하면 바이러스의 50%가 불활성화된다(Segura, M.D.L.M. et al., (2005) A Novel Purification Strategy for Retrovirus Gene Therapy Vectors Using Heparin Afinity Chromatography. Biotechnol. Bioeng. 90:391-404).
친화성 크로마토그래피는 표적 분자와 크로마토그래피 컬럼에 부착된 리간드 사이의 특이적 상호 작용을 기반으로 생체 분자를 분리하는데 사용되는 정제 기술이다. 높은 분자 선택성으로 인해 이 기술은 정제 단계를 어느 정도 단순화할 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 수소결합, 정전기적 상호작용, 반데르발스 힘, 또는 항체-리간드 등에 기반한 친화성 크로마토그래피와 같이 상호작용에 따라 여러 종류로 나눌 수 있다. 항체-리간드 상호작용이 가장 선택적이며, 외피 단백질에 결합하는 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피는 바이러스 벡터 정제에서 볼 수 없다. 헤파린은 다양한 종류의 바이러스와 상호작용하는 상대적으로 저렴한 친화성 리간드로 렌티바이러스 벡터의 정제에 사용되어 왔으며, 최대 53%의 바이러스 벡터를 회수하고 최대 94%의 단백질 불순물 및 56%의 잔류 DNA를 제거할 수 있다. 벡터와 헤파린 사이에는 바이러스 입자 표면의 양전하를 띤 분자와 음전하를 띤 헤파린의 상호 작용이 존재하므로 일반적으로 NaCl을 사용하여 헤파린 컬럼에서 벡터를 용출한다. 염 농도는 일반적으로 바이러스 벡터를 용출하기 위해 약 0.5 M에 도달해야 한다. 이를 위해서는 TFF 단계를 추가로 추가하는 것과 같이 염분을 제거하기 위한 세척 또는 정제 단계를 추가로 추가하여야 한다. 연구에 따르면 헤파린은 바이러스 외피 단백질과 상호 작용하지 않으므로 수율 손실 없이 여러 유형의 바이러스에 결합할 수 있다.
바이러스 벡터의 대규모 정제에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 남은 불순물을 효율적으로 제거하기 위한 클리닝 단계로 사용할 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피로도 알려진 SEC는 바이러스 벡터를 정제할 때 부피가 바이러스 입자의 큰 부피와 불순물의 작은 부피 사이의 차이를 기반으로 한다. 모든 불순물은 기공 크기보다 작기 때문에 컬럼을 통과할 수 있고 부피가 큰 바이러스 입자만 남는다. SEC의 단점은 규모 확장이 어렵고 로딩량이 칼럼 부피의 10%에 불과하다는 것이다. 이 밖에, SEC 정제에는 선형 저유속과 긴 조작 시간이 필요하다.
정제 단계 후 렌티바이러스 벡터는 -80℃에서 동결보존되어야 한다. 렌티바이러스 벡터의 반감기는 실온에서 1~2일, 4℃에서 약 8일이고(Higashikawa, F. et al., (2001) Kinetic Analyses of Stability of Simple and Complex Retroviral Vectors. Virology 280:124-131), -80℃에서 1~2년 보관 가능(Valkama, A.J. et al., (2020) Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 17:717-730)한 것으로 보고되었다. 동결보존 전에 동결보존액으로 교체해야 하며, 자당과 염화마그네슘 성분은 기능성 바이러스 입자의 손실을 줄이고 저장 안정성을 높일 수 있다(Valkama, A.J. et al., (2020) supra; Bandeira, V. et al., (2012) Downstream Processing of Lentiviral Vectors: Releasing Bottlenecks. Hum. Gene Ther. Methods 23:255-263; Kumru, O.S. et al., (2018) Physical Characterization and Stabilization of a Lentiviral Vector Against Adsorption and Freeze-Thaw. J. Pharm. Sci. 107: 2764-2774).
본 출원은 구체적으로 PowerSTM-293T를 포함한 본 출원의 세포주를 사용하여 바이러스 벡터 입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
i) 세포주를 배양하는 단계;
ii) 바이러스 벡터 발현 시스템을 세포주에 도입하는 단계;
iii) 바이러스 벡터 입자의 생산 조건에서 세포주를 배양하는 단계; 및
vi) 바이러스 벡터 입자를 수집하는 단계를 포함한다.
단계 i)은 세포주의 현탁 배양을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포주는 37℃ 및 8% ℃ 조건 하에 무혈청 배지에서 진탕 배양된다. 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택될 수 있다.
단계 i)은 세포주의 계대배양을 더 포함할 수 있다.
단계 ii)는 물리적 또는 화학적 형질감염 방법으로 바이러스 발현 시스템을 세포주에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 물리적 형질감염 방법은 전기천공법, 미세주입법 및 유전자총법 등을 포함할 수 있다. 화학적 형질감염 방법은 인산칼슘 공침전, 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 매개되는 형질감염, 및 Lipofectamine(Invitrogen)에 의해 매개되는 형질감염 등을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터 발현 시스템은 패키징 핵산 벡터 및 외피 핵산 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 발현 시스템은 보조 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 발현 시스템은 이종 핵산 함유 전이 핵산 벡터와 같은 이종 핵산 함유 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다. 이러한 핵산 벡터는 플라스미드일 수 있다.
이종 핵산의 길이는 4 kb 이하이다. 이종 핵산은 키메라 항원 수용체와 같은 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 siRNA와 같은 핵산을 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, 또는 CD269(BCMA)를 표적으로 하는 CAR과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 암배아 항원(CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR, HER2), 티로신 키나아제 수용체(EPHA2) 등을 포함한 성장 및 분화 신호에 관여하는 항원을 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(VEGFR) 등을 포함한 종양 혈관 신생에 관여하는 항원을 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신(tenascin) 단백질 등을 포함한 종양 지지 구조의 종양 스트로마 및 세포외 기질 항원을 표적으로 할 수 있다. 이종 핵산 함유 플라스미드는 pCDH 및 pCMV 등을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, α-레트로바이러스 벡터, γ-레트로바이러스 벡터, 또는 포미 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIN, EIAV 및 VISNA로부터 선택된 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 벡터일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 및 AAV10 등과 같은 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다.
레트로바이러스 벡터 발현 시스템은 레트로바이러스 구조 단백질 gag-pol 유전자를 함유하는 벡터, 및 env 유전자 또는 이의 기능적 대체물을 함유하는 핵산 벡터를 포함할 수 있다. env 유전자 또는 이의 기능적 대체물은 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩할 수 있다. 레트로바이러스 벡터 발현 시스템은 보조 유전자 rev 또는 이의 유사 유전자를 함유하는 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터 발현 시스템은 이종 핵산 함유 전이 핵산 벡터와 같은 이종 핵산 함유 핵산 벡터를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 HIV-1 gag-pol-rev 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩하는 핵산, 및 이종 핵산을 각각 포함하는 3개의 핵산 벡터를 세포주에 도입하는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조에 사용된다.
일 실시형태에서, 방법은 HIV-1 gag-pol 유전자, HIV-1 rev 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 또는 이의 유도 단백질을 코딩하는 핵산, 및 이종 핵산을 각각 포함하는 4개의 핵산 벡터를 세포주에 도입하는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조에 사용된다. 이종 핵산 함유 핵산 벡터는 자가 불활성화 렌티바이러스 긴 말단 반복 서열을 포함할 수 있다.
단계 iii)은 세포주의 현탁 배양을 포함할 수 있다. 세포주는 세포주가 바이러스 벡터를 생성하기에 적합한 임의의 조건에서 배양될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포주는 37℃ 및 8% ℃ 조건 하에 무혈청 배지에서 진탕 배양된다. 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택될 수 있다.
단계 iii)은 세포 계대배양을 더 포함할 수 있다.
본 출원은 바이러스 벡터 발현 시스템을 포함하는 PowerSTM-293T 숙주 세포에 대해 실험 생산(experimental production) 및 파일럿 규모 생산(pilot scale production)을 수행하였으며, 예를 들어 300 ml의 진탕 플라스크에서 배양하되, 예컨대 1 L, 2 L, 10 L, 50 L 및 200 L의 생물 반응기(예를 들어 WAVE 반응기 또는 유리 반응기)에서 현탁 배양하여 바이러스 벡터를 생산한다.
단계 vi) 이후에, 상기 방법은 바이러스 벡터의 역가를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바이러스 벡터의 적용
바이러스 벡터 발현 시스템은 키메라 항원 수용체와 같은 치료 또는 연구용 단백질, 또는 siRNA와 같은 치료 또는 연구용 핵산을 코딩하기 위한 이종 핵산 함유 전달 벡터 플라스미드와 같은 이종 핵산 함유 핵산 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터의 적용은 주로 이종 핵산에 의해 코딩되는 단백질 및 핵산에 의해 결정된다.
이종 핵산은 치료 펩티드와 같은 치료 분자, 또는 siRNA와 같은 치료 핵산을 코딩할 수 있다. “치료 분자”는 세포 또는 피험자의 단백질 결핍 또는 결함으로 인한 증상을 완화시키거나 경감시키는 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 또는, 이종 핵산에 의해 코딩되는 “치료” 펩티드 또는 단백질은 유전적 결함을 교정하거나, 유전자(발현 또는 기능) 결함을 교정하거나, 항암 효과를 제공하는 것과 같이 피험자에 이점을 부여하는 것이다. 치료 핵산은 예를 들어 siRNA, 안티센스 분자 및 miRNA를 포함할 수 있다. 이종 핵산은 다수의 유용한 산물을 코딩할 수 있다.
이종 핵산은 인슐린, 글루카곤, 성장호르몬(GH), 부갑상선호르몬(PTH), 성장호르몬 방출 인자(GRF), 여포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH), 인간 융모생식샘자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오게닌, 안지오스타틴, 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 결합조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGF-α), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ를 포함한 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리 중 어느 하나, 키네틴, 억제제, 또는 골 형성 단백질(BMP) BMP1-15 중 어느 하나, 신경성장 인자(NGF), 뇌유래 신경영양인자(BDNF), 신경영양인자 NT-3 및 NT4/5, 섬모신경영양인자(CNTF), 신경아교세포 유래 신경영양인자(GDNF), 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 카이닉산, 노긴, 및 티로신 수산화효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 호르몬과 성장 인자 및 분화 인자를 코딩할 수 있다.
다른 유용한 이종 핵산 산물은 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL) IL-1 내지 IL-17, 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기세포인자와 같은 시토카인 및 림포카인, flk-2/fFlt3 리간드, 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, CCR5와 같은 G 단백질 결합 수용체(GPCR), 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자, 및 조작된 면역글로불린 및 MHC 분자와 같은 시토카인 및 림프인자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역 체계를 조절하는 단백질을 포함한다. 유용한 이종 핵산 산물은 보체 조절 단백질, 막 보조인자 단백질(MCP), 붕괴 촉진 인자(DAF), CR1, CF2 및 CD59와 같은 조절 단백질을 더 포함한다.
다른 유용한 이종 핵산 산물은 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라아제, 아르기니노숙시네이트 합성효소, 아르기니노숙시네이트 분해효소, 아르기나아제, 푸마릴 아세토아세테이트 가수분해효소, 페닐알라닌 수산화효소, α-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타아제, 포르포피리노겐 탈아미노효소, 인자 V, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XIII 또는 단백질 C와 같은 응고 인자, 시스타티오닌-β-합성효소, 분지쇄 케톤산 탈탄산효소, 알부민, 이소발레릴-CoA 탈수소효소, 프로피오닐-CoA 카르복실화효소, 메틸말로닐-CoA 뮤타아제, 글루타릴-CoA 탈수소효소, 인슐린, β-글루코시다아제, 피루브산 카르복실산염, 간 포스포릴라아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글리신 탈탄산효소, H 단백질, T 단백질, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 서열 및 디스트로핀 cDNA 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 선천적 대사 결함을 교정할 수 있는 유전자 산물을 포함한다.
또 다른 유용한 이종 핵산 산물은 결함, 결핍 또는 결실을 제공할 수 있는 예를 들어 항체, 망막색소상피세포 특이적 65kDa 단백질(RPE65), 에리스로포이에틴, 저밀도 지단백질 수용체, 지단백질 리파아제, 오르니틴 카르바모일 전이효소, β-글로불린, α-글로불린, 스펙트린, α-항트립신, 아데노신 탈아미노효소(ADA), 금속 수송체(ATP7A 또는 ATP7), 설파미다아제, 리소좀 축적병에 관한 효소(ARSA), 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소, β-25 글루코세레브로시다아제, 스핑고미엘리나아제 헥소사미니다아제, 리소좀 헥소사미니다아제, 분지쇄 케톤산 탈수소효소, 호르몬, 성장 인자(예를 들어, 인슐린 유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경성장 인자, 신경영양인자 3 및 4, 뇌유래 신경영양인자, 아교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β 등), 시토카인(예를 들어, α인터페론 , β인터페론 , 인터페론 γ, 인터루킨2, 인터루킨4, 인터루킨12,과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 림포톡신 등), 자살 유전자 산물(예를 들어, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450,데옥시시티딘 키나아제, 종양 괴사 인자 등),약물 내성 단백질(예를 들어, 암 치료에서 약물 내성을 제공하는데 사용됨), 종양 억제 단백질(예를 들어, p53, Rb, Wt-1, NF1, VonHippel-Lindau(VHL), 선종성 폴립증(APC)), 면역조절 펩티드, 관용원성 또는 면역원성 펩티드 또는 단백질 Tregitopes, 또는 hCDR1, 인슐린,글루코키나제, 구아닐레이트 시클라제((LCA-GUCY2D), Rab 가딘 1, LCA5, 오르니틴 케톤산 아미노전이효소, 망막분리증 1(X-연관 망막분리증), USH1C(Usher 증후군 1C), X-연관 색소성 망막염 GTP 효소(XLRP), MERTK(RP의 AR 형태: 색소성 망막염), DFNB1(Connexin26 난청), ACHM2, 3 및 4(색망), PKD-1 또는 PKD-2(다낭성 신장 질환), TPP1, CLN2, 리소좀 저장 질환으로 인한 유전자 결함(예를 들어, 설파타아제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제, 카텝신 A, GM2-AP, NPC1, VPC2, 사포신 등), 게놈 편집을 위한 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제, 또는 게놈 편집을 위한 복구 템플릿으로 사용되는 공여체 서열을 포함한다.
이종 핵산은 또한 종양 관련 항원(TAA)을 코딩할 수 있다. TAA의 비제한적 구현예는 고환 종양 관련 특이성 항원(예를 들어, MAGE, BAGE 및 GAGE), 멜라닌 세포 분화 항원(예를 들어, 티로시나제, Melan-A/MART-1), CDK4, MUM-1, β-카테닌, gp100/pmel17, TRP-1, TRP-2, MITF, MITF-A 및 MITF-M을 포함한다. 다른 TAA의 비제한적 구현예는 흑색종 GP75, 아넥신 I, 아넥신 II, 아데노신 탈아미노효소 결합 단백질(ADAbp),PGP9.5(Rode 등, 1985).Histopathology9:147), 결장직장 관련 항원(CRC)-C017-1A/GA733, Ab2BR3E4, CI17-1A/GA733, Hsp70, Hsp90, Hsp96, Hsp105, Hsp110, HSPPC-96, 스트레스 단백질 gp96, gp96 관련 세포 펩티드, G250, 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 티로글로불린, STn, 암배아 항원(CEA), 암배아 항원(CEA) 펩티드 CAP-1, 암배아 항원(CEA) 펩티드 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이성 항원(PSA), PSA 항원 결정기 PSA-1, PSA-2, PSA-3, Ad5-PSA, 부갑상선호르몬 관련 단백질(PTH-rP), EGFR, PLU1, 암배아 항원-미성숙 라미닌 수용체(OFA-iLR), MN/CAIX(CA9), HP59, 시토크롬 산화효소1, sp100, msa, RanGTPase 활성화 단백질, Rab-GAP 단백질, PARIS-1, T 세포 수용체/CD3-ζ 사슬, cTAGE-1, SCP-1, 당지질 항원-GM2, GD2 또는 GD3, GM3, FucosylGM1, 당단백질 항원-Tn, Sialyl-Tn, TF 및 Mucin-1, CA125(MUC-16), MAGE 패밀리 항원, GAGE-1,2, BAGE, RAGE, LAGE-1, GnT-V, MUM-1, EP-CAM/KSA, CDK4, MUC 패밀리 항원, HER2/neu, ErbB-2/neu, p21ras, RCAS1, α-태아단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, NeuGcGM3, Fos 관련 항원, 시클로필린 B, RCAS1, S2, L10a, L10a, 텔로머라제 rt 펩티드, cdc27, p120ctn, PRAME, GA733/EoCam, NY-BR-1, NY-BR-2, NY-BR-3, NY-BR-4, NY-BR-5, NY-BR-6, NY-BR-7, NY-ESO-1, L19H1, MAZ, PINCH, PRAME, Prp1p/Zer1p, WT1, 대장 선종 폴립증 단백질(APC), PHF3, LAGE-1, SART3, SCP-1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, TAG-72, TRAG-3, MBTAA, Smad 종양 항원, lmp-1, HPV-16E7, c-erbB-2, EBV-코딩된 핵 항원(EBNA)-1, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSVtk), XAGE-1의 선택적 스플라이싱 이소폼, TGFbetaRII 프레임시프트 돌연변이, BAX 프레임시프트 돌연변이를 포함한다.
이 밖에, 이종 핵산은 CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44v7/8, CEA, EGF-RIII(표피 성장 인자 수용체형 돌연변이체 3)EGP-2, erb-B2, erb-B2, 3, 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, k 경쇄, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, NKG2D, 암배아 항원(h5T4), PSCA, 전립선 특이 막 항원(PSMA), 전립선 산 포스파타아제(PAP), 전립선 상피 세포 유래 Ets 전사 인자 (PDEF), mAbIgE를 표적으로 하는 TAA, TAG-72 및 VEGF-R2와 같은 유전자 산물을 코딩할 수 있다.
또는, 이종 핵산은 예를 들어 siRNA, 안티센스 분자 및 miRNA를 포함할 수 있다. 임상적으로 유용한 렌티바이러스 벡터는 또한 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 안티센스 유전자(Levine BL et al., (2006) Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(46):17372-7) 및 다른 중요한 인간 병원체를 발현할 수 있다. Naldini(Naldini L. (2011) Ex vivo gene transfer and correction for cell-based therapies. Nat. Rev. Genet. 12:301-315)은 렌티바이러스 및 관련 벡터의 이들 및 다른 유용한 응용에 대해 논의하고 인용하였다. 렌티바이러스 벡터에 포함된 안티센스 유전자는, 헌팅턴(HTT) 유전자, 치상핵 적핵 담창구 루이체 위축증과 관련된 유전자(예를 들어, atrophin 1, ATN1); 척수구근 근위축증의 X 염색체의 안드로겐 수용체, 인간 Ataxin-1, -2, -3 및 -7, (CACNA1A) 코딩된 Cav2.1P/Q 전압 의존성 칼슘 채널, TATA 결합 단백질, ATXN8OS로도 알려진 Ataxin8 반대편 사슬,척수소뇌 운동실조증 중 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 2A55kDa 조절 서브유닛 B β 이소형(1형, 2형, 3형, 6형, 7형, 8형, 12형, 17형), 취약 X 증후군 중의 FMR1(최약 X 정신 지체 1), 취약 X 관련 떨림/운동실조 증후군 중의 FMR1(취약 X 정신 지체 1), FMR1(취약 X 정신 지체 2) 또는 취약 X 정신 지체 중의 AF4/FMR2 패밀리 구성원 2; 근긴장성이영양증 중의 미오토닌 단백질 키나아제(MT-PK); 프리드리히 운동실조증 중의 프라탁신; 근위축성 측삭 경화증의 슈퍼옥시드 디스무타아제 1(SOD1) 유전자의 돌연변이; 파킨슨병 및/또는 알츠하이머병의 발병 기전에 관한 유전자; 아포지단백 B(APOB) 및 브틸리신 전구체 단백질 전환효소/kexin 9형(PCSK9), 고콜레스테롤혈증; HIV 감염 중의 HIVTat, 전사 유전자의 인간 면역결핍 바이러스 트랜스 활성화 인자; HIV 감염 중의 HIVTAR, HIVTAR, 인간 면역결핍 바이러스 트랜스 활성화 인자 반응 요소 유전자; HIV 감염 중의 C-C 케모카인 수용체(CCR5); RSV 감염 중의 라우스육종바이러스(RSV), C형 간염 바이러스 감염 중의 간 특이적 microRNA(miR-122); p53, 급성 신장 손상, 또는 신장 이식 시 지연된 이식 기능, 또는 신장 손상 급성 신부전; 진행성 또는 전이성 고형 종양 중의 단백질 키나아제 N3(PKN3); LMP2; 프로테아좀 소단위 베타 9형(PSMB9)으로도 알려진 LMP2, 전이성 흑색종; 프로테아좀 소단위 베타 8형(PSMB8)으로도 알려진LMP7, 전이성 흑색종; 프로테아좀 소단위 베타 10형(PSMB10)으로도 알려진 MECL1, 전이성 흑색종; 고형 종양 중의 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 고형 종양 중의 방추 키네신, 만성 골수성 백혈병 중의 아폽토시스 억제 B 세포CLL/림프종(BCL-2), 고형 종양 중의 뉴클레오티드 환원 효소 M2(RRM2), 고형 종양 중의 Furin; 간 종양의 Polo 유사 키나아제1(PLK1), C형 간염 바이러스 감염 중의 디아실글리세로아실 전이효소 1(DGAT1), 가족성 선종성 폴립증 중의 β-카테닌; β2-아드레날린성 수용체, 녹내장; DNA 손상 유도 전사 인자 4 단백질로도 알려진 당뇨병성 황반 부종(DME) 또는 연령 관련 황반 변성 중의 RTP801/Redd1; 연령 관련 황반 변성 또는 맥락막 혈관신생 중의 혈관 내피 성장 인자 수용체I(VEGFR1), 비동맥성 허혈성 시신경병증 중의 카스파제 2; 선천성 손발톱비대증 중의 케라틴 6AN17K 돌연변이 단백질; 인플루엔자 감염 중의 인플루엔자 A 바이러스 게놈/인플루엔자 감염에서의 유전자 서열; SARS 감염 중의 중증급성호흡기증후군(SARS) 코로나바이러스 게놈/유전자 서열; 호흡기 세포융합 바이러스 감염 중의 호흡기 세포융합 바이러스 감염 게놈/유전자 서열; 에볼라바이러스 감염 중의 에볼라 필로바이러스 게놈/유전자 서열; B형 및 C형 간염 바이러스 감염 중의 B형 및 C형 간염 바이러스 게놈/유전자 서열; HSV 감염 중의 단순 포진 바이러스(HSV) 게놈/유전자 서열, 콕삭키 B3 바이러스 감염 중의 콕삭키 바이러스 B3 게놈/유전자 서열; 원발성 근긴장이상 중의 토르신 A(TOR1A) 유사 침묵 질환 유발 대립 유전자(대립 유전자 특이성 침묵), 이식 중의 팬 클래스 I 및 HLA 대립 유전자; 상염색체 우성 색소성 망막염(adRP) 중의 돌연변이된 로돕신 유전자(RHO); 또는 임의의 상기 유전자 또는 서열의 전사체에 결합하는 억제 핵산의 발현을 억제할 수 있다.
일 실시형태에서, 이종 핵산은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, 또는 CD269(BCMA)를 표적으로 하는 CAR과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 암배아 항원(CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR, HER2), 티로신 키나아제 수용체(EPHA2) 등을 포함한 성장 및 분화 신호에 관여하는 항원을 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(VEGFR) 등을 포함한 종양 혈관 신생에 관여하는 항원을 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종 핵산에 의해 코딩된 CAR은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신(tenascin) 단백질 등을 포함한 종양 지지 구조의 종양 스트로마 및 세포외 기질 항원을 표적으로 할 수 있다. 이종 핵산 함유 플라스미드는 pCDH 및 pCMV 등을 포함할 수 있다.
숙주 세포계의 스크리닝
적합한 숙주 세포를 선택하면 바이러스 벡터의 생산량을 크게 증가시킬 수 있다. 바람직한 세포는 무혈청 배양에 적합하고, 및/또는 현탁 배양에 적응된 세포이다. 상술한 바와 같이, 무혈청 배지를 사용하여 세포 배양과 증폭을 진행하면 최종 제품에서 잠재적인 면역원성 물질 오염 및 동물성 성분을 줄일 수 있고, 다운스트림 정제 공정을 단순화할 수 있으며, 정제 공정의 단순화는 바이러스 벡터의 수율 및 활성을 향상시킬 수 있다. 이 밖에, 현탁 배양은 부착 배양보다 바이러스 벡터의 대규모 제조에 더 적합하다.
무혈청 배양
일반적으로, 동물 세포의 성장은 혈청의 존재에 의존한다. 대부분의 세포는 혈청을 추가하지 않으면 증식할 수 없다. 혈청 배지는 일반적으로 소 혈청이 첨가된다.
혈청의 성분은 물질의 수송을 돕는 단백질과 영양소, 세포 성장을 촉진하는 호르몬과 인자 등을 포함하여 복잡한데, 혈청의 이러한 천연 성분의 복잡성으로 인해 혈청은 세포 성장을 유지하고 배양 세포의 성장을 촉진하는 호르몬을 제공하는 것을 포함한 세포 배양 과정에서 다양한 기능을 수행하며; 기본 배지에 없거나 적은 양의 영양소를 보충하고; 결합 단백질을 제공하여 비타민, 지질 및 다른 호르몬 등의 세포 인식 및 활용을 촉진하고; 경우에 따라 결합 단백질은 독성 금속 및 발열원과 결합하여 해독 역할을 하며; 세포 부착을 촉진하고, 플라스틱 배양 기질에서 세포 퍼짐을 촉진할 수 있는 인자를 제공하며; pH 완충제 역할을 하고; 프로테아제 억제제를 제공하여 세포 소화 중에 잔류 트립신을 불활성화하고 세포를 손상으로부터 보호한다. 그러나, 소 혈청의 사용은 외인성 바이러스 및 병원성 요인을 오염시킬 위험이 있으며, 상이한 배치(batch)의 소 혈청 사이의 생물학적 활성 및 요인의 불일치로 인해 제품 및 실험 결과의 재현성이 좋지 않아 제품에 잔류 소 혈청이 발생하여 바이러스 벡터를 받는 사람의 혈청에 알레르기 반응을 일으키기 쉽다.
SFM이라고 하는 무혈청 배지는 혈청을 첨가하지 않은 세포 배양 배지이다. 이는 천연 배지, 합성 배지에 이은 세 번째 배지이다. 기존의 배지와 비교하여 무혈청 배지는 동물 혈청 또는 다른 생물학적 추출액을 포함하지 않지만 시험관 내에서 오랫동안 세포의 성장과 번식을 유지할 수 있다. 비교적 명확한 조성 성분과 간단한 제조 과정으로 인해 SFM은 현대 생명 공학 분야에서 널리 적용되어 왔으며 세포 성장, 증식, 분화 및 유전자 발현 조절의 기초 연구 문제를 해명하는 강력한 도구이기도 하다.
무혈청 배지에는 현재 두 가지 유형이 있는데, 하나는 아무런 동물성 첨가 성분도 포함되지 않은 것이고 다른 하나는 아무런 불특정 첨가 성분도 포함되지 않은 것이다. 현재 비교적 많이 적용되는 배지는 다음과 같은 네 가지가 있다.
첫 번째는 일반적인 의미의 무혈청 배지로, 소 혈청 알부민, 트랜스페린, 인슐린 등 생물학적 거대 분자 뿐만 아니라 혈청으로부터 추출된 단백질 제거된 혼합 지질 및 가수분해 단백질 등과 같은 혈청의 기능을 대체할 수 있는 다양한 생물학적 재료로 세포 배양 배지를 조제한다. 배지 내 단백질 함량이 비교적 높은 것이 특징이지만 첨가된 물질의 화학적 성분이 불분명하고 동물성 단백질을 다량 함유하고 있다.
두 번째는 동물성이 아닌 배지이다. 많은 상업 회사에서 개발한 동물성이 아닌 배지는 재조합 의약품의 생산을 위한 안전성 고려 사항을 기반으로 하며, 배지에 첨가되는 동물성이 아닌 조성 성분에 필요한 단백질은 재조합 단백질 또는 단백질 가수분해물로부터 유래되는데, 이러한 조성 성분은 세포 성장 및 증식의 필요성을 보장할 수 있다.
세 번째는 동물성 단백질이 없는 배지이다. 배지는 동물성 단백질을 전혀 사용하지 않으나, 식물성 단백질의 가수분해 단편이나 합성 폴리펩티드 단편 등 다른 유도체로부터 유래된 일부 첨가물은 여전히 존재한다. 이러한 배지의 조성 성분은 상대적으로 안정적이지만 스테로이드 호르몬과 지질 전구체가 첨가되어야 하며 배양되는 세포에 대해 매우 특이적이다.
네 번째는 화학 조성 성분이 한정된 배지이다. 이러한 유형의 배지는 현재 가장 안전하고 이상적인 배지로서 배지 배치 간의 일치성을 보장할 수 있으며 소량 첨가된 동물성 단백질 가수분해물 및 단백질은 성분이 명확한 조성 성분입니다. 그 특징은 배지의 성질이 정해져 있어 배지를 혼합하는 것이 더 편리하다는 것이다.
무혈청 배지는 다음과 같은 장점을 갖는 바, 혈청 배치 간의 품질 변화를 피할 수 있고, 세포 배양 및 실험 결과의 반복성을 향상시킬 수 있으며; 세포에 대한 혈청의 독성 작용 및 혈청 유래 오염을 피할 수 있고; 실험 연구에 대한 혈청 조성 성분의 영향을 피할 수 있으며; 시험관 내 배양 세포의 분화에 유리하고; 제품의 발현 수준을 증가시킬 수 있어 세포 제품의 정제가 용이하며; 조성 성분이 안정적이고 대량 생산이 가능하며; 미토겐 억제제를 포함하지 않고, 세포 증식을 촉진할 수 있다. 이러한 유형의 배지의 단점은 다음과 같은 바, 세포는 무혈청 배지에서 특정 기계적 및 화학적 요인에 의해 쉽게 영향을 받아 배지의 보존 및 적용이 기존의 합성 배지만큼 편리하지 않고; 비용이 높으며; 표적성이 매우 강하여 한 가지 무혈청 배지는 단지 특정 유형의 세포 배양에만 적합하고; 발달의 상이한 분화 단계에 있는 세포는 상이한 조성을 필요로 하며 성장 인자와 시토카인의 선택이 특히 중요하다. 또한 혈청을 제거하는 동안 일부 혈청 단백질이 제공하는 보호 작용도 제거되므로 시약, 물의 순도 및 기기 청결에 대한 요구가 더 높다.
무혈청 배지는 호르몬, 성장 인자, 부착 인자 및 결합 단백질이 첨가된 영양 완전 기본 배지로 만들어진다.
초기 세포 배양에 사용되는 기본 배지에는 혈장 응고액, 림프액, 대두 펩톤 및 배아 추출물 등과 같은 천연 배지가 있다. 1950년 Morgan 등은 선배들의 연구를 바탕으로 199 배지를 연구해내어 동물 세포 배양 배지를 새로운 단계, 및 합성 배지의 단계로 발전시켰다. 합성 배지는 세포 성장의 필요에 따라 일정 비율의 아미노산, 비타민, 무기염, 포도당 등으로 구성된 기본 배지이다. 현재 시장에는 수백 가지의 합성 배지 제품이 있다. 많은 합성 배지에서, MEM, DMEM, RPMI 1640, F12, 및 TC100이 가장 널리 사용된다. 기본 배지의 성분은 완전히 알려져 있으므로, 상이한 세포주를 배양할 때, 기본 배지의 일부 조성 성분은 그에 따라 세포주의 영양 요건을 더 잘 충족시키거나 표적 단백질의 발현량을 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
보충 인자라고도 하는 무혈청 배지의 첨가 인자는 혈청을 대체하는 다양한 인자의 총칭이다. 대부분의 무혈청 배양액에는 3~8가지 인자가 보충되어야 하며 어떠한 단일 인자도 혈청을 대체할 수 없다. 이러한 인자는 100가지 이상 알려져 있으며 그 중 일부는 인슐린, 아셀렌산나트륨, 트랜스페린과 같은 반드시 보충되어야 하는 인자이고 나머지 대부분은 보조 작용을 하는 인자이다. 다양한 기능에 따라 보충 인자는 네 가지 유형으로 나눌 수 있다.
첫 번째 보충 인자는 호르몬 및 성장 인자이다. 많은 세포는 무혈청 배양 시 인슐린, 성장 호르몬, 글루카곤 등과 같은 호르몬을 첨가해야 한다. 거의 모든 세포계는 세포의 인슐린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하고 RNA, 단백질 및 지방산의 합성을 촉진할 수 있는 폴리펩티드인 인슐린을 필요로 하며 중요한 세포 생존 인자이다. 세포 무혈청 배양에서, 인슐린의 사용 농도는 0.1~10 μg/ml이다. Jan 등은 회분식 배양에서 인슐린의 급속한 고갈이 세포 특이적 성장률 감소의 주요 원인이라고 생각하였다. 이 밖에, 프로게스테론, 하이드로코르티손, 에스트라디올과 같은 갑상선 호르몬 및 스테로이드 호르몬도 무혈청 세포 배양을 위한 보충 인자로 흔히 사용된다. 상이한 세포주는 호르몬의 종류 및 양에 대한 요구가 다르다. 성장 인자는 시험관 내에서 세포의 생존, 증식 및 분화를 유지하는데 필요한 보충 인자이다. 화학적 성질에 따라 폴리펩티드계 성장 인자와 스테로이드계 성장 인자로 나눌 수 있다. 무혈청 배지에 첨가되는 성장 인자는 주로 폴리펩티드계 성장 인자이며, 최근 몇 년 동안 20~30가지의 폴리펩티드계 성장 인자가 동정되었으며, 그 중 절반 이상이 유전자 재조합 수단을 통해 해당 재조합 성장 인자를 얻을 수 있다. 무혈청 배지에서 보다 일반적인 성장 인자에는 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 신경 성장 인자(NGF) 등이 있다. 성장 인자는 세포 집단 배가 시간을 단축시킬 수 있는 강력한 미토겐이다.
두 번째 보충 인자는 결합 단백질이다. 결합 단백질에는 두 가지가 있는데, 하나는 트랜스페린이고 다른 하나는 알부민이다. 대부분의 포유동물 세포에는 특정 트랜스페린 수용체가 존재하고, 수용체와 트랜스페린 및 철 이온의 복합체 결합은 필수 미량 원소 철을 얻기 위한 세포의 주요 공급이며, 또한 트랜스페린은 성장 인자의 성질도 가지고 있으며 바나듐 등과 같은 다른 미량 원소와 결합할 수 있다. 세포마다 트랜스페린에 대한 요구가 다르다. 알부민은 또한 무혈청 배지에서 일반적으로 사용되는 첨가 인자이다. 이는 비타민, 지질, 호르몬, 금속 이온 및 성장 인자와 결합하여 무혈청 배지에서 상기 물질의 활성을 안정화 및 조절하는 작용이 있고, 또한 독소를 결합하고 프로테아제가 세포에 미치는 영향을 줄이는 작용도 있다.
세 번째 보충 인자는 부착 인자이다. 대부분의 진핵 세포는 시험관 내 성장을 위해 적합한 기질에 고정되어야 한다. 세포 고정 작용은 부착 인자의 용기 또는 벡터의 표면으로의 부착, 세포와 부착 인자의 결합 등을 을 포함하는 복잡한 과정이다. 무혈청 배양에서 일반적으로 사용되는 부착 인자에는 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌 및 폴리라이신 등과 같은 세포간질 및 혈청 중의 성분이 포함된다. 예를 들어 본 출원의 현탁 배양에서, 배지는 부착 인자를 첨가할 필요가 없다.
일부 세포계의 무혈청 배양은 또한 미량 원소, 비타민, 지질 등과 같은 특정 저분자량 화학 물질을 보충해야 하고, 비타민 B는 주로 조효소의 형태로 세포 대사에 관여하며, 비타민 C와 비타민 E는 항산화 작용이 있다. 부탄디아민과 리놀레산 등은 세포막 합성에 필요한 지질과 세포 성장에 필요한 수용성 지질을 제공한다.
현재 대규모 동물 세포의 배양에서 무혈청 배지가 널리 사용되고 있다. 백신 성장, 단클론 항체 및 다양한 생물학적 활성 단백질 등과 같은 생물학적 제품의 적용 분야에서, 무혈청 배지의 성분을 최적화하면 상이한 세포가 세포 성장과 목표 산물의 발현에 가장 도움이 되는 환경에서 고밀도 배양으로 유지되도록 할 수 있어 생산 비용을 절감한다. 인간 세포 배양에서, 무혈청 배지를 적용하면 섬유아세포의 과성장을 선택적으로 제어하고 피할 수도 있다. 무혈청 배양 조건에서 특정 세포의 성장량과 항체의 생산량은 혈청이 있을 때보다 심지어 몇 배 더 높다.
생물학적 제품의 생산 외에도 무혈청 배지는 세포 생물학, 약리학 및 종양학 분야에서도 널리 사용된다. 예를 들어, 무혈청 배지를 사용하여 세포의 분화 조건을 연구할 수 있다. 무혈청 배지의 조성은 완전히 알려진 화학 물질일 수 있으므로 연구의 필요에 따라 중요한 생리활성물질의 종류와 양을 증감할 수 있다. 이것은 세포 분화의 조건을 연구하기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 또한 예를 들어 무혈청 배지를 사용하여 다양한 세포 혼합 배양에서 표적 세포를 선택할 수 있다. 무혈청 배양에서 특정 성분을 선택함으로써 일차 조직 배양물에서 비표적 세포의 과도한 성장을 억제할 수 있고, 표적 세포를 선택하는 목적을 달성할 수 있다. 무혈청 배양은 종양 병리학 및 병인학 연구에도 사용된다. 예를 들어, 세포에 대한 발암성 인자의 영향 연구, 정상 세포의 말단 분화를 유발할 수 있는 말초 신호에 대한 종양 세포의 반응 능력 연구, 또는 정상 세포와 종양 세포의 성장과 이동, 기저막 신호 등의 관계 연구에 사용된다. 이 밖에, 무혈청 배양은 호르몬, 성장 인자 및 약물 등과 세포의 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있다.
상업적으로 이용 가능한 무혈청 세포 성장 배지는 FreeStyleTM 293(GibcoTM, Life Technologies), DMEM/F12(GibcoTM, Life Technologies), SFM4Transfx-293(HyCloneTM, ThermoScientific), CDM4HEK293(HyClone TM, ThermoScientific), StemPro-34SFM(GibcoTM, Life Technologies), FreeStyle F17(GibcoTM, Life Technologies), 293SFMII(GibcoTM, LifeTechnologies), CD293(GibcoTM, LifeTechnologies), LV-MAX(A35834-01, GibcoTM), Expi293(Gibco TM, A14351-01), EX-CELL®293(Sigma, 14571C-1000mL), BanlanCD HEK293(Irvine, 91165), Pro293s-CDM(Lonza, 12-765Q), OPM-293 CD03(OPM, 81070-001), Celkey CD HEK293(Jianshun, 10804-19008) 배지를 포함한다.
현탁 배양
현탁 배양이란 단일 세포 및 소세포 군집 배양을 위한 배지 내에 세포를 분산시켜 현탁시키는 것을 의미하며, 부착 비의존성 세포의 배양 방법이다. 특정 부착 의존성 세포는 적응 및 선택 후 이 방법으로 배양할 수도 있다. 현탁 배양 규모를 확장하는 것은 부피를 늘리기만 하면 되므로 비교적 간단하다. 배지의 깊이가 일정 값을 초과하면 장치를 흔들거나 돌려서 배지를 흔드는 것이 필요하다. 배지의 깊이가 깊으면 충분한 가스 교환을 보장하기 위해 이산화탄소와 산소도 통과시켜야 한다.
현탁 배양 기술은 세포 부착성에 따라 현탁 세포 배양 기술과 부착 세포 미세담체 현탁 배양 기술로 구분된다. 현탁 세포(CHO 세포, BHK21l 세포 등)는 반응기에서 직접 생산 및 증식할 수 있으며, 세포는 자유롭게 성장하고, 배양 환경은 균일하며, 샘플링이 간단하고, 배양 조작이 간단하고 제어 가능하며, 증폭이 편리하고, 오염률과 비용이 낮으며; 반응기 내 부착 세포의 현탁 배양은 미세담체의 사용이 필요하고, 세포와 구체의 접촉 부위의 영양분 환경이 열악하고, 배양, 샘플링 관찰 및 증폭 공정이 복잡하며 비용이 많이 든다. 현탁 배양과 비교하여 미세담체 배양 공정은 복잡하지만 여전히 스피너 병 배양에 비해 생산 규모, 제품 품질 및 노동 효율을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있으므로 부착 세포의 현탁 배양의 주요 수단이다.
세포 현탁 배양 공정은 배양 방법에 따라 회분식 배양, 유가 배양 및 관류 배양으로 구분된다. 회분식 배양은 생물 반응기에서 세포의 성장 및 대사 변화를 직관적으로 반영할 수 있으며 조작이 간단하지만 초기 단계에서 많은 대사 폐기물이 있어 세포 성장을 억제하고 세포 성장 밀도가 높지 않으며; 유가 배양은 조작이 쉽고, 산율이 높으며, 증폭이 용이하고 널리 사용되지만 유가 배지를 설계해야 하며; 관류 배양은 배양 부피가 작고, 회수 부피가 크며, 탱크 내 제품의 체류 시간이 짧고, 적시에 회수할 수 있어 저온 보관이 가능하여 제품의 활성을 유지하는데 유리하지만, 조작이 비교적 복잡하고 세포 배양 배지의 이용 효율이 낮으며 스핀 필터가 막히기 쉽다. 상이한 바이러스 벡터의 경우 상이한 세포 배양 방법이 사용된다. 예를 들어, 분비되고 제품 활성이 급격히 감소하는 생물학적 제품의 경우 관류 배양을 사용해야 하며 관류 배양도 미세담체 배양에 더 적합하다.
적합한 생산 공정을 선택한 후에는 과정 제어가 핵심이 된다. 세포가 최적의 환경에서 성장하도록 확보하려면 반응기의 온라인 모니터링 기능을 사용하여 다양한 작동 매개변수를 제어해야 한다. 세포는 온도에 민감하며 세포 손상을 방지하기 위해 배양 온도를 35℃~37℃로 조절하기 위한 적절한 가열 또는 냉각 방법이 필요하다. 동물 세포 성장에 적합한 pH 범위는 일반적으로 6.8~7.3 사이이며 6.8보다 낮거나 7.3보다 높은 pH는 세포 성장에 악영향을 미칠 수 있다.
세포 배양의 규모를 확장할 수 있는지 여부는 반응기 선택의 중요한 전제 조건이며 현탁 배양 규모의 확장은 주로 반응기의 부피를 늘리거나 반응기의 수를 늘리는 것인데, 반응기의 부피를 늘리면 많은 지원 엔지니어링 및 인건비를 절약할 수 있는 반면, 여러 개의 소형 반응기는 유연하게 작동할 수 있지만 비용은 상대적으로 높다. 국외 생물의약품 생산에 사용되는 대부분의 생물 반응기는 단계적 규모 확장이 가능한 비교적 대규모 생물 반응기이다. 생물 반응기의 선택 및 배치도 생산 공정 및 생산 능력 요구를 고려하고 충족해야 한다. 반응기 인터페이스의 표준화, 부품 공급 속도 및 애프터 서비스 품질 등은 모두 생산 지연을 피하기 위해 산업화를 위한 생물 반응기 선택의 요소로 고려되어야 한다.
액체 현탁 배양 과정에서 배양물이 일정 기간까지 성장하면 분열의 정지기에 들어가기 때문에 세포의 적시 계대배양에 주의를 기울여야 한다. 대부분의 현탁 배양물의 경우 세포는 18일에서 25일 사이에 최대 밀도에 도달하며 이때 첫 번째 계대배양을 수행해야 한다. 계대배양할 때 더 큰 세포 덩어리와 접종물 파편을 제거해야 한다.
세포주의 스크리닝
세포 스크리닝 및 순화의 실질은 현대 세포 생물학 기술을 적용하여 상이한 배양 모드(예를 들어, 현탁), 상이한 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에 적응하고, 세포 사멸율을 낮추며, 세포 생존력을 향상시키고, 세포 수명 주기를 연장하며, 산물 농도를 향상시키는 연구를 통해 생산에 적합한 세포주를 스크리닝하는 것이다. 순화의 안정성을 구현하기 위해 고밀도 세포 배양에서 저밀도 세포 배양으로 전환하는 것이 일반적이며, 고농도 혈청 배양에서 점차적으로 혈청 농도를 감소시킨다. 세포는 손상 후 복구가 어렵기 때문에 순화하는 동안 세포 생존율을 90% 이상으로 유지해야 한다. 세포의 증식 능력은 생산 능력에 직접적인 영향을 미치며, 순화 시 세포의 증식 능력에 대한 측정을 유지해야 한다. 세포가 순화될 때 순화 후 세포의 발현 특성의 변화를 피하기 위해 세포의 발현 및 분비 능력도 측정해야 한다. 순화된 세포의 증식 능력, 활력 및 생산 능력은 대규모 산업 생산의 요구를 충족할 수 있어야 한다. 특정 세포의 영양 요구가 다르기 때문에 순화 난이도도 다르며, 순화 시 적합한 세포 배양 배지를 선택하고 세포의 특정 요구를 충족시키기 위해 특정 영양소를 표적적으로 보충하여 순화된 세포가 현탁 또는 무혈청 성장 특성을 유지할 수 있도록 해야 한다.
이 밖에, 현탁 배양에서, 세포는 쉽게 응집된다. 세포의 응집은 많은 벡터 생산용 플라스미드가 세포를 형질감염시킬 수 없고 큰 응집체 중간에 있는 세포는 영양분 부족으로 인해 죽게 될 수 있다. 현재, 세포의 응집을 개선하는 방법은 주로 항응집제를 첨가하는 것이다. 그러나 항응집제를 첨가하면 형질감염 효율이 현저히 감소되어 세포가 렌티바이러스를 형질감염시키지 못하고 패키징할 수 없게 된다.
고분산성, 고증식 밀도 및 고생산 바이러스 벡터를 갖는 세포주의 순화/스크리닝하기 위한 효율적이고 편리한 방법이 해당 분야에서 절실히 필요하다.
본 출원에서, 발명자들은 현재 렌티바이러스 제조에서 가장 많이 사용되는 HEK293T 세포에 대한 순화/스크리닝 방법을 주로 개선하였다.
우선, 본 발명자들은 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 고농도 혈청 배양에서 혈청 농도를 점차적으로 감소시키는 배양 단계를 채택하지 않고 일반 배지에서 배양된 부착 세포를 무혈청 배지에 직접 첨가하여 현탁 배양함으로써, 시간을 크게 절약할 수 있으며, 분산성이 높고(즉, 쉽게 응집되지 않음), 증식 밀도가 높으며, 바이러스 벡터가 많이 생산되는 세포주를 성공적으로 스크리닝하는데 도움이 될 수 있다.
이 밖에, 본 출원의 발명자들은 또한 LV-MAX 생산 배지(Gibco, A35834-01), Expi293 발현 배지(Gibco, A14351-01) 및 OPM-293 CD03 배지(OPM, 81070-001)와 같은 몇 가지 특정 무혈청 현탁 배지를 사용하면 분산성이 우수하고 응집되지 않는 세포주를 스크리닝하는데 더 유리함을 발견하였다. 구체적으로, 이러한 3가지 배지로부터 스크리닝된 세포는 더 높은 밀도(~1E7 세포/ml)에 도달할 수 있고 응집된 세포의 비율이 상대적으로 낮아 응집되지 않은 서브클론의 스크리닝에 유리하다.
본 출원에서 스크리닝된 세포는 주로 렌티바이러스 벡터 제조에 일반적으로 사용되는 HEK293T 세포로, 이는 증식이 빠르고, 형질감염 효율이 높으며, 바이러스 벡터의 효율적인 생산이 가능하고, 바이러스 벡터의 대규모 제조 가능성을 가지고 있다.
구체적으로, 본 출원은 무혈청 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주의 스크리닝 또는 순화 방법을 제공하며, 상기 방법은,
i) 혈청 함유 배지에서 부착 배양된 HEK293T 세포를 취하여 무혈청 배지에 넣어 현탁 배양하는 단계, 및
ii) 무혈청 현탁 배양에 적응된 단클론 세포주를 선택하는 단계를 포함한다.
단계 i)의 혈청 함유 배지는 10% 혈청, 예를 들어 10% 소태아혈청을 함유할 수 있다.
단계 i)의 현탁 배양은 37℃ 및 8% CO2 조건에서의 진탕 배양을 포함할 수 있다.
단계 i)의 현탁 배양은 세포 계대배양을 포함할 수 있다.
무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지(Gibco, A35834-01), Expi293 발현 배지(Gibco, A14351-01), FreeStyle™293 발현 배지(Gibco, 12338-018), CD293 AGT 배지(Gibco, 11913-019), EX-CELL®293 무혈청 배지(Sigma, 14571C-1000mL), BanlanCD HEK293 배지(Irvine, 91165), Pro293s-CDM 무혈청 배지(Lonza, 12-765Q), OPM-293 CD03 배지(OPM, 81070-001) 및 Celkey CD HEK293 배지(Jianshun, 10804-19008)로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지이다.
단계 ii)는 무혈청 현탁 배양에 적응되고 분산성이 우수(즉, 응집되지 않음)한 단클론 세포주를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 ii)는 반고체 배지에서 세포를 배양하고, 반고체 배지에서 단일 세포를 선택하며, 선택된 세포를 현탁 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 ii)의 선택된 세포의 현탁 배양은 37℃ 및 8% CO2 조건에서의 진탕 배양을 포함할 수 있다. 단계 ii)의 선택된 세포의 현탁 배양은 세포 계대배양을 포함할 수 있다.
반고체 배지는 스크리닝 배지가 첨가된 메틸셀룰로오스계 배지일 수 있다.
상기 방법의 실시 과정에서, 항응집제를 첨가할 필요가 없다.
본 출원의 방법에서, 1) 혈청 함유 배지에서 부착 배양된 세포를 혈청 점진적 감소 단계 없이 직접 무혈청 배양하므로 스크리닝 과정을 단축할 수 있고; 2) 무혈청 배지로 세포를 배양하므로, 잠재적인 면역원성 물질 오염 및 동물성 성분을 방지하고, 다운스트림 정제 공정을 단순화하며; 3) LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택된 무혈청 배지를 사용하므로, 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주, 즉 증식 밀도가 높고 분산성이 우수한 HEK293T 세포주를 스크리닝하는데 더욱 유리하고; 4) 항응집제의 사용을 피하므로 세포의 형질감염 효율에 영향을 미치지 않으며; 및 5) 반고체 배지를 사용하므로, 조건에 부합되는 단클론의 스크리닝에 편리하다.
반고체 배양
또한, 본 출원의 발명자들은 상기 스크리닝 방법에서 제한 희석법 대신 단클론 세포 스크리닝을 위한 반고체 배양법을 사용하였다.
제한 희석은 실험실에서 통상적으로 사용되는 세포 복제 방법이다. 그러나, 제한 희석법은 하나의 웰 내에 여러 세포를 추가할 수 있기 때문에 단클론성 확률을 높이려면 다중 서브클로닝이 필요하다. 이 밖에, 실험에서 서브클론을 스크리닝하기 위해 제한 희석법을 사용하였고, 웰 플레이트의 단일 세포가 정상적으로 증식하지 못하는 것을 발견하였는데, 이는 세포 자체의 특성과 관련이 있을 수 있다. 반고체 배지는 보다 빠르고 간단한 클로닝 방법으로, 개별 세포를 반고체 배지에 고정하고 별개의 단클론 세포 집단으로 성장시켜 세포의 성장을 추적하는데 유리하다. 또한, 단클론 세포를 일정 수로 증폭시킨 후 웰 플레이트로 옮기면 단일 세포가 정상적으로 증식하지 못하는 문제를 개선할 수 있다. 이 밖에, 반고체 배지를 사용하면 동일한 웰 내에 여러 개의 세포를 심을 수 있어 작업자의 작업량을 줄일 수 있고, 제한 희석법과 비교하여 배양 웰 플레이트의 수를 줄이고 시약, 소모품 및 인큐베이터 공간을 절약할 수 있다.
반고체 배지는 주로 해당 분야에서 하이브리도마 및 CHO 세포 배양에 많이 사용되어 세포 클로닝을 보다 효율적으로 수행할 수 있다. 바이러스 벡터 패키징/생산 세포의 스크리닝에서 반고체 배양의 적용은 아직 보고되지 않았다.
본 출원의 숙주 세포주
ECACC에서 구입한 HEK293T 세포를 시작으로 본 출원의 세포주 스크리닝/순화 방법을 통해 증식 밀도가 높고 분산성이 높은 다양한 세포주를 얻었다.
그 중 하나는 PowerSTM-293T로 명명되고, 2020년 12월 7일에 부다페스트 조약에 따라 중국 일반 미생물 균종 보존 관리 센터(CGMCC)에 보존되며, 기탁번호는 CGMCC No.: 21110이다.
PowerSTM-293T 세포주는 무혈청 배지에서 현탁 배양에 의해 성장할 수 있다. 상기 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택될 수 있다.
PowerSTM-293T 세포주는 현탁 배양 과정에서 세포 응집이 발생하지 않을 수 있다.
PowerSTM-293T 세포주는 바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다.
PowerSTM-293T 세포주는 무혈청 배지에서 현탁 배양에 의해 성장될 수 있고, 증식 밀도가 높으며, 활성이 우수하고, 세포 응집이 발생하지 않으며, 즉 분산성이 높다. 따라서, 현탁 배양 과정에서 항응집제를 별도로 첨가할 필요가 없다.
PowerSTM-293T 세포는 OPM-293 CD03 배지에서 배가 시간이 약 22시간으로 짧고, 세포 대수기 밀도는 5-7×106 세포/ml에 도달할 수 있으며, 최고 밀도는 1.48×107 세포/ml에 도달할 수 있다.
Gibco의 CTS™ 바이러스 생산 세포(공개 번호: MAN0018590)와 비교하면, PowerSTM-293T의 세포 배가 시간이 짧고, 바이러스 플라스미드의 형질감염 후 더 많은 바이러스 벡터 입자를 생산한다.
아래, 도면과 함께 실시예를 통해 본 발명의 기술적 해결수단을 더 상세하게 설명한다. 달리 명시되지 않는 한, 아래에 설명된 실시예의 방법 및 재료는 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다. 당업자라면 아래에 설명된 방법 및 재료는 예시적일 뿐이며 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 아니됨을 이해할 것이다.
실시예 1. HEK293T 세포의 무혈청 현탁 순화
ECACC에서 구입한 HEK293T 세포를 37℃ 워터배스에서 1분 미만으로 배양하고 동결보존 튜브에 얼음이 없을 때까지 동결보존 튜브에서 세포를 빠르게 해동하였다.
세포를 동결보존 튜브에서 멸균된 원심분리 튜브로 옮기고 4~5 ml의 예열된 DMEM(10% FBS 포함)을 첨가하여 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다.
배양 플라스크 중의 상청액을 버리고 세포 펠릿을 10 ml의 DMEM(10% FBS 포함)에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 T75 배양 플라스크에 넣고, T75 배양 플라스크를 37℃ 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣었다.
세포를 3일 동안 배양하고, 세포 컨플루언스>90%일 때 배양 플라스크 중의 세포 배양 배지를 버렸다. 여기서 세포 컨플루언스는 단일층에서 성장한 세포에 대해 현미경으로 관찰되는 상기 단일층 세포에 의해 덮힌 배양 용기의 표면적의 백분율을 의미한다. 5 ml의 DPBS로 접착층을 한 번 헹구었다. 0.25% 트립신(Gibco, 12563-029)으로 세포를 2분 동안 배양하고, 세포가 분리된 후, 4~5 ml의 10% FBS 함유 DMEM을 T75 배양 플라스크에 첨가하였다.
세포를 무균 원심분리 튜브에 옮겨 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다.
상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 10 ml의 DMEM(10% FBS 포함)에 재현탁하며, 재현탁된 세포를 T75 배양 플라스크에 넣고, T75 배양 플라스크를 37℃ 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣었다.
세포가 부착 정상에 완전히 적응하고 컨플루언스가 90%일 때 계대배양하였다.
세포를 0.25% 트립신으로 소화시킨 다음 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿에 신선한 무혈청 배지(SFM)를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지(Gibco, A35834-01), Expi293 발현 배지(Gibco, A14351-01), FreeStyle™293 발현 배지(Gibco, 12338-018), CD293 AGT 배지(Gibco, 11913-019), EX-CELL®293 무혈청 배지(Sigma, 14571C-1000mL), BanlanCD HEK293 배지(Irvine, 91165), Pro293s-CDM 무혈청 배지(Lonza, 12-765Q), OPM-293 CD03 배지(OPM, 81070-001), Celkey CD HEK293 배지(Jianshun, 10804-19008)인 총 9가지를 포함한다. 무혈청 배지 중의 세포를 125 ml의 진탕 플라스크에 옮긴 다음 37℃ 및 8% CO2의 인큐베이터에 넣고, 진탕 직경이 19 mm이고 회전 속도가 125 rpm인 진탕기에서 배양하였다.
세포 밀도가 3~6×106 세포/ml에 도달하면 계대배양하고, 0.35~0.55×106 세포/ml의 밀도로 세포를 접종하며, 생존율이 95%를 초과할 때까지 3-4일 동안 배양하되, 여기서 생존율은 VI-CELL 세포 계수기(BECKMAN)로 결정하였다.
9가지 무혈청 배지에서 배양한 세포액을 세포 배양 플레이트에 넣고, 현미경으로 촬영하여 클로니 형태를 관찰하였으며 이는 도 1에 도시된 바와 같다.
여기서, LV-MAX 생산 배지(Gibco, A35834-01), Expi293 발현 배지(Gibco, A14351-01), 및 OPM-293 CD03 배지(OPM, 81070-001)에서 순화된 세포는 밀도가 더 높고 분산성이 더 우수하다. 이 3가지 배지에서 순화된 세포를 취하여 성장 곡선을 측정하였다. 구체적으로, 0.4±0.5×106 세포/ml의 세포 밀도로 세포를 세포 배양 플라스크에 접종하여 D0로 기록하고, 600μL의 세포 현탁액을 취하여 세포를 계수한 후, 8일 동안 현탁 배양하고 매일 600μL의 세포 현탁액을 취하여 세포를 계수하며, 세포의 성장 곡선을 그렸으며 이는 도 2에 도시된 바와 같다. 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 3가지 배지에서의 세포 성장 밀도 및 생존율은 동일한 경향을 나타내고, 최고 세포 밀도는 모두 1×107 세포/ml보다 크며, 세포 생존율은 90%보다 크다.
계대배양을 통해 더 높은 밀도에 도달할 수 있는 세포를 선택하고, 최종적으로 상기 3가지 배지에서 1.2 ×107 세포/ml의 가장 높은 현탁 밀도를 갖는 세포계를 선택하였다. 세포를 1×107 생세포/ml의 최종 밀도로 동결보존하여 스크리닝된 무혈청 현탁 배양 세포계로 사용하였다. 이때의 세포에는 10~20개의 세포 응집체가 존재할 수 있다.
실시예 2. 무혈청 현탁에 의해 순화된 HEK293T의 성능 최적화
무혈청 현탁에 의해 순화된 HEK293T 세포의 응집 문제를 더 해결하기 위해, LV-MAX 생산 배지, Expi293 및 OPM-293 CD03 배지에 적응된 세포를 반고체 매트리겔을 사용하여 클로닝 및 스크리닝하였으며, 구체적인 단계는 다음과 같다.
상기 3가지 무혈청 배지를 사용하여 실시예 1에서 얻은 무혈청 현탁에 의해 순화된 세포를 각각 대응되게 희석하고, 밀도가 5×103 세포/mL인 세포 현탁액을 제조하였다.
1 mL의 반고체 매트리겔(Stemcell, 03816)을 함유하는 각 분취된 2.0mL의 동결보존 튜브에 각 세포 현탁액 100 μL, 200 μL, 300 μL, 또는 400 μL을 첨가하여 세포 농도 구배를 형성하되, 즉 각 세포에 대해 4개의 세포 구배를 형성하고, 각 웰의 총 세포 수는 각각 500개, 1000개, 1500개, 2000개의 세포이다. 뚜껑을 닫고 1~2분 동안 진탕하였다. 배지는 불투명하다. 배지를 2~5분 동안 방치하여 배지가 튜브 바닥에 집중되도록 하고, 기포가 액체 표면으로 올라가도록 하였다.
5 mL의 일회용 주사기를 사용하여 접종하였다. 구체적으로, 6웰 플레이트의 각 배양 웰에 1~1.5 mL의 상기 반고체 세포 현탁액을 넣고, 각 밀도를 3회 반복하였다. 배양 플레이트를 부드럽게 기울이고 회전하여 배지가 배양 웰 바닥에 균일하게 분포되도록 확보하였다.
뚜껑을 덮은 6웰 플레이트를 마찬가지로 뚜껑을 덮은 하나의 큰 페트리 접시에 놓고, 상기 페트리 접시에는 무균수가 담긴 뚜껑을 덮지 않은 100 mm 페트리 접시도 놓아져 있다. 또는, 6웰 플레이트를 덮기 전에, 배양 플레이트의 각 웰 사이의 홈 내에 절반 높이의 무균수 또는 PBS를 첨가하였다. 세포계의 배가 시간에 따라 배양물 중의 클로니 상황을 검사하였다. 클로니는 육안으로 볼 수 있으며, 직경은 일반적으로 0.5~1.0 mm이다. 각 접종 밀도에서 성장한 클로니 수를 통계하였다. 배양 플레이트를 촬영하여 클로니 형태를 보존하였다.
7일 후, 24웰 플레이트를 준비하고, 각 웰 플레이트에 웰당 1 mL의 대응되는 무혈청 배지를 각각 넣었다. 10 μL의 피펫 팁을 사용하여 대응되는 세포가 적응된 무혈청 배지 5μL를 흡수하고, 6웰 플레이트의 배양물 중의 비교적 큰 클론을 부드럽게 흡수하며, 세포를 24웰 플레이트에 불어 넣고, 현미경으로 단일 세포인지 관찰하였다. 24웰 플레이트를 37℃ 및 8% CO2의 인큐베이터에 넣고, 회전 속도가 125 rpm이고 진탕 직경이 19 mm인 진탕기에서 배양하였다.
3일마다 액체를 보충하였고, 세포량에 따라 6웰 플레이트에 세포를 웰당 2 mL의 배지로 증폭하며, 37℃ 및 8% CO2의 인큐베이터에 넣고, 진탕 직경이 19 mm이고 회전 속도가 125 rpm인 진탕기에서 배양하였다.
세포량에 따라 125 mL의 진탕 플라스크에 세포를 증폭하고, 계대배양을 3회 진행하며, 세포 현탁액을 취하여 현미경으로 관찰하였고, 세포 형태는 도 3에 도시된 바와 같다. 도 3으로부터 알 수 있는 바, 클로닝을 통해 응집되지 않은 세포주를 스크리닝할 수 있다. 응집되지 않은 세포를 동결보존하였다.
OPM-293 CD03 순화에서 얻은 세포를 PowerSTM -293T로 명명하였으며, 그 세포 형태는 도 4의 A에 도시된 바와 같고, 8일의 성장 곡선 및 성장 활력 그래프는 도 4의 B에 도시된 바와 같다. 상기 세포주는 응집되지 않고, 세포 배가 시간은 약 22시간으로 짧으며, 세포 대수기 밀도는 5-7×106 세포/ml에 도달할 수 있고, 최고 밀도는 1.48×107 세포/ml에 도달할 수 있다.
이에 비해, Gibco의 세포 CTS™ 바이러스 생산 세포(공개 번호: MAN0018590)의 배가 시간은 약 26시간이다.
실시예 3. 무혈청 현탁에 의해 순화된 HEK293T 세포 PowerS™-293T를 사용한 바이러스 벡터의 제조
OPM-293 CD03을 사용하여 실시예 2에서 얻은 세포 PowerS™-293T를 0.55×106 세포/ml 로 125ml의 진탕 플라스크에 접종하고, 37℃ 및 8% ℃의 인큐베이터에 넣고, 진탕 직경이 19 mm이고 회전 속도가 125 rpm인 진탕기에서 3일 동안 현탁 배양하였다.
현탁 세포 배양 진탕 플라스크에서 세포 현탁액을 취하여 계수하고, 세포 밀도가 5.5×106 세포/ml 이상에 도달하고 세포 활력이 95%보다 클 때 형질감염하였다.
30 ml의 형질감염 시스템을 예로 들어, 먼저 형질감염 세포 밀도를 조정하고, 세포 배양액(형질감염 부피(30 ml)×형질감염 세포 밀도(5×106 세포/ml)/실제 생세포 밀도(형질감염 당일 세포의 실제 계수된 생세포 밀도))을 27ml의 OPM-293 CD03 배지에 넣었다. 세포 배양 플라스크를 37℃ 및 8% ℃의 인큐베이터에 넣고, 진탕 직경이 19 mm이고 회전 속도가 125 rpm인 진탕기에서 현탁 배양하였다. 형질감염 전에 세포 밀도를 5.5×106 세포/ml로 조정하고 인큐베이터에 넣어 준비하였다.
이와 동시에, 형질감염 복합체를 제조하였다.
구체적으로, OPM-293 CD03 배지 및 PEIpro 형질감염 시약을 사용 전에 4~5회 부드럽게 흔들었다. TE 완충액 중 56.25μg의 플라스미드를 37℃로 예열된 1.5 ml의 OPM-293 CD03 배지에 넣되, 전달 플라스미드 : pMDLg.pRREKan(gag-pol, 8847 bp) : pRSV-Rev-Amp(rev, 5779 bp) : pMD2.gKan(vsvg, 4137 bp)=4:2:2:1이며, 4~5회 부드럽게 피펫팅하여 균일하게 혼합하고, 튜브 1-DNA로 표기하였다. 여기서, 전달 플라스미드는 총 3가지인데, 각각 7545bp, 9517bp 및 9505bp 크기의 이종 유전자 함유 pCDH 벡터이다. 37℃로 예열된 1.5 ml의 OPM-293 CD03 배지에 112.5 ml의 PEIpro 형질감염 시약(Polyplus Transfection, PT-115-100)을 넣고, 4~5회 부드럽게 피펫팅하여 균일하게 혼합하며, 튜브 2-PEIpro로 표기하였다. 튜브 2 중의 형질감염 완충액을 튜브 1에 옮기고, 건(gun)으로 8~10회 이상 반복 피펫팅하며, 즉시 최대한 볼텍스 믹서 10초 동안 볼텍싱하고 실온에서 15분 동안 방치하였다.
얻은 형질감염 복합체를 형질감염하고자 하는 세포액에 천천히 첨가하되, 첨가하는 동시에 진탕 플라스크를 부드럽게 흔든 후 조작이 완료되면 세포 배양 플라스크를 인큐베이터에 넣어 현탁 배양하였다. 형질감염 24 시간 후 최종 농도가 5 mmol인 부티르산 나트륨을 첨가하였다. 48시간 후 바이러스를 수확하고, FACS를 사용하여 바이러스 역가를 검출하였다.
Gibco의 세포CTS™ 바이러스 생산 세포(Pub. No. MAN0018590)를 양성 대조군으로 사용하고, 형질감염 시약을 제외하고, 다른 조작은 모두 PowerS™-293T와 동일하다. 구체적으로, Gibco 형질감염은 LV-MAX 형질감염 키트(ThermoFisher, A35348)를 사용하였다.
형질감염 테스트 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다. PowerS™-293T 세포의 바이러스 생산량은 모두 Gibco 세포의 바이러스 생산량보다 높고, 테스트 후 바이러스 역가는 모두 1×107 TU/mL보다 크다.
상이한 셔틀 플라스미드에서 PowerS™-293T 세포와 Gibco 세포계의 형질감염 테스트
전달 플라스미드 1-7545bp
(이종 유전자 GFP 함유)		 전달 플라스미드 2-9517bp
(이종 유전자 1 함유)		 전달 플라스미드 3-9505bp
(이종 유전자 2 함유)
PowerS™-293T Gibco PowerS™-293T Gibco PowerS™-293T Gibco
역가
(TU/ml)		 1.88E+08 1.3E+08 1.29E+07 1.01E+07 1.51E+07 8.32E+06
본 발명의 실시형태는 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 전제 하에 당업자는 형태 및 세부 내용에 있어서 다양한 변경 및 개선을 진행할 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 보호 범위에 속하는 것으로 간주된다.
중국 일반 미생물 균종 보존 관리 센터 CGMCC21100 20201207

Claims (22)

  1. 중국 일반 미생물 균종 보존 관리 센터에 보존되며 기탁번호가 CGMCC NO.: 21100인 신규 인간 배아 신장 HEK293T 세포.
  2. 무혈청 현탁 배양에 적응된 HEK293T 세포주의 스크리닝 방법으로서,
    i) 혈청 함유 배지에서 부착 배양된 HEK293T 세포를 취하여 무혈청 배지에 넣어 현탁 배양하는 단계, 및
    ii) 무혈청 현탁 배양에 적응된 단클론 세포주를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    단계 i)의 혈청 함유 배지는 10% 혈청을 함유하는 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    단계 i)의 현탁 배양은 37℃ 및 8% CO2 조건에서의 진탕 배양을 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    단계 i)의 현탁 배양은 세포 계대배양을 포함하는 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    단계 ii)는 무혈청 현탁 배양에 적응되고 응집되지 않는 단클론 세포주를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    단계 ii)는 반고체 배지에서 세포를 배양하고, 반고체 배지에서 단일 세포를 선택하며, 선택된 세포를 현탁 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 ii)의 선택된 세포의 현탁 배양은 37℃ 및 8% CO2 조건에서의 진탕 배양을 포함하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    단계 ii)의 선택된 세포의 현탁 배양은 세포 계대배양을 포함하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 반고체 배지는 스크리닝 배지가 첨가된 메틸셀룰로오스계 배지인 방법.
  11. 제2항에 있어서,
    상기 무혈청 배지는 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택되는 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 항응집제를 첨가하지 않고 수행되는 방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 스크리닝된 세포주.
  14. 제13항에 있어서,
    액체 배지에서 응집되지 않는 세포주.
  15. 현탁 배양에 적응되고 응집되지 않는 HEK293T 세포주의 스크리닝에서 LV-MAX 생산 배지, Expi293 발현 배지 및 OPM-293 CD03 배지로부터 선택된 배지의 용도.
  16. 제1항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 세포주를 사용하여 바이러스 벡터를 제조하는 방법으로서,
    i) 상기 세포주를 현탁 배양하는 단계;
    ii) 바이러스 벡터 발현 시스템을 세포주에 도입하는 단계;
    iii) 바이러스 벡터의 생산 조건에서 세포주를 배양하는 단계; 및
    vi) 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    단계 vi) 이후에, 바이러스 벡터의 역가를 검출하는 단계 v)를 더 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    바이러스 벡터 발현 시스템은 패키징 핵산 벡터 및 외피 핵산 벡터를 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    바이러스 벡터 발현 시스템은 보조 핵산 벡터, 및/또는 이종 핵산 함유 핵산 벡터를 더 포함할 수 있는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    이종 핵산의 길이는 4 kb 이하인 방법.
  21. 제16항에 있어서,
    바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터로부터 선택되는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
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