JP2024504914A - 高分散性hek293t細胞株及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
高分散性HEK293T細胞株及びそのスクリーニング方法を提供する。具体的には、無血清懸濁培養に適したHEK293T細胞株のスクリーニング方法、該方法を用いてスクリーニングされた細胞株、及び該細胞株を用いたウイルスベクター産生方法に関する。TIFF2024504914000003.tif68170
Description
関連出願及び参照による組み込み
本出願において引用又は言及される全ての文書(本明細書に引用される全ての文献、特許、開示された特許出願を含むが、これらに限定されない)(「本出願引用文書」)、本出願引用文書において引用又は言及される全ての文書、及び本出願又は任意の本出願引用文書において言及される任意の製品の製造業者によるマニュアル、明細書、製品仕様及び製品ページは、いずれも参照により本出願に組み込まれ、本発明を実践する際に用いることができる。さらに具体的には、全ての参照文献は、各文書が参照により組み込まれるのと同様に、いずれも参照により本出願に組み込まれる。本明細書において言及される任意のGenbank配列は、参照により本出願に組み込まれる。
本出願において引用又は言及される全ての文書(本明細書に引用される全ての文献、特許、開示された特許出願を含むが、これらに限定されない)(「本出願引用文書」)、本出願引用文書において引用又は言及される全ての文書、及び本出願又は任意の本出願引用文書において言及される任意の製品の製造業者によるマニュアル、明細書、製品仕様及び製品ページは、いずれも参照により本出願に組み込まれ、本発明を実践する際に用いることができる。さらに具体的には、全ての参照文献は、各文書が参照により組み込まれるのと同様に、いずれも参照により本出願に組み込まれる。本明細書において言及される任意のGenbank配列は、参照により本出願に組み込まれる。
本出願における任意の文書の引用は、これらの文書が本出願の従来技術であると認めることに等しいものではない。
本出願は、無血清懸濁培養に適し、特に無血清懸濁培養に適し分散性が高いHEK293T細胞株のスクリーニング方法、及び該方法を用いてスクリーニングされたHEK293T細胞株、特に寄託番号がCGMCC No.: 21100であるPowerSTMー293Tに関する。本出願は、スクリーニングされた細胞株、特にPowerSTMー293Tを用いて、ウイルスベクターを産生する方法にさらに関する。
遺伝子治療と細胞治療は、急速に発展しており、生命医療の発展の最も有望な方向となっている。遺伝子治療の主な目的は、外来遺伝子を標的細胞又は組織に導入し、特定の遺伝子を代替、補償、遮断、修正して、疾患を治療するという目的を達成することである。遺伝子治療において、70%~80%の治療レジメンは、ウイルスベクターによって達成される。ウイルスベクターは、治療的外来遺伝子の目標部位への送達を実現する肝心なベクターであり、そのまま薬物として注射されてもよいし、薬物生産のための重要な原料として使用されてもよい。現在、外来遺伝子を標的細胞に導入するためのウイルスベクターは、主にレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターに由来する。レンチウイルスは、レトロウイルスベクターの一つであり、I型ヒト免疫不全ウイルス(HIVー1)の基礎の上で発展してきた効率的なベクターである。通常、レンチウイルスベクターの産生には、レンチウイルスパッケージングシステムエレメントを安定的に発現する細胞系を使用する方法と、一過性トランスフェクション法を用いる方法との二つの方法がある。一過性トランスフェクションのパッケージング方法は、操作が簡単であり、且つ時間を節約し、それとともに一過性トランスフェクションベクター系において、多くのトランスジェニックとメッセンジャー糖タンパク質が容易に置換され得るため、一過性トランスフェクションによってレンチウイルスベクターを産生する方法が依然として最も一般的である。
HEK293細胞は、ヒト胚腎細胞293とも呼ばれ、レトロウイルス及び他のウイルスベクターの産生に最も一般的に使用される細胞である。このような細胞は、ヒト胚腎細胞の細胞系から派生し、トランスフェクション効率が高く、培養しやすいなどの特徴を有する。SV40ラージT抗原遺伝子をHEK293細胞にトランスフェクションすると、HEK293T細胞系が形成される。HEK293T細胞は、SV40 複製開始点を含むプラスミドをその中で有意に増幅させ、タンパク質発現を促進することができ、したがって様々な遺伝子の発現及びタンパク質の産生に用いられる。
現在、大多数のレンチウイルスの産生は、角瓶、平皿などのシステムにウシ胎児血清を加えてHEK293派生細胞系(例えば、293Tと293E)を接着培養し、多プラスミドの一過性トランスフェクションパッケージングによってウイルスを得る。細胞及び遺伝子治療開発企業にとっては、前臨床研究、IND申告及び臨床試験中のウイルスベクターの需要が限られているため、接着細胞HEK293Tの一過性トランスフェクションの方式によってレンチウイルスベクターを産生することがほとんどである。HEK293T細胞の接着培養は、通常、細胞工場の形で行われ、該産生方式は、主に培養ユニットの数を増やすことによって細胞量を増やす。したがって、より多くのウイルスベクターが必要な場合には、多くのスペースを占有する必要があり、生産労力も多大なものとなる。
大きな成長面積を得るとともに作業量を減少させる方法の一つとして、レンチウイルスを産生する細胞株を懸濁培養に適させる方法がある。接着培養に比べて、懸濁培養は、細胞密度を大幅に向上させることができる。なお、無血清培地を用いて細胞を培養してもよく、最終製品における潜在的な免疫原性物質汚染及び動物由来成分を減少させ、下流の精製プロセスを簡略化し、これにより、製品の臨床レベルへの変換を大幅に推進する。懸濁培養のスケールアップは、培養ユニットの増加による従来の接着培養に比べて、バッチ間の差を減少させることもできる。しかしながら、HEK293T細胞の無血清懸濁馴化プロセスにおいて、細胞が凝集しやすいという問題がある。細胞が凝集すると、ベクターの産生に用いられるプラスミドの多くが細胞にトランスフェクションできなくなり、大きな塊の間の細胞は栄養不足のために死に至り得る。現在、細胞凝集を改善する方法は、主に凝集防止剤を添加することによって行う。凝集防止剤の添加は、トランスフェクション効率を有意に低下させ、その結果、細胞はパッケージングレンチウイルスにトランスフェクションできなくなる。
多数の実験により、本出願の発明者は、無血清懸濁培養に適したHEK293T細胞株をスクリーニングするための方法を見出した。該方法により、分散性が高く、増殖密度が高い細胞株をスクリーニングすることができる。
したがって、一態様では、本出願は、無血清懸濁培養に適したHEK293T細胞株のスクリーニング方法を提供し、前記方法は、
血清含有培地において接着培養されたHEK293T細胞を取り、無血清培地中に置いて懸濁培養するステップi)と、
無血清懸濁培養に適したモノクローナル細胞株を選択するステップii)とを含む。
血清含有培地において接着培養されたHEK293T細胞を取り、無血清培地中に置いて懸濁培養するステップi)と、
無血清懸濁培養に適したモノクローナル細胞株を選択するステップii)とを含む。
ステップi)における血清含有培地は、10%血清、例えば、10%ウシ胎児血清を含んでもよい。
ステップi)における懸濁培養は、37℃、8%CO2の条件下での振盪培養を含んでもよい。
ステップi)における懸濁培養は、細胞の継代を含んでもよい。
無血清培地は、LVーMAX産生培地(Gibco、A35834ー01)、Expi293発現培地(Gibco、A14351ー01)、FreeStyle商標293発現培地(Gibco、12338ー018)、CD293 AGT培地(Gibco、11913ー019)、EXーCELL(登録商標)293無血清培地(Sigma、14571Cー1000mL)、BanlanCD HEK293培地(Irvine、91165)、Pro293sーCDM無血清培地(Lonza、12ー765Q)、OPMー293 CD03培地(奥浦邁、81070ー001)及びCelkey CD HEK293培地(健順、10804ー19008)から選択されてもよい。無血清培地は、好ましくは、LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地である。
ステップii)は、無血清懸濁培養に適した、凝集しないモノクローナル細胞株を選択することを含んでもよい。
ステップii)は、半固体培地中で細胞を培養し、半固体培地から単細胞を選択し、選択された細胞を懸濁培養することを含んでもよい。
ステップii)における選択された細胞の懸濁培養は、37℃、8%CO2の条件下での振盪培養を含んでもよい。ステップii)における選択された細胞の懸濁培養は、細胞の継代、例えば、3回以上の継代を含んでもよい。
半固体培地は、スクリーニング培地が添加されたメチルセルロース系培地であってもよい。
該方法の実施プロセスにおいて、凝集防止剤を添加する必要がない。
本出願の方法において、1)血清含有培地で接着培養された細胞を直接無血清培養し、無血清を漸減するステップがなく、スクリーニングプロセスを短縮することができ、2)無血清培地を用いて細胞を培養し、潜在的な免疫原性物質汚染と動物由来成分を回避し、下流の精製プロセスを簡略化し、3)LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択された無血清培地を用いて、懸濁培養に適し、即ち増殖密度が高く、分散性が高いHEK293T細胞株のスクリーニングにさらに有利であり、4)凝集防止剤の使用を回避し、細胞のトランスフェクション効率に影響を与えなく、そして5)半固体培地の使用は、条件を満たすモノクローナルのスクリーニングを容易にした。
本出願はまた、LVーMAX 産生培地(Gibco、A35834ー01)、Expi293発現培地(Gibco、A14351ー01)及びOPMー293 CD03培地(奥浦邁、81070ー001)から選択された培地の、分散性が高く、増殖密度が高いHEK293T細胞株のスクリーニングにおける用途を包含する。
別の態様では、本出願は、上記方法によりスクリーニングされたHEK293T細胞株に関する。
特に、本出願は、2020年12月7日にブダペスト条約に基づいて中国普通微生物菌種保存管理センター(CGMCC)に寄託され、寄託番号がCGMCC No.: 21100である新規ヒト胚腎HEK293T細胞株PowerSTMー293Tを提供する。
該細胞株は、無血清培地中で懸濁培養して成長することができる。前記無血清培地は、LVーMAX産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択されてもよい。
該細胞株は、懸濁培養プロセス中に細胞塊が現れなくてもよい。
該細胞株は、ウイルスベクターの産生に用いることができる。
PowerSTMー293T細胞株は、無血清培地中で懸濁培養して成長することができ、増殖密度が高く、活力が良好であり、細胞塊が現れなく、即ち分散性が高い。したがって、その懸濁培養プロセスでは、凝集防止剤を追加して添加する必要がない。GibcoのCTS商標ウイルス産生細胞(公開番号:MAN0018590)に比べて、PowerSTMー293Tの細胞は、倍加時間が短く、ウイルスプラスミドをトランスフェクションした後に、より多くのウイルスベクターを産出する。
さらに別の態様では、本出願は、スクリーニングされたHEK293T細胞株の、ウイルスベクターの作製における用途に関する。
具体的には、本出願は、PowerSTMー293Tを含む、本出願によりスクリーニングされた細胞株を用いて、ウイルスベクターを作製する方法を提供し、前記方法は、
細胞株を培養するステップi)と、
細胞株にウイルスベクター発現システムを導入するステップii)と、
ウイルスベクターが産生された条件下で細胞株を培養するステップiii)と、
ウイルスベクターを収集するステップvi)とを含む。
細胞株を培養するステップi)と、
細胞株にウイルスベクター発現システムを導入するステップii)と、
ウイルスベクターが産生された条件下で細胞株を培養するステップiii)と、
ウイルスベクターを収集するステップvi)とを含む。
該方法は、ステップvi)の後、ウイルスベクターに対して力価検出を行うことをさらに含んでもよい。
ステップi)は、細胞株の懸濁培養を含んでもよい。一実施形態において、細胞株は、37℃、8%℃の条件下で、無血清培地において振盪培養される。無血清培地は、LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択されてもよい。
ステップi)は、細胞株の継代をさらに含んでもよい。
ステップii)は、物理又は化学的トランスフェクション法によって細胞株にウイルス発現システムを導入することを含んでもよい。物理的トランスフェクション法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及び遺伝子ガンなどを含んでもよい。化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウム共沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介性トランスフェクション、及びLipofectamine(Invitrogen)媒介性トランスフェクションなどを含んでもよい。
ウイルスベクター発現システムは、パッケージング核酸ベクターとエンベロープ核酸ベクターとを含んでもよい。ウイルスベクター発現システムは、ヘルパー核酸ベクターをさらに含んでもよい。ウイルスベクター発現システムは、異種核酸を含む核酸ベクター、例えば、異種核酸を含むトランスファー核酸ベクターをさらに含んでもよい。これらの核酸ベクターは、プラスミドであってもよい。
異種核酸の長さは4 kb以下である。異種核酸は、ポリペプチド又はキメラ抗原受容体(CAR)のようなタンパク質、又はsiRNAのような核酸をコードすることができる。一実施形態において、異種核酸は、CAR、例えば、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、又はCD269(BCMA)を標的とするCARをコードすることができる。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、成長及び分化シグナルに関与する抗原を標的とすることができ、癌胎児性抗原(CEA)、上皮成長因子受容体(EGFR、HER2)、チロシンキナーゼ受容体(EPHA2)などを含む。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、腫瘍血管発生に関与する抗原を標的とすることができ、血管内皮成長因子(VEGF)、VEGF受容体(VEGFR)などを含む。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、腫瘍支持構造の腫瘍間質と細胞外マトリックス抗原を標的とすることができ、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、tenascinタンパク質などを含む。異種核酸を含むプラスミドは、pCDHとpCMVなどを含んでもよい。
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、αーレトロウイルスベクター、γーレトロウイルスベクター、又は泡沫状レトロウイルスベクターであってもよい。一実施形態において、レトロウイルスベクターは、HIVー1、HIVー2、SIV、FIN、EIAV及びVISNAから選択されるレンチウイルスベクターである。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、HIVー1ベクターであってもよい。一実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。一実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターは、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及びAAV10から選択される。
レトロウイルスベクター発現システムは、レトロウイルスの構造タンパク質gagーpol遺伝子を含むベクターと、env遺伝子又はその機能的置換体を含む核酸ベクターとを含んでもよい。env遺伝子又はその機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードすることができる。レトロウイルスベクター発現システムは、ヘルパー遺伝子rev又はその類似の遺伝子を含む核酸ベクターをさらに含んでもよい。レトロウイルスベクター発現システムは、異種核酸を含む核酸ベクター、例えば、異種核酸を含むトランスファー核酸ベクターをさらに含んでもよい。
一実施形態において、方法は、レンチウイルスベクターを作製するためのものであり、細胞株に三つの核酸ベクターを導入することを含み、それぞれHIVー1 gagーpolーrev遺伝子と、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードする核酸と、異種核酸とを含む。
一実施形態において、方法は、レンチウイルスベクターを作製するためのものであり、細胞株に四つの核酸ベクターを導入することを含み、それぞれHIVー1 gagーpol遺伝子と、HIVー1 rev遺伝子と、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードする核酸と、異種核酸とを含む。異種核酸を含む核酸ベクターは、自己不活化型レンチウイルス長末端反復配列を含んでもよい。
ステップiii)は、細胞株の懸濁培養を含んでもよい。一実施形態において、細胞株は、37℃、8%℃の条件下で、無血清培地において振盪培養される。無血清培地は、LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択されてもよい。
ステップiii)は、細胞の継代を含んでもよい。
以下の具体的な説明及び実施例に基づいて、現在の開示された他の特徴及び利点は非常に明白であり、これらの具体的な説明と実施例は、限定的であるとみなされるべきではない。本出願において引用される全ての引用文献、GenBank受託番号、特許及び公開特許出願は、いずれも参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
注意すべきこととして、本出願、特に特許請求の範囲において、「包含」、「含む」などの用語、「実質的に…で構成される」などの用語は、明示的に記載されていない要素の存在を可能にする。本明細書に記載される本発明の態様と実施形態は、「含む」、「……で構成される」、及び「実質的に……で構成される」の態様と実施形態を含む。
本出願の明細書及び添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数形の「一」、「1つ」及び「該/前記」は、文脈が別途明確に規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つ/1種類の分子」について言及は、任意選択的に、2つ/2種類以上のこのような分子の組み合わせなどを含む。
本出願に使用されるように、「約」という用語は、当業者に容易に知られている、該当する数値の従来の誤差範囲を指す。本明細書において言及された「約」ある数値又はパラメータは、該数値又はパラメータ自体に関する実施形態を含む(説明する)。
以下の例として与えられるが、本発明を、記載される発明を実施するための形態の具体的な説明に限定することを意図しておらず、添付図面に関連してよりよく理解され得る。
異なる培地中で馴化された細胞の形態を示す。
三つの無血清培地中で馴化された細胞の成長曲線を示す。
三つの無血清培地中で馴化されたモノクローナル細胞の形態を示す。
細胞株PowerSTMー293Tの細胞形態(A)及び成長曲線(B)を示す。
寄託についての説明:本出願における新規ヒト胚腎HEK293T細胞株PowerSTMー293Tは、2020年12月7日にブダペスト条約に基づいて中国普通微生物菌種保存管理センター(CGMCC)に寄託され、寄託番号がCGMCC No.: 21100である。
発明を実施するための形態
特に断りのない限り、本発明で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
本出願は、無血清懸濁培養に適した細胞株をスクリーニングするための方法、及びこれによりスクリーニングされた細胞株を提供する。該細胞株は、分散性が高く、増殖密度が高く、力価の高いウイルス粒子ベクター、特にレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター粒子を産出することに用いることができる。
ウイルスベクター
ウイルスベクターは、分子生物学者が細胞に遺伝物質を送達するためのツールであり、外来遺伝子を運び、ウイルス粒子にパッケージングして、外来遺伝子のトランスファーと発現を媒介することができ、生体に病気を引き起こさない。本出願における「異種核酸」、「異種遺伝子」、「外来核酸」又は「外来遺伝子」は、ウイルスに天然に存在するわけではない核酸又は遺伝子を指す。一般的には、異種核酸又は外来遺伝子は、ターゲットタンパク質又は非翻訳性RNAをコードするオープンリーディングフレームを含む。
「ウイルスベクター」、「ウイルス粒子」又は「ウイルスベクター粒子」という用語は、本明細書において交換使用可能である。
既知のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスなどを含む。
レトロウイルス
レトロウイルスベクターは、ヒトの遺伝子治療研究で最も多く使用されているウイルスベクターである。レトロウイルスは、偽二倍体単鎖RNAゲノムを含むウイルスファミリーであり、逆転写酵素をコードし、それがRNAゲノムからDNAを産生し、そして該DNAが宿主細胞DNAに挿入され得る。全てのレトロウイルスは、いずれも少なくとも三つの遺伝子、gag、pol及びenvを含み、それらは、構造タンパク質と酵素(逆転写酵素、RNase H、インテグラーゼ、及びプロテアーゼ)をコードし、ウイルス複製に必要なものである。
レトロウイルスをより良く理解するために、まず全てのレトロウイルスが共有する核酸配列を以下のように説明する。
長末端反復配列(LTR):レトロウイルスゲノムの基本構造は、5'ーLTRと3'ーLTRとを含み、レトロウイルスの産生に必要な遺伝子がその間又はその中に位置する。LTRは、レトロウイルスの組み込みと転写に必要なものである。それらは、プロモーター配列としてレトロウイルス遺伝子の発現を制御することができる(即ち、それらは、シス作用遺伝子である)。LTRは、U3、R、U5に分けられる三つのサブ領域で構成される:U3は、RNA 3'末端の特有の配列に由来し、Rは、RNAの両端で繰り返される配列に由来し、U5は、RNA 5'末端の特有の配列に由来する。複製能力を有するウイルスの発生に関連する安全性問題を解決するために、すでに3'LTRのU3領域における一つのセグメントを削除することによって自己不活性型(SIN)ベクターを開発し、前記U3領域は、TATAカセットと転写因子Sp1及びNFーκBとの結合部位を含む(Miyoshi H et al., (1998) Development of a selfーinactivating lentivirus vector. J Virol. 72(10):8150ー8157)。逆転写し、感染した細胞に組み込まれた後、該欠失は、5'LTRにトランスファーされ、LTR転写の不活性を引き起こす。
ψ:レトロウイルスRNAのカプシド形成は、レトロウイルスゲノム5'末端に位置するψ(psi)配列を介して発生する。当分野で周知されることとして、psi配列の下流でgagコード領域中に延伸する配列は、有効なレトロウイルスベクターの産生に関する(Yan Cui et al., (1999) Contribution of viral splice sites and cisーregulatory elements to lentivirus vector function. J. Virol. 73(7):6171ー6176)。
プライマー結合部位(PBS):レトロウイルスゲノムは、5'ーLTRのU5領域の後に存在するPBSを含む。該部位には、逆転写を開始するために必要なtRNAプライマーが結合している。
PPT:レトロウイルスゲノムは、レトロウイルスゲノムの3'末端付近に、ポリプリン断片(PPT)と呼ばれる短い伸長プリンを含む。これらのPPTは、逆転写プロセスにおいて、プラス鎖DNA合成のためのRNAプライマーとして機能する。複雑なレトロウイルス(例えば、HIVー1)は、より中心に位置する二番目のPPT(即ち、セントラルポリプリン領域(cPPT))を含み、それはDNA合成を開始するための二番目の部位を提供する。cPPTをコードするレトロウイルスベクターは、増強された形質導入及びトランスジェニック発現を有することが示されている(Barry SC et al., (2001) Lentivirus vectors encoding both central polypurine tract and posttranscriptional regulatory element provide enhanced transduction and transgene expression. Hum Gene Ther. 12(9):1103ー1108)。
上記非コード領域のゲノム構造は、当業者によく知られている。例えば、HIVー1における非コード領域のゲノム構造に関する詳細は、NCBI GenbankのGenome受託番号AF033819、又はHIVー1HXB2(一般的に使用されるHIVー1参考菌株)に対するGenome受託番号K03455から知ることができる。
Gag/pol:gagとpol遺伝子の発現は、gagとpolとの間の翻訳フレームシフトに依存する。両方は、いずれも成熟プロセスに切断されるポリタンパク質である。レトロウイルスベクターの主な構造マトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質は、gagによりコードされる。pol遺伝子は、i)、レトロウイルスRNAゲノムの二本鎖DNAへの逆転写に重要な逆転写酵素、ii)、レトロウイルスDNAゲノムを宿主細胞染色体に組み込むインテグラーゼ、及びiii)、合成されたポリタンパク質を開裂させてレトロウイルスの成熟と機能性タンパク質を産生するプロテアーゼを含む、ウイルス複製に関連する酵素をコードする。一実施形態において、gagとpolタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列は、HIVー1HXB2配列に由来し、それはGenome受託番号K03455から、例えば、塩基対790ー5105から得ることができる。
Env:env(「エンベロープ」)遺伝子は、レトロウイルスエンベロープの表面と膜貫通成分(例えば、HIVー1の糖タンパク質gp120とgp41)をコードし、レトロウイルスー細胞膜融合に関与する。レトロウイルスベクターの組織トランスフェクション性を広げるために、別のウイルスからのエンベロープタンパク質でレトロウイルスベクターを偽型化してもよい。偽型化は、レトロウイルスベクター粒子における糖タンパク質(GP)を改変し、例えば、他のエンベロープウイルスから得られたかもしくは他のエンベロープウイルスに由来するGPを使用するか又は合成/人工GPを使用することによって、レトロウイルスベクター(レンチウイルスベクターを含む)の宿主細胞範囲を拡大又は改変することを指す。水疱性口内炎ウイルスGP(VSVg)は、その広範なトランスフェクション性と高いベクター粒子安定性のため、レトロウイルスベクターを偽型化するための最も一般的な糖タンパク質となる。しかしながら、当業者であれば、偽型化には他の糖タンパク質を用いることができることを理解するであろう(Cronin J et al., (2005) Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5(4):387ー398)。偽型化のためのウイルスの選択はさらに、標的とされる細胞及び/又は器官のタイプに依存してもよい。envタンパク質又はその機能置換体は、以下から選択されるウイルスから得られるか又は以下から選択されるウイルスに由来するものであってもよい:ベジクロウイルス(例えば、水疱性口内炎ウイルス)、リッサウイルス(例えば、狂犬病ウイルス、モコラウイルス(Mokola virus))、アレナウイルス(例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV))、アルファウイルス(例えば、ロスリバーウイルス(RRV)、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、フィロウイルス(例えば、レストンエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、ラッサ熱ウイルス)、アルファレトロウイルス(例えば、トリ白血病ウイルス(ALV))、ベータレトロウイルス(例えば、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス(JSRV))、ガンマレトロウイルス(例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(MLV)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、ネコ内在性レトロウイルス(RD114))、デルタレトロウイルス(例えば、ヒトTリンパ球向性ウイルス1(HTLVー1))、スプマウイルス(例えば、ヒト泡沫状ウイルス)、レンチウイルス(例えば、マエディ・ビスナウイルス(MVV))、コロナウイルス(例えば、SARSーCoV)、レスピロウイルス(例えば、センダイウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス(RSV))、ヘパチウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV))、インフルエンザウイルス(例えば、インフルエンザウイルスA)及び核多角体ウイルス(例えば、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス(AcMNPV))。一実施形態において、envタンパク質又はその機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルスから得られたか又は由来する。該実施形態において、レトロウイルス粒子がより広い宿主細胞範囲に感染し、野生型エンベロープタンパク質を産生するために組換えの機会を少なくすることを可能とする水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVg)タンパク質が使用され得る。別の実施形態において、envタンパク質又はその機能的置換体をコードするレトロウイルス核酸配列は、Genome受託番号J02428.1の、例えば、塩基対3071~4720から得ることができる配列に由来する。
本明細書に記載の構造遺伝子は、すべてのレトロウイルスに共通する。他のヘルパー遺伝子は、異なるタイプのレトロウイルスに存在することができる。例えば、HIVー1のようなレンチウイルスは、rev、vif、vpu、vpr、nef及びtatと称される別の六つのヘルパー遺伝子を含む。他のレトロウイルスは、本明細書に記載の遺伝子と類似するヘルパー遺伝子を有し得るが、それらは文献で常に同じ名称で示されているわけではない。例えば、TomonagaとMikamiは、様々なレトロウイルスヘルパー遺伝子を説明した(Tomonaga K, Mikami T. (1996) Molecular biology of the feline immunodeficiency virus auxiliary genes. J Gen Virol 77(Pt 8): 1611ー1621)。
Rev:ヘルパー遺伝子rev(「ウイルス粒子の調節因子」)は、Rev応答エレメント(RRE)に結合しレトロウイルス転写産物の輸送を促進するヘルパータンパク質をコードする。該遺伝子のタンパク質生成物は、Rev応答エレメント(RRE)を含むレトロウイルスmRNA断片が細胞核から細胞質へ輸送されることを可能とする。RRE配列は、複雑な折りたたみ構造を形成するために予想される。revのこの特別な役割は、スプライシング及び核輸送ステップの強固な共役を反映する。RRE配列は、HIVー1HXB2配列に由来してもよく、それはGenome受託番号K03455の、例えば、塩基対7622~8479又は7769~8146、特に塩基対7622~8479から得ることができる。
RevはRREと結合し、シングルスプライシング(env、vif、vpr及びvpu)又は非スプライシング(gag、pol及びゲノムRNA)ウイルス転写産物の輸送を促進することによって、遺伝子翻訳及びパッケージングのような下流事象をもたらす(Suhasini M, Reddy TR. (2009) Cellular proteins and HIVー1 Rev function. Curr HIV Res. 7(1):91ー100)。一実施形態において、ウイルス発現システムは、ヘルパー遺伝子rev又はその類似遺伝子(即ち、他のレトロウイルス又は機能的に類似するシステムに由来する)を含む。rev遺伝子の包含は、特にRREエレメントも輸送される転写産物に含まれる場合に、細胞核から細胞質へのレトロウイルスベクターゲノムのRNA転写産物の効率的輸送を確保した。rev遺伝子は、Genome受託番号M11840(即ちHIVー1クローン12cDNA、HIVPCV12遺伝子座)の塩基対970~1320と少なくとも60%の配列同一性、例えば、少なくとも70%の配列同一性を有してもよい。任意選択的な実施形態において、rev遺伝子は、Genome受託番号K03455.1(即ち1型ヒト免疫不全ウイルス、HXB2)の塩基対5970~6040及び8379~8653と少なくとも60%の配列同一性、例えば、少なくとも70%、80%、90%又は100%の配列同一性を有する。
ヘルパー遺伝子は、レトロウイルス複製及び発症メカニズムに役割を果たすと考えられ、そのため、多数の現在のウイルスベクター産生システムは、これらの遺伝子のいくつかを含まない。通常存在するrevは、例外であり、rev/RREシステムに類似するシステムを使用することができる。一実施形態において、ウイルスベクターにおける、一つもしくは複数のヘルパー遺伝子vpr、vif、vpu、tat及びnef又は類似のヘルパー遺伝子をコードすることができる核酸配列は、ヘルパー遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムから除去されるか又は機能的ヘルパータンパク質をコードできないように破壊され得る。別の実施形態において、少なくとも二つ以上、三つ以上、四つ以上もしくは全てのヘルパー遺伝子vpr、vif、vpu、tat及びnef又は類似のヘルパー遺伝子は、前記ヘルパー遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムから除去されるか又は機能的ヘルパータンパク質をコードできないように破壊される。機能的ヘルパー遺伝子の除去は遺伝子全体の除去を必要とせず、遺伝子の一部を除去したり、遺伝子を破壊したりすればよい。
理解すべきこととして、複製欠損レトロウイルスベクター粒子をコードする核酸配列は、レトロウイルスベクター粒子が基づくレトロウイルスの野生型遺伝子と同じであるか又は該レトロウイルスの野生型遺伝子に由来するものであってもよく、即ち、配列は、野生型ウイルスに含まれる遺伝的に又は他の方法で改変されたバージョンの配列であってもよい。そのため、核酸ベクター又は宿主細胞ゲノムに導入されたレトロウイルス遺伝子は、野生型遺伝子のコドン最適化バージョンを指し得る。
レンチウイルスベクター
レトロウイルスベクターの一つとして、レンチウイルスベクターは、 HIVー1に基づいて開発された遺伝子治療ベクターであり、動物及びヒトの初代細胞又は細胞系に目的遺伝子を導入することができる。レンチウイルスゲノムは、プラス鎖 RNAであり、そのゲノムが細胞に入ると、細胞質中でその自身が運ぶ反転写酵素によりDNAに反転され、DNA組み込み前複合体を形成し、細胞核に入った後、DNAが細胞ゲノムに組み込まれる。組み込みたDNAは、mRNAを転写し、細胞質内に戻り、ターゲットタンパク質を発現する。レンチウイルス媒介性遺伝子の発現は、目的遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれ、細胞ゲノムの分裂と共に分裂するため、持続的で且つ安定的である。また、レンチウイルスは、効果的に感染し、非分裂細胞に組み込まれ得る。以上の特性により、レンチウイルスベクターは、他のウイルスベクター、例えば、組み込まないアデノウイルスベクター、組み込み率が低いアデノ随伴ウイルスベクター、分裂細胞のみを組み込む従来のレトロウイルスベクターに比べて、特別な優位性を持っている。
レンチウイルスベクターは、レンチウイルスのゲノムを基礎として、そのうちのウイルス活性に関連する複数の配列構造を除去し、生物学的安全性を持たせる。そして、このゲノム骨格に臨床又は研究に必要な目的遺伝子配列及び発現構造を導入し、ベクターを作製する。現在のレンチウイルスベクターは、パッケージング、トランスフェクション、安定的組み込みに必要な全ての遺伝子情報を含み、レンチウイルスベクターシステムの主要構成部分である。外来遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターは、レンチウイルスパッケージングプラスミド、細胞系のヘルプで、ウイルスパッケージングを経て感染力のあるウイルス粒子になり、それを収集し濃縮した後に宿主細胞又は動物モデルに直接感染し、外来遺伝子の細胞又は生体組織での発現を実現することができる。研究により、レンチウイルスベクターは、神経細胞、肝細胞、心筋細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、幹細胞などの様々なタイプの細胞に有効に感染し、目的遺伝子の長期発現を媒介することが明らかにされている。現在、レンチウイルスは、RNAiを発現する研究にも広く用いられている。レンチウイルスベクターは、shRNAを発現する高力価レンチウイルスを産生し、周期性と非周期性細胞、幹細胞、受精卵及び分化した後代細胞においてshRNAを発現し、様々なタイプの細胞とトランスジェニックマウスにおいて特異的且つ安定的な遺伝子発現の機能的サイレンシングを達成することができ、初代のヒトと動物細胞組織において遺伝子機能を迅速で効率的に研究し、特定遺伝子発現が低下した動物を産生する可能性を提供した。
初期のレンチウイルスベクターは、HIVを改造して得られたものであり、HIVー1型ベクターシステムとHIVー2型ベクターシステムとを含む。HIVー1は、二本鎖RNAウイルスであり、そのゲノム構造が他のレトロウイルスと類似しており、三つの主なウイルス構造タンパク質、即ちgag、pol及びenvをコードすることができる遺伝子を含む。gag遺伝子は、ウイルスのコアタンパク質、例えば、ヌクレオカプシドタンパク質(p7)、内膜タンパク質(p17)及びカプシドタンパク質(p24)をコードし、pol遺伝子は、ウイルス複製に関連する酵素をコードし、env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードし、ウイルス感染宿主の標的性を決定する。なお、ウイルスゲノムは、二つの調節遺伝子tat、revをさらに含み、revは、主にタンパク質調節の発現レベルの関与し、それによりコードされるタンパク質は、gag、pol、envの発現レベルを調節することができ、tatによりコードされるタンパク質は、RNA転写の制御に関与し、ウイルスの長末端反復配列(LTR)と結合してウイルスの全ての遺伝子の転写を促進する。また、ゲノムは、vif、vpr、vpu、nefの四つのヘルパー遺伝子をさらに含む。HIVー1のゲノム構造には、ウイルス生命歴に必要な他の配列構造、例えば、ウイルス複製とパッケージングなどに必要なシグナルなどがさらに含まれており、例えば、ゲノムの両端は、長末端反復系列であり、複製に必要なシス作用エレメントを内包している。
HIVー1型レンチウイルスベクターシステムの確立は、ベクターの生物学的安全性を徐々に高めるために、段階的に改善された過程を経た。
第1世代のHIVー1レンチウイルスベクターは、2プラスミドシステムであり、3つの構造遺伝子env、gagとpol、2つの調節遺伝子tat、rev、及び4つのヘルパー遺伝子vpr、vif、vpuとnefを含み、両端には長末端反復配列(LTR)があり、5'LTRとgagとの間にさらにウイルスパッケージングシグナル配列がある。レンチウイルスベクターの最初のパッケージングは、HIVゲノムにおけるトランス作用タンパク質遺伝子配列を除去し、そしてターゲット遺伝子を含む核酸ベクター、及びウイルス粒子に必要なタンパク質をトランス提供できるパッケージングプラスミドをパッケージングするとともに、宿主細胞(例えば、293T細胞)に同時トランスフェクションすることによって行われる。これは複製欠損型ベクター系であり、産生したウイルスの力価が低く、CD4+細胞のみに感染でき、トランスフェクションプロセスにおいてパッケージングされたタンパク質DNAとベクターDNAが組換える可能性があり、さらに複製能力のあるウイルスシステムを産生する安全上のリスクがある。
第2世代のベクターは、3プラスミド発現システムであり、つまりHIVー1ゲノムにおいてパッケージング、逆転写及び組み込みに必要なシス作用配列構造を、トランス作用タンパク質をコードする配列と隔離し、次に三つの独立したプラスミドにクローンし、そのうちの一つは、パッケージングプラスミドであり、CMVプロモーターを含み、env以外の完全ウイルス構造遺伝子の発現を制御し、3’LTRの代わりにヒトインスリン遺伝子のpolyAを付加シグナルとして用い、二番目は、エンベローププラスミドであり、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)遺伝子を発現する配列を含み、この遺伝子は、プロウイルスのenv遺伝子を代替するためのものであり、この遺伝子の産物は、ウイルスの宿主範囲を拡大することができ、もう一つは、ベクタープラスミドであり、その中に研究者が関心を持つ遺伝子配列構造、及び全ての関連するシス作用エレメントが含まれている。しかし、この3プラスミドシステムは、HIVー1の付属遺伝子を保持しており、このプラスミド系は、意外が発生して活性のあるウイルスが現れる可能性が高く、したがって安全性が低いと見なされている。
第3世代のプラスミドシステムは、HIVウイルスの全てのヘルパー遺伝子配列を除去し、これらの付属遺伝子の除去は、ウイルスの力価とトランスフェクション能力に影響を与えず、一方でベクターの安全性を向上させた。
第4世代のベクターは、4プラスミドシステムであり、現在広範に使用されているレンチウイルスベクターシステムでもある。第3世代を基礎として、自己不活性レンチウイルスベクターを構築し、即ちU3領域の3’ LTRを削除し、ベクターにHIVー1エンハンサー及びプロモーター配列を失わせ、全てのウイルスタンパク質が存在してもRNAを転写できず、また、env遺伝子を単独の発現プラスミド上に置き、tat遺伝子を除去し、異種プロモーター配列を代用する。このように、四つのプラスミドシステム、即ちpGag/Pol、pRev、pVSVーGが形成され、なお、目的遺伝子配列を置くことができる核酸ベクターが存在する。この系は、活性ウイルスの予期せぬ産生の可能性が大幅に低下された。このようなベクターシステムは、誘導可能遺伝子を含んでもよく、最も代表的なのはテトラサイクリンー誘導システムであり、それは調節可能システムとレンチウイルスベクターとの結合生成物であり、レンチウイルスに移植された目的遺伝子の発現を人為的に制御し、遺伝子の条件的発現と遺伝子ノックアウトの両方を可能にし、且つ自身の不活性化の優位性を保持し続ける(Meng F et al., (2014) Advances of lentiviral vectors. Zhongguo Fei Ai Za Zhi 17(12):870ー6; MartinezーMolina, E. et al., (2020) LargeーScale Production of Lentiviral Vectors: Current Perspectives and Challenges. Pharmaceutics 12:1051)。
他のタイプのレンチウイルスベクターシステムは主に、サル免疫不全ウイルス(SIV)ベクターシステム、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)ベクターシステム、馬伝染性貧血ウイルス(EIAV)ベクター系、山羊関節炎ー脳炎ウイルス(CAEV)ベクターシステム、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)ベクターシステム、ヒツジ髄鞘脱落ウイルスウイルス(VMV)ベクターシステムなどを含む。
ウイルスベクターの作製
ウイルスベクター粒子の作製には、通常、以下のステップが必要である:
1)宿主細胞を培養し増幅し、2)ウイルスベクター発現システムを宿主細胞に導入し、3)導入されたウイルスベクター発現システムの宿主細胞を培養し増幅し、4)産生されたウイルスベクターを収集し精製する。
1)宿主細胞を培養し増幅し、2)ウイルスベクター発現システムを宿主細胞に導入し、3)導入されたウイルスベクター発現システムの宿主細胞を培養し増幅し、4)産生されたウイルスベクターを収集し精製する。
現在、いくつかのウイルスベクター(例えば、AAVベクター)をインビトロで(無細胞)パッケージングすることが可能であるが、このようなパッケージングシステムは、依然として細胞抽出物を必要とし、且つパッケージング効率がかなり低く、産生可能なレベルには達していない。今まで、ウイルスベクターのパッケージングは、主に該ウイルスに敏感な宿主細胞中で行われてきた。宿主細胞は、ウイルス複製とパッケージングのための環境条件を提供するだけでなく、多くの細胞成分がウイルス複製とパッケージングのプロセスに直接関与した。
ウイルスベクター作製に必要な宿主細胞は、産生/パッケージング細胞系とも呼ばれる。レンチウイルスベクターとの関連において、「パッケージング細胞系」という用語は、gag、pol及びenv遺伝子が導入された細胞系を指し、「産生細胞系」は、gag、pol、env遺伝子及び外来遺伝子が導入された細胞系を指す。一実施形態において、「パッケージング細胞系」は、細胞ゲノムにgag、pol及びenv遺伝子が挿入された細胞系であり、「産生細胞系」は、細胞ゲノムにgag、pol、env遺伝子及び外来遺伝子が挿入された細胞系である。別の実施形態において、「パッケージング細胞系」は、細胞ゲノムにgag、pol及びenv遺伝子が安定的に挿入された細胞系であり、「産生細胞系」は、細胞ゲノムにgag、pol、env遺伝子及び外来遺伝子が安定的に挿入された細胞系である。
宿主細胞の培養は、接着培養と懸濁培養に分けられる。ウイルスベクターの作製を増加するために、細胞が付着できる総表面積を増加するか、又は細胞の懸濁培養を行うことができる。
HEK293細胞は、ヒト胚腎細胞293とも呼ばれ、レトロウイルス及び他のウイルスベクターの産生に最も一般的に使用される細胞である。SV40 T抗原が組み込まれたHEK293T細胞は、母細胞系HEK293よりも高いウイルス力価を産生することができる。HEK293T細胞は、通常、10%ウシ胎児血清培地を含む細胞培養フラスコ中で接着培養され、ウイルス収量が小さい。細胞が付着できる表面積を増加させるために、HYPERFlaskTM(Corning)のような多層容器、及び細胞工場システムのような多層細胞工場システムを使用してもよい(Numc、EasyFill、ThermoScientific、Waltham、MA、USA)。HYPERFlaskTM(Corning)は、総成長面積が約1720 cm2であり、通気性表面を有し、酸素と二酸化炭素の交換が可能であり、収量が凡そTー150培養フラスコの10倍以上である。細胞工場システム(Numc、EasyFill、ThermoScientific、Waltham、MA、USA)の層数は40まで高くなり得、約170個のTー150培養フラスコと同等な培養表面積を形成することができる。なお、iCELLis(Pall Life Sciences、Hoegaarden、ベルギー)及びScaleーXTMバイオリアクターシステム(Univercells、Gosselies、ベルギー)のような固定床バイオリアクターも開発され、固定床上にポリエチレンテレフタレート(PET)繊維又はPET繊維層が充填され、細胞が付着するための大きな表面積を提供する。iCELLis 500による細胞成長面積は約3000個のHYPERFlaskである。
様々な機器の更新があり、血清依存性接着HEK293Tの拡大培養が可能になるが、時間と労力がかかっていた。したがって、研究者は、HEK293細胞を懸濁培養に適するように馴化する試みを開始した。HEK293E細胞は、最初に馴化され、無血清培地中で懸濁培養された。その後、新しいこのような細胞系、例えば、HEK293SFー3F6などが開発され続けている(Ansorge, S.et al., (2009) Development of a Scalable Process for HighーYield Lentiviral Vector Production by Transient Transfection of HEK293 Suspension Cultures. J. Gene Med. 11:868―876)。接着培養に比べて、懸濁培養は複雑な計器を必要とせず、細胞の壁を除去するための機械的な力又は酵素を必要とせず、より容易に継代でき、容易にスケールアップできるなど、様々な利点を有する。
細胞及び遺伝子治療開発企業にとっては、前臨床研究、IND申告及び臨床試験中のウイルスベクターの需要が限られているため、接着細胞HEK293Tの一過性トランスフェクションの方式によってレンチウイルスベクターを産生することがほとんどである。HEK293T細胞の接着培養は、通常、細胞工場の形で行われ、該産生方式は、主に培養ユニットの数を増やすことによって細胞量を増やす。したがって、より多くのウイルスベクターが必要な場合には、多くのスペースを占有する必要があり、生産労力も多大なものとなる。大きな成長面積を得るとともに作業量を減少させる方法の一つとして、レンチウイルスを産生する細胞株を懸濁培養に適させる方法がある。接着培養に比べて、懸濁培養は、細胞密度を大幅に向上させることができる。
第2のステップにおいて、ウイルスベクター発現システムを宿主細胞に導入し、即ちパッケージング核酸ベクター、エンベロープ核酸ベクター、ヘルパー核酸ベクター、異種遺伝子を担持した核酸ベクターなどで宿主細胞をトランスフェクションする。
本出願における「ウイルス発現システム」は、一つ又は複数のポリヌクレオチドのシステムを指し、適切な宿主細胞内に導入される場合、該システムは、ウイルスの複製とパッケージングを支援するのに十分である。ウイルス発現ベクターは、異種遺伝子を担持した核酸ベクターをさらに含んでもよく、それによりコードされる核酸、例えば、RNA又はポリペプチド/タンパク質は、一緒にウイルスベクター粒子にパッケージングすることができる。例えば、レンチウイルスの発現システムは、通常、gagーpol遺伝子、env遺伝子、及びヘルパー遺伝子revなどを含む。一実施形態において、レンチウイルスの発現システムは、HIVー1 gagーpolーrev遺伝子、及び水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸ベクターを含む。別の実施形態において、レンチウイルスの発現システムは、HIVー1 gagーpol遺伝子、HIVー1 rev遺伝子、及び水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸ベクターを含む。AAV発現システムは、通常、AAV rep及びcap、ヘルパー遺伝子及びrAAVゲノムをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書における「核酸ベクター」は、DNA又はRNAのベクターを指し、発明を実施するための形態において、プラスミド、又は細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1ー由来人工染色体(PAC)、フォスミド又はコスミドなどであってもよい。核酸ベクターにおいて、必要に応じて、複製開始点、プロモーター、転写調節エレメントなどを含んでもよい。発現を制御できるように、任意のエレメントは、プロモーターに操作可能に連結されてもよい。本明細書で言及されるプロモーターは、既知のプロモーター(完全又は一部)を含んでもよく、それは、例えば、調節タンパク質の存在下で、持続的に活性化されるか又は誘導可能であり得る。一実施形態において、核酸ベクターはまた、効率的なプロモーター、例えば、CMVプロモーターを含む。該プロモーターは、非哺乳動物の核酸ベクター上でコードされるエレメントの高レベル発現を促進する利点を有する。別の実施形態において、CMVプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス株AD169に由来する配列を含む。該配列は、Genome受託番号X17403、例えば、塩基対173731~174404から得ることができる。本出願において、外来遺伝子を担持した核酸ベクターは、トランスファーベクターと呼ばれてもよく、一実施形態において、トランスファープラスミドであってもよい。トランスファーベクタープラスミドは、通常、プロモーター(例えば、CMV)、3'LTR(自己不活性であってもよいし、そうでなくてもよい(即ちSIN)3'ーLTR)、5'LTR(U5領域を含んでもよいし、含まなくてもよい)、カプシド形成配列(ψ)、及びプロモーターに連結される潜在的な外来遺伝子を含む。
本明細書に記載の「トランスフェクション」又は「感染」は、外来遺伝物質、例えば、本明細書に記載の「ウイルス発現システム」を、宿主細胞に導入することを指す。一般的に使用されるトランスフェクション方法は、物理的方法(例えば、エレクトロポレーション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、衝撃トランスフェクション、マグネトフェクション、遺伝子ガン又は粒子衝撃)、化学試薬(例えば、リン酸カルシウム、高分岐有機化合物又はカチオン性ポリマー)又はカチオン性脂質(例えば、リポフェクション)を含むが、これらに限定されないことが当業者に知られている。多くのトランスフェクション方法は、プラスミドDNA溶液を細胞と接触させ、そしてそれを成長させて、マーカー遺伝子発現のために選択する必要がある。
外来核酸又は核酸ベクターの宿主細胞への導入は容易なことではなく、細胞膜という障壁を越えていなければならず、高力価ウイルスベクター粒子を産生するためには高いトランスフェクション効率が必要である。ウイルスプラスミドトランスフェクションの方法は、化学的方法と物理的方法の二つに大別される。一般的な化学的方法は、リン酸カルシウム共沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介性トランスフェクション、及びLipofectamine(Invitrogen)媒介性トランスフェクションを含み、物理的方法は、エレクトロポレーション、例えば、フローエレクトロポレーション、マイクロインジェクション及び遺伝子ガンなどを含む。
リン酸カルシウム共沈殿は、様々な細胞タイプに適し、大量の細胞を同時にトランスフェクションすることを可能にし、大規模なウイルス作製に用いることができる。しかしながら、リン酸カルシウムは、pH値の変化に敏感であり、細胞に対する毒性が大きい。毒性を回避するために、血清又はアルブミンを含む培地で宿主細胞を培養し、トランスフェクション後に培地を適時に交換する必要がある。
PEI媒介性トランスフェクションは、リン酸カルシウムと同様に効率的である。該方法を使用する場合、適切なPEI/DNA比を選択する必要がある。PEIも細胞に対して毒性を示すが、トランスフェクション後に培地を交換しなくてもよい。なお、PEI方法は、pH値に敏感でない。PEI方法は、接着及び懸濁培養される細胞に用いることができ、培地における血清が不可欠なものである(Toledo, J.R. et al., (2009) PolyethylenimineーBased Transfection Method as a Simple and Effective Way to Produce Recombinant Lentiviral Vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157:538―544)。
Lipofectamine媒介性トランスフェクションは、最も効率的で、最も便利であり、様々な細胞タイプに適し、トランスフェクション率が非常に高く、例えば、いくつかの例において、100%の細胞がレンチウイルスにトランスフェクションされることが見いだされる。しかし、大規模なウイルスベクター作製にとっては、Lipofectamineを使用するとコストが高くなる。
フローエレクトロポレーション法は、リン酸カルシウム法と同様に効率的であるが、必要なDNA量がその三分の一以下であり、細胞に対して毒性がなく、懸濁培養される細胞に適する。
なお、トランスフェクション後に培地にブタン酸ナトリウムを添加すれば、ウイルス力価を増加し得ることが報告されている。
上記トランスフェクション方法において、PEIは、接着培養細胞により適し、フローエレクトロポレーション法は、懸濁培養細胞により適し、リン酸カルシウムとLipofectamineは、コストの理由から小規模な応用により適する。
宿主細胞に入ると、核酸ベクターは、哺乳動物宿主細胞の内因性ゲノムにランダムに組み込まれるそのため、例えば、zeocin耐性マーカーのような抗生物質耐性選択マーカーを使用して、核酸ベクター上でコードされる核酸が組み込まれている宿主細胞を選択する必要がある。
当業者は、核酸ベクターの組み込みを促進する方法、例えば、核酸ベクター、例えば、プラスミドが天然の環状である場合、該核酸ベクターを線状化する方法を知っているであろう。核酸ベクターは、内因性ゲノム内に組み込まれた選択部位をガイドするために、宿主細胞の内因性染色体と相同性を共有する領域をさらに含んでもよい。なお、組換え部位は、核酸ベクター上に存在する場合、標的化組換えに用いることができる。他の標的化組み込み方法は、当分野で周知である。例えば、ゲノムDNAの標的化切断を誘導する方法を用いて、選択された染色体遺伝子座での標的化組換えを促進することができるこれらの方法は、通常、天然プロセス(例えば、非相同末端結合)又は修復鋳型(即ち、相同性指向性修復又はHDR)によって切断を修復するために、エンジニアリング切断システムを用いて内因性ゲノムにおける二本鎖切断(DSB)又は切開を誘導することに関する。切断は、エンジニアリングされたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子(例えば、エフェクターヌクレアーゼ)(TALEN)のような特定のヌクレアーゼを使用し、CRISPR/Cas9システム及びエンジニアリングされたcrRNA/tracr RNA('シングルガイドRNA')を使用して特異的切断をガイドし、及び/又はArgonauteシステムに基づくヌクレアーゼ(例えば、サーモフィラス(T.thermophilus)に由来し、'TtAgo’と呼ばれ、Swarts DC et al., (2014) DNAーguided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature. 507(7491):258ー261)を使用することによって行うことができる。これらのヌクレアーゼシステムの一つを使用する標的化切断は、HDR又はNHEJ媒介性プロセスを利用して、核酸を特定の標的位置に挿入することができる。そのため、一実施形態において、少なくとも一つのヌクレアーゼを用いて、核酸ベクター上でコードされる核酸配列を宿主細胞のゲノム(即ち内因性染色体)に組み込み、ここで、前記少なくとも一つのヌクレアーゼは、宿主細胞のゲノムを切断し、核酸配列を細胞のゲノムに組み込む。別の実施形態において、前記少なくとも一つのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casヌクレアーゼシステム及びその組み合わせから選択される。
トランスフェクションはまた、一過性トランスフェクションと安定的トランスフェクションに分けられる。一過性トランスフェクションの場合に、外来遺伝子は、発現されるが、細胞ゲノムに組み込まれることがなく、複製されることもない。細胞で一過的に発現される外来遺伝子の発現時間は、限られており、通常、外来遺伝子が細胞分裂プロセスで様々な要因で失われるまで数日間しか持続しない。安定的トランスフェクションは、一過性トランスフェクションを基礎とし、ただ一つの重要な偶発的プロセスが必要であり、即ち少数のトランスフェクション細胞において、外来遺伝子は、細胞のゲノムに組み込むことができる。外来遺伝子が細胞ゲノムの一部になって複製されることは、安定的トランスフェクション細胞のマーカーである。安定的トランスフェクション細胞の子孫細胞も同様に、外来遺伝子を発現し、これによって安定的な細胞系を形成する。
一過性トランスフェクションは、一般的に、数日間持続し、一過性トランスフェクションを用いて遺伝子発現を研究し、通常、トランスフェクション後の24~96時間内に細胞を収穫し、その具体的な時間は、細胞タイプ、ベクター構築などの様々な要因に依存する。このため、一過性トランスフェクションは、一般的には、遺伝子又は遺伝子生成物の短期発現、遺伝子ノックアウト又はRNA媒介性遺伝子サイレンシングの研究、及びタンパク質の小規模な合成に用いられる。mRNAの一過性トランスフェクションは、従来のプラスミドDNAのトランスフェクションよりも結果が速く出され、これは、mRNAが核外で直接発現することができるためであり、いくつかのシステムにおいて、mRNAはトランスフェクション後の数分間で発現することができる。これに対し、長期遺伝子発現が必要な場合、安定的トランスフェクションを行う必要があり、例えば、大規模なタンパク質合成、長期薬理学的研究、遺伝子治療研究及び長期遺伝調節メカニズム研究などである。安定的トランスフェクションは、一過性トランスフェクションに比べて、より長い時間及びより労力を要する。
安定的トランスフェクション細胞系は、構成型安定的トランスフェクション細胞系と誘導型安定的トランスフェクション細胞系に分けられる。構成型安定的トランスフェクション細胞系は、通常、高い細胞毒性を有するウイルスエンベロープ、例えば、レンチウイルスのVSVーGを発現せず、数ヶ月にわたってより高い力価でウイルスベクター粒子を産生する。このような細胞系は非常に少なく、レンチウイルス安定的トランスフェクション細胞系として、STAR細胞系、WinPac細胞系、RDーMolPack細胞、LentiPro26細胞系などが知られている。誘導型安定的トランスフェクション細胞系は、通常、ウイルスを作製する必要がある時のみにウイルスエンベロープの発現を誘導し、例えば、成長培地に抗生物質などの誘導剤を添加する場合のみに発現する。誘導型安定的トランスフェクション細胞系は、長い時間内で高い力価のウイルスを作製することもできる。例えば、ProSavinは、83日内で最大3×105 TU/mlの力価を産生することができ(Broussau, S. et al., (2008) Inducible Packaging Cells for LargeーScale Production of Lentiviral Vectors in SerumーFree Suspension Culture. Mol. Ther. 16:500―507、Stewart, H.J. et al., (2011) A Stable Producer Cell Line for the Manufacture of a Lentiviral Vector for Gene Therapy of Parkinson’s Disease. Hum. Gene Ther. 22:357―369)、Milani et al.により開発されたこのような細胞系は、4.4×106 TU/mlの力価を産生することができる(Milani, M. et al., (2017) Genome Editing for Scalable Production of Alloantigenーfree Lentiviral Vectors for in Vivo Gene Therapy. EMBO Mol. Med. 9:1558―1573)。
安定的トランスフェクション細胞系を得ることが困難であるため、現在主流のウイルス作製、例えば、レンチウイルスベクター作製は、やはり懸濁培養に適したHEK293T細胞系を用いる。
ウイルスベクター作製の第3のステップは、ウイルスベクター発現システムに導入された宿主細胞を培養し増幅させることであり、第1のステップと類似している。
第4のステップは、ウイルスベクターを単離し精製することである。ウイルスベクター粒子を含む、収集された細胞培養上清には、様々な不純物、例えば、宿主細胞、宿主細胞により産生された他のタンパク質、プラスミドDNA、血清などが含まれてもよく、ここで血清は、成分が複雑であり、エンドトキシン及び免疫原性タンパク質などが含まれてもよい。これらの不純物を除去し、最終製品を濃縮する必要がある。これらの処理において、最大な問題は、どのようにウイルスベクターの活性/機能性を維持するかことであり、したがって可能な限り少ないステップを用いて可能な限り短い時間で処理を完了する必要がある。小規模な精製に用いられる方法は、大量生産には適さないことが明らかになった。いくつかの精製ステップ、例えば、遠心は、cGMP規格に適合せず、高速遠心分離は、ウイルスエンベロープをある程度破壊する。
従来の大規模なウイルスベクター精製方法は、清澄化、濃縮及び精製を含む。
清澄化は、上清を収集した後に宿主細胞と宿主細胞の残骸を除去することを指す。小規模な清澄化は遠心及び精密濾過などの方法で行うことができるが、大規模な清澄化は45μmの多孔質膜を用いることが好ましい。ウェルの目詰まりを回避するために、孔径が漸減する膜を使用して、濾過効率を向上させることができる。
清澄化されたウイルスベクター粒子は、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)を使用して濃縮し、適切な緩衝液に浸透することができ、1~100 nm孔径の膜を使用することを含む。この技術は、ウイルス粒子を濃縮し、血清を除去し、DNA断片などを分解するために、体積を短時間で大幅に減少させることができる。最も重要なのは、TFFによる操作がcGMP規格に完全に準拠していることである。TFF操作における液体がフィルターに平行するため、他の限外濾過方法で問題となっていた膜の目詰まり問題を大幅に減少させることができ、液体流速を高いレベルに維持することができる。TFFにより、約90~100%のレンチウイルス粒子を回収することができる。現在、TFFは、約100 Lのウイルス製品を処理することができる(Valkama, A.J. et al., (2020) Development of LargeーScale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 17:717―730)。
ヒトに適用される医薬製品に対して、レンチウイルスベクター製品はさらに、クロマトグラフィー精製を行う必要がある。陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)は、レンチウイルスベクターが中性pHで正に荷電する特徴に基づいて、ウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター精製の効率的なツールである。ウイルスベクター上清が負に荷電するマトリクスのカラムを通過すると、正に荷電するウイルス粒子は、負に荷電するマトリックスに結合し、不純物が直接カラムを通って流出する。その後、ウイルスベクターを高塩濃度環境(0.5~1 M NaCl)に曝露し、結合した粒子を陰イオン交換カラムから溶出させる。高塩はウイルス粒子を不活性化する可能性があり、これも該技術の唯一の欠点である。ウイルス粒子を室温で高塩溶出液に曝露し、50%のウイルスを不活性化し得る(Segura, M.D.L.M. et al., (2005) A Novel Purification Strategy for Retrovirus Gene Therapy Vectors Using Heparin Afinity Chromatography. Biotechnol. Bioeng. 90:391―404)。
アフィニティークロマトグラフィーは、標的分子とクロマトグラフカラムに付着したリガンドとの間の特異的相互作用に基づいて生体分子を単離することに用いられる精製技術である。分子選択性が高いため、該技術は精製ステップをある程度簡略化することができる。アフィニティークロマトグラフィーは、相互作用の違いに応じていくつかのクラスに分類することができ、例えば、水素結合、静電気作用、ファンデルワールス力、又は抗体ーリガンドなどに基づくアフィニティークロマトグラフィーである。抗体ーリガンドの間の相互作用は、最も選択的なものであり、エンベロープタンパク質に結合する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるウイルスベクター精製は見られなかった。ヘパリンは、安く、様々なウイルスタイプと相互作用する親和性リガンドであり、レンチウイルスベクター精製に用いられており、最大53%のウイルスベクターを回収し、最大94%のタンパク質不純物及び56%の残留DNAを除去することができる。ベクターとヘパリンとの間に、ウイルス粒子表面の正に荷電する分子と負に荷電するヘパリンとの相互作用が存在し、したがって、通常、NaClを用いてベクターをヘパリンカラムから溶出させる。通常、塩濃度が約0.5 Mに達しなければ、ウイルスベクターを溶出させできない。それによって、塩を除去するために、TFFを追加添加するステップのような追加の洗浄又は精製ステップを追加するが必要である。研究により、ヘパリンは、ウイルスエンベロープタンパク質と相互作用を起こさず、したがって収率の損失を引き起こすことなく様々なウイルスタイプに結合し得ることが示された。
大規模なウイルスベクター精製において、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、洗浄ステップとして機能し、残される不純物を効果的に除去することができる。SECは、ゲル濾過クロマトグラフィーとも呼ばれ、ウイルスベクター精製に用いられる場合、ウイルス粒子の大きな体積と不純物の小さな体積との間の差に基づく。全ての不純物は孔径より小さく、したがってカラムを通過することができ、体積が大きいウイルス粒子のみが残る。SECの欠点は、スケールアップが困難であり、充填量がカラム体積のわずか10%であることである。なお、SEC精製は、線形低流量が必要であり、操作時間が長い。
精製ステップ後に、レンチウイルスベクターをー80℃で凍結保存する必要がある。報道によると、室温下で、レンチウイルスベクターの半減期は1~2日間であり、4℃下での半減期は約8日であり(Higashikawa, F. et al., (2001) Kinetic Analyses of Stability of Simple and Complex Retroviral Vectors. Virology 280:124―131)、ー80℃下で、1~2年間保存することができる(Valkama, A.J. et al., (2020) Development of LargeーScale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 17:717―730)。凍結保存する前に、凍結保存液に交換する必要があり、ショ糖及び塩化マグネシウム成分は、機能性ウイルス粒子の損失を低減し、保存安定性を向上させることができる(Valkama, A.J. et al., (2020) supra; Bandeira, V. et al., (2012) Downstream Processing of Lentiviral Vectors: Releasing Bottlenecks. Hum. Gene Ther. Methods 23:255―263、 Kumru, O.S. et al., (2018) Physical Characterization and Stabilization of a Lentiviral Vector Against Adsorption and FreezeーThaw. J. Pharm. Sci. 107: 2764―2774)。
本出願では、具体的には、PowerSTMー293Tを含む本出願の細胞株を用いてウイルスベクター粒子を作製する方法に関し、
細胞株を培養するステップi)と、
細胞株にウイルスベクター発現システムを導入するステップii)と、
ウイルスベクター粒子が産生された条件下で細胞株を培養するステップiii)と、
ウイルスベクター粒子を収集するステップvi)とを含む。
細胞株を培養するステップi)と、
細胞株にウイルスベクター発現システムを導入するステップii)と、
ウイルスベクター粒子が産生された条件下で細胞株を培養するステップiii)と、
ウイルスベクター粒子を収集するステップvi)とを含む。
ステップi)は、細胞株の懸濁培養を含んでもよい。一実施形態において、細胞株は、37℃、8%℃の条件下で、無血清培地において振盪培養される。無血清培地は、LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択されてもよい。
ステップi)は、細胞株の継代をさらに含んでもよい。
ステップii)は、物理又は化学的トランスフェクション法によって細胞株にウイルス発現システムを導入することを含んでもよい。物理的トランスフェクション法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及び遺伝子ガンなどを含んでもよい。化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウム共沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介性トランスフェクション、及びLipofectamine(Invitrogen)媒介性トランスフェクションなどを含んでもよい。
ウイルスベクター発現システムは、パッケージング核酸ベクターとエンベロープ核酸ベクターとを含んでもよい。ウイルスベクター発現システムは、ヘルパー核酸ベクターをさらに含んでもよい。ウイルスベクター発現システムは、異種核酸を含む核酸ベクター、例えば、異種核酸を含むトランスファー核酸ベクターをさらに含んでもよい。これらの核酸ベクターは、プラスミドであってもよい。
異種核酸の長さは4 kb以下である。異種核酸は、ポリペプチド又はキメラ抗原受容体のようなタンパク質、又はsiRNAのような核酸をコードすることができる。一実施形態において、異種核酸は、キメラ抗原受容体(CAR)、例えば、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、又はCD269(BCMA)を標的とするCARをコードすることができる。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、成長及び分化シグナルに関与する抗原を標的とすることができ、癌胎児性抗原(CEA)、上皮成長因子受容体(EGFR、HER2)、チロシンキナーゼ受容体(EPHA2)などを含む。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、腫瘍血管発生に関与する抗原を標的とすることができ、血管内皮成長因子(VEGF)、VEGF受容体(VEGFR)などを含む。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、腫瘍支持構造の腫瘍間質と細胞外マトリックス抗原を標的とすることができ、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、tenascinタンパク質などを含む。異種核酸を含むプラスミドは、pCDHとpCMVなどを含んでもよい。
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、αーレトロウイルスベクター、γーレトロウイルスベクター、又は泡沫状レトロウイルスベクターであってもよい。一実施形態において、レトロウイルスベクターは、HIVー1、HIVー2、SIV、FIN、EIAV及びVISNAから選択されるレンチウイルスベクターである。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、HIVー1ベクターであってもよい。別の実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、例えば、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及びAAV10などであってもよい。
レトロウイルスベクター発現システムは、レトロウイルスの構造タンパク質gagーpol遺伝子を含むベクターと、env遺伝子又はその機能的置換体を含む核酸ベクターとを含んでもよい。env遺伝子又はその機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードすることができる。レトロウイルスベクター発現システムは、ヘルパー遺伝子rev又はその類似の遺伝子を含む核酸ベクターをさらに含んでもよい。レトロウイルスベクター発現システムは、異種核酸を含む核酸ベクター、例えば、異種核酸を含むトランスファー核酸ベクターをさらに含んでもよい。
一実施形態において、方法は、レンチウイルスベクターを作製するためのものであり、細胞株に三つの核酸ベクターを導入することを含み、それぞれHIVー1 gagーpolーrev遺伝子と、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードする核酸と、異種核酸とを含む。
一実施形態において、方法は、レンチウイルスベクターを作製するためのものであり、細胞株に四つの核酸ベクターを導入することを含み、それぞれHIVー1 gagーpol遺伝子と、HIVー1 rev遺伝子と、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVーG)又はその誘導タンパク質をコードする核酸と、異種核酸とを含む。異種核酸を含む核酸ベクターは、自己不活化型レンチウイルス長末端反復配列を含んでもよい。
ステップiii)は、細胞株の懸濁培養を含んでもよい。細胞株は、細胞株がウイルスベクターを産生するのに適する任意の条件下で培養することができ、当業者によって確定することができる。一実施形態において、細胞株は、37℃、8%℃の条件下で、無血清培地において振盪培養される。無血清培地は、LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択されてもよい。
ステップiii)は、細胞の継代をさらに含んでもよい。
本出願は、ウイルスベクター発現システムを含むPowerSTMー293T宿主細胞に対してベンチ及びパイバッチ産生を行い、例えば、300 mlのシェーカーフラスコで培養し、例えば、1 L、2 L、10 L、50 L及び200 Lのバイオリアクター(例えば、WAVEリアクター又はガラスリアクター)中で懸濁培養してウイルスベクターを産生する。
該方法は、ステップvi)の後、ウイルスベクターに対して力価検出を行うことをさらに含んでもよい。
ウイルスベクターの応用
ウイルスベクター発現システムは、異種核酸を含む核酸ベクター、例えば、異種核酸を含むトランスファーベクタープラスミドを含んでもよく、キメラ抗原受容体のような治療もしくは研究用のタンパク質、又はsiRNAのような治療もしくは研究用の核酸をコードするためのものである。ウイルスベクターの応用は、主に異種核酸がコードするタンパク質と核酸に依存する。
異種核酸は、治療ペプチドのような治療分子、又はsiRNAのような治療核酸をコードすることができる。「治療分子」は、細胞又は被験者におけるタンパク質欠如又は欠陥による症状を緩和又は軽減することができるペプチド又はタンパク質であってもよい。又は、異種核酸によりコードされる「治療」ペプチド又はタンパク質は、被験者に利益を与える物質であり、例えば、遺伝欠損を矯正し、遺伝子(発現又は機能)欠損を矯正し、又は抗癌効果を提供する。治療核酸は、例えば、siRNA、アンチセンス分子及びmiRNAを含んでもよい。異種核酸は、複数の有用な生成物をコードすることができる。
異種核酸は、ホルモン、成長因子、分化因子をコードすることができ、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、血管内皮成長因子(VEGF)、アンギオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、形質転換成長因子α(TGFーα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子IとII(IGFーIとIGFーII)、TGFβ、アゴニスト、阻害剤、又は骨形態形成タンパク質(BMP)BMP1ー15の任意の一つを含む形質転換成長因子βスーパーファミリーの任意の一つ、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経栄養因子NTー3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、凝集タンパク質、紡錘状タンパク質ー1及び紡錘状タンパク質ー2、肝細胞成長因子(HGF)、エリスロフィシン酸、ノギン、及びチロシンヒドロキシラーゼを含み、これらに限定されない。
他の有用な異種核酸生成物は、免疫システムを調節するタンパク質を含み、サイトカインとリンフォカイン、例えば、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL)ILー1~ILー17、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球ーマクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、flkー2/fFlt3リガンド、免疫グロブリンIgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、例えば、CCR5のようなGタンパク質共役受容体(GPCR)、クラスI及びクラスIIMHC分子、及びエンジニアリングされた免疫グロブリン及びMHC分子を含み、これらに限定されない。有用な異種核酸生成物は、調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、膜補助タンパク質(MCP)、崩壊促進因子(DAF)、CR1、CF2及びCD59をさらに含む。
他の有用な異種核酸生成物は、先天性代謝異常を補正することができる遺伝子生成物を含み、カルバモイルシンセターゼI、カルバモイルシンセターゼ、カルバモイルシンセターゼ、カルバモイルシンセターゼ、カルバモイルシンセターゼ、αー1アンチトリプシン、グルコース―6―ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、凝血因子、例えば、因子V、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII又はタンパク質C、シスタチオニンーβーシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルAカルボキシラーゼ、プロピオニルAカルボキシラーゼ、グルタリルAデヒドロゲナーゼ、インスリン、βーグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、肝ホスホリラーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Hタンパク質、Tタンパク質、グリシンデカルボキシラーゼ(CFTR)配列及びジストロフィンcDNA配列を含むが、それらに限らない。
別の有用な異種核酸生成物は、機能又は活性の欠損、欠乏又は欠失を提供できるものを含み、例えば、抗体、網膜色素上皮特異的65kDaタンパク質(RPE65)、エリスロポエチン、低密度リポタンパク質受容体、リポプロテインリパーゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、βーグロブリン、αーグロブリン、スペクトリン、αーアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、金属輸送体(ATP7A又はATP7)、スルファターゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素(ARSA)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、βー25グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴホスフォリパーゼヘキソサミニダーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子(例えば、インスリン様成長因子1と2、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子3及び4、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、形質転換成長因子α及びβなど)、サイトカイン(例えば、αインターフェロン、βインターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン12、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど)、自殺遺伝子生成物(例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミダーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムP450、デオキシシチジンサイトキナーゼ、腫瘍壊死因子など)、薬剤耐性タンパク質(例えば、癌治療における薬剤耐性を提供するためのもの)、腫瘍抑制タンパク質(例えば、p53、Rb、Wtー1、NF1、VonHippelーLindau(VHL)、腺腫性ポリープ(APC))、免疫調節ペプチド、耐性又は免疫原性ペプチド又はタンパク質Tregitopes、又はhCDR1、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ((LCAーGUCY2D)、Rab衛星タンパク質1、LCA5、オルニチンケト酸トランスアミナーゼ、網膜分離症1(X連鎖性網膜分離症)、USH1C(Usher症候群1C)、Xー連鎖性色素性網膜炎GTP酵素(XLRP)、MERTK(RPのAR形式:連鎖性色素性網膜炎)、DFNB1(Connexin26難聴)、ACHM2、3及び4(色盲)、PKDー1又はPKDー2(多発性嚢胞腎)、TPP1、CLN2、多発性嚢胞腎による遺伝子欠損(例えば、スルファターゼ、Nーアセチルグルコサミンー1ーリン酸トランスフェラーゼ、カテプシンA、GM2ーAP、NPC1、VPC2、サポシンなど)、ゲノム編集用の一つ又は複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はゲノム編集の修復鋳型としてのドナー配列である。
異種核酸はさらに、腫瘍関連抗原(TAA)をコードすることができる。非限定的TAAの例は、精巣腫瘍関連特異的抗原(例えば、MAGE、BAGEとGAGE)、メラノサイト分化抗原(例えば、チロシナーゼ、MelanーA/MARTー1)、CDK4、MUMー1、βーカテニン、gp100/pmel17、TRPー1、TRPー2、MITF、MITFーA及びMITFーMを含む。別のTAAの非限定的例は、黒色腫GP75、アネキシンI、アネキシンII、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質((ADAbp),PGP9.5(Rodeら、1985).Histopathology9:147)、結腸直腸関連抗原(CRC)ーC017ー1A/GA733、Ab2BR3E4、CI17ー1A/GA733、Hsp70、Hsp90、Hsp96、Hsp105、Hsp110、HSPPCー96、ストレスタンパク質gp96、gp96関連細胞ペプチド、G250、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、甲状腺グロブリン、STn、癌胎児性抗原(CEA)、癌胎児性抗原(CEA)ペプチドCAPー1、癌胎児性抗原(CEA)ペプチドCAPー2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原(PSA)、PSA抗原決定基PSAー1、PSAー2、PSAー3、Ad5ーPSA、副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHーrP)、EGFR、PLU1、癌胎児性抗原ー未熟ラミニン受容体(OFAーiLR)、MN/CAIX(CA9)、HP59、シトクロム酸化酵素1、sp100、msa、RanGTPase活性化タンパク質、RabーGAPタンパク質、PARISー1、T細胞受容体/CD3ーζ鎖、cTAGEー1、SCPー1、糖脂質抗原ーGM2、GD2又はGD3、GM3、FucosylGM1、糖タンパク質抗原ーTn、SialylーTn、TF及びMucinー1、CA125(MUCー16)、MAGEファミリー抗原、GAGEー1,2、BAGE、RAGE、LAGEー1、GnTーV、MUMー1、EPーCAM/KSA、CDK4、MUCファミリー抗原、HER2/neu、ErbBー2/neu、p21ras、RCAS1,αーフェトプロテイン、Eーカドヘリン、αーカテニン、βーカテニン及びγーカテニン、NeuGcGM3、Fosに関連する抗原、シクロフィリンB、RCAS1、S2、L10a、L10a、テロメラーゼrtペプチド、cdc27、p120ctn、PRAME、GA733/EoCam、NYーBRー1、NYーBRー2、NYーBRー3、NYーBRー4、NYーBRー5、NYーBRー6、NYーBRー7、NYーESOー1、L19H1、MAZ、PINCH、PRAME、Prp1p/Zer1p、WT1、腺腫性結腸ポリポーシス(APC)、PHF3、LAGEー1、SART3、SCPー1、SSXー1、SSXー2、SSXー4、TAGー72、TRAGー3、MBTAA、Smad腫瘍抗原、lmpー1、HPVー16E7、cーerbBー2、EBVによりコードされる核抗原(EBNA)ー1、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVtk)、XAGEー1の選択的スプライシング異性体、TGFbetaRIIフレームシフト突然変異、BAXフレームシフト突然変異を含む。
また、異種核酸は、遺伝子生成物、例えば、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44v7/8、CEA、EGFーRIII(上皮成長因子受容体型変異体3)EGPー2、erbーB2、erbーB2、3、4、FBP、胎児性アセチルコリン受容体、GD2、Her2/neu、ILー13Rーa2、KDR、k軽鎖、LeY、L1細胞接着分子、MAGEーA1、メソテリン、MUC1、NKG2D、癌胎児性抗原(h5T4)、PSCA、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、前列腺上皮細胞由来Ets転写因子(PDEF)、mAbIgEを標的とするTAA、TAGー72及びVEGFーR2をコードすることができる。
又は、異種核酸は、例えば、siRNA、アンチセンス分子及びmiRNAを含んでもよい。臨床的に有用なレンチウイルスベクターはさらに、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対するアンチセンス遺伝子(Levine BL et al., (2006) Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(46):17372ー7)及びその他の重要なヒト病原体を発現することができる。Naldini(Naldini L. (2011) Ex vivo gene transfer and correction for cellーbased therapies. Nat. Rev. Genet. 12:301―315)は、レンチウイルス及び関連ベクターのこれらと他の有用な応用を論じて援用した。レンチウイルスベクターに含まれるアンチセンス遺伝子は、以下の発現を抑制することができ、即ち、ハンチンチン(HTT)遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症に関連する遺伝子(例えば、atrophin 1、ATN1)、球脊髄性筋萎縮症のX染色体のアンドロゲン受容体、ヒトAtaxinー1、ー2、ー3及びー7、(CACNA1A)によりコードされるCav2.1P/Q電圧依存性カルシウムチャネル、TATA結合タンパク質、ATXN8OSとも呼ばれるAtaxin8逆鎖、脊髄小脳失調におけるセリン/トレオニンプロテインホスファターゼ2A55kDa調節サブユニットBβアイソフォーム(タイプ1、2、3、6、7、8、12、17)、脆弱X症候群におけるFMR1(脆弱X精神遅滞1)、脆弱X関連振戦/失調症候群におけるFMR1(脆弱X精神遅滞1)、FMR1(脆弱X精神遅滞2)又は脆弱X精神遅滞におけるAF4/FMR2ファミリーメンバー2、筋強直性ジストロフィーにおける筋強直性タンパク質プロテインキナーゼ(MTーPK)、フリートライヒ運動失調における運動タンパク質、筋萎縮性側索硬化症のスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)遺伝子の突然変異、パーキンソン病及び/又はアルツハイマー病の発症メカニズムに関与する遺伝子、アポリポタンパク質B(APOB)及び枯草菌プロテアーゼ前駆タンパク質転換酵素/kexinタイプ9(PCSK9)、血中コレステロール過剰、HIV感染におけるHIVTat、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子、HIV感染におけるHIVTAR、HIVTAR、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答エレメント遺伝子、HIV感染におけるCーCケモカイン受容体(CCR5)、RSV感染におけるラウス肉腫ウイルス(RSV)、肝炎Cウイルス感染における肝臓特異的microRNA(miRー122)、p53、急性腎損傷、又は腎移植による移植機能の遅延、又は腎損傷急性腎不全、進行性又は転移性固形腫瘍におけるプロテインキナーゼN3(PKN3)、LMP2、LMP2は、プロテアソームサブユニットβタイプ9(PSMB9)、転移性黒色腫とも呼ばれ、LMP7は、プロテアソームサブユニットβタイプ8(PSMB8)、転移性黒色腫とも呼ばれ、MECL1は、プロテアソームサブユニットβタイプ10(PSMB10)、転移性黒色腫とも呼ばれ、固形腫瘍における血管内皮成長因子(VEGF)、固形腫瘍におけるキネシンスピンドルタンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制B細胞CLL/リンパ腫(BCLー2)、固形腫瘍におけるヌクレオチドレダクターゼM2(RRM2)、固形腫瘍におけるFurin、肝臓腫瘍におけるPolo様キナーゼ1(PLK1)、C型肝炎ウイルス感染におけるジアシルグリセロール転移1(DGAT1)、家族性腺腫性ポリポーシスにおけるβーカテニン、β2ーアドレナリン受容体、緑内障、糖尿病性黄斑浮腫(DME)又は加齢黄斑変性におけるRTP801/Redd1、DNA損傷により誘導される転写因子4タンパク質とも呼ばれ、加齢黄斑変性又は脈絡膜新生血管における血管内皮成長因子受容体I(VEGFR1)、非動脈炎症性虚血性視神経症におけるカスパーゼ2、先天性厚硬爪甲症におけるケラチン6AN17K突然変異タンパク質、インフルエンザにおけるインフルエンザA型ウイルスAゲノム/遺伝子配列によるインフルエンザ感染、SARS感染における重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルスゲノム/遺伝子配列、呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルス感染ゲノム/遺伝子配列、エボラウイルス感染におけるエボラ糸状ウイルスゲノム/遺伝子配列、B型とC型肝炎ウイルス感染におけるB型とC型肝炎ウイルスゲノム/遺伝子配列、HSV感染における単純ヘルペスウイルス(HSV)ゲノム/遺伝子配列、コクサッキーB3ウイルス感染におけるコクサッキーウイルスB3ゲノム/遺伝子配列、原発性筋緊張性障害におけるトーシンA(TOR1A)の病原性対立遺伝子のサイレンシング(対立遺伝子の特異的サイレンシング)、移植における泛Iクラス及びHLA対立遺伝子、常染色体優性遺伝性網膜色素変性症(adRP)における突然変異ロドプシン遺伝子(RHO)、又は任意の上記遺伝子又は配列に結合する転写物の抑制核酸である。
一実施形態において、異種核酸は、キメラ抗原受容体(CAR)、例えば、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、又はCD269(BCMA)を標的とするCARをコードすることができる。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、成長及び分化シグナルに関与する抗原を標的とすることができ、癌胎児性抗原(CEA)、上皮成長因子受容体(EGFR、HER2)、チロシンキナーゼ受容体(EPHA2)などを含む。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、腫瘍血管発生に関与する抗原を標的とすることができ、血管内皮成長因子(VEGF)、VEGF受容体(VEGFR)などを含む。一実施形態において、異種核酸によりコードされるCARは、腫瘍支持構造の腫瘍間質と細胞外マトリックス抗原を標的とすることができ、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、tenascinタンパク質などを含む。異種核酸を含むプラスミドは、pCDHとpCMVなどを含んでもよい。
宿主細胞系のスクリーニング
適切な宿主細胞を選択することにより、ウイルスベクターの収量を大幅に向上させることができる。好ましい細胞は、無血清培養に適し、及び/又は懸濁培養に適したものである。以上のように、無血清培地で細胞培養と増幅を行う場合、最終製品における潜在的な免疫原性物質汚染と動物由来成分を減少し、下流の精製プロセスを簡略化し、精製プロセスの簡略化は、ウイルスベクターの収率と活性を向上させることができる。なお、懸濁培養は、接着培養よりも、ウイルスベクターの大規模な作製に適する。
無血清培養
一般的には、動物細胞の成長は、いずれも血清の存在に依存する。血清を添加しなければ、ほとんどの細胞は増殖することができない。血清培地には、通常、ウシ血清が添加される。
血清は、成分が複雑であり、物質輸送に協力するタンパク質、栄養物質を有し、さらに、細胞成長を促進するホルモンと因子等を有し、血清という天然成分の複雑性のため、血清は細胞培養過程で様々な機能を発揮し、それは、細胞成長を維持するホルモンを提供して、培養細胞の成長を促進することと、基礎培地にないか又は含有量が少ない栄養物質を補うことと、結合タンパク質を提供し、細胞認識及びビタミン、脂質、および他のホルモンなどの利用を促進することと、いくつかの場合に、結合タンパク質が、有毒金属及び発熱性物質と結合し、解毒作用を果たすことができることと、細胞接着を促進し、細胞のプラスチック培養マトリクスでの広がりを促進できる因子を提供することと、酸アルカリ度緩衝液として機能することと、プロテアーゼ阻害剤を提供し、細胞が消化される時に残存するトリプシンを不活化し、細胞を傷害から保護することとを含む。しかし、ウシ血清の使用には、外来ウイルスと病原因子を汚染する恐れがあり、また異なるバッチのウシ血清の間の生物活性と因子が一致しないため、製品と実験結果の再現性が低く、製品に残留するウシ血清も、ウイルスベクター受容者の血清に対するアレルギー反応を引き起こしやすい。
無血清培地は、SFMと略称され、血清を添加しない細胞培地である。天然培地、合成培地に続く第3種の培地である。従来の培地に比べて、無血清培地は、動物血清又はその生物抽出液を含まないが、細胞がインビトロで長時間成長し増殖するように維持することができる。SFMは、構成成分が明確であり、作製プロセスが簡単であり、現代のバイオテクノロジー分野で広く応用され、細胞の成長、増殖、分化及び遺伝子発現調節の基礎研究問題を解明する有力なツールでもある。
目前に無血清培地には二種類があり、一つは動物由来のいかなる添加成分も添加せず、もう一つはいかなる不明確な添加成分も添加しない。現在、以下の四つが多く応用される。
第1は、一般的な無血清培地であり、血清機能を代替できる様々な生体材料、例えば、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、インスリンなどの生体高分子物質、及び血清から抽出された、タンパク質を除去した後の混合脂質及び加水分解タンパク質などで細胞培地を作製する。その特徴は、培地におけるタンパク質含有量が高いことであるが、添加物質の化学成分が明確でなく、動物由来タンパク質を多く含んでいる。
第2は、動物由来でない培地である。多くの企業により開発された、動物由来でない培地は、組換え薬物の生の安全性を考慮し、培地における添加成分が動物由来でなく、必要なタンパク質が組換えタンパク質又はタンパク質加水分解物に由来し、これらの成分は細胞成長及び増殖のニーズを確保することができる。
第3は、動物タンパク質のない培地である。培地は、動物由来のタンパク質を完全に使用しないが、一部の添加物は、植物タンパク質の加水分解断片又は合成ポリペプチド断片などの他の誘導物に由来する。このような培地は、成分が安定的であるが、ステロイドホルモンと脂質前駆体を添加する必要があり、且つ培養細胞に対して高い特異性を有する。
第4は、化学成分が限定される培地である。このような培地は、現在で最も安全で、最も理想的な培地であり、培地バッチ間の一致性を確保することができ、その中に添加された少量の動物由来のタンパク質加水分解物、タンパク質がいずれも成分が明確な成分である。その特徴は、培地の性質が明確であり、培地を配合する場合も便利であることである。
無血清培地の利点は、血清バッチ間の品質変動を回避し、細胞培養と実験結果の再現性を向上させることと、血清による細胞への毒性作用及び血清由来汚染を回避することと、血清成分が実験研究に与える影響を回避することと、インビトロ培養細胞の分化に有利であることと、製品の発現レベルを向上させ、細胞製品の精製を容易にすることと、成分が安定的であり、大量生産が可能であることと、マイトジェン阻害剤を含まず、細胞増殖などを促進し得ることとを含む。このような培地の欠点として、細胞が無血清培地中で、いくつかの機械的要因と化学的要因の影響を受け、培地の保存と応用が従来の合成培地ほど便利ではなく、コストが高く、標的性が高く、一つの無血清培地がある特定の細胞の培養のみに適し、発育の異なる分化段階にある細胞が異なる処方が必要であり、成長因子とサイトカインの選択が特に重要である。血清を除去すると同時に、血清タンパク質によるいくつかの保護作用をも除去したため、試薬、水の純度、計器の清浄度に対する要求が高い。
無血清培地は、完全栄養基礎培地に、ホルモン、成長因子、接着因子と結合タンパク質を添加して形成したものである。
細胞培養に用いられる初期の基礎培地には、血漿血餅、リンパ液、大豆ペプトン、胚エキスなどの天然培地がある。1950年にMorganらは、以前の研究に基づいて199培地を開発し、動物細胞培地の発展の新しい段階、及び合成培地の段階になった。合成培地は、細胞成長の必要に応じて、一定の割合のアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースなどを組み合わせた基本培地である。現在、合成培地の商品は百種以上市販されている。MEM、DMEM、RPMI 1640、F12、及びTC100は、多くの合成培地の中で最も広く使用される。基礎培地の成分が完全に既知であるため、異なる細胞株を培養する時に、細胞株の栄養要件によりよく適合し又はターゲットタンパク質の発現量を向上させるために、基礎培地のいくつかの成分を適切に調整することができる。
無血清培地における添加因子は、補充因子とも呼ばれ、代替血清の様々な因子の総称である。多くの無血清培養液は、3~8種の因子を追加して添加する必要があり、いずれの単一因子も血清を代替することはできない。このような因子は100種類以上知られており、その中にはインスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリンなどの必須因子があり、その他の多くはヘルパー作用の因子である。補充因子は、機能によって四つに分類される。
第1の補充因子は、ホルモンと成長因子である。無血清で培養する細胞の多くは、インスリン、成長ホルモン、グルカゴンなどのようなホルモンを添加する必要がある。ほとんどの細胞系は、インスリンを必要とし、それは、ポリペプチドであり、細胞におけるインスリン受容体と結合して複合体を形成し、RNA、タンパク質及び脂肪酸の合成を促進することができ、重要な細胞生存因子である。細胞の無血清培養において、インスリンの使用濃度は0.1ー10μg/mlである。Janらは、バッチ培養において、インスリンの急速な枯渇が細胞比成長速度の低下の主な原因であると考えている。なお、チロキシンなど、及びステロイド系ホルモンのうちのプロゲステロン、ヒドロコルチゾン、エストラジオールなども無血清細胞培養における通常の補充因子である。異なる細胞株は、ホルモンの種類と数量に対する要求が異なる。成長因子は、細胞のインビトロ培養生存、増殖と分化を維持するために必要な補充因子である。化学的性質により、ポリペプチド系成長因子とステロイド系成長因子に分類され得る。無血清培地に添加される成長因子は、主にポリペプチド系成長因子であり、近年同定されたポリペプチド系成長因子は20~30種であり、その半数以上は遺伝子組換えの手法によって相応の組換え成長因子を得ることができる。無血清培地によく見られる成長因子は、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)及び神経成長因子(NGF)などがある。成長因子は、有効なミトゲンであり、細胞集団の倍加時間を短縮することができる。
第2の補充因子は、結合タンパク質である。結合タンパク質には二つがあり、一つは、トランスフェリンであり、もう一つはアルブミンである。大部分の哺乳動物細胞には、特定のトランスフェリン受容体が存在し、受容体と、トランスフェリンと鉄イオンとの複合体との結合は、細胞が必要とする微量元素である鉄を採取するための主たる供給源であり、なお、トランスフェリンはさらに、成長因子の性質を有し、バナジウムのような他の微量元素と結合することができる。トランスフェリンの必要量は細胞によって異なる。アルブミンも無血清培地において一般的に用いられる添加因子である。それは、ビタミン、脂質、ホルモン、金属イオン及び成長因子との結合によって、上記物質の無血清培地での活性を安定化し調節する作用を有し、なお、毒素と結合し、プロテアーゼの細胞への影響を軽減する作用を有する。
第3の補充因子は接着因子である。大部分の真核細胞は、インビトロで成長する場合、適切な基材に定着する必要がある。細胞定着作用は、複雑なプロセスであり、接着因子が容器又はベクターの表面に付着することを含む。細胞と接着因子との結合などである。無血清培養に一般的に用いられる接着因子は、細胞間質と血清における成分、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリジンなどを有する。本出願のような懸濁培養において、培地に接着因子を添加する必要がない。
いくつかの細胞系の無血清培養はさらに、微量元素、ビタミン、脂質などのいくつかの低分子量化学物質を補充する必要があり、ビタミンBは、主に補酵素の形式で細胞代謝に関与し、ビタミンCとビタミンEは、抗酸化効果を有する。ブタンジアミンとリノール酸などは、細胞膜合成に必要な脂質及び細胞成長に必要な水溶性脂質を提供する。
現在、大規模な動物細胞の培養において、無血清培地に広く適用されている。ワクチン成長、マブ及び様々な生物活性タンパク質などの生物学的製品の応用分野において、無血清培地の成分の最適化は、細胞成長と目的生成物の発現に最も有利な環境において、異なる細胞の高密度培養を維持し、生産コストを削減することができる。ヒト細胞培養において、無血清培地の応用はさらに、線維芽細胞の過剰成長を選択的に制御及び回避することができる。無血清培養の条件下で、いくつかの細胞の成長量と抗体の収量は、血清がある時より数倍も高い。
生物製品を産生する以外、無血清培地は、細胞生物学、薬理学、腫瘍学分野にも広く応用されている。例えば、無血清培地は、細胞の分化条件の研究に用いることができる。無血清培地の他の成分は、完全に確かに知られている化学物質であってもよく、したがって研究の必要に応じて、重要な生物活性を有する物質の種類と量を増減させることができる。これは、細胞分化の条件の研究のために有効な手段を提供した。また例えば、無血清培地は、様々な細胞が混在する培養から目的細胞を選択するために使用され得る。無血清培養におけるいくつかの成分の取捨によって、初代組織培養物中の目的外細胞の過剰成長を抑制し、目的細胞を選択する目的を達成することができる。無血清培養は、腫瘍病理学と病因学の研究にも用いられる。例えば、細胞に対する発癌性因子の影響を研究し、正常細胞の終末分化を誘発し得る末梢シグナルに対する腫瘍細胞の反応能を研究し、又は正常細胞と腫瘍細胞の成長及び移行と基底膜シグナルとの関係などを研究することに用いられる。なお、無血清培養は、ホルモン、成長因子及び薬物などと細胞との相互作用の研究にも用いることができる。
市販の無血清細胞成長培地は、FreeStyleTM 293(GibcoTM、Life Technologies)、DMEM/F12(GibcoTM、Life Technologies)、SFM4Transfxー293(HyCloneTM、ThermoScientific)、CDM4HEK293(HyClone TM、ThermoScientific)、StemProー34SFM(GibcoTM、Life Technologies)、FreeStyle F17(GibcoTM、Life Technologies)、293SFMII(GibcoTM、LifeTechnologies)、CD293(GibcoTM、LifeTechnologies)、LVーMAX(A35834ー01、GibcoTM)、Expi293(Gibco TM、A14351ー01)、EXーCELL(登録商標)293(Sigma、14571Cー1000mL)、BanlanCD HEK293(Irvine、91165)、Pro293sーCDM(Lonza、12ー765Q)、OPMー293 CD03(奥浦邁、81070ー001)、Celkey CD HEK293(健順、10804ー19008)培地を含む。
懸濁培養
懸濁培養は、細胞を培地中に分散懸濁させ、単細胞及び小細胞ペレット組織培養を行うものを指し、非接着依存性細胞の培養方式である。いくつかの接着依存性細胞は、適合及び選択を経て、この方法で培養してもよい。懸濁培養の規模の増大は簡単であり、体積を増加すればよい。培地の深さが一定値を超える場合、振盪又は回転装置によって培地を揺動する必要がある。培地の深さがよい深くなる場合に、十分なガス交換を確保するために、二酸化炭素と酸素を導入する必要がある。
懸濁培養技術は、細胞接着性により、懸濁細胞培養プロセスと接着細胞マイクロキャリア懸濁培養プロセスに分けられる。懸濁細胞(CHO細胞、BHK21l細胞など)は、リアクター中で直接産生し増殖することができ、細胞が自由に成長し、培養環境が均一であり、容易にサンプリングすることができ、培養操作が簡単で制御可能であり、スケールアップしやすく、汚染率とコストが低く、それに対して、接着細胞は、リアクター中で懸濁培養する場合、マイクロキャリアを用いる必要があり、細胞と球体の接触部位の栄養環境が悪く、培養、サンプリング観察及びスケールアッププロセスが複雑であり、コストが高い。マイクロキャリア培養は、懸濁培養に比べて、プロセスが複雑であるが、回転フラスコ培養に比べて大きな利点を有し、産生規模、製品品質及び作業効率を向上させることができるため、接着細胞の懸濁培養の主な手段である。
細胞懸濁培養プロセスは、培養方式により、バッチ培養、流加培養及び灌流培養に分けられる。バッチ培養は、細胞のバイオリアクター内で成長、代謝変化を直観的に反映でき、操作が簡単であるが、初期代謝の廃棄産物が多く、細胞成長を抑制し、細胞成長密度が高くなく、流加培養は、操作が簡単であり、収率が高く、スケールアップが容易であり、広く応用されているが、流加培地を設計する必要があり、灌注培養は培養体積が小さく、回収体積が大きく、製品のタンク内滞留時間が短く、適時に低温に回収して保存することができ、製品の活性維持に有利であるが、操作が煩雑であり、細胞培地の利用効率が低く、回転フィルターが目詰まりしやすいなどの問題がある。異なるウイルスベクターに対して、異なる細胞培養方式を用いる。例えば、分泌型で製品活性の低下が速い生物製品に対して、灌流培養を用いることが適当であり、灌流培養もマイクロキャリア培養にさらに適している。
適切な産生プロセスを選定した後、プロセス制御は鍵となる。細胞が最適な環境で成長することを確保するために、リアクターのオンライン監視機能を利用して様々な動作パラメータを制御する必要がある。細胞は、温度に敏感であり、適切な加熱又は冷却方式を用いて培養温度を35℃~37℃に制御して、細胞損傷を回避する必要がある。動物細胞成長に適切なpH範囲は、一般的には6.8~7.3であり、6.8より低いか又は7.3より高い場合は、細胞増殖に悪影響を与える可能性がある。
細胞培養をスケールアップできるか否かは、リアクターを選択する重要な前提であり、懸濁培養のスケールアップは、主にリアクター体積の増大又はリアクター数の増加によって行われ、リアクター体積の増大は、多くの設置工事及び人件費を節減することができ、複数台の小さいリアクターは、操作が柔軟であるが、コストが高い。海外の生物製品生産では、大規模で、段階的にスケールアップできるバイオリアクターを用いるのは一般的である。バイオリアクターの選択と配置はさらに、産生プロセスと生産能力の要件を考慮し、満たす必要がある。リアクターインターフェースの標準化、付属品の提供速度、アフターサービス品質などは、いずれもバイオリアクターを大量選択する際に考慮する要因になり、産生の遅延を回避する。
液体懸濁培養プロセスにおいて、培養物が一定期間成長すると分裂の静止期に入るため、細胞の継代培養を適時に行うことに注意されたい。多くの懸濁培養物では、細胞は培養の18~25日目に最大密度に達し、この時に、一回目の継代培養を行う必要がある。継代培養時、大きい細胞塊と接種残渣は除去されるべきである。
細胞株のスクリーニング
細胞スクリーニング馴化の本質は、現代細胞生物学技術を適用し、異なる培養方式(例えば、懸濁)、異なる培地(例えば、無血清培地)への適応、アポトーシス率の低下、細胞活力の向上、細胞ライフサイクルの延長、生成物濃度の向上などの面から研究し、産生に適した細胞株をスクリーニングすることである。馴化の安定化を実現するために、通常、高密度細胞培養から低密度細胞培養に移行し、高濃度血清培養から血清濃度を徐々に低下させた培養を行う。細胞傷害後の修復が困難であるため、馴化時の細胞活力は90%以上に維持する必要がある。細胞の増殖能力は、生産能力に直接影響し、馴化時に、その増殖能力を測定することが必要である。馴化後の細胞発現特性の変化を回避するために、細胞を馴化する時にはその発現分泌能力を測定する必要がある。馴化後の細胞の増殖能力、活力及び生産能力は、工業的な大量生産の要求を満たすことが求められている。特定の細胞の栄養需要が異なり、その馴化を実現する難易度も異なるため、馴化時に適切な細胞培地を選択し、いくつかの栄養成分を的確に補充して細胞の特定の需要を満たす必要があり、それにより馴化済みの細胞は、その懸濁又は無血清成長の特性を維持することができる。
なお、懸濁培養において、細胞は凝集しやすい。細胞が凝集すると、ベクターの産生に用いられるプラスミドの多くが細胞にトランスフェクションできなくなり、大きな塊の間の細胞は栄養不足のために死に至り得る。現在、細胞凝集を改善する方法は、主に凝集防止剤を添加することによって行う。凝集防止剤の添加は、トランスフェクト効率を有意に低下させ、その結果、細胞はパッケージングレンチウイルスにトランスフェクションできなくなる。
分散性が高く、増殖密度が高く、ウイルスベクターを高生産する細胞株を効率的且つ簡便に馴化/スクリーニングする方法が業界に求められている。
本出願では、発明者は、主に現在のレンチウイルス作製に最も多く使用されるHEK293T細胞に対して、その馴化/スクリーニング方法を改善した。
発明者は、高濃度血清培養から血清濃度を徐々に低下させる業界の一般的な培養ステップを用いず、普通の培地で培養した接着細胞を無血清培地に直接加えて懸濁培養を行い、時間を大幅に節約し、分散性が高く(即ち凝集しにくい)、増殖密度が大きく、ウイルスベクターを高生産する細胞株のスクリーニングの成功にもある程度の寄与があると考える。
なお、本出願の発明者はさらに、いくつかの特定の無血清懸濁培地、例えば、LVーMAX 産生培地(Gibco、A35834ー01)、Expi293発現培地(Gibco、A14351ー01)及びOPMー293 CD03培地(奥浦邁、81070ー001)を使用すると、分散性が高く、即ち凝集しない細胞株のスクリーニングにより有利である。具体的には、この三つの培地によりスクリーニングされた細胞は、高い密度(~1E7細胞/ml)に達することができ、凝集細胞の割合が低いため、凝集しないサブクローンのスクリーニングに有利である。
本出願がスクリーニングしたのは、主にレンチウイルスベクターの作製によく用いられるHEK293T細胞であり、それは、増殖が速く、トランスフェクション効率が高く、ウイルスベクターを効率的に作製することができ、ウイルスベクターを大規模に作製する可能性がある。
具体的には、本出願では、無血清懸濁培養に適したHEK293T細胞株をスクリーニング又は馴化する方法を提供し、前記方法は、
血清含有培地において接着培養されたHEK293T細胞を取り、無血清培地中に置いて懸濁培養するステップi)と、
無血清懸濁培養に適したモノクローナル細胞株を選択するステップii)とを含む。
血清含有培地において接着培養されたHEK293T細胞を取り、無血清培地中に置いて懸濁培養するステップi)と、
無血清懸濁培養に適したモノクローナル細胞株を選択するステップii)とを含む。
ステップi)における血清含有培地は、10%血清、例えば、10%ウシ胎児血清を含んでもよい。
ステップi)における懸濁培養は、37℃、8%CO2の条件下での振盪培養を含んでもよい。
ステップi)における懸濁培養は、細胞の継代を含んでもよい。
無血清培地は、LVーMAX産生培地(Gibco、A35834ー01)、Expi293発現培地(Gibco、A14351ー01)、FreeStyle商標293発現培地(Gibco、12338ー018)、CD293 AGT培地(Gibco、11913ー019)、EXーCELL(登録商標)293無血清培地(Sigma、14571Cー1000mL)、BanlanCD HEK293培地(Irvine、91165)、Pro293sーCDM無血清培地(Lonza、12ー765Q)、OPMー293 CD03培地(奥浦邁、81070ー001)及びCelkey CD HEK293培地(健順、10804ー19008)から選択されてもよく、好ましくは、LVーMAX 産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地である。
ステップii)は、無血清懸濁培養に適し、分散性が高い(即ち、凝集しない)モノクローナル細胞株を選択することを含んでもよい。
ステップii)は、半固体培地中で細胞を培養し、半固体培地から単細胞を選択し、選択された細胞を懸濁培養することを含んでもよい。
ステップii)における選択された細胞の懸濁培養は、37℃、8%CO2の条件下での振盪培養を含んでもよい。ステップii)における選択された細胞の懸濁培養は、細胞の継代を含んでもよい。
半固体培地は、スクリーニング培地が添加されたメチルセルロース系培地であってもよい。
該方法の実施プロセスにおいて、凝集防止剤を添加する必要がない。
本出願の方法において、1)血清含有培地で接着培養された細胞を直接無血清培養し、無血清を漸減するステップがなく、スクリーニングプロセスを短縮することができ、2)無血清培地を用いて細胞を培養し、潜在的な免疫原性物質汚染と動物由来成分を回避し、下流の精製プロセスを簡略化し、3)LVーMAX産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択された無血清培地を用いて、懸濁培養に適し、即ち増殖密度が高く、分散性が高いHEK293T細胞株のスクリーニングにさらに有利であり、4)凝集防止剤の使用を回避し、細胞のトランスフェクション効率に影響を与えなく、及び5)半固体培地の使用は、条件を満たすモノクローナルのスクリーニングを容易にした。
半固体培養
なお、本出願の発明者は、上記スクリーニング方法において、有限希釈法ではなく、半固体培養法を用いてモノクローナル細胞スクリーニングを行った。
有限希釈は、実験室で一般的に使用される細胞クローン法である。しかし、有限希釈法は、一つのウェル内に複数の細胞を加える可能性があるため、モノクローナルの確率を向上させるためには、サブクローンを複数回行う必要がある。また、実験において、有限希釈法によってサブクローンをスクリーニングする場合、ウェルプレート中の単細胞は、正常に増殖できず、これは細胞自体の特性と関連している可能性がある。それに対して、半固体培地は、より速くより簡単なクローン方法であり、単一の細胞は、半固体培地中に固定され、離散したモノクローナル細胞群に成長し、細胞成長の追跡に有利である。且つモノクローナル細胞は、一定の数まで増幅した後にウェルプレートに転送して、単一の細胞が正常に増殖できない問題を改善することができる。また、半固体培地を用いて、同じウェル内に複数の細胞を植え付けることができ、作業者の作業量を減少させることができ、且つ有限希釈法に比べて、培養ウェルプレートの数を減少させ、試薬、消耗品及び培養箱空間を節約することができる。
半固体培地は、ハイブリドーマ及びCHO細胞の培養によく使用され、細胞クローンをより効率的に行うことができる。ウイルスベクターパッケージング/産生細胞のスクリーニングにおける半固体培養の適用は、まだ報告されていない。
本出願の宿主細胞株
ECACCから購入したHEK293T細胞から、本出願の細胞株スクリーニング/馴化方法によって、増殖密度が高く、分散性が高い様々な細胞株を得た。
そのうちの一つは、PowerSTMー293Tと命名され、2020年12月7日にブダペスト条約に基づいて中国普通微生物菌種保存管理センター(CGMCC)に寄託され、寄託番号がCGMCC No.: 21110である。
PowerSTMー293T細胞株は、無血清培地中で懸濁培養して成長することができる。前記無血清培地は、LVーMAX産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択されてもよい。
PowerSTMー293T細胞株は、懸濁培養プロセス中に細胞塊が現れなくてもよい。
PowerSTMー293T細胞株は、ウイルスベクターの産生に用いることができる。
PowerSTMー293T細胞株は、無血清培地中で懸濁培養して成長することができ、増殖密度が高く、活力が良好であり、細胞塊が現れなく、即ち分散性が高い。したがって、その懸濁培養プロセスでは、凝集防止剤を追加して添加する必要がない。
PowerSTMー293T細胞は、OPMー293 CD03培地において、倍加時間が短く、約22時間であり、細胞対数期密度が5~7×106細胞/mlに達することができ、最大密度が1.48×107細胞/mlに達することができる。
GibcoのCTS商標ウイルス産生細胞(公開番号:MAN0018590)に比べて、PowerSTMー293Tの細胞倍加時間が短く、ウイルスプラスミドをトランスフェクションした後に、より多くのウイルスベクター粒子を産出する。
以下、実施例を通じて、図面を参照しながら、本発明の技術的解決手段をさらに詳しく説明する。特に断りのない限り、以下に説明する実施例の方法及び材料は、いずれも市販品として入手可能な一般的な製品である。当業者であれば理解できるように、以下に説明する方法及び材料は、単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例1.HEK293T細胞の無血清懸濁馴化
ECACCから購入したHEK293T細胞を37℃の水浴で1分間未満インキュベートし、凍結保存管内の氷塊がなくなるまで凍結保存管内の細胞を急速に解凍した。
細胞を凍結保存管から無菌遠心管に移し、4ー5 mlの予熱されたDMEM(10%FBS含有)を加え、200 gを5分間遠心分離した。
培養フラスコ中の上清を廃棄し、細胞ペレットを10 mlのDMEM(10%FBS含有)に再懸濁した。再懸濁された細胞をT75培養フラスコ中に加え、T75培養フラスコを37℃、5%CO2の培養箱中に置いた。
細胞を三日間インキュベートし、細胞融合度が> 90%になった場合、培養フラスコ中の細胞培地を廃棄した。ここで、細胞融合度とは、単層成長細胞に対して、顕微鏡から観察された、該単層細胞に覆われた培養容器の表面積の百分率を指す。5 mlのDPBSで接着層を一回洗浄した。0.25%のトリプシン(Gibco、12563ー029)で細胞を2分間インキュベートし、細胞が分離した後、4ー5 mlの10%FBS含有DMEMをT75培養フラスコ中に加えて培養した。
細胞を無心遠心管に移し、200 gを5分間遠心した。
上清を吸引し、細胞ペレットを10 mlのDMEM(10%FBS含有)に再懸濁し、再懸濁された細胞をT75培養フラスコ中に加え、T75培養フラスコを37℃、5%CO2の培養箱中に置いた。
細胞が接着成長に完全に適応し融合度が90%になった場合に継代した。
細胞を0.25%トリプシンで消化し、そして200 gを5分間遠心した。上清を吸引し、細胞ペレットに新鮮な無血清培地(SFM)を加えて細胞を再懸濁した。無血清培地は、合計9種類であり、LVーMAX 産生培地(Gibco、A35834ー01)、Expi293発現培地(Gibco、A14351ー01)、FreeStyle商標293発現培地(Gibco、12338ー018)、CD293 AGT培地(Gibco、11913ー019)、EXーCELL(登録商標)293無血清培地(Sigma、14571Cー1000mL)、BanlanCD HEK293培地(Irvine、91165)、Pro293sーCDM無血清培地(Lonza、12ー765Q)、OPMー293 CD03培地(奥浦邁、81070ー001)、Celkey CD HEK293培地(健順、10804ー19008)を含む。無血清培地中の細胞を125 mlのシェーカーフラスコに移し、そして37℃、8%CO2の培養箱中に置き、振盪直径が19 mmであり、回転速度が125 rpmであるシェーカーで培養した。
細胞密度が3ー6×106細胞/mlになった場合、継代し、接種細胞の密度は0.35ー0.55×106細胞/ mlであり、生存率が95%を超えたまで3ー4日間インキュベートし、ここで、生存率は、VIーCELL細胞計数機器(BECKMAN)によって確定された。
9種類の無血清培地で培養された細胞駅を細胞培養プレートに入れ、図1に示すように、顕微鏡を用いて撮影してコロニーの形態を観察した。
ここで、LVーMAX 産生培地(Gibco、A35834ー01)、Expi293発現培地(Gibco、A14351ー01)、及びOPMー293 CD03培地(奥浦邁、81070ー001)培地で馴化された細胞は、密度がより高く、分散性が良い。この三つの培地で馴化された細胞を取り、成長曲線の測定を行った。具体的には、0.4±0.5×106細胞/mlの細胞密度で細胞を細胞培養フラスコに接種し、D0として記し、600マイクロリットルの細胞懸濁液を吸い出して細胞計数を行い、その後、8日間懸濁培養し、毎日600マイクロリットルの細胞懸濁液を取って細胞計数を行い、細胞成長曲線を描き、図2に示した。図2に示すように、上記三つの培地における細胞成長密度と生存率傾向は一致し、細胞最大密度はいずれも1×107細胞/mlより大きく、細胞生存率は90%より大きかった。
より高い密度に達し得る細胞を継代により選択し、最終的に、上記三つの培地における懸濁密度が最大1.2×107細胞/mlである細胞系を選択した。最終密度が1×107生細胞/mlであり、スクリーニングされた無血清として懸濁培養された細胞系に細胞を凍結保存した。この時の細胞に10ー20個の細胞凝集が存在する場合がある。
実施例2.無血清懸濁馴化HEK293Tの性能最適化
無血清懸濁馴化HEK293T細胞が凝集する問題をさらに解決するために、LVーMAX 産生培地、Expi293及びOPMー293 CD03培地に適応した細胞を、半固体マトリックス接着剤でクローンスクリーニングし、具体的なステップは以下のとおりである。
上記三つの無血清培を用いて、実施例1で得た無血清懸濁馴化細胞をそれぞれ対応して希釈し、密度が5×103細胞/mLの細胞懸濁液を作製した。
1 mLの半固体マトリックス接着剤(Stemcell、03816)を含む、それぞれ分取された2.0 mL凍結保存管に、各細胞懸濁液を100、200、300、又は400 μL加え、細胞濃度勾配を形成し、即ち各細胞に4個の細胞勾配を形成し、各ウェルの細胞総量はそれぞれ500、1000、1500、2000個の細胞であった。蓋を掛け、1ー2 min振盪した。培地は不透明であった。培地を2ー5 min静置し、培地を管底に集め、且つ気泡を液面まで上昇させた。
5 mLの使い捨て注射器を用いて接種した。具体的には、6ウェルプレートの各培養ウェル中に1~1.5 mLの上記半固体細胞懸濁液を加え、各密度で三回繰り返した。培地が培養ウェルの底部に均一に分布することを確保するように、培養プレートを軽く傾けて回転させた。
蓋が掛けられた6ウェルプレートを、同様に蓋が掛けられた大きな培養皿に入れ、該培養皿には、さらに、無菌水を入れた100 mmの培養皿が蓋なしで置かれていた。又は、6ウェルプレートに蓋を掛ける前に、培養プレートの各ウェルの間の溝内に半分の高さの無菌水又はPBSを加えた。細胞系の倍加時間に基づいて培養物におけるコロニー状況をチェックした。コロニーは、肉眼で見え、直径が一般的には0.5 ー 1.0 mmであった。各接種密度下で成長したコロニー数を統計した。培養プレートを撮影してコロニー形態を保存した。
7日後、24ウェルプレートを用意し、各ウェルプレートにそれぞれ、対応する無血清培地をウェル当たり1 mLのように加えた。10 μLのガンヘッドを用いて、5 μLの対応する細胞適応無血清培地を吸引し、6ウェルプレート培養物における大きなクローンを軽く吸引し、細胞を24ウェルプレート上に吹き込み、単一細胞であるか否かを顕微鏡下で観察した。24ウェルプレートを37℃、8% CO2の培養箱に入れ、回転速度が125 rpmであり、振盪直径が19 mmであるシェーカーで培養した。
3日ごとに一回補液し、細胞量に基づいて細胞をウェル当たり2 mLの培地のように6ウェルプレートに増幅し、37℃、8% CO2の培養箱に入れ、振盪直径が19 mmであり、回転速度が125 rpmであるシェーカーで培養した。
細胞量に基づいて細胞を125 mLのシェーカーフラスコに増幅し、3回の継代を行い、細胞懸濁液を取り、顕微鏡下で観察し、細胞形態は図3に示すとおりであった。図3からわかるように、凝集しない細胞株をクローンによってスクリーニングすることができる。凝集しない細胞を凍結保存した。
OPMー293 CD03から馴化された細胞を、PowerSTMー293Tと命名し、その細胞形態は図4Aに示すとおりであり、8日間の成長曲線と成長活力図は図4Bに示すとおりであった。該細胞株は、凝集せず、細胞倍加時間が短く、約22時間であり、細胞対数期密度が5ー7×106細胞/mlに達し得、最大密度が1.48×107細胞/mlに達し得た。
対照的に、Gibcoの細胞CTS商標ウイルス産生細胞(公開番号:MAN0018590)は、倍加時間が約26時間であった。
実施例3.無血清懸濁馴化HEK293T細胞PowerS商標ー293Tによるウイルスベクターの作製
実施例2で得られた細胞PowerS商標ー293Tを、OPMー293 CD03を用いて、0.55×106細胞/mlのように125 mlのシェーカーフラスコに接種し、37℃、8%℃の培養箱において、振盪直径が19mmであり、回転速度が125rpmであるシェーカーで三日間懸濁培養した。
実施例2で得られた細胞PowerS商標ー293Tを、OPMー293 CD03を用いて、0.55×106細胞/mlのように125 mlのシェーカーフラスコに接種し、37℃、8%℃の培養箱において、振盪直径が19mmであり、回転速度が125rpmであるシェーカーで三日間懸濁培養した。
懸濁細胞培養シェーカーフラスコから細胞懸濁液を取り、計数し、細胞密度が5.5×106 細胞/ml以上に達し、細胞活力が95%より大きくなる場合、トランスフェクションを行った。
30 mlのトランスフェクション系を例とし、まずトランスフェクション細胞密度を調整し、細胞培養液(トランスフェクション体積(30 ml)×トランスフェクション細胞密度(5×106細胞/ml)/実際生細胞密度(トランスフェクション当日の細胞の実際係数生細胞密度))を取り、27 mlのOPMー293 CD03培地に入れた。細胞培養フラスコを37℃、8%℃の培養箱に入れ、振盪直径が19mmであり、回転速度が125rpmであるシェーカーで懸濁培養した。トランスフェクション前に、細胞密度を5.5×106細胞/mlに調整し、培養箱に入れて用意した。
それと同時に、トランスフェクション複合体を作製した。
具体的には、OPMー293 CD03培地とPEIproトランスフェクション試薬を、使用前に4~5回軽く揺れた。TE緩衝液における56.25マイクログラムのプラスミドを、37℃で予熱された1.5 mlのOPMー293 CD03を含む培地に入れ、トランスファープラスミド:pMDLg.pRREKan(gagーpol、8847 bp):pRSVーRevーAmp(rev、5779 bp):pMD2.gKan(vsvg、4137 bp)=4:2:2:1であり、4~5回軽く吹き込み均一に混合し、管1ーDNAと標識した。ここで、トランスファープラスミドは、合計三種類であり、それぞれ大きさが7545 bp、9517 bp、及び9505 bpである異種遺伝子含有pCDHベクターであった。1.5 mlの37℃で予熱されたOPMー293 CD03培地に112.5 mlのPEIproトランスフェクション試薬(Polyplus Transfection、PTー115ー100)を加え、4~5回軽く吹き込み均一に混合し、管2ーPEIproと標識した。管2におけるトランスフェクション緩衝液を管1に移し、ガンで8ー10回以上繰り返して吹き込み、可能な限り直ちにボルテックスミーターで10秒間ボルテックスし、室温で15 分間静置した。
得られたトランスフェクション複合体をトランスフェクション対象細胞液にゆっくりと加え、加えながらシェーカーフラスコを軽く揺れ、操作が完了した後に、接種細胞培養フラスコを培養箱に入れて懸濁培養を行った。24時間トランスフェクションした後、最終濃度が5ミリモルであるブタン酸ナトリウムを加えた。48時間後にウイルスを収穫し、FACSを用いてウイルス力価を検出した。
Gibcoの細胞CTS商標ウイルス産生細胞(Pub. No. MAN0018590)を陽性対照として使用し、トランスフェクション試薬を除き、他の操作は、いずれもPowerS商標ー293Tと一致した。具体的には、Gibcoトランスフェクションは、LVーMAXトランスフェクションキット(ThermoFisher、A35348)を使用した。
トランスフェクション試験の結果は表1に示すとおりであった。PowerS商標ー293T細胞は、ウイルス収量が、いずれもGibco細胞のウイルス収量より高く、試験後のウイルス力価が、いずれも1×107 TU/mLより大きかった。
本発明の実施形態は、上記実施例の記載に限定されるものではなく、当業者は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の形態と詳細に対して様々な改変と改善を行うことができ、それらはいずれも本発明の保護範囲に入っていると見なされている。
Claims (22)
- 中国普通微生物保存管理センターに寄託され、寄託番号がCGMCC NO.: 21100である、新規ヒト胚腎HEK293T細胞。
- 無血清懸濁培養に適したHEK293T細胞株のスクリーニング方法であって、
血清含有培地において接着培養されたHEK293T細胞を取り、無血清培地中に置いて懸濁培養するステップi)と、
無血清懸濁培養に適したモノクローナル細胞株を選択するステップii)とを含む、方法。 - ステップi)における血清含有培地は10%血清を含む、請求項2に記載の方法。
- ステップi)における懸濁培養は、37℃、8%CO2の条件下での振盪培養を含む、請求項2に記載の方法。
- ステップi)における懸濁培養は、細胞の継代を含む、請求項2に記載の方法。
- ステップii)は、無血清懸濁培養に適した、凝集しないモノクローナル細胞株を選択することを含む、請求項2に記載の方法。
- ステップii)は、半固体培地中で細胞を培養し、半固体培地から単細胞を選択し、選択された細胞を懸濁培養することを含む、請求項2又は6に記載の方法。
- ステップii)における選択された細胞の懸濁培養は、37℃、8%CO2の条件下での振盪培養を含む、請求項7に記載の方法。
- ステップii)における選択された細胞の懸濁培養は、細胞の継代を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記半固体培地は、スクリーニング培地が添加されたメチルセルロース系培地である、請求項7に記載の方法。
- 前記無血清培地は、LVーMAX産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記方法は、凝集防止剤を添加することなく実施される、請求項2~11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2~12のいずれか一項に記載の方法によりスクリーニングされた細胞株。
- 液体培地中で凝集しない、請求項13に記載の細胞株。
- LVーMAX産生培地、Expi293発現培地及びOPMー293 CD03培地から選択された培地の、懸濁培養に適した、凝集しないHEK293T細胞株のスクリーニングにおける用途。
- 請求項1、13及び14のうちのいずれか一項に記載の細胞株を用いてウイルスベクターを作製する方法であって、
前記細胞株を懸濁培養するステップi)と、
細胞株にウイルスベクター発現システムを導入するステップii)と、
ウイルスベクターが産生された条件下で細胞株を培養するステップiii)と、
ウイルスベクターを収集するステップvi)とを含む、方法。 - ステップvi)の後、ウイルスベクターに対して力価検出を行うステップv)をさらに含む、請求項16に記載の方法。
- ウイルスベクター発現システムは、パッケージング核酸ベクターとエンベロープ核酸ベクターとを含む、請求項16に記載の方法。
- ウイルスベクター発現システムは、ヘルパー核酸ベクター、及び/又は異種核酸を含む核酸ベクターをさらに含んでもよい、請求項16に記載の方法。
- 異種核酸の長さは4 kb以下である、請求項19に記載の方法。
- ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項16に記載の方法。
- レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項21に記載の方法。
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