CN116635088A - 高分散性的hek293t细胞株及其筛选方法 - Google Patents

高分散性的hek293t细胞株及其筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116635088A
CN116635088A CN202180088455.1A CN202180088455A CN116635088A CN 116635088 A CN116635088 A CN 116635088A CN 202180088455 A CN202180088455 A CN 202180088455A CN 116635088 A CN116635088 A CN 116635088A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
medium
vector
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180088455.1A
Other languages
English (en)
Inventor
郭晨
谢胜华
宣春玲
惠二京
丁容娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Jinsirui Biotech Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Jinsirui Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Jinsirui Biotech Co ltd filed Critical Jiangsu Jinsirui Biotech Co ltd
Publication of CN116635088A publication Critical patent/CN116635088A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供高分散性的HEK293T细胞株及其筛选方法。具体地，涉及一种筛选适应无血清悬浮培养的HEK293T细胞株的方法、使用该方法筛选出的细胞株、以及使用该细胞株生产病毒载体的方法。

Description

高分散性的HEK293T细胞株及其筛选方法
相关申请和引用并入
在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请。
对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。
发明领域
本申请涉及一种筛选适应无血清悬浮培养，特别是适应无血清悬浮培养且分散性好的HEK293T细胞株的方法、以及使用该方法筛选到的HEK293T细胞株，特别是PowerS TM-293T，其保藏号为CGMCC No.:21100。本申请还涉及使用所筛选的细胞株，特别是PowerS TM-293T，生产病毒载体的方法。
背景技术
基因治疗与细胞治疗已进入飞速发展阶段，成为最具前景的生命医疗发展方向。基因治疗的主要目标是将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正特定基因，以达到治疗疾病的目的。在基因治疗中，70％-80％的治疗方案是通过病毒载体完成的。病毒载体是实现将治疗性外源基因递送至目标位点的关键载体，既可以直接作为药物进行注射，也可以作为药物生产的重要原料。目前用于外源基因导入靶细胞的病毒载体主要来源于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等病毒载体。慢病毒是逆转录病毒载体中的一种，是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基础上发展起来的高效载体。通常慢病毒载体的生产有两种方法：一种是使用稳定表达慢病毒包装系统元件的细胞系；另一种是采用瞬时转染方法。瞬时转染的包装方法操作简便并且节约时间，并且在瞬时转染载体体系中，许多转基因和信使糖蛋白能够很容易被置换掉，因此通过瞬时转染生产慢病毒载体的方法仍然最为常用。
HEK293细胞，又称人胚胎肾细胞293，是最常用于逆转录病毒及其他病毒载体生产的细胞。这种细胞衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于 培养等特点。将SV40大T抗原基因转染HEK293细胞后即形成HEK293T细胞系。HEK293T细胞能够使含有SV40复制起始点的质粒在其中显著扩增，促进蛋白表达，因而用于各类基因的表达及蛋白的生产。
目前大多数慢病毒的生产是在方瓶、平皿等体系中加入胎牛血清贴壁培养HEK293衍生细胞系(如293T和293E)，通过多质粒瞬时转染包装得到病毒。对于细胞与基因治疗研发企业，在临床前研究、IND申报和临床试验期间病毒载体需求量有限，因此几乎都是采用瞬时转染贴壁细胞HEK293T的方式来生产慢病毒载体。HEK293T细胞的贴壁培养通常是用细胞工厂的形式，该生产方式主要依靠增加培养单元数目来增大细胞量。因而，当需要较大数量的病毒载体时，往往需要占用大空间，生产劳动量也很大。
要获取大的生长面积同时减少劳动量，其中一种方法使生产慢病毒的细胞株适应悬浮培养。相较于贴壁培养，悬浮培养可以大大提高细胞密度。此外，可以使用无血清培养基来培养细胞，减少终产品中潜在的免疫原性物质污染和动物源组分，简化下游纯化工艺，这就大大推进了产品向临床级别转变。悬浮培养的放大相比原先通过增加培养单元进行的贴壁培养也可以减少批次间的差异。然而，在HEK293T细胞的无血清悬浮驯化过程中，存在细胞容易结块的问题。细胞结团会导致许多用于载体生产的质粒无法转染细胞，而且在大团块中间的细胞会因为缺乏营养而死亡。目前，改善细胞结团的方法主要通过添加抗结团剂。而添加抗结团剂会显著降低转染效率，导致细胞不能转染包装慢病毒。
发明内容
通过大量实验，本申请的发明人找到了一种用于筛选适应无血清悬浮培养的HEK293T细胞株的方法。通过该方法，可以筛选出分散性高、增殖密度高的细胞株。
因而，在一方面，本申请提供一种筛选适应无血清悬浮培养HEK293T细胞株的方法，包括：
i)取在有血清培养基中贴壁培养的HEK293T细胞，置于无血清培养基中悬浮培养，以及
ii)挑选适应无血清悬浮培养的单克隆细胞株。
步骤i)中的有血清培养基可以含有10％血清，例如10％胎牛血清。
步骤i)中的悬浮培养可以包括在37℃、8％CO 2的条件下振荡培养。
步骤i)的悬浮培养可以包括细胞传代。
无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基(Gibco，A35834-01)、Expi293表达培养基(Gibco，A14351-01)、FreeStyle TM293表达培养基(Gibco，12338-018)、CD293 AGT培养基(Gibco，11913-019)、 无血清培养基(Sigma，14571C-1000mL)、BanlanCD HEK293培养基(Irvine，91165)、Pro293s-CDM无 血清培养基(Lonza，12-765Q)、OPM-293 CD03培养基(奥浦迈，81070-001)和Celkey CD HEK293培养基(健顺，10804-19008)。无血清培养基优选为LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
步骤ii)可以包括挑选适应无血清悬浮培养的不结团的单克隆细胞株。
步骤ii)可以包括，在半固体培养基中培养细胞，从半固体培养基中挑选单细胞，和悬浮培养所挑选的细胞。
步骤ii)中悬浮培养所挑选的细胞可以包括在37℃、8％CO 2的条件下振荡培养。步骤ii)中悬浮培养所挑选的细胞可以包括细胞传代，例如3次以上传代。
半固体培养基可以是添加有筛选培养基的甲基纤维素类培养基。
在该方法的实施过程中，无需添加抗结团剂。
在本申请的方法中，1)将在含血清培养基中贴壁培养的细胞直接进行无血清培养，而无血清递减的步骤，可以缩短筛选过程；2)用无血清培养基培养细胞，避免潜在的免疫原性物质污染和动物源组分，简化下游纯化工艺；3)采用选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基的无血清培养基，更利于筛选出适于悬浮培养的，即增殖密度高且分散性好的，HEK293T细胞株；4)避免使用抗结团剂，不影响细胞的转染效率；以及5)半固体培养基的使用，方便筛选出符合条件的单克隆。
本申请也涵盖选自LV-MAX生产培养基(Gibco，A35834-01)、Expi293表达培养基(Gibco，A14351-01)和OPM-293 CD03培养基(奥浦迈，81070-001)的培养基在筛选分散性高、增殖密度高的HEK293T细胞株中的用途。
另一方面，本申请涉及由上述方法筛选出的HEK293T细胞株。
特别地，本申请提供一种新型人胚肾HEK293T细胞株PowerS TM-293T，2020年12月7日根据布达佩斯条约保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.:21100。
该细胞株可以在无血清培养基中悬浮培养生长。所述无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
该细胞株可以在悬浮培养过程中不出现细胞团。
该细胞株可以用于生产病毒载体。
PowerS TM-293T细胞株可以在无血清培养基中悬浮培养生长，增殖密度高、活力良好，且不出现细胞团，即分散性高。因而，在其悬浮培养过程不需要额外添加抗结团剂。与Gibco的CTS TM病毒生产细胞(公开号：MAN0018590)相比，PowerS TM-293T的细胞倍增时间较短，转染病毒质粒后产出更多病毒载体。
再一方面，本申请涉及所筛选出的HEK293T细胞株在制备病毒载体中的用途。
具体地，本申请提供使用本申请筛选出的细胞株，包括PowerS TM-293T，来制备病毒载体的方法，包括：
i)培养细胞株；
ii)向细胞株导入病毒载体表达系统；
iii)在产生病毒载体的条件下培养细胞株；以及
vi)收集病毒载体。
该方法还可以在步骤vi)后包括对病毒载体进行滴度检测。
步骤i)可以包括细胞株的悬浮培养。在一个实施方式中，细胞株在37℃、8％℃的条件下在无血清培养基中振荡培养。无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
步骤i)还可以包括细胞株的传代。
步骤ii)可以包括经物理或化学转染法向细胞株导入病毒表达系统。物理转染法可以包括电穿孔、显微注射和基因枪等。化学转染法可以包括磷酸钙共沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、和Lipofectamine(Invitrogen)介导的转染等。
病毒载体表达系统可以包含包装核酸载体和包膜核酸载体。病毒载体表达系统还可以包含辅助核酸载体。病毒载体表达系统还可以包含含有异源核酸的核酸载体，如含有异源核酸的转移核酸载体。这些核酸载体可以是质粒。
异源核酸的长度不大于4kb。异源核酸可以编码多肽或蛋白如嵌合抗原受体(CAR)、或核酸如siRNA。在一个实施方式中，异源核酸可以编码CAR，如靶向CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、或CD269(BCMA)的CAR。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向参与生长和分化信号的抗原，包括癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR、HER2)、酪氨酸激酶受体(EPHA2)等。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向参与肿瘤血管生成的抗原，包括血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)等。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向肿瘤支撑结构的肿瘤间质和细胞外基质抗原，包括纤维细胞激活蛋白(FAP)、tenascin蛋白等。含异源核酸的质粒可以包括pCDH和pCMV等。
病毒载体可以是逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。逆转录病毒载体可以是慢病毒载体、α-逆转录病毒载体、γ-逆转录病毒载体、或泡沫逆转录病毒载体。在一个实施方式中，逆转录病毒载体为选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIN、EIAV和VISNA的慢病毒载体。在一个实施方式中，慢病毒载体可以为HIV-1载体。在一个实施方案中，所述病毒载体为腺相关病毒载体。在一个实施方式中，腺相关病毒载体选自AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAV10。
逆转录病毒载体表达系统可以包含，含有逆转录病毒结构蛋白gag-pol基因的载体，和含有env基因或其功能性替代物的核酸载体。env基因或其功能性替代物可以编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白。逆转录病毒载体表达系统还可以包含，含有辅助基因rev或其类似基因的核酸载体。逆转录病毒载体表达系统还可以包含，含有异源核酸的核酸载体，例如含有异源核酸的转移核酸载体。
在一个实施方式中，方法用于制备慢病毒载体，包括向细胞株导入三个核酸载体，分别包含HIV-1 gag-pol-rev基因、编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白的核酸、和异源核酸。
在一个实施方式中，方法用于制备慢病毒载体，包括向细胞株导入四个核酸载体，分别包含HIV-1 gag-pol基因、HIV-1rev基因、编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白的核酸、和异源核酸。含有异源核酸的核酸载体可以含有自灭活慢病毒长末端重复序列。
步骤iii)可以包括悬浮培养细胞株。在一个实施方式中，细胞株在37℃、8％℃的条件下在无血清培养基中振荡培养。无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
步骤iii)可以包括细胞传代。
基于以下具体描述和实施例，当前公开的其他特征和优势将是非常明晰的，这些具体描述和实施例不应当看做是限制性的。在本申请中引用的所有引用文献、GenBank登记号、专利和公开的专利申请，均明确地通过引用的方式并入本文。
应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等、术语例如“基本由…组成”允许没有明确表述的元素的存在。本文中描述的本发明的方面和实施方案包括“包含”，“由……组成”，和“基本上由……组成”的方面和实施方案。
如本申请说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文明确另有规定。如此，例如，提及“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合，诸如此类。
如本申请中使用的，术语“约”指技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。本文中提及“约”某个数值或参数包括(并描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
附图说明
以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
图1示出在不同培养基中驯化的细胞的形态。
图2示出在三种无血清培养基中驯化的细胞的生长曲线。
图3示出在三种无血清培养基中驯化的单克隆细胞的形态。
图4示出细胞株PowerS TM-293T的细胞形态(A)和生长曲线(B)。
保藏说明：本申请涉及的新型人胚肾HEK293T细胞株PowerS TM-293T，于2020年12月7日根据布达佩斯条约保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.:21100。
具体实施方式
除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
本申请提供一种用于筛选适应无血清悬浮培养的细胞株的方法、以及经此筛选出来的细胞株。该细胞株分散性好、增殖密度高，可用于产出高滴度的病毒颗粒载体，特别是逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体颗粒。
病毒载体
病毒载体是分子生物学家用来向细胞递送遗传物质的工具，其携带外源基因并能包装成病毒颗粒、介导外源基因的转移和表达、且对机体不致病。本申请中的“异源核酸”、“异源基因”、“外源核酸”或“外源基因”是指在病毒中并非天然存在的核酸或基因。一般地，异源核酸或外源基因包含编码目的蛋白或非翻译RNA的可读框。
术语“病毒载体”、“病毒颗粒”或“病毒载体颗粒”在本文中可互换使用。
已知的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、孢疹病毒等。
逆转录病毒
逆转录病毒载体是人类基因治疗研究中使用最多的病毒载体。逆转录病毒是含有假二倍体单链RNA基因组的病毒家族，编码逆转录酶，其从RNA基因组产生DNA，然后该DNA可插入宿主细胞DNA。所有的逆转录病毒都至少含有三种基因，gag、pol和env，它们编码结构蛋白和酶(逆转录酶、RNase H、整合酶、和蛋白酶)，是病毒复制所必需的。
为更好地理解逆转录病毒，先将所有逆转录病毒所共有的核酸序列解释如下。
长末端重复序列(LTR)：逆转录病毒基因组的基本结构包含5'-LTR和3'-LTR，产生逆转录病毒所需的基因位于其间或其中。LTR是逆转录病毒整合和转录所必需的。它们也可以作为启动子序列来控制逆转录病毒基因的表达(即，它们是顺式作用基因)。LTR由三个划分为U3、R、U5的亚区组成：U3来源于RNA 3'末端特有的序列；R来源于在RNA两端重复的序列；U5来源于RNA 5'末端特有的序列。为了解决与生成具有复制能力的病毒有关的安全性问题，已经通过删除3'LTR的U3区中的一个区段开发了一种自身失活型(SIN)载体，所述U3区包括TATA盒和转录因子Sp1和NF-κB的结合位点(Miyoshi H et al.,(1998)Development ofa self-inactivating lentivirus vector.J Virol.72(10):8150-8157)。在逆转录并整合到传染的细胞中后，该缺失被转移到5'LTR中，导致LTR的转录失活。
ψ：借助位于逆转录病毒基因组5'末端的ψ(psi)序列发生逆转录病毒RNA的壳体化。本领域中众所周知的是，psi序列下游并延伸到gag编码区中的序列涉及有效的逆转录病毒载体产生(Yan Cui et al.,(1999)Contribution of viral splice sites and cis-regulatory elements to lentivirus vector function.J.Virol.73(7):6171–6176)。
引物结合位点(PBS)：逆转录病毒基因组含有在5'-LTR的U5区之后存在的PBS。该位点结合启动逆转录所需的tRNA引物。
PPT：逆转录病毒基因组在逆转录病毒基因组的3'末端附近包含称为多嘌呤片段(PPT)的短延伸嘌呤。这些PPT在逆转录过程中起到用于正链DNA合成的RNA引物的作用。复杂的逆转录病毒(诸如HIV-1)含有第二个更位于中心的PPT(即，中心聚嘌呤区(cPPT))，其提供了用于启动DNA合成的第二个位点。已显示编码cPPT的逆转录病毒载体具有增强的转导和转基因表达(Barry SC et al.,(2001)Lentivirus vectors encoding both central polypurine tract and posttranscriptional regulatory element provide enhanced transduction and transgene expression.Hum Gene Ther.12(9):1103-1108)。
上述非编码区的基因组结构是本领域技术人员所熟知的。例如，关于HIV-1中非编码区的基因组结构的细节可以从NCBI Genbank的Genome登录号AF033819中找到，或对于HIV-1HXB2(常用的HIV-1参考菌株)为Genome登录号K03455。
Gag/pol：gag和pol基因的表达依赖于gag和pol之间的翻译移码。两者都是在成熟过程中被切割的多蛋白。逆转录病毒载体的主要结构基质、衣壳和核衣壳蛋白由gag编码。pol基因编码病毒复制相关的酶，包括：i)逆转录酶，逆转录酶对逆转录病毒RNA基因组向双链DNA的逆转录至关重要；ii)整合酶，其使逆转录病毒DNA基因组整合至宿主细胞染色体；以及iii)蛋白酶，其裂解合成的多蛋白以产生逆转录病毒的成熟和功能性蛋白。在一个实施方案中，编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列来源于HIV-1HXB2序列，其可从Genome登录号K03455获得，例如从碱基对790-5105获得。
Env：env(“包膜”)基因编码逆转录病毒包膜的表面和跨膜成分(例如HIV-1的糖蛋白gp120和gp41)并参与逆转录病毒-细胞膜融合。为了拓宽逆转录病毒载体的组织转染性，逆转录病毒载体可以用来自另一种病毒的包膜蛋白假型化。假型化是指通过改变逆转录病毒载体颗粒上的糖蛋白(GP)，从而将逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)的宿主细胞范围进行扩展或改变，例如，通过使用从其他包膜病毒获得或来源自其他包膜病毒的GP或使用合成/人工GP。由于其广泛的转染性和高载体颗粒稳定性，用于假型化逆转录病毒载体的最常用的糖蛋白是水泡性口膜炎病毒GP(VSVg)。然而，本领域技术人员应该理解，其他糖蛋白可以用于假型化(Cronin J et al.,(2005)Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.Curr Gene Ther.5(4):387-398)。用于假型化的病毒的选择还可取决于待靶向的细胞和/或器官的类型。env蛋白或其功能替代物可以是从选自以下的病毒获得或来源自选自以下的病毒：水泡病毒属(例如水泡性口膜炎病毒)、狂犬病病毒属(例如，狂犬病病毒、莫克拉病毒(Mokola virus))、沙粒病毒(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV))、甲病毒属(例如，罗斯河病毒(RRV)、 辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒、线状病毒(例如，埃博拉病毒雷斯顿株、埃博拉病毒扎伊尔株、拉沙病毒)、α逆转录病毒属(例如，禽白血病病毒(ALV))、β逆转录病毒属(例如，绵羊肺腺瘤逆转录病毒(JSRV))、γ逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性逆转录病毒(RD114))、δ-逆转录病毒(例如人嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1))、泡沫病毒属(例如人泡沫病毒)、慢病毒(例如梅迪-维斯纳病毒(MVV))、冠状病毒(例如SARS-CoV)、呼吸道病毒(例如，仙台病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV))、丙型肝炎病毒属(例如丙型肝炎病毒(HCV))、流感病毒(例如A型流感病毒)和核型多角体病毒(例如苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV))。在一个实施方式中，env蛋白或其功能性替代物得自或来自水泡性口膜炎病毒。在该实施方案中，可以使用水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSVg)的蛋白，其使逆转录病毒颗粒传染更广泛的宿主细胞范围并消除重组产生野生型包膜蛋白的机会。在另一个实施方案中，编码env蛋白或其功能性替代物的逆转录病毒核酸序列来自Genome登录号J02428.1处的序列，例如来自碱基对3071至4720。
本文所述的结构基因对于所有逆转录病毒都是共同的。其他辅助基因可存在于不同类型的逆转录病毒中。例如，慢病毒，诸如HIV-1，含有另外六种称为rev、vif、vpu、vpr、nef和tat的辅助基因。其他逆转录病毒可能具有与本文描述的基因类似的辅助基因，然而它们可能并不总是被赋予与文献中相同的名称。例如Tomonaga和Mikami描述了各种逆转录病毒辅助基因(Tomonaga K,Mikami T.(1996)Molecular biology of the feline immunodeficiency virus auxiliary genes.J Gen Virol 77(Pt 8):1611–1621)。
Rev：辅助基因rev(“病毒粒子的调节子”)编码与Rev应答元件(RRE)结合并促进逆转录病毒转录物输出的辅助蛋白。该基因的蛋白产物允许含有Rev应答元件(RRE)的逆转录病毒mRNA片段从细胞核输出到细胞质中。预测RRE序列以形成复杂的折叠结构。rev的这一特殊作用反映了拼接和核输出步骤的紧密结合。RRE序列可以来自HIV-1HXB2序列，其可从Genome登录号K03455处获得，例如从碱基对7622至8479或7769至8146，特别是碱基对7622至8479。
Rev与RRE结合并促进单一剪接(env、vif、vpr和vpu)或非剪接(gag、pol和基因组RNA)病毒转录物的输出，从而导致下游事件如基因翻译和包装(Suhasini M,Reddy TR.(2009)Cellular proteins and HIV-1 Rev function.Curr HIV Res.7(1):91-100)。在一个实施方案中，病毒表达系统包含辅助基因rev或类似它的基因(即，来自其它逆转录病毒或功能类似系统)。包含rev基因确保了逆转录病毒载体基因组的RNA转录物从细胞核有效地输出到细胞质，特别是如果RRE元件也包含在待转运的转录物中。rev基因可以与Genome登录号M11840(即HIV-1克隆12cDNA，HIVPCV12基因座)的碱基对970至1320具有至少60％序列同一性，诸如至少70％序列同一性。在可选的实施方案中，rev基因与Genome登录号 K03455.1(即人类免疫缺陷病毒1型，HXB2)的碱基对5970至6040和8379至8653具有至少60％序列同一性，诸如至少70％、80％、90％或100％序列同一性。
辅助基因被认为在逆转录病毒复制和发病机制中起作用，因此许多当前的病毒载体生产系统不包括这些基因中的一些。通常存在的rev是一个例外，或者可使用类似于rev/RRE系统的系统。在一个实施方式中，病毒载体中编码一种或多种辅助基因vpr、vif、vpu、tat和nef或类似辅助基因的核酸序列可以被破坏，使得辅助基因从逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组中被去除或不能编码功能辅助蛋白。在另一个实施方案中，至少两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或全部辅助基因vpr、vif、vpu、tat和nef或类似辅助基因被破坏，使得所述辅助基因从逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组中被去除或不能编码功能辅助蛋白。去除功能辅助基因可不需要去除整个基因；除去部分基因或破坏基因就足够了。
应该理解，编码复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的核酸序列可以与逆转录病毒载体颗粒所基于的逆转录病毒的野生型基因相同或来源于该逆转录病毒的野生型基因，即，序列可以是包含在野生型病毒中的遗传上或其他方式改变版本的序列。因此，引入核酸载体或宿主细胞基因组中的逆转录病毒基因也可以指野生型基因的密码子优化版本。
慢病毒载体
作为逆转录病毒载体的一种，慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，它能够将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白。慢病毒介导的基因表达持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，具有格外的优势。
慢病毒载体以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物安全性。然后，再在这个基因组骨架中引入临床或研究所需的目的基因序列和表达结构，制备为载体。当前的慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的全部遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，将其进行收集和浓缩后可直接感染宿主细胞或者动物模型，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。研究表明，慢病毒载体可有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，介导目的基因的长期表达。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干 细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
早期的慢病毒载体，由HIV改装而来，包括HIV-1型载体系统和HIV-2型载体系统。HIV-1为双链RNA病毒，其基因组结构和其他的逆转病毒类似，含有可编码三种主要病毒结构蛋白的基因，即gag、pol和env。gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)，pol基因编码病毒复制相关的酶，env基因编码病毒包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。此外，病毒基因组还包含两个调节基因tat、rev，rev主要参与蛋白调节的表达水平，其编码的蛋白可以调价gag、pol、env的表达水平，tat编码的蛋白参与RNA转录的控制，与病毒的长末端重复序列(LTR)结合后促进病毒的所有基因的转录。另外，基因组还包含vif、vpr、vpu、nef四个辅助基因。在HIV-1的基因组结构上，还含有病毒生命史所需要的其他序列结构，如病毒复制和包装等所需要的信号等，例如基因组的两端为长末端重复系列，内含复制所需的顺式作用元件。
HIV-1型慢病毒载体系统的建立，经历了一个逐步完善的过程，以逐渐提高载体的生物安全性。
第一代的HIV-1慢病毒载体是两质粒系统，包含3个结构基因env、gag和pol，2个调控基因tat、rev和4个辅助基因vpr、vif、vpu和nef，两端有长末端重复序列(LTR)，5'LTR和gag之间还有病毒包装信号序列。慢病毒载体最初的包装是将HIV基因组中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装上含有目标基因的核酸载体和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，同时共转染宿主细胞(如293T细胞)，进行包装。这是一个复制缺陷型的载体体系，产生病毒的滴度很低，而且只能感染CD4+细胞，在转染过程中包装的蛋白DNA和载体DNA有重组的可能，进而有产生有复制能力的病毒系统的安全风险。
第二代的载体为三质粒表达系统，也就是将HIV-1基因组中负责包装、逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，其中一个是包装质粒，含有CMV启动子，控制除env以外的全病毒结构基因的表达，并用人胰岛素基因的polyA替代3’LTR作为加尾信号，第二个是包膜质粒，含有表达水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因的序列，这个基因用于代替原病毒的env基因，这个基因的产物可以提高病毒的宿主范围，而另一个则是载体质粒，其中含有研究人员所感兴趣的基因序列结构、以及所有相关顺式作用元件。但这个三质粒系统还是保留了HIV-1的附属基因，这个质粒体系产生意外而导致出现具有活性的病毒的可能较大，因而被认为安全系数较低。
第三代质粒系统，去除了HIV病毒所有辅助因序列，这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和转染能力，同时增加了载体的安全性。
第四代的载体为四质粒系统，也是目前被广泛使用的慢病毒载体系统。在第 三代的基础上，构建了自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3’LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA，另外将env基因放在一个单独的表达质粒上，还将tat基因去除，代之以异源启动子序列。这样，形成了四个质粒的系统，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G，此外还有一个可以放置目的基因序列的核酸载体。这个体系意外产生活性病毒的可能被大大降低。这类载体系统中可含有可诱导性基因，最具代表性的为四环素-诱导系统，其为可调控系统与慢病毒载体的结合产物，人为地控制植入慢病毒的目的基因的表达，使基因的条件性表达和基因敲除都成为可能，并且继续保留了自身失活的优势(Meng F et al.,(2014)Advances of lentiviral vectors.Zhongguo Fei Ai Za Zhi 17(12):870-6；Martínez-Molina,E.et al.,(2020)Large-Scale Production of Lentiviral Vectors:Current Perspectives and Challenges.Pharmaceutics 12:1051)。
其他类型的慢病毒载体系统主要包括猿类免疫缺陷病毒(SIV)载体系统、猫免疫缺陷病毒(FIV)载体系统、马传染性贫血病毒(EIAV)载体体系、山羊类关节炎-脑炎病毒(CAEV)载体系统、牛免疫缺陷病毒(BIV)载体系统、绵羊髓鞘脱落病毒(VMV)载体系统等。
病毒载体的制备
病毒载体颗粒的制备通常需要以下几个步骤：
1)培养并扩增宿主细胞；2)将病毒载体表达系统导入宿主细胞；3)培养并扩增已导入病毒载体表达系统的宿主细胞；4)收集并纯化所产生的病毒载体。
虽然现在已有可能对有些病毒载体(如AAV载体)进行体外(无细胞)包装，但是这种包装系统仍然需要细胞提取物，并且包装效率相当低，远远达不到可生产水平。至今为止，病毒载体的包装主要是在对该病毒敏感的宿主细胞中进行的。宿主细胞不但提供了病毒复制和包装的环境条件，许多细胞成分还直接参与了病毒复制和包装的过程。
病毒载体制备所需的宿主细胞，又称为生产/包装细胞系。在慢病毒载体的背景下，术语“包装细胞系”可以指具有导入有gag和pol以及env基因的细胞系；“生产细胞系”可以指导入有gag、pol、env基因以及外源基因的细胞系。在一个实施方式中，“包装细胞系”是在细胞基因组中插入有gag和pol以及env基因的细胞系；“生产细胞系”是在细胞基因组中插入有gag、pol、env基因以及外源基因的细胞系。在另一个实施方式中，“包装细胞系”是在细胞基因组中稳定插入有gag和pol以及env基因的细胞系；“生产细胞系”是在细胞基因组中稳定插入有gag、pol、env基因以及外源基因的细胞系。
宿主细胞的培养分为贴壁培养和悬浮培养。要增加病毒载体的制备，可以增加可供细胞附着的总表面积、或进行细胞的悬浮培养。
HEK293细胞，又称人胚胎肾细胞293，是最常用于逆转录病毒及其他病毒载体生产的细胞。而整合有SV40T抗原的HEK293T细胞，比起母细胞系HEK293， 能够产生更高的病毒滴度。HEK293T细胞通常贴壁培养在含有10％胎牛血清培养基的细胞培养瓶中，病毒产量较小。为增加细胞可附着的表面积，可使用多层容器，如HYPERFlask TM(Corning)，以及多层细胞工厂，如细胞工厂系统(Numc，EasyFill，ThermoScientific，Waltham，MA，USA)。HYPERFlask TM(Corning)的总生长面积为大约1720cm 2，且具有透气表面，可进行氧气和二氧化碳交换，产量大概是T-150培养瓶的10倍多。细胞工厂系统(Numc，EasyFill，ThermoScientific，Waltham，MA，USA)的层数可高达40，可产生与约170个T-150培养瓶相当的培养表面积。此外，市场上还研发出了固床生物反应器，如iCELLis(Pall Life Sciences，Hoegaarden，比利时)和Scale-X TM生物反应器系统(Univercells，Gosselies，比利时)，固定床上充满聚对苯二甲酸乙二酯(PET)纤维或PET纤维层，提供可供细胞附着的大表面积。iCELLis 500提供的细胞生长面积约为3000个HYPERFlask。
尽管有各种设备的更新，可以扩大培养依赖于血清的贴壁HEK293T，但仍耗时耗力。因而，研究者开始尝试将HEK293细胞驯化成适应悬浮培养。HEK293E细胞被最先驯化，在无血清的培养基中悬浮培养。此后，不断开发出新的此类细胞系，如HEK293SF-3F6等(Ansorge,S.et al.,(2009)Development of a Scalable Process for High-Yield Lentiviral Vector Production by Transient Transfection of HEK293Suspension Cultures.J.GeneMed.11:868–876)。比起贴壁培养，悬浮培养有多种优势，如不需要复杂的培养仪器，不需要机械力或酶来使细胞脱壁，更方便传代，方便扩大规模。
对于细胞与基因治疗研发企业，在临床前研究、IND申报和临床试验期间病毒载体需求量有限，因此几乎都是采用瞬时转染贴壁细胞HEK293T的方式来生产慢病毒载体。HEK293T细胞的贴壁培养通常是用细胞工厂的形式，该生产方式主要依靠增加培养单元数目来增大细胞量。因而，当需要较大数量的病毒载体时，往往需要占用大空间，生产劳动量也很大。要获取大的生长面积同时减少劳动量，其中一种方法使生产慢病毒的细胞株适应悬浮培养。相较于贴壁培养，悬浮培养可以大大提高细胞密度。
第二个步骤是将病毒载体表达系统导入宿主细胞，即用包装核酸载体、包膜核酸载体、辅助核酸载体、载有异源基因的核酸载体等转染宿主细胞。
本申请中的“病毒表达系统”是指一种或多种多核苷酸的系统，当引入合适的宿主细胞内时，该系统足以支持病毒的复制和包装。病毒表达载体还可以包含载有异源基因的核酸载体，其编码的核酸如RNA或多肽/蛋白可以一起包装到病毒载体颗粒中。例如，慢病毒的表达系统通常包含gag-pol基因、env基因、和辅助基因rev等。在一个实施方式中，慢病毒的表达系统包含含HIV-1 gag-pol-rev基因、和编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白的核酸序列的核酸载体。在另一个实施方式中，慢病毒的表达系统包含含HIV-1 gag-pol基因、HIV-1rev基 因、以及编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白的核酸序列的核酸载体。AAV表达系统通常包括编码AAVrep和cap、辅助基因和rAAV基因组的多核苷酸。本文中的“核酸载体”是指DNA或RNA的载体，在具体实施方式中可以为质粒，或者细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生人工染色体(PAC)、福斯黏粒或黏粒等。在核酸载体中可以根据需要包含复制起点、启动子、转录调控元件等。任何元件可以可操作地连接至启动子，以便可以控制表达。本文提及的启动子可以包括已知的启动子(完整的或一部分)，其可以是持续性活化的或可诱导的，例如，在调控蛋白存在的情况下。在一个实施方案中，核酸载体另外包含高效启动子，诸如CMV启动子。该启动子具有促进在非哺乳动物核酸载体上编码的元件的高水平表达的优点。在另一个实施方案中，CMV启动子包含源自人巨细胞病毒株AD169的序列。该序列可从Genome登录号X17403处获得，例如从碱基对173731至174404。在本申请中，载有外源基因的核酸载体可以称为转移载体，在一个实施方式中可以为转移质粒。转移载体质粒通常含有启动子(诸如CMV)、3'LTR(可以是或不是自失活的(即SIN)3'-LTR)、5'LTR(可以包含或不包含U5区域)、壳体化序列(ψ)和与启动子连接的潜在的外源基因。
本文所述的“转染”或“感染”是指将外源的遗传物质，如本文所述的“病毒表达系统”，导入宿主细胞。本领域技术人员已知通常使用的转染方法包括但不限于使用物理方法(例如，电穿孔、细胞挤压、声致穿孔、光学转染、原生质体融合、撞击转染、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如，磷酸钙、高度支化的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如，脂质转染)。许多转染方法需要使质粒DNA溶液接触细胞，然后使其生长并选择用于标记基因表达。
要将外源核酸或核酸载体导入宿主细胞并不容易，必须要跨越细胞膜这道屏障，而高的转染效率是产生高滴度病毒载体颗粒所必需的。病毒质粒转染的方法大体可分为化学和物理两种。常用的化学方法包括磷酸钙共沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、和Lipofectamine(Invitrogen)介导的转染，物理方法则包括电穿孔，例如流式电穿孔，显微注射和基因枪等。
磷酸钙共沉淀适用于多种细胞类型，且能够使大量细胞同时被转染，可用于大规模病毒制备。然而，磷酸钙对pH值变化非常敏感，且对细胞毒性较大。为避免毒性，需要用含有血清或白蛋白的培养基来培养宿主细胞，并在转染后及时更换培养基。
PEI介导的转染与磷酸钙同样高效。使用该方法时，需要选取合适的PEI/DNA比。PEI也对细胞产生毒性，但转染后不更换培养基也是可以的。此外，PEI方法对pH值不敏感。PEI方法可用于贴壁和悬浮培养的细胞，且培养基中的血清是必不可少的(Toledo,J.R.et al.,(2009)Polyethylenimine-Based Transfection Method as a Simple and Effective Way to Produce Recombinant Lentiviral Vectors.Appl.Biochem. Biotechnol.157:538–544)。
Lipofectamine介导的转染是最高效和最方便的，适用于多种细胞类型，且转染率很高，例如在一些实例中可见到100％细胞被慢病毒转染。但是，对于大规模病毒载体制备而言，使用Lipofectamine会导致成本过高。
流式电穿孔法与磷酸钙法一样高效，但仅需要三分之一或更少的DNA量，对细胞没有毒性，适用于悬浮培养的细胞。
此外，据报道，在转染过后向培养基加入丁酸钠可增加病毒滴度。
在上述转染方法中，PEI更适用于贴壁培养的细胞，流式电穿孔法更适用于悬浮培养的细胞，而磷酸钙和Lipofectamine因为成本原因更适用于小规模应用。
一旦进入宿主细胞内，核酸载体将被随机整合到哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。因此，可能还需要选择其中已经整合了在核酸载体上编码的核酸的宿主细胞，例如，使用抗生素抗性选择标记，诸如zeocin抗性标记等。
本领域技术人员将知晓促进核酸载体整合的方法，例如，如果核酸载体，例如质粒，是天然的环状，则线性化该核酸载体。核酸载体可以另外包含与宿主细胞的内源染色体共有同源性的区域，以引导整合至内源基因组内的选定位点。此外，如果重组位点存在于核酸载体上，则可用于靶向重组。其他靶向整合方法在本领域中是众所周知的。例如，可以使用诱导基因组DNA的靶向切割的方法来促进选定染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程化切割系统来诱导内源基因组中的双链断裂(DSB)或切口以通过天然过程(例如非同源性末端接合)修复断裂或使用修复模板修复(即，同源性定向修复或HDR)。通过使用特定的核酸酶诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子(诸如效应物核酸酶)(TALEN)、使用CRISPR/Cas9系统和工程化的crRNA/tracr RNA('单向导RNA')指导特异性切割和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如来自嗜热菌(T.thermophilus)，称为'TtAgo'，Swarts DC et al.,(2014)DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute.Nature.507(7491):258-261)可发生切割。使用这些核酸酶系统之一的靶向切割可以利用HDR或NHEJ介导的过程将核酸插入特定的靶位置。因此，在一个实施方案中，使用至少一种核酸酶将在核酸载体上编码的核酸序列整合到宿主细胞的基因组(即内源染色体)中，其中所述至少一种核酸酶切割宿主细胞的基因组，使得核酸序列整合到细胞的基因组中。在另一个实施方案中，所述至少一种核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas核酸酶系统及其组合。
转染又分为瞬时转染和稳定转染。在瞬时转染的情况中，外源基因得以表达但不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制。细胞中瞬时表达的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。稳定转染则建立在瞬时转染的基础上，只不过需要一个重要的偶发过程，即在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。外源基因成为细胞 基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定的细胞系。
瞬时转染一般持续几天，用瞬时转染研究基因表达，通常在转染后的24小时至96小时内收获细胞，其具体时间取决于细胞类型、载体构建等多种因素。也正因如此，瞬时转染一般用于研究基因或基因产物的短期表达，基因敲除或RNA介导的基因沉默，以及进行蛋白质小规模合成。瞬时转染mRNA比转染传统质粒DNA出结果更快，这是因为mRNA能够直接在核外表达，在一些系统中mRNA可以在转染后几分钟就得到表达。相应第，如果需要进行长期基因表达时就得进行稳定转染，例如大规模蛋白合成、长期药理学研究、基因治疗研究和长期遗传调控机制研究等等。稳定转染与瞬时转染相比，时间更长也更费劲。
稳定转染的细胞系又分为组成型稳转细胞系和诱导型稳转细胞系。组成型稳转细胞系通常不表达具有较高细胞毒性的病毒包膜，如慢病毒的VSV-G，持续数月以较高滴度产生病毒载体颗粒。这类细胞系非常少，已知的慢病毒稳转细胞系有STAR细胞系、WinPac细胞系、RD-MolPack细胞、LentiPro26细胞系等。诱导型稳转细胞系通常在需要制备病毒时才诱导病毒包膜的表达，例如当在生长培养基中添加抗生素等诱导剂时才进行表达。诱导型稳转细胞系也能在较长时间内制备较高滴度病毒。例如，ProSavin，能够在83天内产生最高3×10 5TU/ml的滴度(Broussau,S.et al.,(2008)Inducible Packaging Cells for Large-Scale Production of Lentiviral Vectors in Serum-Free Suspension Culture.Mol.Ther.16:500–507；Stewart,H.J.et al.,(2011)A Stable Producer Cell Line for the Manufacture of a Lentiviral Vector for Gene Therapy of Parkinson’s Disease.Hum.Gene Ther.22:357–369)；Milani et al.开发的这类细胞系能够产生4.4×10 6TU/ml的滴度(Milani,M.et al.,(2017)Genome Editing for Scalable Production of Alloantigen-free Lentiviral Vectors for in Vivo Gene Therapy.EMBO Mol.Med.9:1558–1573)。
由于很难得到稳定转染细胞系，目前主流的病毒制备例如慢病毒载体制备还是采用适应悬浮培养的HEK293T细胞系。
病毒载体制备的第三个步骤是培养并扩增已导入病毒载体表达系统的宿主细胞，与第一个步骤相类似。
第四个步骤是分离并纯化病毒载体。在所收集的含有病毒载体颗粒的细胞培养上清液中，可能含有多种杂质，如宿主细胞、宿主细胞产生的其他蛋白、质粒DNA、血清等，其中血清成分复杂，可能含有内毒素和免疫原性蛋白等。需要除去这些杂质，并对终产品进行浓缩。在这些处理中，最大的问题在于如何保持病毒载体的活性/功能性，因而需要使用尽量少的步骤在尽量短的时间内处理完毕。用于小规模纯化的方法显然不适用于大规模生产。而且一些纯化步骤如离心，不符合cGMP规范，且高速离心会在一定程度上破坏病毒包膜。
现有的大规模病毒载体纯化方法包括澄清、浓缩和纯化。
澄清是指在收集上清液后除去宿主细胞和宿主细胞残骸。小规模澄清可以经离心和微过滤等方法进行，而大规模澄清优选使用45μm多孔膜。为避免孔堵塞，可使用递减孔径的膜，提高过滤效率。
澄清后的病毒载体颗粒可以使用切向流过滤(TFF)浓缩并渗透到合适的缓冲液中，包括使用1至100nm孔径的膜。这项技术可以使得在短时间内大大缩减体积，以浓缩病毒颗粒，并除去血清、降解DNA片段等。最重要的是，用TFF操作完全符合cGMP规范。由于TFF操作中的液体是平行于过滤器的，可以大大减少在其他超滤方法中常遇到的膜堵塞问题，可以将液体流速保持在较高水平。通过TFF，可以回收约90-100％的慢病毒颗粒。目前，TFF可处理约100L的病毒产品(Valkama,A.J.et al.,(2020)Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.17:717–730)。
对于应用于人类的医药制品，慢病毒载体产品还需进行色谱纯化。阴离子交换色谱(AEX)是病毒载体特别是慢病毒载体纯化的高效工具，基于慢病毒载体在中性pH下带正电的特点。当病毒载体上清液通过带负电基质的柱时，带正电的病毒颗粒结合至负电基质，杂质直接通过柱而流出。之后，将病毒载体暴露于高盐环境(0.5-1M NaCl)，将结合的颗粒从阴离子交换柱上洗脱出来。高盐可能会使病毒颗粒失活，这也是该项技术的唯一缺陷。病毒颗粒于室温暴露于高盐洗脱液，会使50％病毒失活(Segura,M.D.L.M.et al.,(2005)A Novel Purification Strategy for Retrovirus Gene Therapy Vectors Using Heparin Afinity Chromatography.Biotechnol.Bioeng.90:391–404)。
亲和色谱是基于靶分子与附着色谱柱的配体之间的特异相互作用而用于分离生物分子的纯化技术。由于具有高度的分子选择性，该技术可以在一定程度上简化纯化步骤。亲和色谱可以根据相互作用的不同而分成几类，例如基于氢键、静电作用、范德华力、或抗体-配体等的亲和色谱。抗体-配体之间的相互作用是最具选择性的，然后还未见到使用结合包膜蛋白的抗体的亲和色谱来进行病毒载体纯化。肝素是一种比较价廉且与多种病毒类型相互作用的亲和配体，已经被用于慢病毒载体纯化，可回收最高53％的病毒载体，除去最高94％的蛋白杂质和56％的残留DNA。载体和肝素之间存在病毒颗粒表面的正电分子与带负电的肝素的相互作用，因而通常使用NaCl来从肝素柱上洗脱载体。盐浓度通常需要达到约0.5M才能洗脱出病毒载体。从而需要添加一个额外的清洁或纯化步骤来去掉盐分，例如额外添加TFF步骤。研究表明，肝素不与病毒包膜蛋白产生相互作用，因而可以结合多种病毒类型而不会导致收率上的损失。
在大规模的病毒载体纯化中，体积排阻色谱(SEC)可作为清洁步骤，可有效地除去剩余的杂质。SEC又称为凝胶过滤色谱，用于病毒载体纯化时，基于病毒颗粒的大体积与杂质小体积之间的差别。所有的杂质，都比孔径要小，因而能通过柱子，只有大体积的病毒颗粒会留下。SEC的缺点在于难以规模放大，加载量 仅为柱体积的10％。此外，SEC纯化需要线性低流速，操作时间较长。
在纯化步骤后，慢病毒载体要在-80℃冻存。据报道，室温下慢病毒载体的半衰期在1到2天之间，4℃下的半衰期为约8天(Higashikawa,F.et al.,(2001)Kinetic Analyses of Stability of Simple and Complex Retroviral Vectors.Virology 280:124–131)，-80℃下可保存1-2年(Valkama,A.J.et al.,(2020)Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.17:717–730)。冻存前需要更换成冻存液，蔗糖和氯化镁成分可降低功能病毒颗粒的损失，增加储存稳定性(Valkama,A.J.et al.,(2020)supra；Bandeira,V.et al.,(2012)Downstream Processing of Lentiviral Vectors:Releasing Bottlenecks.Hum.Gene Ther.Methods 23:255–263；Kumru,O.S.et al.,(2018)Physical Characterization and Stabilization of a Lentiviral Vector Against Adsorption and Freeze-Thaw.J.Pharm.Sci.107:2764–2774)。
在本申请中，具体涉及一种使用本申请的细胞株，包括PowerS TM-293T，来制备病毒载体颗粒的方法，包括：
i)培养细胞株；
ii)向细胞株导入病毒载体表达系统；
iii)在产生病毒载体颗粒的条件下培养细胞株；以及
vi)收集病毒载体颗粒。
步骤i)可以包括细胞株的悬浮培养。在一个实施方式中，细胞株在37℃、8％℃的条件下在无血清培养基中振荡培养。无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
步骤i)还可以包括细胞株的传代。
步骤ii)可以包括经物理或化学转染法向细胞株导入病毒表达系统。物理转染法可以包括电穿孔、显微注射和基因枪等。化学转染法可以包括磷酸钙共沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、和Lipofectamine(Invitrogen)介导的转染等。
病毒载体表达系统可以包含包装核酸载体和包膜核酸载体。病毒载体表达系统还可以包含辅助核酸载体。病毒载体表达系统还可以包含含有异源核酸的核酸载体，如含有异源核酸的转移核酸载体。这些核酸载体可以是质粒。
异源核酸的长度不大于4kb。异源核酸可以编码多肽或蛋白如嵌合抗原受体、或核酸如siRNA。在一个实施方式中，异源核酸可以编码嵌合抗原受体(CAR)，如靶向CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、或CD269(BCMA)的CAR。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向参与生长和分化信号的抗原，包括癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR、HER2)、酪氨酸激酶受体(EPHA2)等。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向参与肿瘤血管生成的抗原，包括血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)等。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向肿瘤支撑结构的肿瘤间质和细胞外基质抗原，包括纤维细胞激活蛋白(FAP)、tenascin蛋白等。含异源核酸的质粒可以包括pCDH和 pCMV等。
病毒载体可以是逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。逆转录病毒载体可以是慢病毒载体、α-逆转录病毒载体、γ-逆转录病毒载体、或泡沫逆转录病毒载体。在一个实施方式中，逆转录病毒载体为选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIN、EIAV和VISNA的慢病毒载体。在一个实施方式中，慢病毒载体可以为HIV-1载体。在另一个实施方案中，所述病毒载体可以为腺相关病毒载体，如AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAV10等。
逆转录病毒载体表达系统可以包含，含有逆转录病毒结构蛋白gag-pol基因的载体，和含有env基因或其功能性替代物的核酸载体。env基因或其功能性替代物可以编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白。逆转录病毒载体表达系统还可以包含，含有辅助基因rev或其类似基因的核酸载体。逆转录病毒载体表达系统还可以包含，含有异源核酸的核酸载体，例如含有异源核酸的转移核酸载体。
在一个实施方式中，方法用于制备慢病毒载体，包括向细胞株导入三个核酸载体，分别包含HIV-1 gag-pol-rev基因、编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白的核酸和异源核酸。
在一个实施方式中，方法用于制备慢病毒载体，包括向细胞株导入四个核酸载体，分别包含HIV-1 gag-pol基因、HIV-1rev基因、编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)或其衍生蛋白的核酸和异源核酸。含有异源核酸的核酸载体可以含有自灭活慢病毒长末端重复序列。
步骤iii)可以包括悬浮培养细胞株。细胞株可以在任何适合细胞株产生病毒载体的条件下培养，可以由本领域技术人员确定。在一个实施方式中，细胞株在37℃、8％℃的条件下在无血清培养基中振荡培养。无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
步骤iii)还可以包括细胞传代。
本申请对包含病毒载体表达系统的PowerS TM-293T宿主细胞进行了小试以及中试生产，如300ml的摇瓶培养，如在1L、2L、10L、50L以及200L的生物反应器(如WAVE反应器或玻璃反应器)中悬浮培养生产病毒载体。
该方法还可以在步骤vi)后包括对病毒载体进行滴度检测。
病毒载体的应用
病毒载体表达系统可以包含含有异源核酸的核酸载体，如含有异源核酸的转移载体质粒，用于编码治疗或研究用蛋白如嵌合抗原受体、或治疗或研究用核酸如siRNA。病毒载体的应用主要取决于其中异源核酸所编码的蛋白和核酸。
异源核酸可以编码一个治疗分子，如治疗肽、或治疗核酸如siRNA。“治疗分子”可以是可缓和或减轻由细胞或受试者中蛋白质缺少或缺陷产生的症状的肽或蛋白质。或者，异源核酸编码的“治疗”肽或蛋白是给予受试者好处的一种物质， 例如矫正遗传缺陷，矫正基因(表达或功能)缺陷，或提供抗癌效果。治疗核酸可包括例如siRNA、反义分子和miRNA。异源核酸可编码多个有用的产物。
异源核酸可以编码激素和生长因子和分化因子，包括且不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，转化生长因子β超家族的任一个，包括TGFβ、激动素、抑制剂，或骨形态形成性蛋白质(BMP)BMP1-15的任一个，神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、聚集蛋白、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、红藻氨酸、头蛋白、和酪氨酸羟化酶。
其他有用的异源核酸产物包括调节免疫系统的蛋白，包括且不限于细胞因子和淋巴因子，例如促血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1至IL-17、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子，flk-2/fFlt3配体，免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，例如CCR5之类的G蛋白偶联受体(GPCR)，类别I和类别IIMHC分子，以及工程化的免疫球蛋白和MHC分子。有用的异源核酸产物还包括调节蛋白，例如补体调节蛋白、膜辅蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
其他有用的异源核酸产物包括可矫正先天性代谢缺陷的那些基因产物，包括但不限于氨甲酰合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，凝血因子，例如因子V、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII或蛋白C，胱硫醚-β-合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调控子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
另外有用的异源核酸产物包括可提供缺陷、缺少或缺失功能或活性的那些，例如抗体、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素，低密度脂蛋白受体，脂蛋白脂酶，鸟氨酸氨甲酰转移酶，β-球蛋白，α-球蛋白，血影蛋白，α-抗胰蛋白酶，腺苷脱氨酶(ADA)，金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)， 硫酸胺酶，溶酶体贮积病涉及的酶(ARSA)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，β-25葡糖脑苷脂酶，鞘磷脂酶氨基己糖苷酶，溶酶体己糖胺酶，支链酮酸脱氢酶，激素，生长因子(例如，胰岛素样生长因子1和2，血小板衍生生长因子，表皮生长因子，神经生长因子，神经营养因子3和4，脑源性神经营养因子，胶质细胞源性生长因子，转化生长因子α和β等)，细胞因子(例如α干扰素，β干扰素，干扰素γ，白细胞介素2，白细胞介素4，白细胞介素12，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，淋巴毒素等)，自杀基因的产物(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶，白喉毒素，细胞色素P450，脱氧胞苷激酶，肿瘤坏死因子等)，耐药蛋白(例如，在癌症治疗中用于提供耐药性)，肿瘤抑制蛋白(例如p53，Rb，Wt-1，NF1，VonHippel-Lindau(VHL)，腺瘤性息肉(APC))，免疫调节肽，耐受性或免疫原性肽或蛋白质Tregitopes，或hCDR1，胰岛素，葡萄糖激酶，鸟苷酸环化酶((LCA-GUCY2D)，Rab护卫蛋白1，LCA5，鸟氨酸酮酸转氨酶，视网膜劈裂症1(X连锁视网膜劈裂症)，USH1C(Usher氏综合症1C)，X-连锁色素性视网膜炎GTP酶(XLRP)，MERTK(RP的AR形式：视网膜色素变性)，DFNB1(Connexin26耳聋)，ACHM2、3和4(色盲)，PKD-1或PKD-2(多囊肾)，TPP1，CLN2、溶酶体贮积病引起的基因缺陷(例如硫酸酯酶，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶，组织蛋白酶A，GM2-AP，NPC1，VPC2，鞘脂激活蛋白等)，用于基因组编辑的一个或多个锌指核酸酶，或用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
异源核酸还可编码肿瘤相关抗原(TAA)。非限制TAA实例包括：睾丸肿瘤相关特异性抗原(例如MAGE、BAGE和GAGE)、黑素细胞分化抗原(例如，酪氨酸酶、Melan-A/MART-1)、CDK4、MUM-1、β-连环蛋白、gp100/pmel17、TRP-1、TRP-2、MITF、MITF-A和MITF-M。另外的TAA的非限制实例包括黑素瘤GP75、膜联蛋白I、膜联蛋白II、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp),PGP9.5(Rode等，1985).Histopathology9:147)、结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、Ab2BR3E4、CI17-1A/GA733、Hsp70、Hsp90、Hsp96、Hsp105、Hsp110、HSPPC-96、应激蛋白gp96、gp96关联的细胞肽、G250、二肽基肽酶IV(DPPIV)、甲状腺球蛋白、STn、癌胚抗原(CEA)、癌胚抗原(CEA)肽CAP-1、癌胚抗原(CEA)肽CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSA抗原决定簇PSA-1、PSA-2、PSA-3、Ad5-PSA、甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-rP)、EGFR、PLU1、癌胚抗原-未成熟层粘连蛋白受体(OFA-iLR)、MN/CAIX(CA9)、HP59、细胞色素氧化酶1、sp100、msa、RanGTPase活化蛋白、Rab-GAP蛋白、PARIS-1、T细胞受体/CD3-ζ链、cTAGE-1、SCP-1、糖脂抗原-GM2、GD2或GD3、GM3、FucosylGM1、糖蛋白抗原-Tn、Sialyl-Tn、TF和Mucin-1、CA125(MUC-16)、MAGE家族抗原、GAGE-1,2、BAGE、RAGE、LAGE-1、GnT-V、MUM-1、EP-CAM/KSA、CDK4、MUC家族抗原、HER2/neu、ErbB-2/neu、p21ras、RCAS1,α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、NeuGcGM3、与Fos相关的抗原、亲环素B、RCAS1、 S2、L10a、L10a、端粒酶rt肽、cdc27、p120ctn、PRAME、GA733/EoCam、NY-BR-1、NY-BR-2、NY-BR-3、NY-BR-4、NY-BR-5、NY-BR-6、NY-BR-7、NY-ESO-1、L19H1、MAZ、PINCH、PRAME、Prp1p/Zer1p、WT1、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、PHF3、LAGE-1、SART3、SCP-1、SSX-1、SSX-2、SSX-4、TAG-72、TRAG-3、MBTAA、Smad肿瘤抗原、lmp-1、HPV-16E7、c-erbB-2、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)、XAGE-1的选择性拼接异构体、TGFbetaRII移框突变、BAX移框突变。
另外，异源核酸可编码基因产物，例如CAIX，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD44v7/8，CEA，EGF-RIII(表皮生长因子受体型突变体3)EGP-2，erb-B2，erb-B2、3、4，FBP，胎儿型乙酰胆碱受体，GD2，Her2/neu，IL-13R-a2，KDR，k轻链，LeY，L1细胞粘附分子，MAGE-A1，间皮素，MUC1，NKG2D，癌胚抗原(h5T4)，PSCA，前列腺特异膜抗原(PSMA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，前列腺上皮细胞衍生的Ets转录因子(PDEF)，靶向mAbIgE的TAA，TAG-72和VEGF-R2。
或者，异源核酸可包括例如siRNA、反义分子和miRNA。临床上有用的慢病毒载体还可表达针对人免疫缺陷病毒(HIV)的反义基因(Levine BL et al.,(2006)Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector.Proc Natl Acad Sci USA.103(46):17372-7)以及其他重要的人病原体。Naldini(Naldini L.(2011)Ex vivo gene transfer and correction for cell-based therapies.Nat.Rev.Genet.12:301–315)论述和援引了慢病毒及相关载体的这些和其他有用的应用。包含在慢病毒载体中的反义基因可抑制以下的表达：亨廷顿氏(HTT)基因，与齿状核红核苍白球路易体萎缩症相关的基因(例如atrophin 1、ATN1)；脊延髓肌萎缩症的X染色体的雄性激素受体，人Ataxin-1、-2、-3和-7，(CACNA1A)编码的依赖于Cav2.1P/Q电压的钙通道、TATA结合蛋白、还称为ATXN8OS的Ataxin8相反链、脊髓小脑性共济失调中丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55kDa调节亚基Bβ同工型(类型1、2、3、6、7、8、12、17)、脆性X综合症中的FMR1(脆性X智力缺陷1)、脆性X相关震颤/共济失调综合征中的FMR1(脆性X智力缺陷1)、FMR1(脆性X智力缺陷2)或脆性X智力缺陷中的AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的肌强直蛋白蛋白激酶(MT-PK)；弗里德希氏共济失调中的共济蛋白；肌萎缩性脊髓侧索硬化症的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变；帕金森症和/或阿尔茨海默病的发病机制中涉及的基因；阿朴脂蛋白B(APOB)和枯草杆菌蛋白酶前体蛋白转化酶/kexin类型9(PCSK9)、血胆脂醇过多；HIV感染中的HIVTat、转录基因的人免疫缺陷病毒反式激活因子；HIV感染中的HIVTAR、HIVTAR、人免疫缺陷病毒反式激活因子响应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、肝炎C病毒感染中的肝脏特异的microRNA(miR-122)；p53、急性肾损伤、或肾移植延迟移植功能、或肾损伤急性肾功能衰 竭；进展性或转移性实体瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2；LMP2也被称为蛋白酶体亚基β类型9(PSMB9)、转移性黑色素瘤；LMP7，也被称为蛋白酶体亚基β类型8(PSMB8)、转移性黑色素瘤；MECL1，也被称为蛋白酶体亚基β类型10(PSMB10)，转移性黑色素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的纺锤体驱动蛋白、慢性骨髓白血病中的凋亡抑制B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)，实体瘤中的核苷酸还原酶M2(RRM2)，实体瘤中的Furin；肝脏肿瘤中Polo样激酶1(PLK1)，丙型肝炎病毒感染中的二酰基甘油酰基转移1(DGAT1)，在家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2-肾上腺素受体，青光眼；在糖尿病性黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中的RTP801/Redd1，还称为DNA损伤诱导的转录因子4蛋白；在年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)，非动脉炎性缺血性视神经病变中的半胱天冬酶2；在先天性厚甲中的角蛋白6AN17K突变蛋白；流感中的甲型流感病毒A基因组/基因序列在流感感染；SARS感染中的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒感染基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉丝状病毒基因组/基因序列；B型和C型肝炎病毒感染中的B型和C型肝炎病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列，在柯萨奇B3病毒感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；在原发性肌张力障碍中的类扭转蛋白A(TOR1A)沉默致病等位基因(等位基因特异性沉默)，移植中的泛I类和HLA等位基因；常染色体显性遗传性视网膜色素变性(adRP)中的突变的视紫红质基因(RHO)；或结合到任何上述基因或序列的转录本的抑制核酸。
在一个实施方式中，异源核酸可以编码嵌合抗原受体(CAR)，如靶向CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、或CD269(BCMA)的CAR。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向参与生长和分化信号的抗原，包括癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR、HER2)、酪氨酸激酶受体(EPHA2)等。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向参与肿瘤血管生成的抗原，包括血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)等。在一个实施方式中，异源核酸编码的CAR可以靶向肿瘤支撑结构的肿瘤间质和细胞外基质抗原，包括纤维细胞激活蛋白(FAP)、tenascin蛋白等。含异源核酸的质粒可以包括pCDH和pCMV等。
宿主细胞系的筛选
选择一个合适的宿主细胞，可以大大提升病毒载体的产量。优选的细胞为，适用于无血清培养，和/或适应于悬浮培养的那些。如上所述，如果使用无血清培养基进行细胞培养和扩增，可以减少终产品中潜在的免疫原性物质污染和动物源组分，简化下游纯化工艺，而纯化工艺的简化，可提高病毒载体的收率和活性。此外，悬浮培养比起贴壁培养更适合病毒载体的大规模制备。
无血清培养
通常而言，动物细胞的生长均有赖于血清的存在。如不添加血清，绝大部分细胞不能增殖。血清培养基中通常添加的是牛血清。
血清成分复杂，既有协助物质运输的蛋白、营养物质，还有促进细胞生长的激素和因子等，正因为血清这种天然成分的复杂性，使得血清在细胞培养过程中发挥了多种功能，包括提供维持细胞生长的激素，促进所培养细胞的生长；弥补基础培养基中没有或含量很少的营养物质；提供结合蛋白，促进细胞识别和利用维生素、脂类和其他激素等；某些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用；促进细胞贴壁，提供可促进细胞铺展在塑料培养基质的因子；起酸碱度缓冲液作用；以及提供蛋白酶抑制剂，使细胞消化时残留的胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。然而，牛血清的使用存在污染外源病毒和致病因子的风险，而且由于不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，制品中残留的牛血清也易引起病毒载体接受者对血清的过敏反应。
无血清培养基，简称为SFM，就是不添加血清的细胞培养基。其是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长和繁殖。SFM由于组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用，也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。
目前的无血清培养基有两类，一类不含任何动物来源的添加组分，另一类则是不含任何不明确的添加组分。目前应用较多的有以下四种。
第一种是一般意义上的无血清培养基，用各类可代替血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质后的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高，但添加物质的化学成分不明确，含有大量的动物来源蛋白。
第二种是无动物来源培养基。许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。
第三种是无动物蛋白培养基。培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。
第四种是化学组分限定的培养基。此类培养基是目前最安全、也是最理想的培养基，可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组分。其特点是培养基的性质确定，配起培养基来也比较方便。
无血清培养基的优点包括可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；避免血清组分对 实验研究的影响；有利于体外培养细胞的分化；可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化；组分稳定，可大量生产；不含有丝分裂原抑制剂，可以促进细胞增殖等。而这类培养基的缺点是，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便；成本较高；针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养；处于发育的不同分化阶段的细胞需要不同的配方，对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白所提供的保护作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。
无血清培养基由营养完全的基础培养基添加激素、生长因子、贴壁因子和结合蛋白而成。
早期用于细胞培养的基础培养基有血浆凝块、淋巴液、大豆蛋白胨和胚胎浸膏等天然培养基。1950年Morgan等在前人的研究基础上研究出199培养基，是动物细胞培养基发展到一个崭新的阶段，及合成培养基阶段。合成培养基是按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组合成的基础培养基。目前市场上已经有上百种的合成培养基商品。在众多的合成培养基中，MEM、DMEM、RPMI 1640、F12、和TC100的使用最为广泛。基础培养基的成分是完全已知的，因此在对不同的细胞株进行培养时可以对基础培养基的某些组分进行相应的调整，以更好的符合细胞株的营养要求或提高目的蛋白的表达量。
无血清培养基中的添加因子，又称补充因子，是代替血清各种因子的总称。多数无血清培养液必须补加3至8种因子，任何单一因子都不能取代血清。已知有100多种此类因子，其中有些是必须补充因子，如胰岛素、亚硒酸钠和转铁蛋白，其他多数为辅助作用的因子。按照功能的不同，补充因子可分为四类。
第一类补充因子为激素和生长因子。很多细胞用无血清培养时需要加入激素，如胰岛素、生长激素、胰高糖素等。几乎所有的细胞系都需要胰岛素，其是一种多肽，能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，是重要的细胞存活因子。细胞无血清培养中，胰岛素的使用浓度为0.1-10μg/ml。Jan等认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。此外甲状腺素等和甾体类激素中的孕酮、氢化可的松、雌二醇等也是无血清细胞培养是常用的补充因子。不同细胞株对激素的种类和数量要求有所不同。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。按化学性质可分为多肽类生长因子和甾类生长因子。无血清培养基中添加的生长因子主要是多肽类生长因子，近些年已鉴定的多肽类生长因子已有20-30种，其中半数以上都可以通过基因重组的手段获得相应的重组生长因子。无血清培养基较常见的生长因子有表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和神经生长因子(NGF)等。生长因子是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞群体倍增时间。
第二种补充因子为结合蛋白。结合蛋白有两种，一种是转铁蛋白，另一种是 白蛋白。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白与铁离子的复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。不同细胞对转铁蛋白的需要量也不同。白蛋白也是无血清培养基中常用的添加因子。它通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中活性的作用，此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用。
第三种补充因子为贴壁因子。绝大多数的真核细胞在体外生长时需要固着在适宜的基底上。细胞固着作用是一个复杂的过程，包括贴壁因子吸附于器皿或载体的表面。细胞与贴壁因子的结合等。无血清培养中常用的贴壁因子有细胞间质和血清中的成分，如纤粘连蛋白、胶原、昆布氨酸和多聚赖氨酸等。在例如本申请的悬浮培养中，培养基不需要添加贴壁因子。
一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低分子量的化学物质，如微量元素、维生素、脂类等，维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢，维生素C和维生素E具有抗氧化作用。丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质。
目前在大规模动物细胞的培养中已经普遍适用于无血清培养基。在疫苗生长、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养，降低生产成本。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。在无血清培养条件下，某些细胞的生长量和抗体的产量甚至较有血清时高出数倍。
除生产生物制品外，无血清培养基也被广泛应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学领域。例如，无血清培养基可用于研究细胞的分化条件。无血清培养基其组成可以是完全确知的化学物质，因而可根据研究的需要增减具有重要生物活性物质的种类和数量。这就为研究细胞分化的条件提供了有效的手段。又比如无血清培养基可用于从多种细胞混杂的培养中选择目的细胞。通过对无血清培养中的某些成分的取舍，可抑制原代组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的。无血清培养还用于肿瘤病理学和病因学的研究。如用于研究致癌因子对细胞的影响，研究肿瘤细胞对可能触发正常细胞终末分化的外周信号的反应能力，或用于研究正常细胞与肿瘤细胞的生长和移行与基底膜信号的关系等。此外，无血清培养还可以用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究。
可商购的无血清细胞生长培养基包括，FreeStyle TM 293(Gibco TM，Life Technologies)、DMEM/F12(Gibco TM，Life Technologies)、SFM4Transfx-293(HyClone TM，ThermoScientific)、CDM4HEK293(HyClone TM，ThermoScientific)、StemPro-34SFM(Gibco TM，Life Technologies)、FreeStyle F17(Gibco TM，Life Technologies)、293SFMII(Gibco TM，LifeTechnologies)、CD293(Gibco TM， LifeTechnologies)、LV-MAX(A35834-01，Gibco TM)、Expi293(Gibco TM，A14351-01)、 (Sigma，14571C-1000mL)、BanlanCD HEK293(Irvine，91165)、Pro293s-CDM(Lonza，12-765Q)、OPM-293 CD03(奥浦迈，81070-001)、Celkey CD HEK293(健顺，10804-19008)培养基。
悬浮培养
悬浮培养指的是使细胞分散悬浮于培养基内，进行单细胞及小细胞团组织的培养，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积即可。培养基深度超过一定值时，需要通过振荡或转动装置摇动培养基。当培养基深度更深时，还需要通入二氧化碳和氧气，以保证足够的气体交换。
悬浮培养技术按细胞贴壁性分为悬浮细胞培养工艺和贴壁细胞微载体悬浮培养工艺。悬浮细胞(CHO细胞、BHK21l细胞等)可以在反应器中直接生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低；而贴壁细胞在反应器中悬浮培养需要借助微载体，细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高。虽然相对于悬浮培养，微载体培养工艺复杂，但与转瓶培养相比仍有很大优势，能提高生产规模、产品质量和劳动效率，因此是贴壁细胞悬浮培养的主要手段。
细胞悬浮培养工艺按照培养方式分为批培养、流加培养及灌注培养。批培养能直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢废产物较多，抑制细胞生长，细胞生长密度不高；流加培养操作简单、产率高、容易放大，应用广泛，但需要进行流加培养基的设计；灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性，但操作比较繁杂、细胞培养基利用效率低、旋转过滤器容易堵塞等。针对不同的病毒载体，采用的细胞培养方式不同。例如，对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，宜采用灌注培养，且灌注培养也更适宜于微载体培养。
选定合适的生产工艺后，过程控制成为关键。为确保细胞生长在最优环境中，需要利用反应器的在线监控功能控制各种运行参数。细胞对温度较敏感，需要采用合适的加热或冷却方式控制培养温度在35℃～37℃，避免细胞受到损伤。动物细胞生长适宜的pH范围一般在6.8～7.3之间，低于6.8或高于7.3都可能会对细胞生长产生不利的影响。
细胞培养规模能否放大是选择反应器的一个重要前提，悬浮培养规模的放大主要通过增加反应器体积或者增加反应器数量，增大反应器体积可以节省大量的配套工程及人员成本，而多台小的反应器虽然操作灵活，但成本相对高。在国外生物制品生产中采用的多是较大规模的、能够逐级放大的生物反应器。选择和配置生物反应器还需考虑和满足生产工艺和产能需求。反应器接口的标准化、配件提供速度及售后服务质量等，均应作为工业化选用生物反应器考虑的因素，以免 造成生产的延误。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25天时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
细胞株的筛选
细胞筛选驯化的实质是应用现代细胞生物学技术，在适应不同培养模式(如悬浮)、不同培养基(如无血清培养基)、降低细胞凋亡率、提高细胞活力、延长细胞生命周期、提高产物浓度等方面进行研究，筛选适用于生产的细胞株。为实现驯化的稳定，通常由高密度细胞培养转向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养。因细胞损伤后难以修复，所以驯化时细胞活力应保持在90％以上。细胞的增殖能力直接影响产能，驯化时应保持对其增殖能力的测定。细胞驯化时还应对其表达分泌能力进行测定，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。驯化后细胞的增殖能力、活力及生产能力要能够满足工业大规模生产的需要。由于特定细胞的营养需求不同，实现其驯化的难易程度也不同，在驯化时需要选用合适的细胞培养基，有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其悬浮或是无血清生长的特性。
此外，在悬浮培养中，细胞容易结块。细胞结团会导致许多用于载体生产的质粒无法转染细胞，而且在大团块中间的细胞会因为缺乏营养而死亡。目前，改善细胞结团的方法主要通过添加抗结团剂。而添加抗结团剂会显著降低转染效率，导致细胞不能转染包装慢病毒。
领域内亟需一种高效便捷地驯化/筛选分散性高、增殖密度大、且高产病毒载体的细胞株的方法。
在本申请中，发明人主要针对目前在慢病毒制备中使用最多的HEK293T细胞改进了其驯化/筛选方法。
首先，发明人没有采用领域内常用的由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度的培养步骤，而是将在普通培养基培养的贴壁细胞直接加入无血清培养基中进行悬浮培养，大大节约了时间，对成功筛选出分散性高(即不易结团)、增殖密度大且高产病毒载体的细胞株可能也有一定的帮助。
此外，本申请的发明人还发现，使用几种特定的无血清悬浮培养基，例如LV-MAX生产培养基(Gibco，A35834-01)、Expi293表达培养基(Gibco，A14351-01)和OPM-293 CD03培养基(奥浦迈，81070-001)，更有利于筛选出分散性好、即不结团的细胞株。具体而言，由这三种培养基筛选出的细胞能够达到较高密度(～1E7细胞/ml)并且结团细胞比例相对较低，有利于筛选到不结团的亚克隆。
本申请筛选的主要是常用于慢病毒载体制备的HEK293T细胞，其增殖快、转染效率高、且能高效制备病毒载体，具有大规模制备病毒载体的潜力。
具体地，本申请中，提供了一种筛选或驯化适应于无血清悬浮培养的HEK293T细胞株的方法，包括：
i)取在有血清培养基中贴壁培养的HEK293T细胞，置于无血清培养基中悬浮培养，以及
ii)挑选适应无血清悬浮培养的单克隆细胞株。
步骤i)中的有血清培养基可以含有10％血清，例如10％胎牛血清。
步骤i)中的悬浮培养可以包括在37℃、8％CO 2的条件下振荡培养。
步骤i)的悬浮培养可以包括细胞传代。
无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基(Gibco，A35834-01)、Expi293表达培养基(Gibco，A14351-01)、FreeStyle TM293表达培养基(Gibco，12338-018)、CD293 AGT培养基(Gibco，11913-019)、 无血清培养基(Sigma，14571C-1000mL)、BanlanCD HEK293培养基(Irvine，91165)、Pro293s-CDM无血清培养基(Lonza，12-765Q)、OPM-293 CD03培养基(奥浦迈，81070-001)和Celkey CD HEK293培养基(健顺，10804-19008)，优选为LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
步骤ii)可以包括挑选适应无血清悬浮培养且分散性好(即，不结团)的单克隆细胞株。
步骤ii)可以包括，在半固体培养基中培养细胞，从半固体培养基中挑选单细胞，和悬浮培养所挑选的细胞。
步骤ii)中悬浮培养所挑选的细胞可以包括在37℃、8％CO 2的条件下振荡培养。步骤ii)中悬浮培养所挑选的细胞可以包括细胞传代。
半固体培养基可以是添加有筛选培养基的甲基纤维素类培养基。
在该方法的实施过程中，无需添加抗结团剂。
在本申请的方法中，1)将在含血清培养基中贴壁培养的细胞直接进行无血清培养，而无血清递减的步骤，可以缩短筛选过程；2)用无血清培养基培养细胞，避免潜在的免疫原性物质污染和动物源组分，简化下游纯化工艺；3)采用选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基的无血清培养基，更利于筛选出适于悬浮培养的，即增殖密度高且分散性好的，HEK293T细胞株；4)避免使用抗结团剂，不影响细胞的转染效率；以及5)半固体培养基的使用，方便筛选出符合条件的单克隆。
半固体培养
此外，本申请的发明人在上述筛选方法中使用了半固体培养法进行单克隆细胞筛选，而非有限稀释法。
有限稀释是实验室常规使用的细胞克隆法。但是，有限稀释法有可能在一个孔内加入多个细胞，因此需要多次亚克隆来提高单克隆的概率。另外，在实验中发现采用有限稀释法筛选亚克隆，孔板中的单细胞无法正常增殖，这可能与细胞 本身特性相关。而半固体培养基是一种更快更简单的克隆方法，单个的细胞固定在半固体培养基中，生长成离散的单克隆细胞群，有利于追踪细胞的生长。并且当单克隆细胞扩增到一定数量后再转接到孔板中可以改善单个细胞无法正常增殖的问题。另外，采用半固体培养基可以在同一个孔内种植多个细胞，能够降低操作人员工作量，并且相较于有限稀释法能够减少培养孔板数量，节约试剂、耗材以及培养箱空间。
半固体培养基在领域内多用于杂交瘤和CHO细胞的培养，使得细胞克隆能够更有效率地进行。在病毒载体包装/生产细胞的筛选中应用半固体培养，还未见报道。
本申请的宿主细胞株
由ECACC购买的HEK293T细胞出发，通过本申请的细胞株筛选/驯化方法，得到了多种增殖密度高、分散性高的细胞株。
其中一株命名为PowerS TM-293T，于2020年12月7日根据布达佩斯条约保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.:21110。
PowerS TM-293T细胞株可以在无血清培养基中悬浮培养生长。所述无血清培养基可以选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
PowerS TM-293T细胞株可以在悬浮培养过程中不出现细胞团。
PowerS TM-293T细胞株可以用于生产病毒载体。
PowerS TM-293T细胞株可以在无血清培养基中悬浮培养生长，增殖密度高、活力良好，且不出现细胞团，即分散性高。因而，在其悬浮培养过程不需要额外添加抗结团剂。
PowerS TM-293T细胞在OPM-293 CD03培养基中倍增时间短，约22小时，细胞对数期密度能达到5-7×10 6细胞/ml，最高密度能到达1.48×10 7细胞/ml。
与Gibco的CTS TM病毒生产细胞(公开号：MAN0018590)相比，PowerS TM-293T的细胞倍增时间较短，转染病毒质粒后产出更多病毒载体颗粒。
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1.HEK293T细胞的无血清悬浮驯化
将ECACC购买的HEK293T细胞在37℃水浴中孵育小于1分钟，快速融化冻存管中的细胞，直到冻存管中没有冰块。
将细胞从冻存管转移到无菌离心管中，加入4-5ml预热的DMEM(含10％FBS)，200g离心5分钟。
丢弃培养瓶中的上清液，并将细胞沉淀重悬于10ml DMEM(含10％FBS) 中。将重悬的细胞加入T75培养瓶中，并将T75培养瓶置于37℃、5％CO 2培养箱中。
将细胞孵育三天，细胞融合度>90％时，丢弃培养瓶中的细胞培养基。此处的细胞融合度是指对于单层生长的细胞而言，由显微镜观察到的被该单层细胞覆盖的培养器皿表面积的百分比。用5ml DPBS冲洗粘附层一次。用0.25％胰蛋白酶(Gibco，12563-029)孵育细胞2分钟，细胞脱离后，将4-5ml含10％FBS的DMEM加入T75培养瓶培养中。
将细胞转移到无菌离心管中，200g离心5分钟。
吸出上清液，将细胞沉淀重悬于10ml DMEM(含10％FBS)中，将重悬的细胞添加到T75培养瓶中，并将T75培养瓶置于37℃、5％CO 2培养箱中。
在细胞完全适应贴壁生长且融合度90％时进行传代。
细胞用0.25％胰蛋白酶消化，然后在200g离心5分钟。吸出上清液，向细胞沉淀添加新鲜的无血清培养基(SFM)以重悬细胞。无血清培养基共9种，包括LV-MAX生产培养基(Gibco，A35834-01)、Expi293表达培养基(Gibco，A14351-01)、FreeStyle TM293表达培养基(Gibco，12338-018)、CD293 AGT培养基(Gibco，11913-019)、 无血清培养基(Sigma，14571C-1000mL)、BanlanCD HEK293培养基(Irvine，91165)、Pro293s-CDM无血清培养基(Lonza，12-765Q)、OPM-293 CD03培养基(奥浦迈，81070-001)、Celkey CD HEK293培养基(健顺，10804-19008)。将无血清培养基中的细胞转移到125ml的摇瓶中，然后放置在37℃、8％CO 2的培养箱中，在震荡直径19mm、转速125rpm的摇床上进行培养。
当细胞密度达到3-6×10 6细胞/ml时，进行传代，接种细胞的密度为0.35-0.55×10 6细胞/ml，并孵育3-4天，直到存活率超过95％，其中存活率通过VI-CELL细胞计数仪(BECKMAN)确定。
将在9种无血清培养基培养起来的细胞液放入细胞培养板中，使用显微镜拍照以观察集落形态，如图1所示。
其中，在LV-MAX生产培养基(Gibco，A35834-01)、Expi293表达培养基(Gibco，A14351-01)、和OPM-293 CD03培养基(奥浦迈，81070-001)培养基中驯化的细胞密度更高、分散性较好。取在这三种培养基中驯化的细胞进行生长曲线的测定。具体而言，以0.4±0.5×10 6细胞/ml的细胞密度将细胞接种到细胞培养瓶中，记为D0，汲取600微升细胞悬液进行细胞计数，之后悬浮培养8天且每天取600微升细胞悬液进行细胞计数，绘制细胞生长曲线，并显示在图2中。由图2显示，在上述三种培养基中的细胞生长密度和存活率趋势一致，细胞最高密度均大于1×10 7细胞/ml，细胞存活率大于90％。
通过传代选择可以达到更高密度的细胞，最终选择在上述三种培养基中悬浮密度最高为1.2×10 7细胞/ml的细胞系。将细胞冻存至最终密度为1×10 7活细胞/ml， 作为筛选到的无血清悬浮培养的细胞系。此时的细胞会存在10-20个细胞聚集的情况。
实施例2.无血清悬浮驯化HEK293T的性能优化
为进一步解决无血清悬浮驯化HEK293T细胞结团的问题，将适应LV-MAX生产培养基、Expi293和OPM-293 CD03培养基的细胞使用半固体基质胶进行克隆筛选，具体步骤如下。
使用上述三种无血清培养基分别对应地稀释实施例1得到的无血清悬浮驯化细胞，制备密度为5×10 3细胞/mL的细胞悬液。
向每个分装好的含1mL半固体基质胶(Stemcell，03816)的2.0mL冻存管中，加入各细胞悬液100、200、300、或400μL，形成细胞浓度梯度，即每个细胞做4个细胞梯度，每孔的细胞总量分别为500、1000、1500、2000个细胞。盖好盖子，震荡1-2min。培养基呈不透明状。将培养基静置2-5min，使培养基集中于管底，并且使气泡上升到液面。
使用5mL的一次性注射器进行接种。具体地，在6孔板的各培养孔中加入1～1.5mL上述半固体细胞悬液，各密度重复三次。轻轻倾斜和旋转培养板，以确保培养基均匀分布于培养孔底部。
将盖上盖子的6孔板置于一个同样盖上盖子的大培养皿中，该培养皿中还放置一个盛有无菌水且不盖盖子的100mm培养皿。或者，在将6孔板盖上前，在培养板各孔之间的槽内加入一半高度的无菌水或者PBS。根据细胞系的倍增时间检查培养物中的集落情况。集落肉眼可见，直径一般为0.5-1.0mm。统计各接种密度下生长出的集落数目。对培养板拍照以保留集落形态。
7天后，准备24孔板，在各孔板中分别加入对应的无血清培养基，每孔1mL。使用10μL枪头吸取5μL对应细胞适应的无血清培养基，轻轻吸取6孔板培养物中的较大克隆，将细胞吹至24孔板上，显微镜下观察是否为单个细胞。将24孔板放置于37℃、8％CO 2的培养箱中，在转速为125rpm、震荡直径19mm的摇床上培养。
每3天进行一次补液，根据细胞量将细胞扩增至6孔板，每孔2mL培养基，并放置于37℃、8％CO 2的培养箱中，在震荡直径19mm、转速125rpm的摇床上培养。
根据细胞量将细胞扩增至125mL摇瓶，进行3次传代，取细胞悬液于显微镜下观察，细胞形态如图3所示。从图3可以看出，可以通过克隆筛选出不结团的细胞株。将不结团的细胞进行冻存。
得自OPM-293 CD03驯化的一株细胞，命名为PowerS TM-293T，其细胞形态如图4A所示，8天的生长曲线和生长活力图如图4B所示。该细胞株不结团，细胞倍增时间短，约22小时，细胞对数期密度能达到5-7×10 6细胞/ml，最高密度能到达1.48×10 7细胞/ml。
相比而言，Gibco的细胞CTS TM病毒生产细胞(公开号：MAN0018590)倍增时间为约26小时。
实施例3.使用无血清悬浮驯化HEK293T细胞PowerS TM-293T制备病毒载体
按照0.55×10 6细胞/ml，使用OPM-293 CD03，将实施例2得到的细胞PowerS TM-293T接种于125ml摇瓶，在37℃、8％℃的培养箱中，震荡直径19mm、转速125rpm的摇床上悬浮培养三天。
从悬浮细胞培养摇瓶中取细胞悬液，计数，当细胞密度达到5.5×10 6细胞/ml以上，细胞活力大于95％时进行转染。
以30ml转染体系为例，先调整转染细胞密度，取细胞培养液(转染体积(30ml)×转染细胞密度(5×10 6细胞/ml)/实际活细胞密度(转染当天细胞的实际计数活细胞密度))于27ml OPM-293 CD03培养基中。将细胞培养瓶放入37℃、8％℃的培养箱中，震荡直径19mm、转速125rpm的摇床上进行悬浮培养。转染之前将细胞密度调至5.5×10 6细胞/ml，放入培养箱中备用。
与此同时，制备转染复合物。
具体地，OPM-293 CD03培养基和PEIpro转染试剂在使用前轻晃4-5次。将TE缓冲液中56.25微克的质粒加入到含已37℃预热的1.5ml OPM-293 CD03培养基中，转移质粒：pMDLg.pRREKan(gag-pol，8847bp)：pRSV-Rev-Amp(rev，5779bp)：pMD2.gKan(vsvg，4137bp)＝4：2：2：1，轻轻吹打混匀4-5次，标记为管1-DNA。其中，转移质粒共三种，分别为大小7545bp、9517bp、和9505bp的含异源基因的pCDH载体。在1.5ml已37℃预热的OPM-293 CD03培养基中加入112.5ml PEIpro转染试剂(Polyplus Transfection，PT-115-100)，轻轻吹打混匀4-5次，标记为管2-PEIpro。将管2中的转染缓冲液移入管1，用枪反复吹打8-10次以上，尽量立即用涡旋仪涡旋10秒，室温静置15分钟。
将得到的转染复合物慢慢加入到待转染的细胞液中，在加入的同时轻轻摇动摇瓶，操作完成后将接细胞培养瓶放入培养箱中进行悬浮培养。转染24小时后添加终浓度为5毫摩尔的丁酸钠。48小时后收获病毒，使用FACS检测病毒滴度。
Gibco的细胞CTS TM病毒生产细胞(Pub.No.MAN0018590)用作阳性对照，除转染试剂外，其他操作都与PowerS TM-293T的一致。具体地，Gibco转染使用LV-MAX转染试剂盒(ThermoFisher，A35348)。
转染测试的结果如表1所示。PowerS TM-293T细胞的病毒产量均高于Gibco细胞的病毒产量，且测试后的病毒滴度均大于1×10 7TU/mL。
表1.PowerS TM-293T细胞与Gibco细胞系在不同穿梭质粒上的转染测试
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

Claims (22)

  1. 一株新型人胚肾HEK293T细胞，由中国普通微生物保藏管理中心保藏，保藏号为CGMCC NO.:21100。
  2. 一种筛选适应无血清悬浮培养的HEK293T细胞株的方法，包括：
    i)取在有血清培养基中贴壁培养的HEK293T细胞，置于无血清培养基中悬浮培养，以及
    ii)挑选适应无血清悬浮培养的单克隆细胞株。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤i)中的有血清培养基含有10％血清。
  4. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤i)中的悬浮培养包括在37℃、8％CO 2的条件下振荡培养。
  5. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤i)的悬浮培养包括细胞传代。
  6. 根据权利要求2所述的方法，其中步骤ii)包括挑选适应无血清悬浮培养且不结团的单克隆细胞株。
  7. 根据权利要求2或6所述的方法，其中步骤ii)包括，在半固体培养基中培养细胞，从半固体培养基中挑选单细胞，和悬浮培养所挑选的细胞。
  8. 根据权利要求7所述的方法，其中步骤ii)中悬浮培养所挑选的细胞包括在37℃、8％CO 2的条件下振荡培养。
  9. 根据权利要求7所述的方法，其中步骤ii)中悬浮培养所挑选的细胞包括细胞传代。
  10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述半固体培养基是添加有筛选培养基的甲基纤维素类培养基。
  11. 根据权利要求2所述的方法，其中所述无血清培养基选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基。
  12. 根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中实施所述方法而无需添加抗结团剂。
  13. 一种由权利要求2-12中任一项所述的方法筛选出的细胞株。
  14. 根据权利要求13所述的细胞株，其在液体培养基中不结团。
  15. 选自LV-MAX生产培养基、Expi293表达培养基和OPM-293 CD03培养基的培养基在筛选适应悬浮培养且不结团的HEK293T细胞株中的用途。
  16. 一种使用权利要求1、13和14中任一项所述的细胞株来制备病毒载体的方法，包括：
    i)悬浮培养所述细胞株；
    ii)向细胞株导入病毒载体表达系统；
    iii)在产生病毒载体的条件下培养细胞株；以及
    vi)收集病毒载体。
  17. 根据权利要求16所述的方法，其中在步骤vi)后进一步包括步骤v)对病毒载体进行滴度检测。
  18. 根据权利要求16所述的方法，其中病毒载体表达系统包含包装核酸载体和包膜核酸载体。
  19. 根据权利要求16所述的方法，其中病毒载体表达系统还可以包含辅助核酸载体、和/或含有异源核酸的核酸载体。
  20. 根据权利要求19所述的方法，其中异源核酸的长度不大于4kb。
  21. 根据权利要求16所述的方法，其中病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
  22. 根据权利要求21所述的方法，其中逆转录病毒载体是慢病毒载体。
CN202180088455.1A 2020-12-29 2021-12-28 高分散性的hek293t细胞株及其筛选方法 Pending CN116635088A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011592436 2020-12-29
CN2020115924366 2020-12-29
PCT/CN2021/141958 WO2022143623A1 (zh) 2020-12-29 2021-12-28 高分散性的hek293t细胞株及其筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116635088A true CN116635088A (zh) 2023-08-22

Family

ID=82260222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180088455.1A Pending CN116635088A (zh) 2020-12-29 2021-12-28 高分散性的hek293t细胞株及其筛选方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240101964A1 (zh)
EP (1) EP4273236A1 (zh)
JP (1) JP2024504914A (zh)
KR (1) KR20230126214A (zh)
CN (1) CN116635088A (zh)
WO (1) WO2022143623A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118660958A (zh) * 2021-10-12 2024-09-17 江苏金斯瑞蓬勃生物科技有限公司 适应无血清悬浮培养的hek293细胞株及其应用
CN117247972B (zh) * 2023-11-20 2024-02-13 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2782997T (pt) * 2011-11-24 2018-04-09 Genethon Sistema de produção de vetor lentiviral escalável compatível com aplicações farmacêuticas industriais
CN102604889B (zh) * 2012-03-19 2013-05-08 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 适应无血清培养的hek293细胞系及其应用
WO2014145578A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Scalable manufacturing process to produce recombinant lentiviral vectors in serum-free suspension cell culture system
CN104450607B (zh) * 2014-11-14 2017-07-11 武汉金开瑞生物工程有限公司 用于hek293细胞悬浮生长的全化学成分培养基及培养方法
JP7374119B2 (ja) * 2018-04-05 2023-11-06 ジェネトン 減少した肝臓向性を有するＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４とのハイブリッド組換えアデノ随伴ウイルス血清型

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022143623A1 (zh) 2022-07-07
JP2024504914A (ja) 2024-02-02
KR20230126214A (ko) 2023-08-29
EP4273236A1 (en) 2023-11-08
US20240101964A1 (en) 2024-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10994028B2 (en) Scalable manufacturing process to produce recombinant lentiviral vectors in serum-free suspension cell culture system
US20220235371A1 (en) Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
Manceur et al. Scalable lentiviral vector production using stable HEK293SF producer cell lines
Ferreira et al. Progress and perspectives in the development of lentiviral vector producer cells
WO2022143623A1 (zh) 高分散性的hek293t细胞株及其筛选方法
EP3778880A1 (en) Method for large-scale production of lentivirus by using gmp-level serum-free suspension cells
WO2023061409A1 (zh) 适应无血清悬浮培养的hek293细胞株及其应用
KR20230017799A (ko) 세포 및 유전자 요법을 위한 안정한 바이러스 벡터 생산자 세포를 생산하기 위한 조성물 및 방법
Carrondo et al. Integrated strategy for the production of therapeutic retroviral vectors
US20230212590A1 (en) Nucleic acid constructs for protein manufacture
US20220056476A1 (en) Vectors for protein manufacture
AU2012352394B2 (en) Large commercial scale lentiviral vector production system and vectors produced thereby
JP3517399B2 (ja) レトロウイルスベクターのための浮遊パッケージング細胞株
Wu et al. Propagation kinetics of retrovirus transgene vector and replication-competent retrovirus in static and microcarrier cell culture systems using different medium exchange strategies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination