KR20230112903A - 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Morus alba　Linn) 추출물을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 패장초, 의이인 및 상백피 추출물은 암 세포의 세포활성(cell viability)을 억제하고, 세포 주기(cell cycle)에 영향을 미치며 세포자멸(apoptosis)을 유도함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 효과적인 제제로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는 항암용 조성물{Anticancer composition comprising extracts of Patriniae radix, Coicis semen and Morus alba　Linn}
본 발명은 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Morus alba　Linn) 추출물을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
세포의 증식과 분화 및 생존을 조절할 수 있는 정상 세포와 달리, 암은 기본적인 세포 조절 기전의 장애로 무제한 증식하고, 주위의 정상 조직 또는 기관으로 전이하여 개체의 생명을 빼앗아갈 수 있다.
기존의 암 치료법에는 외과적 수술, 방사선요법 및 항암화학요법 등이 있으며, 최근에는 종양을 면역조절방법으로 치료하려는 면역치료요법 등의 바이오치료법이 적용되고 있다. 하지만 기존의 치료방법들이 외과적 수술로 암을 제거하고 방사선요법과 항암제 투여에 의해 암 성장을 일시적으로 억제할 수는 있지만, 치료 후 잔여 암세포로부터 생기는 침윤(invasion)과 전이과정으로 예측할 수 없는 조직에 새로운 악성종양이 생기고, 결국 이러한 고형암은 항암제에 대한 내성이 매우 증가하게 된다. 따라서 최근 암세포의 성장을 효과적으로 억제시키고자 하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다.
암세포에서 세포사멸의 선택적 유도는 암 치료를 위한 이상적인 접근법으로 간주하여 이 메커니즘을 갖는 항암제들이 개발되고 있으나, 치료에 따른 내성, 부작용과 더불어 상당한 경제적 부담감이 있는 단점이 있다.
따라서 항암제의 부작용을 경감시키고 효과적으로 암을 치료할 수 있는 새로운 약제를 개발하기 위하여 천연 자원을 이용한 항암제 개발은 오랜 기간 사용되어 오던 생약이나 식품을 대상으로 하므로 낮은 독성, 높은 안정성 및 높은 치료효과가 확립되어 있는 장점이 있다.
천연물을 중심으로 하는 항암제의 개발은 전통적으로 오랜 기간 민간요법 등으로 사용되어 오던 식물 등의 추출물들을 현대 세포생물학적 연구의 발달로 확립된 암 유전자, 암 억제 유전자, 시그날 전달인자, 약제 내성 감수성 인자 및 세포사멸과 관련된 인자 등 암 분자표적을 중심으로 스크리닝하여 활성물질을 분리, 정제하고 그 활성물질의 구조를 결정하는 항암제의 개발이라 할 수 있다.
1. Yu, H., D. Pardoll, and R. Jove, STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3. 2009. 9(11): p. 798-809.
본 발명의 목적은 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 항암용 건강기능성 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 항암용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Mori radicis cortex) 추출물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.
상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 70 내지 100%(v/v)의 에탄올일 수 있다.
상기 암은 직결장암 또는 유방암일 수 있다.
또한, 본 발명은 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 항암용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 항암용 사료 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 패장초, 의이인 및 상백피 추출물은 암 세포의 세포활성(cell viability)을 억제하고, 세포 주기(cell cycle)에 영향을 미치며 세포자멸(apoptosis)을 유도함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 효과적인 제제로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 PSY-E 및 PSY-W 처리에 따른 직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480의 세포 생존 및 최소저해농도(IC50)를 나타낸 것이다. A: MTT분석 세포생존율, B: IC50값.
도 2는 PSY-E 처리에 따른 직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480의 세포 자멸을 나타낸 것이다. a: Annexin V /PI 프로토콜 및 염색 결과, b: Annexin V 염색 세포수 비율, c: TUNEL 분석 공초점 현미경 이미지, d: TUNEL 양성 세포수 비율, e: 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3은 PSY-E 처리에 따른 직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480의 세포주기 변화를 나타낸 것이다. a: 유세포 분석 그래프에 의한 세포 주기 분포 결과, b: 세포 주기별 세포 정량화 결과, c: 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, d: 단백질 발현에 대한 농도계 정량 결과이다.
도 4는 PSY-E을 처리한 직결장암 세포주 HCT116및 SW480의 STAT3 신호전달경로 활성 수준 변화를 나타낸 것이다. a: 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, b: 웨스턴 블롯 결과에 대한 농도계 정량, c: 공초점 현미경 이미지, d: pSTAT3-Luc 리포터 형광 발현 분석 결과이다.
도 5는 직결장암 세포주에서 PSY-E처리에 따른 JAK2 및 Src 인산화 수준 및 PTPs(SHP1 및 SHP2) 발현 변화와 PSY-E 및 PTPs억제제(pervanadate) 처리에 따른 STAT3 인산화 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다. a: JAK2, p-JAK2, Src, p-Src 단백질 발현 웨스턴 블롯 결과, b: JAK2 및 Src에 대한 웨스턴 블롯 농도계 정량, c: SHP1 및 SHP2에 대한 웨스턴 블롯 단백질 발현 결과, d: SHP1 및 SHP2에 대한 웨스턴 블롯 농도계 정량, e: PSY-E 및 PTPs억제제(Pervanadate) 처리군과 PSY-E 단독 처리군의 p-STAT3 단백질 발현 결과, f: PSY-E 및 PTPs억제제(Pervanadate) 처리군과 PSY-E 단독 처리군의 p-STAT3 농도계 정량 결과이다.
도 6은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB231　및 유방상피세포 MCF-10A의 세포 생존율(왼쪽) 및 최소억제농도IC50(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 7은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231의 세포주기 변화를 나타낸 것이다. FL2-A 형광영역(왼쪽), 세포수 농도계 정량(오른쪽)이다.
도 8은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231의 세포자멸을 나타낸 것이다. a: Annexin V 염색영역(왼쪽), 염색세포수 농도계 정량 결과(오른쪽), b: 현미경이미지(왼쪽), 사멸세포수 농도계 정량(오른쪽), c: PARP 단백질 발현 웨스턴 블롯 결과이다.
도 9는 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에서 세포자멸 및 자가포식 관련 분석을 나타낸 것이다. a: MDA-MB231에서 caspase-3 단백질 발현 웨스턴 블롯, b: MCF-7 및 MDA-MB231에서 Bcl-2, Bcl-xL 단백질 발현 웨스턴 블롯, c: Z-DEVD-FMK 및 PSY-E 처리에 따른 Annexin V 염색영역(왼쪽), 세포수 농도계 정량(오른쪽)이다. d: MCF-7 및 MDA-MB231에서 Atg7, p-Beclin-1 및 Beclin-1 단백질 발현 웨스턴 블롯, e: 3-MA 및 PSY-E 처리에 따른 AO-green 염색영역(왼쪽), 세포수 농도계 정량(오른쪽)이다.
도 10은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231의 자가포식에 의한 세포자멸을 나타낸 것이다. a: AO-green 염색영역(왼쪽), 세포수 농도계 정량(오른쪽), b: AO염색 현미경이미지, c: MDC염색 현미경이미지, d: LC3 Ⅰ, LC3 Ⅱ 단백질 발현 웨스턴 블롯, e: LC3 발현 현미경이미지이다.
도 11은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231와 β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에서의 세포자멸 비교 분석을 나타낸 것이다. a: normal MCF-7 및 MDA-MB231에서의 β-카테닌 단백질 발현 웨스튼 블롯, b: 형질전환된 MCF-7 및 MDA-MB231에서의 β-카테닌 단백질 발현 웨스튼 블롯, c: 형질전환된 MCF-7 및 MDA-MB231에서의 LC3 Ⅰ, LC3 Ⅱ 단백질 발현 웨스턴 블롯, d: 형질전환된 MCF-7 및 MDA-MB231에서의 PARP 단백질 발현 웨스턴 블롯이다. e: 현미경이미지(왼쪽), 사멸세포수 농도계 정량(오른쪽)이다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고 있다.
일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 갖는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자들은 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Mori radicis cortex) 추출물이 직결장암 또는 유방암 세포의 세포생존(cell viability)을 억제하고, 세포 주기(cell cycle)에 관여하여 암세포 성장을 억제하며, 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 효과를 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Mori radicis cortex) 추출물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “패장초(Patriniae radix)”란 여러해살이 풀인 마티리과(Valerianaceae)에 속한 다년생 초본인 마타리(Partinia scabiosaefolia Fisch.ex Link)의 뿌리를 붙인 전초를 건조한 것이다. 독이 없고 맵고 쓴 맛을 가진 것이 특징이다.
본 발명에서 용어 “의이인(Coicis semen)”이란 벼과(Poaceae)에 속하는 일년생 또는 다년생 본초인 율무속(Coix lachyma-jobi　var.　ma-yuen STAPF)의 잘 익은 씨로서 씨껍질을 제거한 것이다. 담백하고 약간 단 맛을 가진 것이 특징이다.
본 발명에서 용어 “상백피(Mori radicis cortex)” 란 뽕나무(Morus alba L.)의 뿌리 껍질로 특이한 냄새를 가지며 단 맛을 가진 것이 특징이다.
본 발명에서는 염증과 암의 관계를 고려하여, <동의보감>에서 ‘장옹(腸癰)’치료를 위해 제시된 처방 중 패장산(敗醬散; 의이인 패장초 부자로 구성) 중 효능을 담당하는 것으로 여겨지는 의이인과 패장초를 취하고, 여기에 <본초학>에서 폐열로 인한 해수 등과 소변 불리로 인한 보종과 해천에 많이 쓰여 폐경에 들어간다는 상백피를 추가하여 새로운 조합의 조성물(PSY)을 구성하였다. 이렇게 구성한 PSY를 활용하여 직결장암 및 유방암 세포에서 항암효과를 확인하였으며, 특히 실제 염증에 중요한 기전들(e.g. STAT3)을 억제함으로 인해 항암 효과를 나타내고 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 추출물은 상기 패장초, 의이인 및 상백피를 포함하는 추출물일 수 있다.
상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합된 혼합물을 추출한 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1:0.6의 중량비로 혼합된 혼합물을 추출한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 패장초, 의이인 및 상백피를 상기와 같은 중량비로 각각 추출한 추출물을 혼합한 추출물을 포함할 수 있으며, 패장초, 의이인 및 상백피를 상기 중량비로 혼합한 후 동시에 추출한 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "패장초, 의이인 및 상백피 추출물"은 적절한 용매를 이용하여 패장초, 의이인 및 상백피의 혼합물로부터 추출한 것이며, 예를 들어 패장초, 의이인 및 상백피의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 추출물은 당업계에 공지된 추출, 분리 및 분획하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출, 분리 및 분획하여 수득한 것을 사용할 수 있다.
상기 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 수득하기 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하다. 예를 들어, 상기 용매로는 물, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올 등을 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 추출물은 바람직하게는 70 내지 100%(v/v)의 에탄올 또는 물을 용매로 추출한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 90 내지 100%(v/v) 에탄올 또는 물을 용매로 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추출방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 초음파추출법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 패장초, 의이인 및 상백피 추출물은 당업계에서 알려진 통상의 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결건조 할 수도 있다. 또한 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수도 있다.
또한 상기 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획으로도 얻을 수 있다.
따라서 본 발명에서 사용되는 상기 패장초, 의이인 및 상백피 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출물, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
또한, 상기 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매의 몸통, 열매의 껍질뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출할 수 있다.
따라서, 상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피 각각의 뿌리, 전초, 줄기, 잎, 씨, 꽃, 또는 열매로부터 수득한 원료의 혼합물로 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 패장초, 의이인 및 상백피 추출물이 암세포의 생존 및 성장을 억제하고 세포자멸 유도 또는 자가포식에 의한 세포사멸 효과로 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 항암 활성을 나타냄을 확인하였다.
상기 암은 직결장암 또는 유방암일 수 있다. 상기 직결장암은 직장암 및 결장암을 모두 포함하는 것으로, 대장암과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 직결장암 세포주에 처리하였을 때 STAT3 경로 활성화를 억제하고 직결장암 세포주의 sub G1기 및 G2-M기 정지를 유발할 수 있는 세포주기 관련 단백질의 발현을 검출하였다. 이로 인해 직결장암세포의 성장과 증식 또는 전이를 억제할 수 있을 뿐만 아니라 세포자멸을 유도하여 암세포 사멸효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 유방암 세포주에 처리하였을 때 sub G1기 정지를 유발하여 세포 성장을 억제하고 세포자멸 및 자가포식을 유도하였다. 특히 β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주에서 PARP 발현을 증가시켜 세포자멸 활성화를 유도함으로써 유방암 세포에서 β-카테닌의 발현조절을 통해 세포자멸효과를 나타냄을 확인하였다. 또한 β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주에서 LC3 발현을 증가시켜 자가포식 활성화를 유도함으로써 유방암 세포에서 β-카테닌의 발현조절을 통해 자가포식효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 암의 발생, 확산 또는 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 암 또는 종양 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본 발명의 조성물이 효과가 있는 질환의 기준을 알고 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, "약학 조성물"은 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물은 패장초, 의이인 및 상백피 추출물과 같은 유효성분 이외에 해당 기술 분야에서 통상적으로 약제학적으로 허용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학 조성물의 총 중량에 대하여 패장초, 의이인 및 상백피 추출물 또는 분획물은 바람직하게는 0.01 내지 95중량%로 포함되고, 더욱 바람직하게는 1 내지 80중량%로 포함될 수 있다.
상기 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톤, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화나 제형화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 성분들은 유효성분 즉, 패장초, 의이인 및 상백피 추출물 또는 분획물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 해당 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 1 내지 10,000mg/kg/일, 바람직하게는 1 내지 2000mg/kg/일 로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하에 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로, 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 항암용 건강기능성 식품조성물에 관한 것이다.
상기 "패장초, 의이인 및 상백피 추출물"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "항암용"이란 암세포의 생존 및 성장을 억제하고 세포자멸 유도 또는 자가포식에 의한 세포사멸 효과로 암을 예방, 개선 또는 치료하는 항암 활성 용도를 의미한다.
본 발명에 있어서 "식품조성물”은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강기능(성)식품(health functional food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용 식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강기능(성)식품(health functional food)은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강기능(성)식품은 본 발명의 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품조성물 중 상기 패장초, 의이인 및 상백피 추출물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들어 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 80 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 식품으로 인정되는 제형이면 다양한 형태의 제형으로 제한 없이 제조될 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별하고 적절한 양으로 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로, 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는, 항암용 사료 조성물에 관한 것이다.
상기 "패장초, 의이인 및 상백피 추출물"은 전술한 바와 같다.
상기"항암용"은 전술한 바와 같다.
상기 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 포함하는 사료조성물은 암세포의 생존 및 성장을 억제하고 세포자멸 유도 또는 자가포식에 의한 세포사멸 효과로 항암활성을 나타내는 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서 "사료 조성물"의 원료인 패장초, 의이인 및 상백피 추출물은 건조된 상태로 공급될 수도 있으며, 별도의 건조과정을 수행하지 않고 그대로 이용될 수도 있다. 상기 패장초, 의이인 및 상백피 추출물을 단독으로 사용할 수도 있으며, 종래 공지된 사료 첨가제 또는 사료와 병용하여 사용할 수도 있다. 또한 공지된 사료 첨가제 또는 사료에 첨가되는 각종 부형제들도 역시 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에는 동물사료에 통상적으로 사용되는 영양제, 방부제, 보존제, 항생제, 비타민 등의 미량 영양성분 등이 더 포함될 수 있다. 상기 영양제, 방부제, 보존제, 항생제, 미량 영양 성분 등은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자가 통상적으로 사료에 첨가하는 함량으로 임의 선택하여 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
제조예: 추출물 제조
우수의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP)에 따른, 패장초(Patriniae radix; 동우당제약㈜ 제조번호:D1912035158C), 의이인(Coicis semen; 동우당제약㈜ 제조번호:D1705195044K) 및 상백피(Morus alba　Linn; ㈜허브팜 수입, 원산지 중국, 제조번호:N180208077)를 정확히 감정한 후에 음건, 세절하여 사용하였다.
마쇄된 패장초 37.5g, 의이인 37.5g및 상백피 22.5g을 취하여 혼합한 원료에 99% 에탄올을 877.5ml가하여 90분동안 초음파 처리한 에탄올 추출물(이하 PSY-E)과 마쇄된 패장초 37.5g, 의이인 37.5g및 상백피 22.5g을 취하여 혼합한 원료를 877.5ml의 증류수에서 90분동안 끓인 물 추출물(이하 PSY-W)을 준비하였다. 상기 추출물들을 SAVANT SPD2010 SpeedVacTM 농축기(써모 사이언티픽, Asheville, NC, USA)를 사용하여 건조하였다. 건조 추출물의 수율은 에탄올 추출물의 경우 3.21%, 물 추출물의 경우 10.13%로 나타났다.
상기 건조 추출물을 DMSO에 용해시켜 500㎎/㎖의 스톡 용액을 만들고, 세포 실험에서 농도를 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25 및 0.05㎎/㎖ 로 설정하고, RPMI-1640 세포배양 배지를 이용하여 희석하였다.
실시예1: 직결장암 세포주에 대한 PSY-E 영향
1-1. 세포배양
인간의 직결장암(CRC) 세포주HCT116, HT29 및 SW480를 37℃에서 5% CO2 조건의 가습 인큐베이터에서 10% FBS 및 1% 항생제/항진균제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
1-2. 세포 생존율 분석
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)는 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
직결장암 세포주HCT116, HT29 및 SW480 (3-5 x 103 cells/well)를 96 well 플레이트에 1 x 104 cells/ml로 분주하고 24 시간 배양한 다음, PSY-E 및 PSY-W을 농도별(0, 31.25, 62.5, 1 25, 250 및500 ㎍/㎖)로 72시간 동안 처리한 후, 2㎎/㎖ MTT 용액 20㎕를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.
DMSO로 포르마잔 결정을 용해한 후, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고 최소 3회 반복하여 평균값의 표준오차(SEM)로 표시하였다.
도 1은 PSY-E 및 PSY-W 처리에 따른 직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 1의 A를 참고하면, PSY-W 및 PSY-E은 모든 직결장암 세포의 사멸을 유도하였으며 특히 PSY-E은 직결장암 세포의 생존율을 현저하게 억제하였다. 도 1의 B를 참고하면, PSY-E을 처리한 HCT116, HT29 및 SW480에서 IC50 값은 각각 54.32±2.12㎍/ml, 43.83±1.29㎍/ml 및 60.17±2.52㎍/ml로 PSY-W 과 비교하여 20배가량 낮은 저해농도를 나타냈다.
따라서, 직결장암 세포주에서 PSY-E을 적은 농도로 처리하여도 세포 생존율이 크게 억제됨을 확인하였다.
1-3. PSY-E에 의한 세포 자멸사(Apoptosis) 분석
직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480에 PSY-E를 50㎍/ml 및 100㎍/ml 농도로 48시간 동안 처리 후, 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC, Fluorescein Isothiocyanate)-Annexin V 및 요오드화 프로피듐(PI, propidium iodide)으로 이중염색하고 유세포(Flow cytometry) 분석을 통해 자멸 세포의 비율을 측정하였다.
도 2는 PSY-E 처리에 따른 직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480의 세포 자멸사를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b를 참고하면, PSY-E를 처리한 직결장암 세포주에서 농도의존적으로 자멸세포(apoptotic cells) 비율이 증가하였음을 확인하였으며, 도 2c 및 도 2d에서 보는 바와 같이, PSY-E를 처리하였을 때, TUNEL 분석으로 측정한 자멸세포의 DNA 단편 비율이 현저히 증가하였음을 확인하였다. 또한, 도 2e를 참고하면, PSY-E를 50㎍/ml 및 100㎍/ml 농도로 처리한 직결장암 세포주에서 웨스턴 블롯팅한 결과 PARP절단을 확인하였다.
이러한 결과로, 패장초, 의이인 및 상백피의 에탄올 추출물(PSY-E)이 인간 직결장암 세포주에서 세포자멸을 유도함을 확인하였다.
1-4. PSY-E에 의한 세포주기 변화 및 관련 단백질 발현 조절능 분석
직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480에 PSY-E를 50㎍/ml 및 100㎍/ml 농도로 48시간 동안 처리 후, 요오드화 프로피듐(PI, propidium iodide)으로 염색하고 유세포(Flow cytometry) 분석하여 PSY-E이 암세포의 세포주기를 변화시키는지 확인하였다.
도 3은 PSY-E 처리에 따른 직결장암 세포주 HCT116, HT29 및 SW480의 세포주기 변화를 나타낸 것이다.
도 3 a 및 b를 참고하면, PSY-E을 처리하였을 때, G0/G1기에 해당하는 직결장암 세포주의 PI형광을 나타내는 세포수는 점차 감소한 반면, G2-M기와 세포자멸을 의미하는 sub G1기에 해당하는 직결장암 세포수는 증가함을 확인하였다. 또한, 도 3c 및 도 3d를 참고하면, PSY-E를 50㎍/ml 및 100㎍/ml 농도로 처리한 직결장암 세포주에서 웨스턴 블롯팅을 통해 CDK4, CDK6, CDK1, Cyclin B1 및 p-CDK1 단백질 발현 수준의 변화를 검출하였다. 구체적으로, HCT116 세포에서는 농도가 증가함에 따라 CDK1 및 Cyclin B1의 발현이 점차 감소하고, SW480 세포에서 CDK1의 Tyr-15 인산화가 유의하게 증가하였다.
이러한 결과로, 패장초, 의이인 및 상백피의 에탄올 추출물(PSY-E)이 인간 직결장암 세포주의 G2-M기 정지를 유발하여 암세포의 성장을 억제하고 세포자멸을 유도할 수 있음을 확인하였다.
1-5. PSY-E에 의한 STAT3 신호전달경로 분석
도 4는PSY-E을 처리한 직결장암 세포주 HCT116및 SW480의 STAT3 신호전달경로 활성 수준 변화를 나타낸 것이다.
도 4 a 및 도 4b를 참고하면, 세포주 HCT116및 SW480에 PSY-E를 0, 50 및 100㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포 용해물을 STAT3 및 p-STAT3(Tyr705) 항체로 웨스팅 블롯팅한 결과, PSY-E 처리군에서 PSY-E이 농도 의존적으로 STAT3(Tyr705) 인산화를 효과적으로 억제함을 확인하였다.
도 4c를 참고하면, 세포주 HCT116및 SW480에 PSY-E를 50 ㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 후 p-STAT3 및 DAPI 염색한 공초점 현미경 이미지 분석 결과, PSY-E는 STAT3 전사 활성화를 나타내는 핵으로의 이동을 유의하게 억제함을 확인하였다.
추가적으로, 도 4d를 참고하면, pSTAT3-Luc 플라스미드로 형질감염한 HCT116 세포에 PSY-E를 50 및 100㎍/ml 농도로 24시간 처리한 결과, PSY-E 처리 농도 의존적으로 STAT3의 전사 활성화가 현저하게 감소함을 확인하였다.
이러한 결과로, 패장초, 의이인 및 상백피의 에탄올 추출물(PSY-E)이 직결장암 세포주에서 STAT3 활성화를 억제함으로써, 암세포의 성장과 증식 또는 전이를 억제할 수 있음을 확인하였다.
1-6. PSY-E의 STAT3 활성 억제능 분석
PSY-E에 의한 STAT3 신호전달경로 비활성화 및 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 유도와의 상관관계를 분석한 결과, PSY-E의 STAT3 경로 억제는 JAK또는 Src의 활성 억제와 단백질 티로신 포스파타제(PTP)인 SHP1의 발현증가에 의해 이루어짐을 확인하였다.
도 5는 직결장암 세포주에서 PSY-E처리에 따른 JAK2 및 Src 인산화 수준 및 PTPs(SHP1 및 SHP2) 발현 변화와 PSY-E 및 PTPs억제제(pervanadate) 처리에 따른 STAT3 인산화 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
먼저, 직결장암 세포주 HCT116 및 SW480 각각에 대해 PSY-E을 처리하고 JAK2 및 Src의 활성화 및 발현과 PTPs(SHP1 및 SHP2)의 발현 수준을 확인하였다. 도 5a 및 도 5b를 참고하면, 세포주 HCT116및 SW480에 PSY-E를 0, 50 및 100㎍/ml 농도로 24시간동안 처리한 후, 세포 용해물을 JAK2, p-JAK2, Src, p-Src항체로 웨스턴 블롯팅한 결과, HCT116 세포에서는 JAK2 및 Src의 인산화 수준을 감소시켰으며 SW480세포에서는JAK2 인산화 수준을 감소시키고 Src 인산화 수준은 증가시켰다(도 5b). 이러한 결과로 PSY-E이 HCT116 세포에서는 STAT3의 인산화를 통한 활성을 유도하는 업스트림 신호전달 분자인 JAK2 및 Src 활성을 동시에 저해하고, SW480세포에서는JAK2의 활성 저해를 통해 STAT3의 인산화 및 활성을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, PSY-E의 PTPs(STAT3의 탈인산화를 통해 활성을 억제하는 업스트림 신호전달 분자)에 대한 작용을 통해 PSY-E의 STAT3 활성 저해 기전을 살펴보았다.
도 5c 및 도 5d를 참고하면, 세포주 HCT116및 SW480에 PSY-E를 0, 50 및 100㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포 용해물을 SHP1 및 SHP2 항체로 웨스턴 블롯팅한 결과, PSY-E처리 농도 의존적으로 SHP1가 증가하였으며, SHP2는 증가하지 않았다.
HCT116 세포에 대해 PSY-E을 50㎍/ml 농도로 처리한 실험군과 PTPs억제제인 페르바나데이트(Pervanadate) 및 PSY-E을 함께 처리한 실험군을 대조하여 STAT3(Tyr705) 인산화 수준을 비교하였다. 도 5e 및 도 5f를 참고하면, PSY-E만을 처리하였을 경우 STAT3(Tyr705) 인산화가 억제된 반면, 페르바나데이트(Pervanadate) 5μM를 함께 처리한 실험군에서는 STAT3(Tyr705) 인산화가 억제되지 않아 PSY-E 처리에 의한 STAT3 신호전달경로 비활성화는 PSY-E 처리 농도의존적으로 증가한 SHP1에 의한 것으로 추정할 수 있다.
이러한 결과로, 패장초, 의이인 및 상백피 에탄올 추출물(PSY-E)을 인간 직결장암 세포주에서 세포 성장 및 생존 메카니즘인 STAT3 신호전달경로를 표적으로 하는 STAT3 억제제로 이용할 수 있음을 확인하였다.
실시예2: 유방암 세포주에 대한 PSY-E 효과
2-1. 세포배양
유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB231　및 유방상피세포 MCF-10A를 37℃에서 5% CO2 조건의 가습 인큐베이터에서 10% FBS 및 1% 항생제/항진균제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
2-2. 세포 생존율 분석
유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB231　및 유방상피세포 MCF-10A에 대해서는 PSY-E를 농도별(0, 30, 50 및 100㎍/㎖)로 24, 48 및 72시간 동안 처리한 후, 2㎎/㎖ MTT 용액 20㎕를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.
도 6은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주MCF-7, MDA-MB231 및 유방상피세포 MCF-10A의 세포 생존율 및 최소억제농도(IC50)를 나타낸 것이다.
도6을 참고하면, PSY-E은 유방상피세포 MCF-10A와 비교하여 유방암 세포주에 대하여 시간이 경과함에 따라 농도 의존적으로 세포 생존을 현저하게 억제하였다. 또한, PSY-E을 24시간 처리한 MCF-7, MDA-MB231　및 MCF-10A에서 IC50 값이 각각 107㎍/ml, 154㎍/ml 및 406㎍/ml으로 나타나 유방암 세포주에서 PSY-E을 적은 농도로 처리하여도 세포 생존을 크게 억제할 수 있음을 확인하였다.
2-3. PSY-E에 의한 세포 자멸사(Apoptosis) 분석
유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 시간별(0, 12, 24, 36 및 48시간) 처리 후, 요오드화 프로피듐(PI, propidium iodide)으로 염색하고 유세포 분석(BD AcuriTM C6 Plus Flow Cytometer)을 수행하였다.
도 7은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231의 세포주기 변화를 나타낸 것이다.
도 7을 참고하면, PSY-E을 처리한 실험군에서 세포자멸을 나타내는 sub G1기의 유방암 세포주의 세포수가 증가함을 확인하였다.
그 다음, 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 시간별(0, 12, 24, 36 및 48시간) 처리 후, 요오드화 프로피듐(PI, propidium iodide)으로 염색하고 아넥신V(Annexin v) 분석 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
도 8은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231의 세포자멸을 나타낸 것이다.
도 8a를 참고하면, 24시간이 경과하며 ealy apoptosis의 수가 급격히 증가하며, PSY-E에 의해 세포자멸이 발생함을 확인하였다. 또한 시간이 경과함에 따라 late apoptosis의 수도 점차 증가하여, PSY-E이 유방암 세포주의 자멸을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 도 8b를 참고하면, 유방암 세포주의 live and dead 검정을 수행한 공초첨 현미경 이미지에서 보는 바와 같이, 시간이 경과할수록 MCF-7 및 MDA-MB231 세포의 사멸수는 현저하게 증가하였다. 또한, 도 8c를 참고하면, 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과 절단된 PARP가 검출되었다.
이러한 결과로, 패장초, 의이인 및 상백피의 에탄올 추출물(PSY-E)이 인간 유방암 세포주의 세포주기 정지기에 관여하여 성장을 억제하고, 세포자멸을 유도할 수 있음을 확인하였다.
이를 바탕으로, 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 시간별(0, 12, 24, 36 및 48시간) 처리 후, 세포 용해물에서 caspase-3, Bcl-2, Bcl-Xl에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 세포자멸을 효과적으로 유도하는지 확인하였다.
도 9는 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에서 세포사멸 관련 분석을 나타낸 것이다.
도 9 a를 참고하면, MDA-MB231에 PSY-E처리 24시간 경과 후 caspase-3가 활성화되며 세포자멸이 발생하였으며, 도9b를 참고하면, PSY-E을 처리한 MCF-7 및 MDA-MB231에서 항세포자멸(anti-apoptotic) 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현을 억제함을 확인하였다. 아울러, 도 9c에서는 caspase-3 억제제인 Z-DEVD-FMK를 PSY-E와 함께 처리하였을 경우에는 PSY-E에 의한 세포자멸 유도 효과가 Z-DEVD-FMK에 의해 억제되었다.
2-4. PSY-E에 의한 자가포식 유도능 및 세포자멸 유도능 분석
유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 시간별(0, 12, 24, 36 및 48시간) 처리 후, 세포 용해물에서 Atg7, p-Beclin-1 및 Beclin-1에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 세포의 자가포식을 유도하는지 확인하였다.
Atg7과 Beclin-1의 수준을 측정하여PSY-E에 의한 유방암 세포주의 자가포식 여부를 확인하였다.
도 9d를 참고하면, PSY-E 처리 12시간 내지 24시간이 경과하면서, Atg7, p-Beclin-1 및 Beclin-1의 발현이 두드러지게 나타남으로서 유방암 세포주의 자가포식이 유도됨을 확인하였다. 또한, 도 9e에서는 자가포식 억제제인 3-MA를 PSY-E와 함께 처리하였을 경우, PSY-E에 의한 자가포식 유도 효과가 3-MA에 의해 억제되었다.
그리고 PSY-E이 자가포식으로 유발되는 세포자멸을 유도하는지 확인하였다.
유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 시간별(0, 12, 24, 36 및 48시간) 처리 후, 아크리딘 오렌지(AO) 및 모노단실카다베린(MDC)으로 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 자가포식 소체(AVO, acidic vesicular organelles)를 정량화하였으며, LC3를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 10은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231의 자가포식에 의한 세포자멸을 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10c를 참고하면, PSY-E 처리 시간이 경과함에 따라 아크리딘 오렌지로 염색된 세포의 수가 현저하게 증가함을 확인하였으며, PSY-E 처리 24시간이 경과하면서 자가포식 형광표지된 MDC 염색 세포의 수가 확연하게 증가함을 확인하였다. 또한, 도 10d 및 도 10e를 참고하면, PSY-E을 처리한 12시간 내지 24시간이 경과하면서, 자가포식 수용체인 LC3 단백질의 발현이 점차 증가하였음을 확인하였다.
이러한 결과로, 패장초, 의이인 및 상백피의 에탄올 추출물(PSY-E)이 인간 유방암 세포주의 자가포식율을 증가시키고, 세포자멸을 효과적으로 유도함을 확인하였다.
2-5. β-카테닌 녹다운 형질전환세포에서의 PSY-E의 세포자멸 유도능
β-카테닌은 caspase 및 LC3의 활성화를 조절하여 세포자멸과 자가포식을 억제하는 기능을 하는 것으로, PSY-E는 β-카테닌의 녹다운보다 효과적으로 유방암 세포주의 세포자멸을 유도하였다.
유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 시간별(0, 12, 24, 36 및 48시간) 처리 후, β-카테닌에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그리고, β-카테닌 siRNA로 형질전환된 세포에서 PSY-E를 100㎍/ml 농도로 처리하고, 세포사멸을 분석하였다.
도 11은 PSY-E 처리에 따른 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231와 β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB231에서의 세포자멸 비교 분석을 나타낸 것이다.
도 11a를 참고하면, MCF-7 세포에서는 PSY-E 처리 12시간 경과 후, MDA-MB231 세포에서는 PSY-E 처리 24시간 경과 후, β-카테닌 단백질 발현이 억제되었음을 확인하였다.
유방암 세포주를 β-카테닌 siRNA로 형질전환하여 β-카테닌 발현을 녹다운 한 후, PSY-E을 처리하였을 때 β-카테닌 및 LC3 발현 변화와 비교 분석하였다. 도 11b를 참고하면, β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주에서 PSY-E를 처리하였을 때 PSY-E를 처리하지 않은 실험군과 비교하여 β-카테닌의 발현이 우수하게 억제됨을 확인하였다. 또한, 도 11c를 참고하면, β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주에서 PSY-E를 처리하였을 때 PSY-E를 처리하지 않은 실험군과 비교하여 자가포식 수용체인 LC3 단백질의 발현이 두드러지게 나타남을 확인하였다.
또한, 도 11d 및 도 11e를 참고하면, β-카테닌 siRNA로 형질전환된 유방암 세포주에서 PSY-E를 처리하였을 때 PSY-E를 처리하지 않은 실험군과 비교하여 PARP 발현이 증가하여 세포자멸 활성화가 증가하였고, 세포사멸수 또한 MCF-7 및 MDA-MB231 세포 각각 8% 및 7%에서 74% 및 80%로 크게 증가함을 확인하였다.
이러한 결과로, β-카테닌 발현 조절을 통해 유방암 세포주에서 패장초, 의이인 및 상백피의 에탄올 추출물(PSY-E)이 세포자멸을 현저히 우수하게 유도함을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Morus alba　Linn) 추출물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것인, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 70 내지 100%(v/v)의 에탄올인 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암은 직결장암 또는 유방암인 것인, 약학 조성물.
  6. 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Morus alba　Linn) 추출물을 포함하는, 항암용 건강기능성 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 혼합 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것인, 식품 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것인, 식품 조성물.
  9. 패장초(Patriniae radix), 의이인(Coicis semen) 및 상백피(Morus alba　Linn) 추출물을 포함하는, 항암용 사료 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 혼합 추출물은 패장초, 의이인 및 상백피를 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것인, 사료 조성물.
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1. Yu, H., D. Pardoll, and R. Jove, STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3. 2009. 9(11): p. 798-809.

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